KR20220060018A - 남극-유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 화합물 및 이를 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 조성물 - Google Patents

남극-유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 화합물 및 이를 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남극-유래 진균에서 분리한 화합물, 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 신규한 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물, 염증, 암 또는 당뇨 개선용 식품 및 상기 화합물의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 남극-유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 화합물을 포함하는 조성물은 PTP1B의 발현을 억제하며, 천연물 유래 물질로서 안전성 및 부작용 관련 문제가 발생될 가능성도 낮으므로, 염증성 질환, 암 또는 당뇨의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

남극-유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 화합물 및 이를 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 조성물{Compound from a Antarctic-Derived Fungal Strains Acremonium sp. SF-7394 and Composition for Anti-Inflammation, Anticancer or Anti-Diabetes Comprising the Same}
본 발명은 남극-유래 진균에서 분리한 화합물, 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 신규한 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물, 염증, 암 또는 당뇨 개선용 식품 및 상기 화합물의 분리방법에 관한 것이다.
염증은 신체의 부상 또는 감염에 대한 필수적인 면역반응이다. 염증은 정상적인 경우에는 생체 내에서 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키는 작용을 하지만, 염증의 정도가 일정 수준 이상이 되거나 만성화되어 만성염증과 같은 질병 상태로 진행되는 경우 문제가 된다. 임상질환 가운데 거의 모든 질환에서 염증반응을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 암발생과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
최근 밝혀진 바에 의하면, 염증, 암 및 당뇨병과 같은 많은 병리생리학적 조건 하에서 PTP1B 발현이 증가하는 것으로 나타났다(Song, G.J., et al.; A novel role for protein tyrosine phosphatase 1B as a positive regulator of neuroinflammation. J. Neuroinflammation 2016, 13, 86.). 또한, 단백질 티로신 포스파타제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)는 인슐린 및 렙틴 신호전달 경로의 주요 음성 조절제의 작용을 한다(Zhou, Y., et al.; Chem. Biodivers. 2017, 14, e1600462.). 따라서, 최근에는 그러한 질환을 치료하기 위하여, PTP1B는 새로운 약물 표적이 되었으며, PTP1B 억제제에 대한 연구가 진행되고 있다.
한편, 진균류 아크레모늄(Acremonium) 속(genus)은 토양, 식물, 및 해양 유기체와 같은 다양한 공급원로부터 수득될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 아크레모늄 종으로부터 유래된 2차 대사체는 스테로이드, 테르페노이드, 메로테르페노이드, 폴리케티드, 알칼로이드 및 펩티드를 함유하는 것으로 보고되었다(Tian, J.; Lai, D.; Zhou, L. Mini Rev. Med. Chem. 2017, 17, 603-632.). 이들은 항박테리아, 항진균 및 세포독성 효과와 같은 다양한 생물학적 활성을 나타내었다. 이러한 생물학적 활성 대사체의 예로는 세팔로스포린 항생제, 세포독성 헵텔리드산 클로로히드린, 항진균 아크레모크산톤 A 및 항생제 세파이볼 B가 있다. 그러나, 아직까지 임상적으로 사용되는 PTP1B를 억제하는 효과를 갖는 화합물은 보고된 바 없으며, 기존의 PTP1B 억제제는 상대적으로 낮은 활성(마이크로몰 수준의 IC50) 또는 부족한 선택성을 갖는다는 단점이 있다(Cheng-shi JIANG, et al.; Acta Pharmacologica Sinica (2012) 33: 1217-1245).
이에, 본 발명자들은 항염증, 항암 또는 항당뇨 활성이 우수한 화합물을 스크리닝하고자 예의 노력한 결과, 남극 유래 진균 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394로부터 신규한 화합물인 아크레슈도테린(acrepseudoterin), 이소코디세폴로사이드 A(isocordycepoloside A) 및 페놀 유도체를 순수하게 분리 및 정제하였으며, 상기 화합물은 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP1B)의 효소활성을 억제함으로써 항염증, 항암 및 항당뇨 효과를 갖는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 남극-유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 신규한 화합물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증, 항암 또는 항당뇨 활성이 우수한 상기 화합물을 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 염증, 암 또는 당뇨 개선용 식품을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 분리방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아크레슈도테린(acrepseudoterin) 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
여기서, 상기 R1 내지 R7은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 이소코디세폴로사이드 A(isocordycepoloside A) 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
Figure pat00002
여기서, 상기 R8 내지 R10은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물; 상기 화학식 2로 표시되는 화합물; 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 3]
Figure pat00003
여기서, 상기 R11 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이다.
본 발명은 또한 (a) 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 균주 배양물을 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물의 분리방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00004
[화학식 2]
Figure pat00005
[화학식 3]
Figure pat00006
여기서, 상기 R1 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이다.
본 발명에 따르면 남극-유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리한 화합물을 포함하는 조성물은 PTP1B의 발현을 억제하며, 천연물 유래 물질로서 안전성 및 부작용 관련 문제가 발생될 가능성도 낮으므로, 염증성 질환, 암 또는 당뇨의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 화합물 1의 계산되고 실험된 ECD 스펙트럼의 비교를 도시한다.
도 2는 화합물 1에 의한 PTP1B의 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯을 도시한다. 데이터는 3개의 실험의 평균값 ±SD를 기술한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 남극 유래 진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394(기탁번호: KCTC 14322BP)의 추출물로부터 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 및 (-)-테르나틴, [D-Leu]-테르나틴 및 슈로틴 A을 분리하고 그 구조를 확인하였다. 또한, 상기 화합물이 PTP1B의 발현을 억제시킴으로써, 염증성 질환 또는 당뇨의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 하기 화학식 1로 표시되는 아크레슈도테린(acrepseudoterin) 화합물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00007
여기서, 상기 R1 내지 R7은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이며, 바람직하게는 H, CH3 또는 CH2CH3이다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물 1은 신규한 엠필렉텐형 디테르펜(amphilectane-type diterpene)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 하기 화학식 2로 표시되는 이소코디세폴로사이드 A(isocordycepoloside A) 화합물에 관한 것이다.
