CN103860529B - 金色灰绿曲霉素类化合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体地说涉及金色灰绿曲霉素类化合物在制备预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的相关疾病的药物中的应用，尤其是在制备治疗肥胖、糖尿病、肿瘤等疾病药物中的应用；它为临床用药提供了更多的选择。

Description

金色灰绿曲霉素类化合物的用途

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体地说涉及金色灰绿曲霉素类化合物的医药新用途。

背景技术

蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein-tyrosine phosphatase，PTP)是一类信号传导酶，它们通过调节细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化水平来控制细胞的成长、分化、代谢；细胞迁移、基因转录、离子通道开闭、免疫反应、细胞凋亡以及成骨发育也受到调控。蛋白质酪氨酸磷酸酶的紊乱可导致多种疾病，如癌症、糖尿病、肥胖症和骨质疏松症[Desai, et al. 1996, Cell, 84: 599-609; Kishihara , et al. 1993, Cell, 74: 143-156; Hardy S, et al. Anticancer Agents Med Chem, 2012 Jan; 12(1): 4-18]。

蛋白质酪氨酸磷酸酶是一个大家族，主要分为跨膜受体型（如CD45和LAR等）和胞内非受体型（如PTP1B、SHP2等）两种。目前的研究结果证明其中PTP1B、SHP2以及LAR与胰岛素信号通路关系和肿瘤的发生发展最为密切相关。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(Protein tyrosine Phosphatase 1B，PTP1B)属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，是在体内广泛表达的胞内蛋白质酪氨酸磷酸酶，由PTPN1基因编码（Brown-Shimer S., et al. Proc Nat Acad Sci,1990, 87: 5148-5152）。蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2[Src homology 2 (SH2) domain containing phosphotyrosine phosphatase 2, SHP2] 是一种由PTPN11基因编码，细胞质内广泛表达的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2分子结构包括N端两个Src同源区、中部一个酪氨酸磷酸(酯)酶活性区域、C端一个包含多个酪氨酸磷酸化位点及一个富含脯氨酸Motif尾巴的区域[Neel B.G., et al. Trends Biochem Sci, 2003, 28(6): 284-293]。

胰岛素（Insulin）通过与胰岛素受体（Insulin receptor，IR）的α亚基结合，激活受体胞内β亚基内在的酪氨酸激酶活性，从而导致酪氨酸参加自身的磷酸化。而被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate，IRS），从而将胰岛素信号传递下去。胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号通路的阻断或减弱。研究发现PTP1B通过对胰岛素受体激酶（insulin receptor kinase，IRK)或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号传导进行负调节。PTPlB通过无催化活性的C-末端结构域与内质网相连，与其他PTPase相比，有更高的去IRβ和IRS磷酸化活性，从而抑制IRS和PI3K的P85亚基复合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰岛素诱导的糖原合成被抑制，因此，PTPlB可在胰岛素信号级联中的多个位点发挥负调控作用。过度表达PTPlB能增加胰岛素受体脱磷酸化、下调受体后信号；相反，抑制受体-PTPlB结合、PTPlB的定点突变以及给与抑制性抗体的实验方法均可增强胰岛素信号[Elchebly M., et al. Science, 1999, 283: 1544-1548] 。

更重要的研究证明，PTP1B基因敲除小鼠的基础代谢水平和总体能量消耗升高，体重减轻，胰岛素敏感性增强[Klaman L.D., et al. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20(15): 5479-5489]。Tonks等[Tonks N.K., et al. Mol Cell Biol, 1990, 10: 458-463]的实验表明，给爪蟾卵显微注射PTPlB阻断了胰岛素的作用。最近的基因敲除小鼠模型的研究已充分证明了PTPlB是胰岛素作用的特异性调控子。PTPlB可影响体重和能量消耗的调节。Elchebly等报道，PTP1B基因敲除鼠在表型上是健康的，同时有较低的空腹血胰岛素和血糖水平、在胰岛素耐量实验中血糖明显下降等胰岛素敏感性增加的表现，且这种增敏效应具有组织特异性，它可增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，但对脂肪组织无明显影响。更加令人振奋的是，敲除鼠在高脂饮食喂养时不会出现肥胖或体重增加，也不发生IR的加重[Elchebly M., et al. Science 1999, 283:1544-1548]。这一研究结果提出了一个可能性：抑制PTPlB能有效的解决代谢综合征的两个主要问题，糖耐量减低和肥胖，PTPlB是研究开发抗糖尿病药物的一个重要的新靶点。

