SK283318B6

SK283318B6 - Farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu a spôsob jeho výroby

Info

Publication number: SK283318B6
Application number: SK113-95A
Authority: SK
Inventors: Paul E. Kennedy; Roger A. Rajewski; John M. Baldoni
Original assignee: Medimmune Oncology, Inc.
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 2003-05-02
Also published as: SK11395A3; DE69333453D1; NO20005775D0; RU2125880C1; PL307298A1; NO950343L; JPH08500104A; PT655917E; NO5775A; MX9304627A; EP0655917A1; CA2120133C; HU227122B1; CZ23095A3; IS1843B; ATE261729T1; CA2120133A1; IS4060A; HK1010692A1; NZ255182A

Abstract

Farmaceutický prostriedok s obsahom kryštalického amifostínu a prípadne farmaceuticky prijateľnej látky a spôsob jeho výroby. Prostriedok je vhodný ako látka chrániaca proti účinkom žiarenia alebo proti účinkom chemických látok. Riešenie sa týka aj liekovej formy s obsahom kryštalického amifostíntrihydrátu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutického prostriedku s obsahom amifostínu, S-2-(3-aminopropylamino)etyldihydrogenfosfortioátu so zvýšenou stálosťou a taktiež sa týka spôsobu výroby farmaceutického prostriedku z amifostíntrihydrátu v kryštalickej forme.

Doterajší stav techniky

Účinná látka S-2-(3-aminopropylamino)etyldihydrogenfosfortioát, ktorá je známa aj ako amifostin, etiofos, Etyoľ®, NSC 296961 a WR-2721 a ďalej bude v priebehu prihlášky uvádzaná ako amifosfln a aj ďalšie látky tohto typu boli opísané v US patentovom spise č. 3 892 824 (Piper a ďalší). Uvedený patentový spis opisuje tiež známe postupy na výrobu kryštalickej formy amifostínu. Tieto kryštalické formy amifostínu sú pomerne stále pri teplote miestnosti počas niekoľkých rokov a pri teplote 50 °C niekoľko mesiacov. Uvedené látky boli pôvodne vyvinuté ako ochranné látky proti žiareniu, zvlášť proti rtg-žiareniu alebo jadrovému žiareniu, najmä pokiaľ môže k zasiahnutiu takýmto žiarením dôjsť v priebehu vojnových konfliktov.

Okrem svojho použitia proti účinkom žiarenia má amifostín podľa výsledkov vykonaných skúšok aj dobré použitie ako ochranná látka nielen proti žiareniu, ale aj proti chemickým látkam pri mierovom využití, napríklad ako ochrana proti nežiaducim účinkom, ktoré môžu vzniknúť v priebehu liečenia zhubných nádorov ožiarením a pri použití rôznych chemoterapeutíckých látok, napríklad alkylačných činidiel, ako cyklofosfamid, cisplatín karboplatín, doxorubicín a derivátov týchto látok a tiež mitomycínu a jeho derivátov. Podobne bolo tiež opísané, že amifostin už bol použitý klinicky na ochranu chorých, infikovaných HIV (AIDS) pred nepriaznivými vedľajšími účinkami pri liečbe 3'-azido-3'-deoxytymidínom, AZT. Amifostin a jeho deriváty majú požadovaný ochranný účinok, bez toho, aby v podstatnej miere došlo k ovplyvneniu priaznivých účinkov podávaných liečebných látok. Tento účinok je aspoň z časti spôsobený selektívnym príjmom tiolovej skupiny, ktorá je ochrannou skupinou, do normálneho neporušeného tkaniva.

Pod pojmom „amifostin na liečebné účely“ sa rozumie látka, vopred vysušená vo vákuu, dodávaná aj vo forme trihydrátu. Bežne dodávané sterilné prostriedky s obsahom amifostínu budú ďalej uvádzané ako „amorfný amifostin“, zatiaľ čo forma, ktorá je podstatou vynálezu, bude uvádzaná ako „kryštalický amifostin“, aby bolo možné obe tieto formy od seba slovne odlíšiť. Pokiaľ nie je výslovne uvedené inak, sú uvádzané množstvá tejto látky prepočítané na bezvodú bázu.

Hoci má amifostin celý rad výhodných vlastností, vznikajú značné problémy pri pokusoch spracovať túto látku na stály sterilný prostriedok, ktorý by bolo možné vhodným spôsobom podávať.

Súčasný spôsob výroby a balenie amifostínu spočíva v tom, že sa táto látka plní do vopred sterilizovaných nádobiek vo forme sterilizovaného vodného roztoku s obsahom amifostínu vo vopred stanovenom objeme, nádobky aj s obsahom sa ochladia a potom sa rozpúšťadlo odstráni lyoftlizáciou, čím vznikne v každej nádobke vopred stanovené množstvo suchého amifostínu, ako bolo opísané v publikácii L. Lachman a ďalší, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, str. 62 až 63, 1986. Pri tomto postupe sú vyriešené podstatné praktické problémy, týkajúce sa balenia tuhého amifostínu za sucha vo forme zhlukov alebo vo forme voľne sypného prášku. Takéto plnenie je spojené s ťažkosťami pri manipulácii s práškovým materiálom vzhľadom na to, že práškový materiál je nutné mlieť na prijateľnú veľkosť častíc a dostatočnú sypnosť za aseptických podmienok, ďalšou ťažkosťou je naplnenie presnej dávky tuhého amifostínu do každej nádoby.

Ale bežne dodávaný farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu zvyčajne obsahuje amorfnú formu, získanú lyofilizáciou, táto forma však nie je stála za rôznych tepelných podmienok, najmä pri vyššej teplote. V dôsledku toho je nutné udržovať lyofilizovaný materiál na teplote -20 °C a tiež ho prepravovať pri teplote -70 °C až -20 °C tak, aby nedošlo k rozkladu farmaceutického prostriedku. Nutnosť udržiavania nízkych teplôt v priebehu skladovania a dopravy je veľkou nevýhodou bežne dodávaných, vo vákuu sušených foriem amifostínu. Pri skladovaní a preprave týchto farmaceutických prostriedkov vznikajú zvláštne náklady na balenie a chladenie. Okrem toho nie je možné zásobovať týmito prostriedkami zdravotnícke zariadenia, ktoré nie sú vybavené mraziacim zariadením na skladovanie a tieto zariadenia teda nemôžu používať amifostin pre svojich chorých, ide najmä o zdravotnícke zariadenia vo vývojových krajinách. Ale vzhľadom na to, že zatiaľ nebol k dispozícii žiadny iný farmaceutický prostriedok, boli klinické pokusy vykonávané s použitím uvedeného prostriedku.

Je zrejmé, že by bolo potrebné vyvinúť liekovú formu s dostatočnou stálosťou pri teplote miestnosti za menej silného ochladenia tak, ako tomu je v prípade iných farmaceutických prostriedkov.

Vynález si kladie za úlohu navrhnúť nový postup, ktorým by bolo možné získať tuhý farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu, sušeného vo vákuu, prípadne s farmaceutickými pomocnými látkami, ako je manitol a so zlepšenou stálosťou v porovnaní so známym farmaceutickým prostriedkom.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu, ktorého podstatou je, že obsahuje sterilný kryštalický amifostíntrihydrát s kryštalickou štruktúrou, obsahujúci priestorovú skupinu P2_l2₁2_lj s rozmermi a = 8,46x ΙΟ⁴⁰ m, b = 21,55 x 10⁴°m a c = 6,76 x 10⁴⁽¹m, vhodný na rekonštitúciu vo farmaceutický prijateľnom nosnom prostredí na produkt, zbavený časticového materiálu, určený na injekčné podanie.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže ďalej obsahovať ešte farmaceutický prijateľnú pomocnú látku, pričom táto pomocná látka môže byť vybraná zo skupiny chlorid sodný, glycín, dextróza, sacharóza a manitol.

Farmaceutickým prostredím na rekonštitúciu môže byť voda na injekčné podanie alebo fyziologický roztok chloridu sodného.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu obsahuje výhodne ako jednotlivú dávku 10 až 10 000 mg kryštalického amifostíntrihydrátu sušeného vo vákuu a prípadne 10 až 10 000 mg farmaceutický prijateľnej pomocnej látky a je určený na rekonštrukciu vo farmaceutický prijateľnom prostredí na produkt, zbavený tuhých častíc a vhodný na injekčné podanie.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže výhodnejšie obsahovať 100 až 1000 mg kryštalického amifostíntrihydrátu, sušeného vo vákuu a 100 až 1000 mg manitolu a najvýhodnejšie môže obsahovať 500 mg kryštalického amifostíntrihydrátu, sušeného vo vákuu a 500 mg manitolu.

Podstatu vynálezu ďalej tvorí spôsob výroby farmaceutických prostriedkov s obsahom kryštalického amifostínu, tento postup spočíva v tom, že sa

a) pripraví prostriedok s obsahom aminoalkyldihydrogenfosfortioátu všeobecného vzorca RHN(CH₂)_nNH(CH₂)_raSPOjH₂ alebo hydrátov tejto látky, alebo solí s alkalickým kovom, kde R znamená vodík alebo alkyl s 1 až Ί atómami uhlíka a n a m sú nezávislé celé čísla 2 až 6, etanolu a vodného rozpúšťadla, v ktorom relatívny pomer účinnej látky, etanolu a vody je taký, že vzniká roztok, zbavený častíc pri teplote miestnosti až teplote 10 °C, po ochladení na teplotu nižšiu ako 0 °C však vzniká kryštalická zrazenina aminoalkyldihydrogenfosfortioátu,

b) prostriedok sa ochladí na teplotu nižšiu ako 0 °C v čase, dostatočnom na vyzrážanie kryštalického aminoalkyldihydrogenfosfortioátu, potom sa

c) výsledná zmes suší vo vákuu za vzniku tuhého kryštalického prostriedku so zvýšenou tepelnou stálosťou.

