DK170617B1 - Pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904, fremgangsmåde til fremstilling heraf og farmaceutiske præparater indeholdende denne - Google Patents

Description

DK 170617 Bl i

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt pyra-zinoxidforbindelse NF-1616-904, en fremgangsmåde til fremstilling af denne forbindelse og farmaceutiske præparater til anvendelse som lægemidler ved behandling af sygdomme, 5 der skyldes superoxidgrupper, eller nephritis, der er ejendommelige ved, at de som den aktive bestanddel indeholder forbindelsen.

Pyrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 er ikke tidligere be-10 skrevet i litteraturen.

Forbindelsen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den har formlen (1) och3 AA J "\ΛΛ (i)

N J

H 0 20

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne.

Under henvisning til tegningen viser 25 fig. 1 ^H-NMR-spektret af et hidtil ukendt mellemprodukt NF-1616-902; fig. 2 viser -^C-NMR-spektret af denne forbindelse; og 30 fig. 3 viser IR-absorptionsspektret af denne forbindelse.

Som et resultat af et større videnskabeligt arbejde har det vist sig, at en ikke tidligere kendt forbindelse, der DK 170617 B1 2 har specifikke biologiske aktiviteter, kan frembringes ved at dyrke en mikroorganisme, der var isoleret fra en jordprøve i Iriomote-jima, Okinawa-ken, Japan. Det er således lykkedes at frembringe den omhandlede forbindelse NF-1616-5 904, der fremstilles ved at hydrolysere en hidtil ukendt forbindelse, der anvendes som mellemprodukt.

Fremstillingen af den hidtil ukendte forbindelse, der anvendes som mellemprodukt, og den omhandlede pyrazinoxid-10 forbindelse NF-1616-904 er nærmere forklaret nedenfor.

Mellemproduktet, der anvendes ved fremstillingen af den ønskede omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904, kan fremstilles ved at dyrke en mikroorganisme.

15

Som et specifikt eksempel på en mikroorganismestamme, der anvendes til at fremstille mellemproduktforbindelsen, kan anvendes stammen hørende til slægten Thielavia, der var isoleret fra en jordprøve i Iriomote-jima, Okinawa-ken, 20 Japan. Denne stamme blev betegnet Thielavia minor OFR-1561 og er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, under deponeringsnummeret FERM BP-1908.

25 De mykologiske egenskaber ved denne stamme er følgende: (a) Morfologi:

Mikroskopisk er cleistothecia kugleformede eller sub-kugleformede med en størrelse på 40 til 100 fim i dia-30 meter, mørkebrune, uden hals med glat overflade. Peri- dia er semi-transparente. Sporesækkene er 8-sporede og er åbne pære- eller æggeformede og af en størrelse på 20-25 x 11-15 |im, såvel som de flygtige. Ascosporerne er ellipsoide med en størrelse på 8-11 x 6-8 m i star DK 170617 B1 3 ten, farveløse, der bliver mørkt olivengrønne eller olivenbrune af farven. Begge sider af den glatte overflade er svagt ophøjede, og der dannes en enkel top kimspore. Der ses ikke conidier.

5 (b) Vækstformer på forskellige agardyrkningssubstrater: Visuel undersøgelse af kæmpekolonier, der voksede på forskellige agardyrkningsmedier ved dyrkning af stammen i 10 dage ved 37 °C.

10 i) Maltekstrakt-agardyrkningssubstrat

Vokser udmærket. Hvide vatagtige hypher vokser udmærket i ophobet form. Ascosporer dannes i rigelig mængde. Bagsiden af kolonierne er hvid el-15 ler mørkegrøn.

ii) Kartoffel-glucoseagardyrkningssubstrat

Vokser udmærket. Hvide vatagtige hypher er åbne. Ascosporer dannes i mindre antal. Bagsiden af ko- 20 lonierne er mørkegrøn.

iii) Sabouraud's agardyrkningssubstrat

Vokser udmærket. Hvide vatagtige hypher ses kun.

Der ses ikke dannelse af ascosporer. Bagsiden af 25 kolonierne er lysegul.

iv) YpSs-agardyrkningssubstrat

Vokser udmærket. Hvide hypher er spredt tyndt udover overfladen. Ascosporer er grå eller sorte og 30 i rigelig mængde på overfladen af kolonierne.

Bagsiden af kolonierne er farveløs.

(c) Fysiologiske egenskaber:

Væksttemperatur: 18 til 43 °C

DK 170617 B1 4 Vækst pH-område: pH 3 til 10.

Optimum væksttemperatur: 25 til 39 °C.

Optimum vækst pH-område: pH 5 til 8.

