JP2002325586A - 微生物識別方法、微生物識別装置、微生物識別用データベースの作成方法および微生物識別プログラムを記録した記録媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物群を構成する複数の微生物を同時にか
つ容易に識別することが可能な微生物識別方法、微生物
識別装置および微生物識別用データベースの作成方法お
よび微生物識別プログラムを記録した記録媒体を提供す
ることである。 【解決手段】 微生物識別方法は、ＳＳＣ−ＰＣＲ法に
より微生物の解析実験を行うステップＳ１と、解析実験
により得られた電気泳動像を取り込むステップＳ２と、
画像データから電気泳動像の輝度分布を示す波形データ
を生成するステップＳ３と、波形データを補正するステ
ップＳ４と、波形データを連結するステップＳ５と、波
形データを用いてデータベースの検索を行うステップＳ
６と、結果を表示するステップＳ７とから構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物識別方法、
微生物識別装置、微生物識別用データベースの作成方法
および微生物識別プログラムを記録した記録媒体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、家庭等から排出される有機系廃棄
物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する
生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理
機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解す
ることにより肥料が作成される。

【０００３】このような生ゴミ処理機によるコンポスト
化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）にお
いて、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度
合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料
が作成されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。

【０００４】しかしながら、より良質な肥料を作成する
ためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物群（少
なくとも微生物の種類）の情報が必要である。この微生
物群の情報は、微生物により生ゴミの分解を良好に制御
するためにも必要である。また、作成された肥料の添加
により土壌の改良を進める上では、土壌中の微生物群の
情報を知ることも重要である。

【０００５】生ゴミ処理機内において、生ゴミに含まれ
る各種成分は、種類の異なる微生物が共同して分解を進
めることによりコンポスト化される。それぞれの細菌は
お互いに何らかの関係を維持しており、生ゴミ処理機内
において全体的に１つの生態系を構成している。したが
って、生ゴミ処理機内の菌叢を調べれば、生ゴミの処理
状態をいち早く知ることが可能となる。例えば、活性の
高い細菌が生ゴミ処理機内に多く存在するときには生ゴ
ミの処理状態が良好であるのに対し、嫌気性細菌が多く
なると生ゴミの処理が進まず、生ゴミ処理機内への空気
供給が必要であることなどがわかる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来、微生物群の情
報、例えば細菌群の情報を得る方法としては、細菌群に
含まれる個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が
用いられる。しかし、この方法は時間がかかる上に、単
離の難しい細菌については調べることが困難であった。

【０００７】一方、ＤＮＡ分析を行うことにより微生物
群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うに
はＤＮＡを増幅する必要がある。ＤＮＡを増幅する方法
としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction;ポリメラー
ゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８
３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６
５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３
３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとする
ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配
列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程およ
び伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すこ
とにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅する
ことを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いる
と、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定
の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することがで
きる。

【０００８】しかしながら、このＰＣＲ法を用いるため
には、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列
が既知であることが必要である。したがって、従来のＰ
ＣＲ法では、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土
壌に存在する微生物の種類および塩基配列が知られてい
ないと、それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することは
できない。

【０００９】そこで、単一のプライマーで塩基配列の情
報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ
断片を増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorph
icＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Prim
ed-Polymerase Chain Reaction) 法が提案されている。
これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニ
ーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイ
オン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配
列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを
伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複
製される。

【００１０】これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ
法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報
がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断
片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電
気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープ
リントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分
析することにより微生物の状態を分析することが可能と
なる。

【００１１】その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ
−ＰＣＲ法を複数の微生物から構成される微生物群に適
用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎる
ために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった微生物と
の対応付けが困難となり、微生物群が形成する生態系を
把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断
片から微生物群を構成する微生物を識別することはでき
ない。

【００１２】生ゴミ処理機は、処理槽の温度が例えば３
０℃以上かつ含水率が例えば４０％となるように設定調
整を行うとともに、撹拌機能を設けることで処理状態を
安定に保つことができる。しかし、適切な微生物測定技
術がないため、装置の小型化、悪臭防止、良質な堆肥生
成などの機能向上を行うことは困難である。

【００１３】このように、生ゴミ処理機に代表される微
生物利用の商品およびシステムでは、内部で活動してい
る微生物の状態、例えば微生物の種類や経時変化等を評
価する適切な方法がないため、開発や改良を進める上で
大きな障害が生じる。

【００１４】本発明の目的は、微生物群を構成する複数
の微生物を同時にかつ容易に識別することが可能な微生
物識別方法、微生物識別装置、微生物識別用データベー
スの作成方法および微生物識別プログラムを記録した記
録媒体を提供することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段および発明の効果】第１の
発明に係る微生物識別方法は、識別対象となる微生物を
識別する微生物識別方法であって、複数のプライマーを
準備し、複数のプライマーの各々を用いて、識別対象と
なる微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーの
アニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工
程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を
一度に適用することにより、識別対象となる微生物のＤ
ＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプライ
マーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気
泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像を
得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像を
画像データに変換するステップと、画像データに基づい
て各プライマーに対応する電気泳動像における輝度分布
を示す波形データを求めるステップと、照合対象となる
微生物についての複数のプライマーに対応する電気泳動
像に関する情報が予め記憶されたデータベースを検索
し、データベースに記憶された情報に基づいて照合対象
となる微生物についての複数のプライマーに対応する電
気泳動像における輝度分布を示す波形データを求め、識
別対象となる微生物について求められた波形データと照
合対象となる微生物について求められた波形データとの
相関関係を求めるステップと、相関関係に基づいて識別
対象となる微生物を識別するステップとを備えたもので
ある。

【００１６】本発明に係る微生物識別方法によれば、単
一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群
のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識
別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可
能となる。

【００１７】特に、微生物群を識別対象として用いる場
合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時
に識別し、さらに同定することが可能となる。このた
め、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名
を明らかにすることが可能となる。

【００１８】本発明の微生物識別方法は、微生物群と微
生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生
ごみ処理機の微生物群から得られた電気泳動像の輝度分
布を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた電
気泳動像の輝度分布を示す波形データとを比較すること
で、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群
としての違いを見ることができる。

【００１９】一方、単一の微生物を識別対象として用い
る場合においては、識別対象となる微生物とデータベー
スの照合対象となる微生物との多型を検出することも可
能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生
物を見いだすこともできる。

【００２０】ここで、この微生物識別方法においては、
複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適
用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅して
ＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単
離および培養する工程が不要となる。このため、容易に
識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離
の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、
上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、
塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であ
るため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象とな
る微生物の識別および同定を行うことができる。

【００２１】さらに、この微生物識別方法においては、
複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反
応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用い
て識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ
連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリ
メラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識
別を安定して行うことが可能となる。

【００２２】電気泳動像に関する情報は、電気泳動像の
輝度分布を示す波形データであってもよい。

【００２３】電気泳動像に関する情報は、電気泳動像の
輝度分布におけるピークの位置およびピークの高さまた
は面積を示すデータであり、相関関係を求めるステップ
は、電気泳動像の輝度分布におけるピークの位置および
ピークの高さまたは面積を示すデータに基づいて電気泳
動像の輝度分布を示す波形データを求めるステップを含
んでもよい。

【００２４】電気泳動像に関する情報は、電気泳動像を
示す画像データであり、相関関係を求めるステップは、
電気泳動像を示す画像データに基づいて電気泳動像の輝
度分布を示す波形データを求めるステップを含んでもよ
い。

【００２５】相関関係を求めるステップは、識別対象と
なる微生物について求められた複数のプライマーに対応
する波形データを連結し、かつ照合対象となる微生物に
ついて求められた複数のプライマーに対応する波形デー
タを連結し、識別対象となる微生物についての連結され
た波形データと照合対象となる微生物についての連結さ
れた波形データとの相関関係を求めるステップを含んで
もよい。

【００２６】これにより、識別対象となる微生物につい
て求められた複数のプライマーに対応する波形データと
照合対象となる微生物について求められた複数のプライ
マーに対応する波形データとの相関関係を容易かつ短時
間に求めることができる。

【００２７】相関関係に基づいて識別対象となる微生物
を識別するステップは、相関関係における相関係数を算
出し、算出された相関係数に基づいて識別対象となる微
生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定するス
テップを含んでもよい。

【００２８】既知の塩基配列を有する参照用プライマー
を用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配
列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応
法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を
増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅さ
れた参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適
用し、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステッ
プと、参照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を画像データ
に変換するステップと、参照用ＤＮＡに対応する画像デ
ータに基づいて識別対象となる微生物に対応する画像デ
ータを補正するステップとをさらに備えてもよい。

【００２９】この場合、参照用プライマーを用いたポリ
メラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断
片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照
用ＤＮＡのＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像デー
タに基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応における参照用Ｄ
ＮＡのＤＮＡ断片の増幅効率を求めることが可能にな
る。このようにして求めた増幅効率は、識別対象となる
微生物のＤＮＡ断片においても適用可能である。したが
って、求めた増幅効率に基づいて識別対象となる微生物
のＤＮＡ断片の電気泳動像に対応する画像データを補正
し、ＤＮＡ断片の量を分析することが可能になる。

【００３０】各プライマーに対応する電気泳動像を得る
ステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を
得るステップと、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画
像データに変換するステップと、画像データに基づいて
ＤＮＡサイズマーカに対応する電気泳動像における輝度
分布を示す波形データを求めるステップと、ＤＮＡサイ
ズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象とな
る微生物に対応する波形データを補正するステップとを
さらに備えてもよい。

【００３１】波形データを補正するステップは、ＤＮＡ
サイズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象
となる微生物に対応する波形データにおけるピークの位
置を補正するステップを含んでもよい。

【００３２】電気泳動像の画像データにおいてバンドの
背景の輝度のむらを補正するステップをさらに備えても
よい。

【００３３】データベースには複数種類の微生物につい
ての電気泳動像に関する情報が記憶されてもよい。これ
により、識別対象となる種々の微生物を識別することが
できる。

【００３４】相関関係を求めるステップは、識別対象と
なる微生物について求められた波形データと照合対象と
なる微生物について求められた波形データとの相関係数
ＮＣを次式により算出するステップを含んでもよい。

【００３５】

【数５】

【００３６】式（１）において、Ｓ_iは識別対象となる
微生物の波形データのｉ番目の点における輝度値、ａ_i
は照合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点にお
ける輝度値であり、ｎは各波形データにおける点数であ
る。

【００３７】識別するステップは、相関係数ＮＣに基づ
いて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であ
るか否かを判定するステップを含んでもよい。

【００３８】相関関係を求めるステップは、識別対象と
なる微生物について求められた波形データの各点におけ
る輝度値および照合対象となる微生物について求められ
た波形データの対応する各点における輝度値のうち低い
方の輝度値を選択することによりクリッピング信号ＣＳ
を求めるステップと、クリッピング信号と照合対象とな
る微生物について求められた波形データとの相関係数Ｃ
Ｃを次式により算出するステップとを含んでもよい。

【００３９】

【数６】

【００４０】式（２）において、ＣＳ_iはクリッピング
信号ＣＳのｉ番目の点における輝度値、ａ_iは照合対象
となる微生物の波形データのｉ番目の点における輝度値
であり、ｎは各波形データにおける点数である。

【００４１】識別するステップは、相関係数ＣＣに基づ
いて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であ
るか否かを判定するステップを含んでもよい。

【００４２】第２の発明に係る微生物識別方法は、識別
対象となる微生物を識別する微生物識別方法であって、
複数のプライマーを準備し、複数のプライマーの各々を
用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱変成
工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラー
ゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメ
ラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、識別対
象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステッ
プと、複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮ
Ａ断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対
応する出力信号を得るステップと、出力信号に基づいて
各プライマーに対応する波形データを求めるステップ
と、照合対象となる微生物についての複数のプライマー
に対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデー
タベースを検索し、データベースに記憶された情報に基
づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマ
ーに対応する波形データを求め、識別対象となる微生物
について求められた波形データと照合対象となる微生物
について求められた波形データとの相関関係を求めるス
テップと、相関関係に基づいて識別対象となる微生物を
識別するステップとを備えたものである。

【００４３】本発明に係る微生物識別方法によれば、単
一の微生物および複数の微生物から構成される微生物群
のいずれを識別対象として用いる場合にも、微生物の識
別を行うことが可能となり、さらに同定を行うことも可
能となる。

【００４４】特に、微生物群を識別対象として用いる場
合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時
に識別し、さらに同定することが可能となる。このた
め、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名
を明らかにすることが可能となる。

【００４５】本発明の微生物識別方法は、微生物群と微
生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生
ごみ処理機の微生物群から得られた出力信号を示す波形
データと別の生ごみ処理機から得られた出力信号を示す
波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを
調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることが
できる。

【００４６】一方、単一の微生物を識別対象として用い
る場合においては、識別対象となる微生物とデータベー
スの照合対象となる微生物との多型を検出することも可
能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生
物を見いだすこともできる。

【００４７】ここで、この微生物識別方法においては、
複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
物のＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適
用し、識別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅して
ＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生物を単
離および培養する工程が不要となる。このため、容易に
識別および同定を行うことが可能になるとともに、単離
の困難な微生物の識別および同定も可能になる。また、
上記の複数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、
塩基配列が未知の識別対象に対して行うことが可能であ
るため、塩基配列の測定を行うことなく、識別対象とな
る微生物の識別および同定を行うことができる。

【００４８】さらに、この微生物識別方法においては、
複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反
応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用い
て識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ
連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリ
メラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識
別を安定して行うことが可能となる。

【００４９】出力信号に関する情報は、その出力信号の
強度を示す波形データであってもよい。

【００５０】出力信号に関する情報は、その出力信号の
強度におけるピークの位置およびピークの高さまたは面
積を示すデータであり、相関関係を求めるステップは、
出力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高
さまたは面積を示すデータに基づいて出力信号の強度を
示す波形データを求めるステップを含んでもよい。