[화학식 2]
Figure pat00008
여기서, 상기 R8 내지 R10은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이며, 바람직하게는 H, CH3 또는 CH2CH3이다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물 2는 신규한 아코란형 세스퀴테르펜 글리코사이드(acorane-type sesquiterpene glycoside)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물 1 및 화합물 2는 남극 유래 진균 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물; 상기 화학식 2로 표시되는 화합물; 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 3]
Figure pat00009
여기서, 상기 R11 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이며, 바람직하게는 H, CH3 또는 CH2CH3이다.
본 발명에 있어서, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 또는 슈로틴(pseurotin) A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 및 슈로틴(pseurotin) A는 남극 유래 진균 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 및 슈로틴(pseurotin) A는 단백질 티로신 포스파타제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 효소활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 화합물 1 및 [D-Leu]-테르나틴은 22.8±1.1mM 및 14.8±0.3mM의 IC50값으로 PTP1B 효소활성을 용량-의존적으로 억제하는 것으로 나타났다. 나머지 화합물은 80μM 수준의 IC50 값에서 12% 내지 44%의 PTP1B 억제율을 나타내었다.
PTP1B 과발현은 염증성 질환의 특징이며, PTP1B 억제는 유용한 항염증 및 신경영양 요법이 될 수 있음이 보고되었다. PTP1B 억제제는 i) 미세아교세포, 대식세포 및 간 세포주와 같은 세포 유형 및 ii) LPS-, IFN-γ- 또는 식이유도된 비만과 같은 염증 자극에 따라 달라지는 다양한 항염증 효과가 있다(Song et al. Journal of Neuroinflammation (2016)).
또한, PTP1B의 효소활성을 억제하는 화합물은 유방암, 대장암(colon cancer), 위암, 전립선암을 포함하는 여러종류의 암을 억제하는 효과를 갖는 것으로 보고되었으며(Song et al. Journal of Neuroinflammation (2016); Navasona Krishnan, et al., nature chemical biology, vol 10, July 2014 p.558-565), 당뇨병 및 비만에 대한 검증된 대사조절제 및 치료 표적으로 보고되었다(Navasona Krishnan, et al., nature chemical biology, vol 10, July 2014 p.558-565; Tonks, N.K. FEBS J. 280, 346-378 (2013)).
따라서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물; 상기 화학식 2로 표시되는 화합물; 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 또는 슈로틴(pseurotin) A를 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 옥살산 (oxalic)과 같은 산은 약학적으로 허용되는 것은 아니지만 약학적으로 허용되는 염을 얻기 위한 중간체로서, 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 당업자에게 인식될 수 있는 면역요법, 화학요법 및 방사선요법 등과 같은 염증성 질환의 치료법 및 다른 염증성 질환의 치료용 약학 조성물 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에 있어서, 용어 "화합물 1"은 상기 화학식 1로 표시되는 아크레슈도테린(acrepseudoterin) 화합물을 의미한다.
또한, 용어 "화합물 2"는 상기 화학식 2로 표시되는 이소코디세폴로사이드 A(isocordycepoloside A) 화합물을 의미한다.
또한, 용어 "화합물 3"은 상기 화학식 3으로 표시되는 페놀 유도체를 의미한다.
본 발명에서 용어 "항염증"은 염증을 억제하거나 감소시키는 작용을 의미한다.
본 발명에서 용어 "염증"이란, 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.
본 발명에 있어서, 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물은 항염증 활성을 가짐으로써 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서 "염증성 질환"은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것이다.
예를 들어, 각종 암, 부종, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스성 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선 관절염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 중증근무력증, 다발성 경화증 피부염, 알러지, 비염, 간직성 척추염, 건주위염, 제1형 당뇨병, 피부경화증(scleroderma), 퇴행성 신경질환, 제2형 당뇨병, 규폐증, 죽상동맥경화증, 백반증, 결막염 및 자가면역 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "추출물"은 상기 남극 유래 진균 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394로부터 분리된 항염증 활성을 가지는 물질을 말한다. 또한 본 발명에서 추출물은 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에서 추출물은 극성, 비극성, 물, 유기 용매 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등), 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다. 여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물; 상기 화학식 2로 표시되는 화합물; 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 염증, 암 또는 당뇨 개선용 식품에 관한 것이다.
Figure pat00010
여기서, 상기 R11 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴이며, 바람직하게는 H, CH3 또는 CH2CH3이다.
본 발명에 있어서, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 또는 슈로틴(pseurotin) A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 및 슈로틴(pseurotin) A는 단백질 티로신 포스파타제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 효소활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 "개선", "예방" 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "개선"이란 질환 또는 하나 이상의 임상적 증상을 일시적/지속적으로 완화시키는 모든 행위를 의미한다. "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, SF-7394의 배양물로부터 제조된 EtOAc 추출물에 Sephadex LH-20, 역상(RP) C18 및 고정상으로서 실리카겔 및 RP C18 prep HPLC을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(CC)와 같은 여러 분리 공정을 수행하였다. 그 결과, EtOAc 추출물로부터 화합물 1 내지 화합물 3 및 (-)-테르나틴, [D-Leu]-테르나틴 및 슈로틴 A를 수득하였다(실시예 3).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 균주 배양물을 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물의 분리방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00011
[화학식 2]
Figure pat00012
[화학식 3]
Figure pat00013
본 발명에 있어서, (a) 단계는 아크레모늄(Acremonium sp.) sp. SF-7394를 배양하는 단계로서, 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 영양원으로는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 탄소원으로는 글루코오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모 추출물, 황산암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있고, 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕 배양 또는 정치배양이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하나, 보통 20 내지 37℃에서 배양하는 것이 바람직하고, 25℃에서 배양하는 것이 더욱 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 일반적인 실험 절차.