På basis af ovenfor beskrevne mykologiske egenskaber og efter fremgangsmåderne beskrevet i en artikel "The Genus Thielavia" af David Malloch og R.F. Cain i Mycologia, bind 5 65 (1973), side 1055-1077, og i en artikel "Les Thielavia des sols arides: especes nouvelles et analyse generique" af Jean Mouchacca i Bulletin Trimestriel Société Mycologi-que France, Bind 89 (1973), side 295-311, bestemtes denne stamme til at være en stamme hørende til Thielavia minor, 10 fordi overfladen af perithecium er glat, ascosporerne har en størrelse på 8-11 x 8 μπι, med en enkelt top kimspore, samt at den ikke danner conidier. Til slut betegnedes stammen Thielavia minor OFR-1561 (FERM BP-1908).

15 Mellemproduktet til anvendelse ved fremstillingen af den ønskede omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 fremstilles således ved at dyrke ovennævnte stamme Thielavia minor OFR-1561 eller en hvilken som helst mutant heraf hørende til slægten Thielavia, der er i stand til at frem-20 bringe ovennævnte mellemprodukt, i et passende dyrkningssubstrat. Dyrkning af ovennævnte mikroorganismer kan udføres på sædvanlig måde til dyrkning af almindelige mikroorganismer, og dyrkningen udføres sædvanligvis under aerobe betingelser, f.eks. som flydende kultur, rystekultur, gen-25 nemluftet omrørt kultur og lignende.

ψ

Med hensyn til dyrkningssubstratet, der kan anvendes til at dyrke mikroorganismerne, kan et hvilket som helst substrat, der indeholder næringskilder, der kan anvendes til 30 ovennævnte mikroorganismer hørende til slægten Thielavia, som f.eks. syntetiske dyrkningssubstrater, halvsyntetiske DK 170617 B1 5 dyrkningssubstrater, naturlige dyrkningssubstrater og lignende substrater anvendes. Med hensyn til carbonkilder ved fremstilling af dyrkningssubstratet kan anvendes glucose, saccharose, fructose, glycerol, dextrin, stivelse, melas-5 se, majsstøbevæske og organiske syrer, hver for sig eller som en kombination af disse. Med hensyn til nitrogenkilder ved fremstilling af dyrkningssubstratet kan organiske kilder, som f.eks. pharmasubstrater, pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, sojabønnemel, kasein, aminosyrer eller urin-10 stof anvendes og uorganiske nitrogenkilder, som f.eks. natriumnitrat eller ammoniumsulfat hver for sig eller som en blanding heraf. Eventuelt kan natriumsalte, kaliumsalte, magnesiumsalte, phosphater eller andre metalsalte være sat til dyrkningssubstratet. Udover ovennævnte kan, dersom 15 dyrkningssubstratet skummer noget, et hvilket som helst kendt skumdæmpende middel sættes til dyrkningssubstratet. Imidlertid bør en sådan tilsætning af skumdæmpende middel ikke have nogen uheldig indvirkning på frembringelsen af det ønskede mellemprodukt.

20

Dyrkningssubstrater pH bør fortrinsvis kontrolleres til den anvendte mikroorganismes optimale pH-område, idet pH sædvanligvis kontrolleres til omkring neutralt område. Væksttemperaturen bør kontrolleres til omkring den tempe-25 ratur, der er velegnet til dyrkning af mikroorganismen, sædvanligvis holdes temperaturen ved ca. 20-40 °C, sædvanligvis omkring ca. 30 °C. Dyrkningstiden er, når det drejer sig om flydende kultur, ca. 1 til 5 dage.

30 Ved ovennævnte dyrkning frembringes det ønskede mellemprodukt og akkumuleres i dyrkningsbouillonen. Som en følge heraf kan ovennævnte dyrkningsbetingelser på passende måde ændres afhængig af typen og egenskaberne ved den mikroorganisme, der anvendes, såvel som af de ydre betingelser.

DK 170617 B1 6

Optimale dyrkningsbetingelser kan således udvælges og kontrolleres afhængigt af disse faktorers indvirkning.

*

Dersom det ønskede mellemprodukt frembragt i dyrkningssub-5 stratet er akkumuleret til den maksimale mængde, kan den ønskede mellemproduktforbindelse fraskilles ved metoder, der sædvanligvis anvendes til opnåelse af fermenterings-produkter, f.eks. ved udsaltning, som udfældning med ammo-niumsulfat, ved dialyse, ekstraktion, forskellige gelkro-10 matografi-, ion-bytterkromatografi- og absorptionskromatografimetoder og lignende, hver for sig eller i en kombination heraf i optimal rækkefølge.