另外，最新的研究结果表明，PTP1B可以通过对p62DOK的脱磷酸化激活Ras-ERK、Src激酶和Ras/Erk途径的癌症的发生和发展途径，从而在癌症，特别在乳腺癌、肺癌和结肠癌等癌症的发生、发展中起重要作用（Dube N, et al. Proc Natl Acad Sci, 2004, 101: 1834-1839; Bentires-Alj M, et al. Cancer Res, 2007, 67: 2420-2424; Zhu S., et al., Cancer Res, 2007, 67: 10129-10137）。越来越多的证据表明：PTP1B在调节胰岛素敏感性、能量代谢以及癌症的发生发展过程中均起着重要作用。

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2参与多种细胞内讯息传递如MAP kinase、Jak-Stat及PI3 kinase等途径，在胰岛素增敏、细胞的增殖及分化等过程扮演重要的角色，所以不仅是个糖尿病的药物靶点，也被确定为一个原癌基因，是抗肿瘤的药物靶点。[Neel B.G., et al. Trends Biochem Sci, 2003, 28(6): 284-293; Cunnick J.M., et al. J Biol Chem, 2002, 277(11): 9498-9504; Rebecca J.C., Gen S.F., Blood, 2008, 109(3): 862-867]。

白细胞共同抗原相关蛋白(leukocyte antigen-related protein，LAR)属于受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)，它具有广泛的组织分布。LAR参与不同种细胞的多种信号通路，它的功能主要有以下三个方面：(1)细胞与细胞间的粘着与通讯；(2)细胞与胞外基质的通讯，例如粘着斑等；(3)胰岛素受体信号通路 [Ozawa, M. et al., J Biol Chem., 1998, 273 , 6166-6170; Vleminckx, K. and Kemler, R., Bioessays, 1999, 21, 211-220; Kornberg, L. et al., J Biol Chem, 1992, 267, 23439-23442]。在胞间信号通路中，LAR主要是通过与B-连环蛋白结合，抑制EGFR或erbB2依赖的酪氨酸磷酸化，从而保持细胞间的通讯连接。在进行人类乳腺癌的免疫组化研究中发现，大量表达erbB2/neu的癌症中46％都同时有LAR的表达。将erbB2/neu基因的跨膜区点突变使其编码蛋白酪氨酸激酶活性增强，再将突变基因转染正常人类乳腺上皮细胞，种植上皮细胞的裸鼠体内形成癌症，同时发现LAR和PTP1B表达水平升高，说明LAR表达与癌症有着密切的关系[Kulas, D. T., et al. J Biol Chem, 1996, 271, 748-754]。