UV 스펙트럼을 메카시스 옵티젠 포프 분광계(Mecasys Optizen Pop spectrometer)(Mecasys, 한국 대전) 상에 기록하였다. ECD 스펙트럼을 JASCO J-1100 분광편광계로 기록하였다. ESIMS 데이터를 quadrupole-time of flight(Q-TOF) 마이크로 LC-MS/MS 기기(Waters)를 사용하여 얻었다. 광학 회전을 Jasco p-2000 디지털 편광계를 사용하여 기록하였다. NMR 스펙트럼(1D 및 2D)을 JEOL JNM ECP-400 분광계로 MeOD (δH/δC = 3.31/49.0), pyridine-d 5 (δH/δC = 7.22, 7.58, 8.74/123.9, 135.9, 150.2)에 기록하였고, 화학적 이동을 잔류 용매 피크와 관련하여 참고하였다. HMQC 및 HMBC 실험은 각각 1 J CH = 140 Hz 및 n J CH = 8 Hz 에 대해 최적화되었다. 박층 크로마토그래피(TLC)는 Kieselgel 60 F254 (1.05715; Merck, Darmstadt, Germany) 또는 RP-18 F254s (Merck, Darmstadt, Germany) 플레이트 상에서 수행하였다. 스팟은 10% 수성 황산(H2SO4) 용액을 갖는 플레이트를 분무한 후 가열함으로써 가시화하였다. CC는 실리카겔(Kieselgel 60, 70-230 mesh 및 230-400 mesh, Merck, Darmstadt, Germany) 및 YMC octadecyl-functionalized 실리카겔 상에서 수행하였다. HPLC를 5 mL/min의 유속으로 preparative-C18 column (10 Х 250 mm; 5 μm 입자 크기) 상에서 수행하였고, 화합물을 자외선 검출기(210 및 254 nm에서의 흡수) 또는 증발성 광산란 검출기(evaporative light scattering detector)에 의해 검출하였다.
실시예 2: 균주 수집 및 동정(identification).
진균 균주 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394(기탁번호: KCTC 14322BP)을 2017년 1월에 남극대륙의 킹 조지 아일랜드 상의 Marian Cove (S 62°13'09.16", W 58°45'57.67")로부터 수집한 미확인 지의류(lichen)로부터 단리하였다. 확증표본(Voucher specimens, SF-7394)은 한국 극지연구소(Korea Polar Research Institute)에 수집되었다.
샘플 1g을 멸균 해수 (10mL)와 혼합하고 샘플의 일부 (0.1mL)를 멸균 해수를 포함하는 감자 덱스트로스 한천(PDA) 배지에서 스프레드 플레이트 방법(spread plate method)에 따라 처리했다. 분리물을 여러 번 배양(25℃에서 14일 동안)하여 최종 순수 배양물을 얻었고, 선택된 배양물을 -70℃에서 보존했다. 진균 균주 SF-7394의 동정은 ITS 유전자 서열을 분석하여 수행되었다. SF-7394 (GenBank accession number MK307778)의 ITS 시퀀스를 사용한 GenBank 검색에서는 Acremonium rutilum (NR_077124), Acremonium cereale (AB540571) 및 Acremonium persicinum (NR_131260)이 각각 93.63%, 88.81%, 및 88.5%의 서열동일성을 보여주는 가장 가까운 일치 항목으로 나타났다. 따라서 곰팡이 균주 SF-7394는 아크레모늄(Acremonium sp.)의 특징을 나타내었다.
실시예 3: 화합물 1 내지 3, (-)-테르나틴, [D-Leu]-테르나틴 및 슈로틴 A의 분리.
진균 균주 SF-7394을 25℃에서 28일 동안 3% NaCl을 갖는 200 mL의 감자 덱스트로스 아가(PDA) 배지를 각각 함유하는 23 fernbach 플라스크(1L) 상에서 배양하였다. 조합된 PDA 배지를 EtOAc (23 L)로 추출하였다. 합한 추출물 용액을 여과지를 통해 여과한 후 증발시켜 건조시켜서 조추출물(crude extract), SF-7394 (2) (2.5 g)을 수득하였다. 조추출물을 H2O (각각 500 mL) 중 20, 40, 60, 80 및 100% (v/v) MeOH의 단계적 구배로 용출하여, RP C18 flash CC (4.5 Х 30 cm)상에서 분획화하여 6개의 분획, SF-7394 (2)-1~6을 수득하였다. 분획 SF-7394 (2)-4 (307.6 mg)을 실리카겔 CC (3.0 x 25 cm)에 적용하고, 클로로포름 (CH2Cl2)-MeOH (70:1~2:1)로 용출시켜 하위분획(SF-7394 (2)-4-1~12)을 수득하였다. 하위-분획 SF-7394(2)-4-2 (9.9 mg)을 반-예비 RP HPLC에 의해 단리하고, H2O 중 20-70% CH3CN 의 구배로 30분에 걸쳐 용출시켜 화합물 3(1.3 mg, t R = 23.0 min)을 수득하였다. 하위-분획 SF-7394(2)-4-5 (34.9 mg)을 반-예비 RP HPLC에 의해 단리하고, H2O 중 20-50% CH3CN 의 구배로 30분에 걸쳐 용출시켜 슈로틴 A (10.0 mg, t R = 20.1 min)를 수득하였다. RP C18 CC (1.0 x 25 cm) [50분 동안 H2O (0.1% HCOOH) 중 60-100% MeOH] 를 사용하여 하위분획 SF7394(2)-4-8 (26.4 mg) 을 또한 정제하여 화합물 2 (4.2 mg, tR = 20.2 min) 를 수득하였다. 먼저, SF-7394 (2)-5 (786.7 mg)을 Sephadex LH-20을 정지상으로서 사용하고, CHCl3 중의 MeOH의 1/3 (v/v) 혼합물을 컬럼 (3.0 x 35 cm) 상에서 이동상으로서 사용하여 5개의 하위분획 SF- 7394 (5)-1~5로 분리하였다. 이어서, 하위-분획 SF-7394 (2)-5-2 (20 mg)을 RP C18 prep HPLC [30분 동안 H2O (0.1% HCOOH) 중 40-100% CH3CN] 상에서 추가로 분리하여 2개의 화합물, [D-Leu]-테르나틴(2.0 mg, t R = 20.0 min) 및 (-)-테르나틴(10.1 mg, t R = 21.0 min)을 수득하였다. 유사하게, 하위-분획 SF-7394 (2)-5-3 (256 mg)을 또한 RP C18 prep HPLC [30분 동안 H2O (0.1% HCOOH) 중 40-100% CH3CN]를 사용하여 정제하여 화합물 1 (4.6 mg, t R = 33.8 min)을 수득하였다.
