CN1111127A - 用渥曼青霉素及其类似物抑制磷脂酰肌醇3-激酶 - Google Patents

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Abstract

渥曼青霉素及其某些类似物是磷脂酰肌醇3-激 酶的抑制剂。这些化合物特别有用于抑制哺乳动物 磷脂酰肌醇3-激酶和用于治疗哺乳动物磷脂酰肌醇 3-激酶依赖性疾病，特别是治疗肿瘤。

Description

本发明涉及抑制裂解的或完整的细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）的方法，它是通过将裂解的细胞或完整的细胞与一种称为渥曼青霉素（Wortmannin）的化合物或与某种渥曼青霉素类似物之一接触。这类化合物也能被用于选择性抑制哺乳动物，尤其是人体中的磷脂酰肌醇3-激酶，并用于治疗人体的磷脂酰肌醇3-激酶依赖性疾病，特别是人体肿瘤。
据信，肌醇磷脂的代谢是应答各种激素和生长因子的受体介导的信号传导途径中的必需组成部分[参见例如        Berridge，M.J.，etal.，Nature，312∶315-321（1984）;Nishizuka，Y.，Science，225∶1365-1370（1984）]。
在上述信号传导途径中，磷脂酰4，5-二磷酸经磷脂酶C水解生成1，4，5-三磷酸肌醇和甘油二脂这两种细胞内第二信使物质。1，4，5-三磷酸肌醇促进细胞内Ca2+库释放Ca2+，导致Ca2+/钙调素依赖性激酶的激活;甘油二酯则是激活蛋白激酶C。4，5-二磷酸磷脂酰肌醇在被裂解后，通过磷脂酰肌醇4-激酶和磷脂酰肌醇-4-磷酸激酶对磷脂酰肌醇的分步磷酸化作用又迅速重新合成了4，5-二磷酸磷脂酰肌醇。这两种激酶似乎在第二信使物质的产生过程中起着重要作用（参见，例如Duell，T.F.，US5，001，064（1991）;Shibasaki，F.，et    al.，J.Biol.Chem.266（13）∶8108-8114（1991）。
最近，已经证实存在着另外一种磷脂酰肌醇激酶，并且其存在与某些被激活的酪氨酸激酶相关[Courtneidge，S.A.，et    al.，Cell，50∶1031-1037（1987）;Kaplan，D.R.，et    al.，Cell，50∶1021-1029（1987）]。已发现这种鉴定为磷脂酰肌醇3-激酶的激酶对磷脂酰肌醇（PI）的肌醇环3位进行磷酸化形成3-磷酸磷脂酰肌醇（PI-3P）[Whitman，D.，etal.，Nature，332∶664-646（1988）]。
除了PI外，磷脂酰肌醇3-激酶也能够使4-磷酸磷脂酰肌醇和4，5-二磷酸磷脂酰肌醇磷酸化，分别产生3，4-二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[Auger，K.R.，et al.，Cell，57∶167-175（1989）]。
PI3-激酶与酪氨酸激酶[例如PP60V-Src、多瘤中期T/PP60V-Src、血小板衍生的生长因子受体、集落刺激因子-1受体和胰岛素受体（参见例如Shibasaki，同上文）]存在物理相关性，这表明PI3-激酶在信号传导及涉及与PI3-激酶相关性，这表明PI3-激酶在信号传导及涉及与PI3-激酶相关和激活PI3-激酶的蛋白质酪氨酸激酶的其它细胞过程中具有重要的但仍未确定的作用。也已在嗜中性粒细胞中鉴定了与嗜中性粒细胞和血小板中的G-蛋白受体相关的PI3-激酶活性[Traynor-Kaplan，A.E.，et al.，Nature，334∶353-356（1988）;Mitchell，C.A.，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，87∶9396-9400（1990）]。然而，嗜中性粒细胞中发生的PI3-激酶的激活不依赖于酪氨酸的磷酸化[Vlahos，C.J.，et al.，FEBS Letters，309（3）∶242-248（1992）]。
PI3-激酶以85KDa调节亚单位和110KDa催化亚单位紧密相联的杂二聚体形式存在，并见于与几乎所有的配体-激活的生长因子受体和致癌基因蛋白质酪氨酸激酶的细胞复合体中[Cantley，L.C.，et    al.，Cell，64∶281-302（1991）]。85KDa调节亚单位在表观上充当一种使得PI3-激酶的110KDa催化亚单位与生长因子受体和酪氨酸磷酸化的蛋白质发生相互作用的接头蛋白[Margolis，C.，Cell    Groth    Differ.，3∶73-80（1992）]。