V ďalšom prípadnom stupni podľa vynálezu je možné plniť farmaceutický prostriedok v prítomnosti sterilného inertného plynu, ako argónu, dusíka alebo hélia. Teplota, pri ktorej sa prostriedok chladí na vyzrážanie kryštalickej účinnej látky je v oblasti eutektického bodu prostriedku. Prostriedok môže výhodne obsahovať pomocné látky, napríklad manitol.

Aminoalkyldihydrofosfortioáty, vhodné na použitie pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu, zahrnujú napríklad nasledujúce zlúčeniny: S-2-(3-aminopropylamino)etyldihydrogenfosfortioát (amifostín), S-2-(3-metylaminopropylamino)etyldihydrogenfosfortioát (WR-3689), S-2-(3-ctylaminopropylamino)etyldihydrogenfosfortioát, S-2-(3-aminopropylamino)-2-metylpropyldihydrogenfosfortioát, S-2-(2-aminoetylamino)-2-etyldihydrogenfosfortioát, S-2-(4-aminobutylamino)2-etyldihydrogenfosfortioát, S-2-(5-aminopentylamino)-2-etyldihydrogenfosfortioát, S-2-(6-aminohexylamino)-2-etyldihydrogenfosfortioát, S-2-(2-metylaminoetylamino)-2-etyldihydrogenfosfortioát, S - 2-(3 -metylaminopropylamino)-2-etyldihydrogenfosfortioát a S-3-(3-metylaminopropylamino)-3-propyldihydrogenfosfortioát (WR-151327). Vo výhodnom uskutočnení je aminoalkyldihydrogenfosfortioátom amifostín, WR-3689, WR-151327, najvýhodnejší je amifostín.

Vo zvláštnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa teplota zmesi, získanej v stupni b) zvýši na teplotu v rozmedzí 1 °C až 20 °C nad eutektickú teplotu prostriedku s následným ochladením z tejto teploty späť na eutektickú teplotu alebo nižšiu skôr, než sa uskutoční v stupni c) sušenie farmaceutického prostriedku vo vákuu. V špecifických prípadoch sa môže eutektickú teplota farmaceutického prostriedku pohybovať v rozmedzí -80 °C až 0 °C, takže teplota, na ktorú je potrebné zmes zohriať pred opätovným ochladením na eutektickú teplotu, sa môže pohybovať v rozmedzí -30 °C až 10 °C.

Spôsobom podľa vynálezu sa získa prostriedok, ktorý obsahuje 50 až 400 mg účinnej látky na ml prostriedku, približne 1 až 35 % objemových etanolu a približne 65 až 99 % objemových vody. Výhodne obsahuje prostriedok približne 125 až 250 mg účinnej látky na ml, približne 5 až 20 % objemových etanolu a približne 80 až 95 % objemových vody. Vo zvlášť výhodnom uskutočnení obsahuje prostriedok približne 100 mg účinnej látky na ml, približne 10 % objemových etanolu a približne 90 % objemových vody.

Teplota v rôznych stupňoch, pri ktorých sa vykonáva chladenie a sušenie vo vákuu, sa môže meniť v širokom rozmedzí v závislosti od špecifických pomerov aminoal kyldihydrogenfosfortioátu k etanolu a k vode. Ale zvyčajne sa teplota v stupňoch b) a c) pohybuje v rozmedzí -40 až -5 °C, výhodne je približne -20 °C.

V špecifickom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu postup zahrnuje aj sterilizačný stupeň. Túto sterilizáciu je možné uskutočniť celým radom postupov, ktoré sú v danej oblasti techniky známe, napríklad zohrievaním zmesi v autokláve, ožiarením prostriedku pomocou gama-žiarenia, prekryštalizovaním za aseptických podmienok alebo sterilizáciou roztoku pomocou filtrácie, napríklad použitím filtra s priemerom otvorov 0,2 pm. Ďalej je nutné uviesť, že kryštalický aminoalkyldihydrogenfosfortioát môže byť bezvodý alebo môže obsahovať kryštalizačné rozpúšťadlo. Napríklad kryštalický amifostín môže byť výhodne bezvodý alebo môže mať formu solvátu alebo hydrátu, napríklad monohydrátu alebo trihydrátu. Hydráty zvyčajne obsahujú 1 až 5, výhodne 1 až 3 móly kryštalizačnej vody.

V ďalšom uskutočnení spôsobu výroby farmaceutického prostriedku je možné rozpustiť aminoalkyldihydrogenfosfortioát, napríklad amifostín spolu s akýmkoľvek požadovaným pomocným prostriedkom vo vode na injekčné použitie podľa US liekopisu a výsledný roztok je potom možné sterilizovať pomocou filtrácie.

Potom sa pridá požadované množstvo sterilného etanolu, ktorý zodpovedá požiadavkám US liekopisu, čím sa získa prostriedok, ktorý je potom možné ochladiť alebo zohriať uvedeným spôsobom.

Farmaceutické prostriedky, získané spôsobom podľa vynálezu, môžu ďalej obsahovať pomocné látky, prijateľné z farmaceutického hľadiska. Vhodné pomocné látky zahrnujú napríklad chlorid sodný, propylénglykol, sacharózu, dextrózu, sorbitol, inositol, manitol, glycín, arginín alebo iné aminokyseliny, výhodne manitol a najvýhodnejšie manitol NF.

Podstatu vynálezu teda tvorí spôsob výroby farmaceutického prostriedku s obsahom kryštalického amifostínu, tento postup spočíva v tom, že sa

a) pripraví prostriedok, obsahujúci 50 až 300 mg amifostínu na 1 ml, približne 3 až 30 % objemových etanolu, približne 70 až 97 % objemových vody a prípadne približne 5 až 300 mg farmaceutický prijateľného pomocného prostriedku na 1 ml za vzniku roztoku, zbaveného tuhých častíc pri teplote miestnosti až teplote približne 10 °C, ale po ochladení pod 0 °C v prostriedku vznikne kryštalická zrazenina amifostínu,

b) zmes sa ochladí na teplotu v rozmedzí približne -40 až -5 °C na čas, dostatočný na vyzrážanie kryštalického amifostínu a

c) výsledná zmes sa suší vo vákuu za vzniku tuhého prostriedku s obsahom kryštalického amifostínu pri zvýšenej tepelnej stálosti.

Všeobecne sa postupy, vykonávané po stupni a) a pred stupňom c) uskutočnia v priebehu približne pol až 72 hodín, výhodne v priebehu 2 až 24 hodín. Tie postupy, ktoré sa vykonávajú v rámci stupňa c), sú vykonávané v priebehu časového obdobia 1 až 72 hodín, výhodne v priebehu 10 až 20 hodín. Okrem toho sa sušenie vo vákuu v stupni c) vykonáva pri hodnotách 1,33 až 133 Pa, výhodne 19,8 Pa.

Podstatu vynálezu tvorí aj spôsob výroby sterilného farmaceutického prostriedku so zvýšenou tepelnou stálosťou, v ktorom účinná zložka, to znamená kryštalický aminoalkyldihydrogenfosfortioát, napríklad amifostín, zostáva stály aspoň 2 roky pri teplote približne 4 °C. Výhodne zostáva kryštalický aminoalkyldihydrogenfosfortioát, napríklad amifostín stály pri teplote miestnosti najmenej 2 roky. To znamená, že sa získava sterilný prostriedok so zvýšenou tepelnou stálosťou s obsahom kryštalického amifostínu, tento prostriedok môže byť rekonštituovaný pridaním nosného prostriedku, prijateľného z farmaceutického hľadiska za vzniku injekčného prostriedku, zbaveného tuhých častíc. Výhodne sa sterilný prostriedok vyrába ako prostriedok, rozdelený na jednotlivé sterilné dávky so zvýšenou tepelnou stálosťou, ktoré obsahujú približne 10 až 10 000 mg kryštalického amifostínu a prípadne približne ešte 10 až 10 000 mg pomocného prostriedku, prijateľného z farmaceutického hľadiska, takto získaný prostriedok je možné rekonštituovať pridaním nosného prostredia, prijateľného z farmaceutického hľadiska na produkt, zbavený tuhých častíc a vhodný na injekčné podanie. Vo zvlášť výhodnom uskutočnení obsahuje takto získaný prostriedok, rozdelený na sterilné jednotlivé dávky približne 100 až 1000 mg kryštalického amifostínu a približne 100 až 1000 mg pomocného prostriedku. V najvýhodnejšom uskutočnení obsahuje sterilný prostriedok, rozdelený na jednotlivé dávky približne 500 mg kryštalického amifostínu a približne 500 mg manitolu. Nosné prostredie je možné voliť zo širokej škály nosných prostredí, prijateľných z farmaceutického hľadiska a môže teda ísť napríklad o vodu pre injekčné podanie podľa US liekopisu, o fyziologický roztok chloridu sodného podľa US liekopisu, o 5 % dextrózu vo vode podľa US liekopisu alebo o vodné pufre.