실시예 4: 화합물 1의 구조 결정 및 성질.
화합물 1의 HRESIMS는 m/z 309.2196 [M + Na]+에서 나트륨 부가물 이온을 나타냈으며, 이는 C20H30O의 분자식을 나타내며(C20H30ONa에 대해 계산, 309.2194), 따라서 분자 내에 6도의 불포화도가 존재한다. 화합물 1의 1H, DEPT, 및 13C NMR 스펙트럼(표 1)의 분석은 1,2,3,4-사치환된 방향족 고리, 4개의 메틸기(모두 1H NMR 스펙트럼에서 이중선임), 5개의 메틸렌 단위(이들 중 하나는 산소화된 것임), 및 5개의 메틴의 존재를 나타내었다. 이러한 정보는 4개의 불포화 단위를 설명하며, 이는 요구되는 불포화 단위를 충족시키기 위해 화합물이 2개의 추가의 고리시스템을 가져야 한다는 것을 암시한다. 다음으로, 2D NMR 데이터의 상세한 분석을 수행하여 화합물 1의 평면구조를 확립하였다. 분자 내의 양성자와 탄소 사이의 직접 연결성은 HMQC 데이터의 분석에 의해 확립되었고, 분자 내의 스핀시스템은 COSY 데이터의 해석에 의해 정의되었다. 화합물 1의 COSY 스펙트럼은 2개의 메틸기(CH3-16 및 CH3-17)가 메틴 양성자인 H-15와 관련되었고, 이 메틴 양성자는 메틸렌 양성자 H2-14에 추가로 연결되었고, 이는 차례로 δH 3.35(H-1)에서 메틴양성자와 관련을 나타냈다. COSY 데이터의 분석은 H-1에서 H-7로 순차 스핀시스템을 추가로 연장시켰으며, 2개의 메틸기 CH3-18 및 CH3-17는 각각의 양성자들 사이의 COSY 상관관계에 기초하여 C-3 및 C-7에 각각 위치하였다. 또한, 단리된 옥시메틸렌 단위(H2-20) 및 상호 오쏘-커플링된 방향족 양성자의 존재는 COSY 데이터에서 명백하였다. 이들 스핀시스템 및 4차 탄소 사이의 연결성은 HMBC 데이터의 분석에 의해 확립되었다. 방향족 양성자 H-9 및 H-10와 방향족/올레핀 탄소의 영역 내의 탄소의 HMBC 상관관계는 1,2,3,4-테트라치환된 벤젠 고리에 대한 탄소 화학적 이동의 완전한 배치를 가능하게 하였다. 또한, H-10로부터 산소화된 메틸렌 탄소(C-20)로의 HMBC 상관관계는 이 탄소를 C-11에 연결시켰다. H-7로부터 C-8 및 C-9로의 HMBC 상관관계는 C-7과 C-8 사이의 연결을 제공하였다. 이어서, C-4 및 C-13를 H-4과 C-8 및 C -14의 HMBC 상관관계에 의해 연결하였다. 마지막으로, H-2과 C-12의 HMBC 상관관계는 C-1의 C-12과 유일한 나머지 연결 부위 사이의 연결에 대한 증거를 제공하였다. 따라서, 화합물 1의 3고리 평면 구조는 헥사히드로-1H-페날렌 고리시스템을 갖는 것으로 도시된 바와 같이 배치되었다. 화합물 1의 탄소는 이전의 슈도테로신에 따라 넘버링되었다. 화합물 1의 구조는 신규한 엠필렉텐형 디테르페노이드(amphilectane-type diterpenoid)로 인식되고 아크레슈도테린(acrepseudoterin)으로 명명되었다.
화합물 1의 상대적 및 절대적 구성은 NOESY 데이터 및 계산된 전자원형 이색성(electron circular dichroism, ECD) 계산의 분석에 의해 결정되었다(도 1). 화합물 1의 NOESY 스펙트럼은 H-7와 H-1 및 H-4의 상관관계를 보여주었으며, 이는 이들 양성자가 고리시스템의 동일한 면에 위치되었음을 나타낸다. 차례로, H3-18 및 H3-19 사이의 NOESY 상관관계는 분자 내 모든 입체중심의 상대적인 배열을 다루고, 고리시스템의 반대 면 상에 이들 메틸기를 위치시켰다. 화합물 1의 절대 배열은 그의 실험 ECD 스펙트럼을 거울상이성질체인 (1S, 3R, 4R, 7R)-화합물 1(화합물 1a) 및 (1R, 3S, 4S, 7S)-화합물 1(화합물 1b)에 대한 시간-의존성 밀도 작용 이론(time-dependent density functional theory, TDDFT)을 사용하여 계산된 시뮬레이션된 ECD 스펙트럼과 비교함으로써 제안되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 화합물 1의 실험적인 ECD 곡선은 화합물 1b에 대해 계산된 것과 거의 동일하였으며, 이는 화합물 1의 절대 배열이 1R, 3S, 11S, 7S임을 암시한다.