细胞水平的实验证明了LAR具有调节胰岛素受体信号通路的作用。通过反义RNA技术将肝细胞LAR表达抑制60％，胰岛素受体数量和体外活性不变，体内胰岛素受体自磷酸化水平、胰岛素依赖性的MAP激酶活性和三磷酸磷脂酰肌醇活性都提高了3倍；同时，胰岛素受体去磷酸化速度降低了2.6倍。Zhang等实验证明，全长LAR表达水平提高6倍，则胰岛素受体的自磷酸化水平和胰岛素受体底物磷酸化水平降低了30％～50％[Zhang, et al. Mol Endocrinol, 1996, 10, 575- 584; Calera M. R. J., et al. Biol Chem, 2000, 275, 6308-6312]。Zabolotny等建立转基因动物模型，使小鼠肌肉组织LAR表达量与抗胰岛素小鼠相当，发现禁食后体内胰岛素水平升高了2.5倍，葡萄糖水平正常，而肌肉组织葡萄糖摄取降低了39％～50％，肌肉组织中和IRS-l、IRS-2相关的PI3激酶活性以及P85亚基与P110的结合水平下降，肌肉组织出现了抗胰岛素的现象。Skarnes等利用LAR剔除小鼠研究体内LAR的功能，发现LAR缺陷的禁食小鼠体内胰岛素和葡萄糖水平下降，肝糖元转化为葡萄糖的量减少。大量的实验结果表明，LAR能够负向调节胰岛素信号通路；抑制LAR可能有效改善胰岛素抵抗的作用，提高Ⅱ型糖尿病病人对胰岛素的敏感性，为LAR作为潜在的Ⅱ型糖尿病抑制剂靶点提供了更具有说服力的证据 [Zabolotny, J. M., Proc Natl Acad Sci, 2001, 98: 5187- 5192]。

巨噬细胞蛋白酪氨酸磷酸酶2（MEG2），最初是从人的巨噬细胞MEG-01和脐静脉内皮细胞的cDNA文库中克隆，并因此而得名。MEG2表达于多种细胞，在人脑、胰脏、白细胞、巨噬细胞等中表达量较高[Kruger JM, et al. J Biol Chem, 2002, 277(4): 2620-8; Wang X, et al. J Immunol, 2002,168(9): 4612-9]。目前的研究结果证实MEG2与多种疾病的发生和发展有关[Hao Q, et al., Am J Physiol Cell Physiol. 2012 Sep 1;303(5):C548-53; Su F, et al., Breast Cancer Res. 2012 Mar 6;14(2):R38; Wang Y, et al., J Exp Med. 2005 Dec 5;202(11):1587-97.]。Cho CY 等发现MEG2是胰岛素依赖的FOXO1亚细胞定位的调控因子，该基因在细胞中的异位表达可抑制胰岛素诱导的胰岛素收的磷酸化，从而抑制胰岛素的信号通路。利用RNAi技术使MEG2表达降低，可明显增加胰岛素的作用，从而使糖尿病小鼠对糖尿病的耐受性得到改善[Cho CY, Cell Metab. 2006 May;3(5):367-78.]。MEG2的抑制剂被证明具有潜在的抗II型糖尿病的作用[Zhang S, et al., J Am Chem Soc. 2012 31;134(43): 18116-24.]。

糖尿病（diabetes mellitus）是一种由遗传和环境相互作用而引起的、以高血糖、胰岛素抵抗为特征的临床综合征。糖尿病是因胰岛素分泌绝对或相当不足以及靶组织细胞对胰岛素灵敏性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱的疾病。高血糖是糖尿病的临床主要标志，但久病可引起多个系统的损害。由于糖尿病人群中高发冠心病、缺铁性或出血性血管病、失明、肢端环疽等严重的并发症，所以糖尿病具有很高的致死率和致残率。据国际糖尿病联盟2012年发布的《糖尿病地图》估计，2012年糖尿病患病人数为3.71亿，其中死亡人数为480万。最新数据显示，糖尿病上升趋势仍在持续。截止到2013年年末，共计510万人死于糖尿病并发症。并居当今世界死亡原因的第4位，已严重危害了人类的健康。中国糖尿病人数超过1亿，并随着生活方式改变和老龄化的问题并呈快速的上升趋势。另外，据2012年世界卫生组织数据，全球肥胖人数超5亿，肥胖以及肥胖带来的相关疾病也早已成为全球面临的重大卫生健康难题。