Takto spracované farmaceutické prostriedky, získané spôsobom podľa vynálezu, je možné použiť na ochranu proti rádioaktívnemu žiareniu alebo proti pôsobeniu chemických látok, v týchto prípadoch sa podáva účinné množstvo farmaceutického prostriedku, obsahujúceho kryštalický aminoalkyldihydrogenfosfortioát, obsahujúci kryštalický aminoalkyldihydrogenfosfortioát uvedeného všeobecného vzorca, napríklad amifostín po rekonštitúcii kryštalického prostriedku v nosnom prostredí, prijateľného z farmaceutického hľadiska. Takto rekonštituovaný farmaceutický prostriedok je možné podávať parenterálne. V prípade potreby je rekonštituovaný farmaceutický prostriedok možné podávať vnútrožilovo, vnútrosvalovo, podkožné, do telesných dutín alebo intratekálne.

Podrobný opis výhodných uskutočnení

Až dosiaľ dostupný farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu, Etyol®, je tepelne nestály. Vzhľadom na nestálosť tohto prostriedku je nevyhnutné ho skladovať a prepravovať pri veľmi nízkych teplotách, aby nedošlo k degradácii účinnej látky v produkte.

Vynález prvýkrát uvádza stály, vo vákuu vysušený farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu, ktorý je možné bežne prepravovať a skladovať pri teplote 4 °C až teplote miestnosti po dlhé časové obdobie bez podstatnejšej degradácie produktu, ide teda o roztok, ktorého potreba bola dlho zrejmá. Prostriedok je možné prepravovať a skladovať v nemocniciach po celom svete aj v prípade, že tieto nemocnice nie sú vybavené skladovacím mraziacim zariadením, tak ako to bolo až dosiaľ nutné v prípade známeho prostriedku.

Neočakávane bolo zistené, že sterilný a stály produkt s obsahom kryštalického amifostínu, prípadne s obsahom pomocnej látky alebo látok, napríklad manitolu, je možné pripraviť tak, že sa vo vákuu suší amifostín z roztoku v zmesi vody a etanolu s obsahom etanolu približne 1 až 35 % objemových.

Po počiatočných skúškach bola najprv' stanovená

1. rozpustnosť amifostínu v mg/ml v zmesiach a rôznym pomerom vody a etanolu,

2. rozpustnosť amifostínu v zmesi vody a etanolu pri rôznych teplotách,

3. vhodná teplota v lyofilizačnom zariadení, nutná na vyzrážanie amifostínu pred sušením vo vákuu a

4. koncentrácia etanolu, ktorá je potrebná na vytvorenie presýteného roztoku, v ktorom po ochladení na požadovanú teplotu v lyofilizačnom zariadení dôjde k vyzrážaniu amifostínu v kryštalickej forme.

Z uvedených skúšok, ktoré budú podrobnejšie rozvedené v príkladovej časti prihlášky, bolo zistené, že výhodná koncentrácia bezvodého amifostínu bola 100 mg/ml v približne 10 % vodnom etanole. Ďalej bolo zistené, že k vyzrážaniu amifostínu dochádza výhodne pri teplote približne -20 °C.

Aby bolo možné získať dobre spracovateľný filtračný koláč, je potrebné, aby sa podiel etanolu v zmesi etanolu a vody pohyboval v rozmedzí 1 až 35 % objemových etanolu, ide napríklad o pomer etanolu a vody 1 : 99 alebo 35 : 65. Teplota v lyofilizačnom zariadení sa môže pohybovať v rozmedzí -40 až -10 °C, výhodná teplota je približne -20 °C. Výsledky predbežných skúšok sa stali dôležitým podkladom na úpravu koncentrácie etanolu a teploty pre rôzne kombinácie objemu zásobníka a veľkosti náplne.

Zvyčajne sa postupuje tak, že sa lyofilizačné zariadenie predchladí na teplotu -30 °C až -15 °C, výhodne -20 °C. Nádobky sa naplnia a teplota sa znovu upraví na tú istú hodnotu a potom sa nádobky s obsahom na tejto teplote udržujú počas približne 20 hodín. V závislosti od koncentrácie etanolu a amifostínu alebo amifostínu a pomocnej látky v roztokoch a v závislosti od koncentrácie etanolu sa bude meniť aj teplota, ktorá je potrebná na vyzrážanie účinnej látky. Potom sa vyzráža kryštalický amifostín a nato sa prostriedok zmrazí.

Hneď ako dôjde k zmrazeniu prostriedku, je možné prostriedok sušiť na odstránenie hlavného podielu vody a etanolu. Zvyčajne sa tlak zníži na približne 19,8 Pa. Primárny cyklus sušenia je ukončený približne po viac než 2 hodinách pri teplote približne -20 ± 2 °C. V priebehu sekundárneho sušenia sa prostriedok udržuje na teplote približne -20 °C až 10 °C, výhodne na teplote vy ššej než v priebehu primárneho sušenia počas približne 40 až 50 hodín na uľahčenie sekundárneho stupňa sušenia, to znamená odstránenie zvyškov vody a etanolu. Hneď ako parciálny tlak vody a etanolu dosiahnu stálu úroveň, považuje sa sušenie za ukončené. Týmto spôsobom je možné získať produkty, sušené vo vákuu s obsahom kryštalického amifostínu so zvýšenou stálosťou v porovnaní so známym prostriedkom s obsahom amorfného amifostínu. Nádobky s obsahom tohto prostriedku je možné skladovať a prepravovať pri teplote 4 °C až teplote miestnosti, bez toho aby došlo k podstatnejšej degradácii produktu.

K prostriedku je možné pridávať pomocné prostriedky, najmä na zvýšenie množstva tuhého podielu v prostriedku. Z pomocných látok, vhodných na toto použitie jednotlivo alebo v zmesi je možné uviesť fosforečnan sodný alebo draselný, chlorid sodný, kyselinu citrónovú, kyselinu vínnu, želatínu a rôzne uhľohydráty, ako sú dextróza, sacharóza, sorbitol, inositol, manitol a dextrán. Okrem toho je možné použiť ešte iné látky, bežne používané na tieto účely.

Tuhé prostriedky s obsahom kryštalického amifostínu, sušeného vo vákuu môžu byť uložené do nádobiek s obsahom jednotlivej dávky aseptickým plnením vhodných nádobiek sterilným roztokom, vopred sušeným vo vákuu na požadovaný obsah amifostínu, potom sa pripraví tuhý prostriedok a nádobka s obsahom jednej dávky sa hermeticky uzavrie. Tieto nádobky dovoľujú rýchle rozpustenie tuhého prostriedku pri rekonštitúcii vhodným sterilným riedidlom in situ za vzniku sterilného roztoku s koncentráciou amifostínu, vhodnou na okamžité podanie. Pojem „vhodná

SK 283318 Β6 nádobka“, tak ako je v priebehu prihlášky používaný, znamená nádobku, vhodnú na uloženie sterilného materiálu, napríklad fľaštičku, do ktorej je možné uložiť produkt, sušený vo vákuu a potom ju hermeticky uzavrieť zátkou. Nádobka musí mať vhodnú veľkosť v závislosti od objemu roztoku po rekonštitúcii produktu, sušeného vo vákuu a musí byť vyrobená z vhodného materiálu, zvyčajne ide o sklo typu I. Zátka je tvorená napríklad sterilnou gumou alebo ekvivalentným materiálom tak, aby bolo možné zátkou vstreknúť príslušné riedidlo, napríklad sterilnú vodu na injekčné podanie podľa US liekopisu, fyziologický roztok chloridu sodného podľa US liekopisu alebo 5 % roztok dextrózy vo vode podľa US liekopisu na «konštitúciu amifostínu na požadovaný roztok. Požiadavky na vhodnosť veľkosti a materiálu nádobiek na farmaceutické produkty sú v danej oblasti techniky známe.

Tuhým prostriedkom podľa vynálezu boli zlepšené fyzikálne vlastnosti produktu, ale neočakávane bolo dokázané, že získaný ľahko rozpustný produkt má aj zlepšenú tepelnú stálosť v porovnaní s dosiaľ známymi bežne používanými prostriedkami. Pri sledovaní zlepšenia chemickej stálosti pri sušení vo vákuu sa porovnáva stálosť tuhého materiálu po sušení vo vákuu so stálosťou roztoku farmaceutického prostriedku. Prostriedok podľa vynálezu však má vyššiu stálosť než tuhé produkty s obsahom tej istej účinnej látky, získanej odlišným spôsobom, ako bude opísané v príkladovej časti.

Farmaceutické prostriedky, získané spôsobom podľa vynálezu, sú vhodné na parenterálne podanie, napríklad vnútrožilové, vnútrosvalové, intratekálne a podkožné podanie alebo na podanie do telesných dutín.

Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Vynález bude ďalej opísaný podrobnejšie najskôr v súvislosti s priloženými výkresmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je graficky znázornená rozpustnosť pre amifostín WR-2721 v roztokoch s obsahom vody a etanolu za rôznych tepelných podmienok, na osi y je uvedená teplota v stupňoch Celzia, na osi x množstvo amifostíntrihydrátu v mg/ml.

Na obr. 2 je znázornená grafická závislosť rozpustnosti amifostínu od koncentrácie etanolu, na osi y je znázornené množstvo etanolu v % objemových, na osi x množstvo amifostíntrihydrátu v mg/ml.

Na obr. 3 sú znázornené výsledky TGA pre kryštalický amifostín v 10 % etanole vo vode.

Na obr. 4 je znázornený priebeh TGA pre čistý amifostín. Na obr. 5 je znázornená diferenciálna kalorimetria DSC pre kryštalický amifostín použitím 10 % etanolu vo vode.