尽管PI3-激酶似乎是信号传导中的一种重要的酶，但仅仅才鉴定出对PI3-激酶具有抑制活性的有限数量的化合物[参见例如Matter，W.F.，et    al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，186∶624-631（1992）]。与用于本发明方法中化合物的选择性PI3-激酶活性相反，Matter等人所使用的生物类黄酮化合物，尤其是槲皮酮及其某些类似物抑制PI3-激酶和其它的激酶，如蛋白激酶C和PI4-激酶（Matter，et    al.，同上文）。
因此，本发明提供一种用渥曼青霉素或某种渥曼青霉素类似物之一抑制裂解细胞或完整细胞中磷脂酰肌醇3-激酶的方法。
本发明还提供一种用渥曼青霉素或其某种类似物之一抑制哺乳动物，尤其是人体中磷脂酰肌醇3-激酶的方法。
本发明进一步还提供治疗哺乳动物中磷脂酰肌醇3-激酶依赖性疾病尤其是肿瘤的方法。
本发明提供抑制裂解细胞或完整细胞中磷脂酰肌醇3-激酶的方法，它包括将裂解的或完整的细胞与选自下列通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物中的一种接触：
式Ⅰ中        R是H或乙酸基;
式Ⅲ中 R1是H、甲基或乙基;
R2是H或CH3。
本发明也提供抑制哺乳动物中的磷脂酰肌醇3-激酶的方法，包括给所说哺乳动物施用磷脂酰肌醇3-激酶抑制量的、选自上述通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物中的一种化合物。
本发明还提供对需要进行有关治疗的哺乳动物治疗磷脂酰肌醇3-激酶依赖性疾病的方法，包括给所说哺乳动物施用磷脂酰肌醇3-激酶抑制量的、选自上述通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物中的一种化合物。
如前所述，本发明涉及抑制裂解的或完整的细胞中磷脂酰肌醇3-激酶的方法，包括将所说裂解的或完整的细胞与选自下列通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物中的一种化合物接触：
Figure 941083985_IMG12
式Ⅰ中        R是H或乙酸基;
式Ⅲ中 R1是H、甲基或乙基;及
R2是H或CH3。
通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的化合物是本领域中已知的。下表Ⅰ说明用于本发明方法中优选化合物的俗名。
表1渥曼青霉素及优选的渥曼青霉素类似物
通式命名 R R1R2俗名
Ia        乙酸基        NA        NA        渥曼青霉素
Ib        H        NA        NA        11-脱乙酸基渥曼青霉素
II        NA        NA        NA        △9,11-脱氢-脱乙酸
基渥曼青霉素
IIIa        NA        H        H        渥曼青霉素的开A环酸
IIIb        NA        甲基        H        渥曼青霉素的开A环甲基酯
渥曼青霉素（Ia）的生物合成生产是本领域中熟知的。典型的情况下，它可由发酵大量以前公开的微生物中的任一种来生产，所说微生物例如渥曼氏踝节菌（Talaromyces    Wortmannin[Nakanishi，et    al.，J.Biol.Chem.，267（4）∶2157-2163（1992）]以及渥曼氏青霉、露湿漆斑菌和尖孢镰孢[Abbas，et    al.，Appl.Environ.Microbiol.，54（5）∶1267-1274（1988）]。发酵之后，通过已知方法提取并纯化渥曼青霉素。
优选的是，渥曼青霉素经微生物法合成，并以基本纯化的形式从被确定为A24603.1的发酵培养物中分离出来。
培养物A24603.1将根据布达佩斯条约进行保藏（Midwest    Area    Northern    Regional    Research    Center，Agricultural    Research    Service，United    States    Department    of    Agriculture，1815    North    University    Street，Peoria，Illinois，61604）。
在专利被批准的整个有效期中将提供对培养物A24603.1的永久性保存（Midwest    Area    Northern    Regional    Research    Center    at    Peoria，Illinois），并易于被公众得到。根据C.F.R.§1.14和35U.S.C.§112，在专利申请的待审查过程中也可得到培养物。在专利获得授权时，一切有关公众可得到培养物的限制将被不可撤消地解除。
