JPH0753370A

JPH0753370A - ワートマンニンおよびその類縁体によるホスファチジルイノシトール３−キナーゼの阻害

Info

Publication number: JPH0753370A
Application number: JP6165068A
Authority: JP
Inventors: Rosanne Bonjouklian; ロザンヌ・ボンジョウクリアン; Powis Garth; ガース・ポウィス; Chris J Vlahos; クリス・ジョン・ブラホス
Original assignee: Eli Lilly and Co; University of Arizona Foundation; University of Arizona
Current assignee: Eli Lilly and Co; University of Arizona Foundation; University of Arizona
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 1995-02-28
Also published as: PL304317A1; CZ283806B6; CA2128046A1; CN1111127A; US5378725A; EP0635268A1; IL110325A0; NO942641L; AU678831B2; RU94026082A; TW287102B; NO942641D0; CZ169294A3; ZA945103B; PH30794A; KR950002755A; AU6754094A; HUT67667A; HU9402128D0

Abstract

(57)【要約】【構成】活性成分としてワートマンニンまたはその類
縁体を含有する、ホスファチジルイノシトール３−キ
ナ−ゼ依存性の症状あるいは新生物を処置するための製
剤が提供される。【効果】本製剤は、哺乳動物のホスファチジルイノシ
トール３−キナ−ゼを阻害するのに、および哺乳動物
のホスファチジルイノシトール３−キナ−ゼ依存性の
症状（特に新生物）を治療するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はＮational Ｉnstitutes of Ｈeal
thによって裁定されたＵＯ１ＣＡ５２９９５のもと、
政府の支援を受けて成された。政府は本発明に一部の権
利をもつ。

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、溶解細胞または全細胞
をワートマンニン（wortmannin）として知られている化
合物またはある種のワートマンニン類縁体のいずれかと
接触させることによって、溶解細胞または全細胞中のホ
スファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キ
ナーゼ）を阻害する方法に関する。また、これら化合物
を用いて哺乳動物、特にヒトにおいてホスファチジルイ
ノシトール３−キナーゼを選択的に阻害し、そして、
ヒトにおいてホスファチジルイノシトール３−キナー
ゼ依存症、特に新生物を治療することができる。

【０００３】

【従来の技術】イノシトールリン脂質の代謝は、多様な
ホルモンおよび増殖因子に応答する受容体媒介のシグナ
ル変換経路の必須の部分であると考えられている［例え
ば、Berridge, M.J.ら、 Nature, 312: 315-321 (1984);
Nishizuka, Y.、Science, 225: 1365-1370 (1984) を
参照］。

【０００４】このシグナル伝達経路において、２つの細
胞内第二メッセンジャーであるイノシトール１,４,５
−トリスリン酸およびジアシルグリセロールが、ホスホ
リパーゼＣによるホスファチジル４,５−ビスリン酸の
加水分解によって生成する。イノシトール１,４,５−
トリスリン酸は細胞内Ｃa²⁺貯蔵からＣa²⁺を放出させ、
Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存性キナーゼの活性化を導
き、ジアシルグリセロールはプロテインキナーゼＣを活
性化する。分解した後、ホスファチジルイノシトール
４,５−ビスリン酸は、ホスファチジルイノシトール４
−キナーゼおよびホスファチジルイノシトール−４−リ
ン酸キナーゼによるホスファチジルイノシトールの段階
的リン酸化によって速やかに再合成される。これら２種
のキナーゼは第二のメッセンジャーの生産において重要
な役割を果すと考えられている［例えば、Duell, T.
F.、米国特許No.5,001,064 (1991); Shibasaki,F.ら、
J.Biol.Chem., 266(13): 8108-8114 (1991) を参照］。

【０００５】より最近になって、別のホスファチジルイ
ノシトールキナーゼの存在が同定されたが、これはある
種の活性化チロシンキナーゼに関係している［Courtnei
dge,S.A.ら、 Cell, 50: 1031-1037 (1987); Kaplan, D.
R.ら、Cell, 50: 1021-1029(1987)］。このキナーゼ
は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼと識別
され、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のイノシト
ール環の３位をリン酸化してホスファチジルイノシトー
ル３−リン酸（ＰＩ−３Ｐ）を与えることがわかって
いる［Whitman, D.ら、Nature, 332: 664-646 (198
8)］。

【０００６】ＰＩに加えて、この酵素はホスファチジル
イノシトール４−リン酸およびホスファチジルイノシ
トール４,５−ビスリン酸をもリン酸化して、各々ホス
ファチジルイノシトール３,４−ビスリン酸およびホス
ファチジルイノシトール３,４,５−トリスリン酸（Ｐ
ＩＰ₃）を生産することができる［Auger, K.R.ら、Cel
l, 57: 167-175 (1989)］。

【０００７】ＰＩ３−キナーゼは物理的にpp６
０^v-src、ポリオーマ・ミドルＴ/pp６０^c-src、血小板
由来成長因子受容体、コロニー刺激因子−１受容体、お
よびインスリン受容体のようなチロシンキナーゼに関連
しており［例えば、Shibasaki （同上）を参照］、この
ことは、シグナル変換および他の細胞内現象（ＰＩ３
−キナーゼに関連しておりこれを活性化するタンパク質
チロシンキナーゼが関与する）において、重要ではある
が未だ明確にはなっていない役割を担っていることを示
唆する。また、ＰＩ３−キナーゼ活性は好中球中のＧ
プロテイン受容体および好中球中の血小板に関連して同
定されている［Traynor-Kaplan, A.E.ら、 Nature, 334:
353-356 (1988); および Mitchell, C.A.ら、 Proc.Na
t.Acad.Sci., 87: 9396-9400 (1990)］。しかし、好中
球におけるＰＩ３−キナーゼの活性化はチロシンのリ
ン酸化と独立して起こる［Vlahos, C.J.ら、 FEBS Lette
rs, 309(3): 242-248 (1992)］。

