JPH08500104A - 結晶質アミホスチン組成物及びその調製方法並びに使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、任意に製剤学的に許容される賦形剤を含有する、無菌の、安定した、真空乾燥した結晶質アミホスチン組成物に関する。一般に、本発明の結晶質組成物は、既存の真空乾燥した固体の無定形アミホスチン製剤と比べて、約４℃から周囲温度付近で少なくとも２年間にわたり向上した安定性を示す。本発明の再調製された組成物は、放射線防護剤または化学防護剤としてヒトに投与するのに適している。

Description

【発明の詳細な説明】 結晶質アミホスチン組成物及びその調製方法並びに使用 １．発明の分野 本発明は、安定性が向上した、無菌で、粒子不含の、結晶質Ｓ−２−（３−ア ミノプロピルアミノ）エチルジヒドロゲンホスホロチオエート（amifostine：ア ミホスチン）に関するものである。 ２．発明の背景 化合物Ｓ−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルジヒドロゲンホスホロチ オエート（アミホスチン、エチオフォス、エチオ ここでは以後“アミホスチン”と呼ぶことにする）および他のアミノアルキルジ ヒドロゲンホスホロチオエートはパイパー（Piper）らの米国特許第3,892,824 号に記載されている。また、この特許は結晶形のアミホスチン薬剤物質をつくる ための既知方法を開示しており、この特許を参考としてここに組み入れる異にす る。この結晶形のアミホスチンは室温で数年間、５０℃では数カ月間にわたり比 較的安定していることがわかっている。これらの化合物はもともと抗放射線剤（ 放射線防護剤）として、特に戦争中に遭遇しうる核放射線またはＸ線からの防護 用に開発されたものである。 軍事上の抗放射線剤としての利用に加えて、アミホスチンは非 軍事上の放射線防護剤および化学防護剤として、すなわち、ガン治療における放 射線療法および化学療法剤（例えば、シクロホスファミドのようなアルキル化剤 、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシンおよびその誘導体、マイトマ イシンおよびその誘導体）の使用中に生じる望ましくない有害作用の防護剤とし て格別の有用性が実証されている。同様に、アミホスチンはＨＩＶ感染患者（Ａ ＩＤＳ）を３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）治療から保護する ために実験的に使用されたと報じられている。アミホスチンとその誘導体は、投 与した治療薬の有益な作用に有意な影響を及ぼすことなく、その防護効果を発揮 する。これは、部分的には、正常組織への防護チオールの選択的取り込みによる ものである。 ここで用いる“アミホスチン薬剤物質”という用語は、三水和物の形で“その ままで”入手可能な予備真空乾燥したものまたは予備真空乾燥状態をさす。現在 入手可能なアミホスチン薬剤生成物の無菌の真空乾燥製剤は“無定形アミホスチ ン”と称し、一方、本発明に包含される形態は“結晶質アミホスチン”と称して 、これら２つの形態を区別することにする。特に指示しない限り、ここに記載し た量は無水物に基づいて計算されたものである。 アミホスチンは多くの有利な性質をもっているが、簡便で、安定した無菌の製 剤を得ようとする際には多大の困難に遭遇してきた。 アミホスチンを製造して包装する現在の方法は、予め滅菌したバイアルにアミ ホスチンを含有する滅菌水溶液を所定量まで充填し、バイアルおよびその内容物 を冷却し、そして各バイアル中に 所定量の乾燥アミホスチンをもたらすべく凍結乾燥により溶媒を除去する段階か ら成っている（L.Lachmanら，The Theory and Practice of Industrial Pharmac y,p. 62-63, 1986を参照されたい）。これはいわゆる“乾燥充填”または“粉 末充填”法による嵩高の固形アミホスチンの包装に伴う実際的な諸問題をかなり 回避するものである。かかる問題として、粉末の手動操作の困難性、粉末を微粉 砕して許容される粒子サイズおよび流動性とすることの必要性、粒子不含で無菌 の状態を維持することの困難性、そして正確な量の固形アミホスチンを各バイア ルに供給することの困難性を挙げることができる。 しかし、凍結乾燥によって生じる無定形アミホスチンの現在入手可能な製剤は 熱的に不安定である。その結果、この凍結乾燥製剤は配合成分の分解を避けるた めに−２０℃付近の温度で貯蔵し、−７０℃から−２０℃ほどの温度で輸送しな ければならない。輸送および貯蔵中の低温の必要性は現在入手可能な真空乾燥形 態のアミホスチンの障害および欠点となっている。この製品の輸送および貯蔵に は、特殊な包装ならびに多大の費用を要する。さらに、冷凍庫での貯蔵条件が整 っていない病院は患者にアミホスチンを供給することができないだろう（例えば 、第三世界の市場はアミホスチンの使用を相当に妨げられるだろう）。しかし、 代替製剤が入手できないので、この製剤を用いて臨床実験が行われてきた。 かくして、室温で、またはあまり厳格でない冷蔵条件（多くの薬剤生成物にと って珍しくない）のもとで、長期の貯蔵寿命を与えるのに十分な安定性を有する 投与形態を開発する必要性が存在している。 本発明は、真空乾燥したアミホスチンを、マンニトールのような製剤学的に許 容される賦形剤の存在下または不在下で含有する固体組成物であって、以前に入 手可能な組成物よりも安定性の向上した該組成物をもたらす新規な方法を提供す るものである。 ３． 発明の概要 本発明は、（ａ）式RHN(CH₂)_nNH(CH₂)_mSPO₃H₂のアミノアルキルジヒドロゲン ホスホロチオエートまたはその水和物もしくはアルカリ金属塩（式中、ＲはＨま たはＣ₁−Ｃ₇アルキルであり、ｎおよびｍは独立に２〜６の整数である）、アル コールおよび水溶剤溶液を含有する組成物を調製し、その際、アミノアルキルジ ヒドロゲンホスホロチオエートとアルコールと水の相対量は、室温付近から約１ ０℃までの温度で粒子不含の溶液が得られるが、０℃以下に冷却するとアミノア ルキルジヒドロゲンホスホロチオエートの結晶質沈殿が生じるようなものであり 、（ｂ）結晶質アミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエートの沈殿を生じさ せるのに十分な時間にわたり０℃以下の温度に該組成物を冷却し、そして（ｃ） 得られた混合物を真空乾燥して温度安定性の増大した固体の結晶質組成物を残存 させる各段階からなる結晶質組成物の調製方法に関する。好ましくは、前記組成 物を冷却して結晶質アミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエートの沈殿を開 始させる温度は該組成物の共融点の範囲内とする。