CZ283806B6

CZ283806B6 - Wortmannin a jeho analogy pro přípravu farmaceutického prostředku

Info

Publication number: CZ283806B6
Application number: CZ941692A
Authority: CZ
Inventors: Rosanne Bonjouklian; Garth Powis; Chris John Vlahos
Original assignee: Eli Lilly And Company; The Arizona Board Of Regents
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 1998-06-17
Also published as: HU9402128D0; PH30794A; IL110325A0; JPH0753370A; HUT67667A; AU6754094A; AU678831B2; TW287102B; NO942641D0; RU94026082A; CA2128046A1; PL304317A1; CN1111127A; US5378725A; NO942641L; CZ169294A3; EP0635268A1; ZA945103B; KR950002755A

Abstract

Wortmannin a jeho určité analogy jsou inhibitory fosfatidylinositol-3-kinasy a jsou obzvláště užitečné pro přípravu farmaceutických prostředků pro inhibici fosfatidylinositol-3-kinasy v případě savců a pro ošetřování stavů závislých na fosfatidylinositol-3-kinase, zvláště neoplasmů savců. ŕ

Description

Vynález se týká inhibice fosfatidyl inositol-3-kinasy (označované jakožto PI 3-kinasa) v celých buňkách nebo v buňkách po jejich lysy uváděním do styku lysovaných nebo celých buněk se sloučeninou, známou jakožto wortmannin a s jejich analogy. Takových sloučenin se také může selektivně používat k inhibici fosfatidylinositol-3-kinasy v případě savců, zvláště lidí a k ošetřování stavů závislých na fosfatidylinositol-3-kinase, zvláště neoplazem u lidí.

Dosavadní stav techniky

Metabolismus inositolfosfolipidů je pravděpodobně podstatným podílem receptorem zprostředkovávaného signálu transdukční cesty odezvy různých hormonů a růstových faktorů (například Berridge, M.J. a kol., Nátuře, 312, str. 315 až 321, 1984. Nishizuka Y., Science 225, str. 1365 až 1370, 1984).

V této signální cestě dva intracelulámí sekundární mediátory inositol-l,4,5-trifosfát a diacylglycerol se generují hydrolyzou fosfatidyl—4,5-bifosfátu fosfolipazou C. Inositol-l,4,5-trifosfat uvolňuje vápenaté ionty z intracelulámí zásoby vápenatých iontů, což vede k aktivaci kinasy závislé na systému vápenatý iont/calmodulin: diacylglycerol aktivuje proteinkinasu C. Po zlomu se fosfatidylinositol—4,5-bifosfát rychle resyntetizuje postupnou fosforylací fosfatidylinositolu fosfatidylinositol—4-kinasou a fosfatidylinositol-4-fosfatkinasou. Zdá se, že tyto dvě kinasy mají důležitý úkol v produkci sekundárních mediátorů (například Duell, T.F., americký patentový spis číslo 5 001064 (1991), Shibasaki, F. a kol., J. Biol. Chem., 266 (13), str. 8108 až 8114(1991)).

Nejnověji byla identifikována existence jiné fosfatidylinositolkinasy a byla asociována s určitými aktivovanými tyrosinkinasami (Courtneidge, S.A. a kol., Cell, 50, str. 1031 až 1037 (1987), Kaplan, D.R. a kol., Cell 50, str. 1021 až 1029 (1987)). Tyto kinasy, identifikované jakožto fosfatidylinositol-3-kinasy, fosforylují polohu 3 inositolového kruhu fosfatidylinositolu (PI) za vytvoření fosfatidylinositol-3-fosfátu (PI -3P) (Whitman, D. a kol. Nátuře, 332, str. 664 až 646 (1988)).

Kromě fosfatidylinositolu (PI) může tento enzym také fosforylovat fosfatidylinositol-4-fosfat a fosfatidylinositol-4,5-bifosfát za vzniku fosfatidylinositol-3,4-bifosfátu a fosfatidylinositol3,4,5-trifosfátu (PIP₃) (Auger, K.R. a kol. Cell, 57, str. 167 až 175 (1989)).

PI 3-kinasa fyzikálně asociuje s tyrosinkinasami, například jako jsou pp60^v'^src, polyoma střední T/pp60^c'^src, od destiček odvozený růstový faktorový receptor, kolony stimulující faktor-1 receptor a insulinový receptor (například Shibasaki, F. a kol., J.Biol.Chem., 266 (13), str. 8108 až 8114 (1991)), jak shora uvedeno), což naznačuje důležitou, i když dosud nedefinovanou, úlohu v signální transdukci a v jiných příhodách buňky zahrnujících proteintyrosinkinasy, které asociují s aktivní PI 3-kinasou a aktivují ji. PI 3-kinasová aktivita byla také identifikována ve spojení s G-proteinovými receptory v neutrofilech a v destičkách neutrofilů (Traylor-Kaplan, A.E. a kol., Nátuře, 334, str. 353 až 356 (1988) a Mitchell, C.A. a kol. Proč. Nat. Acad. Sci. 87, str. 9396-9400)). Avšak aktivace PI 3-kinasy v neutrofilu probíhá nezávisle na fosforylací tyrosinu (Vlahos, C.J. a kol., FEBS Letters, 309 (3), str. 242 až 248 (1992)).

PI 3-kinasa existuje jakožto těsně asociovaný heterodimer 85 kDa regulátorové subjednotky a 110 kDa katalytické subjednotky a zjistila se v buněčných komplexech s téměř všemi ligandově aktivovanými receptory růstového faktoru a onkofgenními proteinovými tyrosinovými kinasami

-1 CZ 283806 B6 (Cantley, L.C. a kol., Cell 64, str. 281 až 302 (1991)). 85 kDa regulátorová subjednotka zjevně působí jakožto adaptor proteinu k vzájemnému působení s receptory růstového faktoru a s tyrosin fosforylovanými proteiny (Margolis C., Cell Growth Differ. 3, str. 73 až 80 (1992)).