엠필렉텐형 디테르페노이드는 구조적으로 목적하는 트리시클릭 탄소 골격을 가지며, 공유된 구조적 특성에 기초하여 두 개의 그룹으로 나누어진다: 방향족 고리를 갖는 슈도프테로신 그룹 및 퍼히드로페날렌 고리를 갖는 엠필렉텐 그룹. 슈도프테로신, 헬리오포린 E, 및 슈도프테록사졸과 같은 슈도프테로신(pseudopterosin) 그룹에 속하는 엠필렉텐형 디테르페노이드는 일반적으로 완전히 치환된 벤젠 고리와 isobutenyl기를 가지고 있다. 또한, 이러한 부류의 대부분은 항암, 항말라리아 및 항염증 효과와 같은 다양한 생물학적 활성을 갖는 모노글리코실화된 형태로서 해양 무척추동물로부터 분리되었다. 그러나, 화합물 1과 같은 테트라치환된 벤젠 고리를 갖는 엠필렉텐형 디테르페노이드는 아직 보고되지 않았다. 따라서, 화합물 1은 독특한 구조적 특징을 갖는 진균 기원의 신규한 엠필렉텐형 디테르페노이드를 나타낸다.
화합물 1은 아크레슈도테린(acrepseudoterin)으로 명명되며, 백색의 무정형 고체이다. [α]20 D -15.6 (c 0.16, CH3CN); ECD (c 0.25 mM, CH3CN) λmax (Δε) 233 (-10.3), 250 (+4.8); 1H NMR 및 13C NMR (400 및 100 MHz, pyridine-d 5) 표 1 참조; HRESIMS m/z 309.2196 [M + Na]+ (calcd. for C20H30ONa, 309.2194).
화합물 1에 대한 NMR 분광측정 데이터 (400 MHz, 피리딘-d)로서, 8Hz에 대해 최적화된 aHMBC 상관관계는 표시된 탄소(들)에 대해 언급된 양성자(들)로부터의 것이다.
위치 δC, 유형 δH (J in Hz) HMBCa NOESY
1 32.9, CH 3.35, m 7
2 34.7, CH2 1.85, dt (2.2, 13.2)
1.46, m		 1, 3, 4, 12
3 29.1, CH 1.68, m
4 45.6, CH 2.10, m 3, 6, 13, 18 7
5 28.7, CH2 β 2.15, m
α 1.25, m		 18, 19
6 33.0, CH2 2.04, m
1.41, m
7 34.6, CH 2.98, m 6, 8, 9, 13, 19 1, 4
8 141.2, C
9 126.2, CH 7.25, d (7.8) 7, 11, 13
10 126.9, CH 7.79, d (7.8) 8, 12, 20
11 138.1, C
12 139.4, C
13 136.4, C
14 46.4, CH2 1.57, td (3.4, 8.0)
1.33, m
15 26.1, CH 1.72 c , m
16 21.2, CH3 1.00, d (6.4) 14, 17
17 24.8, CH3 0.85, d (6.4) 14, 15, 16
18 21.5, CH3 1.03, d (6.4) 2, 3, 4 5β, 19
19 24.4, CH3 1.31, d (6.6) 6, 8 5β, 18
20 62.1, CH2 5.18, dd (3.2, 12.9)
5.03, dd (3.2, 12.9)
20-OH 6.66, br t
실시예 5: 화합물 2의 구조 결정 및 성질.
화합물 2(C21H34O7)의 분자식은 이의 HRESSIMS 및 NMR 데이터에 기초하여 결정되었으며, 이는 5개의 불포화 단위를 나타낸다. 화합물 2의 1H, 13C 및 DEPT NMR 데이터(표 2)의 분석은 3개의 메틸, 6개의 메틸렌 단위(이들 중 2개는 산소화됨), 8개의 sp3 메틴(이 중 6개는 산소화되고 1개의 아세탈을 포함), 1개의 sp2 메틴 및 3개의 4차 탄소(이들 중 하나는 sp2 탄소임)의 존재를 나타냈다. 삼중치환된 올레핀 (δ 121.5 및 δ 141.2)에 대한 공명만이 NMR 데이터에서 관찰되어 불포화 단위를 고려했기 때문에, 화합물은 요구되는 불포화 단위를 충족시키기 위해 4개의 고리를 가져야 한다는 것이 제안되었다. 산소화된 sp3 양성자에 대한 영역에는 9개의 1H NMR 신호가 있었으며, 이 관찰은 13C NMR 스펙트럼에서 하나의 아세탈(δ 95.4, δ 75.6, δ 74.5 δ 74.1 및 δ 72.1) 및 하나의 산소화된 메틸렌(δ 62.9) 신호를 포함하는 5개의 sp3 산소화된 메틴과 함께 화학적 이동 및 커플링 데이터에 기초한 글루코스 모이어티를 나타낸다. 또한, 글루코스 단위는 4개의 요구되는 교환가능한 양성자를 설명하며, 이는 화합물 2의 아글리콘이 교환가능한 양성자를 갖지 않아야 한다는 것을 암시한다.