最適には、前記組成物はマン ニトールのような賦形剤をさらに含有する。 本発明において使用するのに適したアミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオ エートとして、Ｓ−２−（３−アミノプロピルア ミノ）エチルジヒドロゲンホスホロチオエート（アミホスチン）、Ｓ−２−（３ −メチルアミノプロピルアミノ）エチルジヒドロゲンホスホロチオエート（WR-3 689）、Ｓ−２−（３−エチルアミノプロピルアミノ）エチルジヒドロゲンホス ホロチオエート、Ｓ−２−（３−アミノプロピルアミノ）−２−メチルプロピル ジヒドロゲンホスホロチオエート、Ｓ−２−（２−アミノエチルアミノ）−２− エチルジヒドロゲンホスホロチオエート、Ｓ−２−（４−アミノブチルアミノ） −２−エチルジヒドロゲンホスホロチオエート、Ｓ−２−（５−アミノペンチル アミノ）−２−エチルジヒドロゲンホスホロチオエート、Ｓ−２−（６−アミノ ヘキシルアミノ）−２−エチルジヒドロゲンホスホロチオエート、Ｓ−２−（２ −メチルアミノエチルアミノ）−２−エチルジヒドロゲンホスホロチオエート、 Ｓ−２−（３−メチルアミノプロピルアミノ）−２−エチルジヒドロゲンホスホ ロチオエート、およびＳ−３−（３−メチルアミノプロピルアミノ）−３−プロ ピルジヒドロゲンホスホロチオエート（WR-151327）を挙げることができるが、 これらに限らない。好ましい実施態様において、アミノアルキルジヒドロゲンホ スホロチオエートはアミホスチン、WR-3689およびWR-151327であり、最も好まし くはアミホスチンである。アミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエートの結 晶質沈殿を生じさせるにあたって本発明で使用するのに適したアルコールとして 、Ｃ₁−Ｃ₅アルキルアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール 、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、 ｎ−ペンタノール、２−ペンタノールなどを挙げることができるが、これらに限 らない。好 ましいアルコールはエタノールである。 本発明の特定の方法では、段階（ｂ）から得られる混合物の温度を、組成物の 共融温度より約１〜２０℃高いアニール温度まで上げ、その後段階（ｃ）の真空 乾燥を行う前に該混合物の温度をアニール温度から共融温度またはそれ以下に冷 却する。ある場合に、共融温度は約−８０℃〜０℃の範囲であり、一方、アニー ル温度は約−３０℃〜１０℃の範囲である。 従って、本発明の目的は、前記組成物が組成物１mlあたり約５０〜４００ｍｇ のアミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエート、約１〜３５％(v/v)のアル コール、および約６５〜９９％(v/v)の水を含有する前記方法を提供することで ある。好ましくは、前記組成物は組成物１mlあたり約１２５〜２５０ｍｇのアミ ノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエート、約５〜２０％(v/v)のアルコール 、および約８０〜９５％(v/v)の水を含有する。最も好ましくは、前記組成物は 組成物１mlあたり約１００ｍｇのアミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエー ト、約１０％(v/v)のアルコール、および約９０％(v/v)の水を含有する。 冷却および真空乾燥段階の温度はアミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエ ート対アルコール対水の特定比率に応じて広範に変化しうる。しかし、一般には 、段階（ｂ）および（ｃ）の温度は約−４０℃〜−５℃の範囲であり、好ましく は約−２０℃である。 本発明の特定の実施態様では、この方法が滅菌段階を包含する。滅菌は当業者 によく知られた多くの方法で行うことができ、例えばオートクレーブ内での混合 物の加熱、ガンマ線による処理、無 菌再結晶、溶液の滅菌濾過（例えば、孔サイズ０．２μｍのフィルターを通す） などがある。結晶質アミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエートは無水物で あっても、結晶化溶媒を含んでいてもよいことに注意すべきである。特に、結晶 質アミホスチンは無水物、溶媒和物、または水和物（例えば、一水和物または三 水和物）であり得る。一般に、水和物は約１〜５モル、好ましくは約１〜３モル の結晶水を含むことができる。 組成物の別の調製方法では、アミホスチンのようなアミノアルキルジヒドロゲ ンホスホロチオエートおよび所望の任意の賦形剤を注射用の水（ＵＳＰ）に溶解 し、次に得られた溶液を滅菌濾過する。その後、必要量の無菌アルコール（例え ば、無菌エタノール、ＵＳＰ）を加えて組成物を形成し、続いてこれを冷却また はアニール段階に付す。 記載した方法に従って調製した組成物は製剤学的に許容される賦形剤をさらに 含んでいてもよい。適当な賦形剤としては、塩化ナトリウム、プロピレングリコ ール、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、イノシトール、マンニトール、グリシ ン、アルギニン、または他のアミノ酸を挙げることができるが、これらに限らな い。好ましい賦形剤はマンニトールで、最も好ましいものはマンニトール（ＮＦ ）である。 かくして、本発明の特定の目的は、（ａ）室温付近から約１０℃までの温度で は粒子不含の溶液が得られるが、０℃以下に冷却するとアミホスチンの結晶質沈 殿が生じるように、組成物１mlあたり約５０〜３００ｍｇのアミホスチン、約３ 〜３０％(v/v)のエタノール、約７０〜９７％(v/v)の水、任意に、組成物１mlあ た り約５〜３００ｍｇの製剤学的に許容される賦形剤を含有する組成物を調製し、 （ｂ）結晶質アミホスチンの沈殿を生じさせるのに十分な時間にわたり約−４０ ℃〜−５℃の範囲内の温度に該組成物を冷却し、そして（ｃ）得られた混合物を 真空乾燥して温度安定性の増大した固体の結晶質アミホスチン組成物を残存させ る各段階からなる、結晶質アミホスチンを含有する医薬組成物の調製方法を提供 することである。一般に、段階（ａ）の後で段階（ｃ）の前に行う段階は約０． ５〜７２時間、好ましくは約２〜２４時間にわたって実施する。段階（ｃ）で行 う操作は約１〜７２時間、好ましくは約１０〜２０時間にわたって実施する。さ らに、段階（ｃ）の真空乾燥は約１０〜１０００mTorr、好ましくは１５０mTorr の真空下で実施する。 本発明の更なる目的は、活性成分、すなわちアミホスチンのような結晶質アミ ノアルキルジヒドロゲンホスホロチオエートが約４℃で少なくとも２年間安定し たままで存在する、温度安定性の増大した無菌の医薬組成物の調製に関する。