Jakkoliv se PI 3-kinasa jeví jako důležitý enzym při převodu signálu, byl identifikován jen omezený počet sloučenin s inhibiční aktivitou proti PI 3-kinase (Matter, W.F. a kol. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, str. 624 až 631 (1992)). Na rozdíl od selektivní

PI 3-kinasové aktivity sloučenin použitých podle vynálezu bioflavoidní sloučeniny podle Mattera a kol., zvláště quercetin a jeho určité analogy, inhibují PI 3-kinasu a jiné kinasy, například proteinovou kinasu C a PI 4-kinasu (Matter, W.F. a kol. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, str. 624 až 631 (1992), jak shora uvedeno).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití sloučeniny ze souboru zahrnujícího sloučeninu obecného vzorce I

(I) kde znamená R atom vodíku nebo acetoskupinu, sloučeninu vzorce II

-2CZ 283806 B6 a sloučeninu obecného vzorce III

(ΠΙ) kde znamená

R¹ atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu a

R² atom vodíku nebo methylovou skupinu, pro přípravu farmaceutického prostředku inhibujícího fosfatidylinositol-3-kinasu u savců.

Vynález se tudíž týká způsobu inhibice fosfatidylinositol-3-kinasy v lysovaných nebo v celých buňkách wortmanninem nebo určitými analogy wortmanninu.

Vynález se také týká způsobu ošetřování stavů závislých na fosfatidylinositol-3-kinase, zvláště neoplazem u lidí.

Vynález se tudíž týká způsobu inhibice fosfatidylinositol-3-kinasy v lysovaných nebo v celých buňkách uváděním do styku lysovaných nebo v celých buněk se sloučeninou shora uvedeného obecného vzorce I, vzorce II a obecného vzorce III, přičemž jednotlivé symboly mají shora uvedený význam.

Vynález představuje nový způsob inhibice fosfatidylinositol-3-kinasy v případě savců podáváním těmto savcům fosfatidylinositol-3-kinasu inhibujícího množství sloučeniny ze souboru zahrnujícího shora uvedené sloučeniny vzorce I, II a III.

Vynález se dále týká způsobu ošetřování stavů závislých na fosfatidylinositol-3-kinase v případě savců, kteří takové ošetření potřebují, podáváním těmto savcům fosfatidylinositol-3-kinasu inhibujícího množství sloučeniny ze souboru zahrnujícího shora uvedené sloučeniny vzorce I, II ani.

Jak shora uvedeno, týká se vynález způsobu inhibice fosfatidylinositol-3-kinasy v lysovaných nebo v celých buňkách uváděním do styku lysovaných nebo v celých buněk se sloučeninu shora uvedeného obecného vzorce I, vzorce II a obecného vzorce III

kde znamená R atom vodíku nebo acetoxyskupinu,

(Π)

(ΠΙ)

R¹ atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu a

-4CZ 283806 B6

R² atom vodíku nebo methylovou skupinu.

Sloučeniny obecného vzorce I, II a III jsou v oboru známy. V tabulce I se uvádějí triviální názvy výhodných sloučenin, používaných podle vynálezu, přičemž NA znamená nesubstituováno.

Tabulka I

Wortmannin a jeho výhodné analogy

Vzorec	R	R‘	R²	Triviální název
Ia	acetoxy	NA	NA	wortmannin
Ib	H	NA	NA	11-desacetoxywortmannin
II	NA	NA	NA	Δ9,11-dehydrodesacetoxywortmannin
lila	NA	H	H	kyselina wortmanninu s otevřeným A řetězcem
Hlb	NA	methyl	H	methylester wortmanninu s otevřeným

A řetězcem

Biosyntetický způsob přípravy wortmanninu (Ia) je v oboru dobře znám. Zpravidla se připravuje fermentací jakéhokoliv počtu již drive známých mikroorganismů, jako jsou například Talaromyces wortmannin (Nakanishi a kol., J. Biol. Chem., 267 (4), str. 2157 až 2163 (1992)) 15 a Penicillium wortmannini, Myrothecium roridium a Fusarium oxysporum (Abbas a kol., Appl.

Environ. Microbiol., 54 (5), str. 1267 až 1274 (1988)). Po fermentací se wortmannin extrahuje a čistí se o sobě známými způsoby.

S výhodou se wortmannin syntetizuje a izoluje v podstatě čisté formě z fermentační kultury 20 indetifíkované j akožto A24603.1.

Kultura identifikovaná jakožto A24603.1 je uložena v souhlase s Budapešťskou úmluvou a je součástí kolekce zásobních kultur v organizaci Midwest Area Northem Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North 25 University Street, Peoria, Illinois, 61604.

Je zaručeno trvalé uložení této kultury v organizaci Midwest Area Northem Regional Research Center, at Peoria Illinois, a snadná dostupnost pro veřejnost po dobu životnosti patentu v případě, že bude udělen. Kultura je v době existence přihlášky vynálezu dostupná pod 30 označením 37 C.F.R. § 1.14 a 35 U.S.C. § 112. Všechna omezení dostupnosti pro veřejnost budou neodvolatelně odstraněna po udělení patentu.

Wortmannin se produkuje kultivací shora uvedeného A24603.1 kmene za submerzních aerobních podmínek ve vhodném kultivačním prostředí až do získatelného množství produkovaného 35 wortmanninu. Wortmannin se může získat různými způsoby izolace a čištění, jak je pracovníkům v oboru známo.

Prostředí, použité k růstu A24603.1 kultury, může být jakékoliv z četných živných prostředí. Se zřetelem na ekonomii produkce, optimální výtěžky a snadnost izolace produktu je však 40 přednostním zdrojem uhlíku při fermentací ve velkém měřítku glukóza a rozpustný škrob, například kukuřičný škrob. Rovněž se může použít maltózy, ribózy, xylózy, fruktózy, galaktózy, manózy, mannitolu, bramborového dextrinu, methyloleátu, olejů, jako je například sojový olej.

Výhodnými zdroji dusíku jsou enzymem hydrolyzovaný kasein a moučka bavlníkových semen, 45 jakkoliv se také může použít například pepsinizovaného mléka, digerované sojové moučky, rybí

-5CZ 283806 B6 moučky, kukuřičné živné pudy, kvasnicového extraktu, kysele hydrolyzovaného kaseinu a hovězího extraktu.

Jakožto živné anorganické soli, které se mohou včleňovat do kultivačního prostředí, se uvádějí obvyklé rozpustné soli schopné dodávat vápenaté, hořečnaté, sodné, amoniové, chloridové, uhličitanové, sulfátové, nitrátové, zinečnaté a podobné soli.