Mere specielt, da den ønskede mellemproduktforbindelse 15 frembragt ved ovennævnte dyrkning for det meste findes i dyrkningsbouillonen (filtratet), fraskilles myceliet fra den faste del af dyrkningsbouillonen først ved filtrering eller centrifugering, hvorefter det opnåede filtrat eks-traheres med ethylacetat, og det organiske lag af ekstrak-20 ten indeholdende den ønskede mellemproduktforbindelse koncentreres, hvorefter den koncentrerede væske kan underkastes rensning ved hjælp af kromatografi, som f.eks. søjlekromatografi, Sephadex LH-20 søjle (fremstillet af Pharmacia Fine Chemica. Inc.) kromatografi og lignende metoder.

25 Detaljer om rensningsmetoden er angivet i det efterfølgende eksempel 1.

Den således fremstillede mellemproduktforbindelse bestemmes ved hjælp af forbindelsens fysisk-kemiske egenskaber 30 som angivet nedenfor i eksempel 1. Man har betegnet dette mellemprodukt NF-1616-902. Mellemproduktet NF-1616-902 kan anvendes til fremstilling af den omhandlede pyrazinoxid-forbindelse NF-1616-904, og er også angivet under det farmakologiske forsøg 1 nedenfor, idet mellemproduktforbin- DK 170617 Bl 7 delsen af NF-1616-904, som sådan, er i besiddelse af visse specifikke biologiske og farmakologiske egenskaber, der bevirker nedsættelse af tolerancen af cancerceller over for forskellige antitumormidler, når den anvendes sammen 5 med disse antitumormidler. Mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 er således et anvendeligt middel til cancerterapi .

Den omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 frem-10 stilles ved at hydrolysere ovennævnte mellemproduktforbindelse NF-1616-902 under betingelser, der sædvanligvis anvendes til hydrolyse, i nærværelse af en alkaliforbindelse.

15 Når hydrolysen er fuldendt, kan den ønskede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 fraskilles ved hjælp af almindelige fraskillelsesmetoder og rensningsmetoder, som f.eks. opløsningsmiddelekstraktion, søjlekromatografi eller omkrystallisation. Mere specielt med hensyn til adskillelsen 20 f.eks. af den hydrolyserede blanding, der ekstraheres med ethylacetat, underkastes denne ekstrakt herefter for søjlekromatografi, f.eks. ved at anvende Sephadex LH-20 søjlen, og den opnåede fraktion herfra udkrystalliseres med methanol til på fordelagtig måde at opnå den ønskede pyra-25 zinoxidforbindelse NF-1616-904.

Den således fremstillede omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 er i besiddelse af en hæmmende virkning over for peroxidgrupper (O2-) frigjort fra makrofage celler af 30 marsvin ved stimulering, og er også i besiddelse af en anti-albuminuri-virkning ved Masufi nephritis. Den omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 er således et værdifuldt middel til at forhindre og behandle forskellige sygdomme forårsaget af ovennævnte peroxidgrupper, f.eks.

i DK 170617 B1 8 sygdomme inden for autoimmunområdet, som f.eks. rheumatoid arthritis, arteriosclerose, iskæmisk hjertesygdom, transient cerebral iskæmisk angreb, hepatisk insufficiens, renal insufficiens og lignende såvel som et værdifuldt middel 5 til at forhindre og behandle nephritis i forbindelse med forskellige kliniske tilstande.

Under anvendelsen af den omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 eller mellemproduktet NF-1616-902 som den ak-10 tive bestanddel i farmaceutiske præparater, kan hver af forbindelserne anvendes i en hvilken som helst form til almindelige farmaceutiske præparater, idet disse kan fremstilles under anvendelse af sædvanlige farmaceutisk acceptable bærestoffer. Eksempler på disse farmaceutisk accep-15 table bærestoffer udvælges afhængig af det pågældende farmaceutiske præparat, og omfatter fortyndingsmidler og hjælpestoffer, som f.eks. fyldstoffer, fortyndingsmidler, bindemidler, befugtningsmidler, henfaldsmidler, overfladeaktive midler eller glidemidler. De farmaceutiske præpara-20 ter kan vælges i en hvilken som helst ønsket enhedsform afhængig af terapiformålet, herunder som tabletter, piller, pulvere, væsker, suspensioner, emulsioner, granuler, kapsler, suppositorier, injektionspræparater (som f.eks. opløsninger eller suspensioner) eller salver.