好 ましくは、アミホスチンのような結晶質アミノアルキルジヒドロゲンホスホロチ オエートがほぼ周囲温度で少なくとも２年間安定した状態で存在する。かくして 、製剤学的に許容されるビヒクルを用いて注射可能な粒子不含の薬剤生成物に再 調製し得る、結晶質アミホスチンを含有する温度安定性の増大した無菌の組成物 が提供される。好ましくは、無菌の組成物は、約１０〜１０，０００ｍｇの結晶 質アミホスチンを、任意に約１０〜１０，０００ｍｇの製剤学的に許容される賦 形剤とともに含有する、温度安定性の増大した無菌の単回投与量組成物として提 供され、該組成物は製剤学的に許容さ れるビヒクルを用いて注射可能な粒子不含の薬剤生成物に再調製することができ る。より好ましい実施態様では、無菌の単回投与量組成物が約１００〜１０００ ｍｇの結晶質アミホスチンと約１００〜１０００ｍｇの賦形剤を含有する。最も 好ましくは、無菌の単回投与量組成物が約５００ｍｇの結晶質アミホスチンと約 ５００ｍｇのマンニトールを含有する。ビヒクルは製剤学的に許容される多種多 様のビヒクルから選ぶことができ、注射用の水（ＵＳＰ）、生理食塩水（ＵＳＰ ）、５％ブドウ糖水溶液（ＵＳＰ）、または水性緩衝液を含む。 本発明の更なる目的は、放射線防護または化学防護を必要とする被験者に、有 効量の上記一般化学式を有する結晶質アミノアルキルジヒドロゲンホスホロチオ エート（例えば、アミホスチン）を含有する医薬組成物（製剤学的に許容される ビヒクルを用いて再調製したもの）を投与することからなる、放射線防護または 化学防護を必要とする被験者の処置方法を包含する。再調製した医薬組成物は非 経口的に投与することができる。所望により、再調製した医薬組成物を静脈内、 筋肉内、皮下、空洞内、および鞘内に投与してもよい。 本発明のこれらの目的並びに他の目的は、本明細書中の一般的記載および詳細 な説明から当業者には明らかになるはずである。 ４．図面の簡単な説明 図１ 温度（℃）に対する水性／エタノール溶液中のアミホスチン薬剤物質（WR -2721）の溶解度を示すグラフ 図２ アミホスチン薬剤物質の溶解度のエタノール濃度への依存 性を示すグラフ 図３ １０％エタノール／水から調製した結晶質アミホスチン薬剤生成物のＴＧ Ａ 図４ アミホスチン薬剤物質のＴＧＡ 図５ １０％エタノール／水から調製した結晶質アミホスチン薬剤生成物のＤＳ Ｃ 図６ アミホスチン薬剤物質のＤＳＣ 図７ １０％エタノール／水から調製した結晶質アミホスチン薬剤生成物のＦＴ ＩＲ 図８ アミホスチン薬剤物質のＦＴＩＲ 図９ １０％エタノール／水から調製した結晶質アミホスチン薬剤生成物のＸ線 回折 図１０ アミホスチン薬剤物質のＸ線回折 図１１ １０％エタノール／水から調製した結晶質アミホスチンおよびマンニト ール薬剤生成物のＴＧＡ 図１２ １０％エタノール／水から調製した結晶質アミホスチンおよびマンニト ール薬剤生成物のＤＳＣ 図１３ 真空乾燥したアミホスチンの分子および結晶構造を示す。 ５．発明の詳細な説明 低温での輸送および貯蔵を行って薬剤生成物の分解を防ぐ必要があった。 本発明は、有意な薬剤生成物の分解なしに約４℃から室温までの温度で都合よ く取り扱うことができ、長期間にわたって貯蔵す ることができるアミホスチンの安定した真空乾燥製剤を最初に提供するものであ り、かくして長い間の要求への解決法を提供する。この製剤は、既存の薬剤生成 物に必要とされる冷凍庫の貯蔵設備をもたない世界中の病院へアミホスチン薬剤 生成物を輸送し、その病院で貯蔵できるようにするだろう。 意外にも、マンニトールのような賦形剤を含むまたは含まない結晶質アミホス チンの安定した無菌製剤は、アミホスチン薬剤物質を含有する水性エタノール溶 液（約１〜３５％エタノール）の真空乾燥から調製することができる。 本発明の重要な面は、（１）さまざまな濃度の水／エタノール中のアミホスチ ン薬剤物質の溶解度（ｍｇ／ｍｌ）、（２）さまざまな温度での水／エタノール 中のアミホスチン薬剤物質の溶解度、（３）真空乾燥前にアミホスチンを沈殿さ せるのに必要な凍結−乾燥機の適切な棚温度、および（４）凍結−乾燥機内で希 望の棚温度に冷却したときに結晶形のアミホスチンの沈殿を生じさせる過飽和溶 液を与えるのに必要とされる組成物中のエタノールの濃度、を測定する予備調製 実験を含んでいた。これらの予備調製実験（下記の実施例を参照のこと）から、 アミホスチンの好ましい濃度は、無水物に基づいて、約１０％水性エタノール中 約１００ｍｇ／ｍｌであることが判明した。さらに、約−２０℃の好ましい棚温 度がアミホスチンの沈殿を起こさせるだろう。 上等のケーク生成物を得るために、エタノール／水混合溶媒中のエタノールの パーセンテージは約１〜３５％(v/v)のエタノール（例えば、エタノール：水の 比が１：９９〜３５：６５）の範囲である。同様に、凍結−乾燥機の棚温度は約 −４０℃〜−１０ ℃の範囲であり、好ましくは−２０℃である。本発明において提示された予備調 製実験の結果は、多数の容器サイズ／充填容量の組合せに備えるためにアミホス チン濃度、エタノール濃度および温度の相互依存的変動要因を調整する際の重要 な手がかりを提供するだろう。 一般的には、凍結−乾燥機の棚を約−３０℃〜−１５℃、好ましくは約−２０ ℃の温度に予め冷却する。バイアルを載置し、温度を約−３０℃〜−１５℃、好 ましくは−２０℃に再調整し、そしてバイアルをこの温度で約２０時間維持する 。溶液中のエタノールおよびアミホスチンまたはアミホスチンと賦形剤の濃度に 応じて、また、エタノールの濃度に応じて、沈殿を起こさせるのに必要な温度は 変化するだろう。次に、結晶質アミホスチンの沈殿が起こり、続いてこの組成物 の凍結が起こる。 この組成物の凍結が観察されたら、大半の水およびエタノールを除くために１ 回目の乾燥サイクルを開始する。一般には、チャンバー内の圧力を約１５０mTor rに低下させる。組成物の温度が２時間以上にわたって約−２０±２℃となった とき１回目の乾燥サイクルが完了する。２回目の乾燥サイクルでは、乾燥を促進 させる（すなわち、残留水およびエタノールを除去する）ために組成物を約−２ ０℃〜１０℃、好ましくは１回目の乾燥サイクルの温度より高い温度に約４０〜 ５０時間維持する。チャンバー内の水とエタノールの分圧が定常状態に達すると き、乾燥は完了したと考えられる。これらの組成物は真空乾燥薬剤生成物を提供 し、これは無定形アミホスチンを含有する既存の薬剤生成物よりも向上した安定 性を示す結晶質アミホスチンであることがわかった。 かくして、有意な薬剤生成物の分解なしに約４℃から室温までの温度でバイアル を貯蔵し、輸送することができる。 さらに、組成物中に存在する固体の量を増やすために賦形剤を添加することが できる。