Esenciální stopové prvky, nutné pro růst a vývoj organismu, se rovněž mohou včleňovat do kultivačního prostředí. Takové stopové prvky se běžně vyskytují jako nečistoty v jiných složkách živného prostředí v dostatečném množství pro požadavky růstu organismu.

Pro produkci podstatného množství wortmanninu je výhodná submerzní aerobní fermentace v míchaném bioreaktoru. Malá množství wortmanninu se mohou získat kultivací v třepací baňce. Pro časovou prodlevu při produkci, spojenou s naočkováním velkého bioreaktoru se sporovou formou organismu, je výhodné používat vegetativního inokula. Vegetativní inokulum se připravuje naočkováním malého objemu kultivačního prostředí sporovou formou nebo myceliovými fragmenty organismu k získání čerstvé, aktivně rostoucí kultury organismu. Vegetativní očkovací prostředí může být totožné s kultivačním prostředím při provozní fermentaci nebo to může být jiné prostředí.

Wortmannin se produkuje organismem A24603.1 při teplotě 23 až 29 °C. Optimální teplotou pro produkci wortmanninu se zdá být teplota kolem 25 °C.

Jako při běžném submerzním aerobním kultivačním procesu se fouká sterilní vzduch do nádoby ode dna, zatímco se prostředí míchá běžnými turbínovými míchadly. Obecně má být rychlost provzdušňování a rychlost míchání dostatečná k udržení koncentrace rozpuštěného kyslíku alespoň 45 % nasycení vzduchem za vnitřního tlaku v nádobě přibližně 0,5 MPa.

Produkce wortmanninu se může sledovat v průběhu fermentace zkoušením PI 3-kinasových extraktů z živné půdy. Systém pro zkoušení 3-kinasy, dále popsaný, je užitečnou zkouškou pro tento účel.

Po produkci se wortmannin může získat z fermentační půdy o sobě známými způsoby. Wortmannin, produkovaný při fermentaci A24603.1 organismu, se vyskytuje hlavně v živné půdě.

Zpravidla se wortmannin může získat z biomasy různými způsoby. Výhodný způsob zahrnuje filtraci veškeré fermentační půdy keramickým filtrem. Filtrát se eluuje organickým rozpouštědlem, jako je například ethylacetát a zkoncentruje se. Koncentrát se suspenduje v alkoholu až do chvíle, kdy začne krystalizace a roztok se zfiltruje, promyje se a vysuší se. Pro ujištění se krystalický materiál rozpustí v organickém rozpouštědle a chromatografuje se na reverzní fázi, kterou je silikagelový absorbent (C₈ nebo C]_g). Frakce se eluují v organickém vodném pufru, jako je například 60% acetonitril.

11-Deacetoxywortmannin (obecného vzorce Ib) je v oboru také znám a stejně jsou v oboru známy způsoby jeho přípravy. Obecně se může připravovat biosynteticky fermentaci kultury Penicillium funiculosum Thom (například Baggolini a kol., Exp. Cell Res., 169, str. 408 až 419, 1987), s výhodou se však připravuje chemicky z wortmanninu způsobem, který popsal Haeflinger a kol., Helv. Chem. Acta 56 (8), str. 2901 až 2904 (1973).

Podobně je v oboru znám způsob přípravy 9,11-dehydrodesacetoxywortmanninu (vzorce Π) a popsal ho Haeflinger a kol., Helv. Chem. Acta 56 (8), str. 2901 až 2904 (1973). Přípravu sloučeniny obecného vzorce ΙΠ popsal MacMillan, J. a kol., J. Chem. Soc. Perkin I, str. 2892 až 2893.

-6CZ 283806 B6

Podle vynálezu se zjistilo, že sloučeniny obecného vzorce I, II a III jsou účinné pro selektivní inhibici fosfatidylinositol—3-kinasy v lysovaných a v celých buňkách. Způsob lze provádět in vitro nebo in vivo a může ho být využito jakožto farmakologického nástroje pro studium 5 například Pl 3-kinasy v mitogenesi, v buněčné proliferaci nebo v buněčné diferenciaci. Tyto sloučeniny obecného vzorce I, II a ΠΙ se také mohou radiově značit (například tritiovat) pro snadnější detekci takových sloučenin v buňkách.

Jestliže se použije sloučenin obecného vzorce I, Π a ΠΙ pro takový způsob, rozpustí se takové sloučeniny v organickém rozpouštědle, jako je například dimethylsulfoxid (DMSO) a zředí se pufrem HEPES (hodnota pH 7,5, obsah 15mM chloridu hořečnatého a 1 nM ethylenglykolbis(P-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraoctové kyseliny (EGTA) na žádanou koncentraci. Získaný prostředek se pak uvede do styku s čištěnou Pl 3-kinasou nebo s buňkou o sobě známým způsobem.

Jakožto jiné provedení vynálezu se uvádí způsob pro inhibici fosfatidylinositoI-3-kinasy v případě savců, zvláště lidí, při kterém se podává takovým savcům fosfatidylinositol-3-kinasu inhibující množství sloučeniny ze souboru zahrnujícího sloučeniny obecného vzorce I, Π a ID.

Jakožto výhodné provedení vynálezu se uvádí způsob pro ošetřování stavů, závislých na fosfatidylinositol-3-kinase, v případě savců, při kterém se podává takovým savcům fosfatidylinositol-3-kinasu inhibující množství sloučeniny ze souboru zahrnujícího sloučeniny obecného vzorce I, Π a ΠΙ. Jakožto stavy, závislé na fosfatidylinositol-3-kinase, se uvádějí biochemické procesy způsobující nemoc, diabetes, zánět, agregaci destiček, vaskulámí nemoce, 25 jako jsou atherosklerosa, restenosis a jako jsou podobné stavy a zvláště abnormální buněčný růst v neoplazmech.