Na obr. 6 je znázornená diferenciálna kalorimetria pre čistý amifostín.

Na obr. 7 je znázornený priebeh FTIR pre kryštalický amifostín s použitím 10 % etanolu vo vode.

Na obr. 8 je znázornený priebeh FTIR s použitím kryštalického amifostínu.

Na obr. 9 je znázornená difrakcia rtg-lúčov s použitím kryštalického amifostínu v zmesi 10 % etanolu vo vode.

Na obr. 10 je znázornená difrakcia rtg-žiarenia použitím čistého amifostínu.

Na obr. 11 je znázornený priebeh TGA pre kryštalický amifostín, ktorý bol spracovaný spoločne s manitolom s použitím 10 % etanolu vo vode.

Na obr. 12 je znázornený priebeh diferenciálnej kalorimetrie pre kryštalický amifostín, ktorý bol spracovaný spolu s manitolom s použitím 10 % etanolu vo vode.

Na obr. 13 je znázornená molekulová a kryštalická štruktúra amifostínu, sušeného vo vákuu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Predbežné pokusy

V tomto príklade sa opisujú výsledky pokusov, pri ktorých boli vyhodnotené rôzne parametre, napríklad koncentrácia amifostínu, koncentrácia etanolu a teplota tak, aby bolo možné získať sterilný, vo vákuu sušený kryštalický amifostín sám osebe alebo v zmesi s farmaceutickými pomocnými látkami pri sušení roztoku účinnej látky v zmesi vody a etanolu.

A. Príprava roztoku

Do skúmaviek, opatrených skrutkovacími uzávermi, boli uložené nasledujúce kvapaliny:

a) 5000 pl vody,

b) 4750 pl vody a 250 pl etanolu,

c) 4500 pl vody a 500 pl etanolu,

d) 4250 pl vody a 750 pl etanolu,

e) 4000 pl vody a 1000 pl etanolu.

Do každej skúmavky sa pridáva amifostín tak dlho, až sa tuhá látka prestane rozpúšťať a zostane nerozpustený podiel. Potom sa roztok spracováva 30 sekúnd ultrazvukom. V prípade, že sa všetok amifostín rozpustí, pridáva sa ďalšie množstvo tejto látky opäť tak dlho, až zostane nerozpustený podiel. Potom sa skúmavky 30 minút energicky pretrepávajú pri teplote 25 °C.

B. Príprava štandardných roztokov

Pripraví sa 10 ml nasledujúcich roztokov účinnej látky vo vode:

a) 0,05 mg/ml,

b) 0,1 mg/ml,

c) 0,3 mg/ml,

d) 0,5 mg/ml.

Použitím UV spektrometra sa každý roztok zmerá proti vode pri 190 až 290 nm. Absorbancia sa zaznamenáva pri 200 nm alebo 210 nm. Potom sa vykoná lineárna analýza regresie štandardných údajov pri 200 nm alebo 210 nm, čím sa získa zodpovedajúci grafický vzťah.

C. Analýza vzoriek roztoku

Odoberie sa približne 0,5 ml každého roztoku a roztok sa odstredí na usadenie tuhého podielu. Potom sa každá vzorka prefiltruje použitím filtra s priemerom otvorov 0,45 pm na odstránenie prebytočných častíc v prípade potreby. Každá vzorka sa zriedi vodou na koncentráciu 0,3 až 0,4 mg/ml. Na UV spektrofotometri sa každá vzorka sleduje v rozmedzí 190 až 290 nm. Hodnoty pre každú vzorku sa odpočítajú pri 200 alebo 210 nm. Podľa štandardnej krivky a riedenia sa vypočíta koncentrácia účinnej látky v každom roztoku. Potom sa roztok ochladí vždy na nasledujúcu nižšiu teplotu a pri tejto teplote sa udržuje 1 hodinu, potom sa meranie opakuje. V nasledujúcej tabuľke 1 sú uvedené výsledky rozpustnosti amifostínu v zmesi etanolu a vody pri rôznych teplotách. Tie isté vzťahy sú vyhodnotené graficky na obr. 1 a 2.

Tabuľka 1

Priemerná rozpustnosť amifostíntrihydrátov v zmesi etanolu a vody v mg/ml

	25 *C	10’C	5’C	0 *C	-5*C	-10’C
voda	425,7	264.0	251,2	204,7	199,8	NO
1% etanol	396.0	256,3	236,7	195,1	184,2	NO
2% etanol	370,9	241,7	226,6	189,6	177,2	186,1
3% etanol	389,0	220,4	204,7	162,4	154,1	NO
4% etanol	308,8	172,4	161,9	131,1	123,3	117,4
5¾ etanol	302,9	152,7	144,7	115,0	111,7	101,7
10% etanol	188,0	84,5	76,2	57,6	55,3	52,5
15% etanol	106,3	36,6	34.7	26,6	25,7	22,5
20% etanol	68,8	19,5	23.4	13,4	12,2	11.5

NO nebolo vykonané

Výsledky pokusov v tomto príklade dokazujú, že rozpustnosť amifostínu je silne závislá tak od množstva etanolu, pomocného rozpúšťadla, ako aj od teploty. Zvyčajne sa stupeň presýtenia, ku ktorému dochádza pri poklese teploty daného roztoku amifostínu, znižuje so zvyšujúcim sa množstvom etanolu. Táto závislosť je využitá v nasledujúcich príkladoch 2 a 3 tak, aby bol získaný kryštalický amifostín.

Príklad 2

Príprava kryštalického amifostínu bez manitolu

K 130 ml vody sa pri teplote 25 °C za miešania pridá 21,25 g amifostíntrihydrátu, čo je množstvo, ekvivalentné 17,0 g bezvodého amifostínu. Po úplnom rozpustení amifostínu sa k roztoku za miešania pridá 17 ml absolútneho etanolu podľa US liekopisu. Potom sa roztok doplní vodou na objem 170 ml. Výsledný roztok sa sterilizuje cez filter s priemerom ôk 0,22 pm. Do každej z 33 fľaštičiek s objemom 10 ml sa uloží vždy 5 ml prefiltrovaného roztoku, takže každá fľaštička obsahuje 500 mg amifostínu, vztiahnuté na bezvodú bázu v zmesi etanolu a vody v pomere 10 : 90. Fľaštičky sa uzatvoria zátkami a vzorky sa sušia vo vákuu nasledujúcim spôsobom. Fľaštičky sa uložia do lyofilizačného zariadenia, vopred ochladeného na -20 °C na čas 17 hodín pri atmosférickom tlaku, potom sa priestor evakuuje a udržuje 28 hodín na teplote -20 °C. V priebehu tohto času sú fľaštičky otvorené. Po uplynutí tohto času sa priestor naplní dusíkom a nádobky sa rýchlo ručne zazátkujú. Týmto spôsobom sa získa tepelne stály lyofilizovaný produkt, uložený vo fľaštičkách, obsahujúci približne 500 mg kryštalického amifostínu.

Príklad 3

Spôsob výroby kryštalického amifostínu

K 150 ml vody sa pri teplote 25 °C pridá približne 20 g manitolu. K vzniknutému roztoku sa za miešania pridá približne 25 g amifostíntrihydrátu, čo je množstvo, ekvivalentné 20 g bezvodej bázy. Po úplnom rozpustení sa pridá 20 ml bezvodého etanolu podľa US liekopisu za miešania. Potom sa roztok doplní vodou na 200 ml. Výsledný roztok sa sterilizuje filtráciou cez filter s priemerom ôk 0,2 pm a vždy 5 ml roztoku sa uloží do každej zo 40 nádobiek s obsahom 10 ml. Vzorky sa uložia do lyofilizovaného zariadenia pri teplote miestnosti a potom sa teplota znižuje rýchlosťou 2 °C za minútu až na -25 °C a na tejto teplote sa udržuje 90 minút na začatie kryštalizácie amifostínu. Po tomto čase sa teplota opäť zvýši nad eutektický bod rýchlosťou 2 °C za minútu až na -5 °C a na tejto teplote sa udržuje celkom 10 hodín. Potom sa teplota opäť zníži na -25 °C tak, aby teplota produktu bola nižšia než -18 °C v čase dlhšom než 60 minút. Po tomto čase sa upraví tlak v lyofilizačnom zariadení na približne 19,8 Pa. Teplota sa zvýši na -20 °C a vzorky sa sušia 14 hodín. Po tomto čase sa teplota nádoby vyrovná s teplotou celého zariadenia, čo znamená, že primáme sušenie je ukončené. Nádobky sa nechajú pri tlaku 19,8 Pa a teplote zariadenia -20 °C v zariadení ešte 13,4 hodín, aby bolo možné zaistiť odstránenie vody, nevytvárajúcej hydrát. Potom sa priestor naplní dusíkom a nádobky sa mechanicky zazátkujú. Týmto spôsobom sa získa tepelne stály, vo vákuu vysušený produkt, uložený v nádobkách, obsahujúcich približne 500 mg amifostínu, vztiahnuté na bezvodú bázu a 500 mg manitolu.

Príklad 4

Skúšky na stálosť kryštalického amifostínu, sušeného vo vákuu

Niekoľko uzavretých, dusíkom naplnených fľaštičiek s obsahom kryštalického amifostínu v zmesi etanolu a vody v pomere 10 : 90, tak ako boli pripravené v príklade 2 sa zohrieva na teplotu 50 °C až 35 dní na stanovenie tepelnej stálosti kryštalického amifostínu.

Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 2. Všetky údaje sú uvádzané v percentách počiatočnej koncentrácie, ktorá sa považuje za 100 %.

Tabuľka 2

pokus	doba pri 50 *C (dni)	% počiatočnej koncentrácie
\|	0	100,0
	3	106.3
	35	96.9
2	0	100,0
	3	97.2
	7	101,1
	14	93,9
	21	71.1
3	0	100,0
	3	103,6
	7	101,8
	14	97,5
	21	86,7

Na porovnanie bol aj bežne dodávaný prostriedok s obsahom amorfného amifostínu podrobený podobným skúškam tak, že bol zohrievaný pri teplote 50 °C počas až 28 dní. Výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 3. Všetky údaje sú opäť uvádzané v percentách počiatočnej koncentrácie, ktorá je považovaná za 100 %.

Tabuľka 3

pokus	3ooa pn so *c (dni)	% počiatočnej koncentrácie
1	0	100,0
	14	2.8
	28	1,5
2	0	100,0
	14	2,0
	28	1.4
3	0	100,0
	14	1.7
	28	1,4

Z výsledkov týchto skúšok je celkom zrejmé, že aj medzi tuhými prostriedkami je možné dosiahnuť podstatné zvýšenie tepelnej stálosti pre kryštalický produkt, získaný uvedeným postupom.

Príklad 5

Výhodný spôsob výroby kryštalického amifostínu

Spracovanie amifostínu s manitolom (100 mg každej z týchto látok, vztiahnuté na bezvodý produkt/ml)

3,5 litrov s obsahom uvedených látok sa získa nasledujúcim spôsobom:

1. 350 g manitolu podľa US liekopisu sa rozpustí za miešania teflónovým magnetickým miešadlom v približne 2300 ml vody Nanopure pri teplote miestnosti v tlakovej nádobe z nerezovej ocele.

2. K vzniknutému roztoku sa pridá 438,3 g amifostíntrihydrátu, rozpustenie sa uľahčí energickým miešaním.

3. Po úplnom rozpustení amifostínu sa k roztoku za energického miešania pomaly pridá 525 ml bezvodého etanolu podľa US liekopisu. K zrážaniu amifostínu dochádza v mieste pridávania, amifostín sa však opäť rýchlo rozpustí pri riedení etanolom a miešaním.

4. Po ukončenom pridávaní etanolu sa roztok zriedi 3500 ml vody Nanopure.

5. Roztok sa prefiltruje cez filter Millipore-40 pod tlakom 0,07 MPa.

6. 5 ml výsledného roztoku sa prenesie vždy do každej zo 660 fľaštičiek s objemom 10 ml (Wheaton E-2910-B47B). Fľaštičky sa čiastočne uzavrú zátkami zo šedej butylovej gumy Tompkins PT23BO857 F2 a potom sa sušia vo vákuu.

Sušenie zmesi amifostínu a manitolu (vždy 100 mg každej z bezvodých látok/ml) vo vákuu

1. Nádobky sa uložia do zariadenia pri teplote 25 °C, aby nedošlo k začiatku zrážania amifostínu.

2. Teplota v zariadení sa znižuje rýchlosťou 2 °C za minútu až na -35 °C. Hneď ako sa dosiahne táto teplota zariadenia, udržuje sa zariadenie na tejto teplote 240 minút na zaistenie zmrazenia roztoku vo všetkých nádobkách. V priebehu tohto stupňa prechádzajú všetky vzorky eutektickým bodom približne -16 °C.

3. Na konci času 240 minút sa teplota v zariadení zvyšuje rýchlosťou 2 °C za minútu v priebehu 25 minút až na teplotu 0 °C. Hneď ako sa táto teplota dosiahne, udržuje sa zariadenie na tejto teplote 600 minút.

4. Na konci uvedeného času 600 minút sa teplota v zariadení opäť zníži až na -35 °C rýchlosťou 2 °C za minútu. Hneď ako sa táto teplota dosiahne, udržuje sa zariadenie na tejto teplote 180 minút.

5. Po uplynutí uvedeného času sa začne zariadenie evakuovať. K evakuácii dochádza pri teplote kondenzačného zariadenia nižšej než -40 °C. Hneď ako tlak v zariadení dosiahne hodnotu nižšiu než 19,8 Pa, zvýši sa teplota v zariadení na -20 °C rýchlosťou 2 °C za minútu a zariadenie sa udržuje pri tlaku 19,8 Pa v prítomnosti dusíka.

6. Produkt sa pri uvedenom tlaku ponechá v zariadení počas 12 až 24 hodín tak dlho, až sa teplota produktu vyrovná s teplotou zariadenia. Potom sa zariadenie opäť naplní dusíkom a nádobky sa zazátkujú.

Hermeticky uzavreté, dusíkom naplnené nádobky s objemom 10 ml a s obsahom kryštalického amifostínu, sušeného vo vákuu spôsobom podľa príkladu 5 boli vy stavené pôsobeniu teploty 40 °C v čase 4 týždne. Pre kryštalický amifostín, sušený 12 hodín pri teplote -20 °C bolo možné dokázať, že na konci uvedeného času obsahoval prostriedok ešte 93 % pôvodného obsahu amifostínu. V prípade kryštalického amifostínu, ktorý bol sušený pri teplote -20 °C celkom 24 hodín, bolo na konci uvedeného času možné dokázať ešte 84 % pôvodného amifostínu.

Príklad 6

Najvýhodnejší spôsob výroby kryštalického amifostínu

Bolo dokázané, že naj stálej ši vo vákuu sušený kryštalický amifostín je možné získať tak, že sa vo vákuu suší zmes amifostínu a manitolu v zmesi etanolu a vody s obsahom 15 % objemových etanolu. Spôsob je podobný ako spôsob opísaný v príklade 5 až na to, že sa k spracovávanému roztoku pridáva nižšie množstvo bezvodého etanolu.

Špecifický spôsob sušenia vo vákuu za vzniku veľmi stáleho kryštalického amifostínu bol zistený po rade pokusov, pri ktorých bol vyhodnotený vplyv zmien teploty pri konečnom sušení, vplyv doby konečného sušenia a rýchlosť počiatočného ochladzovania nádobiek s obsahom roztoku až na teplotu -35 °C. Bolo dokázané, že všeobecne je stálosť kryštalického amifostínu najvyššia v prípade, že sa použije teplota -20 °C pri konečnom sušení a čas konečného sušenia sa pohybuje v rozmedzí 12 až 24 hodín. Okrem toho je stálosť kryštalického amifostínu vyššia v prípade, že počiatočné ochladenie na -35 °C trvá dlhšie, 160 minút namiesto pôvodných 45 minút.

V závislosti od uvedených skúšok je možné uviesť nasledujúci postup sušenia produktu vo vákuu ako najvýhodnejší:

1. Nádobky sa uložia do zariadenia pri teplote 25 °C, aby nedošlo k predčasnému zrážaniu amifostínu.

2. Teplota v zariadení sa zníži z 25 °C na 0 °C v priebehu 20 minút, z 0 °C na -20 °C v priebehu 60 minút a potom z -20 °C na -35 °C v priebehu 80 minút. Hneď ako sa teplota zariadenia zníži na uvedenú hodnotu, udržuje sa stále na tejto hodnote počas 240 minút. V priebehu tohto postupu prechádzajú všetky vzorky eutektickým bodom, ktorý je približne -16 °C.

3. Na konci uvedeného času 240 minút sa zvýši v priebehu 25 minút teplota zariadenia na 0 °C. Po dosiahnutí tejto teploty sa zariadenie udržuje na tejto stálej teplote celkom 600 minút.

4. Na konci uvedeného času 600 minút sa teplota v zariadení znova zníži v priebehu 15 minút z 0 na -15 °C a potom v priebehu 120 minút z teploty -15 °C na -35 °C. Hneď ako je uvedená teplota dosiahnutá, udržuje sa zariadenie na tejto teplote ešte 180 minút.

5. Po uplynutí uvedeného času sa zapne kondenzačné zariadenie. Hneď ako je teplota kondenzačného zariadenia nižšia než -40 °C, evakuuje sa postupne zariadenie až pod 19,8 Pa a teplota zariadenia sa zvýši z -35 °C na -20 °C rýchlosťou 2 °C za minútu, pričom tlak v zariadení sa vyčerpávaním dusíka udržuje na 19,8 Pa.

6. Produkt, uložený vo fľaštičkách sa v zariadení udržuje pri tlaku 19,8 Pa ešte 12 až 24 hodín potom, až sa teplota produktu vyrovná s teplotou zariadenia. Potom sa zariadenie znova naplní dusíkom a nádobky sa zazátkujú.

Bez toho, aby bolo nutné sa viazať na akékoľvek teoretické vysvetlenia, tvoria sa zrejme v priebehu stupňa 2. uvedeného postupu v zmrazenom roztoku kryštáliky amifostínu, ktoré sú očkovacím materiálom a v stupni 3. rastú a okolo nich sa tvoria ďalšie kryštáliky, čím dochádza k úpl nemu vykryštalizovaniu amifostínu z čiastočne zmrazeného roztoku.

Kryštalický amifostín bol získaný v priebehu uvedeného postupu s použitím 12,5 % etanolového roztoku, pričom v priebehu jedného pokusu bolo konečné sušenie vykonávané 12 hodín a v druhom pokuse 24 hodín. Obe vzorky boli zohriate na 40 °C počas 8 týždňov. Po tomto čase nebolo možné dokázať žiadny úbytok pre produkt, sušený 12 hodín, pri produkte, sušenom 24 hodín došlo k 2 % úbytku produktu.