【０００８】ＰＩ３−キナーゼは８５kＤaの調節サブ
ユニットと１１０kＤaの触媒性サブユニットが強固に結
合したヘテロ二量体として存在し、殆ど全てのリガンド
活性化成長因子受容体およびガン遺伝子タンパク質チロ
シンキナーゼを伴う細胞複合体において見いだされる
［Cantley, L.C.ら、 Cell, 64: 281-302 (1991)］。８
５kＤaの調節サブユニットはアダプタータンパク質とし
て作用し、ＰＩ３−キナーゼの１１０kＤaの触媒サブ
ユニットが成長因子受容体およびチロシンリン酸化タン
パク質と相互作用するように作用するようである［Marg
olis, C.、 Cell Growth Differ., 3: 73-80 (1992)］。

【０００９】ＰＩ３−キナーゼはシグナル変換におい
て重要な酵素であると考えられるが、限られた数の化合
物だけがＰＩ３−キナーゼに対して阻害活性をもつと
同定されている［例えば、Matter, W.F.ら、 Biochem.Bi
ophys.Res.Commun., 186: 624-631 (1992) を参照］。
本発明の方法において用いた化合物の選択的なＰＩ３
−キナーゼ阻害活性とは対照的に、Ｍatterらが使用し
たバイオフラビノイド（bioflavinoid）化合物、特にケ
ルセチンおよびそのある種の類縁体は、ＰＩ３−キナ
ーゼおよび他のキナーゼ（プロテインキナーゼＣやＰＩ
４−キナーゼなど）を阻害する［Matterら、同上］。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明は、ワー
トマンニンまたはある種のワートマンニン類縁体のいず
れかを用いて溶解細胞または全細胞中のホスファチジル
イノシトール３−キナーゼを阻害する方法を提供す
る。

【００１１】また、本発明は、ワートマンニンまたはあ
る種のワートマンニン類縁体のいずれかを用いて哺乳動
物、特にヒトにおいてホスファチジルイノシトール３
−キナーゼを阻害する方法を提供する。

【００１２】さらに、本発明は、哺乳動物においてホス
ファチジルイノシトール３−キナーゼに依存する症
状、特に新生物を治療する方法を提供する。

【００１３】本発明は、溶解細胞または全細胞中のホス
ファチジルイノシトール３−キナーゼを阻害する方法
であって、溶解細胞または全細胞を、

【化８】［式中、ＲはＨまたはアセトキシである］

【化９】および

【化１０】［式中、Ｒ¹はＨ、メチルまたはエチルであり、Ｒ²はＨ
またはＣＨ₃である］から成る群から選ばれる化合物と
接触させることから成る方法を提供する。

【００１４】また、本発明は哺乳動物中のホスファチジ
ルイノシトール３−キナーゼを阻害する方法であっ
て、上記の式I、IIおよびIIIで示される化合物から成る
群から選ばれる化合物のホスファチジルイノシトール
３−キナーゼ阻害量を該哺乳動物に投与することから成
る方法を提供する。

【００１５】さらに、本発明は、哺乳動物中の治療を必
要とするホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依
存性の症状を治療する方法であって、上記の式I、IIお
よびIIIで示される化合物から成る群から選ばれる化合
物のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害量
を該哺乳動物に投与することから成る方法を提供する。

【００１６】上記のように、本発明は、溶解細胞または
全細胞中のホスファチジルイノシトール３−キナーゼ
を阻害する方法であって、溶解細胞または全細胞を、

【化１１】［式中、ＲはＨまたはアセトキシである］

【化１２】および

【化１３】［式中、Ｒ¹はＨ、メチルまたはエチルでありＲ²はＨま
たはＣＨ₃である］から成る群から選ばれる化合物と接
触させることから成る方法を提供する。

【００１７】

【課題を解決するための手段】式I、IIおよびIIIで示さ
れる化合物は当該技術分野において既知である。以下の
表１に、本発明の方法において用いた好ましい化合物の
通称名を示す。

【表１】表１ワートマンニンおよび好ましいワートマンニン類縁体式の表示ＲＲ¹ Ｒ² 通称名 Ia アセトキシＮＡＮＡワートマンニン Ib ＨＮＡＮＡ１１−デスアセトキシワートマンニン II ＮＡＮＡＮＡ Δ９,１１−デヒドロ− デスアセトキシワートマンニン IIIa ＮＡＨＨワートマンニンの開いたＡ環の酸 IIIb ＮＡメチルＨワートマンニンの開いたＡ環のメチルエステル

【００１８】ワートマンニン（Ia）の生合成による製造
は当該技術分野において周知である。通常は多数の既に
開示された微生物、例えば、Ｔalaromyces wortmannin
［Nakanishiら、 J.Biol.Chem., 267(4): 2157-2163 (19
92)］およびＰenicillium wortmannii、Ｍyrothecium r
oridium、およびＦusarium oxysporum［Abbasら、 Appl.
Environ.Microbiol., 54(5): 1267-1274 (1988)］など
の微生物のいずれかの発酵によって製造される。発酵に
次いで、ワートマンニンを既知の方法によって抽出およ
び精製する。

【００１９】好ましくは、ワートマンニンはＡ２４６０
３.１として同定された発酵培養物から実質的に純粋な
形で合成および単離する。培養物Ａ２４６０３.１はブ
ダペスト条約に従って寄託され、そして、Ｍidwest Ａr
ea Ｎorthern Ｒegional Ｒesearch Ｃenter［Agricult
ural Reseacrh Service、アメリカ合衆国農業省、1815
North University Street、Peoria、Illinois、61604］
の保存培養物コレクションの一部となるであろう。

【００２０】Ｍidwest Ａrea Ｎorthern Ｒegional Ｒe
search Ｃenter（Peoria、Illinois）におけるこの培養
物の寄託の永続性およびそれをだれでも容易に入手でき
ることは、特許が許された場合には、該特許の有効期間
中に付与されるであろう。出願の継続中の培養物の入手
は、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.１４および３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１
１２のもとで可能となるであろう。この培養物をだれで
も入手できることの全制限は、特許が許されたときに除
かれるであろう（この取り消しはできない）。