目前一般讲糖尿病分为两类，I型糖尿病（胰岛素依赖糖尿病，IDDM）与II型糖尿病（非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM）。I型糖尿病的病因是胰岛细胞被破坏，从而引起胰岛素的绝对不足，患者必须依赖胰岛素维持生命；而II型糖尿病原因复杂，是由于胰岛素的相对不足或胰岛素抵抗引起的。糖尿病中90%以上是II型。所以II型糖尿病药物的治疗策略是增加胰岛素分泌以及胰岛素增敏。

总之，大量的研究结果已经证明蛋白酪氨酸磷酸酶介导多种疾病的发生和发展，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂具有预防或治疗肥胖、糖尿病、肿瘤以及相关并发症的药物作用。蛋白酪氨酸磷酸酶已经作为新的抗糖尿病、肥胖、抗肿瘤等药物研究的靶点[Darry A.J., Future Med Chem. 2010, 2(10): 1563-1576]。

金色灰绿曲霉素类化合物是一类来源于曲霉菌属或散囊菌属的微生物次级代谢产物［Mycological Research, 2009, 113(4): 480-490］，其化学结构为6位连接不同不饱和度脂肪链的2,5-二羟基3-异戊烯基苯甲醛，文献报道该类化合物具有抗真菌、抗疟疾、抗利什曼虫[Med Chem Res, 2012, 21: 3080-3086]、抗氧化[Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(6): 1323-1327；J Food Sci, 1985, 50(6): 1742- 1744]、人类阿片受体和大麻素受体的良好结合剂[J Nat Prod, 2011, 74, 1636-1639]等生物活性，该类化合物在抗糖尿病、肥胖等方面的活性未见报道。

发明内容

本发明的目的就是要提供金色灰绿曲霉素类化合物的新的医药用途。

本发明人经大量研究发现，结构如下式金色灰绿曲霉素类化合物，

、、、或

具有良好的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制活性，因此，可作为蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂用于预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的相关疾病，特别是肥胖、糖尿病或肿瘤。

为此，本发明完成了前述金色灰绿曲霉素类化合物在制备预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的相关疾病药物中的应用。

所述化合物在制备预防或治疗肥胖药物中的应用。

所述化合物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用，尤其在制备预防或治疗Ⅱ型糖尿病药物中的应用。

所述化合物在制备预防或治疗抗肿瘤药物中的应用。

所述化合物在制备预防或治疗蛋白酪氨酸磷酸酶介导的其他疾病或病症中的应用。

同时提供了所述化合物中的任意一种化合物为活性成分，与药学上可接受的载体、辅料或赋形剂组成的药物组合物。

本发明结构式代表的化合物，当时，简称为化合物A；当R为时，简称为化合物B；当R为时，简称为化合物C；当R为时，简称为化合物D。

本发明所述化合物可作为活性成分直接与药学上可接受的载体、辅料或赋形剂按照常规制剂工艺制备成各种形式的药物制剂，也可与生理学上可接受的酸如苯磺酸、硫酸等形成复合盐，再与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合制备成各种形式的药物制剂。

本发明的所述化合物或药物组合物还可以选择性地与已知的抗肥胖剂、抗高血糖剂、胰岛素抵抗改善剂、糖尿病治疗药以及蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的其他疾病的预防或治疗药物联合给药。当它与已知药物联合给药时，可以同时、分别或顺序给药。

本发明中所述的“药学上可接受的载体或辅料”是指可以与本发明化合物一起施用给患者的任何载体或辅料，它们不破坏本发明化合物的药理活性。

应用本发明药物组合物中的可药用载体、辅料和载体包括但不限于离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，半乳化药物递送系统(SEDDS)例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，在药物剂型中使用的表面活性剂例如吐温或其它类似聚合递送基质，血清蛋白例如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。也可以使用环糊精例如α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物例如是羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-ß-环糊精、或其它增溶衍生物来促进本发明化合物的递送。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。