Príklad 7

Výhodný spôsob testovania stálosti kryštalického amifostínu

Hermeticky uzavreté, dusíkom naplnené fľaštičky s objemom 10 ml s obsahom kryštalického amifostínu, sušeného vo vákuu, získaného spôsobom podľa príkladu 6, boli zohrievané 8 týždňov na teplotu 40 °C.

Bolo dokázané, že skôr vykonávané skúšky na stálosť pri teplote 50 °C spôsobili rozklad kryštalického amifostínu v uzavretých nádobách spôsobom, ktorý nebolo možné ľahko uviesť do korelácie so stálosťou kryštalického amifostínu za typických podmienok na jeho skladovanie, to znamená pri teplote približne 4 °C. Ale výsledky skúšok na stálosť, vykonaných pri teplote 40 °C a nižších, je možné uviesť do korelácie so stálosťou kryštalického amifostínu za podmienok, typických pre jeho skladovanie. Stálosť jeden mesiac pri teplote 30 °C je napríklad v korelácii so stálosťou 18 mesiacov pri teplote 4 °C, stálosť 2 až 3 týždne pri teplote 40 °C je v korelácii so stálosťou 18 mesiacov pri teplote 4 °C a stálosť 8 až 12 týždňov pri teplote 40 °C je v korelácii so stálosťou 18 mesiacov pri teplote 25 °C, všeobecná diskusia predpovede stálosti pri určitých teplotách bola opísaná v publikácii L. Lachman a ďalší, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, str. 766 až 67.

Na konci času zahrievania bol kryštalický amifostín v nádobkách skúmaný na obsah vody, obsah tiolu a obsah amifostínu. Obsah vody bol stanovený titráciou podľa Karí Fischera. Vzhľadom na to. že pri vyššej teplote môže dôjsť k hydrolýze amifostínu za vzniku 2-[(3-aminopropyl)aminojetántiolu a kyseliny fosforečnej, je stanovenie množstva tiolu ukazovateľom stálosti amifostínu. Analýza tiolu a amifostínu bola vykonávaná nasledujúcim spôsobom:

1. Príprava štandardov a vzoriek

V tomto prípade môže byť nutné upraviť hmotnosť alebo objem tak, aby konečná koncentrácia zostávala rovnaká. Roztoky je nutné okamžite po príprave skladovať v mraziacom zariadení a/alebo v chladiacom zariadení na uchovávanie vzoriek.

1.1. Príprava štandardných roztokov amifostínu, 3 mg/ml, metanol/voda 50:50

Presne sa naváži približne 30,0 mg amifostínu do volumetrických nádobiek s obsahom 10 ml. Pridá sa 5 ml vody a po rozpustení účinnej látky sa objem doplní metanolom. Roztok je možné použiť do 24 hodín pri uchovávaní pri teplote 4 °C.

1.2. Príprava štandardného roztoku 2-[(3-aminopropyl)aminojetántioldihydrochloridu s obsahom 0,012 mg/ml voľnej bázy, metanol/voda 50 : 50

Presne sa naváži približne 1,85 mg uvedeného dihydrochloridu tiolu do volumetrickej nádobky s objemom 100 ml. Pridá sa 50 ml vody, po rozpustení tiolu sa objem doplní metanolom. Roztok je možné použiť do 24 hodín pri uchovávaní pri teplote 4 °C.

1.3. Príprava amifostínu

A. Príprava vzorky 3 mg/ml, metanol/voda 50 : 50

Presne sa naváži 30,0 mg amifostínu do volumetrickej nádobky s objemom 10 ml. Pridá sa 5 ml vody a po rozpustení sa objem doplní metanolom. Roztok je možné použiť do 24 hodín pri jeho uchovaní pri 4 °C.

B. Príbuzné látky, 15 mg/ml, voda

Presne sa naváži približne 150,0 mg amifostínu do volumetrickej nádobky s objemom 10 ml. Po rozpustení sa objem doplní vodou. Roztok je použiteľný 24 hodín pri jeho uchovaní pri 4 °C.

1.4. Príprava amifostínu na injekčné podanie 4,8 mg/ml. metanol/voda 50 : 50

Obsah jednej fľaštičky s produktom sa rozpustí v približne 9 ml vody. Vzorka sa kvantitatívne prenesie do volumetrickej nádobky s objemom 25 ml a zriedi sa vodou. 6 ml tohto roztoku sa prenesie do volumetrickej nádobky s objemom 50 ml, pridá sa 19 ml vody a objem sa doplní metanolom. Roztok je možné použiť do 24 hodín pri jeho uchovávaní pri 4 °C.

2. Vhodnosť systému

Amifostín (použitie štandardného roztoku zo stupňa 1.1) % RSD pri 6 opakovaných injekciách amifostínu <2 faktor doznievania <2 teoretická hodnota pre doštičky >1,000

2-[(3-aminopropyl)amino]etántioldihydrochlorid (WR-1065) s použitím štandardného roztoku zo stupňa 1.2 % RSD pri 6 injekciách< 4 faktor doznievania< 2 teoretická hodnota pre doštičky > 7,000

3. Zariadenie a materiály (ako je ďalej uvedené alebo vo forme ekvivalentov)

Zariadenie

HPLC systém s UV detektorom

Materiály

Štandard amifostínu koncentrovaná kyselina fosforečná na účely HPLC metanol (MeOH) pre HPLC čistená voda: 16 mega ohm alebo vyššia hodnota sodná soľ kyseliny 1-oktánsulfónovej (OSA) pre HPLC.

Podmienky pri HPLC

Stĺpec:

náplň TosoHaas TSK ODS-80TM s uzáverom (USP Ll) rozmery: 4,6 x 250 mm veľkosť častíc: 5 pm

Mobilná fáza: metanol/vodná kyselina fosforečná s pH 3,0, 3,5 mM OSA (50/50)

1. Rozpustí sa 0,38 g OSA v 500 ml vodnej kyseliny fosforečnej s pH 3,0,

2. roztok sa zriedi metanolom na 1000 ml a

3. mobilná fáza sa prefiltruje a zbaví sa plynov.

Detekcia: 220 nm absorbancia rýchlosť prietoku: 1,0 ml/min. vstrekovaný objem: 10 pl teplota v stĺpci: teplota miestnosti teplota vzorky: 4 °C úprava: zariadenie sa nastaví tak, aby bolo možné získať vrchol pre amifostin v rozsahu približne 80 % celej stupnice.

4. Vykonanie skúšky

Vstrekne sa vzorka a štandardný roztok a zaznamenáva sa doba retencie pre vrchol amifostínu, tento čas je približne 4 minúty. Čas retencie pre vrchol amifostínu a pre vrchol skúšobnej vzorky by mali byť v súlade v rozmedzí 10 % tak, aby bolo možné potvrdiť identifikáciu amifostínu v skúmanej vzorke.

5. Výpočty

Výpočet pre vzorku amifostínu plocha pre vzorku hmotn. štandardu mg amifostin (% hmotnostné} -----------------x -------------------x P x 100 plocha pre štandard hmotn. vzorky mg čistota štandardu v %

P=-------------100

Výpočet pre amifostin na injekčné podanie plocha pre vzorku hmotn. štandardu mg bezvodý amifostin % =--------------------x ------------------------x P x F plocha pre štandard 10 ml (50 ml) (25 ml)

F =------------------------------------x 100 = 41,67 (6 ml) (500 mg/nádobka) plocha vzorky WR-1065 hmotn. štandardu WR-1065 (mg) 134,25 % WR-1065 v amlfoatfne·------------------------x ---------------------------xPxFx------preinjakciu plocha Štandardu WR-1065 100 mg 207,15 (50 ml) (25 ml)

F =------------------------ x 100 = 41,67 (6 ml) (500 mg/nádobka)

Príbuzné látky (RS)

Vylúčia sa vrcholy, prítomné na chromatograme slepej skúšky alebo pre vrchol rozpúšťadla.

Pre každú príbuznú látku sa uvedie relatívna plocha pre vrchol:

plocha pre vrchol RS jednotlivá príbuzná látka % =------------------------------- x 100 celková plocha vrcholov

Uviesť je nutné % pre WR-1065 a látky s plochou vyššou než 0,1 %.

Uvádza sa celkové množstvo všetkých príbuzných látok.

Príklad 8

Výsledky skúšky na stálosť pre kryštalický amifostin, sušený vo vákuu pri teplote 40 °C

V nasledujúcej tabuľke 4 sú uvedené typické výsledky, získané pri zohrievaní kryštalického amifostínu, získaného spôsobom z príkladu 6, skúšky boli vykonané spôsobom, uvedeným v príklade 7.