25

Til fremstilling af tabletformer anvendes bærestoffer, der er alment anvendelige inden for dette område, som f.eks. hjælpestoffer, som lactose, saccharose, natriumchlorid, glucose, urinstof, stivelse, calciumcarbonat, kaolin, kry-30 stallinsk cellulose eller kieselsyre; bindemidler, som f.eks. vand, ethanol, propanol, almindelig sirup, glucose-opløsninger, stivelsesopløsninger, gelatineopløsninger, kaliumphosphat eller polyvinylpyrrolidon; henfaldsmidler, som f.eks. tørret stivelse, natriumalginat, agar-agar pul DK 170617 B1 9 ver, laminariapulver, natriumhydrogencarbonat, calciumcar-bonat, estere af polyoxyethylensorbitan fede syrer, natri-umlaurylsulfat, monoglycerid og stearinsyre, stivelse eller lactose; henfaldsinhibitorer, som f.eks, saccharose, 5 stearin, kakaosmør eller hydrogenerede olier; absorptions-acceleratorer, som kvaternære ammoniumbaser eller natri-umlaurylsulfat; befugtningsmidler, som glycerol eller stivelse; adsorptionsmidler, som stivelse, lactose, kaolin, bentonit eller kolloidalt kieselsyre; og glidemidler, som 10 renset talkum, stearinsyresalte, borsyrepulvere eller po-lyethylenglycoler. Eventuelt kan tabletterne yderligere overtrækkes med almindelige overtræksmaterialer til fremstilling af overtrukne tabletter, f.eks. tabletter overtrukket med sukker, tabletter overtrukket med gelatine-15 film, tabletter overtrukket med enteriske overtræk, tabletter overtrukne med film eller dobbeltlagtabletter og multilagtabletter.

Til fremstilling af piller kan bærestoffer, der er vel-20 kendte inden for fagområdet, også anvendes, som f.eks. hjælpestoffer som glucose, lactose, stivelse, kakaosmør, hydrogenerede vegetabilske olier, kaolin eller talkum; bindemidler som f.eks. pulveriseret gummi arabicum, pulveriseret tragacanth, gelatine og ethanol; henfaldsmidler, 25 som f.eks. laminaria og agar-agar.

Til fremstilling af suppositorier kan også anvendes bærestoffer, der er velkendte inden for dette fagområde, som f.eks. polyethylenglycoler, kokosnøddesmør, højere alkoho-30 ler, estere af højere alkoholer, gelatine og halvsyntetiske glycerider.

DK 170617 B1 10

Til fremstilling af kapsler blandes den aktive bestanddel med ovennævnte bærestoffer på almindelig måde, og blandingen fyldes i faste gelatinekapsler eller i bløde kapsler.

5 Til fremstilling af injektionspræparater steriliseres opløsninger eller suspensioner af den aktive bestanddel og indstilles fortrinsvis isotonisk med blodet. Til fremstilling af injektionspræparater i form af opløsninger, emulsioner og suspensioner kan et hvilket som helst fortyn-10 dingsmiddel, der sædvanligvis anvendes inden for fagområdet, også anvendes, som f.eks. vand, ethanol, polyethy-lenglycoler, propylenglycol, ethoxyleret isostearylalko-hol, polyoxyethyleret isostearylalkohol eller polyoxyethy-lensorbitan fede syrer estere. F.eks. kan en passende 15 mængde natriumchlorid, glucose eller glycerol sættes til de pågældende præparater for at gøre disse isotoniske. Yderligere kan almindelige opløsningsmidler, puffere, analgesiske midler og andre midler tilsættes, såvel som farvestoffer, konserveringsmidler, parfumemidler, smags-20 korrigerende midler, sødemidler og andre lægemidler kan eventuelt også sættes til de pågældende præparater.

Til fremstilling af pastaer, cremer og geler kan anvendes fortyndingsmidler, som f.eks. hvid petrolatum, paraffin, 25 glycerol, cellulosederivater, polyethylenglycoler, silico-ner og bentonit.

Mængden af den aktive ingrediens i ovennævnte farmaceutiske præparater er ikke specielt begrænset og kan udvælges 30 inden for et bredt område, idet de sædvanligvis udgør 1-70 vægt-% aktiv bestanddel i forhold til hele præparatet.

»

Administreringsmåden af det omhandlede farmaceutiske præparat er ikke specielt begrænset, og præparatet kan anven- DK 170617 B1 11 des i en række forskellige præparatformer afhængig af patientens alder, køn, symptomernes sværhedsgrad og øvrige tilstande ved patienten. F.eks. administreres tabletter, piller, opløsninger, suspensioner, emulsioner, granuler og 5 kapsler peroralt; injektionspræparater administreres intravenøst alene eller sammen med sædvanlige injicerbare transfusionsopløsninger, som f.eks. glucoseopløsninger eller aminosyreopløsninger; og eventuelt administreres injektionspræparaterne for sig intramuskulært, intrakutant, 10 subkutant eller intraperitonealt. Suppositorier administreres i rektum.