【００５１】相関関係を求めるステップは、出力信号の
強度を示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形
データを求めるステップを含んでもよい。

【００５２】相関関係を求めるステップは、識別対象と
なる微生物について求められた複数のプライマーに対応
する波形データを連結し、かつ照合対象となる微生物に
ついて求められた複数のプライマーに対応する波形デー
タを連結し、識別対象となる微生物についての連結され
た波形データと照合対象となる微生物についての連結さ
れた波形データとの相関関係を求めるステップを含んで
もよい。

【００５３】これにより、識別対象となる微生物につい
て求められた複数のプライマーに対応する波形データと
照合対象となる微生物について求められた複数のプライ
マーに対応する波形データとの相関関係を容易かつ短時
間に求めることができる。

【００５４】相関関係に基づいて識別対象となる微生物
を識別するステップは、相関関係における相関係数を算
出し、算出された相関係数に基づいて識別対象となる微
生物が照合対象となる微生物であるか否かを判定するス
テップを含んでもよい。

【００５５】既知の塩基配列を有する参照用プライマー
を用いて、参照用プライマーの塩基配列に相補な塩基配
列を有する参照用ＤＮＡに対し、ポリメラーゼ連鎖反応
法を適用することにより、参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片を
増幅するステップと、参照用プライマーを用いて増幅さ
れた参照用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適
用し、参照用ＤＮＡに対応する出力信号を得るステップ
と、参照用ＤＮＡに対応する出力信号に基づいて識別対
象となる微生物に対応する出力信号を補正するステップ
とをさらに備えてもよい。

【００５６】この場合、参照用プライマーを用いたポリ
メラーゼ連鎖反応法により、参照用ＤＮＡからＤＮＡ断
片が確実に増幅される。このようにして増幅された参照
用ＤＮＡのＤＮＡ断片に対応する出力信号に基づいて、
ポリメラーゼ連鎖反応における参照用ＤＮＡのＤＮＡ断
片の増幅効率を求めることが可能になる。このようにし
て求めた増幅効率は、識別対象となる微生物のＤＮＡ断
片においても適用可能である。したがって、求めた増幅
効率に基づいて識別対象となる微生物のＤＮＡ断片に対
応する出力信号を補正し、ＤＮＡ断片の量を分析するこ
とが可能になる。

【００５７】ＤＮＡサイズマーカの出力信号を得るステ
ップと、出力信号に基づいてＤＮＡサイズマーカに対応
する出力信号の強度を示す波形データを求めるステップ
と、ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づい
て識別対象となる微生物に対応する波形データを補正す
るステップとをさらに備えてもよい。

【００５８】波形データを補正するステップは、ＤＮＡ
サイズマーカに対応する波形データに基づいて識別対象
となる微生物に対応する波形データにおけるピークの位
置を補正するステップを含んでもよい。

【００５９】データベースには複数種類の微生物につい
ての出力信号に関する情報が記憶されてもよい。これに
より、識別対象となる種々の微生物を識別することがで
きる。

【００６０】相関関係を求めるステップは、識別対象と
なる微生物について求められた波形データと照合対象と
なる微生物について求められた波形データとの相関係数
ＮＣを次式により算出するステップを含んでもよい。

【００６１】

【数７】

【００６２】式（１）において、Ｓ_iは識別対象となる
微生物の波形データのｉ番目の点における信号出力値、
ａ_iは照合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点
における信号出力値であり、ｎは各波形データにおける
点数である。

【００６３】識別するステップは、相関係数ＮＣに基づ
いて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であ
るか否かを判定するステップを含んでもよい。

【００６４】相関関係を求めるステップは、識別対象と
なる微生物について求められた波形データの各点におけ
る信号出力値および照合対象となる微生物について求め
られた波形データの対応する各点における信号出力値の
うち低い方の信号出力値を選択することによりクリッピ
ング信号ＣＳを求めるステップと、クリッピング信号と
照合対象となる微生物について求められた波形データと
の相関係数ＣＣを次式により算出するステップとを含ん
でもよい。

【００６５】

【数８】

【００６６】式（２）において、ＣＳ_iはクリッピング
信号ＣＳのｉ番目の点における信号出力値、ａ_iは照合
対象となる微生物の波形データのｉ番目の点における信
号出力値であり、ｎは各波形データにおける点数であ
る。

【００６７】識別するステップは、相関係数ＣＣに基づ
いて識別対象となる微生物が照合対象となる微生物であ
るか否かを判定するステップを含んでもよい。

【００６８】第３の発明に係る微生物識別装置は、識別
対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリ
ング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適
用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤ
ＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数の
プライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対し
て電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳
動像を得る電気泳動手段と、電気泳動手段により得られ
た各プライマーに対応する電気泳動像を画像データに変
換する画像データ変換手段と、画像データに基づいて各
プライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示
す波形データを求める波形データ生成手段と、照合対象
となる微生物についての複数のプライマーに対応する電
気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータベースを
検索し、データベースに記憶された情報に基づいて照合
対象となる微生物についての複数のプライマーに対応す
る電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求
め、識別対象となる微生物について求められた波形デー
タと照合対象となる微生物について求められた波形デー
タとの相関関係を作成する相関関係作成手段と、相関関
係作成手段により作成された相関関係に基づいて識別対
象となる微生物を識別する識別手段とを備えたものであ
る。

【００６９】本発明に係る微生物識別装置によれば、第
１の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができ
る。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構
成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合
にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同
定を行うことも可能となる。

【００７０】特に、微生物群を識別対象として用いる場
合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時
に識別し、さらに同定することが可能となる。このた
め、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名
を明らかにすることが可能となる。

【００７１】本発明の微生物識別装置は、微生物群と微
生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生
ごみ処理機の微生物群から得られた電気泳動像の輝度分
布を示す波形データと別の生ごみ処理機から得られた電
気泳動像の輝度分布を示す波形データとを比較すること
で、個々の微生物の違いを調べなくとも両者の微生物群
としての違いを見ることができる。

【００７２】一方、単一の微生物を識別対象として用い
る場合においては、識別対象となる微生物とデータベー
スの照合対象となる微生物との多型を検出することも可
能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生
物を見いだすこともできる。

【００７３】この微生物識別装置においては、複数のプ
ライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮ
Ａに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識
別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分
析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および
培養する工程が不要となる。このため、容易に識別およ
び同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な
微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複
数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列
が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、
塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物
の識別および同定を行うことができる。

【００７４】さらに、この微生物識別装置においては、
複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反
応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用い
て識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ
連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリ
メラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識
別を安定して行うことが可能となる。

【００７５】第４の発明に係る微生物識別装置は、識別
対象となる微生物を識別する微生物識別装置であって、
複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリ
ング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適
用することにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤ
ＮＡ断片を増幅する増幅手段と、増幅手段により複数の
プライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対し
て電気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信
号を得る電気泳動手段と、出力信号に基づいて各プライ
マーに対応する波形データを求める波形データ生成手段
と、照合対象となる微生物についての複数のプライマー
に対応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデー
タベースを検索し、データベースに記憶された情報に基
づいて照合対象となる微生物についての複数のプライマ
ーに対応する波形データを求め、識別対象となる微生物
について求められた波形データと照合対象となる微生物
について求められた波形データとの相関関係を作成する
相関関係作成手段と、相関関係作成手段により作成され
た相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別する
識別手段とを備えたものである。

【００７６】本発明に係る微生物識別装置によれば、第
２の発明に係る微生物識別方法を容易に行うことができ
る。そのため、単一の微生物および複数の微生物から構
成される微生物群のいずれを識別対象として用いる場合
にも、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに同
定を行うことも可能となる。

【００７７】特に、微生物群を識別対象として用いる場
合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時
に識別し、さらに同定することが可能となる。このた
め、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名
を明らかにすることが可能となる。

【００７８】本発明の微生物識別装置は、微生物群と微
生物群の間の比較に用いることもできる。例えばある生
ごみ処理機の微生物群から得られた出力信号を示す波形
データと別の生ごみ処理機から得られた出力信号を示す
波形データとを比較することで、個々の微生物の違いを
調べなくとも両者の微生物群としての違いを見ることが
できる。

【００７９】一方、単一の微生物を識別対象として用い
る場合においては、識別対象となる微生物とデータベー
スの照合対象となる微生物との多型を検出することも可
能となる。また、識別対象となる微生物と類似した微生
物を見いだすこともできる。

【００８０】この微生物識別装置においては、複数のプ
ライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮ
Ａに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応法を適用し、識
別対象となる微生物からＤＮＡ断片を増幅してＤＮＡ分
析を行うので、生化学検査のように微生物を単離および
培養する工程が不要となる。このため、容易に識別およ
び同定を行うことが可能になるとともに、単離の困難な
微生物の識別および同定も可能になる。また、上記の複
数のプライマーを用いたＤＮＡの増幅方法は、塩基配列
が未知の識別対象に対して行うことが可能であるため、
塩基配列の測定を行うことなく、識別対象となる微生物
の識別および同定を行うことができる。

【００８１】さらに、この微生物識別装置においては、
複数のプライマーを用いてそれぞれポリメラーゼ連鎖反
応法を行い、複数のポリメラーゼ連鎖反応の結果を用い
て識別を行うため、諸条件によって個々のポリメラーゼ
連鎖反応が良好に進まない場合においても、個々のポリ
メラーゼ連鎖反応の影響は小さい。このため、良好な識
別を安定して行うことが可能となる。

【００８２】第５の発明に係るコンピュータ読み取り可
能な記録媒体は、識別対象となる微生物を識別する微生
物識別プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能
な記録媒体であって、微生物識別プログラムは、複数の
プライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤ
ＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工
程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で
繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用する
ことにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断
片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅され
たＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより
得られた電気泳動像を画像データとして取り込む処理
と、画像データに基づいて各プライマーに対応する電気
泳動像における輝度分布を示す波形データを求める処理
と、照合対象となる微生物についての複数のプライマー
に対応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデ
ータベースを検索し、データベースに記憶された情報に
基づいて照合対象となる微生物についての複数のプライ
マーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す波形
データを求め、識別対象となる微生物について求められ
た波形データと照合対象となる微生物について求められ
た波形データとの相関関係を求める処理と、相関関係に
基づいて識別対象となる微生物を識別する処理とを、コ
ンピュータに実行させるものである。

【００８３】本発明に係る微生物識別プログラムを記録
した記録媒体によれば、第１の発明に係る微生物識別方
法を容易に行うことができる。

【００８４】第６の発明に係るコンピュータ読み取り可
能な記録媒体は、識別対象となる微生物を識別する微生
物識別プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能
な記録媒体であって、微生物識別プログラムは、複数の
プライマーの各々を用いて、識別対象となる微生物のＤ
ＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリング工
程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で
繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用する
ことにより、識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断
片を増幅し、複数のプライマーの各々を用いて増幅され
たＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用することにより
得られた出力信号を取り込む処理と、出力信号に基づい
て各プライマーに対応する波形データを求める処理と、
照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベ
ースを検索し、データベースに記憶された情報に基づい
て照合対象となる微生物についての複数のプライマーに
対応する波形データを求め、識別対象となる微生物につ
いて求められた波形データと照合対象となる微生物につ
いて求められた波形データとの相関関係を求める処理
と、相関関係に基づいて識別対象となる微生物を識別す
る処理とを、コンピュータに実行させるものである。

【００８５】本発明に係る微生物識別プログラムを記録
した記録媒体によれば、第２の発明に係る微生物識別方
法を容易に行うことができる。

【００８６】第７の発明に係る微生物識別用データベー
スの作成方法は、微生物を識別するために照合対象とな
る微生物のデータが格納されるデータベースの作成方法
であって、複数のプライマーを準備し、複数のプライマ
ーの各々を用いて、微生物のＤＮＡに対し、熱変成工
程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ
による伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラ
ーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、微生物の
ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプラ
イマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電
気泳動法を適用し、各プライマーに対応する電気泳動像
を得るステップと、各プライマーに対応する電気泳動像
を画像データに変換するステップと、画像データに基づ
いて各プライマーに対応する電気泳動像に関する情報を
求めるステップと、電気泳動像に関する情報を前記照合
用の微生物のデータとして記憶手段に格納するステップ
とを備えたものである。

【００８７】本発明に係るデータベース作成方法によれ
ば、第１の発明に係る微生物識別方法および第２の発明
に係る微生物識別装置に用いるデータベースを作成する
ことができる。また、微生物群としてのデータベースも
作成することができる。この場合、微生物群と運転状態
との対応がつけば、種々の運転状態の時の微生物群から
得た電気泳動像の輝度値分布を示す波形データをデータ
ベースとして持っておき、サンプルの電気泳動像の輝度
分布を示す波形データと比較することで、運転状態を予
測することが可能となる。

【００８８】第８の発明に係る微生物識別用データベー
スの作成方法は、微生物を識別するために照合対象とな
る微生物のデータが格納されるデータベースの作成方法
であって、複数のプライマーを準備し、複数のプライマ
ーの各々を用いて、微生物のＤＮＡに対し、熱変成工
程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ
による伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラ
ーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、微生物の
ＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、複数のプラ
イマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電
気泳動法を適用し、各プライマーに対応する出力信号を
得るステップと、出力信号に基づいて各プライマーに対
応する情報を求めるステップと、情報を前記照合用の微
生物のデータとして記憶手段に格納するステップとを備
えたものである。

【００８９】本発明に係るデータベース作成方法によれ
ば、第２の発明に係る微生物識別方法および第４の発明
に係る微生物識別装置に用いるデータベースを作成する
ことができる。また、微生物群としてのデータベースも
作成することができる。この場合、微生物群と運転状態
との対応がつけば、種々の運転状態の時の微生物群から
得た出力信号を示す波形データをデータベースとして持
っておき、サンプルの出力信号を示す波形データと比較
することで、運転状態を予測することが可能となる。