渥曼青霉素的生产是通过在适宜的培养基中以浸没需氧条件培养上述的A24603.1菌株直至产生可回收量的渥曼青霉素。可用各种本领域中已知的分离及纯化方法回收渥曼青霉素。
用于生长A24603.1培养物的培养基可以是大量培养基中的任意一种。然而，为了达到经济的生产、最理想的产率和简便的产物分离，在大规模发酵中优选的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉（如玉米淀粉）。还可以使用的是麦芽糖、核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露糖醇、土豆糊精、甲基油酸酯和油类（如豆油）等。
尽管也可使用胃蛋白酶化乳、消化的豆粉、鱼粉、玉米浆、酵母提取物、酸解的酪蛋白、牛肉提取物等，但优选的氮源是酶解的酪蛋白和棉籽粉。
能够掺入到培养基中的营养性无机盐是那些能产生钙、镁、钠、铵、氯、碳酸、硫酸、硝酸和锌等离子的常见可溶性盐。
培养基中还可包括生物体生长和发育所需的必需微量元素。这类微量元素通常以足以满足生物体生长所需的量在培养基的其它取代成分中作为不纯物存在。
为了生产基本量的渥曼青霉素，优选在搅拌生物反应器中进行浸没需氧发酵。通过烧瓶振摇培养可以得到少量的渥曼青霉素。因用生物体的芽胞形式接种大的生物反应器常伴以生产的时滞效应，所以优选使用生长性的接种物。用生物体的芽胞形式或菌丝体片段接种少量的培养基以获得新鲜的、活性生长的生物体培养物，从而制得生长性接种物。生长性接种物培养物可同于用于大规模发酵的培养基，但也可以是其它合适的培养基。
由A24603.1生物体在约23℃～29℃下生长生产渥曼青霉素。产生渥曼青霉素最理想的温度看来是约25℃。
如浸没需氧培养法中所习惯的，当用常规涡轮转子搅拌培养基时，从底部向容器中鼓入无菌空气。一般情况下，通气速率和搅拌速率应足以维持至少45%空气饱和度（伴随容器内压为约5个大气压）的溶解氧水平。
在发酵过程中通过测试取自液体培养基中的PI3-激酶提取物可以观察渥曼青霉素的生产。下文所述的PI3-激酶测定系统是有用于上述目的的测定法。
在产生渥曼青霉素后，可用现有技术中已知的方法从发酵培养基中进行回收。在发酵A24603.1菌株过程中产生的渥曼青霉素主要存在于液体培养基中。
一般情况下，可以利用各种技术从生物量中回收渥曼青霉素。优选的技术包括用陶瓷滤器过滤全部的发酵液体培养基。用有机溶剂（如乙酸乙酯）洗脱滤液，再浓缩滤液。浓缩物被悬浮于醇中直至出现结晶，过滤、洗涤和干燥所得的溶液。为了证实所得物，将结晶物溶解于有机溶剂中，并在反相硅胶吸附剂（C3或C18）上进行层析。在有机-水缓冲液（如60%乙腈）中洗脱馏分。
11-脱乙酸基渥曼青霉素（通式Ib）及其制备方法也是现有技术中已知的。一般说来，该化合物可由发酵绳状青霉（Penicillium    funiculosum    Thom）的培养物经生物合成途径产生[参见例如Baggolini，et    al.，Exp.Cell    Res.169∶408-418（1987）]，但优选的是用Haeflinger等人公开的方法[（Helv.Chem.Acta，56（8）∶2901-2904（1973）]由渥曼青霉素经化学衍生制得。
类似地，△9，11-脱氢-脱乙酸基渥曼青霉素（通式Ⅱ）的制备也是现有技术中已知的，并由Haeflinger等人（同上）描述过，MacMillan等人[（J.Chem.Soc.，Perkin    I∶2892-2898（1972）]描述了如何制备通式Ⅲ的化合物。
在本发明的方法中，通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物有效地选择性抑制裂解的或完整的细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶。该方法可在体外或体内进行，并可作为一种药理学工具用于研究如PI3-激酶在分丝分裂、细胞增殖或分化中的涉入。还可以对通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物进行放射标记（例如氚化的），以使得这类化合物在细胞中能更简便地检测出。
当通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物被用于本发明的方法中时，这一种化合物被溶解于有机溶剂（如二甲基亚砜DMSO）中，并用HEPES缓冲液（pH7.5，含15mM MgCl2和1mM EGTA）稀释至所需浓度。然后按现有技术中熟知的方法将所得制备物与纯化的PI3-激酶或与一种细胞接触。