本发明药物组合物可呈无菌注射剂形式，例如无菌可注射水或油悬浮液。该悬浮液可依据本领域已知技术使用合适的分散剂或润湿剂(例如吐温80)和悬浮剂来配制。无菌注射剂还可以是在无毒可非胃肠道给药用稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的赋形剂和溶剂是甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。如可使用温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，也可以使用天然可药用油例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化变型。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或类似的醇，或羧甲基纤维素，或通常用于配制可药用剂型例如乳剂或悬浮剂的类似分散剂。其它常用表面活性剂例如吐温或司盘或其它常用于制备可药用固体、液体或其它剂型的类似乳化剂或生物利用度促进剂也可用于配制的目的。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服使用水悬浮液或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂或矫味剂或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。

本发明所述化合物及药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可由多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。

本发明药物组合物可以为局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本发明所述化合物及药物组合物，可单一或联合用以预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病。其治疗量取决于多种因素，如预期用途、给药方式、接受者、所治疗病症或疾病的类型和严重性。通常，治疗人蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病或病症所用剂量在0.01-400mg/kg体重/天的水平，优选约0.5-150mg/kg体重/天剂量。次剂量可作为单一单位剂量给予或作为数个单独单位剂量给予，或作为连续输注给予。

本发明所述化合物或药物组合物一般每天给药约1-5次，或者连续输注。这样的给药可用作长期或急性治疗。可与载体合并以制得单个剂型的活性组分的量取决于治疗对象和特定给药方式。一般的制剂含有约5%-95%活性化合物(w/w)，优选含有约20%-80%活性化合物制剂。

当本发明组合物包含本发明所述化合物和一种或多种其他的治疗剂或预防剂时，本发明所述化合物剂量应为约10-95%，优选约10%-80%的给药的剂量。其他的活性剂可以作为多剂量方案的一部分与本发明化合物分开给药，或者是与本发明化合物在单一组合物中混合在一起的单一剂型的一部分。

本发明药物制剂的给药剂量优选对患者是无毒的恰当剂量，但也不排除在某些情况下依据疾病的严重程度被迫给予可能导致毒性迹象的较大剂量。

为了改善患者的状况，如果需要的话，可施用维持剂量的本发明所述化合物或药物组合物。然后可根据症状，将给药剂量或频率或二者降低至保持改善状况的水平，当症状已减轻至所需水平时，停止治疗。然而，由于疾病症状的复发，患者可能需要长期的间歇性治疗。

本领域技术人员能够理解，可能需要比上述剂量更低或更高的剂量。对于任何特定患者，具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物组合、疾病严重程度和病程以及治疗医师的判断。

本发明为临床预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的相关疾病，特别是肥胖、糖尿病或肿瘤等疾病提供了更多的用药选择。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

下列实施例所涉及的仪器设备及部分原材料的规格型号如下：

紫外光谱仪：Pharmacia公司Ultrospec 2100 Pro型。

核磁共振仪：Varian公司Inova 500（TMS为内标）。

低分辨质谱仪：Waters LCMS ZQ 2000 (ESI mode)。

中压层析系统：Buchi公司。

高压液相系统（分析）：Waters公司，2个515型泵，996 检测器。

高压液相系统（制备）：Waters公司，600型泵，2487检测器。

酶标仪：Perkin Elmer公司 Victor2 1420 Multilabel Counter。

分析型色谱柱：Chromasil ODS column (4.6×250 mm, 10 µm)。

制备色谱柱：Phenomenex ODS column (21.2×250 mm, 10 µm )。

反相C18层析介质：40-60 µm , Merck 公司。

层析硅胶：300~400目，青岛海洋化工厂。

色谱级甲醇和乙腈购自德国Merck公司，其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂厂。

下面实施例中金色灰绿曲霉素类化合物A-D可以采用任何现有技术制备，制备方法在Antioxidants Produced by Eurotium herbariorum of Filamentous Fungi Used for the Manufacture of Karebushi,Dried Bonito(Katsuobushi) (Biosci Biotechnol Biochem ,73(6): 1323-1327, 2009) 等文献中有详尽描述。