【００９０】第９の発明に係るデータベースを記録した
記録媒体は、微生物を識別するために照合対象となる微
生物のデータが格納されるデータベースを記録した記録
媒体であって、データベースは、第７または第８の発明
に係る作成方法により作成されたものである。

【００９１】本発明に係るデータベースを記録した記録
媒体は、第１および第２の発明に係る微生物識別方法お
よび第３および第４の発明に係る微生物識別装置に用い
ることができる。

【００９２】

【発明の実施の形態】図１は本発明に係る微生物識別装
置を示す図である。

【００９３】図１に示すように、微生物識別装置は、Ｓ
ＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力
部２、解析用コンピュータ３、データベース格納部４お
よび結果表示手段５からなる。

【００９４】ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１について
は後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣ
Ｄカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コン
ピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピ
ュータからなる。データベース格納部４はハードディス
ク装置等からなり、結果表示手段５はディスプレイ等か
らなる。

【００９５】なお、ＳＳＣ−ＰＣＲとはSingle Strain
Counting Polymerase Chain Reactionのことであり、特
定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩
基配列を有する微生物群または単一の微生物からＤＮＡ
断片を連鎖反応的に増幅する反応のことである。なお、
ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。

【００９６】図２は、図１の微生物識別装置を用いた微
生物識別方法の一例を示すフローチャートである。

【００９７】図２に示すように、まず図１のＳＳＣ−Ｐ
ＣＲ増幅・解析装置１を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ
法により、微生物の解析実験を行う（ステップＳ１）。
なお、この解析実験においては、単離した単一の微生物
をサンプルとして用いてもよく、また、複数の微生物を
含む微生物群をサンプルとして用いてもよい。

【００９８】ＳＳＣ−ＰＣＲ法による微生物の解析実験
の詳細を図３に示す。まず、図３に示すように、微生物
のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プラ
イマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ
₂ および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチ
ド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を
調製する（ステップＳ１−１）。

【００９９】なお、複数の微生物を含む微生物群をサン
プルとして用いる場合においては、複数の微生物のＤＮ
Ａが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液
を調製する。

【０１００】ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の
５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳
型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応
を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。ま
た、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するため
に不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短
鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩
基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。

【０１０１】なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法に
おいては複数のプライマーを用いるため、各々のプライ
マーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。な
お、各ＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとす
る。

【０１０２】上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と
同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコン
トロールを調製する（ステップＳ１−２）。

【０１０３】なお、この場合においては、ＳＳＣ−ＰＣ
Ｒ法において、長さが１２塩基対（ｂｐ）のプライマー
をそれぞれ用いている。それにより、各プライマーにお
いては、確率的に４¹²（約１０⁷ ）に１回ＤＮＡ断片が
出現するように調整することができ、一般に１本のＤＮ
Ａの長さが約１０⁷ 塩基対といわれている微生物ＤＮＡ
から１種類のＤＮＡ断片だけを増幅するように設定する
ことができる。このため、後述するように、増幅された
ＤＮＡ断片と微生物とを対応させることが可能となる。

【０１０４】ここで、ポジティブコントロールとは、後
述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる
誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料で
ある。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率
は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−Ｐ
ＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、
マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合
い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響
を受けると考えられる。このような誤差を除去するため
に、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ
断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプ
ライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する
鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコ
ントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動
法により定量することが可能である。したがって、ポジ
ティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量
から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。こ
のようにして求めた増幅効率をもとにして複数種類のＳ
ＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正するこ
とにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において
生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結
果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。

【０１０５】一方、ネガティブコントロールとは、増幅
されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群または微生
物のものであることを確認するためのコントロール実験
に用いる試料である。一般に、細菌等の微生物は空気中
等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ
用反応溶液の調製時において反応溶液に微生物が混入す
る可能性がある。微生物が反応溶液に混入した場合、増
幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする微生物群由来のＤ
ＮＡ断片かあるいは混入した微生物由来のＤＮＡ断片か
判別不可能となる。そのため、ネガティブコントロール
として、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳ
Ｃ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコン
トロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行
い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバ
ンドが現れないことを確認する。これにより、増幅され
たＤＮＡ断片が分析対象である微生物群または微生物由
来のものであることが確認できる。

【０１０６】なお、ポジティブコントロールおよびネガ
ティブコントロールに用いるプライマーは、前述のＳＳ
Ｃ−ＰＣＲ用反応溶液に用いたプライマーのうちの１つ
もしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。

【０１０７】上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶
液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１によ
り、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−
３）。

【０１０８】図４は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１
のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図４の
ＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持
プレート５０により構成される。

【０１０９】支持プレート５０の上面に複数の孔部５１
が形成されている。この場合には、複数の孔部５１に、
前述のプライマーをそれぞれ含むＳＳＣ−ＰＣＲ用反応
溶液がプライマーの増幅確率の順に連続的に配置され
る。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロ
ールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコ
ントロールが配置される。

【０１１０】このようなＤＮＡ断片増幅装置により、各
ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールお
よびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳ
ＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われ
る。

【０１１１】ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と
同様に、次の３段階の工程を繰り返し行う。ただし、Ｓ
ＳＣ−ＰＣＲ法では、未知の塩基配列を有する微生物ま
たは微生物群に対して特定の塩基配列を有するプライマ
ーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅
する。

【０１１２】（１）熱変性工程 ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本
鎖（ＤＮＡ鎖）にする。

【０１１３】（２）プライマーのアニーリング工程（プ
ライマーの結合工程） プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように
熱処理を行う。

【０１１４】（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程
（ポリメラーゼによる複製工程） プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を
合成し、２本鎖化する。

【０１１５】上記（１）〜（３）の工程を１サイクルと
してこのサイクルを繰り返し行う。第１のサイクルとし
て、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変
性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持する
プライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を
例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長
反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性
工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するため
に下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。

【０１１６】引続き、第２のサイクルとして、上記反応
溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記
反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーの
アニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で
３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
順序で例えば３３回繰り返す。

【０１１７】最後に、第３のサイクルとして、上記反応
溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記
反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーの
アニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分
間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序
で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反
応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第
２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも
長めに設定する。

【０１１８】ここで、上記第１のサイクル、第２のサイ
クルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第
２回目のサイクルを図５〜図７を用いて説明する。な
お、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプラ
イマーと結合する部分の塩基配列を示している。

【０１１９】図５〜図７では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣ
Ｇの塩基配列（配列番号１５）を有するプライマーを用
いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。

【０１２０】図５（ａ）に示すように最初、上記反応溶
液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ
（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全
ＤＮＡに着目して説明する。

【０１２１】最初に、図５（ｂ）に示すように、第１の
サイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程
より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮ
Ａ１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖
（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。

【０１２２】次に、図５（ｃ）に示すように、プライマ
ーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配
列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置
（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置
とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列
の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき
塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−
ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニー
ル温度を低く設定することにより、プライマーは、その
塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも
結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完
全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合するこ
とができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本
鎖に結合することもできる。なお、図５〜図７では、簡
単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべ
き塩基配列の位置に結合する場合を図示している。

【０１２３】続いて、図５（ｄ）に示すように、ポリメ
ラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長
反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って
１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３
ａ，１３ｂが形成される。

【０１２４】第２のサイクルの１回目のサイクルでは、
第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変
性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃお
よび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここ
では、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説
明する。

【０１２５】図６に示すように、熱変性工程で分離した
１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程で
プライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合す
る。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメ
ラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿っ
て１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとな
る。

【０１２６】その後、図７に示すように、第２のサイク
ルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３
ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなる
が、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着
目して説明する。

【０１２７】図７に示すように、熱変性工程で分離した
１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程
で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するよ
うに結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工
程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１
２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖
（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。

【０１２８】このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤ
ＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種
のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連
鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅
される。

【０１２９】その後、図３に示すように、ＳＳＣ−ＰＣ
Ｒ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティ
ブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶
液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）
ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤ
ＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分
画する（ステップＳ１−４）。

【０１３０】さらに、電気泳動法により得られた電気泳
動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線
照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−
６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このよ
うにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバ
ンド（帯）として現れる。

【０１３１】なお、ここで、ネガティブコントロールの
電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅された
ＤＮＡ断片が分析対象である微生物または微生物群由来
のものであることが確認できる。

【０１３２】続いて、図２に示すように、撮影した電気
泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナ
で解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取
り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて各プラ
イマーについての電気泳動像の輝度分布（発光強度分
布）を示す波形データを生成する（ステップＳ３）。

【０１３３】なお、上記の方法においては、電気泳動像
が歪んでいるために輝度分布を示す波形データを正確に
生成できない場合がある。したがって、このような電気
泳動像の歪みを補正するため、電気泳動像にアフィン変
換を含む種々の画像補正を行ってもよい。

【０１３４】ところで、上記の方法においては、電気泳
動像を染色する際に染色むらが生じるおそれがある。こ
のため、電気泳動像の背景にむらが生じるおそれがあ
る。電気泳動像の背景にむらが生じた場合には、電気泳
動像の輝度分布を正確に検出することができない。した
がって、生成された波形データの信頼性が低下する。

【０１３５】また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片
を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型Ｄ
ＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場
合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライ
マーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像におい
て再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プラ
イマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳
型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライ
マーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応に
おいては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳
型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率
が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増
幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低
く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低
いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によ
り得られたデータは全体の信頼性が低くなる。

【０１３６】そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られた
データの信頼性を向上させるために、解析コンピュータ
３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の輝度分
布を示す波形データの補正を行う（ステップＳ４）。

【０１３７】図８は波形データの補正の工程の一例を示
すフローチャートである。図８に示すように、波形デー
タの補正の工程（ステップＳ４）は以下の４つの工程
（Ｓ４−１〜Ｓ４−４）から構成される。

【０１３８】図８に示す一連の波形データの補正の工程
（ステップＳ４）においては、まず、電気泳動像の背景
むらの補正を行う（ステップＳ４−１）。以下、背景む
らの補正工程（ステップＳ４−１）について説明する。

【０１３９】図９（ａ）は、染色むらが生じたために背
景にむらが生じた電気泳動像を示す図である。図９
（ａ）においては、レーンＡおよびレーンＢにそれぞれ
３つのバンド〜，〜が表れている。この場合、
電気泳動像の対角線左上側の輝度が最も低く右下側が最
も高く、レーンＡ側の輝度がレーンＢ側の輝度に比べて
低くなっている。このため、図９（ｂ）に示す輝度分布
において、レーンＡおよびレーンＢの各バンド〜に
対応するピークのうち、特にレーンＢのバンド，の
ピークにおいて背景の輝度の影響が大きくなる。このよ
うに背景の輝度の影響が大きくなると、正確にバンド
〜に対応する輝度分布のピークを検出することができ
ない。

【０１４０】そこで、電気泳動像における背景の輝度の
影響を補正するために、図９（ｃ）に示すように、画像
処理により、レーンＡおよびレーンＢのバンド〜を
含む矩形領域を除去し、除去した矩形領域の周辺の輝度
に基づいて図９（ｄ）に示すように除去した矩形領域の
補間を行う。このようにして得られた図９（ｄ）に示す
電気泳動像の背景のデータをもとに、下記式（１）に基
づいて、背景の輝度の影響を取り除いたバンド〜に
対応する輝度分布の波形データを求める。

【０１４１】 Ｚ_new ＝Ｚ_max ・（Ｚ₁ −Ｚ₀ ）／（Ｚ_max −Ｚ₀ ） ・・・（１） なお、式（１）中のＺ_new は電気泳動像の補正後の輝度
分布における輝度値を示しており、Ｚ_max は電気泳動像
の輝度分布における最大輝度値を示し、Ｚ₀ は電気泳動
像の輝度分布における最小輝度値を示し、Ｚ₁ は電気泳
動像の輝度分布におけるある点の輝度値を示している。
（Ｚ₁ −Ｚ₀ ）／（Ｚ_max −Ｚ₀ ）によりある点の全体
に対する相対輝度の割合が得られ、これにＺ_max を乗算
することにより相対輝度が得られる。

【０１４２】また、全体的にむらの少ない場合には、各
サンプルのレーンの輝度値から対応するネガティブコン
トロールの輝度値を引き算したり、各レーンに隣接する
レーン間隙の輝度値を引き算することによって、補正す
ることも可能である。

【０１４３】以上のようにして電気泳動像における背景
のむらを補正することにより、背景の輝度の影響を除去
して、電気泳動像の輝度分布を示す波形データを正確に
生成することが可能となる。

【０１４４】図８に示すように、輝度分布を示す波形デ
ータにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光
強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発
光強度とを比較することにより、ポジティブコントロー
ルにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこ
の定量した値を用いてＤＮＡ断片増幅反応の増幅効率を
求める。この増幅効率に基づいて各ＳＳＣ−ＰＣＲ用反
応溶液の波形データの輝度を補正する（ステップＳ４−
２）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件
等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去さ
れる。なお、ここでの発光強度とは、輝度分布における
ピークの高さのことである。

【０１４５】また、ポジティブコントロールの定量方法
としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収
量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。

【０１４６】さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカの
バンドの発光強度を基準として用い、複数種類のＳＳＣ
−ＰＣＲ用反応溶液に対応する波形データの輝度を補正
する。このようにして、電気泳動像の波形データの補正
を行う（ステップＳ４−３）。

【０１４７】一般に、エチジウムブロマイド染色時の染
色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得ら
れる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、
濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に
基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うこと
により、このような誤差を除去することができる。

【０１４８】続いて、ＤＮＡサイズマーカの波形データ
に基づいて以下に示す軸合わせおよび濃度調整を行う
（ステップＳ４−４）。なお、上記のような画像補正
は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。