本发明另一实施方案提供抑制在哺乳动物，尤其是人体中的磷脂酰肌醇3-激酶的方法，包括给所说哺乳动物施用磷脂酰肌醇3-激酶抑制量的、选自通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ化合物中的一种化合物。
本发明的优选实施方案包括治疗哺乳动物的磷脂酰肌醇3-激酶依赖性疾病的方法，包括给所说哺乳动物施用磷脂酰肌醇3-激酶抑制量的、选自通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ化合物中的一种化合物。PI3-激酶依赖性疾病包括与疼痛、糖尿病、炎症、血小板积聚、血管性疾病（如动脉粥样硬化）、再狭窄等特别是见于肿瘤中的异常细胞生长等相关的生化过程。
因此，本发明特别优选的实施方案包括用选自通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物中的一种化合物治疗磷脂酰肌醇3-激酶依赖性肿瘤，尤其是淋巴肉瘤的方法。其它的磷脂酰肌醇3-激酶依赖性肿瘤包括例如女性乳腺癌、结肠癌、头颈部的表皮样瘤、白血病、黑素瘤、卵巢癌、浆细胞骨髓瘤和鳞状或小细胞肺癌。为了治疗上述及其它肿瘤性PI3-激酶依赖性疾病，优选使用渥曼青霉素。
为了对所指定的适应症进行对症治疗，可以直接施用通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物，或者也可将所说化合物混合并配制成适于胃肠外、透皮直肠、鼻内或静脉内给药或优选是口服的单位剂量形式的药物组合物。用现有技术熟知的方法制备上述药物组合物，它包括至少一种选自通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物中的一种化合物和一种药物载体。在整个说明书中所使用的术语“活性化合物”指的是至少一种选自通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物或其药用盐。
在这种组合物中，活性化合物被称为“活性成分”。在制备组合物的过程中，活性成分通常与载体混合，或用载体稀释，或者包入胶囊、香囊、纸或其它容器形式的载体中。当载体充当稀释剂时，它可以是作为载体、活性成分基质的赋形剂的固体、半固体或液体物。因此，组合物的形式可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、香囊剂、扁囊剂、酏剂、乳化剂、溶液剂、糖浆、悬浮剂、软硬明胶胶囊剂、无菌注射液和无菌包装的粉剂。
合适载体、赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸藻酸钙、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、黄蓍胶、明胶、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸镁、水和矿物油。配方中可另外包括润滑剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或香味剂。组合物可以配制成在用现有技术熟知的方法给病人施用后能使活性成分迅速、持续或延缓释放。
用于口服的化合物可与载体和稀释剂混合被做成片剂或包入明胶胶囊中。该混合物或者也可溶解于如10%葡萄糖水溶液、等渗盐水和无菌水等液体中，并通过静脉输注或注射途径给药。
组合物优选配制成单位剂量形式，每剂含活性成分约1-500mg，更常见的是约5-300mg。术语“单位剂量形式”指的是适用于人和其它哺乳动物的单元剂量的在物理上周到考虑的单位，每一单位含有经计算能产生所需治疗作用的预定量活性物质和可药用的所需载体。“可药用的”意味着载体、稀释剂或赋形剂必须与配方中的其它成份相容且对其接受者无害。
下面的配方实例仅是说明性的，而无意于以任何方式限制本发明的范围。术语“活性成分”的含义同上文的定义。
配方1利用下列成分制备硬明胶胶囊：
含量
(mg/胶囊)
活性成分        250
淀粉(干)        200
硬脂酸镁        10
总量        460mg
配方2利用下列成分制备片剂：
含量
(mg/胶囊)
活性成分        250
纤维素(微晶)        400
SiO2(fumed) 10
硬脂酸        5
总量        665mg
将各成分混合，并挤压成每片重665mg的片剂。
配方3制备含下列成分的气溶胶液：
重量
活性成分        0.25
乙醇        25.75
气雾剂挥发剂22(一氯二氟甲烷)        70.00
总量        100.00mg
将活性成分与乙醇混合，再将混合物加入部分气雾剂挥发剂22中，冷却至-30℃，并转移到装填机中。然后将所需量进料到不锈钢容器，并用剩余的气雾剂挥发剂稀释。再把阀装置固定于容器上。