Proto se jakožto obzvláště výhodné provedení vynálezu uvádí způsob ošetřování na fosfatidylinositol-3-kinase závislých neoplazmů, zvláště různých lymphosarcoma, sloučeninami ze 30 souboru zahrnujícího sloučeninu obecného vzorce I, Π a III. Jakožto jiné, na Pl 3-kinase závislé neoplazmy se uvádějí například adenokarcinoma ženského prsu, rakovina střev, rakoviny epidermu hlavy a šíje, leukemie, melanoma, rakoviny vaječníků, myeloma plazmové buňky a rakovina plic. Pro ošetření těchto a jiných neoplazmových stavů, závislých na 3-kinase, je použití wortmanninu výhodné.

Pro terapeutické ošetření specifických indikací se může sloučenina obecného vzorce I, Π a ΠΙ podávat jako taková, nebo se může zpracovávat na farmaceutické prostředky v jednotkové dávkovači formě pro parenterální, transdermální, rektální, nasální nebo intravenozní podání, nebo s výhodou pro orální podání.

Takové farmaceutické prostředky podle vynálezu se připravují o sobě známými způsoby a obsahují alespoň jednu účinnou látku ze souboru zahrnujícího sloučeninu obecného vzorce I, Π a III spolu s farmaceuticky vhodným nosičem. Výrazem účinná látka se zde vždy míní alespoň jedna sloučenina ze souboru zahrnujícího sloučeninu obecného vzorce I, II a III nebo jejich 45 farmaceuticky vhodné soli.

V takových farmaceutických prostředcích se účinná látka označuje jakožto účinná složka. Pro výrobu farmaceutických prostředků se účinná složka podle vynálezu zpravidla mísí s nosiči nebo se ředí nosiči nebo se zapouzdřuje do nosiče, který může mít formu kapsle, sáčku, papírku nebo 50 jiného obalu. Pokud nosič slouží jako ředidlo, může to být pevná, polopevná nebo kapalná látka, která působí jako nosič, excipient nebo prostředí pro účinnou látku. Farmaceutické prostředky mohou proto mít formu tablet, pilulek, prášků, pastilek, sáčků, elixírů, suspenzí, emulzí, roztoků,

-7CZ 283806 B6 sirupů, měkkých a tvrdých želatinových kapslí, sterilních vstřikovatelných roztoků a sterilních balených prášků.

Jakožto příklady vhodných nosičů, excipientů a ředidel se uvádějí laktóza, dextróza, sacharóza, 5 sorbitol, mannitol, škroby, klovatina akacia, fosforečnan vápenatý, algináty, tragakant, želatina, křemičitan vápenatý, mikrokrystalická celulóza, polyvinylpyrrolidon, celulóza, vodný sirup, methylcelulóza, methylhydroxybenzoát a propylhydroxybenzoát, mastek, stearát hořečnatý, voda a minerální olej. Farmaceutické prostředky mohou přídavně obsahovat mazadla, smáčedla, emulgační a suspenzační činidla, konzervační činidla, sladidla nebo chuťové přísady.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou formulovat tak, aby rychle, prodlouženě nebo odložené uvolňovaly účinnou látku po podání nemocnému.

Pro orální podání se sloučeniny mísí s nosiči, ředidly, taví se na tablety nebo zapouzdřují se do 15 želatinových kapslí. Nebo se směsi rozpouštějí v kapalinách, například v 10% vodném roztoku glukózy isotonické solanky, sterilní vodě a podávají se intravenózně nebo vstřikováním.

Prostředky se s výhodou formulují v jednotkové dávkovači formě, přičemž každá dávka obsahuje přibližně 1 až přibližně 500 mg, zpravidla přibližně 5 až přibližně 300 mg účinné látky. Výrazem 20 jednotková dávkovači forma se zde vždy míní fyzikálně oddělená jednotka vhodná pro podání lidem nebo jiným savcům, přičemž každá takové jednotka obsahuje předem stanovené množství účinné látky, vypočtené k dosažení požadovaného účinku, spolu s farmaceuticky vhodným nosičem. Výrazem farmaceuticky vhodný se míní nosič, ředidlo nebo excipient, které jsou kompatibilní s jinými složkami farmaceutického prostředku a nejsou škodlivé uživateli.

Následující příklady farmaceutických prostředků objasňují vynález, nijak jej však neomezují. Výraz účinná látka je shora vysvětlen.

Příklad farmaceutického prostředku 1

Tvrdé želatinové kapsle se připravují z následujících složek:

Množství (mg/kapsle) účinná látka250 škrob, sušený200 stearát hořečnatý10 celkem 460mg

Uvedené složky se smísí a plní se do tvrdých želatinových kapslí v množství 460 mg.

Příklad farmaceutického prostředku 2

Tablety se připravují z následujících složek:

Množství (mg/tableta) účinná látka250 celulóza, mikrokrystalická400,0 oxid křemičitý, sublimovaný10,0 kyselina stearová5,0 celkem 665,0mg

Uvedené složky se smísí a slisují se na tablety vždy o hmotnosti 665 mg.

-8CZ 283806 B6

Příklad farmaceutického prostředku 3

Aerosolový roztok se připravuje z následujících složek:

Množství (mg) účinná látka0,25 ethanol29,75 hnací prostředek 22 (chlordifluormethan)70,00 celkem 100,00mg

Účinná látka se smísí s ethanolem. Směs se vnese do části hnacího prostředku 22, ochladí se na teplotu -30 °C a převede se do plnicího zařízení. Požadované množství se pak vnese do obalu z nerezavějící oceli se zbytkem hnacího prostředku. Nádobka se pak vybaví ventilem.

Příklad farmaceutického prostředku 4

Tablety, obsahující vždy 60 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

Množství (mg/tableta) účinná látka60,0 škrob45,0 celulóza, mikrokrystalická35,0 polyvinylpyrrolidon (10% roztok ve vodě)4,0 natriumkarboxymethylovaný škrob4,5 stearát hořečnatý0,5 mastek1,0 celkem150,0

Účinná látka, škrob a celulóza se vedou sítem No.45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a důkladně se promísí. Se získaným práškem se smísí roztok polyvinylpyrrolidonu a směs se vede sítem No.14 mesh U.S. (průměr ok 1400 mikrometrů). Takto získané granule se suší při teplotě 50 °C a vedou sítem No.18 mesh U.S. (průměr ok 1000 mikrometrů). Natriumkarboxymethylovaný škrob, stearát hořečnatý a mastek se vedou sítem No.60 mesh U.S. (průměr ok 250 mikrometrů), přidají se do granulí, promísí se a směs se lisuje na tablety vždy o hmotnosti 150 mg.