【００２１】ワートマンニンは、上記のＡ２４６０３.
１株を適当な培養培地中、水中好気条件下、回収し得る
量のワートマンニンが生産されるまで培養することによ
って製造する。ワートマンニンを、当該技術分野におい
て既知の種々の単離および精製の方法を用いて回収する
ことができる。

【００２２】Ａ２４６０３.１培養物の増殖に用いる培
地は多くの培地のいずれかであってよい。しかし、製造
経費、最適収率および生成物単離の容易さのため、大規
模発酵における好ましい炭素源はグルコースおよびコー
ンスターチのような可溶性デンプンである。また、マル
トース、リボース、キシロース、フルクトース、ガラク
トース、マンノース、マンニトール、ポテト・デキスト
リン、オレイン酸メチル、大豆油のような油なども使用
することができる。

【００２３】好ましい窒素源は酵素加水分解されたカゼ
インおよび綿実粉であるが、ペプシン分解されたミル
ク、消化された大豆粉、魚粉、トウモロコシ浸出液、酵
母抽出物、酸加水分解されたカゼイン、ビーフ抽出物な
ども使用することができる。

【００２４】培養培地に導入しうる栄養無機塩には、カ
ルシウム、マグネシウム、ナトリウム、アンモニウム、
塩化物、炭酸塩、硫酸塩、硝酸塩、亜鉛などのイオンを
与え得る通常の可溶性塩が含まれる。

【００２５】生物の成長および発達に必要な必須微量元
素もまた、培養培地に含まれるべきである。このような
微量元素は、一般に生物の成長要求を満足させるに十分
な量で培地の他の置換体中に不純物として見いだされ
る。

【００２６】ワートマンニンを大量に生産するために
は、撹拌生物反応器での水中好気発酵に付すのが好まし
い。少量のワートマンニンは振盪フラスコ培養で得られ
るであろう。胞子形態の生物を大きな生物反応器に接種
することに通常伴われる生産時の時間的ずれのために、
栄養成長接種物を使用するのが好ましい。この栄養成長
接種物は、少量の培養培地に生物の胞子形態または菌糸
断片を接種して生物の新鮮で活発に増殖している培養物
を得ることにより調製される。栄養成長接種物の培地は
大量発酵に用いられる培地と同じであってよいが、他の
培地も適している。

【００２７】ワートマンニンはＡ２４６０３.１の生物
を約２３°〜２９°Ｃの温度で増殖させたときに生産さ
れる。ワートマンニン生産の最適温度は約２５°Ｃのよ
うである。

【００２８】水中好気培養過程において普通であるよう
に、培地を通常のタービン羽根で撹拌しながら、底から
容器中に滅菌した空気を送り込む。一般に、通気速度お
よび撹拌速度は、約５気圧の容器内圧力で空気飽和の少
なくとも４５％の溶存酸素レベルを維持するのに十分で
あるべきである。

【００２９】ワートマンニンの生産は、発酵中にブロス
からのＰＩ３−キナーゼ抽出物を試験することによっ
て観察することができる。後記のＰＩ３−キナーゼ分
析系がこの目的に有用な分析である。

【００３０】生産に次いで、ワートマンニンを当該技術
分野で使用される方法によって発酵培地から回収するこ
とができる。Ａ２４６０３.１の生物の発酵中に生産さ
れるワートマンニンは主にブロス中に見いだされる。

【００３１】通常、ワートマンニンは色々な技術によっ
て、バイオマスから回収することができる。好ましい技
術はセラミックフィルターで全発酵ブロスを濾過するこ
とを伴う。濾液を酢酸エチルのような有機溶媒で溶離
し、濃縮する。この濃縮液を結晶化が起こるまでアルコ
ールで懸濁し、その溶液を濾過、洗浄、そして乾燥す
る。確認のために、結晶物質を有機溶媒に溶かし、逆相
シリカゲル吸収剤（Ｃ₈またはＣ₁₈）のクロマトグラフ
ィーにかける。６０％アセトニトリルのような有機−水
性緩衝液で分画を溶出させる。

【００３２】また、１１−デアセトキシワートマンニン
（式 Ib）もその調製法と共に当該技術分野において知
られている。一般に、この化合物はＰenicillium funic
ulosum Ｔhom［例えば、Baggoliniら、 Exp.Cell Res.,
169: 408-418 (1987) を参照］の培養物の発酵によって
生合成的に生産されるが、好ましくはＨaeflingerら［H
elv.Chem.Acta, 56(8): 2901-2904 (1973)］によって開
示された方法によって化学的にワートマンニンから誘導
される。

【００３３】同様に、Δ９,１１−デヒドロ−デスアセ
トキシワートマンニン（式 II）の調製も当該技術分野
において知られており、Ｈaeflingerら［同上］によっ
て記述されている。さらに、式 IIIで示される化合物の
調製もＭacＭillan, J.ら［J.Chem.Soc, Perkin I: 289
2-2898 (1972)］によって記述されている。

【００３４】本発明の方法において、式 I、IIおよびII
Iで示される化合物は溶解細胞または全細胞中のホスフ
ァチジルイノシトール３−キナーゼの選択的阻害に有
効である。本方法をインビトロまたはインビボで実施す
ることができ、例えば、有糸分裂におけるＰＩ３−キ
ナーゼの関与、細胞増殖、または細胞分化を研究するた
めの薬理学的道具として利用することができる。また、
式 I、IIおよびIIIで示される化合物を放射ラベル（例
えば、三重水素化）し、細胞中のこれら化合物の検出を
より容易なものとすることができる。

【００３５】式 I、IIまたはIIIで示される化合物を本
方法で用いる場合、このような化合物をジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）のような有機溶媒中に溶解し、ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（pＨ７.５、１５mM ＭgＣl₂および１mM
ＥＧＴＡを含む）で希釈し、所望の濃度にする。次に、
得られた調製物を当該技術分野において周知の方法に従
い、精製されたＰＩ３−キナーゼまたは細胞と接触さ
せる。