【０１４９】図１０（ａ），（ｂ）は電気泳動像の例を
示す図である。図１０（ａ），（ｂ）において、レーン
１，８は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を示してい
る。また、レーン２〜７およびレーン９〜１４は、１２
種類の各プライマーにおける電気泳動像をそれぞれ示し
ている。

【０１５０】なお、上記において、図１０（ａ）はゲル
Ａを用いて電気泳動させた場合の電気泳動像を示してお
り、図１０（ｂ）はゲルＢを用いて電気泳動させた場合
の電気泳動像を示している。

【０１５１】ゲルＡおよびゲルＢは同一種類のゲルであ
り、いずれのゲルを用いる場合においても電気泳動の条
件は同一とする。また、ゲルＡ上およびゲルＢ上で電気
泳動させるＤＮＡサイズマーカ（レーン１，８）として
は同一のものを用いている。

【０１５２】ここで、図１０（ａ）に示されたＤＮＡサ
イズマーカの電気泳動像（レーン１）と図１０（ｂ）に
示されたＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の（レーン
８）とを比較すると明らかなように、同一のＤＮＡサイ
ズマーカを異なるゲル上（この場合はゲルＡ上およびゲ
ルＢ上）で電気泳動させる場合においては、同一のもの
を同一の条件で電気泳動させたにもかかわらず、同一サ
イズのバンドが各ゲル上においてそれぞれ異なる位置に
現れる。

【０１５３】このように、電気泳動に用いるゲルが異な
ると、同一の条件で電気泳動させたにもかかわらず、用
いたゲルによりバンドの移動度が異なってくる。このた
め、異なるゲル間においては、バンドの位置とＤＮＡサ
イズとの関係が異なる。そこで、本例においては、以下
の方法により、異なるゲル間でも波形データの比較が可
能となるように、波形データの標準化を行う。この波形
データの標準化を軸合わせと呼ぶ。

【０１５４】波形データの軸合わせを行う方法として
は、ＤＮＡサイズマーカの波形データに基づいて所定の
変換式のパラメータを決定し、この変換式に基づいて各
ゲルごとに波形データを補正する。このような変換式と
しては、例えば以下の式（２）を用いる。

【０１５５】 ｙ＝ｍ１＋ｌｏｇ（ｍ２−ｍ３・ｘ）/（ｍ４−ｍ５・ｘ） ・・・（２） ここで、式（２）中のｘは電気泳動のスタート位置から
の距離、すなわち泳動距離（画素/１０００ )を示して
おり、ｙはＤＮＡのサイズを対数値（ｌｏｇ（ｂｐ））
で示している。

【０１５６】図１１（ａ）は、図１０（ａ）に示したゲ
ルＡについて、ＤＮＡサイズマーカの各バンドをプロッ
トしたものである。また、図１１（ｂ）は、図１０
（ｂ）に示したゲルＢについて、ＤＮＡサイズマーカの
各バンドをプロットしたものである。

【０１５７】図１１（ａ）および図１１（ｂ）の各点の
ｘおよびｙの値を用いて最小二乗法により、ゲルＡおよ
びゲルＢの各々について各パラメータｍ１、ｍ２、ｍ
３、ｍ４およびｍ５を求める。この場合においては、例
えば下記表１に示すようなパラメータｍ１、ｍ２、ｍ
３、ｍ４およびｍ５がゲルＡおよびゲルＢについて求め
られる。

【０１５８】

【表１】

【０１５９】求めた各パラメータｍ１〜ｍ５を代入した
変換式（２）により表される曲線とＤＮＡサイズマーカ
の各バンドをプロットした点との相関係数は、ゲルＡお
よびゲルＢともに０．９９９８６となる。図１１（ａ）
および（ｂ）に示すように、ＤＮＡサイズマーカの各バ
ンドの点はほぼ変換式（２）で表される曲線上にのる。

【０１６０】図１２（ａ）は上記の変換式（２）による
軸合わせを行う前のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の
輝度分布を示す波形データを示す図であり、図１２
（ｂ）は上記の変換式（２）による軸合わせを行ったの
ちのＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示す
波形データを示す図である。図１２において、太線はゲ
ルＡにおけるＤＮＡサイズマーカの波形データであり、
細線はゲルＢにおけるＤＮＡサイズマーカの波形データ
である。

【０１６１】図１２（ａ）に示すように、同一のＤＮＡ
サイズマーカを用いて同一の条件で電気泳動を行った場
合においても、異なるゲル間（ゲルＡおよびゲルＢ）に
おいては、波形データのピーク（バンドに相当）が異な
る位置に現れる。これは、前述のように、異なるゲル間
（ゲルＡおよびゲルＢ）においては、バンドの移動度に
差が生じるためである。

【０１６２】そこで、前述の図１１に示す方法により、
ゲルＡおよびゲルＢにおいてそれぞれパラメータｍ１〜
ｍ５を求めるとともに、各ゲルにおいて求めたパラメー
タｍ１〜ｍ５を代入した変換式（２）に基いて波形デー
タの軸合わせを行う。その結果、図１２（ｂ）に示すよ
うに、ゲルＡおよびゲルＢを用いた場合の波形データの
ピークの位置を一致させることができる。

【０１６３】図１３（ａ）は、上記の変換式（２）によ
る軸合わせを行う前のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像
の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての
電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図であ
る。また、図１３（ｂ）は、上記の変換式（２）による
軸合わせを行った後のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像
の輝度分布を示す波形データおよびある細菌についての
電気泳動像の輝度分布を示す波形データを示す図であ
る。さらに、図１３（ｃ）は、後述する濃度調整を行っ
た後のＤＮＡサイズマーカの電気泳動像の輝度分布を示
す波形データおよびある細菌についての電気泳動像の輝
度分布を示す波形データを示す図である。

【０１６４】図１３（ａ），（ｂ），（ｃ）には、図１
０（ａ）に示すゲルＡを用いた場合の波形データおよび
ゲルＢを用いた場合の波形データが示される。

【０１６５】図１３（ａ）に示すように、ゲルＡおよび
ゲルＢを用いて電気泳動を行った場合、ＤＮＡサイズマ
ーカおよび細菌の電気泳動像の輝度分布を示す波形デー
タにおいてピークが異なる位置に現れる。

【０１６６】そこで、上記の波形データの軸合わせを行
うと、図１３（ｂ）に示すように、ゲルＡおよびゲルＢ
を用いた場合の波形データのピークの位置を一致させる
ことができる。

【０１６７】この場合、図１１（ａ），（ｂ）からわか
るように、泳動距離の中間付近（軸合わせ前の４００付
近）では、泳動距離とＤＮＡサイズとの関係が直線に近
いが、両端では、泳動距離とＤＮＡサイズとの関係が直
線にならず、泳動距離に対するＤＮＡサイズの変化量が
増大する。これにより、変換式（２）に基いて波形デー
タの軸合わせを行うと、波形データの両端に近い領域に
おいて「引き伸ばし」が起こり、ピークの幅が広くな
る。その結果、波形データの両端に近い領域においてピ
ークの面積が大きくなる。このピークの面積は、ＤＮＡ
の濃度に相当する。そこで、軸合わせ前の波形データと
ピークの面積が等しくなるように、軸合わせ後の波形デ
ータのピークの高さを補正する。この補正を濃度調整と
呼ぶ。

【０１６８】ここで、濃度調整の方法を説明する。上記
の軸合わせにおいて変換式（２）のパラメータｍ１〜ｍ
５を確定する。確定したパラメータｍ１〜ｍ５を代入し
た変換式（２）をｙ＝ｆ（ｘ）とする。次に、変換式
（２）の１次微分（傾き）ｙ’＝ｆ’（ｘ）を求める。
さらに、変換式（２）の２次微分ｙ”＝ｆ（ｘ）を求め
る。そして、２次微分が０となる変曲点ｘ０を求める。
変曲点ｘ０における傾きｆ’（ｘ０）から各点での引き
伸ばし率ｆ’（ｘ）／ｆ”（ｘ０）を求める。波形デー
タの各点での輝度値を引き伸ばし率ｆ’（ｘ）／ｆ”
（ｘ０）で割る。これにより、波形データの両端に近い
領域においてピークの高さが低減され、図１３（ｃ）に
示すように、ピークの面積が軸合わせ前と等しくなるよ
うに補正される。

【０１６９】このようにして、軸合わせおよび濃度調整
を行うことにより、ゲルの違いによるバンドの移動度の
差を補正することが可能となり、異なるゲル間において
も波形データを標準化することが可能となる。

【０１７０】なお、上記においては、図１１に示すよう
に、各ゲル上のＤＮＡサイズマーカのバンドの泳動距離
をｘとするとともにＤＮＡサイズの対数値をｙとして上
記の変換式（２）に基づいて最小二乗法によりパラメー
タｍ１〜ｍ５を求める場合について説明したが、波形デ
ータの標準化のための変換式は泳動距離とＤＮＡサイズ
との関係を近似することができれば、任意の変換式を用
いることができる。例えば、平方根、立方根、整関数等
を含む式を変換式として用いてもよい。

【０１７１】上記のようにしてＤＮＡサイズマーカの波
形データの軸合わせおよび濃度調整を行った後、ゲルＡ
およびゲルＢ上のレーン２〜７，９〜１４の各プライマ
ーの波形データについても、上記と同様の方法により、
各ゲルについて求めたパラメータｍ１〜ｍ５を用いて変
換式（２）により軸合わせおよび濃度調整を行う。それ
により、異なるゲルを用いて電気泳動を行ったプライマ
ーの全ての波形データを標準化することができる。

【０１７２】なお、上記のような波形データの標準化
は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。

【０１７３】図１４（ａ）は図１０（ａ）に示すゲルＡ
上で電気泳動させた６種類のプライマー（レーン２〜
７）の波形データを示す図である。また、図１４（ｂ）
はゲルＢ上で電気泳動させた６種類のプライマー（レー
ン９〜１４）の波形データを示す図である。なお、波形
データにおけるピークの高さはバンド強度に相当する。

【０１７４】上記のような波形データの補正を行った
後、図２に示すように、複数のプライマーについての波
形データを連結する（ステップＳ５）。例えば、上記の
ようにして作成した図１４（ａ）に示すレーン２〜７の
各プライマーの波形データを連結し、サンプルの微生物
の波形データとする。同様に、図１４（ｂ）に示すレー
ン９〜１４の各プライマーの波形データを連結し、サン
プルの微生物の波形データとする。

【０１７５】なお、図１の微生物識別装置の解析用コン
ピュータ３において、このようにして作成されたサンプ
ルの微生物の波形データは、後述するように、データ格
納部４（図１）に格納されたデータベース中の微生物の
波形データとの比較に用いられる。

【０１７６】次に、上記のようにして作成したサンプル
の微生物の波形データに基づいてサンプルの微生物の識
別・同定を行う方法について説明する。

【０１７７】図１５（ａ）はサンプルの微生物に図２に
示すステップＳ１およびステップＳ２の工程により得ら
れた電気泳動像の一例を示す図である。

【０１７８】なお、図１５（ａ）において、レーン１は
ＤＮＡサイズマーカＭの電気泳動像を示しており、レー
ン２はプライマーｐ０１における電気泳動像を示してお
り、レーン３はプライマーｐ０３における電気泳動像を
示しており、レーン４はプライマーｐ０４における電気
泳動像を示しており、レーン５はプライマーｐ０６にお
ける電気泳動像を示しており、レーン６はプライマーｐ
０７における電気泳動像を示している。

【０１７９】図１５（ｂ）は、図１５（ａ）に示す各プ
ライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７につ
いて、図２に示すステップＳ３からステップＳ５の工程
により得られた波形データを示す図である。図１５
（ｂ）に示すように、各プライマーｐ０１，ｐ０３，ｐ
０４，ｐ０６，ｐ０７の波形データが連結されて１つの
波形データが作成されている。

【０１８０】続いて、図２に示すように、解析用コンピ
ュータ３（図１）を用いて、サンプルの微生物の波形デ
ータ（図１５（ｂ））に基づいて、データベース格納部
４のデータベースを検索する（ステップＳ６）。

【０１８１】以下に、データベース検索（ステップＳ
６）の詳細について、順を追って説明する。

【０１８２】図１に示すように、微生物識別装置のデー
タベース格納部４のデータベースには、生化学検査等に
より同定された複数の微生物の各々に関して、ＳＳＣ−
ＰＣＲのデータ、例えば、複数のプライマーについての
波形データおよび電気泳動像の画像データが登録されて
いる。

【０１８３】データベースに登録されている微生物の波
形データの一例を図１６（ａ）に示す。図１６（ａ）に
おいては、Escherichia coli（大腸菌）（以下、E.coli
と略記する）およびBacillus subtilis （枯草菌）（以
下、B.sub と略記する）についてのプライマーｐ０１〜
ｐ０７に関する波形データが示されている。

【０１８４】データベース格納部４には、上記に示すE.
coli（大腸菌）およびB.sub （枯草菌）以外の微生物に
ついても、上記のような波形データが登録されている。

【０１８５】図１６（ｂ）は、サンプルの微生物の波形
データとの比較のために、データベース格納部４に格納
されているE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）および
Staphylococcus aureus （黄色ブドウ球菌）（以下、S.
aur と略記する）の波形データからプライマーｐ０１，
ｐ０３，ｐ０４，ｐ０６，ｐ０７に関する波形データを
抽出して連結したものである。

【０１８６】なお、データベースに一部のプライマーの
データがなかった場合には、ピークなしの波形データと
して連結された波形データを作成するか、あるいはサン
プルと同じピークを補って連結された波形データを作成
する。前者のようにピークなしの波形データとして連結
された波形データを作成する場合においては、後述の相
関係数が小さくなる。一方、後者のようにサンプルと同
じピークを補って連結された波形データを作成する場合
においては、後述の相関係数が大きくなる。