Dosering af ovennævnte farmaceutiske præparat kan udvælges afhængig af administreringsmåde, patientens alder og køn 15 og øvrige tilstand såvel som symptomernes sværhedsgrad, og den udgør sædvanligvis 0,5 til 30 mg/kg legemsvægt pr. dag aktiv ingrediens, idet det farmaceutiske præparat administreres 1 til 4 gange om dagen.

20 Den foreliggende opfindelse illustreres nærmere ved fremstillingseksemplerne af mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 og den omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 samt farmakologiske undersøgelser for hver af disse forbindelser.

25 EKSEMPEL 1

Fremstilling af mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 30 1) Dyrkning af Thielavia minor OFR-1561 (FERM BP-1908): 100 ml dyrkningssubstrat bestående af 30 g/liter stivelse, 5 g/liter glucose, 5 g/liter sojabønnemel, 1 g/liter gærekstrakt, 1 g/liter polypepton, 3 g/liter DK 170617 B1 12

CaCOg og 0,5 g/liter MgSO^ anbragtes i en konisk kolbe på 500 ml.

a

En platin-øsefuld mycelium af Thielavia minor ORF-1561 5 (FERM BP-1908) stammen, der er deponeret i Fermentati- .

on Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, udsået på en skråagarkultur, inokkule-redes i ovennævnte dyrkningssubstrat og underkastedes rystedyrkning eller roterende dyrkning ved 28 °C i 96-10 120 timer.

Ovennævnte mycelium af Thielavia minor ORF-1561 FERM BP-1908 dyrkedes og blev udstrøget på en skråagarkultur (pH 6,5) indeholdende 4% maltose, 1% polypepton og 15 2% agar i 1 uge under 30 °C.

2) Rensning af mellemproduktforbindelsen NF-1616-902:

Efter at have afsluttet ovennævnte dyrkning af Thiela-20 via minor OFR-1561 (FERM BP-1908) opnåedes 100 ml fil trat fra dyrkningsbouillonen ved filtrering.

Ovennævnte filtrat ekstraheredes med ethylacetat, og ethylacetatlaget koncentreredes, hvorefter det således 25 fremstillede koncentrat rensedes ved hjælp af sili- cagelsøjlekromatografi (elueringsmiddel: chloro form: ethylacetat = 2:1) til opnåelse af en aktiv fraktion. Den aktive fraktion underkastedes behandling på en Sephadex LH-20 søjle (fremstillet af Pharmacia Fine 30 Chemicals, Inc.), hvorefter de fraktioner, der eluere- de med elueringsmidlet (chloroform:methanol = 1:1) opsamledes og koncentreredes til opnåelse af den ønskede mellemproduktforbindelse NF-1616-902.

DK 170617 B1 13 3) Identifikation af den ønskede mellemproduktforbindelse:

Den således opnåede mellemproduktforbindelse NF-1616-5 902 havde følgende fysisk-kemiske egenskaber: (1) Rf-værdi ved TLC (tyndtlagskromatografi): Dersom et blandet opløsningsmiddel (benzen:ethylace- tat:methanol = 3:1:0,2) anvendtes som fremkalde- 10 ren, var Rf-værdien på TLC-plade (fremstillet af

Merck & Co., Inc.) 0,40.

(2) Farveforandring efter blanding med 50% H2SO4: Farven forandrede sig til gul.

15 (3) Opløselighed i forskellige opløsningsmidler:

Opløsningsmiddel Opløselighed_

Ethylacetat ++ (lidt opløselig)

Hexan - (uopløselig)

Dimethylsulfoxid +++ (let opløselig)

Chloroform ++ (lidt opløselig)

Benzen + (knapt opløselig)

Methanol +++ (letopløselig)

Vand - (uopløselig) (4) Smeltepunkt: 20 Ikke i krystalform, derfor en forbindelse af ikke- definerbar form, der ikke gav noget klart smeltepunkt; den sintrer ved temperaturer fra 191 til 194 °C.

25 (5) Massespektrum (El): (M+) = 327.

DK 170617 B1 14 (6) FAB (hurtig atombombardement) massespektrum: [M + 1]+ = 653 [M + Na]+ = 675 5 (7) Ultraviolet absorptionsspektrum (ethanol): 1% λιηθχ (E·^ cm) = 352 (233, ε = 15160) 287 (256, ε = 16680) 235 (skulder) 232 (791, ε = 51550 (8) Optisk drejning: 26 [a]D = 775 (c=l, CHCI3) 10 (9) Kernemagnetisk resonansspektrum (-*-H-NMR):

Bestemt i DMSO-Dg ved 400 MHz.