【００３６】本発明の別の態様は哺乳動物、特にヒトの
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼを阻害する
方法であって、式 I、式 IＩおよび式 IIIで示される化
合物から成る群から選ばれる化合物のホスファチジルイ
ノシトール３−キナーゼ阻害量を該哺乳動物に投与す
ることから成る方法を提供する。

【００３７】本発明の好ましい態様は、哺乳動物におけ
るホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依存症を
治療する方法であって、式 I、式 IIおよび式 IIIで示
される化合物から成る群から選ばれる化合物のホスファ
チジルイノシトール３−キナーゼ阻害量を該哺乳動物
に投与することから成る方法を包含する。ＰＩ３−キ
ナーゼ依存症には、痛み、糖尿病、炎症、血小板集合、
アテローム性動脈硬化症や再狭窄などの脈管の疾患、お
よび特に新生物に見られるような異常細胞増殖に関連し
た生化学的過程が含まれる。

【００３８】即ち、本発明の特に好ましい態様には、ホ
スファチジルイノシトール３−キナーゼ依存性の新生
物、特に種々のリンパ肉腫を式 I、IIおよびIIIで示さ
れる化合物から成る群から選択される化合物により治療
する方法が含まれる。他のＰＩ３−キナーゼ依存性の
新生物には、例えば、雌性乳腺癌、結腸癌、頭部および
頸部の上皮悪性腫瘍、白血病、黒色腫、卵巣癌、血漿細
胞骨髄腫および鱗状または小細胞肺癌が含まれる。上記
および他の新生物性ＰＩ３−キナーゼ依存症の治療の
ために、ワートマンニンの使用が好ましい。

【００３９】これらの特定の症候の治療処置のために、
式 I、IIまたはIIIで示される化合物をそのまま投与し
てもよいし、また、非経口、経皮、直腸、鼻孔または静
脈内投与または好ましくは経口投与用の単位投与形態の
医薬組成物に調合および製剤化することができる。この
ような医薬組成物は当該技術分野で周知の方法で製造さ
れ、薬学的担体と共に式 I、IIおよびIIIで示される化
合物から成る群から選ばれる少なくとも１つの活性化合
物を含有する。本明細書中で用いる「活性化合物」とい
う用語は、式 I、IIおよびIIIで示される化合物または
それらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる化合物のう
ちの少なくとも１つを指す。

【００４０】このような組成物においては、活性化合物
は「活性成分」として知られている。この組成物を調製
する際には、通常、活性成分を担体と混合するか、担体
で希釈するか、またはカプセル、サシエ、紙もしくは他
の容器の形態を取り得る担体内に封入する。この担体が
希釈剤として作用する場合には、該担体は活性成分に対
してビヒクル、賦形剤または媒質として作用する固体、
半固体または液体物質であってよい。即ち、本組成物
は、錠剤、丸剤、粉剤、ロゼンジ剤、サシエ剤、カシエ
剤、エリキシル剤、乳濁剤、溶剤、シロップ剤、懸濁
剤、軟および硬ゼラチンカプセル剤、滅菌注射溶剤、お
よび無菌包装粉剤の形態とすることができる。

【００４１】適当な担体、賦形剤および希釈剤のいくつ
かの例には、ラクトース、デキストロース、スクロー
ス、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシア
ゴム、リン酸カルシウムアルギン酸塩、ケイ酸カルシウ
ム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セル
ロース、トラガカント、ゼラチン、シロップ、メチルセ
ルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息
香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水
および鉱油が含まれる。本製剤は、さらに滑沢剤、湿潤
剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、甘味剤、または香料な
どを含むことができる。本組成物は、当該技術分野で周
知の方法を用いて、患者に投与した後に活性成分を迅速
に、持続して、または遅延して放出するように製剤化す
ることができる。

【００４２】経口投与のために、化合物を担体および希
釈剤と混合し、錠剤に成形するか、またはゼラチンカプ
セルに封入することができる。別法によれば、この混合
物を１０％グルコース水溶液、等張食塩水、滅菌水など
の液体に溶解し、静脈内にまたは注射によって投与する
ことができる。

【００４３】本組成物は、各投与が約１〜約５００mg、
より普通には約５〜約３００mgの活性成分を含んでいる
単位投与形態に製剤化するのが好ましい。この「単位投
与形態」なる用語は、ヒト対象および他の哺乳動物用の
１回投与に適した物理的に独立した単位であって、各単
位が、所望の治療効果を与えるように計算された予め決
めた量の活性物質を、必要な薬学的に許容され得る担体
と共に含有していることを意味する。「薬学的に許容し
うる」は、担体、希釈剤または賦形剤が製剤の他の成分
にとって許容しうるものでなくてはならず、その受容者
にとって有害なものであってはならないことを意味す
る。

【００４４】以下に製剤例を挙げるが、これらは例示の
ためのものであり、いかなる意味においても本発明の範
囲を限定しようとするものではない。「活性成分」なる
用語の意味は上記にて定義した通りである。製剤例１以下の成分を用いて硬ゼラチンカプセルを調製する：

【００４５】製剤例２以下の成分を用いて錠剤を調製する：各成分を配合し、圧縮して各重量６６５mgの錠剤を得
る。

【００４６】製剤例３以下の成分を含有するエアロゾル溶液を調製する：使用量成分（重量％）活性成分０.２５エタノール２５.７５プロペラント２２（Propellant 22）（クロロジフルオロメタン）７０.００合計１００.００活性化合物をエタノールと混合し、この混合液をプロペ
ラント２２の一部に添加し、−３０℃まで冷却し、充填
装置に入れる。次いで、必要な量をステンレス鋼容器に
入れ、残りのプロペラントで希釈する。次に、この容器
にバルブユニットを装着する。