【０１８７】図１６（ｂ）に示すE.coli（大腸菌）、B.
sub （枯草菌）およびS.aur （黄色ブドウ球菌）以外の
データベースに登録されている複数の微生物について
も、それぞれ図１６（ｂ）に示すような連結された波形
データを作成する。

【０１８８】さらに、図１７に示すように、上記におい
て作成した図１５（ａ）に示すサンプルの微生物の波形
データと、図１６（ａ）に示すようなデータベース格納
部４に格納されている複数の既知の微生物の波形データ
とを比較し、両者の相関関係を調べる。

【０１８９】ここでは、一例として、サンプルの微生物
の波形データとE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）お
よびS.aur （黄色ブドウ球菌）の波形データとを比較し
た場合について説明する。

【０１９０】図１７に示すように、サンプルの微生物の
波形データとE.coli（大腸菌）、B.sub （枯草菌）およ
びS.aur （黄色ブドウ球菌）の波形データとを比較して
サンプルの微生物の波形データと各微生物の波形データ
との相関係数を計算する。この例では、E.coli（大腸
菌）との間の相関係数は０．５６８となり、B.sub （枯
草菌）との間の相関係数は０．３６８となり、S.aur
（黄色ブドウ球菌）との間の相関係数は０．１２１とな
る。相関係数が１に近いほど相関関係が高い。

【０１９１】したがって、波形データより求めた相関係
数から、サンプルの微生物はE.coli（大腸菌）である確
率が最も高い。このように、サンプルの微生物の波形デ
ータとデータベース格納部４に格納された各微生物の波
形データとを比較することにより、サンプルの微生物を
識別することが可能となる。なお、このような相関係数
の計算は、解析用コンピュータ３（図１）を用いて行
う。

【０１９２】最後に、図２に示すように、結果表示手段
５（図１）により、微生物の名称を相関係数の高い順に
検索結果として表示する（ステップＳ７）。

【０１９３】なお、必要に応じて以下の工程（ステップ
Ｓ８）を設けてもよい。例えば、図２に示すように、画
像データの比較等による確認の工程を設けてもよい。こ
の工程においては、検索結果として表示された微生物が
サンプルの微生物と同一であること、あるいはサンプル
を構成する微生物の１つであることを以下のような方法
により確認する。

【０１９４】例えば、サンプルの微生物の電気泳動像の
画像データを読み出すとともに、検索された微生物の電
気泳動像の画像データをデータベース格納部４から読み
出し、両者の電気泳動像の画像データの比較を行っても
よい。また、サンプルの微生物の波形データと検索され
た微生物の波形データとの相関図を表示することによ
り、両者の相関の状態を調べてもよい。これらの方法に
より、検索結果の確認を行うことが可能となる。

【０１９５】また、データベースへの登録工程を設けて
もよい。この工程は、単一の微生物をサンプルに用いて
波形データの検索を行った結果、データベースに同じ微
生物の波形データが存在しないことが明らかとなった場
合に、このサンプルの微生物に関する波形データを新た
にデータベース格納部４のデータベースに登録するもの
である。それにより、検索可能な微生物の範囲がより広
がる。

【０１９６】また、パラメータ等を変更して再び検索を
行う工程を設けてもよい。この工程においては、例え
ば、データベース検索の工程（ステップＳ６）において
説明した相関係数の計算方法を変更し、再検索を行う。
それにより、サンプルの微生物に適した検索を行って結
果を得ることができる。

【０１９７】ここで、サンプルに単一の微生物を用いて
１種類の微生物が検索された場合においては、サンプル
の微生物の波形データと検索された微生物の波形データ
との間の不一致ピークが、サンプルの微生物と検索され
た微生物との区別を可能にする多型（異なる性質）に相
当する可能性がある。一方、サンプルが複数の微生物の
混合物である場合、サンプルの微生物の波形データと検
索された微生物の波形データとの間の不一致ピークは、
データベースに登録されていない微生物のバンドである
可能性が高い。このように、不一致ピークはサンプルの
微生物に関する重要な情報となり得るので、データとし
て残すことが好ましい。

【０１９８】なお、上記においては、各プライマーにお
ける波形データを連結して１つの波形データを作成して
いるが、各プライマーにおける波形データを個々に比較
してもよい。この場合においては、各プライマーについ
て相関係数を求めるとともに、求められた各相関係数の
平均を求めてサンプルの微生物を識別する。

【０１９９】以上のような本発明に係る微生物識別方法
によれば、単一の微生物および複数の微生物から構成さ
れる微生物群のいずれをサンプルとして用いる場合にお
いても、微生物の識別を行うことが可能となり、さらに
同定を行うことも可能となる。

【０２００】特に、微生物群をサンプルとして用いる場
合においては、微生物群を構成する複数の微生物を同時
に識別し、さらに同定することが可能となる。このた
め、微生物群を構成する微生物の種類の数および種類名
を明らかにすることが可能となる。この方法によれば、
１００種類程度の微生物を同時に識別することが可能と
なる。

【０２０１】一方、単一の微生物をサンプルとして用い
る場合においては、サンプルの微生物とデータベースの
微生物との多型を検出することも可能となる。また、サ
ンプルの微生物と類似した微生物を見い出すこともでき
る。

【０２０２】ここで、この微生物識別方法においては、
ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの微生物（または微生物
群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように微生
物を単離および培養する工程が不要となる。この方法に
よれば、混在する多数の微生物を数時間で識別すること
が可能となる。このため、容易に識別および同定を行う
ことが可能になる。また、このような方法においては、
単離が困難な微生物の識別および同定も可能になる。さ
らに、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対
して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行う
ことなくサンプルの微生物の識別および同定を行うこと
ができる。

【０２０３】したがって、この微生物識別方法は全ての
微生物に適用可能であり、さらに、この方法によれば、
微生物の種の違いだけでなく、株の違いまで検出するこ
とが可能となる。

【０２０４】さらに、この微生物識別方法においては、
複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ反応を行い、
複数のＰＣＲ反応の結果を用いて分析を行うため、諸条
件によって個々のＰＣＲ反応が良好に進まない場合にお
いても、個々のＰＣＲ反応の影響は小さい。このため、
良好な分析を安定して行うことが可能となる。

【０２０５】例えば、上記の微生物識別方法を生ごみ処
理機の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物
に適用することにより、生ごみ処理機の処理槽内または
土壌中の微生物を同定することができる。また、この結
果にしたがって生ごみ処理機の処理槽の条件を変えるこ
とにより、生ごみの処理を良好に行えるとともに良好な
肥料を作製することができる。

【０２０６】実際に生ゴミ処理機の菌叢に本発明に上記
の微生物識別方法を適用した結果、生ゴミ処理機には約
４０種類の微生物が存在して菌叢を構成しており、この
菌叢は経時的に変化することが明らかとなった。また、
処理状態が良好な生ゴミ処理機においては２０〜３０種
類の微生物が処理槽内に定着することが明らかとなっ
た。

【０２０７】さらに、このような微生物識別方法は、水
銀、砒素、ダイオキシン、環境ホルモン等の有害な汚染
物質に汚染された土壌、食品等の発見、およびこれらの
汚染状態を知るのに有効である。すなわち、この微生物
識別方法により検索された微生物の中に汚染物質に関係
のある微生物が含まれている場合には、微生物を採取し
た土壌等にこの汚染物質が含まれる可能性が示唆され
る。また、汚染物質に関係のある微生物の存在の程度に
より、汚染状態が示唆される。

【０２０８】大便・唾液・たんなどからの病原性細菌の
検出、水質浄化設備などの移動状況の把握なども可能で
ある。

【０２０９】図１８は図１の解析用コンピュータ３とし
て用いられるパーソナルコンピュータの構成を示すブロ
ック図である。

【０２１０】図１８のパーソナルコンピュータは、ＣＰ
Ｕ（中央演算処理装置）３１０、ディスプレイ３２０、
入力装置３３０、ＲＯＭ（リードオンリメモリ）３４
０、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３５０、記録媒
体駆動装置３６０、スキャナ３７０および外部記憶装置
３８０を備える。

【０２１１】ディスプレイ３２０は、液晶表示パネル、
ＣＲＴ（陰極線管）等からなり、図１の結果表示手段５
として用いられる。入力装置３３０は、キーボード、マ
ウス等からなり、各種データおよび各種指令を入力する
ために用いられる。ＲＯＭ３４０にはシステムプログラ
ムが記憶される。

【０２１２】記録媒体駆動装置３６０は、ＣＤ−ＲＯＭ
ドライブ、フロッピィディスクドライブ等からなり、Ｃ
Ｄ−ＲＯＭ、フロッピィディスク等の記録媒体３９０に
対してデータの読み書きを行う。記録媒体３９０には、
図２の微生物識別方法におけるステップＳ２〜Ｓ８の処
理を行う微生物識別プログラムが記録されている。

【０２１３】スキャナ３７０はＣＣＤカメラにより撮影
された電気泳動像を画像データとして入力し、外部記憶
装置３８０に格納する。スキャナ３７０は図１の電気泳
動イメージ入力部２として働く。

【０２１４】外部記憶装置３８０は、ハードディスク装
置等からなり、記録媒体駆動装置３６０を介して記録媒
体３９０から読み込まれた微生物識別プログラムを記憶
する。また、外部記憶装置３８０は、上記のデータベー
スを記憶する。図１のデータベース格納部４は外部記憶
装置３６０により構成される。ＣＰＵ３１０は、外部記
憶装置３８０に記憶された微生物識別プログラムをＲＡ
Ｍ３５０上で実行する。

【０２１５】なお、微生物識別プログラムを記録する記
録媒体３９０として、ＲＯＭ等の半導体メモリ、ハード
ディスク等の種々の記録媒体を用いることができる。ま
た、微生物識別プログラムを通信回線等の通信媒体を介
して外部記憶装置３６０にダウンロードし、ＲＡＭ３５
０上で実行してもよい。この場合、通信媒体が記録媒体
に相当する。

【０２１６】本実施の形態では、図１のＳＳＣ−ＰＣＲ
増幅・解析装置１が増幅手段に相当し、電気泳動イメー
ジ入力部２が画像データ変換手段に相当し、解析用コン
ピュータ３が波形データ生成手段、相関関係作成手段お
よび識別手段を構成する。

【０２１７】なお、データベース格納部４に格納される
データベースは、照合対象となる微生物について図２の
ステップＳ１〜Ｓ４の処理を行うことにより作成され
る。

【０２１８】本実施の形態では、データベース格納部４
に電気泳動像の輝度分布を示す波形データが格納されて
いるが、データベース格納部４に電気泳動像の輝度分布
におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を
示すデータを格納してもよい。この場合には、解析用コ
ンピュータ３がデータベース格納部４に格納された電気
泳動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの
高さまたは面積を示すデータに基づいて電気泳動像の輝
度分布を示す波形データを作成し、サンプルの微生物に
ついての電気泳動像の輝度分布を示す波形データと比較
して相関係数を計算する。例えば、データベース格納部
４に格納された電気泳動像の輝度分布におけるピークの
位置およびピークの高さまたは面積に基づいて個々のピ
ークをガウス関数、デルタ関数、矩形等で表現する。

【０２１９】また、データベース格納部４に電気泳動像
を示す画像データを格納してもよい。この場合には、解
析用コンピュータ３がデータベース格納部４に格納され
た電気泳動像の画像データに基づいて電気泳動像の輝度
分布を示す波形データを作成し、サンプルの微生物につ
いての電気泳動像の輝度分布を示す波形データと比較し
て相関係数を計算する。

【０２２０】一般的に、電気泳動法としては、大きく分
けて２種類の方法が知られている。アガロースゲル等の
平板ゲルを用いる方法と、ゲルを詰めた細管（キャピラ
リ）を用いる方法とがある。ＤＮＡ断片の分離の原理
は、いずれの方法でも同じであり、大きな分子はゲル内
を移動しにくく、小さな分子ほど移動しやすいことを利
用している。

【０２２１】平板ゲル法では、一定時間の電気泳動後の
ＤＮＡ断片の移動距離を画像データから測定するのに対
して、細管法では、ＤＮＡ断片が一定距離の細管を通っ
て出てくるまで、あるいは細管中で一定距離を移動する
までの時間をセンサを用いて測定している。なお、平板
ゲルを用いてＤＮＡ断片が一定距離を移動する時間をセ
ンサにより測定する場合もあり、あるいは細管に沿って
センサを並べておいてＤＮＡ断片の一定時間の移動距離
を測定することも可能である。

【０２２２】図１９は細管型の電気泳動装置を用いた微
生物識別装置を示すブロック図である。図１９の微生物
識別装置が図１の微生物識別装置と異なるのは、電気泳
動イメージ入力部２の代わりに電気泳動・信号検出装置
２ａが設けられている点である。電気泳動・信号検出装
置２ａは、細管型の電気泳動装置を含む。この電気泳動
・信号検出装置２ａでは、例えばＤＮＡ断片を蛍光色素
で染色し、ゲルを詰めた細管に、その色素を励起させる
波長の光を発光する発光部とその光を受光する受光部と
を対応させて設けることにより、電気泳動法を実行して
いる最中に受光部からＤＮＡ断片の移動に応じた出力信
号を得ることができる。

【０２２３】図２０は図１９の電気泳動・信号検出装置
２ａにより得られるセンサ出力波形の一例を示す図であ
る。図２０の横軸は、ＤＮＡ断片の移動時間であり、縦
軸はセンサの信号強度である。マーカー１および２は、
標準化のために用いられる。ＤＮＡ断片１〜４は増幅さ
れたＤＮＡ断片である。センサの信号強度を示す波形デ
ータを標準化することにより、図１の微生物識別装置と
同様の方法で微生物の識別を行うことができる。

【０２２４】以下の実施例では、平板ゲルを用いて電気
泳動を行った結果を画像データとして採取し、その画像
データを波形データに加工したが、図１９の微生物識別
装置を用いる場合には、細管型の電気泳動装置から直接
波形データを得ることができる。