Resultaterne er angivet i fig. 1.

15 δ = 7,36 (d, J = 7,6, 2H), 7,12 (s, 2H), 7,05 t, J

= 7,6, 2H), 6,67 (t, J = 7,6, 2H), 6,65, d, J = 7,7, 2H), 6,03 (s, 2H), 3,86 (d, J = 17,6, 2H), 3,72 (s, 6H), 3,47 (d, J = 17,6 2H), 2,61 (dd, J = 12,7 og 7,1, 2H), 2,53 (dd, J = 12,7 og 7,1, 2H), 20 2,05 (m, 2H), 0,84 (d, J = 7,1 12H).

(10) Kernemagnetisk resonansspektrum (^C-NMR):

Bestemt i CD3OD ved 50 Mhz, idet resultaterne af 13C-NMR er angivet i fig. 2. De fleste af toppene 25 på kortet er følgende: δ = 156,5, 150,0, 144,0, 142,6, 131,6, 131,3, 4 128,8, 126,3, 120,8, 111,4, 85,4, 62,1, 60,0, 37,0, 34,5, 27,1, 23,0.

DK 170617 B1 15 (11) Infrarødt absorptionsspektrum (IR):

Det infrarøde absorptionsspektrum under anvendelse af KBr-metoden er angivet i fig. 3, hvor hovedabsorptionsbåndene er følgende: 5 3352, 2950, 2852, 1680, 1610, 1480, 1425, 1371, 1330, 1315, 1255, 1240, 1182, 1092, 1018, 750 cm"1.

Farmakologiske forsOg 1 10

Evne til at_sænke_tolerancen over for_Vineristin i P388/VCR-celler

Denne undersøgelse udførtes ved samme metoder som beskre-15 vet i en artikel af T. Tsuruo, et al. i Cancer Research, bind 44 (1984), side 5095-5099.

Først opslæmmedes P388/VCR-celler til en koncentration på 5 x 104 celler/ml i et dyrkningssubstrat af RPMI-1640 + 20 10% føtalt kalveserum (FCS) + 10 μιη 2-mercaptoethanol.

Herefter fremstilledes en opløsning ved at opløse mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 i dimethylsulfoxid (DMSO), hvorefter en forudbestemt mængde af denne opløsning sattes til ovennævnte suspension af P388/VCR-celler.

25 På samme måde sattes Vineristin til ovennævnte cellesuspension ved at fremstille række-tofold fortyndinger, og hver af cellesuspensionerne inkuberedes i en inkubator, der var fyldt med 5% CO2 + 95% luft i 48 timer. Overlevel-30 sesgraden af cellerne bestemtes, og koncentrationerne af forbindelsen NF-1616-902 for at sænke cellernes tolerance over for Vineristin opnåedes.

Resultaterne af undersøgelsen er angivet i tabel 1.

DK 170617 B1 16 TABEL 1

Koncentration af forbin Cytotoxisk koncen- delse NF-1616-902 (μιη/ml) tration af Vineristin i _(ng/ml)_

Kontrolgruppe_0_100_ .

Forsøgsgruppe 10 1

Forsøgsgruppe 5 4

Forsøgsgruppe_2,5_20_

Som det fremgår af resultaterne angivet i tabel 1, er mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 i besiddelse af en evne til sænke tolerancen af cancerceller over for Vineristin, 5 når den anvendes sammen med Vineristin. Sædvanligvis er opnåelse af tolerance af cancerceller over for et antitumormiddel et af de vigtigste problemer ved udførelse af cancerterapi. Som angivet ovenfor er mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 i stand til at kunne anvendes som 10 middel ved cancerterapien af den grund, at dersom mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 anvendes sammen med et anti-tumormiddel (i dette tilfælde Vineristin), kan der forventes en virkning i form af at sænke cancercellers tolerance over for det pågældende anti-tumormiddel. Udover 15 dette blev det fastslået, at virkningen af mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 ikke er begrænset til kun at anvendes sammen Vineristin, men også er effektivt, dersom den anvendes sammen med andre anti-tumormidler, som f.eks. Daunomycin, Vinblastin, Mitomycin eller Belomycin.