发明人利用如下方法制备了化合物A-D, 真菌F07Z1575从采自云南的土壤中分离得到，保藏于华北制药集团新药研究开发有限责任公司菌种保藏中心，公众可从华北制药集团新药研究开发有限责任公司获得。

实施例1 本发明所述金色灰绿曲霉素类化合物A-D的制备

将真菌F07Z1575斜面菌株接种于种子培养基（各成分的质量分数分别为：淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%，酵母粉0.5% ，CaCO₃ 0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.2%，NaCl 0.2%，pH为7.0），于27℃、220rpm摇瓶培养72 h后，接种于装量为150 g大米培养基（大米浸泡3 d，加入质量百分数为2.5%的热榨黄豆饼粉，搅拌均匀后，120℃消毒30 min）的1000 mL三角瓶中，27℃静置培养14 d。

发酵产物（固体发酵）约3Kg，加入6L乙酸乙酯浸泡并搅拌，2h后过滤并减压蒸干滤液，得深棕色膏状物10.1g。

用氯仿加少量甲醇溶解油膏，过硅胶粗分（500mL漏斗，G5孔径，装量40%总容积，硅胶300-400目），洗脱溶剂依次为氯仿-甲醇（10:1, V:V）和氯仿-甲醇（1:1, V:V）各500mL，分别减压抽滤收集洗脱液，减压蒸干得到组份a和b，重量分别为(a)3.1g、(b)5.9g。两个组份定量测活后确定组分a为活性组分。组份a通过ODS中压柱(3.5×50 cm)分离，乙腈和水作流动相，乙腈10%~100% (60min)线性浓度梯度洗脱，流速50mL/min，220nm检测，按峰收集，从第一个峰开始编号，依次为1-12组分，浓缩至干，得到12个组分，分别定量测活， 7号组分（123mg）和8号组分(580mg)为活性组分。7号组分通过Sephadex LH20柱分离（纯甲醇洗脱），收集洗脱液，浓缩至干，得到化合物A（89mg）。8号组分通过Sephadex LH20柱分离（纯甲醇洗脱），液相检测，按峰收集洗脱液，浓缩至干，得到8-1（78mg）、8-2（220mg）两个活性组分，这两部分分别利用HPLC进行单体制备[流动相：CH₃CN-H₂O(80:20, V:V)，流速：16mL/min，检测波长254nm、300nm]，其中组份8-1制备得到化合物B(17mg，Rt:11.5min)和C(4mg, Rt:14.6min )，组份8-2制备得到化合物D(13mg, Rt:18.6min )。

化合物A-D通过MS和NMR数据分析分别鉴定为异二氢金色灰绿曲霉素（CAS No. 74886-31-0, 化合物A）、金色灰绿曲霉素（CAS No. 41451-81-4，化合物B）、二氢金色灰绿曲霉素（CAS No. 77102-91-1，化合物C）和四氢金色灰绿曲霉素（CAS No. 33514-92-0，化合物D）。

化合物A（异二氢金色灰绿曲霉素）：深黄色固体粉末，易溶于氯仿，微溶于甲醇。UV λmax(MeOH)=229；274；389nm。ESI-MS m/z 299[M-H]^-，599[2M-H]^-。分子式C₁₉H₂₄O₃，¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.93 (s, 1H), 10.22 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.09–5.95 (m, 1H+1H), 5.59 (qd, J = 13.8, 6.8 Hz, 2H), 5.28 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.29 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 3.02 – 2.93 (m, 2H), 2.34 (dd, J = 15.0, 7.4 Hz, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.73 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.69 (s, 3H)。