Příklad farmaceutického prostředku 5

Kapsle, obsahující vždy 80 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

Množství (mg/kapsle) účinná látka80,0 škrob59,0 mikrokrystalická celulóza59,0 stearát hořečnatý1,0 celkem200,0

Účinná látka, celulóza, škrob a stearát hořečnatý se smísí, vedou se sítem No.40 mesh U.S. (průměr ok 425 mikrometrů) a plní se do tvrdých želatinových kapslí v množství vždy 200 mg.

-9CZ 283806 B6

Příklad farmaceutického prostředku 6

Čípky, obsahující vždy 225 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

účinná látka glyceridy nasycených mastných kyselin do

Množství (mg) 225,0 2000,0

Účinná látka se vede sítem No.60 mesh U.S. (průměr ok 250 mikrometrů) a suspenduje se v glyceridech nasycených mastných kyselin, předem roztavených za použití minimálně nutného tepla. Směs se lije do formy na čípky o nominální kapacitě 2,0 g a nechá se ochladit.

Příklad farmaceutického prostředku 7

Suspenze, obsahující vždy 50 mg účinné látky v 5,0 ml, se připravuje z následujících složek:

účinná látka 50,00mg natriumkarboxymethylcelulóza 50,00mg sirup 1,25mg roztok benzoové kyseliny 0,10 ml chuťová přísadaq.v.

barvivoq.v.

čištěná voda do 5,0 ml

Účinná látka se vede sítem No.45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů a smísí se s natriumkarboxymethylcelulózou a se sirupem za získání hladké pasty. Přidá se za míchání roztok kyseliny benzoové, chuťové přísady a barviva, smísený s trochou vody. Pak se přidá dostatečné množství vody k dosažení požadovaného objemu.

Příklad farmaceutického prostředku 8

Farmaceutický prostředek pro intravenozní podání se připravuje z následujících složek:

účinná látka 250,0 mg isotonická solanka 1000,0 mg

Sloučeniny obecného vzorce I, Π a ΙΠ jsou účinné proti stavům, závislým na PI3-kinase v širokém rozmezí dávek. Například je denní dávka účinné látky přibližně 0,1 až přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti. Při ošetřování dospělých jedinců je výhodná dávka přibližně 5 až 25 mg/kg ve formě jedné nebo několika dávek. Určitou dávku podávané sloučeniny obecného vzorce I stanovuje ostatně lékař se zřetelem na okolnosti ošetřovaného případu, jako jsou určitá podávaná sloučenina, cesta podání, ošetřovaný stav, věk, hmotnost a odezva jednotlivého ošetřovaného jedince a podobné skutečnosti.

Sloučeniny obecného vzorce I, II a III vykazují selektivní účinnost proti PI 3-kinase. Tuto aktivitu dokládají následující testy.

Č ištění fosfatidylinositol-3-kinasy

PI 3-kinasa se může připravovat četnými způsoby. Podle jednoho způsobu se PI 3-kinasa připravuje z buněk Swis 3T3 od organizace Američan Type Culture Collection, Rockville, MD.

-10CZ 283806 B6

Před čištěním PI 3-kinasy se buňky udržují ve formě kultury v živném prostředí Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) doplněném 10% zárodečného telecího séra a pasažované za použití 0,25% trypsinu a 0,02% ehylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA). Promyje se 24 x 10⁶ buněk na čtyřech 100 mm kultivačních destičkách 10 ml Hanksova vyváženého solného roztoku (HBSS, Sigma) o hodnotě pH 7,4 a buňky se ponechají v DMEM bez zárodečného telecího séra po dobu jedné hodiny před stimulací po dobu 15 minut 100 ng/ml rekombinantního lidského BB homodimeru od destiček odvozeného růstového faktoru (PDGF, Genzyme, Cambridge, MA). Prostředí se odpaří a buňky se promyjí 10 ml HBSS před lysí 3 ml roztoku 137 mM chloridu sodného, 20 mM Tris (hodnota pH 8,0) obsahujícím 1 mM chloridu hořečnatého, 10 % glycerolu, 1 % Tritonu X-100 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA). 2 pg/ml leupeptinu, 2 μg/ml aprotoninu, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) a 1 mM ortovanadátu sodného. Buňky se seškrábnou od povrchu misky a odstřeďují se při 6000 g po dobu 10 minut. Supematant se smísí s 50 μΐ kuliček IgG2bk antifosfotyrosinové protilátky (Upstate Biotechnology lne., Lake Placid, NY) v 1,5 ml zkumavkách. Zkumavky se uzavřou a rotují po dobu dvou hodin při teplotě 4 °C a kuličky se dvakrát promyjí 1 ml HBSS obsahujícím 2 pg/mí leupeptinu, 4 pg/ml aprotoninu, 1 mM PMSF, 200 μΜ adenosinu a 1 mM ortovanadátu sodného. Tyrosinem fosforylovaná PI 3-kinasa se eluuje z kuliček použitím 200 μΐ/zkumavku 10 mM Tris (hodnota pH 7,5), 2 M chloridu sodného, 1 mM ethlyendiamintetraoctové kyseliny, 200 μΜ adenosinu a 10 mM fenylfosfonátu sodného.

Podle jiného výhodného způsobu se PI 3-kinasa připravuje z hovězího mozku. Dva hovězí mozky (mokrá hmotnost přibližně 900 g) se získají z místních jatek v průběhu minut porážky, zabalí se do ledu a homogenizují se v průběhu jedné hodiny. Mozky se zbaví odříznutím nadbytečného tuku a krevních cév a homogenizují se za použití jednotky Tekmar Tissuemizer (Cincinnati, OH) při teplotě 4 °C ve 20 mM Tris (hodnota pH 8,3) obsahujícím 250 mM sacharózy, 6 mM β-merkaptoethanolu, 1 pg/ml leupeptinu, 1 pg/ml pepstatinu A, 0,4 mM PMSF a 1 mM chloridu hořečnatého.