Tabuľka 4

Výsledky pre stálosť kryštalického amifostínu, sušeného vo vákuu pri teplote 40 °C šarža 812

doba	% vody	% tiolu	% amifostínu
prijateľné hodnoty	10-14 % hmotn.	NMT 2,0% hmotn	38-46 % hmotn.
na začiatku	12,1	0.5	44,5
po 1 týždni	10,5	0,2	42,6
po 2 týždňoch	10,1	0,2	42,5
po 3 týždňoch	10,4	0,2	42,5
po 4 týždňoch	10,2	0,2	41,2
po 8 týždňoch	11,7	0.3	43,4
NMT = najviac
šarža 815
doba	% vody	% tiolu	% amifostínu
prijateľné hodnoty	10-14% hmotn.	NMT 2,0 hmotn.	38-46 % hmotn.
na začiatku	12,0	0,3	43,3
po 1 týždni	11.7	0,2	43,6
po 2 týždňoch	11,6	0,2	43,4
po 4 týždňoch	11,5	0,3	43,0

Výpočet pre WR-1065 plocha pre vzorku WR-1065 hmotn. Štandardu WR-1065 (me) 134,25 %WR-1065vamifoatJne·----------------------- «-------------------------- xPxFx------plocha pre štandard WR-1065 hmotn. imlfoitlnu (mg) 207.18 ml

F =-------------100 ml x 100 = 10

Získané výsledky jasne ukazujú zvýšenú stálosť kryštalického amifostínu, vyrobeného spôsobom podľa príkladu

6. Zvýšená stálosť je zrejmá z nízkej tvorby tiolu v percentách hmotnostných, nízka tvorba tiolu dokazuje veľmi malý rozklad amifostínu hydrolýzou, pri ktorej vzniká 2-[(3-aminopropyl)amino]etántiol. Okrem toho je tiež veľmi nízka strata vody z amifostínu v priebehu času. Tieto údaje silne kontrastujú s nízkou stálosťou amorfného amifostínu, sušeného vo vákuu, ktorý sa podstatne rozkladá v priebehu dní pri teplote 50 °C, ako je zrejmé z tabuľky 3 v príklade 4.

Príklad 9

Kryštalická štruktúra amifostínu, sušeného vo vákuu

Bola stanovená molekulová a kryštalická štruktúra kryštalického amifostínu, sušeného vo vákuu. Analýza kryštálov bola vykonaná pri teplote miestnosti s použitím žiarenia z medi.

Štruktúra bola analyzovaná priamo a detailný výpočet bol vykonaný metódou najmenších štvorcov a Fourierovou metódou. Všetky atómy, odlišné od vodíkových atómov boli analyzované anizotropicky. Atómy vodíka, viazané na dusíkové atómy a na kyslíkové atómy vody, boli identifikované podľa Fourierových diferenčných máp a izotropicky. Poloha zvyšných vodíkových atómov bola vypočítaná za predpokladu ideálnej geometrie. Tieto vodíkové atómy neboli priamo analyzované vzhľadom na nízky odraz v dôsledku pomeru parametrov.

Zlúčenina kryštalizuje vo finálnej priestorovej skupine P2₁2₁2₁. Údaje, uvedené v tomto príklade sú odvodené od enantiomérnej štruktúry s nízkymi hodnotami R (R = 0,036 a R_w = 0,042). Druhá enantioméma štruktúra mala hodnotu R = 0,042 a R, = 0,051. Grafické znázornenie molekulovej štruktúry a kryštalickej štruktúry pre trihydrátamifostínu, sušený vo vákuu, je uvedené na obr. 13.

Experimentálne uskutočnenie

Získanie údajov

Bezfarebný kryštál C₅H₂₁N₂O₆PS tvaru plochej ihličky s približnými rozmermi 0,350 x 0,050 x 0,030 mm bol upevnený na sklenené vlákno. Všetky merania boli vykonávané na difraktometri Rigaku AFC5R s grafitovým monochromatickým žiarením Cu Ka a s rotujúcim anódovým generátorom s 12 kW.

Konštanty a orientácia matrice na získanie údajov podľa metódy najmenších štvorcov s použitím uhlov pre 20 starostlivo do stredu umiestnených odrazov v oblasti 40,45 < 20 < 52,03°, zodpovedajú ortorombickému základnému tvaru s nasledujúcimi rozmermi: a= 8,456 (2) Ä b = 21,553 (2) A c = 6,758 (2) A

V = 1231,6 (5) A³

Pre Z = 4 a F.W. = 268,26 je vypočítaná hustota

1,447 g/cm³.

V závislosti od hOO: h / 2n 0k0:k#2n 001: l#2n a od úspešnej analýzy štruktúry bola priestorová skupina stanovená ako

P2,2,2, (# 19)

Údaje bolo zhromaždené pri teplote 23 ± 1 °C použitím techniky ω-2θ do maximálnej hodnoty 20 = 120,0°. Hodnoty omega pre niekoľko intenzívnych odrazov, namerané pred odberom všetkých údajov mali priemernú šírku, rovnajúcu sa polovici výšky 0,21° pri uhle 6,0°. Merania (0,89 + 0,14 tan 0)° boli vykonávané rýchlosťou 8,0° za minútu (omega). Slabé odrazy s hodnotami I < 15,0 σ(Ι) boli znova maximálne štyrikrát analyzované a údaje boli zhromaždené tak, aby bolo zaistené dobré štatistické vyhodnotenie. V každom odraze bolo zaznamenané aj pozadie. Pomer vrcholu k pozadiu bol 2 : 1. Priemer kolimátora bol 0,5 mm a vzdialenosť kryštálu od detektora bola 400 mm.

Úpravy údajov

Celkom bolo zaznamenaných 1120 odrazov. Intenzity troch reprezentatívnych odrazov, ktoré boli namerané vždy po každých 150 odrazoch, zostávali konštantné v priebehu získavania údajov, čo ukazuje na stálosť kryštálov, nebolo nutné použiť žiadnu opravu na ich rozpad.

Lineárny koeficient absorpcie pre Cu Ka je 37,1 cm'¹. V tomto prípade bola použitá enterická oprava na absorpcii dôsledkom boli faktory na prenos v rozmedzí 0,89 až 1,0. Údaje boli upravené vzhľadom na polarizačné účinky a na účinky podľa Lorentza.

Podrobné výsledky pokusov

A. Údaje o kryštáloch

Empirický vzorec molekulová hmotnosť F.W. farba a tvar kryštálov rozmery kryštálov v mm kryštálový systém počet odrazov na jednotku stanovenia (oblasť 20} šírka vrcholu omega pri polovici výšky parametre mriežky priestorová skupina hodnota Z

Fooo ^M(CuKa)

C₅H₂₁N₂O_ePS

268,26 bezfarebné ploché ihličky

0,350x0,050x0,030 ortorombický (40,5 - 52,0“)

0,21 a= 8,456 (2) A b = 21,553 (2) A c = 6,758 (2) A V =1231,6 (5) A³

Ρ^,^ΙΘ)

1,447 g/cm³

576

37,10 071-¹

B. Meranie intenzity difraktometer žiarenie teplota atenuátory uhol odberu otvor detektora vzdlalenosr detektora od kryštálu typ analýzy rýchlosť analýzy

Slrka úseku

2θ«, počet meraných odrazov opravy

Rigaku AFC5R

CuKa (Λ «1,54178 A) ’C

Zr (faktory fólie Ľ 3,8,13,4 a 47.8)

β.0^β

6,0 mm horizontálne

6,0 mm vertikálne cm ω-2θ

8,0*/min (omega) vždy 4x (0,89 + 0,14 tacQ)^e

120.0°

1120 celkom

Podľa Lorentza a na polarizáciu (trans.faktory 0,69 -1,00)

SK 283318 Β6

C. Analýza štruktúry

analýza Štruktúry	priamou metódou
typ výpočtu	metóda najmenších štvorcov
minimalizovaná funkcia	Σ W(] Fo\| -1 Fc\|F
hmotnosti najmenších Štvorcov	4Fo^a/(j² (Fo³)
p-faktor	0.03
anomálne disperzie	všetky atómy, odlišné od
	vodíka
počet pozorovaní	856
(1 > 3.00 o(l))
počet variabilných faktorov	180
pomer odrazu/parametru	4,76
zvyšky: Ra	0,036, 0,042
hodnota indikátora	1,37
maximálny pomer posun/chyba
v konečnom cykle	0.00
maximálny vrchol v konečnej
diferenčnej mape	0,30 e/A^s
maximálny vrchol v konečnej
diferenčnej mape	-0,22 e/A³

V nasledujúcej tabuľke budú uvedené ešte polohové parametre a B (eq) pre kryštály výsledného produktu.

Polohové parametre a B(eq) pre

C(5)H(21 )N(2)O(6)P(1)S(1)