【００４７】製剤例４以下のように、各々が活性成分を６０mg含有する錠剤を
調製する：成分使用量活性成分６０ mg デンプン４５ mg 微結晶セルロース３５ mg ポリビニルピロリドン（１０％水溶液として）４ mg カルボキシメチルデンプンナトリウム４.５ mg ステアリン酸マグネシウム０.５ mgタルク１ mg 合計１５０ mg 活性成分、デンプン、およびセルロースをＮo.４５メッ
シュＵ.Ｓ.のふるいに通し、緊密に混合する。得られた
粉末とポリビニルピロリドン水溶液を混合し、次いで、
この混合物をＮo.１４メッシュＵ.Ｓ.のふるいに通す。
得られた顆粒を５０℃で乾燥し、Ｎo.１８メッシュＵ.
Ｓ.ふるいに通す。カルボキシメチルデンプンナトリウ
ム、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを予めＮo.
６０メッシュＵ.Ｓ.のふるいに通し、次に、上記顆粒に
加え、混合した後、打錠機で圧縮して各重量１５０mgの
錠剤を得る。

【００４８】製剤例５以下のように、各々が活性成分を８０mg含有するカプセ
ルを調製する：活性成分、セルロース、デンプンおよびステアリン酸マ
グネシウムを混合し、Ｎo.４５メッシュＵ.Ｓ.のふるい
に通し、２００mgの量を硬ゼラチンカプセルに充填す
る。

【００４９】製剤例６以下のように、各々が活性成分を２２５mg含有する坐剤
を調製する：活性成分をＮｏ.６０メッシュＵ.Ｓ.ふるいに通し、必
要最少限の加熱により予め融解して置いた飽和脂肪酸グ
リセリド中に懸濁する。次いで、この混合物を表示容量
２gの坐剤型に注ぎ、冷却する。

【００５０】製剤例７以下のように、各々が用量５ml当たり活性成分を５０mg
含有する懸濁液を調製する：成分使用量活性成分５０ mg カルボキシメチルセルロースナトリウム５０ mg シロップ１.２５ml 安息香酸溶液０.１０ml 香料適量着色料適量純水合計５mlになる量活性成分をＮｏ.４５メッシュＵ.Ｓ.のふるいに通し、
カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびシロップ
と混合して、滑らかなペーストを得る。安息香酸溶液、
香料および着色料を水の一部で希釈し、撹拌しながら添
加する。次いで、充分量の水を加えて必要な容量にす
る。

【００５１】製剤例８以下のように、静脈内製剤を調製する：成分使用量活性成分１００ mg等張食塩水１０００ ml

【００５２】式I、IIおよびIIIで示される化合物はＰＩ
３−キナーゼおよびＰＩ３−キナーゼ依存症に対して
広い用量範囲にわたって有効である。例えば、１日用量
は、通常、体重１ｋｇに対して約０.１〜約５０mgの範
囲内となるであろう。成人ヒトの治療においては、１回
または分割用量で約５〜２５mg/kgの用量範囲が好まし
い。しかし、実際に投与される化合物の量は、病状の重
篤度、投与される化合物の選択、個々の患者の年令、体
重および反応を含む関連の環境、ならびに選ばれる投与
経路に照らして医師が決定するであろうことは理解され
よう。従って、上記の用量範囲は、いかなる意味におい
ても本発明の範囲を限定しようとするものではない。

【００５３】式I、IIおよびIIIで示される化合物はＰＩ
３−キナーゼに対して選択的活性を示した。以下にこ
の活性を証明するために用いた試験系を記述する。

【００５４】ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの精製ＰＩ３−キナーゼは多数の方法によって調製すること
ができる。その一つの方法において、ＰＩ３−キナー
ゼをＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection（Rockvill
e、MD）から入手した全面Ｓwiss３Ｔ３細胞のから調製
した。ＰＩ３−キナーゼの精製に先立って、１０％子
牛血清を追加したＤulbeccoの修飾イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ；Sigma、St. Louis、MO）の大量培養液中で細胞を
維持し、０.２５％トリプシンおよび０.０２％エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて継代した。４つの
１００mm培養プレート上の２４x１０⁶細胞を１０mlのＨ
anks平衡塩溶液（pＨ７.４、ＨＢＳＳ； Sigma）で洗浄
し、子牛血清を含まないＤＭＥＭ中で１時間放置した。
次いで、１５分間、１００ng/mlの血小板由来成長因子
（ＰＤＧＦ; Genzyme、 Cambridge、 MA）の組換えヒトＢ
Ｂホモ二量体で刺激した。培地を吸い出し、細胞をＨＢ
ＳＳ（１０ml）で洗浄し、次いで３mlの１３７mＭＮa
Ｃl、１mＭＭgＣl₂を含む２０mＭトリス（pＨ８.
０）、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００
（Rohm and Haas、 Philadelphia、 PA）、２μg/ml ロイ
ペプチン、２μg/ml アプロトニン、１mＭフェニルメ
チルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、および１mＭ
オルトバナド酸ナトリウムで溶解した。この細胞をプレ
ートの表面からかき集めて６０００ｘｇで１０分間遠心
した。上清を１.５mlの試験管中、５０μlの洗浄したＩ
gＧ２bk抗ホスホチロシン抗体ビーズ（Upstate Biotech
nology Inc.、Ｌake Placid、NY）と混合した。この試
験管に蓋をし、４°Ｃで２時間回転させ、ビーズを２μ
g/ml ロイペプチン、４μg/ml アプロトニン、１mＭＰ
ＭＳＦ、２００μＭアデノシン、および１mＭオルト
バナド酸ナトリウムを含むＨＢＳＳ（１ml）で２回洗浄
した。チロシンリン酸化ＰＩ３−キナーゼを、２００μ
l/試験管の１０mＭトリス（pＨ７.５）、２ＭＮaＣ
l、１mＭＥＤＴＡ、２００μＭアデノシン、および１
０mＭフェニルリン酸ナトリウムを用いてビーズから溶
離した。