20 DK 170617 B1 17 EKSEMPEL 2

Fremstilling· af den omhandlede pyrazlnoxidforbindelse NF-1616-904 5

Mellemproduktforbindelsen NF-1616-902 fremstillet i eksempel 1 opløstes i methanol, og 2N-NaOH-opløsning tilsattes i en mængde på 2:1 (rumfang til rumfang), hvorefter blandingen henstod 48 timer ved stuetemperatur. Herefter neu-10 traliseredes blandingen 6N-HC1, og der ekstraheredes med ethylacetat, ekstrakten underkastedes søjlekromatografi under anvendelse af en Sephadex LH-20 søjle, og der elue-redes med et opløsningsmiddel af chloroform:methanol (2:1), hvorved der opnåedes den ønskede pyrazinoxidforbin-15 delse NF-1616-904, der herefter udkrystalliseredes med methanol. Den således fremstillede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 underkastedes strukturanalyse ved hjælp af røntgenkrystallografi. Følgende krystallografiske resultater opnåedes: 20

Krystallografiske resultater for C-^ø^iNgOg:

Triklin, rumgruppe PI, a = 10,804 (4) b = 12,786 (5) 25 c - 13,564 (6) Å oc = 86,07 (3) β = 107,00 (3) γ = 106,93 (3) 2 = 4 30

Som et resultat af den strukturmæssige fastlæggelse udført ved den direkte metode fra MULTAN-programmet bekræftedes den kemiske opbygning af pyrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 til at være som angivet for formlen (1) vist ovenfor.

DK 170617 B1 18

De fysisk-kemiske egenskaber af pyrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 er følgende: (1) Udseende: Gule krystaller (omkrystallisation med 5 methanol).

* Λ (2) Smeltepunkt: 223,5-225,5 °C.

(3) Massespektrum (El): (M+) = 327, 311, 310, 268, 193.

10 (4) Ultraviolet absorptionsspektrum (ethanol): 1%

Xmax (cm) = 354 (233, s = 7370) 287 (skulder) 15 279 (326, s = 10320) 273 (skulder) 220 (1558, S = 49390) (5) Kernemagnetisk resonans spektrum (-^H-NMR): 20 Bestemt i DMSO-dg ved 250 MHz.

Resultaterne af ^H-NMR er følgende: 6 = 11,96 (bs, IH), 10,97 (s, IH), 7,59 (d, J = 7,8 IH), 7,36 (d, J = 7,9, IH), 7,27 (d, J = 2,1, IH), 7,08 (dt, J = 1,3 og 7,8, IH), 6,99 (dt, J = 1,3 25 og 7,8, IH), 3,93 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 2,62 (d, J = 7,2, 2H), 2,11 (m, IH), 0,86 (d, J = 6,7, 6H).

(6) Kernemagnetisk resonansspektrum (-^C-NMR);

Bestemt i CDCI3-CD3OD ved 62 MHz.

30 Resultaterne af ^C-NMR er følgende: δ = 157,82, 143,88, 142,24, 137,20, 131,06, 127,21, 124,27, 122,42, 119,60, 118,72,. 112,09, 109,36, * 62,08, 33,99, 26,53, 24,60, 23,04.

DK 170617 B1 19 (7) Infrarødt absorptionsspektrum (IR): Følgende absorptionsbånd observeredes ved IR-ab-sorptionsspektralanalyse under anvendelse af KBr-metoden.

5 3250, 2950, 2910, 1620, 1450, 1409, 1370, 1330, 1241, 1090, 990, 735 cm-1.

Farmakologiske undersøgelsesmetoder 2 10 Hæmmende virkning af pvrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 over for peroxidgrupper_(02") frigjort fra peritoneale makrofage celler fra marsvin ved stimulering: 15 Mineralolie administreredes intraperitonealt til et marsvin, hvorefter der 96 timer efter administreringen opnåedes peritoneale makrofage celler.

Peroxidgrupper (O^) bestemtes ud fra reduktion af cyto-20 chrom C udført som beskrevet i en artikel af T. Matsumoto et al. I Biochemical and Biophysical Research Communications, bind 88, nr. 3 (1979), side 974-979.

Peritoneale makrofage celler sattes således i en slutkon-25 centration på 2 x 10^-celler/ml til 1 ml 80 μπι cytochrom C opløsning, hvorefter pyrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 yderligere tilsattes for at udgøre undersøgelsesgruppeprøven. På den anden side tilsattes vand i stedet for pyrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 for at udgøre kontrolgrup-30 peprøven. Både undersøgelsesgruppe- og kontrolgruppeprøver underkastedes simpel inkubation i 1 minut ved 37 °C.

Som det stimulerende middel for at frigøre peroxidgrupper (02“) tilsattes formylmethionylleucylphenylalanin (FML) DK 170617 B1 20 til en slutkoncentration på 10“^ M til ovennævnte forsøgsgruppeprøve og kontrolgruppeprøve. Herefter underkastedes begge prøver yderligere omsætning i 1 minut.