Po odstřeďování po dobu 60 minut při lOOOOxg se hodnota pH supematantu (přibližně 1200 ml) sníží na 5,75 přidáváním po kapkách 1M kyseliny octové při teplotě 4 °C. Po míchání po dobu dalších 15 minut při teplotě 4 °C se roztok odstřeďuje po dobu 60 minut při 13 500 x g. Supematant se vyhodí. Pelety se resuspendují v pufru A (20 mM Tris, hodnota pH 8,3, obsahujícím 6 mM β-merkaptoethanolu, 0,1 mM ethylenglykol-bis(p-aminoethylether)-N,N,N',N'tetraoctové kyseliny (EGTA), 1 pg/ml leupeptinu, 1 pg/ml pepstatinu A a 1 mM chloridu hořečnatého, a vnesou se na kolonu Q Sepharose s rychlým průtokem (300 ml) při rychlosti toku ml/min při teplotě 4 °C. Po nanesení se kolona vymyje třemi objemy pufru A obsahujícího 0,1 M chloridu draselného a kinasu a pak se eluuje lineárním gradientem pufr A/0,1 M chlorid draselný až pufr A/0,6 M chlorid draselný rychlostí 3 ml/min 7 objemy.

Frakce se zkoušejí na aktivitu PI 3-kinasy za použití 10 μΐ frakce a fosfatidylinositolu jakožto substrátu, jak bude popsáno. PI 4-kinasa eluuje ve zlomu: PI 3-kinasa eluuje při přibližně 0,3 M chloridu draselného. Shromážděná PI 3-kinasa se podrobuje srážení 40% síranem amonným. Po odstředění (60 minut při 13 500 xg) se pelety resuspendují v pufru B (10 mM fosforečnanu draselného, hodnota pH 7,4, obsahujícího 6 mM β-merkaptoethanolu, 1 pg/ml leupeptinu, 1 pg/ml pepstatinu A a 1 mM chloridu hořečnatého a vnesou se na 50 ml hydroxylapatitového sloupce (Calbiochem, lne., La Jolla, CA) rychlostí 2,5 ml/min. Sloupec se promývá 150 ml pufru B až A₂8o dosáhne nuly a kinasa se pak eluuje lineárním gradientem 10 až 320 mM dihydrogenkaliumfosfatu rychlostí 1 ml/min po dobu 450 minut.

Aktivní frakce se shromáždí a vnesou se rychlostí 3 ml/min na sloupec Monos (8 ml) (Pharmacia, lne., Piscataway, NJ) vyvážený v pufru C (50 mM MES, hodnota pH 6,2, obsahující mM β-merkaptoethanolu, 1 pg/ml 0,1 mM ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N’

-11CZ 283806 B6 tetraoctové kyseliny (EGTA), 1 gg/ml leupeptinu, 1 pg/ml pepstatinu A a 1 mM chloridu hořečnatého). PI 3-kinasa se pak eluuje lineárním gradientem 0 až 0,4 M chloridu draselného v pufru C po dobu 120 minut. Při zkoušce frakcí se rutinním způsobem zjišťuje aktivita PI 3— kinasy ve dvou podílech. Celková aktivita se zjišťuje při průtoku, přičemž se 20 % aktivity eluuje v gradientu. Jakkoliv produkt v gradientu má značnou aktivitu PI 4-kinasy, v podstatě žádná aktivita PI 4-kinasy se nespojuje s PI 3-kinasou, eluovanou při průtoku. Proto se MonoS průtok koncentruje tangenciální tokovou filtrací na membráně Mini-Ultrasette Omega 50 K (Filtron, lne., Northborough, MA) a zředí se v pufru C na nižší vodivost. Produkt se pak znovu vnese na sloupec MonoS za shora uvedených podmínek. PI 3-kinasa, vázaná na sloupec v průběhu promývání, se eluuje v gradientu. Dva soubory fosfatidylinositolkinasové aktivity se získají v gradientu. Každý se zkouší na PI 3-kinasovou a PI 4-kinasovou aktivitu. Podle zjištění obsahuje soubor I 95 % PI 3-kinasovou aktivitu (a 5 % PI 4-kinasy), zatímco soubor II obsahuje převážně 4-kinasovou aktivitu.

Soubor I ze sloupce MonoS se zředí pufrem A a chromatografuje se na MonoQ (1 ml) a eluuje se gradientem 0 až 0,4 M chloridu draselného v pufru A. Konečný soubor se zkouší na PI 3kinasovou a PI 4-kinasovou aktivitu. Zjištěno, že konečný soubor obsahuje více než 99 % PI 3kinasové aktivity.

Zkouška čištěné PI 3-kinasové aktivity

PI 3-kinasová aktivita se měří dříve popsaným způsobem (Matter a kol., Biochemical and Biophysical Research Communications, 186, str. 624 až 632, 1992). Inhibitory se nejdříve rozpustí v dimethylsulfoxidu a zředí se desetkrát 50 mM pufru HEPES, hodnota pH 7,5 obsahujícím 1 mM ethylenglykol-bis(p-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraoctové kyseliny (EGTA) a 15 mM chloridu hořečnatého. Inkubuje se 10 μΐ tohoto roztoku čištěnou PI 3-kinasou z hovězího mozku (9 μΐ) a fosfatidylinositolem (5 μΐ 2 mg/ml zásobního roztoku v 50 mM pufru HEPES, hodnota pH 7,5 obsahujícího 1 mM ethylenglykol-bis((3-aminoethylether)-N,N,Ν',Ν’tetraoctové kyseliny (EGTA)). Konečná reakční směs, obsahuje 0,1 až 5 ng/ml inhibitoru a 3 % (objem/objem) dimethylsulfoxidu. Tato koncentrace dimethylsulfoxidu nemá žádného vlivu na PI 3-kinasovou aktivitu. Kontrolní reakční směsi obsahují 3 % dimethylsulfoxidu (objem/objem) bez inhibitoru. Reakční směsi se předinkubují po dobu 10 minut při teplotě okolí a nastartuje se enzymová reakce po přidání 1 μΐ [gama’³²P]ATP (2 mCi/ml, 500 μΜ zásobního roztoku, 0,08 mCi/ml, 20 μΜ konečná koncentrace: DuPont, New England Nuclear, Boston, MA). Reakce se nechává probíhat po dobu 10 minut při teplotě okolí za častého míchání, načež se reakce ukončí přidáním 40 μΐ IN kyseliny chlorovodíkové. Lipidy se extrahují přidáním 40 μΐ systému chloroform/methanol (objem/objem). Vzorky se promísí a odstředí, nižší organická fáze se vnese na silikagelovou destičku pro chromatografii v tenké vrstvě (EM Science, Gibbstown, NJ) a vyvíjí se v systému chloroform/methanol/voda/hydroxid amonný (45:35: 8,5 : 1,5, objem/objem). Destičky se usuší a kinasová reakce se zviditelní autoradiografií. Fosfatidylinositol-3-monofosfátová oblast se seškrábne z destičky a kvantitativně se hodnotí kapalinovou scintilační spektroskopií za použití zařízení ReadyProtein (Beckamn Instruments, lne., Fullerton, CA). Úroveň inhibice pro wortmannin a jeho analogy se stanovuje jakožto procento [³²P] počtů za minutu ve srovnání s kontrolou.