화합물 2의 추가 구조 설명은 COSY, HMQC, 및 HMBC 데이터의 분석으로 진행되었다. 개별 양성자 신호는 HMQC 데이터의 분석에 의해 상응하는 양성자-관련 탄소 신호에 관련되었다. COSY 및 HMBC 데이터의 추가 분석은 분자 내 글루코피라노스 고리 모이어티의 존재를 확인하였다. 스핀시스템은 COSY 데이터의 분석에 의해 확인된 H-1-H2-2-H2-3-H-4-H3-14, H-6-H-7-C-8-H3-15, 및 H2-9-H2-10로 구성된다. 이들 스핀시스템과 화합물 2에서 단리된 산소화된 메틸렌 단위 및 아글리콘 모이어티의 4차 탄소의 연결은 HMBC 데이터의 분석에 의해 확립되었다. 스핀 시스템 H-1-H2-2-H2-3-H-4-H3-14 은 H3-14 에서 C-5 및 H-2 에서 C-5로의 HMBC 상관관계에 의해 추가로 확장되어, 분자 내에 시클로펜탄 고리를 확립하였다. 유사하게, 스핀시스템 H2-9-H2-10 및 H-6-H-7-C-8-H3-15은 H3-15 에서 C-9로의 HMBC 상관관계에 의해 C-8 및 C-9 연결을 통해 연결되고, 이 단위는 H2-9 및 H-7 에서 C-5로의 HMBC 상관관계에 기초하여 사이클로헥센 고리시스템을 형성하도록 추가로 확장되었다. 또한, H-1 에서 C-6, H2-10 에서 C-4, 및 H-6 에서 C-1로의 HMBC 상관관계는 스피로 중심인 C-5를 갖는 상기 언급된 시클로펜탄 및 시클로헥센 모이어티 사이의 스피로-연결을 뒷받침하였다. 단일선 신호 H3-13 에서 C-1, C-11 및 C-12로의 HMBC 상관관계는 메틸기 C-13의 4차 탄소 C-11로의 연결뿐만 아니라 C-1와 C-11 사이의 연결을 유도한다. 마지막으로, H2-12 에서 C-1, C-6 및 C-11의 HMBC 연결은 분자에서 테트라하이드로피란 고리 모이어티의 배치를 유도하였다. 종합하면, 화합물 2의 아글리콘 모이어티는 추가의 6-원 에테르 고리를 갖는 스피로[4.5]데칸 시스템을 소유하도록 배치되었고, 글루코스 단위는 아노머 양성자 H-1'에서 C-11로의 HMBC 상관관계에 기초하여 C-11에 위치되었다. 따라서, 도시된 바와 같이 화합물 2의 평면 구조가 완성된다.
화합물 2의 아글리콘 모이어티의 상대적인 구성은 NOESY 상관관계의 분석에 의해 제안되었다. H-1에 대한 신호는 H-6, H3-13, 및 H3-14와 관련되어, 이들을 분자의 동일한 면에 배치한다. 또한, H-6과 H3-14 사이의 NOESY 교차-피크는 이러한 배치를 뒷받침하였다. 따라서, 분자의 아글리콘 부분에 대한 화합물 1의 상대적인 구성이 도시된 바와 같이 확립되었다. 글루코스 단위는 아노머 양성자(δ 5.55)의 커플링 상수(J = 3.6 Hz)를 기반으로 a-연결을 통해 연결되도록 배치되었다. 분자 내 글루코스 단위의 절대 배열을 다루기 위해, 당으로부터 유래된 부분입체이성질체 티오카바모일-티아졸리딘 유도체의 HPLC 분석을 사용하였다. 이 분석에서, 화합물 1을 2M HCl 중에서 가열함으로써 가수분해하고 NH4OH로 중화시켰다. 진공 건조 후, 잔류물을 피리딘에 용해시키고, L-시스테인 메틸 에스터 및 페닐 이소티오시아네이트로 유도체화시켰다. 반응 혼합물의 직접 HPLC 분석은 D-글루코스의 티오카바모일-티아졸리딘 유도체의 것과 상응하는 38.0분에서의 체류 시간에 피크를 나타냈다. 아노머 탄소 C-1'는 에테르 연결을 통해 C-11에 연결되고, 이 결합 주위에서 자유 회전이 있기 때문에, 분자의 아글리콘 모이어티의 절대 배열은 신뢰를 가지고 배치될 수 없다.
화합물 2의 아글리콘 구조는 추가의 피란 고리 시스템을 갖는 특이한 스피로[4.5]데칸 세세이퀴테르펜(아코란 골격)으로서 보고된, 코르디세폴 A(cordycepol A)에서 발견되는 것과 동일한 탄소 골격을 갖는다. cordycepol A의 C-1 및 C-12에서 원래 제안된 상대 배열은 수정되었다. 그러나 화합물 2에서 C-1, C-5 및 C-6의 상대 배열은 원래 제안되거나 수정된 cordycepol A의 구성 중 어느것과도 일치하지 않았다. 또한, 글리코실화된 cordycepol A는 보고되지 않았다. 따라서, 화합물 2은 새로운 아코란형 세스퀴테르펜으로 확인되었고, 이소코디세폴로사이드 A로 명명되었다.
화합물 2는 이소코디세폴로사이드 A(isocordycepoloside A)로 명명되며, 무색의 검(gum)형태이다; [α]20 D +18.6 (c 0.42, CH3OH); 1H NMR 및 13C NMR (400 및 100 MHz, pyridine-d 5) 표 2 참조; HRESIMS m/z 421.2213 [M + Na]+ (calcd. for C21H34O7Na, 421.2202).
화합물 2에 대한 NMR 분광측정 데이터 (400 MHz, 피리딘-d)로서, 8Hz에 대해 최적화된 aHMBC 상관관계는 표시된 탄소(들)에 대해 언급된 양성자(들)로부터의 것이다.