そのために有効であるとわかった賦形剤は、しばしば組合せで、リン酸 ナトリウムまたはカリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、酒石酸、ゼラチン、お よび炭水化物、例えばブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、イノシトール、マンニ トールおよびデキストランである。ここに挙げたもの以外に、他のものも当業者 に知られている。 本発明の真空乾燥した結晶質アミホスチン固体組成物は、適当な容器に、無菌 の予備真空乾燥溶液を、指定したアミホスチン含量となるまで無菌的に充填し、 所望の真空乾燥固体組成物を調製し、その後単回投与量容器を気密的にシールす ることによって、単回投与量容器の形態で提供され得る。これらの充填容器は、 適当な無菌の希釈剤を用いて再調製する際に固体組成物を速やかに溶解し、投与 のために希望のアミホスチン濃度の無菌溶液をその場で提供できるようになって いる。ここで用いる“適当な容器”とは、ストッパー手段によって気密的にシー ルされた真空乾燥薬剤生成物を供給し得る、バイアルのような無菌環境を維持す ることができる容器を意味する。さらに、適当な容器は、真空乾燥組成物の再調 製時に保持すべき溶液の容量を考慮して、サイズが適切であること、さらに容器 の材料が適切であること（一般には、Ｉ型ガラス）を包含する。用いるストッパ ー手段（例えば、無菌のゴム栓または同等物）は、前記のシールをもたらし、同 時にアミホスチン溶液の再調製のために希釈剤、例えば注射用滅菌水 （ＵＳＰ）、生理食塩水（ＵＳＰ）、または５％ブドウ糖水溶液（ＵＳＰ）の導 入を可能にするものであると理解すべきである。本発明のごとき薬剤生成物のた めの容器の適合性については製剤分野において当業者によく知られている。 本発明の固体組成物は物理的性質（例えば、外観）が改善されたことにより本 発明の一つの目的を達成したが、意外にも、これらの固体組成物は既存の組成物 と比べて向上した熱安定性を有することが見いだされた。実際、真空乾燥により 化学的安定性が向上することの期待は、真空乾燥固体の安定性と溶液形態の医薬 組成物の安定性との比較に関係している。これに対して、本発明の組成物は固体 の投与形態間で向上した化学的安定性を示すものである。以下の実施例を参照さ れたい。 本発明の医薬組成物は非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、空洞内、鞘内およ び皮下注射に適している。 次の実施例は本発明を例示するためのものであって、いかなる場合も、本発明 の制限であると解釈されるべきでない。 ６．実施例 実施例１ ：予備調製実験の手順 この実施例は、水／エタノール混合物から、真空乾燥を使用して、医薬上許容 できる賦形剤を含むまたは含まない結晶質アミホスチンの殺菌された真空乾燥形 態を得るための適当なパラメーター、即ち、アミホスチン濃度、エタノール濃度 及び温度を評価するために設計された予備調製実験の手順を示すものである。A．試料溶液の調製 ねじ式の蓋を有する別々の試験管に以下のものを加える。 (a)5000μLの水 (b)4750μLの水及び250μLのエタノール (c)4500μLの水及び500μLのエタノール (d)4250μLの水及び750μLのエタノール (e)4000μLの水及び1000μLのエタノール 固体が溶解せずに残るまで各試験管にアミホスチンを加える。30秒間超音波処 理する。全部のアミホスチンが溶解した場合は、追加量の薬剤物質を、溶媒中に 溶解していない粒子が残るまで加える。25℃で30分間、試験管を激しく震盪する 。 B.標準溶液の調製 水に溶解した薬剤物質の下記の溶液10mlを調製する。 (a)0.05mg/mL (b)0.1mg/mL (c)0.3mg/mL (d)0.5mg/mL UV分光光度計において、各溶液を水ブランクに対して、190〜 290nmの範囲にわたって走査する。200nmまたは210nmにおける吸収を記録する。2 00nm、または210nmにおける標準データの線形回帰分析を行い、勾配と切片値と を得る。 C.試料溶液の分析 各溶液の約0.5mLを取り出し、遠心分離して固体をペレット化する。必要であ れば0.45μmフィルターで各試料を濾過し、過剰な粒子を除去する。各試料を、0 .3〜0.4mg/mLの操作濃度に水で希釈する。UV分光光度計において各試料を190〜2 90nmの範囲にわたって走査する。各試料について200nm、または210nmにおける読 み取りを得る。標準勾配と切片と希釈度から、各溶液中のアミホスチンの濃度を 計算する。溶液を最低に近い温度に冷却し、溶液をその温度に１時間おいた後、 上記を繰り返す。表１は、種々の温度におけるエタノール／水混合物中のアミホ スチンの溶解度実験の結果を示す。この関係を図１及び２に図示する。 この実施例は、アミホスチン薬剤物質の溶解度がエタノール共溶媒の含有量及 び温度の両方に強く依存していることを示している。一般に、所与のアミホスチ ン溶液の温度の低下の結果起こる過飽和の程度は、エタノール共溶媒の含有量が 増加するにつれて減少する（表１及び図１及び２参照）。この依存性は、以下の 実施例２及び３において結晶質アミホスチンを得るのに利用される。実施例２ ：マンニトールの不在下で結晶質アミホスチンを製造する方法 25℃の水130mLに、攪拌しながら17.0gmの無水アミホスチン薬剤物質に相当す る21.25gmのアミホスチン薬剤物質三水和物を加える。アミホスチン薬剤物質の 溶解が完了した後、17mLの無水エタノール、USPを攪拌しながら前記溶液に加え る。次に十分量の水を加えて170mLとする。得られた溶液を0.22μmフィルターを 通して滅菌濾過する。33の10mLバイアルのそれぞれに、5mLの濾過した溶液を加 え、10:90のエタノール：水比中において、バイアル当たり無水物基準で500mgの アミホスチンを得る。スプリットストッパーをバイアル上に付し、試料を以下の 真空乾燥サイクルにかける。試料を凍結乾燥機の棚の上に置き、これを周囲圧力 下に約17時間約-20℃に予備冷却し、その時間の後チャンバーを減圧し棚を28時 間約-20℃に維持する。この期間の後、チャンバーを窒素で再充填し、手作業で バイアルに素早く栓をする。この手順により、上等のケークとして約500mgの結 晶質アミホスチンを含む、温度安定性を有する、凍結乾燥された単回投与量バイ アルが得られる。実施例３ ：結晶質アミホスチンを製造する方法 約20グラムのマンニトールを25℃の150mLの水に攪拌しながら加える。この溶 液に、攪拌しながら、20グラムの無水アミホスチン薬剤物質に相当する、約25グ ラムのアミホスチン薬剤物質（三水和物基準）を加える。溶解が完了した後、20 mLの無水エタノール、USPを、攪拌しながら容積を測定するように溶液に加える 。 水を十分量加えて200mLとする。得られた溶液を0.2μmフィルターを通して滅菌 濾過し、溶液の5mLを40の10-mLバイアルのそれぞれに移す。