配方4根据下文制备含60mg活性成分的片剂
活性成分        60mg
淀粉        45mg
微晶纤维素        35mg
聚乙烯吡咯烷酮        4mg
(10%水溶液)
羧甲基钠淀粉        4.5mg
硬脂酸镁        0.5mg
滑石        1mg
总量        150mg
将活性成分、淀粉和纤维素过45号筛目美国筛并充分混合。将含聚乙烯吡咯烷酮的水溶液与所得的粉状混合物混合，再将混合物过14号筛目的美国筛。在50℃干燥所产生的颗粒，过18号筛目的美国筛。预先过60号筛目的美国筛的羧甲基钠淀粉、硬脂酸镁和滑石被加入所制备的颗粒中，混匀后在片剂机上挤压，产生150mg的片剂。
配方5
如下制备含80mg活性成分的胶囊：
活性成分        80mg
淀粉        59mg
微晶纤维素        59mg
硬脂酸镁        2mg
总量        200mg
将活性成分、纤维素、淀粉和硬脂酸镁混合，过45号筛目美国筛，以200mg量填充于硬明胶胶囊中。
配方6如下制备每剂含225mg活性成分的栓剂：
活性成分        225mg
饱和脂肪酸甘油酯        2,000mg
总量        2,225mg
将活性成分过60号筛目美国筛，并悬浮于预先用最低限度的必需热量加热融化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倒入具有2g额定容量的栓剂模子中，冷却。
配方7如下制备每5ml剂量含50mg活性成分的悬浮液剂：
活性成分        50mg
羧甲基纤维素钠        50mg
糖浆        1.25ml
苯甲酸溶液        0.10ml
香味剂        适量
着色剂        适量
补纯净水至总量        5ml
将活性成分过45号筛目美国筛，与羧甲基纤维素钠和糖浆混合形成匀质糊。用部分水稀释苯甲酸溶液、香味剂和着色剂，并在搅拌下加入糊状物中。加入足量的水得到所需容量。
配方8如下制备静脉内用配方：
活性成分        100mg
等渗盐水        1,000ml
通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物可在一个很宽的剂量范围内有效地对抗PI3-激酶和该酶依赖性疾病。例如，每天的剂量通常为约0.1mg/kg体重-50mg/kg体重。在对成人进行治疗时，优选的剂量范围是以单剂或分次剂量的约5mg/kg-约25mg/kg。然而，应该明确的是实际施用的化合物剂量将根据有关的情况包括疾病的相对严重程度、对施用化合物的选择、病人年龄、体重和各病人的反应以及选择的施药途径由内科大夫确定。因此，上述剂量范围无意于以任何方式来限制本发明的范围。
通式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化合物表现出有对抗PI3-激酶的选择活性。下面的描述用于说明上述活性的测试系统。
纯化磷脂酰肌醇3-激酶
PI3-激酶可由多种方法制备。在一种方法中，PI3-激酶可由得自ATCC的融合Swiss 3T3细胞制备。在纯化PI3-激酶之前，细胞以批量培养维持于添加了10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagles培养基中（DMEM;Sigma，St，Louis，MO），并用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）处理。用10ml Hanks平衡盐溶液（HBSS;Sigma pH7.4）洗涤四块100mm培养板上的24×106细胞，将细胞留于无胎牛血清的DMEM中维持1小时，然后用100ng/ml血小板衍生的生长因子的重组人BB同型二聚体（PDGF：Genzyme，Cambridge，MA）刺激15分钟。向培养基中通气，用10ml HBSS洗涤细胞，然后用3ml 137mM NaCl和含1mM MgCl2、10%甘油、1% Triton X-100（Rohm and Hass，Philadelphia，PA）、2μg/ml亮肽素、2μg/ml抑肽酶、1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和1mM原钒酸钠的20mM Tris（pH8.0）进行裂解。使细胞从平皿的表面刮下来，并以6，000xg离心10分钟。在1.5ml管中将上清液与50μl洗过的IgG 2bk抗磷酪氨酸抗体珠（Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid NY）混合。将管盖盖上，在4℃下旋转2小时，用1ml含2μg/ml亮肽素、4μg/ml抑肽酶、1mM PMSF、200μM腺苷和1mM原钒酸钠的HBSS 洗抗体珠两次。用200μl/管的10mM    Tris（pH7.5）、2M    NaCl、1mM    EDTA、200μM腺苷和10mM苯磷酸钠将酪氨酸磷酸化的PI3-激酶从抗体珠上洗脱下来。