化合物B（金色灰绿曲霉素）：淡黄色粉末，易溶于氯仿，溶于甲醇。 UV λmax(MeOH)=266；316；422nm。ESI-MS m/z 297[M-H]^-，595[2M-H]^-，分子式C₁₉H₂₂O₃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.79 (s, 1H), 10.09 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.65 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.49 (dd, J = 15.7, 9.6 Hz, 1H), 6.40 – 6.27 (m, 2H), 6.20 – 6.12 (m, 1H), 5.86 (dq, J = 13.8, 6.9 Hz, 1H), 5.29 (dd, J = 8.1, 6.7 Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 3.32 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.83 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 2H), 1.76 (s, 2H), 1.70 (s, 2H)。

化合物C（二氢金色灰绿曲霉素）：棕黄色粉末，易溶于氯仿，溶于甲醇。UV λmax(MeOH)=250；297；409nm。ESI-MS m/z 297[M-H]^-，595[2M-H]^-，分子式C₁₉H₂₂O₃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.78 (s, 1H), 10.09 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.56 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.44 (dd, J = 15.8, 10.3 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 14.9, 10.4 Hz, 1H), 5.95 – 5.84 (m, 1H), 5.29 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.93 (s, 1H), 3.32 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.15 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.47 (dd, J = 14.6, 7.3 Hz, 2H), 0.95 (t, J = 7.3 Hz, 3H).。

化合物D（四氢金色灰绿曲霉素）：淡黄色晶体，易溶于氯仿，微溶于甲醇。UV λmax(MeOH)=230；273；393nm。ESI-MS m/z 301[M-H]^-，603[2M-H]^-，分子式C₁₉H₂₆O₃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 11.73 (s, 1H), 10.10 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.48 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 5.99 (dt, J = 16.1, 6.8 Hz, 1H), 5.29 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.99 (s, 1H), 3.32 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.32 (dt, J = 7.9, 4.0 Hz, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.53 (dd, J = 14.4, 7.2 Hz, 2H), 1.39 – 1.32 (m, 4H), 0.92 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。

实施例2：本发明所述化合物的生物活性测定

用于活性测定的蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B，SHP2，LAR，MEG2 均为本公司利用基因工程方法在大肠杆菌中表达，并经亲和层析纯化获得。

样品对蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B，SHP2，LAR，MEG2抑制活性的测定方法如下：将实施例1制备的金色灰绿曲霉素类化合物稀释后加入到96孔板中，并分别加入每孔100 µl含0.5-2nM的PTP1B，SHP2，LAR或MEG2酶蛋白的0.01 M NaAc-HAc pH 6.0酶反应缓冲液，室温下孵育15分钟后，加入100 µl含5 mM对硝基苯磷酸二钠(pNPP)反应底物的0.01 M NaAc-HAc pH6.0，1mmol/L EDTA 钠盐缓冲液。37ºC反应保温30 min，加0.2 M NaOH终止反应，用酶标仪测定405nm下的光吸收变化。

按以下公式计算抑制率：

抑制率=(1-实验组吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值)×100%。

抑制活性的评价标准：

IC₅₀值为抑制率为50%时的金色灰绿曲霉素类化合物浓度（µg/ml）

所述金色灰绿曲霉素类化合物的抑制活性如表1所示。

表1 金色灰绿曲霉素类化合物对蛋白质酪氨酸磷酸酶的抑制活性

实验结果表明，本发明所述化合物具有显著的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制活性，可用于制备预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶所介导的疾病的药物。

实施例3

按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分：

化合物A 15mg

乳糖 180mg

硬脂酸镁 5mg

玉米淀粉 50mg

实施例4

按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分：

化合物B 50mg

乳糖 188mg

硬脂酸镁 12mg

以本发明所述化合物为活性成分，按照本领域已知的方法制备，均可以制备成各种临床所需制剂，在此不再一一赘述。

Claims (2)

1.下式化合物

、、或

在制备预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病的药物中的应用，其中蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病是肥胖。

2.下式化合物

、、或

在制备预防或治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病的药物中的应用，其中蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病是糖尿病。

3.根据权利要求2所述的应用，其中蛋白质酪氨酸磷酸酶介导的疾病是Ⅱ型糖尿病。