Nebo se produkty reakce PI 3-kinasy potvrzují HPLC chromatografií, způsobem, který popsal Whitman M., Nátuře 332, str. 644 až 646 (1988). Fosfolipidy se deacylují v methylaminovém reakčním činidle a oddělují se za použití anexového sloupce Whatman Pertisphere SAX způsobem, který popsal Auger K.R. Cell, 57, str. 167 až 175 (1989). Používá se detektoru radioaktivity Radiomatic Model A-140 Flo-One/Beta k monitorování deacylovaných [³²P] enzymových produktů. Jakožto vnitřní standard se přidává deacylovaný [³H]PI 4-monofosfat.

-12CZ 283806 B6

Inhibiční efekt wortmanninu a jeho analogů na čištěnou PI 3-kinasu z hovězího mozku se uvádí v tabulce II.

Tabulka II

Inhibice fosfatidylinositol-3-kinasy hovězího mozku wortmanninem a analogy wortmanninu

Sloučenina vzorce

IC₅₀ (ng/ml) la Ib Π ΠΙ

1,8 (4,2 nM)

6,2(16,7 nM) 20,0 (59,0 nM)

1500,0(4,6 μΜ)

Kromě toho wortmannin a wortmanninové analogy, použité podle vynálezu, nemají žádný vliv na PI 4-kinasu, fosfolipasu C, c-src proteinovou tyrosinovou kinasu nebo na proteinovou kinasu C a mají až stonásobně větší účinnost než je drive popsaná účinnost jakožto inhibitoru myosinové kinasy s lehkým řetězcem (například Nakanishi S. a kol., J. Biol. Chem. 267 (4), str. 2157 až 2163, 1992). Proto jsou wortmannin a jeho analogy potentními, vysoce selektivními inhibitory PI 3-kinasy.

Zkouška celých buněk se zřetelem na 3-kinasovou aktivitu

Vyselektují se v-sis NIH 3T3 buňky (National Cancer Institute, Bethesda, MD) pro měření fosfatidylinositol-3-fosfatových hladin, jelikož je o nich známo, že vykazují konstitutivní a destičkami stimulovanou od růstového faktoru odvozenou PI 3-kinasovou aktivitu. Buňky v-sis NIH 3T3 v logaritmickém růstu v 75 cm³ kultivační baňce na dvě hodiny v DMEM bez zárodečného telecího séra. Buňky se promyjí fosfátu prostým DMEM a inkubují se v témže prostředí, obsahujícím 0,1 % mastné kyseliny prostého hovězího séra, albumin a 0,15mCi/ml [³²Ρ]Η₃ΡΟ₄ (ICN Biomedicals, Irvine, CA) po dobu 70 minut. Inhibitorové kandidáty se připraví shora popsaným způsobem a uvedou se do styku s buňkami na 10 minut před stimulací. Buňky se stimulují 100 ng/ml PDGF po dobu 10 minut. K měření fosfatidylinositol-3-fosfatů v buňkách se prostředí odstraní a buňky se promyjí jednou fosfátem pufrovanou solankou před vnesením 4 ml/baňka systému kyselina chlorovodíková/methanol (objemově 1:1). Buňky se vyškrábnou z baňky a veškeré lipidy se extrahují způsobem, který popsal Folch J. a kol., J. Biol. Chem. 226, str. 497 až 509, (1957). Připraví se deacylované lipidy za použití methylaminu, způsobem, který popsal Clark N.G. a kol., Biochem. J., 195, str. 301 až 306 (1981) a oddělí se chromatografií HPLC za použití 10 cm RAC II Partisil 5 SAX sloupce (Whatman, Kent, U.K.) za eluování amoniumdihydrogenfosfátovým gradientem při průtoku 0,8 ml/min způsobem, který popsal Auger K.R. a kol., Methods in Inositide Research (způsoby výzkumu inositidu), str. 159 až 166, Irvine, R.F., Ed., Raven Press, Ltd., New York, NY (1980). Detekce elučních píků se provádí radioaktivním průtokovým detektorem (Flo-One Beta, Model A515, Radiomatic Instruments, Meriden, CT). Jakožto referenčních sloučenin se používá deacyl[³²P]fosfatidylinositol-3,4,5trifosfatu.

Jakkoliv je inhibice čištěné PI 3-kinasy podstatně větší než inhibice PI 3-kinasy v celých buňkách, wortmannin při 1,3 μΜ vykazuje v podstatě úplnou inhibici vytváření fosfatidylinositol-3-fosfátu v celých buňkách stimulovaného růstovým faktorem odvozeným od destiček.

Následující příklady vynález blíže objasňují avšak nijak ho neomezují.

-13CZ 283806 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 fermentace kultury A 24603.1

A. Třepačka

Kultura A 24603.1 buď ve formě lyofilizovaných pelet, nebo jakožto suspenze udržovaná v kapalném dusíku se použije k naočkování vegetativního prostředí následujícího složení:

Vegetativní prostředí

Složka	Množství (g/1)
glukóza glycerol moučka bavlníkových semen³	10,0 10,0 25,0

nenastavená hodnota pH je 6,3, nenastaveno ^a moučka PROFLO (Traders Protein, Memphis, TN)

Naočkované vegetativní prostředí se inkubuje v Erlenmeyerově baňce s širokým hrdlem o obsahu 250 ml při teplotě 25 °C po dobu přibližně 72 hodin na třepačce obíhající v kruhu 5,08 cm počtem otáček 250/min.