在另一个优选方法中，可由牛脑制备PI3-激酶。从当地的屠宰场在屠宰后的数分钟内获得两个牛脑（湿重约900g），置于冰上，在一小时内制成匀浆。去除牛脑中多余的脂肪和血管，然后用Tekmar Tissuemizer （Cincinnati OH）在含有250mM蔗糖、6mM β-巯基乙醇、1μg/ml亮肽素、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A、O.4mM PMSF和1mM MgCl2的20mM Tris（pH8.3）中于4℃制成匀浆。
以10，000xg离心60分钟后，于4℃滴加1M乙酸将上清液的pH值降至5.75。于4℃再搅拌15分钟后，将溶液以13，500xg离心60分钟，弃去上清液。将沉淀丸重悬浮于缓冲液A[含6mM β-巯基乙醇、0.1mM 乙二醇-双（β-乙胺醚）-N，N，N′，N′-四乙酸（EGTA）、1μg/ml亮肽素、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A和1mM MgCl2的20mM Tris（pH8.3）]，并以5ml/分的流速于4℃上样于Fast Flow Q Sepharose柱（300ml）。上样后，用3体积含0.1M KCl的缓冲液A冲洗该柱，然后以3ml/分的流速用总共7体积的缓冲液A/0.1M KCl至缓冲液A/0.6M KCl线性梯度洗脱激酶。
如下所述，用10μl馏分和磷脂酰肌醇作底物测定馏分的PI3-激酶活性。PI4-激酶洗脱于突破点;PI3-激酶在约0.3M    KCl处洗脱。PI3-激酶收集物进行40%硫酸铵沉淀。离心后（60分钟13，500xg），沉淀丸重悬于缓冲液B（10mM磷酸钾、pH7.4，含有6mM β-巯基乙醇，1μg/ml亮肽素、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A和1mM MgCl2），并以2.5ml/分的流速上样于50ml羟基磷灰石柱上（Calbiochem，Inc.，La Jolla，CA）。用150ml缓冲液B冲洗该柱直至A280基线值达到0，然后以1ml/分的流速用10-320mM KHz PO4线性梯度洗脱激酶共450分钟。
收集活性馏分，然后以3ml/分的流速上样于用缓冲液C（50mM MES，pH6.2，含6mM β-巯基乙醇，0.1mM EGTA，1μg/ml亮肽素、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A和1mM MgCl2）平衡过的Monos柱（8ml）（Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ）。用溶于缓冲液C中的0-0.4M KCl在120分钟内线性梯度洗脱PI3-激酶，在测定馏分时，常规地发现了两组PI3-激酶活性收集物。主要的活性部分见于直流（flow-through）中，而约20%的活性部分被梯度洗脱。尽管梯度中的物质具有很大的PI4-激酶活性，但基本上没有PI4-激酶活性部分与在直流（flow-through）中洗脱的PI3-激酶相关。因此，通过在Mini-Ultrasette Omega 50K膜（Filtron，Inc.，Northborough，MA）膜上进行切线流动过滤浓缩Mono S直流（flow-through），并在缓冲液C中稀释以降低传导性。用上述条件将该物质重新上样于Mono S柱。在冲洗过程中PI3-激酶结合至柱上，并在梯度中洗脱。在梯度中获得两组磷脂酰肌醇激酶活性收集物，测定每种的PI3-激酶活性和PI4-激酶活性。发现收集物I含有95%PI3-激酶活性（和5%PI4-激酶）而收集物Ⅱ主要含有PI4-激酶活性。
用缓冲液A稀释得自Mono    S柱的收集物Ⅰ，并在Mono    Q（1ml）上进行层析，用溶于缓冲液A的0-0.4M    KCl梯度洗脱。测定最终收集物的PI3-激酶活性和PI4-激酶活性。发现最终产物含有大于99%的PI3-激酶活性。
测定纯化的PI3-激酶活性