atóm	X	y	z	B(aq)
S(1)	0,5773 (2)	0,67451 (7)	0,3809 (3)	3,13(6)
P(1)	0,5106 (2)	0,59073(6)	0,2413(2)	2.14 (5)
0(1)	0,3359 (4)	0,5965 (2)	0,1901 (6)	2.8(2)
0(2)	0,5330 (5)	0,5383 (2)	0,3868 (7)	3.1 (2)
0(3)	0,6192 (4)	0,5882 (2)	0,0644 (6)	3,2(2)
0(4)	0,8435 (6)	0,6830 (3)	0,970(1)	4.7(3)
0(5)	1,1634 (7)	0,7064 (3)	0,097(1)	4,5(3)
0(5)	1,2270 (6)	0,5451 (2)	0,8548 (8)	4,0(2)
N(1)	0,1325 (6)	0,4983 (2)	0,2650 (9)	2,4 (2)
N(2)	0,2036 (6)	0,6289 (2)	0,5503 (0)	2,6(2)
C(<)	-0,0319(7)	0,554(3)	0,2978 (9)	2,B (3)
C(2)	-0,0011 (7)	0,5820 (3)	0,5004 (9)	2,0 (3)
0(3)	0,0296 (7)	0,6415(3)	0,537 (1)	2,9(3)
C(4)	0,2065 (7)	0,6853 (3)	0,604 (1)	3,0(3)
C(5)	0.4721	0,6719(3)	0,615(1)	3.4(3)
H(1)	0,798 (8)	0,716(3)	0,04(1)	4(1)
H(2)	0,77 (1)	0,650 (4)	1,00(1)	10(2)
H(3)	1,08 (1)	0,699 (4)	0,04(1)	B (2)
H(4)	1,215(9)	0,675(3)	0,11(1)	5(2)
H(5)	1,147 (8)	0,521 (3)	0,87 (1)	4(1)
H(B)	1,27 (1)	0,559 (4)	0,98 (2)	10(2)
H (7)	-0.24(1)	0,513(3)	0,28(1)	4(1)
H (B)	-0,110 (8)	0,484 (3)	0.14 (1)	4(1)
H(9)	-0,104(8)	0,466 (3)	0,34(1)	4(1)
H(10)	0,227 (9)	0,594(4)	0,65(1)	7(2)
H(11)	0,234(7)	0,617(2)	0,443 (9)	2(1)
H(12>	-0,0561	0,5845	0,1998	3,4
H(13)	0,0763	0,5429	0,2873	3.4
H(14)	-0,1709	0,5905	0,5130	3,4
H(15)	-0,0308	0,5524	0,5974	3.4
H(16)	0,0103	0,6690	0,4318	3.5
H(17)	-0,0052	0,6594	0,6582	3,5
H(18)	0,2787	0,7165	0,5077	3.6
H(19)	0,2617	0,6998	0,7299	3,6
H(20)	0,5188	0,7016	0,7010	4.1
H(21)	0,4852	0,6315	0,6694	4.1

Je zrejmé, že by bolo možné navrhnúť ešte rad ďalších uskutočnení, ktoré neboli síce podrobne opísané, aj napriek tomu patria do rozsahu vynálezu. Z tohto dôvodu nie je možné použiť opísané uskutočnenie na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostriedok s obsahom amifostínu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje sterilný kryštalický amifostíntrihydrát s kryštalickou štruktúrou, obsahujúci priestorovú skupinu Pž^ži, s rozmermi a= 8,46 x x 10’¹⁰m, b=21,55 x 10 ^l0m a c=6,76 x 10 ^lom, vhodný na rekonštitúciu vo farmaceutický prijateľnom nosnom prostredí na produkt, zbavený časticového materiálu, určený na injekčné podanie.
2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyzná í u j ú c i sa tým, že ďalej obsahuje ešte farmaceutický prijateľnú pomocnú látku.
3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, v y značujúci sa tým, že obsahuje pomocnú látku, je zo skupiny chlorid sodný, glycín, dextróza, sacharóza a manitol.
4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že farmaceutickým prostredím na rekonštitúciu je voda na injekčné podanie alebo fyziologický roztok chloridu sodného.
5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako jednotlivú dávku obsahuje 10 až 10 000 mg kryštalického amifostíntrihydrátu sušeného vo vákuu a prípadne 10 až 10 000 mg farmaceutický prijateľnej pomocnej látky a je určený na rekonštrukciu vo farmaceutický prijateľnom prostredí na produkt, zbavený tuhých častíc a vhodný na injekčné podanie.
6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 100 až 1000 mg kryštalického amifostíntrihydrátu, sušeného vo vákuu a 100 až 1000 mg manitolu.
7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým,že obsahuje 500 mg kryštalického amifostíntrihydrátu, sušeného vo vákuu a 500 mg manitolu.
8. Spôsob výroby farmaceutického prostriedku podľa nároku 1 s obsahom amifostíntrihydrátu v kryštalickej forme, vyznačujúci sa tým, že sa a) pripraví prostriedok, obsahujúci amifostín, etanol a vodu s množstvami amifostínu, etanolu a vody, pri ktorých sa získa pri teplote miestnosti až teplote 10 °C roztok, zbavený tuhých častíc, ale v ktorom vzniká kryštalická zrazenina amifostínu po ochladení na teplotu nižšiu ako 0 °C, b) prostriedok sa ochladí na teplotu nižšiu ako 0 °C v čase dostatočnom na vyzrážanie kryštalického amifostínu a c) výsledná zmes sa suší vo vákuu.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa po ukončení sušenia vo vákuu v stupni c) farmaceutický prostriedok prevrství sterilným inertným plynom.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m , že sa na prevrstvenie použije plyn zo skupiny argón, dusík a hélium.
11. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa prostriedok v stupni b) schladí na teplotu, zodpovedajúcu eutektickému bodu pre tento prostriedok.
12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že sa po uskutočnení stupňa b) teplota výslednej zmesi zvýši na 1 až 20 °C nad eutektickú teplotu, potom

SK 283318 Β6 sa zmes znovu ochladí z tejto teploty späť na eutektickú alebo nižšiu teplotu pred vykonávaním stupňa c).
13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že sa eutektická teplota zmesi pohybuje v rozmedzí 0 až -80 °C.
14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa v priebehu zahrievania zmes zahreje na teplotu -30 až 10 °C, pričom eutektická teplota zmesi sa pohybuje v rozmedzí 0 až -80 °C.
15. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa v stupni a) použije 50 až 400 mg amifostínu na 1 ml prostriedku, 1 až 35 % objemových etanolu a 65 až 99 % objemových vody.
16. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa v stupni a) použije 125 až 250 mg amifostínu na 1 ml prostriedku, 5 až 20 % objemových etanolu a 80 až 95 % objemových vody.
17. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa v stupni a) použije 100 mg amifostínu na 1 ml prostriedku, 10 % objemových etanolu a 90 % objemových vody.
18. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa v stupni b) prostriedok schladí na teplotu v rozmedzí -5 až -40 °C.
19. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa v stupni b) prostriedok schladí na teplotu -20 °C.
20. Spôsob podľa nároku 8 alebo 11, vyznačujú c i sa t ý m , že sa získaný prostriedok ešte sterilizuje.
21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa t ý m , že sa sterilizácia prostriedku uskutočňuje filtráciou prostriedku po uskutočnení stupňa a) pred ochladením.
22. Spôsob podľa nároku 8 na výrobu farmaceutického prostriedku s obsahom amifostíntrihydrátu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa a) pripraví prostriedok s obsahom 50 až 300 mg amifostínu na 1 ml prostriedku, 3 až 30 % objemových etanolu 70 až 97 % objemových vody a prípadne 5 až 300 mg farmaceutický prijateľnej pomocnej látky na 1 ml prostriedku, pričom sa pri teplote miestnosti až teplote 10 °C získa roztok, zbavený tuhých častíc, ale po schladení roztoku na teplotu nižšiu ako 0 °C vzniká v roztoku zrazenina kryštalického amifostínu, b) roztok sa schladí na teplotu v rozmedzí -5 až -40 °C na čas dostatočný na vznik kryštalickej zrazeniny amifostínu a c) výsledná zmes sa suší vo vákuu.
23. Spôsob podľa nárokov 8, 11 alebo 22, vy znali u j ú c i sa tým, že sa stupeň alebo stupne, vykonávané po stupni a) a pred stupňom c) uskutočnia v priebehu časového obdobia 0,5 až 72 hodín.
24. Spôsob podľa nárokov 8, 11, 12 alebo 22, v y značujúci sa tým, že sa stupeň alebo stupne, vykonávané po stupni a) a pred stupňom c) uskutočnia v priebehu časového obdobia 2 až 24 hodín.
25. Spôsob podľa nárokov 8, 11, 12 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že sa stupeň c) vykonáva v priebehu časového obdobia 1 až 72 hodín.
26. Spôsob podľa nárokov 8, 11, 12 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že sa stupeň c) vykonáva v priebehu časového obdobia 10 až 20 hodín.
27. Spôsob podľa nárokov 8, 11, 12 alebo 22, vyznačujúci sa tým, že sa stupeň c) vykonáva vo vákuu v rozmedzí 1,33 až 133 Pa.
28. Spôsob podľa nárokov 8, 11, 12 alebo 22, vyznačujúci sa tým, že sa stupeň c) vykonáva vo vákuu pri 19,8 Pa.
29. Spôsob podľa nároku 8 na výrobu prostriedku s obsahom kryštalického amifostíntrihydrátu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa a) pripraví prostriedok, obsahujúci 100 mg amifostínu na 1 ml prostriedku, 100 mg farmaceutický prijateľnej pomocnej látky na 1 ml prostriedku a roztok etanolu vo vode s koncentráciou etanolu 12,5 % objemových za vzniku roztoku, ktorý je pri teplote miestnosti zbavený tuhých častíc, b) prostriedok sa ochladí z teploty miestnosti v priebehu 160 minút na teplotu -35 °C, c) na teplote -35 °C sa prostriedok udržuje 240 minút za vzniku očkovacích kryštálikov amifostínu, d) prostriedok sa zohreje v priebehu 25 minút na teplotu 0 °C, e) na teplote 0 °C sa prostriedok udržuje 600 minút na zahriatie očkovacích kryštálikov a na vyzrážanie kryštalického amifostínu, f) prostriedok sa v priebehu 15 minút ochladí na teplotu v rozmedzí 0 až -15 °C, g) prostriedok sa ochladí v priebehu 120 minút na teplotu -15 až -35 °C, h) prostriedok sa udržuje počas 180 minút na teplote -35 °C, i) vzduch, obklopujúci prostriedok sa vyčerpá až na tlak nižší ako 19,8 Pa, j) prostriedok sa v priebehu 54 hodín zahreje na teplotu -35 až -20 °C, k) prostriedok sa udržuje ešte ďalších 12 hodín až 24 hodín na teplote -20 °C.