【００５５】別の好ましい方法においてＰＩ３−キナ
ーゼを牛脳から調製した。２つの牛脳（湿重量約９００
g）を地方の屠殺場から屠殺の数分以内に入手し、氷詰
めにし、１時間以内にホモジナイズした。脳の余分の脂
肪および血管を除去し、次いでＴekmar Ｔissuemizer
（Cincinnati、 OH）を用いて２５０mＭ蔗糖、６mＭ β
−メルカプトエタノール、１μg/ml ロイペプチン、１
μg/ml ペプスタチンＡ、０.４mＭＰＭＳＦ、および１
mＭＭgＣl₂を含む２０mＭトリス（pＨ８.３）中、４
°Ｃでホモジナイズした。

【００５６】１０,０００ｘｇで６０分間遠心した後、
４°Ｃで１Ｍ酢酸を滴下して上清（約１２００ml）のp
Ｈを５.７５まで低下させた。４°Ｃでさらに１５分撹
拌した後、溶液を１３,５００ｘｇで６０分間遠心し
た。上清を捨て、ペレットをバッファーＡ［６mＭ β-
メルカプトエタノール、０.１mＭエチレングリコール
−ビス(β−アミノエチルエーテル)Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−四
酢酸（ＥＧＴＡ）、１μg/mlロイペプチン、１μg/ml
ペプスタチンＡ、および１mＭＭgＣl₂を含む２０mＭト
リス（pＨ８.３）］中に再懸濁し、４°Ｃで５ml/分の
流速でファーストフローＱセファロースカラム（３００
ml）に導入した。導入した後、カラムを３倍容量の０.
１ＭＫＣlを含むバッファーＡで洗浄し、次いで３ml/
分で７倍容量以上のバッファーＡ／０.１ＭＫＣlから
バッファーＡ／０.６ＭＫＣlの直線勾配を用いてキナ
ーゼを溶離した。

【００５７】以下の記載のように、１０μlの分画と基
質としてのホスファチジルイノシトールを用いて各分画
のＰＩ３−キナーゼ活性について測定した。ＰＩ４−
キナーゼは最初に溶離され、ＰＩ３−キナーゼは約０.
３ＭＫＣlで溶離された。このＰＩ３−キナーゼのプ
ールを４０％硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心（１
３,５００ｘｇ、６０分間）に次いでペレットをバッフ
ァーＢ［６mＭ β-メルカプトエタノール、１μg/ml ロ
イペプチン、１μg/ml ペプスタチンＡ、および１mＭ
ＭgＣl₂を含む1０mＭリン酸カリウム（pＨ７.４）］中
に再懸濁し、５０mlのヒドロキシルアパタイトカラム
（Calbiochem, Inc.、 La Jolla、 CA）に２.５ml/分で導
入した。カラムをＡ₂₈₀ベ−スラインが０に到達するま
で１５０mlのバッファーＢで洗浄し、次いで１ml/分で
４５０分以上、１０〜３２０mＭＫＨ₂ＰＯ₄の直線勾配
を用いてキナーゼを溶離した。

【００５８】活性分画をプールし、次いでバッファーＣ
［６mＭ β-メルカプトエタノール、０.１mＭＥＧＴ
Ａ、１μg/ml ロイペプチン、１μg/ml ペプスタチン
Ａ、および０.１mＭＭgＣl₂を含む５０mＭＭＥＳ（p
Ｈ６.２）］で平衡化したＭonoＳカラム（８ml）(Pharm
acia, Inc.、 Piscataway、 NJ）に３ml/分で導入した。
１２０分以上、バッファーＣ中の０〜０.４ＭＫＣlの
直線勾配を用いてＰＩ３−キナーゼを溶離した。分画
の分析において、通常ＰＩ３−キナーゼ活性の２つの
プールが見いだされた。活性の大部分は最初の溶出液中
に見いだされたが、約２０％の活性は勾配中に溶離され
た。勾配中の物質はかなりのＰＩ４−キナーゼ活性を有
していたが、最初の溶出液中に溶離されたＰＩ３−キナ
ーゼにはＰＩ４−キナーゼ活性が実質的に伴われていな
かった。従って、ＭonoＳの最初の溶出液をＭini-Ｕltr
asette Ｏmega 50Ｋ膜（Filtron, Inc.、 Northborough、
MA）による接線フロー濾過によって濃縮し、バッファ
ーＣで希釈して伝導率を低下させた。次いで、この物質
を上記条件を用いて、ＭonoＳカラムに再び導入した。
ＰＩ３−キナーゼは洗浄中にカラムに結合し、勾配中
に溶離した。ホスファチジルイノシトールキナーゼ活性
の２つのプールを勾配中に得て、各プールをＰＩ３−キ
ナーゼおよびＰＩ４−キナーゼ活性について分析した。
プール１は９５％のＰＩ３−キナーゼ活性（および５
％のＰＩ４−キナーゼ活性）を含み、一方、プール２は
主にＰＩ４−キナーゼ活性を含んでいることがわかっ
た。

【００５９】ＭonoＳカラムからのプール１をバッファ
ーＡで希釈し、ＭonoＱ（１ml）でのクロマトグラフィ
ーに導入し、バッファーＡ中の０〜０.４ＭＫＣlの勾
配で溶離した。最終プールをＰＩ３−キナーゼおよび
ＰＩ４−キナーゼの活性について測定した。最終産物は
９９％より大きいＰＩ３−キナーゼ活性を含有するこ
とが分かった。