【０２２５】

【実施例】［実施例１］実施例１においては、以下に示
す１６種類の細菌についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮ
Ａの分析を行い、得られた結果に基づいて波形データを
作成した。さらに、この１６種類の細菌の波形データを
検索用の波形データとしてデータベースに登録した。以
下に、詳細について説明する。

【０２２６】１．データベースの作成 １６種類の細菌のＤＮＡ分析 ここでは、まず表２に示す１６種類の細菌を用意すると
ともに、各細菌の染色体ＤＮＡを調製してＳＳＣ−ＰＣ
Ｒ用反応溶液の調製を行った。

【０２２７】

【表２】

【０２２８】なお、各細菌の染色体ＤＮＡはCurrent Pr
otocols in Molecular Biology (published by Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience) の2.
4.1〜2.4.2 に記載の“Preparation of Genomic DNA fr
om Bacteria”の方法に従って調製した。

【０２２９】次に、上記のようにして調製した反応溶液
を用いて、PE Applied BiosystemのPCR System 9700お
よび三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０に
より、以下に示すＳＳＣ−ＰＣＲ法で各細菌についてＤ
ＮＡ分析を行った。

【０２３０】本実施例のＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、
１６種類のプライマー（配列番号１〜１６）を用いた。
なお、以下においては、配列番号１のプライマーをＰ０
１、配列番号２のプライマーをＰ０２と表し、以下、配
列番号３から配列番号１６のプライマーまでを同様にし
てＰ０３〜Ｐ１６と表すものとする。

【０２３１】本実施例のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応
溶液の組成を表３に示す。

【０２３２】

【表３】

【０２３３】表３において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのＴｒｉ
ｓは、Tris(hydroxymethyl)aminomethane の略である。
ｄＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ(2--デオキシアデノシン-5--
三燐酸）、ｄＣＴＰ(2--デオキシシチジン- 5-- 三燐
酸) 、ｄＧＴＰ(2--デオキシグアノシン-5--三燐酸) 、
ｄＴＴＰ(2--デオキシチミジン-5--三燐酸) の等濃度混
合溶液である。反応溶液量は２０μＬとした。

【０２３４】ここでは、１６種類の細菌の各々につい
て、プライマーとして配列番号１〜１６の各プライマー
（Ｐ０１〜Ｐ１６）をそれぞれ含む１６種類のＳＳＣ−
ＰＣＲ用反応溶液を同時に調製した。また、配列番号１
のプライマー（Ｐ０１）とこれに対応する塩基配列を有
する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロ
ールとして、また、配列番号１のプライマー（Ｐ０１）
を含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコント
ロールとして各細菌の１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応
溶液と同時に調製した。

【０２３５】次に、１６種類の細菌の各々について、上
記のようにして調製した１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反
応溶液を図４に示すＤＮＡ断片増幅装置の孔部５１にそ
れぞれ収納するとともに、孔部５１ａおよび孔部５１ｂ
にネガティブコントロールおよびポジティブコントロー
ルをそれぞれ収納した。このＤＮＡ断片増幅装置を用い
てＳＳＣ−ＰＣＲを行った。ＳＳＣ−ＰＣＲのサイクル
を表４に示す。

【０２３６】

【表４】

【０２３７】続いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポ
ジティブコントロールおよびネガティブコントロールの
１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動法で分析した。
電気泳動条件は、３．６Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、
この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドサ
イズを測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡ
サイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Smart Ladde
r）を反応溶液と同時に電気泳動させた。

【０２３８】電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド
染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときのエチ
ジウムブロマイド蛍光像をポラロイド（登録商標）カメ
ラまたはＣＣＤカメラで撮影した。

【０２３９】各プライマーについての波形データの生
成 次に、１６種類の細菌の各々について、電気泳動写真を
スキャナでコンピュータに取込んだ後、電気泳動像の画
像データから、ソフトウェア（Genomic Solutions Adva
nced Quantifier 1-D Match ）を用いて、ＤＮＡサイズ
マーカの電気泳動像の輝度分布を示す波形データ、各プ
ライマーについての電気泳動像の輝度分布を示す波形デ
ータ、ポジティブコントロールについての電気泳動像の
輝度分布を示す波形データおよびネガティブコントロー
ルについての電気泳動像の輝度分布を示す波形データを
生成した。

【０２４０】ここでは、ネガティブコントロールの電気
泳動像においてバンドが検出されなかった。このことか
ら、現れたバンドはサンプルとして用いた細菌由来のも
のであることが確認できた。

【０２４１】この場合においては、行っていないが、電
気泳動像の歪みを補正するためにアフィン変換を行って
もよい。

【０２４２】また、ポジティブコントロールのバンドの
発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正して
もよい。例えば、測定したポジティブコントロールのバ
ンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発
光強度が１００％になるように補正するとともに、他の
バンドの発光強度も同様の割合で補正する。これによ
り、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差が
ＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することがで
きる。

【０２４３】また、各々の電気泳動像の画像データにお
いて、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００
ｂｐのバンドの発光強度が１００％になるような割合で
補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同
様の割合で補正を行ってもよい。このように画像データ
の階調の補正を行うことにより、各々の画像データにお
ける階調の誤差を除去することができる。

【０２４４】各プライマーについての波形データの補
正 各プライマーについての波形データに対して図２に示し
た波形データの補正（ステップＳ４）を行った。ここで
は、図８のステップＳ４−１の背景むらの補正ならびに
ステップＳ４−４の軸合わせおよび濃度調整を行った。

【０２４５】なお、前述のように、この場合において
は、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジテ
ィブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他の
バンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮ
Ａサイズマーカの発光強度による補正は行わなかった。

【０２４６】各プライマーについての波形データの連
結 細菌ごとに１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６につい
ての波形データをデータベースに登録した。そして、細
菌ごとに１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６について
の波形データを連結した。細菌ごとの１６種類のプライ
マーＰ０１〜Ｐ１６についての連結された波形データを
図２１に示す。

【０２４７】２．単離した単一細菌をサンプルとして用
いた場合のデータ検索 ここでは、単一細菌をサンプルとしてを用いた検索をテ
ストするために、単離した細菌E.coli（大腸菌）につい
て前述のＳＳＣ−ＰＣＲを行ってＤＮＡの分析を再度行
い、１６種類のプライマーＰ０１〜Ｐ１６について得ら
れたサンプルの波形データを連結した。

【０２４８】サンプルの細菌の１６種類のプライマーＰ
０１〜Ｐ１６についての連結された波形データを図２２
に示す。

【０２４９】３．相関係数の計算 この場合においては、図２３に示すように、サンプルか
ら作成した波形データとデータベースから作成した１６
種類の細菌についての波形データとを比較し、相関係数
を次式により求めた。

【０２５０】 Ｒ_a,s ＝Σａ_n ・Ｓ_n ／｛√(Σａ_n ²)√(ΣＳ_n ²)｝ ここで、Ｒ_a,s はデータベース中の微生物ａとサンプル
Ｓの相関係数、ａ_n はデータベース中の微生物の波形デ
ータのｎポイント目の輝度値、Ｓ_n はサンプルＳの微生
物の波形データのｎポイント目の輝度値である。

【０２５１】なお、相関係数の計算は、本発明者がMicr
osoft Visual Basicで作成したソフ３トウェアを用いて
行った。上記のようにして相関係数を計算したところ、
細菌E.coli K12Ga（大腸菌）の相関係数が最も１に近か
った。このように、サンプルの細菌をデータベースから
検索することが可能であった。

【０２５２】［実施例２］次に、実施例２においては、
実施例１と同様の方法によりEscherichia coli K12 (E.
coli K12)およびSalmonella enteritidis GTC 131 (S.e
nteritidis GTC 131)を含む混合サンプルおよび４種類
の細菌について配列番号１７のプライマー（プライマー
Ａ８７）を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析
を行った。ここで、プライマーＡ８７の塩基配列は、AA
GTCGTTTGGGである。

【０２５３】得られた結果に基づいて波形データを作成
した。４種類の細菌の波形データを検索用の波形データ
としてデータベースに登録した。

【０２５４】さらに、混合サンプルの波形データとデー
タベースに登録された図２４に示す４種類の細菌の波形
データＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４との相関係数を求めた。
図２４には、混合サンプルの波形データＳ、Escherichi
a coli K12の波形データＤ１、Salmonella enteritidis
GTC 131の波形データＤ２、Vibrio chorelae GTC 37の
波形データＤ３およびBacillus subtilis ATCC 6051の
波形データＤ４が示される。

【０２５５】本実施例では、まず、次式（１）によりノ
ーマル相関係数を算出した。

【０２５６】

【数９】

【０２５７】上式（１）において、ＮＣはノーマル相関
係数であり、Ｓ_iはサンプルに含まれる細菌の波形デー
タのｉポイント目の輝度値、ａ_iはデータベースに登録
された波形データのｉポイント目の輝度値である。ま
た、ｎは各波形データのポイント数である。

【０２５８】また、以下に示す方法により算出されるク
リッピング信号を用いて相関係数を算出した。クリッピ
ング信号を用いて算出される相関係数をクリッピング相
関係数と呼ぶ。

【０２５９】図２５は混合サンプルの波形データとEsch
erichia coli K12の波形データとのクリッピング信号の
算出方法を説明するための図である。

【０２６０】図２５（ａ）はEscherichia coli K12およ
びSalmonella enteritidis GTC 131を含む混合サンプル
の波形データＳを示し、図２５（ｂ）はEscherichia co
li K12の波形データＤ１を示す。図２５（ａ）の波形デ
ータＳおよび図２５（ｂ）の波形データＤ１を重ね合わ
せると、図２５（ｃ）のようになる。

【０２６１】次に、ＣＳ_i＝ｍｉｎ(Ｓ_i,Ｄ１_i)によりク
リッピング信号ＣＳを求める。ここで、Ｓ_iは波形デー
タＳのｉポイント目の輝度値、Ｄ１_iは波形データＤ１
のｉポイント目の輝度値である。ｉは任意の整数であ
る。また、ｍｉｎ(Ｓ_i,Ｄ１_i)は波形データＳのｉポイ
ント目の輝度値および波形データＤ１のｉポイント目の
輝度値のうち低い方の輝度値を選択することを意味す
る。ＣＳ_iはクリッピング信号ＣＳのｉポイント目の輝
度値である。このようにして求めたクリッピング信号Ｃ
Ｓを図２５（ｄ）に示す。

【０２６２】図２６は混合サンプルの波形データとSalm
onella enteritidis GTC 131の波形データとのクリッピ
ング信号の算出方法を説明するための図である。

【０２６３】図２６（ａ）はEscherichia coli K12およ
びSalmonella enteritidis GTC 131を含む混合サンプル
の波形データＳを示し、図２６（ｂ）はSalmonella ent
eritidis GTC 131の波形データＤ２を示す。図２６
（ａ）の波形データＳおよび図２６（ｂ）の波形データ
Ｄ２を重ね合わせると、図２６（ｃ）のようになる。

【０２６４】次に、ＣＳ_i＝ｍｉｎ(Ｓ_i,Ｄ２_i)によりク
リッピング信号ＣＳを求める。ここで、Ｓ_iは波形デー
タＳのｉポイント目の輝度値、Ｄ２_iは波形データＤ２
のｉポイント目の輝度値である。また、ｍｉｎ(Ｓ_i,Ｄ
２_i)は波形データＳのｉポイント目の輝度値および波形
データＤ２のｉポイント目の輝度値のうち低い方の輝度
値を選択することを意味する。ＣＳ_iはクリッピング信
号ＣＳのｉポイント目の輝度値である。このようにして
求めたクリッピング信号ＣＳを図２６（ｄ）に示す。

【０２６５】次に、次式（２）によりクリッピング相関
係数を算出した。

【０２６６】

【数１０】

【０２６７】上式（２）において、ＣＣはクリッピング
相関係数であり、ＣＳ_iはクリッピング信号のｉポイン
ト目の輝度値、ａ_iはデータベースに登録された波形デ
ータのｉポイント目の輝度値である。また、ｎは各波形
データのポイント数である。

【０２６８】ここでは、図２５（ｂ）のEscherichia co
li K12の波形データＤ１および図２５（ｄ）のクリッピ
ング信号ＣＳを用いて上式（２）から混合サンプルの波
形データＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１と
のクリッピング相関係数ＣＣを求めた。また、図２６
（ｂ）のSalmonella enteritidis GTC 131の波形データ
Ｄ２および図２６（ｄ）のクリッピング信号ＣＳを用い
て上式（２）から混合サンプルの波形データＳとSalmon
ella enteritidis GTC 131の波形データＤ２とのクリッ
ピング相関係数ＣＣを算出した。

【０２６９】比較のために、同様の方法で混合サンプル
の波形データＳと図２４のVibrio chorelae GTC 37の波
形データＤ３とのクリッピング相関係数ＣＣを算出し、
混合サンプルの波形データＳと図２４のBacillus subti
lis ATCC 6051の波形データＤ４とのクリッピング相関
係数ＣＣを算出した。

【０２７０】表５に混合サンプルの波形データＳとEsch
erichia coli K12の波形データＤ１、Salmonella enter
itidis GTC 131の波形データＤ２、Vibrio chorelae GT
C 37の波形データＤ３およびBacillus subtilis ATCC 6
051の波形データＤ４とのノーマル相関係数ＮＣおよび
クリッピング相関係数ＣＣの算出結果を示す。

【０２７１】

【表５】

【０２７２】表５に示すように、混合サンプルの波形デ
ータＳとEscherichia coli K12の波形データＤ１とのノ
ーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣな
らびに混合サンプルの波形データＳとSalmonella enter
itidis GTC 131の波形データＤ２とのノーマル相関係数
ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣは、混合サンプル
の波形データＳとVibrio chorelae GTC 37の波形データ
Ｄ３とのノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関
係数ＣＣならびに混合サンプルの波形データＳとBacill
us subtilis ATCC 6051の波形データＤ４とのノーマル
相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣに比べて
高くなっている。