위치 δC, 유형 δH (J in Hz) HMBCa NOESY
1 52.3, CH 1.65, m 2, 5, 6, 10 6, 13, 14
2 21.0, CH2 2.01, m
1.76, m		 1, 4, 5
3 29.4, CH2 1.86, m
1.00, m
4 34.8, CH 1.97, m 1, 3, 5, 10, 14
5 43.5, C - -
6 77.6, CH 3.51, d (5.6) 1, 5, 7, 8, 10, 12 1, 12β, 14
7 121.5, CH 5.71, brd (5.6) 5, 6, 9, 15
8 141.2, C
9 28.6, CH2 1.77, m
1.95, m		 5, 7, 8
10 23.3, CH2 1.26, m
2.93, ddd (6.8, 12.8, 25.6)		 4, 5, 6, 8, 9
11 76.5, C
12 75.7, CH2 α 4.57, d (12.4)
β 3.15, d (12.0)		 1, 6, 11
 13
13, 6
13 20.1, CH3 1.31, s 1, 11, 12
14 18.6, CH3 0.76, d (6.8) 3, 4, 5 1, 6
15 23.4, CH3 1.47, s 7, 8, 9
1' 95.4, CH 5.57, d (3.6) 11, 3', 5'
2' 74.1, CH 4.09, dd (3.6, 9.6) 3'
3' 75.6, CH 4.58, t (9.6) 2', 4'
4' 72.1, CH 4.22, t (9.6) 5', 6'
5' 74.5, CH 4.69, m
6' 62.9, CH2 4.40, dd (12.0, 2.0)
4.31, dd (11.6, 4.8)		 4'
실시예 6: 화합물 3의 구조 결정 및 성질.
화합물 3의 분자식은 HRESIMS 데이터에서 m/z 261.1461 (C14H22O3Na에 대해 계산됨, 261.1467)에서 나트륨 부가물 이온 피크의 관찰에 따라 C14H22O3인 것으로 결정되었다. 화합물 3의 1H NMR 스펙트럼은 심해 박테리아 바실러스 종으로부터 단리된 에피구아이마솔(epiguaymasol)의 스펙트럼과 거의 동일하였다. 유일한 차이점은 화합물 3의 메톡시 그룹에 해당하는 신호(δH 3.75)의 존재였다. 결국, COSY 및 HMBC 데이터의 분석에 기초하여 화합물 3의 평면 구조가 배치되었다. 상대 구성이 (2R *, 3S *)로 결정된 epiguaymasol {[α]D -7.2 (c 0.17, CHCl3)}의 구체적인 회전은 화합물 3 {[α]D -10.0 (c 0.13, CHCl3)}의 회전과 일치하였다. 또한, 화합물 3의 C-2 및 C-3에 대응하는 화학적 시프트 값은 문헌(Trischman, J.A.; Jensen, P.R.; Fenical, W. Nat. Prod. Lett. 1998, 11, 279-284.)의 epiguaymasol의 값과 일치하였다. 따라서 화합물 3의 상대 구성은 epiguaymasol과 유사할 수 있다는 것이 제안되었다. 화합물 3의 평면 구조는 (+)-guaymasol 의 전체 합성 과정에서 부분입체이성질체 혼합물로서 이전에 설명되었다. 그러나, 본 발명에서는 천연물로서의 epiguaymasol 유사체의 분리를 처음으로 보고하였다. 나머지 3개의 알려진 화합물, (-)-테르나틴, [D-Leu]-테르나틴 및 슈로틴 A의 구조는 또한 NMR 및 MS 데이터의 분석에 의해 설명되었다.
화합물 3은 점성 오일의 형태이다; [α]20 D -10.0 (c 0.13, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ H 7.14 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-2' 및 H-6'), 6.81 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-3' 및 H-5'), 3.75 (3H, s, 4'-OCH3), 3.54 (1H, m, H-2), 3.47 (1H, m, H-3), 2.88 (1H, dd, J = 14.2 및 3.7 Hz, H-1a), 2.53 (1H, dd, J = 14.2 및 8.8 Hz, H-1b), 1.84 (1H, m, H-5), 1.40 (2H, m, H2-4), 0.96 (3H, d, J = 6.8, H3-7), 0.89 (3H, d, J = 6.4, H3-6); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ C 159.6 (C-4'), 132.9 (C-1'), 131.4 (C-2' 및 C-6'), 114.7(C-3' 및 C-5'), 77.9 (C-2), 73.5 (C-3), 55.7 (4'-OCH3), 42.6 (C-4), 39.3 (C-1), 25.6 (C-5), 24.4 (C-7), 21.9 (C-6); HMBC correlations H2-1/C-2, C-3, C-1', C-2', C-6'; H-3/C-2; H2-4/C-2, C-3, C-5, C-6, C-7; H-5/C-3, C-4, C-6, C-7; H3-6/C-4, C-5, C-7; H3-7/C-4, C-5, C-6; H-2' 및 H-6'/C-1, C-4'; H-3' 및 H-5'/C-1, C-4'; 4'-OCH3/C-4'; HRESIMS m/z 261.1461 [M+Na]+ (calcd. for C14H22O3Na, 261.1467).
실시예 7: 글루코오스 배열의 결정.
화합물 2(1.0 mg)를 2M HCl(200μL)에 용해시키고, 스크류-캡핑된 바이알에서 2 시간 동안 90℃에서 가열하였다. 가수분해 후, 반응 혼합물을 2 M NH4OH (220 μL)로 중화시키고, 진공에서 건조시켰다.
화합물 1 (1.0 mg)의 각각의 단당류 또는 산 가수분해물 및 D/L-시스테인 메틸 에스테르(1.O mg)를 피리딘(200 μL)에 용해시키고, 스크류-캡핑된 바이알에서 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 다음으로, 페닐 이소티오시아네이트 (5 μL) 를 혼합물에 첨가하고 1 시간 동안 추가로 가열하였다. 반응 혼합물(5μL)을 HPLC 분석 전에 5 배 더 희석하고 포토다이오드 어레이 검출기로 250nm에서 검출했다. 분석용 HPLC를 50 mM H3PO4 중 25% CH3CN 의 등용매 용리(isocratic elution)로 40분 동안 수행하고, 이어서 Phenomenex Gemini NX-C18 (4.6 Х 250 mm; 5 μm)상에서 0.8 mL/분의 유속으로 90% CH3CN 으로 컬럼을 세척하여 수행하였다. 표준 D-글루코오스 및 L-시스테인 메틸 에스테르로부터 제조된 유도체, 및 표준 L-글루코스 및 L -시스테인 메틸 에스테르로부터 제조된 유도체의 체류 시간(t R)은 각각 38.0 및 36.9분이었다. 화합물 1의 산 가수분해물 및 L-시스테인으로부터 제조된 유도체의 체류 시간은 D-글루코오스의 유도체에 대해 수득된 것과 일치하였다.