【００６０】精製したＰＩ３−キナーゼ活性の分析ＰＩ３−キナーゼ活性を、Ｍatter, Ｗ.Ｆ.ら［Bioche
mical and Biophysical Research Communications， 18
6: 624-631 (1992)］によって先に記述されたようにし
て測定した。阻害候補物質を最初にＤＭＳＯ中に溶解
し、次いで１５mＭＭgＣl₂および1mＭＥＧＴＡを含む
５０mＭＨＥＰＥＳバッファー（pＨ７.５）で１０倍に
希釈した。この溶液１０μlを、精製した牛脳ＰＩ３−
キナーゼ（９μl）およびホスファチジルイノシトール
［1mＭＥＧＴＡを含む５０mＭＨＥＰＥＳバッファー
（pＨ７.５）中の２mg/ml ストック溶液（５μl）］と
インキュベートした。最終反応混合物は０.１〜５ng/ml
阻害物質および３％ＤＭＳＯ（v:v）を含んでいた。こ
のＤＭＳＯ濃度はＰＩ３−キナーゼ活性に何の影響も
及ぼさず、対照の反応混合物に阻害物質を含まない３％
ＤＭＳＯ（v:v）を用いた。反応物を周囲温度で１０分
間プレインキュベートし、次いで１μlの[γ-³²Ｐ]ＡＴ
Ｐ（２mCi/ml、５００μＭストック溶液；０.０８mCi/
ml、２０μＭ最終濃度；Dupont New England Nuclear、
Boston、MA）を加えて酵素反応を開始させた。周囲温度
で１０分間頻繁に混合して反応を進行させ、その後１N
ＨＣl（４０μl）を加えて反応を停止させた。脂質を８
０μl ＣＨＣ１₃:ＭeＯＨ（１：１、v:v）を加えて抽出
した。試料を混合し、遠心して、下層の有機相をシリカ
ゲルＴＬＣプレート（EM Science、 Gibbstown、 NJ）に
乗せ、それをＣＨＣl₃:ＭeＯＨ:Ｈ₂Ｏ:ＮＨ₄ＯＨ（４
５:３５:８.５:１.５、v:v）で展開した。プレートを乾
燥させ、キナーゼ反応をオートラジオグラフィーで可視
化した。ホスファチジルイノシトール３−モノホスフェ
ートの領域をプレートからかき集め、液体シンチレーシ
ョン分光法を用い、シンチレーションカクテルとして使
用されるＲeady Ｐrotein（Beckman Instruments, In
c.、 Fullerton、CA）を用いて定量した。ワートマンニ
ンおよび類縁体の阻害レベルは、対照との比較による［
³²Ｐ］−カウント／分の百分率（％）として決定した。

【００６１】また、ＰＩ３−キナーゼ反応の産物をＷh
itman，Ｍ.［Nature, 332: 644-646(1988)］によって議
論されたＨＰＬＣによって確認した。先にＡuger, Ｋ.
Ｒ.［Cell, 57: 167-175 (1989)］によって記述された
ように、リン脂質をメチルアミン試薬中で脱アシル化
し、Ｗhatman Ｐartisphere ＳＡＸ陰イオン交換カラ
ムを用いて分離した。Ｒadiomatic Ｍodel Ａ−140 Ｆl
o-Ｏne/Ｂeta オンライン放射能検出器を用いて、脱ア
シル化された［³²Ｐ］−酵素産物をモニターした。脱ア
シル化された［³Ｈ］ＰＩ４−モノホスフェートを内部
標準として加えた。

【００６２】牛脳から精製したＰＩ３−キナーゼに対
するワートマンニンおよびその類縁体の阻害効果を表２
に示す。

【表２】

【００６３】さらに、本発明の方法において用いるワー
トマンニンおよびワートマンニン類縁体は、ＰＩ４−キ
ナーゼ、ホスホリパーゼＣ、ｃ−ｓｒｃプロテインチロ
シンキナーゼまたはプロテインキナーゼＣに影響を及ぼ
さず、先に報告されたミオシン軽鎖キナーゼの阻害物質
としての活性［例えば、Nakanishi, S.ら、J.Biol.Che
m., 267(4): 2157-2163 (1992) を参照］よりも１００
倍程度大きい活性を持っている。即ち、ワートマンニン
およびその類縁体は強力かつ選択性の高いＰＩ３−キナ
ーゼの阻害物質である。

【００６４】全細胞ＰＩ３−キナーゼ活性の分析ｖ−ｓｉｓＮＩＨ３Ｔ３細胞［National Cancer Inst
itute、 Bethesda、 MD］は構成性の、ならびに血小板由
来成長因子によって刺激されるＰＩ３−キナーゼ活性
を示すことがわかっているので、この細胞をホスファチ
ジルイノシトール３−ホスフェートのレベルを測定する
ために選択した。７５cm²培養フラスコ中の対数増殖期
のｖ−ｓｉｓＮＩＨ３Ｔ３細胞を子牛血清を含まない
ＤＭＥＭ中に２時間置いた。この細胞をリン酸を含まな
いＤＭＥＭで洗浄し、０.１％の脂肪酸不含の牛血清ア
ルブミンおよび０.１５mCi/ml［³²Ｐ］Ｈ₃ＰＯ₄（ICN B
iomedicals、Irvine、CA）を含む同一培地中で７０分間
インキュベートした。阻害候補物質を上述の方法を用い
て調製し、これを細胞と１０分間接触させて置き、次い
でその細胞を１００ng/ml ＰＤＧＦで１０分間刺激し
た。細胞中のホスファチジルイノシトール３−ホスフェ
ートを測定するために、培地を除去し、細胞をリン酸緩
衝生理食塩水で１回洗浄し、次いでフラスコにつき４ml
のＨＣl：メタノール（１：１容量比）を加えた。細胞
をフラスコからかき集め、全脂質をＦolch, Ｊ.ら［J.B
iol.Chem., 226: 497-509 (1957)］によって記述された
方法によって抽出した。脱アシル化脂質をＣlark, Ｎ.
Ｇ.ら［Ｂiochem.J., 195: 301-306 (1981)］によって
記述された方法によりメチルアミンを用いて調製し、Ａ
uger, Ｋ.Ｒ.ら［Methods in Inositide Research、 159
-166頁; Irvine, R.F.編、 Raven Press, Ltd.、 New Yor
k、 NY (1990)］が記述したように、１０cmのＲＡＣ II
Ｐartisil 5 ＳＡＸカラム（Whatman、 Kent、 U.K.）を
用いるＨＰＬＣにより、０.８ml/分の流速のＮＨ₄Ｈ₂Ｐ
Ｏ₄勾配で溶離することによって分離した。溶出ピーク
の検出は放射活性流動検出器（Flo-One Beta、 A515型、
Radiomatic Instruments、 Meriden、 CT）で行った。対
照の化合物にデアシル−［³Ｈ］ホスファチジルイノシ
トール−４,５−ビスホスフェートおよびデアシル−［
³²Ｐ］ホスファチジルイノシトール−３,４,５−トリス
ホスフェートを使用した。