用前述Matter等的方法（Biochemical and Biophysical Research Communications，186∶624-631，（1992））测定PI3-激酶活性。首先将抑制剂待测物溶解于DMSO中，然后用含15mM MgCl2和1mM EGTA的50mM HEPES缓冲液（pH7.5）稀释10倍。将10μl该溶液与纯化的牛脑PI3-激酶（9μl）和磷脂酰肌醇（5μl 2mg/ml贮存液溶于50mM HEPES缓冲液，pH7.5，含1mM EGTA）一起保温。终反应混合物含0.1-5ng/ml抑制剂和3%DMSO（V/V）。该浓度的DMSO对PI3-激酶活性没有影响;对照的反应混合物含3%DMSO（V/V），不含抑制剂。反应物在室温下预保温10分钟，在加入1μl[γ-32P]ATP（2m Ci/ml，500μm贮存液;0.08m Ci/ml，20μM终浓度;Dupont New England Nuclear，Boston MA）后酶反应开始。该反应在不断搅拌中于室温下进行10分钟，在此之后通过加40μl 1N HCl中止反应。加入80μl CHCl3∶MeOH（1∶1，V/V）抽提类脂类。混合并离心样品，将底层有机相放到硅胶TLC板（EM Science，Gibbstown NJ）上，该板在CHCl3∶MeOH∶H2O∶NH4OH（45∶35∶8.5∶1.5，V/V）中显色。干燥TLC板，并用放射自显影仪观察激酶反应。从板上刮下3-磷酸磷脂酰肌醇区，并借助液体闪烁光谱利用用作闪烁鸡尾（Cocktail）的Ready Protein（Beckman Instruments Inc.，Fullertor，CA）进行定量。渥曼青霉素和其类似物的抑制作用水平被测定为与对照样相比的每分钟[32P]计数的百分比。
此外，如Whitman（Nature，332∶644-646（1988））所述用HPLC证实PI3-激酶反应产物。磷脂在甲胺试剂中脱酰基化并用如Auger（Cell，57∶167-175（1989））所述的Whatman Partisphere SAX阴离子交换柱进行分离。用Radiomatic Model A-140Flo-One/Beta在线放射性检测仪监测脱酰基的[32P]-酶产物;加入脱酰基的[3H]PI4-单磷酸作为内标。
渥曼青霉素及其类似物对由牛脑纯化的PI3-激酶的抑制作用示于表2中。
表2
用渥曼青霉素及其类似物抑制由牛脑纯化的PI3-激酶
通式 IC50(ng/ml)
Ia        1.8(4.2nM)
Ib        6.2(16.7nM)
II        20.0(59.0nM)
IIIb        1500.0(4.6μM)
另外，用于本发明方法中的渥曼青霉素及其类似物对于PI4-激酶、磷脂酶C、c-src蛋白酪氨酸激酶或者蛋白激酶C没有影响，并且具有比先前报道的肌球蛋白轻链激酶抑制剂的活性[参见例如Nakanishi，S.，et    al.，J.Biol.Chem.，267（4）∶2157-2163（1992）]强100倍的效力。因此渥曼青霉素及其类似物是PI3-激酶有效的、高选择性的抑制剂。
测定完整细胞的PI3-激酶活性
因为已知v-sis NIH 3T3细胞（National Cancer Institute，Bethesda，MD）显示出构成性以及血小板衍生生长因子刺激的PI3-激酶活性，所以选择上述细胞用于测定3-磷酸磷脂酰肌醇水平。75cm2培养烧瓶中对数生长的v-sis NIH 3T3细胞被置于不含胎牛血清的DMEM中两小时。用不含磷酸的DMEM冲洗细胞并在含有0.1%无脂肪酸的牛血清、白蛋白和0.15mCi/ml[32P]H3PO4（ICN Biomedicals，Irvine，CA）的相同培养基中保温70分钟。用上述方法制备抑制剂待测物，并在其刺激前与细胞接触10分钟。用100ng/ml PDGF刺激细胞10分钟。为了检测细胞中的3-磷酸磷脂酰肌醇，去掉培养基并在加入4ml/烧瓶的HCL∶甲醇（1∶1，V/V）之前，用磷酸盐缓冲液洗细胞1次。从烧瓶中刮下细胞并用Folch等人描述的方法（J.Biol.Chem.226∶497-509，（1957））抽提总的类脂类。用甲胺通过Clark等人所述方法（Biochem J.，195∶301-306，（1981））制备脱 酰基的类脂类，并借助HPLC利用10cm RAC Ⅱ Partisil 5 SAX 柱（Whcitman，Kent，U.K.），按照Auger等人所述方法[Methods in Inositide Research，159-166（Irvine，R.F.，Ed.，Raven Press，Ltd.，New York，NY（1990））]以流量为0.8ml/分的NH4H2PO4梯度洗脱来进行分离。借助放射性流量探测器（Flo-One Beta，Model A515，Radiomatic Instruments，Meriden，CT）检测洗脱峰。所用的参考化合物是脱酰基-4，5二磷酸[3H]磷脂酰肌醇和脱酰基-3，4，5-三磷酸[32P]磷脂酰肌醇。