バイアル上にスプリ ットストッパーを付し、試料を室温の凍結乾燥機の棚に置く。棚温度を２℃／分 で−25℃まで低下させ、この温度で90分間維持してアミホスチン結晶化を開始さ せる。この時間の後、棚温度を２℃／分の速度で−５℃まで共融点を越えて上昇 させ、この温度で10時間維持して生成物をアニールさせる。次に、生成物温度が 60分間より長く−18℃未満になるまで、棚温度を−25℃に低下させる。この時間 の後、凍結乾燥機のコンデンサーを作動させ、チャンバー内の真空を150ミリト ルまで低下させる。棚温度を−20℃まで上昇させ、試料を14時間真空乾燥させる 。この時点でモニターしているバイアルが棚温度に達し、一次乾燥サイクルが終 了したことを示した。さらに13.4時間の間−20℃の棚上で150ミリトルにバイア ルを維持し、非水和水が除去されるようにする。チャンバーを窒素で再充填し、 バイアルに機械的に栓をする。この手順により、上等なケークとして約500mgの アミホスチン（無水物基準）を及び500mgのマンニトールを含む、温度安定性を 有する、凍結乾燥された単回投与量バイアルが得られる。実施例４ ：真空乾燥結晶質アミホスチンの安定性試験 上記実施例２に記載した、10:90のエタノール：水から形成された結晶質アミ ホスチンの密閉された窒素充填バイアルのいくつかを最高35日間にわたって50℃ のストレスにかけ、結晶質アミホスチンの温度安定性を測定する。 結果を下記表２として表にした。全てのデータは、100％と定義される当初濃 度に対するパーセント（％）で表す。 比較のため、従来の無定形アミホスチン製剤も、最高28日間にわたる50℃にお けるストレス試験にかける。結果を下記表３に示す。全てのデータは、100％と 定義される当初濃度に対するパーセント（％）で表す。 このように、固体製剤の間においてさえも、開示した方法で得られた結晶質組 成物により温度安定性の劇的な増加が達成されることが極めて明らかである。実施例５ ：結晶質アミホスチンを製造する好ましい方法 アミホスチン／マンニトール（それぞれ100mg無水／mL）のための混合手順 以下に記載した方法により3.5リットルの溶液が得られた。 １. 350グラムのマンニトール(USP)を、ステンレス鋼圧力容器中の約2300mLのNa nopure水に、攪拌（磁気テフロン攪拌棒）しながら室温で溶解した。 ２. この溶液に438.3グラムのアミホスチン三水和物を加えた。 激しく攪拌することにより溶解を促進した。 ３．アミホスチンの溶解が完了した後、525mLの脱水エタノール(USP)を激しく攪 拌した溶液にゆっくりと加えた。添加場所においてアミホスチンの沈殿が起こり 、攪拌によりエタノールが希釈されるに従って急速に再溶解した。 ４．エタノールの添加が完了した後、溶液をNanopure水で3500mLに希釈した。 ５．溶液を、10psi（窒素）の正圧下にMillipore-40フィルターを通して濾過し た。 ６．得られた溶液の５mLを660の10mLバイアル管(Wheaton E-2910-B47B)のそれぞ れに移した。バイアルに灰色のブチルゴム栓(Tompkins PT23B0857 F2)を取り付 け部分的に密封し、真空乾燥した。アミホスチン／マンニトール（100mg無水物／mL）のための真空乾燥サイクル １．バイアルを約25℃の棚の上に置き、アミホスチンの沈殿が外因的に開始され ないようにする。 ２．棚温度を毎分２℃で−35℃まで低下させる。この棚温度が得られた後、240 分間一定に保ち、全てのバイアルの溶液が凍結するようにする。この段階の間に 試料は共融点（約−16℃）を通過する。 ３．240分の保持時間の終了時に、棚温度を毎分２℃で０℃まで25分にわたって 上昇させる。この棚温度を得た後、600分間一定に保つ。 ４．600分の保持時間の終了時に、棚温度を毎分２℃で−35℃まで再度低下させ る。この温度が得られた後、180分間一定に保つ。 ５．この時間の後、コンデンサーを作動させる。コンデンサー温度が−40℃未満 になったとき、チャンバーを減圧する。チャンバー圧力が150mT未満になったと き、棚温度を毎分２℃で−20℃まで上昇させ、窒素のチャンバーからの漏出によ りチャンバー圧力を150mTに保つ。 ６．モニターしている生成物温度が棚温度に達した後、150mTで12〜24時間生成 物をチャンバー内に置く。チャンバーを窒素で再充填し、バイアルに栓をする。 注：１トル(Torr)は０℃において1mmHgに相当する。 実施例５に記載したようにして得られた真空乾燥結晶質アミホスチンを含む、 密閉され窒素充填された10mLバイアル管を４週間40℃のストレスにかけた。−20 ℃で12時間乾燥した結晶質アミホスチンについては、このストレス試験期間の終 了時において93％のアミホスチンが残っていた。−20℃で24時間乾燥した結晶質 アミホスチンについては、このストレス試験期間の終了時において84％のアミホ スチンが残っていた。実施例６ ：結晶質アミホスチンの最も好ましい製造方法 15%v/vのエタノールを含むアミホスチン／マンニトールのエタノール／水溶液 を真空乾燥することによって、最も安定な真空乾燥結晶質アミホスチンが得られ ることが判明した。混合方法は、より少ない量の脱水エタノールが溶液に添加さ れることを除いて実施例５に記載したものと同様である。 この最も安定な結晶質アミホスチンを生成するための真空乾燥サイクルを行う 具体的な方法は、最終乾燥温度、最終乾燥の期間、及び溶液を含むバイアルの− 35℃への初期冷却の速度を変化させることの影響を評価するために行ったいくつ かの実験の後に到達したものである。一般的に、結晶質アミホスチンの安定性は 、最終乾燥温度が−20℃であり、最終乾燥の期間が12〜24時間の間であるときに 最大であることが判明した。さらに結晶質アミホスチンの安定性は、溶液を含む バイアルの−35℃への初期冷却を45分間行うよりも160分間行った場合の方がよ り高い。 上記の開発実験に基づけば、真空乾燥サイクルを行う最も好ましい方法は以下 の通りである。アミホスチン／マンニトール（100mg無水物／mL）のための真空乾燥サイクル １．バイアルを約25℃の棚の上に置き、アミホスチン沈殿が外因的に開始されな いようにする。 ２．棚温度を25℃から０℃に20分間で、０℃から−20℃に60分間で、そして−20 ℃から−35℃まで80分間で低下させる。この棚温度が得られた後、240分間一定 に保ち、全てのバイアルの溶液が凍結するようにする。この段階の間に試料は共 融点（約−16℃）を通過する。 ３．240分の保持時間の終了時に、棚温度を０℃まで25分にわたって上昇させる 。この０℃の棚温度が得られた後、600分間一定に保つ。 ４．600分の保持時間の終了時に、棚温度を０℃から−15℃に15分間で、そして −15℃から−35℃まで120分間で再度低下させる。 この−35℃の温度が得られた後、180分間一定に保つ。 ５．この時間の後、コンデンサーを作動させる。コンデンサー温度が−40℃未満 になったとき、チャンバーを減圧する。チャンバー圧力が150 mT未満になったと き、棚温度を−35℃から−20℃まで毎分２℃で上昇させ、その間窒素のチャンバ ーからの漏出によりチャンバー圧力を150 mTに保つ。 ６．モニターしている生成物温度が棚温度に達した後、150mTで12〜24時間バイ アル中の生成物をチャンバー内に置く。チャンバーを窒素で再充填し、バイアル に栓をする。 注：１トルは０℃において1mmHgに相当する。 理論により限定されることを望むものではないが、上記の段階２は凍結した溶 液中でのアミホスチンの種結晶の形成を生起し、段階３は種結晶の周囲でのアミ ホスチン結晶の成長を生起し、部分的に凍結した溶液からのアミホスチンの結晶 化を完了させるものと考えられる。 上記の真空乾燥サイクルにより、12.5％エタノール溶液を使用して結晶質アミ ホスチンが生成され、１つは12時間の最終乾燥段階により製造されたものであり 、もう１つは24時間の最終乾燥段階により製造されたものである。これらの２つ の生成物の40℃における８週間のストレス試験においては、12時間乾燥させた生 成物については認知できるアミホスチンの分解はなく、24時間乾燥させた生成物 についてはアミホスチンの２％の分解が示された。実施例７ ：結晶質アミホスチン安定性試験を行う好ましい方法 実施例６に記載したようにして得られた真空乾燥結晶質アミホスチンを含む、 密閉され窒素充填された10mLバイアル管を８週間まで40℃のストレスにかけた。 以前の50℃における安定性試験は、典型的な貯蔵条件（即ち、約４℃の冷蔵 温度）下の結晶質アミホスチンの安定性に容易には関連付けられない形で、密封 されたバイアル中の結晶質アミホスチンの分解を起こしたことが判明した。しか し、40℃以下における安定性試験の結果は、典型的な貯蔵条件下の結晶質アミホ スチンの安定性に関連付けることができる。おおむね、30℃における１か月の安 定性は、４℃における18か月に関連付けられ、40℃における２〜３週間の安定性 は、４℃における18か月に関連付けられ、40℃における８〜12週間の安定性は、 25℃における18か月に関連付けられる。安定性の予測の一般論については、L.La chman,et al.,The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, p766-67を参 照されたい。 ストレス期間の終了時に、バイアル中の結晶質アミホスチンを、水分含有量、 チオール含有量及びアミホスチン含有量について試験した。水分含有量はカール フィッシャー滴定により測定した。アミホスチンはストレス下に加水分解されて 2-[(3-アミノプロピル)アミノ]エタンチオールとリン酸を生成し得るので、この チオールの量の測定はアミホスチンの安定性の指標を与える。チオール及びアミ ホスチン含有量の分析は以下の手順を用いて行った。 １．標品と試料の調製 最終濃度は同じであることを条件に、重量と容量は調整することができる。冷 蔵下及び／または冷蔵されたオートサンプラー中に調製直後の溶液を貯蔵する。 １.１アミホスチン標品溶液（3mg/mL、メタノール／水［50:50］）の調製 標品アミホスチンの約30.0mgを、10mL容量測定フラスコ中に正確に量り取る。 ５mLの水に溶解し、メタノールで容量に希釈する。 保存期限：４℃において24時間 １.２2-［（3-アミノプロピル）アミノ］エタンチオール二塩酸塩の標品溶液（0 .012mg/mL遊離塩基、メタノール／水［50:50］）の調製 2-［（3-アミノプロピル）アミノ］エタンチオール二塩酸塩標品の約1.85mgを 、100mL容量測定フラスコ中に正確に量り取る。50mLの水を加え、メタノールで 容量に希釈する。 保存期限：４℃において24時間 １.３アミホスチン（薬剤物質）の調製 A. アッセイ調製物（3mg/mL、メタノール／水［50:50］） アミホスチンの約30.0mgを、10mL容量測定フラスコ中に正確に量り取る。5mL の水に溶解し、メタノールで容量に希釈する。 保存期限：４℃において24時間 B. 関連物質（15mg/mL、水） アミホスチンの約150.0mgを、10mL容量測定フラスコ中に正確に量り取る。水 で溶解し、容量に希釈する。 保存期限：４℃において24時間 １.４注射用アミホスチン（薬剤生成物）（4.8mg/mL、メタノール／水［50:50］ ）の調製 １つの薬剤生成物バイアルの内容物を約9mLの水で溶解する。定量的に試料を2 5mL容量測定フラスコ中に移し、水で容量に希釈する。この溶液の６mLを50mL容 量測定フラスコ中に移し、19mLの水を加え、メタノールで容量に希釈する。 保存期限：４℃において24時間 ３．装置及び材料（以下に述べるものあるいは等価物） 装置 UV検出器を備えたHPLCシステム材料 アミホスチン標品 濃リン酸(H₃PO₄)：HPLCグレード メタノール(MeOH)： HPLCグレード 精製水： 16メグオーム以上 1-オクタンスルホン酸、ナトリウム塩(OSA): HPLCグレードHPLCクロマトグラフィー条件 カラム仕様： 充填材料：TosoHaas TSK ODS-80TM，末端キャップ付き(USP L1) 寸法：4.6×250mm 粒子サイズ：5μm 移動相：メタノール／水性リン酸、pH3.0，3.5mM OSA（50/50） 1. 0.38gのOSAを500mLの水性リン酸pH3.0中に溶解する。 2. メタノールで1000mLに希釈する。 3. 移動相を濾過及び脱ガスする。 検出：220nm吸収 流速：1.0mL／分 注入容量： 10μL カラム温度：周囲温度 試料温度：４℃ 減衰：フルスケールアミホスチンピークの約80％を生成するように調整する。 ４．手順 試料及び標品溶液を注入し、アミホスチンピークの保持時間（約４分）を記録 する。標品アミホスチンピークと試料調製物ピークの保持時間は10％以内で一致 し、試料中のアミホスチンの同一性が確認されなければならない。 ５．計算 ・アミホスチンアッセイ ・注射用アミホスチンアッセイ アミホスチン（無水）%ラベル記載 ・WR-1065 アミホスチン中の%WR-1065 注射用アミホスチン中の%WR-1065 ・関連物質(RS) ブランクのクロマトグラム上に見られる関連物質試料クロマトグラム上のピー ク及び溶媒前線妨害からのピークを除く。 それぞれの検出された余分の関連物質について相対ピーク面積パーセントを明 記する。 WR-1065パーセンテージ及び0.1面積%よりも大きい全ての追加の関連物質を記 載する。関連物質の全部の合計を記載する。実施例８ ：40℃でストレスをかけた真空乾燥結晶質アミホスチンの安定性につい ての結果 実施例６に記載した方法で製造され、実施例７に記載したように試験された結 晶質アミホスチンにストレスをかけることによって得られた典型的な結果を表４ にまとめる。 