실시예 8: 계산 방법.
형태이성질체(conformer) 분포는 Spartan' 14 software (Wave-function, Inc., Irvine, CA, USA)를 갖는 MMFF 힘 필드에 의해 수행되었다. 선택된 형태이성질체에 대한 기하학적 최적화는 DFT [B3LYP functional/6-31+G(d,p) basis set] 레벨에서 수행되었고, ECD 계산은 Gaussian 09 software (Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA)에 의해 ACN에서 CPCM 용매 모델로 TDDFT (CAM-B3LYP/SVP basis set)레벨에서 수행되었다. 계산된 ECD 곡선은 0.3 eV의 반 대역폭을 갖는 SpecDis 1.64 software (University of Wuerzburg, Wuerzburg, Germany)에 의해 시뮬레이션되었다. UV 보정 후 볼츠만 분포를 사용하여 형태이성질체의 ECD 곡선을 가중시켰다.
실시예 9: PTP1B 억제 활성 확인.
본 발명의 화합물의 생물학적 효과를 평가하기 위해, PTP1B 활성에 대한 억제 효과를 조사하였다.
PTP1B(인간, 재조합체)는 ATGen Co., Ltd.(한국, 경기도)로부터 구입하였다. 효소 활성은 50mM Bis-Tris (pH 6.0), 2mM EDTA 및 5mM dithiothreitol (DTT) 중 1 mM p-NPP를 함유하는 반응 혼합물에서 측정하였다. 37.5℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 10N NaOH를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 유도된 p-니트로페놀의 양은 405 nm에서 흡광도의 증가를 측정함으로써 결정되었다. 1 mM p-NPP의 비효소 가수분해를 PTP1B 효소의 부재 하에 수득된 405 nm에서의 흡광도의 증가를 측정함으로써 보정하였다.
p-니트로페놀 포스페이트(pNPP)를 효소 기질로서 사용하는 효소 검정에서, 화합물 1 및 [D-Leu]-테르나틴은 각각 22.8 ± 1.1 μM 및 14.8 ± 0.3 μM의 IC50 값으로 용량-의존적 방식으로 PTP1B 활성을 억제하였다. 한편, 나머지 화합물은 80 μM 수준의 IC50 값에서 12% 내지 44%의 억제율을 나타내었다. 이 분석에서, 우르솔산(IC50 = 3.8 ± 0.5 μM)을 양성 대조군으로서 사용하였다.
다음으로, 본 발명자들은 PTP1B-촉매된 pNPP 가수분해의 동역학적 프로파일에 대한 화합물 1의 효과를 조사하였다. PTP1B를 화합물 1의 부재 또는 존재 하에 상이한 농도의 p-NPP와 함께 인큐베이션하였다. PTP1B 검정과 동일한 방법으로 검정을 수행하고, 전체 속도 곡선을 결정하였다. PTP1B의 Michaelis-Menten 상수(K m) 및 최대 속도(V max)는 Graph Pad Prism® 4 program (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 Lineweaver-Burk 플롯에 의해 결정되었다. 동역학적 분석은 화합물 1의 억제 모드가 경쟁적 모드임을 나타내었는데, 이는 Lineweaver-Burk 플롯이 V max 값을 변화시키지 않으면서 K m 의 증가를 보였기 때문이다(도 2). 이 결과는 화합물 1이 PTP1B 내의 활성 부위에 결합할 수 있음을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
생물자원센터 KCTC14322BP 20200925

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 아크레슈도테린(acrepseudoterin) 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00014

    여기서, 상기 R1 내지 R7은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴임.
  2. 하기 화학식 2로 표시되는 이소코디세폴로사이드 A(isocordycepoloside A) 화합물:
    [화학식 2]
    Figure pat00015

    여기서, 상기 R8 내지 R10은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴임.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물은 남극 유래 진균 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394에서 분리된 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항의 화합물; 제2항의 화합물; 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 항염증, 항암 또는 항당뇨용 약학 조성물:
    [화학식 3]
    Figure pat00016

    여기서, 상기 R11 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴임.
  5. 제4항에 있어서, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 또는 슈로틴(pseurotin) A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 및 슈로틴(pseurotin) A는 단백질 티로신 포스파타제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 효소활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제1항의 화합물; 제2항의 화합물; 및 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 염증, 암 또는 당뇨 개선용 식품.
    [화학식 3]
    Figure pat00017

    여기서, 상기 R11 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴임.
  9. 제8항에 있어서, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 또는 슈로틴(pseurotin) A를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물, (-)-테르나틴(ternatin), [D-Leu]-테르나틴(ternatin) 및 슈로틴(pseurotin) A는 단백질 티로신 포스파타제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 효소활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 식품.
  11. (a) 아크레모늄(Acremonium sp.) SF-7394 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 균주 배양물을 에틸아세테이트(EtOAc)로 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 에틸아세테이트(EtOAc) 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물의 분리방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00018

    [화학식 2]
    Figure pat00019

    [화학식 3]
    Figure pat00020

    여기서, 상기 R1 내지 R13은 각각 독립적으로 H, 직쇄형 또는 분지쇄형의 C1-10 알킬, C1-10 알콕시, C3-10 사이클로알킬, C2-10 알케닐 또는 C6-10 아릴임.
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