【０２７３】この結果から、混合サンプルには、Escher
ichia coli K12およびSalmonella enteritidis GTC 131
が含まれていることがわかる。

【０２７４】また、クリッピング相関係数ＣＣはノーマ
ル相関係数ＮＣに比べて高くなっている。例えば、例え
ば、０．５のクリッピング相関係数ＣＣを判定のしきい
値とすることにより、混合サンプルに含まれている異な
る種類の細菌の各々を高精度で識別することができる。

【０２７５】［実施例３］次に、実施例３においては、
実施例１と同様の方法により６種類の細菌についてプラ
イマーＡ８７を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの
分析を行った。得られた結果に基づいて波形データを作
成した。６種類の細菌の波形データを検索用の波形デー
タとしてデータベースに登録した。さらに、データベー
スに登録された図２７に示す６種類の細菌の波形データ
Ｅ１〜Ｅ６同士のノーマル相関係数およびクリッピング
相関係数を求めた。

【０２７６】図２７には、Escherichia coli K12の波形
データＥ１、Escherichia coli GTC837 (EAggEC)の波形
データＥ２、Escherichia coli GTC 1062 (ETEC)の波形
データＥ３、Salmonella enteritidis GTC 131 の波形
データＥ４、Vibrio chorelae GTC 37の波形データＥ５
およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形データＥ６
が示される。ここで、Escherichia coli（大腸菌）の後
のK12 、GTC 837およびGTC 1062は異なる株を表してい
る。

【０２７７】図２８に上記の６種類の細菌の波形データ
Ｅ１〜Ｅ６同士のノーマル相関係数およびクリッピング
相関係数の算出結果を示す。図２８の横軸は、Escheric
hiacoli K12 (E.coli K12)、Escherichia coli GTC 837
(E.coli GTC 837)、Escherichia coli GTC 1062 (E.co
li GTC 1062)、Salmonella enteritidis GTC 131 (S.en
teritidis GTC 131)、Vibrio chorelae GTC 37 (V.chor
elae GTC 37)およびBacillus subtilis ATCC 6051 (B.s
ubtilis ATCC 6051)であり、棒グラフは横軸の各細菌の
波形データと６種類の細菌の波形データＥ１〜Ｅ６との
ノーマル相関係数およびクリッピング相関係数を示す。
例えば、黒で塗りつぶされた棒グラフは、Escherichia
coli K12の波形データＥ１と６種類の細菌の波形データ
Ｅ１〜Ｅ６とのノーマル相関係数およびクリッピング相
関係数を示す。

【０２７８】同じ細菌の波形データ同士のノーマル相関
係数およびクリッピング相関係数は、いずれも１．０と
なっている。

【０２７９】また、Escherichia coliの異なる株の波形
データ同士のクリッピング相関係数は０．５以上となっ
ている。これに対して、Escherichia coliの各株の波形
データとSalmonella enteritidis GTC 131、Vibrio cho
relae GTC 37およびBacillus subtilis ATCC 6051の波形
データとのノーマル相関係数およびクリッピング相関係
数は低くなっている。したがって、大腸菌の各株を識別
することができるとともに、大腸菌とサルモネラ菌、ビ
ブリオ菌および枯草菌とを区別することができる。

【０２８０】［実施例４］次に、実施例４においては、
実施例１と同様の方法によりEscherichia coli（大腸
菌）の６種類の株についてプライマーＡ８７を用いてＳ
ＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。得られた
結果に基づいて波形データを作成した。６種類の株の波
形データを検索用の波形データとしてデータベースに登
録した。

【０２８１】図２９には、Escherichia coliの６種類の
株JCM1649、IFO 3301 (K12)、BL21、GIFU 11097 (EIE
C)、GTC 1062(ETEC) およびGTC 1059 (EHEC)の波形デー
タを示す。

【０２８２】また、図２９に示すように、データベース
に登録されたEscherichia coliの６種類の株の波形デー
タを混合することによりEscherichia coliの６種類の株
が混合された波形データを作成し、検索用の波形データ
としてデータベースに登録した。

【０２８３】さらに、データベースに登録されたEscher
ichia coliの６種類の株が混合された波形データとデー
タベースに登録されたEscherichia coliの６種類の株の
各々の波形データとのノーマル相関係数ＮＣおよびクリ
ッピング相関係数ＣＣを算出した。図２９にノーマル相
関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数ＣＣの算出結果
を示す。

【０２８４】図２９に示すように、Escherichia coliの
６種類の株が混合された波形データとEscherichia coli
の６種類の株の各々の波形データとのクリッピング相関
係数ＣＣはほぼ１となっている。したがって、同じ大腸
菌の異なる複数の株を含むサンプルから個々の株を識別
することができる。

【０２８５】また、実施例１と同様の方法により図３０
に示すEscherichia coliの４種類の株のサンプルおよび
Shigellaの４種類のサンプルについてプライマーＡ８７
を用いてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行っ
た。得られた結果に基づいて波形データを作成した。Es
cherichia coliの４種類の株の波形データおよびShigel
laの４種類の株の波形データを検索用の波形データとし
てデータベースに登録した。

【０２８６】図３０には、Escherichia coliの４種類の
株JM109、GTC 837 (EAggEC)、IFO 3366およびIFO 13500
の波形データおよびShigellaの４種類の血清boydii GTC
779、flexneri GTC 780、sonnei GTC 781およびdysent
eriae GTC 786の波形データが示される。ここで、Shige
llaの後のboydii、flexneri、 sonneiおよびdysenteria
eは種名を表し、GTC 779、GTC 780、GTC 781およびGTC
786は株を表す。

【０２８７】さらに、データベースに登録された図２９
に示したEscherichia coliの６種類の株が混合された波
形データと図３０に示したEscherichia coliの４種類の
株の波形データおよびShigellaの４種類の波形データと
のノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数Ｃ
Ｃを算出した。

【０２８８】図３０に、Escherichia coliの６種類の株
が混合された波形データとEscherichia coliの４種類の
株の波形データおよびShigellaの４種類の波形データと
のノーマル相関係数ＮＣおよびクリッピング相関係数Ｃ
Ｃの算出結果を示す。

【０２８９】図３０に示すように、Escherichia coliの
６種類の株が混合された波形データとEscherichia coli
の異なる４種類の株の各々の波形データとのクリッピン
グ相関係数ＣＣは１に近くなっている。したがって、デ
ータベースに登録された大腸菌の複数の株が混合された
波形データを用いて同じ大腸菌の異なる株を検出するこ
とも可能である。

【０２９０】また、Escherichia coliの６種類の株が混
合された波形データとShigellaの４種類の各々の波形デ
ータとのクリッピング相関係数ＣＣも１に近くなってい
る。したがって、データベースに登録された大腸菌の複
数の株が混合された波形データを用いて生物学的に近縁
関係にある赤痢菌を検出することも可能である。

【０２９１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sanyo Electric Co., Ltd. <120> Method of Discriminating Microorganisms, Apparatus for Discriminat ing Microorganisms, Method of Making Database for Discriminating Microor ganisms and Record Medium for recording Microorganism Discriminating Pro gram <130> NAR1016029 <160> 16 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gacctgcgat ct 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gagcaggaat at 12 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aagtcgtttg gg 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gacgcccatt at 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tcgtccggag at 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 actgagatag ca 12 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttgagtagtt gc 12 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 taacaaccga gc 12 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 cgcttcgtag ca 12 <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tattgggatt gg 12 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gatggtccgt tt 12 <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 agagctgaag ta 12 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tacgatatgg ct 12 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gtggatctga at 12 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ggcttcgaat cg 12 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 ttcaccaacg ag 12 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 aagtcgtttg gg 12

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る微生物識別装置の一例を示す模式
図である。

【図２】本発明に係る微生物識別方法の一例を示すフロ
ーチャートである。

【図３】図２の微生物識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ
法の一例を示すフローチャートである。

【図４】図３のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増
幅装置の例を示す模式図である。

【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の
過程を示す模式図である。

【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１
回目のサイクル中の過程を示す模式図である。

【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２
回目のサイクル中の過程を示す模式図である。

【図８】図２の微生物識別方法に用いる波形データの補
正の工程を示すフローチャートである。

【図９】電気泳動像における背景むらの補正を示す模式
図である。

【図１０】異なるゲルを用いた電気泳動像の例を示す図
である。

【図１１】異なるゲルを用いた場合の泳動距離とＤＮＡ
サイズとの変換式を説明するための図である。

【図１２】電気泳動像の輝度分布を示す波形データの軸
合わせを説明するための図である。

【図１３】電気泳動像の輝度分布を示す波形データの軸
合わせおよび濃度調整を説明するための図である。

【図１４】図１０の電気泳動像から生成された波形デー
タを示す図である。

【図１５】異なるプライマーを用いた電気泳動像の一例
および連結された波形データの一例を示す図である。

【図１６】データベースに登録された細菌ごとの波形デ
ータおよびデータベースから抽出されて連結された波形
データの一例を示す図である。

【図１７】サンプルから作成された波形データおよびデ
ータベースから作成された波形データを示す図である。

【図１８】図１の解析用コンピュータとして用いられる
パーソナルコンピュータの構成を示すブロック図であ
る。

【図１９】細管型の電気泳動装置を用いた微生物識別装
置のブロック図である。

【図２０】図１９の細管型の電気泳動装置により得られ
るセンサ出力波形の一例を示す図である。

【図２１】データベースから作成された連結された波形
データを示す図である。

【図２２】サンプルから作成された連結された波形デー
タを示す図である。

【図２３】データベースから作成された波形データとサ
ンプルから作成された波形データとの比較による相関係
数の計算を説明するための図である。

【図２４】実施例２における混合サンプルおよび４種類
の細菌の波形データを示す図である。

【図２５】混合サンプルの波形データとEscherichia co
li K12の波形データとのクリッピング信号の算出方法を
説明するための図である。

【図２６】混合サンプルの波形データとSalmonella ent
eritidis GTC 131の波形データとのクリッピング信号の
算出方法を説明するための図である。

【図２７】実施例３における６種類の細菌の波形データ
を示す図である。

【図２８】６種類の細菌同士のノーマル相関係数および
クリッピング相関係数の算出結果を示す図である。

【図２９】実施例４における大腸菌の６種類の株の波形
データおよびこれらの波形データが混合された波形デー
タを示す図である。

【図３０】大腸菌の４種類の株および赤痢菌の４種類の
波形データを示す図である。

【符号の説明】

１ ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置 ２ 電気泳動イメージ入力部 ３ 解析用コンピュータ ４ データベース格納部 ５ 結果表示手段 １１ ＤＮＡ １２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ １本鎖 １３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ ２本鎖 ２１ａ，２１ｂ，２１ｃ プライマー ５０ 支持プレート ５１，５１ａ，５１ｂ 孔部

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３２５Ｂ ３２５Ｄ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA04 EA04 HA11 HA19 4B029 AA23 BB20 CC08 4B063 QA01 QQ05 QQ41 QR32 QR55 QR62 QS34 4D054 FA10 FB20 5B075 ND20 UU19