尽管对纯化的PI3-激酶的抑制作用实质上大于对完整细胞中PI3-激酶的抑制作用，但1.3μm的渥曼青霉素对完整细胞中血小板衍生生长因子刺激的3-磷酸磷脂酰肌醇的形成提供了几乎完全的抑制作用。
为了便于更充分理解本发明，给出了下面的实施例，然而应该理解这些实施例仅仅是为了说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
发酵培养物A24603.1
A.振摇烧瓶
用维持于液氮中的冻干的团丸状或悬浮液形的培养物A24603.1接种具有下列组成的生长性培养基：
生长性培养基
成分        含量(g/L)
葡萄糖        10.0
甘油        10.0
棉籽粉a25.0
未调的pH＝6.3;没有调整
αPROFLO    Flour（Traders    Protein，Memphis，TN）。
被接种的生长性培养基在250ml广口Erlenmeyer烧瓶中置于摇床上在25℃保温约72小时，摇床以2英寸（5.08cm）的环以250rpm旋转。
B.罐发酵培养物A24603.1
为了提供更大体积的接种物，将如A部分所述制备的10ml经保温的振摇烧瓶培养基用于接种至400ml含有上述组成的第二期生长性培养基中。该第二期培养基被置于摇床上的2L广口Erlenmeyer烧瓶中，该摇床以2英寸（5.08cm）的环进行旋转，转速为250rpm，在25℃下培养培养物约23小时。
该第二期培养基（400ml）被用于接种115升含有下列组成的无菌生产培养基
生产培养基
成分        含量(g/L)
葡萄糖        25.0
玉米淀粉        10.0
Lexein        10.0
酶解的酪蛋白        4.0
赤糖糊        5.0
硫酸镁(无水)        5.0
CaCO32.0
去离子水        加至115升
未调的pH＝6.8;未调整
加入消泡剂：SAG 471b（0.2gm/L）
aNZ Amine A（Sheffield Chemical Co.，Norwich，NY）
bSAG 471（Union Carbide，Sistersville，WV）
被接种的生产培养基于大约25℃在115L搅拌的发酵罐中发酵4-5天。维持约45%空气饱和度的溶解氧水平。在搅拌容器中为低转速（180-330rpm）。
实施例2
分离和纯化渥曼青霉素
来自实施例1的发酵培养基通过一陶瓷滤器（Membralox    Systems，Illinois    Water    Treatment，Rockford，IL）过滤生成175L含渥曼青霉素的滤液。用5N盐酸将滤液的pH值调至约3.9。然后用1/2体积的乙酸乙酯洗脱滤液3次得到总体积207升，在真空中将其浓缩到6升。
6升的乙酸乙酯浓缩液在真空中被进一步浓缩形成深棕色的粘性油，向其中加入500ml甲醇，搅拌混合物直至所产生的结晶化完成，过滤并用冷甲醇简单冲洗，在真空中干燥产生20.4g渥曼青霉素。
在真空中再次浓缩甲醇上清液形成粘性油，溶解于180ml氯仿中并以溶解于氯仿的形式加样于12×20cm    Woelm    Grade    62二氧化硅柱上。在真空中浓缩5.0L氯仿洗液形成棕色油，然后再溶解于250ml热甲醇中，18小时后过滤收集所得的晶体，产生4.2g渥曼青霉素。对剩余的上清液重复上述结晶过程另外得到了1.9g渥曼青霉素。用HPLC确定渥曼青霉素。

Claims (8)

1、选自下列通式的化合物中的一种化合物制备抑制哺乳动物磷脂酰肌醇3-激酶的药物的用途：
Figure 941083985_IMG1
式Ⅰ中R是H或乙酸基：
Figure 941083985_IMG3
式Ⅲ中，R1是H、甲基或乙基；和
R2是H或CH3。
2、根据权利要求1的用途，其中所说的化合物是下列通式Ⅰ的化合物：
其中R是H或乙酸基。
3、根据权利要求2的用途，其中所说通式Ⅰ的化合物是其中的R为乙酸基的化合物。
4、选自下列通式的化合物中的一种化合物用于制备治疗哺乳动物磷脂酰肌醇3-激酶依赖性疾病的药物的用途：
Figure 941083985_IMG5
式Ⅰ中R是H或乙酸基;
Figure 941083985_IMG6
Figure 941083985_IMG7
式Ⅲ中，R1是H、甲基或乙基;
R2是H或CH3。
5、根据权利要求4的用途，其中所说的磷脂酰肌醇3-激酶依赖性疾病是肿瘤。
6、根据权利要求5的用途，其中所说的化合物是下列通式Ⅰ的化合物：
其中        R是H或乙酸基。
7、根据权利要求6的用途，其中所说的通式Ⅰ的化合物是其中的R为乙酸基的化合物。
8、根据权利要求4的用途，其中所说的化合物是下列通式Ⅱ的化合物：
Figure 941083985_IMG9
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