上記の結果は、実施例６に記載された方法により製造された結晶質アミホスチ ンの高められた安定性を明確に示している。高められた安定性は、加水分解によ り2-［（3-アミノプロピル）アミノ］エタンチオールを形成するアミホスチンの 分解がごく僅かであることを示す、チオール形成の低い重量パーセントから明ら かである。さらに、時間の経過における水分含有量あるいはアミホスチン含有量 の損失が殆どない。これは、50℃、14日間で有意な分解を示す真空乾燥無定形ア ミホスチン製剤（実施例４の表３を参照）の貧弱な安定性と対照的である。実施例９ ：真空乾燥アミホスチンの結晶構造 真空乾燥結晶質アミホスチンの分子及び結晶構造を調べた。結晶調査、単位セ ル測定、及びデータ収集は室温において銅放射線を使用して行った。 構造は直接法により解析し、フルマトリックス最小二乗(full-matrix least-s quares)及びディファレンスフーリエ(difference Fourier)法により改善した。 全ての非水素原子は異方的に改善した。窒素に結合した水素原子及び水の酸素原 子はディファレンスフーリエマップから位置を決定し、等方的に改善した。残り の水素原子の位置は理想的な幾何学的配置を仮定して計算した。これらの水素原 子は、低い反射／パラメーター比のために改善しなかった。 前記化合物は、キラル空間群P2₁2₁2₁に結晶化する。この実施例に示したデー タは、より低いR値(R=0.036，R_w=0.042)を有するエナンチオマー構造からのもの である。別のエナンチオマ ー構造は、0.042のR値及び0.051のR_w値を有する。真空乾燥アミホスチン三水和 物の分子及び結晶構造の図解的描写を図13に示す。実験 データ収集 0.350×0.050×0.030mmの概算寸法を有するC₅H₂₁N₂O₆PSの無色平板針状結晶を ガラス繊維上に載せた。全ての測定は、グラファイト単色化Cu Kα放射線及び12 kW回転アノードジェネレータを有するRigaku AFC5Rにおいて行った。 40.45＜2θ＜52.03゜の範囲で注意深く中心を決定された20の反射のセット角 度を使用した最小二乗改善から得られたデータ収集のためのセル定数及び方向マ トリックスは、 a = 8.456(2)Å b = 21.553(2)Å c = 6.758(2)Å V = 1231.6(5)ų の寸法を有する斜方セルに対応した。Z=4及びF.W.=268.26の場合、密度は1.447g /cm³と計算される。 h00: h ≠ 2n 0k0: k ≠ 2n 00l: l ≠ 2n の系統的な不存在及び正しい構造の解析と改善に基づき、空間群は、 P2₁2₁2₁（＃19） と決定された。 データは、ω-２θ走査法を用いて、120.0゜の最大２θ値まで23±１℃の温度 で収集した。データ収集に先立って行ったいくつかの強い反射のオメガ走査は、 6.0°のテイクオフ角を有する、0.21°の半値高における平均幅を有していた。 （0.89 ＋ 0.14tanθ）゜の走査は、8.0゜／分（オメガにおいて）の速度で行っ た。弱い反射(I＜15.0σ(I))については再走査し（最大４走査）、計測値を積算 して良好な計測統計値が得られるようにした。定常バックグラウンドの計測値は 反射の各サイドで記録した。ピーク計測時間のバックグラウンド計測時間に対す る比は２：１であった。入射ビームコリメーターの直径は0.5mmであり、結晶と 検出器の距離は400.0mmであった。データ換算 全部で1120の反射を収集した。150の反射毎の後に測定した３種の代表的な反 射の強度はデータ収集の間一定であり、結晶及び電子的な安定性を示した（減衰 補正は使用しなかった）。 Cu Kαについての線形吸収係数は37.1cm^-1である。いくつかの反射の方位走査 に基づいた経験的吸収補正を適用した結果、0.89から1.00の範囲の透過係数が得 られた。データはローレンツ(Lorentz)及び偏光効果について補正した。実験の詳細 A.結晶データ B.強度測定 C.構造解析及び改善 具体的に開示しなかったその他の態様も、開示のないことにかかわらず本発明 の範囲及び思想に含まれることは当業者に明らかである。従って、以下の請求の 範囲に記載されていることを除き、本明細書の記載はいかなるようにも本発明を 限定するものと解してはならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 ラジュースキー，ロジャー エイ. アメリカ合衆国 66049 カンザス州 ロ ーレンス， アップルゲイト コート1424 ビー番地 (72)発明者 バルドニ，ジョン エム. アメリカ合衆国 19430 ペンシルバニア 州 グレンモア， ローズマリー レーン 20番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．結晶質アミホスチン組成物の調製方法であって、 （ａ）アミホスチン、エタノールおよび水を含有する組成物を調製し、その際 、アミホスチンとエタノールと水の相対量は、室温付近から約１０℃までの温度 では粒子不含の溶液が得られるが、０℃以下に冷却するとアミホスチンの結晶質 沈殿が生じるようなものであり、 （ｂ）結晶質アミホスチンの沈殿を生じさせるのに十分な時間にわたり０℃以 下の温度に該組成物を冷却し、そして （ｃ）得られた混合物を真空乾燥して、安定性が向上した固体の結晶質アミホ スチン組成物を残存させる、各段階からなる方法。 ２．段階（ｃ）の真空乾燥の完了後に、前記組成物に無菌の不活性ガスを導入す ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記不活性ガスがアルゴン、窒素およびヘリウムよりなる群から選ばれる、 請求項２に記載の方法。 ４．段階（ｂ）の温度が前記組成物の共融点付近である、請求項１に記載の方法 。 ５．段階（ｂ）の後で、得られた混合物の温度を、前記の共融温度より約１〜２ ０℃高いアニール温度まで上げ、その後段階（ｃ）を行う前に該混合物の温度を アニール温度から共融温度またはそれ以下に冷却することをさらに含む、請求項 ４に記載の方法。 ６．前記の共融温度が約０℃〜約−８０℃の範囲である、請求項４に記載の方法 。 ７．前記のアニール温度が約−３０℃〜約１０℃の範囲であり、前記の共融温度 が約０℃〜約−８０℃の範囲である、請求項５に記載の方法。 ８．前記組成物が組成物１mlあたり約５０〜４００ｍｇのアミホスチン、約１〜 ３５％(v/v)のエタノール、および約６５〜９９％(v/v)の水を含有する、請求項 １に記載の方法。 ９．前記組成物が組成物１mlあたり約１２５〜２５０ｍｇのアミホスチン、約５ 〜２０％(v/v)のエタノール、および約８０〜９５％(v/v)の水を含有する、請求 項１に記載の方法。 10．