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 識別対象となる微生物を識別する微生物
   識別方法であって、 複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各
   々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱
   変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメ
   ラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポ
   リメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前
   記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅す
   るステップと、 前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ
   断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応
   する電気泳動像を得るステップと、 各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに
   変換するステップと、 前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記
   電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求める
   ステップと、 照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
   応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータ
   ベースを検索し、前記データベースに記憶された情報に
   基づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプ
   ライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す
   波形データを求め、前記識別対象となる微生物について
   求められた前記波形データと前記照合対象となる微生物
   について求められた前記波形データとの相関関係を求め
   るステップと、 前記相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識
   別するステップとを備えたことを特徴とする微生物識別
   方法。
2. 【請求項２】 前記電気泳動像に関する情報は、電気泳
   動像の輝度分布を示す波形データであることを特徴とす
   る請求項１記載の微生物識別方法。
3. 【請求項３】 前記電気泳動像に関する情報は、電気泳
   動像の輝度分布におけるピークの位置およびピークの高
   さまたは面積を示すデータであり、 前記相関関係を求めるステップは、前記電気泳動像の輝
   度分布におけるピークの位置およびピークの高さまたは
   面積を示すデータに基づいて電気泳動像の輝度分布を示
   す波形データを求めるステップを含むことを特徴とする
   請求項１記載の微生物識別方法。
4. 【請求項４】 前記電気泳動像に関する情報は、電気泳
   動像を示す画像データであり、 前記相関関係を求めるステップは、前記電気泳動像を示
   す画像データに基づいて電気泳動像の輝度分布を示す波
   形データを求めるステップを含むことを特徴とする請求
   項１記載の微生物識別方法。
5. 【請求項５】 既知の塩基配列を有する参照用プライマ
   ーを用いて、前記参照用プライマーの塩基配列に相補な
   塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラー
   ゼ連鎖反応法を適用することにより、前記参照用ＤＮＡ
   のＤＮＡ断片を増幅するステップと、 前記参照用プライマーを用いて増幅された前記参照用Ｄ
   ＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、前記参
   照用ＤＮＡに対応する電気泳動像を得るステップと、 前記参照用ＤＮＡに対応する前記電気泳動像を画像デー
   タに変換するステップと、 前記参照用ＤＮＡに対応する画像データに基づいて前記
   識別対象となる微生物に対応する画像データを補正する
   ステップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれかに記載の微生物識別方法。
6. 【請求項６】 各プライマーに対応する電気泳動像を得
   るステップと同時に、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像
   を得るステップと、 前記ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を画像データに変
   換するステップと、 前記画像データに基づいてＤＮＡサイズマーカに対応す
   る電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求め
   るステップと、 前記ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づい
   て前記識別対象となる微生物に対応する波形データを補
   正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求
   項１〜５のいずれかに記載の微生物識別方法。
7. 【請求項７】 前記電気泳動像の画像データにおいてバ
   ンドの背景の輝度のむらを補正するステップをさらに備
   えたことを特徴とする請求項６記載の微生物識別方法。
8. 【請求項８】 前記データベースには複数種類の微生物
   についての前記電気泳動像に関する情報が記憶されたこ
   とを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物
   識別方法。
9. 【請求項９】 前記相関関係を求めるステップは、前記
   識別対象となる微生物について求められた前記波形デー
   タと前記照合対象となる微生物について求められた前記
   波形データとの相関係数ＮＣを次式により算出するステ
   ップを含み、 【数１】 式（１）において、Ｓ_iは前記識別対象となる微生物の
   波形データのｉ番目の点における輝度値、ａ_iは前記照
   合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点における
   輝度値であり、ｎは各波形データにおける点数であり、 前記識別するステップは、前記相関係数ＮＣに基づいて
   前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物
   であるか否かを判定するステップを含むことを特徴とす
   る請求項１〜８のいずれかに記載の微生物識別方法。
10. 【請求項１０】 前記相関関係を求めるステップは、 前記識別対象となる微生物について求められた前記波形
    データの各点における輝度値および前記照合対象となる
    微生物について求められた前記波形データの対応する各
    点における輝度値のうち低い方の輝度値を選択すること
    によりクリッピング信号ＣＳを求めるステップと、 前記クリッピング信号と前記照合対象となる微生物につ
    いて求められた前記波形データとの相関係数ＣＣを次式
    により算出するステップとを含み、 【数２】 式（２）において、ＣＳ_iは前記クリッピング信号ＣＳ
    のｉ番目の点における輝度値、ａ_iは前記照合対象とな
    る微生物の波形データのｉ番目の点における輝度値であ
    り、ｎは各波形データにおける点数であり、 前記識別するステップは、前記相関係数ＣＣに基づいて
    前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物
    であるか否かを判定するステップを含むことを特徴とす
    る請求項１〜９のいずれかに記載の微生物識別方法。
11. 【請求項１１】 識別対象となる微生物を識別する微生
    物識別方法であって、 複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各
    々を用いて、識別対象となる微生物のＤＮＡに対し、熱
    変成工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメ
    ラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポ
    リメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、前
    記識別対象となる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅す
    るステップと、 前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ
    断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応
    する出力信号を得るステップと、 前記出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形デ
    ータを求めるステップと、 照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
    応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベ
    ースを検索し、前記データベースに記憶された情報に基
    づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプラ
    イマーに対応する波形データを求め、前記識別対象とな
    る微生物について求められた前記波形データと前記照合
    対象となる微生物について求められた前記波形データと
    の相関関係を求めるステップと、 前記相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識
    別するステップとを備えたことを特徴とする微生物識別
    方法。
12. 【請求項１２】 前記出力信号に関する情報は、前記出
    力信号の強度を示す波形データであることを特徴とする
    請求項１１記載の微生物識別方法。
13. 【請求項１３】 前記出力信号に関する情報は、前記出
    力信号の強度におけるピークの位置およびピークの高さ
    または面積を示すデータであり、 前記相関関係を求めるステップは、前記出力信号の強度
    におけるピークの位置およびピークの高さまたは面積を
    示すデータに基づいて出力信号の強度を示す波形データ
    を求めるステップを含むことを特徴とする請求項１１記
    載の微生物識別方法。
14. 【請求項１４】 前記相関関係を求めるステップは、前
    記出力信号の強度を示すデータに基づいて出力信号の強
    度を示す波形データを求めるステップを含むことを特徴
    とする請求項１１記載の微生物識別方法。
15. 【請求項１５】 既知の塩基配列を有する参照用プライ
    マーを用いて、前記参照用プライマーの塩基配列に相補
    な塩基配列を有する参照用ＤＮＡに対し、前記ポリメラ
    ーゼ連鎖反応法を適用することにより、前記参照用ＤＮ
    ＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、 前記参照用プライマーを用いて増幅された前記参照用Ｄ
    ＮＡのＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、前記参
    照用ＤＮＡに対応する出力信号を得るステップと、 前記参照用ＤＮＡに対応する出力信号に基づいて前記識
    別対象となる微生物に対応する出力信号を補正するステ
    ップとをさらに備えたことを特徴とする請求項１１〜１
    ４のいずれかに記載の微生物識別方法。
16. 【請求項１６】 ＤＮＡサイズマーカの出力信号を得る
    ステップと、 前記出力信号に基づいてＤＮＡサイズマーカに対応する
    出力信号の強度を示す波形データを求めるステップと、 前記ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基づい
    て前記識別対象となる微生物に対応する波形データを補
    正するステップとをさらに備えたことを特徴とする請求
    項１１〜１５のいずれかに記載の微生物識別方法。
17. 【請求項１７】 前記データベースには複数種類の微生
    物についての前記出力信号に関する情報が記憶されたこ
    とを特徴とする請求項１１〜１６のいずれかに記載の微
    生物識別方法。
18. 【請求項１８】 前記相関関係を求めるステップは、前
    記識別対象となる微生物について求められた前記波形デ
    ータと前記照合対象となる微生物について求められた前
    記波形データとの相関係数ＮＣを次式により算出するス
    テップを含み、 【数３】 式（１）において、Ｓ_iは前記識別対象となる微生物の
    波形データのｉ番目の点における信号出力値、ａ_iは前
    記照合対象となる微生物の波形データのｉ番目の点にお
    ける信号出力値であり、ｎは各波形データにおける点数
    であり、 前記識別するステップは、前記相関係数ＮＣに基づいて
    前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物
    であるか否かを判定するステップを含むことを特徴とす
    る請求項１１〜１７のいずれかに記載の微生物識別方
    法。
19. 【請求項１９】 前記相関関係を求めるステップは、 前記識別対象となる微生物について求められた前記波形
    データの各点における信号出力値および前記照合対象と
    なる微生物について求められた前記波形データの対応す
    る各点における信号出力値のうち低い方の信号出力値を
    選択することによりクリッピング信号ＣＳを求めるステ
    ップと、 前記クリッピング信号と前記照合対象となる微生物につ
    いて求められた前記波形データとの相関係数ＣＣを次式
    により算出するステップとを含み、 【数４】 式（２）において、ＣＳ_iは前記クリッピング信号ＣＳ
    のｉ番目の点における信号出力値、ａ_iは前記照合対象
    となる微生物の波形データのｉ番目の点における信号出
    力値であり、ｎは各波形データにおける点数であり、 前記識別するステップは、前記相関係数ＣＣに基づいて
    前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微生物
    であるか否かを判定するステップを含むことを特徴とす
    る請求項１１〜１７のいずれかに記載の微生物識別方
    法。
20. 【請求項２０】 前記相関関係を求めるステップは、前
    記識別対象となる微生物について求められた複数のプラ
    イマーに対応する前記波形データを連結し、かつ前記照
    合対象となる微生物について求められた複数のプライマ
    ーに対応する前記波形データを連結し、前記識別対象と
    なる微生物についての連結された波形データと前記照合
    対象となる微生物についての連結された波形データとの
    相関関係を求めるステップを含むことを特徴とする請求
    項１〜１９のいずれかに記載の微生物識別方法。
21. 【請求項２１】 前記相関関係に基づいて前記識別対象
    となる微生物を識別するステップは、前記相関関係にお
    ける相関係数を算出し、前記算出された相関係数に基づ
    いて前記識別対象となる微生物が前記照合対象となる微
    生物であるか否かを判定するステップを含むことを特徴
    とする請求項１〜２０のいずれかに記載の微生物識別方
    法。
22. 【請求項２２】 前記波形データを補正するステップ
    は、前記ＤＮＡサイズマーカに対応する波形データに基
    づいて前記識別対象となる微生物に対応する波形データ
    におけるピークの位置を補正するステップを含むことを
    特徴とする請求項６または１６記載の微生物識別方法。
23. 【請求項２３】 識別対象となる微生物を識別する微生
    物識別装置であって、 複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
    物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリ
    ング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
    順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適
    用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡ
    のＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、 前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用い
    て増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、
    各プライマーに対応する電気泳動像を得る電気泳動手段
    と、 前記電気泳動手段により得られた各プライマーに対応す
    る前記電気泳動像を画像データに変換する画像データ変
    換手段と、 前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記
    電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求める
    波形データ生成手段と、 照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
    応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータ
    ベースを検索し、前記データベースに記憶された情報に
    基づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプ
    ライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す
    波形データを求め、前記識別対象となる微生物について
    求められた前記波形データと前記照合対象となる微生物
    について求められた前記波形データとの相関関係を作成
    する相関関係作成手段と、 前記相関関係作成手段により作成された相関関係に基づ
    いて前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを
    備えたことを特徴とする微生物識別装置。
24. 【請求項２４】 識別対象となる微生物を識別する微生
    物識別装置であって、 複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
    物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリ
    ング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
    順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適
    用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡ
    のＤＮＡ断片を増幅する増幅手段と、 前記増幅手段により前記複数のプライマーの各々を用い
    て増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用し、
    各プライマーに対応する出力信号を得る電気泳動手段
    と、 前記出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形デ
    ータを求める波形データ生成手段と、 照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
    応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベ
    ースを検索し、前記データベースに記憶された情報に基
    づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプラ
    イマーに対応する波形データを求め、前記識別対象とな
    る微生物について求められた前記波形データと前記照合
    対象となる微生物について求められた前記波形データと
    の相関関係を作成する相関関係作成手段と、 前記相関関係作成手段により作成された相関関係に基づ
    いて前記識別対象となる微生物を識別する識別手段とを
    備えたことを特徴とする微生物識別装置。
25. 【請求項２５】 識別対象となる微生物を識別する微生
    物識別プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能
    な記録媒体であって、 前記微生物識別プログラムは、 複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
    物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリ
    ング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
    順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適
    用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡ
    のＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を
    用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用
    することにより得られた電気泳動像を画像データとして
    取り込む処理と、 前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記
    電気泳動像における輝度分布を示す波形データを求める
    処理と、 照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
    応する電気泳動像に関する情報が予め記憶されたデータ
    ベースを検索し、前記データベースに記憶された情報に
    基づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプ
    ライマーに対応する電気泳動像における輝度分布を示す
    波形データを求め、前記識別対象となる微生物について
    求められた前記波形データと前記照合対象となる微生物
    について求められた前記波形データとの相関関係を求め
    る処理と、 前記相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識
    別する処理とを、前記コンピュータに実行させることを
    特徴とする微生物識別プログラムを記録した記録媒体。
26. 【請求項２６】 識別対象となる微生物を識別する微生
    物識別プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能
    な記録媒体であって、 前記微生物識別プログラムは、 複数のプライマーの各々を用いて、識別対象となる微生
    物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プライマーのアニーリ
    ング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
    順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適
    用することにより、前記識別対象となる微生物のＤＮＡ
    のＤＮＡ断片を増幅し、前記複数のプライマーの各々を
    用いて増幅されたＤＮＡ断片に対して電気泳動法を適用
    することにより得られた出力信号を取り込む処理と、 前記出力信号に基づいて各プライマーに対応する波形デ
    ータを求める処理と、 照合対象となる微生物についての複数のプライマーに対
    応する出力信号に関する情報が予め記憶されたデータベ
    ースを検索し、前記データベースに記憶された情報に基
    づいて前記照合対象となる微生物についての複数のプラ
    イマーに対応する波形データを求め、前記識別対象とな
    る微生物について求められた前記波形データと前記照合
    対象となる微生物について求められた前記波形データと
    の相関関係を求める処理と、 前記相関関係に基づいて前記識別対象となる微生物を識
    別する処理とを、前記コンピュータに実行させることを
    特徴とする微生物識別プログラムを記録した記録媒体。
27. 【請求項２７】 微生物を識別するために照合対象とな
    る微生物のデータが格納されるデータベースの作成方法
    であって、 複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各
    々を用いて、微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プラ
    イマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸
    長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖
    反応法を一度に適用することにより、前記微生物のＤＮ
    ＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、 前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ
    断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応
    する電気泳動像を得るステップと、 各プライマーに対応する前記電気泳動像を画像データに
    変換するステップと、 前記画像データに基づいて各プライマーに対応する前記
    電気泳動像に関する情報を求めるステップと、 前記電気泳動像に関する情報を前記照合用の微生物のデ
    ータとして記憶手段に格納するステップとを備えたこと
    を特徴とする微生物識別用データベースの作成方法。
28. 【請求項２８】 微生物を識別するために照合対象とな
    る微生物のデータが格納されるデータベースの作成方法
    であって、 複数のプライマーを準備し、前記複数のプライマーの各
    々を用いて、微生物のＤＮＡに対し、熱変成工程、プラ
    イマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸
    長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖
    反応法を一度に適用することにより、前記微生物のＤＮ
    ＡのＤＮＡ断片を増幅するステップと、 前記複数のプライマーの各々を用いて増幅されたＤＮＡ
    断片に対して電気泳動法を適用し、各プライマーに対応
    する出力信号を得るステップと、 前記出力信号に基づいて各プライマーに対応する情報を
    求めるステップと、 前記情報を前記照合用の微生物のデータとして記憶手段
    に格納するステップとを備えたことを特徴とする微生物
    識別用データベースの作成方法。
29. 【請求項２９】 微生物を識別するために照合対象とな
    る微生物のデータが格納されるデータベースを記録した
    記録媒体であって、 前記データベースは、請求項２７または２８記載の作成
    方法により作成されたことを特徴とするデータベースを
    記録した記録媒体。