B. Fermentace kultury A 24603.1 ve velké nádobě

K získání většího objemu inokula se použije 10 ml prostředí inkubovaného v třepací baňce, připraveného podle odstavce A, k naočkování 400 ml druhého stadia vegetačního prostředí o stejném složení, jako je uvedeno v odstavci A. Prostředí druhého stadia se inkubuje v Erlenmeyerově baňce s širokým hrdlem o obsahu dvou litrů při teplotě 25 °C po dobu přibližně 23 hodin na třepačce obíhající v kruhu 5,08 cm počtem otáček 250/min.

Tohoto prostředí, označovaného jako druhé stadium (400 ml), se použije k naočkování 115 litrů sterilního prostředí následujícího složení:

Produkční prostředí

Složka

Množství (g/1) glukóza25,0 kukuřičný škrob10,0

Lexein10,0 enzymem hydrolyzovaný kasein4,0 hroznová melasa5,0 síran hořečnatý (bezvodý)5,0 uhličitan vápenatý2,0 deionizovaná voda q.s. do 115,0 litrů nenastavená hodnota pH je 6,8, nenastaveno přidáno protipěnicí činidlo SAG 47 l^b (0,2 g/1) ^a NT Amin A (Cheffield Chemical Co., Norvich, NY) ^b SAG 471 (Union Carbide, Sistersville, WV)

-14CZ 283806 B6

Inoku lační produkční prostředí se nechává fermentovat v míchané fermentační nádobě o obsahu 115 litrů po dobu 4 až 5 dnů při teplotě přibližně 25 °C. Koncentrace rozpuštěného kyslíku je přibližně 45% nasycení vzduchem v míchané nádobě za nízkého počtu otáček (180 až 3300/min).

Příklad 2

Izolace a čištění wotmanninem

Fermentační půda podle příkladu 1 se zfiltruje keramickým filtrem (Membralox Systems, Illinois Water Treatment, Rockford, IL) za získání 175 litrů filtrátu obsahujícího wortmannin. Hodnota pH filtrátu se nastaví na přibližně 3,95N kyselinou chlorovodíkovou. Filtrát se pak eluuje třikrát polovičními objemy ethylacetátu, čímž se získá spojený objem 207 litrů, který se zkoncentruje ve vakuu na 6 litrů.

Ethylacetátový koncentrát o objemu 6 litrů se dále koncentruje ve vakuu za získání tmavo hnědého viskozního oleje, do kterého se přidá 500 ml methanolu. Směsí se krouží až do ukončení krystalizace, směs se zfiltruje, produkt se krátce promyje studeným methanolem a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 20,4 g wortmanninu.

Methanolový supematant se opět zkoncentruje ve vakuu za získání viskozního oleje, produkt se rozpustí ve 180 ml chloroformu a nanese se na sloupec 12 x 12 cm oxidu křemičitého Woelm Grade 62 v chloroformu. Ve vakuu se zkoncentruje 5,0 1 chloroformovaného roztoku za získání tmavo hnědého oleje, který se rozpustí ve 250 ml teplého methanolu. Získané krystaly se oddělí po 18 hodinách filtrací, čímž se získá 4,2 g wortmanninu. Krystalizace se opakuje se zbylým supematantem, čímž se získá dalších 1,9 g wortmanninu. Identita wortmanninu je potvrzena chromatografií HPLC.

Průmyslová využitelnost

Wortmannin a jeho určité analogy jsou inhibitory fosfatidylinositol-3-kinasy a jsou obzvláště užitečné pro inhibici fosfatidylinositol-3-kinasy v případě savců a pro ošetřování stavů, závislých na fosfatidylinositol-3-kinase, zvláště neoplazmů savců.

Claims

1. Použití wortmanninu a jeho analogů ze souboru zahrnujícího sloučeninu obecného vzorce I

O) kde znamená R atom vodíku nebo acetoxyskupinu, sloučeninu vzorce Π

15 (Π) a sloučeninu obecného vzorce ΙΠ

-16CZ 283806 B6 (ΠΙ) kde znamená

R¹ atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu a

2. Použití podle nároku 1 sloučeniny obecného vzorce I (D kde znamená R atom vodíku nebo acetoxyskupinu, pro přípravu farmaceutického prostředku inhibujícího fosfatidylinositol-3-kinasu u savců.

3. Použití podle nároku 2 sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená R acetoxyskupinu, pro přípravu farmaceutického prostředku inhibujícího fosfatidylinositol-3-kinasu u savců.

-17CZ 283806 B6

4. Použití sloučeniny ze souboru zahrnujícího sloučeninu obecného vzorce I (0 kde znamená R atom vodíku nebo acetoxyskupinu, sloučeninu vzorce Π a sloučeninu obecného vzorce ΙΠ

-18CZ 283806 B6 (ΠΙ) kde znamená

R¹ atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu a

R² atom vodíku nebo methylovou skupinu,

10 pro přípravu farmaceutického prostředku pro ošetřování stavů závisejících na fosfatidylinositol3-kinase v případě savců.

5. Použití podle nároku 4 sloučenin obecného vzorce I, Π a ΓΠ pro přípravu farmaceutického

15 prostředku pro ošetřování stavu závisejícího na fosfatidylinositol-3-kinase v případě savců, kterým je neoplazma.

6. Použití podle nároku 5 sloučeniny obecného vzorce I (I) kde znamená R atom vodíku nebo acetoxyskupinu,

-19CZ 283806 B6 pro popravu farmaceutického prostředku pro ošetřování stavu závisejícího na fosfatidylinositol3-kinase v případě savců, kterým je neoplazma.

7. Použití podle nároku 6 sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená R acetoxyskupinu, pro přípravu farmaceutického prostředku pro ošetřování stavu závisejícího na fosfatidylinositol—3— kinase v případě savců, kterým je neoplazma.

8. Použití podle nároku 4 sloučeniny vzorce Π

O (Π) pro přípravu farmaceutického prostředku pro ošetřování stavu závisejícího na fosfatidylinositol3-kinase v případě savců, kterým je neoplazma.

Konec dokumentu