前記組成物が組成物１mlあたり約１００ｍｇのアミホスチン、約１０％(v/v )のエタノール、および約９０％(v/v)の水を含有する、請求項１に記載の方法。 11．段階（ｂ）の前記温度が約−５℃〜約−４０℃の範囲である、請求項１に記 載の方法。 12．段階（ｂ）の前記温度が約−２０℃である、請求項１に記載の方法。 13．滅菌段階をさらに含む、請求項１、４または５に記載の方法。 14．前記の滅菌段階が冷却に先立って段階（ａ）の前記組成物を滅菌 濾過することからなる、請求項13に記載の方法。 15．前記の結晶質アミホスチンがアミホスチンの水和物である、請求項１、４、 ５または14に記載の方法。 16．前記の結晶質アミホスチンがアミホスチン三水和物である、請求項１、４、 ５または14に記載の方法。 17．前記の結晶質アミホスチンが約１〜３モルの結晶水を含む、請求項１、４、 ５または１４に記載の方法。 18．前記組成物が製剤学的に許容される賦形剤をさらに含有する、請求項１、４ 、５または14に記載の方法。 19．前記賦形剤が塩化ナトリウム、グリシン、ブドウ糖、ショ糖、およびマンニ トールよりなる群から選ばれる、請求項18に記載の方法。 20．前記賦形剤がマンニトールである、請求項18に記載の方法。 21．結晶質アミホスチン組成物の調製方法であって、 （ａ）室温付近から約１０℃までの温度では粒子不含の溶液が得られるが、０ ℃以下に冷却するとアミホスチンの結晶質沈殿が生じるように、組成物１mlあた り約５０〜３００ｍｇのアミホスチン、約３〜３０％(v/v)のエタノール、約７ ０〜９７％(v/v)の水、任意に、組成物１mlあたり約５〜３００ｍｇの製剤学的 に許容される賦形剤を含有する組成物を調製し、 （ｂ）結晶質アミホスチンの沈殿を生じさせるのに十分な時間にわたり約−５ ℃〜約−４０℃の範囲内の温度に該組成物を冷却し、そして （ｃ）得られた混合物を真空乾燥して、安定性が向上した固体の結晶質アミホ スチン組成物を残存させる、各段階からなる方法。 22．段階（ａ）の後で段階（ｃ）の前に行う段階を約０．５〜７２時間にわたっ て実施する、請求項１、４、５または21に記載の方法。 23．段階（ａ）の後で段階（ｃ）の前に行う段階を約２〜２４時間にわたって実 施する、請求項１、４、５または21に記載の方法。 24．段階（ｃ）を約１〜７２時間にわたって実施する、請求項１、４、５または 21に記載の方法。 25．段階（ｃ）を約１０〜２０時間にわたって実施する、請求項１、４、５また は21に記載の方法。 26．段階（ｃ）を約１０〜１０００mTorrの真空下で実施する、請求項１、４、 ５または21に記載の方法。 27．段階（ｃ）を約１５０mTorrの真空下で実施する、請求項１、４、５または2 1に記載の方法。 28．請求項１、４、５、13、18または21の方法により調製された、安定性が向上 した結晶質アミホスチン組成物。 29．放射線防護または化学防護を必要とする被験者に、製剤学的に許容されるビ ヒクルを用いて再調製された、有効量の請求項28の結晶質アミホスチン組成物を 投与することからなる、放射線防護または化学防護を必要とする被験者の処置方 法。 30．前記の再調製された医薬組成物を非経口的に投与する、請求項29に記載の方 法。 31．前記の再調製された医薬組成物を静脈内、筋肉内、皮下、空洞内、または鞘 内に投与する、請求項29に記載の方法。 32．製剤学的に許容されるビヒクルを用いて注射可能な粒子不含の薬剤生成物に 再調製し得る、真空乾燥した結晶質アミホスチンを 含有する、安定性の向上した無菌組成物。 33．製剤学上の賦形剤をさらに含有する、請求項32に記載の無菌組成物。 34．前記賦形剤が塩化ナトリウム、グリシン、ブドウ糖、ショ糖、およびマンニ トールよりなる群から選ばれる、請求項33に記載の無菌組成物。 35．前記ビヒクルが注射用の水（ＵＳＰ）または生理食塩水である、 請求項32に記載の無菌組成物。 36．前記の結晶質アミホスチンがアミホスチンの水和物である、請求項32に記載 の無菌組成物。 37．前記の結晶質アミホスチンがアミホスチン三水和物である、請求項32に記載 の無菌組成物。 38．前記の結晶質アミホスチンが約１〜３モルの結晶水を含む、請求項32に記載 の無菌組成物。 39．約１０〜１０，０００ｍｇの真空乾燥した結晶質アミホスチン、および、任 意に約１０〜１０，０００ｍｇの製剤学的に許容される賦形剤を含有する、安定 性の向上した真空乾燥した結晶質アミホスチンの無菌の単回投与量組成物であっ て、製剤学的に許容されるビヒクルを用いて注射可能な粒子不含の薬剤生成物に 再調製することができる組成物。 40．約１００〜１０００ｍｇの真空乾燥した結晶質アミホスチンおよび約１００ 〜１０００ｍｇのマンニトールを含有する、請求項39に記載の無菌の単回投与量 組成物。 41．約５００ｍｇの真空乾燥した結晶質アミホスチンおよび約５００ｍｇのマン ニトールを含有する、請求項39に記載の無菌の単回投与量組成物。 42．放射線防護または化学防護を必要とする被験者に、再調製された有効量の請 求項32または33の無菌組成物を投与することからなる、放射線防護または化学防 護を必要とする被験者の処置方法。 43．放射線防護または化学防護を必要とする被験者に、再調製された有効量の請 求項39または40の単回投与量組成物を投与することからなる、放射線防護または 化学防護を必要とする被験者の処置 方法。 44．安定性が向上した真空乾燥アミホスチン。 45．前記アミホスチンが三水和物である、請求項44に記載の真空乾燥アミホスチ ン。 46．前記アミホスチンが結晶質である、請求項44に記載の真空乾燥アミホスチン 。 47．前記アミホスチンが三水和物である、請求項46に記載の真空乾燥アミホスチ ン。 48．実施例９に記載した結晶構造を実質的に有する結晶質アミホスチン三水和物 。 49．結晶質アミホスチン組成物の調製方法であって、 （ａ）室温付近の温度で粒子不含の溶液が得られるように、組成物１mlあたり 約１００ｍｇのアミホスチン、組成物１mlあたり約１００ｍｇの製剤学的に許容 される賦形剤、および約１２．５％(v/v)のエタノール水溶液を含有する組成物 を調製し、 （ｂ）該組成物を室温から約−３５℃へ約１６０分で冷却し、 （ｃ）該組成物を約−３５℃に約２４０分間維持して結晶質アミホスチンの種 結晶を形成させ、 （ｄ）該組成物を約０℃へ約２５分で温め、 （ｅ）該組成物を約０℃で約６００分間維持し、種結晶をアニールして結晶質 アミホスチンを沈殿させ、 （ｆ）該組成物を約０℃から約−１５℃へ約１５分で冷却し、 （ｇ）該組成物を約−１５℃から約−３５℃へ約１２０分で冷却し、 （ｈ）該組成物を約−３５℃で約１８０分間維持し、 （ｉ）該組成物の周囲の空気を排気して約１５０ミクロン以下の圧力となし、 （ｊ）該組成物を約−３５℃から約−２０℃へ約５４時間かけて温め、 （ｋ）該組成物を約−２０℃で約１２〜２４時間維持して、安定性の向上した 結晶質アミホスチン組成物を残存させる、 各段階からなる方法。