【００６５】精製したＰＩ３−キナーゼの阻害は、全
細胞中のＰＩ３−キナーゼの阻害よりもかなり大きい
が、１.３μＭワートマンニンは全細胞中の血小板由来
成長因子によって刺激されるホスファチジルイノシトー
ル３−ホスフェート生成のほぼ完全な阻害を与えた。

【００６７】本明細書中に記載した発明を十分に理解し
うるように以下に実施例を挙げる。しかし、これら実施
例は例示のためだけのものであり、いかなる意味におい
ても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでないこ
とは理解されよう。

【００６８】実施例１培養物Ａ２４６０３.１の発酵Ａ．振盪フラスコ培養物Ａ２４６０３.１（凍結乾燥ペレットまたは液体
窒素中で維持された懸濁液のどちらか）を以下の組成を
有する栄養培地に接種した。無調整pＨ＝６.３（調整せず）ａ：ＰＲＯＦＬＯＦlour（Traders Protein、Memphi
s、TN）接種した栄養培地を２５０ml 広口Ｅrlenmeyerフラスコ
中、２５°Ｃで約７２時間、２インチ（５.０８cm）の
円を２５０ｒｐｍで周回する振盪器上でインキュベート
した。

【００６９】Ｂ．培養物Ａ２４６０３.１のタンク発酵大量の接種物を得るため、１０mlのインキュベートした
振盪フラスコの培地（Ａ項で記述したように調製）を４
００mlの上記と同一の組成を有する第二段階の栄養培地
に接種した。この第二段階の培地を２Ｌ広口Ｅrlenmey
erフラスコ中、２５°Ｃで約２３時間、２インチ（５.
０８cm）の円を２５０ｒｐｍで周回する振盪器上でイン
キュベートした。

【００７０】この第二段階の培地（４００ml）を以下の
組成を有する無菌生産培地（１１５Ｌ）に接種した。無調整ｐＨ＝６.８（調整せず）加えた消泡剤：０.２g/ＬＳＡＧ 471^b ａ：ＮＺＡmine Ａ（Sheffield Chemical Co.、 Norwic
h、 NY）ｂ：ＳＡＧ 471（Union Carbide、 Sistersville、 WV）接種した生産培地を１１５Ｌ撹拌発酵タンク中、約２５
°Ｃの温度で４〜５日間発酵させた。低ｒｐｍ（１８０
〜３３０）で撹拌しながら溶存酸素レベルを空気飽和の
４５％に維持した。

【００７１】実施例２ワートマンニンの単離および精製実施例１の発酵ブロスをセラミックフィルター（Ｍembr
alox Systems、 Illinois Water Treatment、 Rockford、
IＬ）で濾過し、１７５Ｌのワートマンニン含有濾液を
得た。５N ＨＣlで濾液のpＨを約３.９に調節した。次
いで、この濾液を２分の１容量の酢酸エチルで３回溶離
して合計容量を２０７Ｌにし、これを真空下で６Ｌに濃
縮した。

【００７２】この６Ｌの酢酸エチル濃縮液をさらに真空
下で濃縮し、暗褐色の粘稠油状物を得、これに５００ml
のメタノ−ルを加えた。結晶化が完結するまでこの混合
物を撹拌し、濾過して、冷メタノールで簡単に洗浄し、
真空乾燥させて、２０.４gのワートマンニンを得た。

【００７３】メタノール上清を真空下で再濃縮し、粘稠
油状物を得、１８０mlのクロロホルム中に溶解し、クロ
ロホルム中のＷoelm Ｇrade 62 シリカの１２ｘ２０cm
カラムに導入した。５.０Ｌのクロロホルム洗浄液を真
空下で濃縮して、褐色の油状物を得、次いでこれを２５
０mlの温メタノール中に溶解した。生じた結晶を１８時
間後に濾過によって集め、４.２gのワートマンニンを得
た。この結晶化操作を残りの上清についても行い、さら
に１.９gのワートマンニンを得た。ワートマンニンの同
定はＨＰＬＣによって確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 594120537 ジ・アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツＴＨＥＡＲＩＺＯＮＡＢＯＡＲＤＯＦＲＥＧＥＮＴＳアメリカ合衆国85719アリゾナ州シティ・オブ・トゥーソン、イースト・フォート・ローウェル・ロード1430番スウィート 200 (72)発明者ロザンヌ・ボンジョウクリアンアメリカ合衆国46077インディアナ州ジオンズビル、ドミニオン・ドライブ318番 (72)発明者ガース・ポウィスアメリカ合衆国85718アリゾナ州トゥーソン、イースト・カレ・デ・ミラー6301番 (72)発明者クリス・ジョン・ブラホスアメリカ合衆国46033インディアナ州カーメル、ウエストミンスター・ウェイ11203 番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性成分として、【化１】［式中、ＲはＨまたはアセトキシである］【化２】および【化３】［式中、Ｒ¹はＨ、メチルまたはエチルであり、Ｒ²はＨ
またはＣＨ₃である］から成る群から選ばれる化合物を
含む抗ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依存
症製剤。
【請求項２】活性成分として、【化４】［式中、ＲはＨまたはアセトキシである］【化５】および【化６】［式中、Ｒ¹はＨ、メチルまたはエチルであり、Ｒ²はＨ
またはＣＨ₃である］から成る群から選ばれる化合物を
含む抗ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依存
新生物製剤。
【請求項３】化合物が以下の式I：【化７】［式中、ＲはＨまたはアセトキシである］で示される化
合物である請求項２に記載の製剤。
【請求項４】式Iの化合物が、Ｒがアセトキシである
化合物である請求項３に記載の製剤。