5 Forskelle i absorbans målt ved 550 nm (OD55q) for både un- v dersøgelsesgruppe og kontrolgruppeprøver bestemtes, og den 50% hæmmende koncentration (IC^q) blev opnået ved at beregnes som forholdet mellem OD550 af undersøgelsesgruppeprøven i forhold til kontrolgruppeprøven. Den opnåede 10 ICgQ-værdi var 1,2 x 10“^ g/ml.

Farmato-logisk undersøgelse 3

Anti-albuminur i-virkning af pyrazinoxidforbindelsen_NF-- 15 1616-904 ved Masugi nephritis

Rotte nephrotoxin (i det efterfølgende betegnet "NT") fremstilledes på følgende måde. Nyrebark fra en rotte homogeniseredes med samme mængde fysiologisk saltvand, hvor-20 ved der opnåedes et homogenat, der blandedes med Freund’s komplette adjuvans (fremstillet af Difco Laboratories,

Inc., Detroit, Michigan, USA) i forholdet 1:1. Herefter administreredes 2 ml af denne blanding subkutant til en kanin (legemsvægt 3,1 kg) for at immunisere kaninen. 1,5 25 måneder efter immunisering udtoges blod fra kaninens hjerte, og der opnåedes serum herfra. Det opnåede serum inak-tiveredes 30 minutter ved 56 °C og underkastedes herefter fraktionering ved udsaltning med en vandig opløsning mættet med 40% ammoniumsulfat. Ved opsamling af immunoglobu-30 lin-y-globulin (IgG) fraktionen opnåedes det Ønskede NT.

Selve undersøgelsen udførtes under anvendelse af Wistar- ά stamme hanrotter med en legemsvægt på 150-160 g. Den omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904 blev tvangs • .r DK 170617 B1 21 fodret samtidig med NT til rotterne. Herudover administreredes 1 ml NT intravenøst i halevenen af rotten. På den anden side administreredes i stedet for pyrazinoxidforbin-delsen NF-1616-904 fysiologisk saltvand til andre rotter, 5 der herved udgjorde kontrolgruppen.

Den totale mængde urinprotein udskilt i urinen i løbet af 24 timer efter administrering af NT bestemtes ved hjælp af den turbidimetriske metode under anvendelse af sulfosali-10 cylsyre og bovint serumalbumin (BSA) som referenceforbindelsen efter metoderne, der er beskrevet i en artikel af F. Kingsbury et al., i J. Lab. Clin. Med., bind 11 (1926), side 981-989.

15 Hæmningsforholdet for albuminuri (%) i forsøgsgruppen beregnedes ved at sammenligne med den målte værdi i kontrolgruppen. Forsøgsresultaterne er angivet i tabel 2, hvor hver af undersøgelsesresultaterne er angivet ved gennemsnitsværdi ± standardafvigelse for seks rotter, der anven-20 des både i undersøgelses- og kontrolgrupperne.

TABEL 2

Dosis af pyrazin- Hæmningsoxidforbindelsen størrelse NF-1616-904 (mg/kg) Albuminuri af albumin- _(mg/dag) uri (%)_

Kontrolgruppe (6 rotter) _0 mg/kg_120 + 30_-_

Undersøgelsesgruppe (6 rotter) 60 mg/kg 88 ± 18 26,7 _30 mg/kg_45 ± 16_62, 5_ DK 170617 B1 22

Som det fremgår af ovennævnte forsøgsresultater opnået ved den farmakologiske undersøgelse 2 og 3, udviser pyrazin-oxidforbindelsen NF-1616-904 klart hæmmende virkning over for peroxidgrupper, ligesom den udviser antialbuminuri-5 virkning ved nephritis. Den omhandlede pyrazinoxidforbin-delse NF-1616-904 kan således anvendes til at forhindre og behandle ikke alene nephritis, men også forskellige sygdomme forårsaget af peroxidgrupper, som f.eks. autoimmune sygdomme, som rheumatoid arthritis, arteriosclerose, iskæ-10 misk hjertesygdomme, transsient celebralt iskæmisk angreb, hepatisk insufficiens og renal insufficiens.

DK 170617 B1 23

Eksempel på farmaceutisk præparat:

Et farmaceutisk præparat indeholdende pyrazinoxidforbin-delsen NF-1616-904 som en aktiv ingrediens fremstilledes 5 med følgende sammensætning:

Den omhandlede pyrazinoxid-forbindelse NF-1616-904 150,0 g

Citronsyre 1,0 g

Lactose 33,5 g

Dicalciumphosphat 70,0 g

Pluronic F-68 30,0 g (Varemærke for en række polyoxyalkylen-derivater af propylenglycol, fremstillet af BASF-Wyandott Corp., N.J., USA)

Natriumlaurylsulfat 15,0 g

Polyvinylpyrrolidon 15,0 g

Carbowax 1500 4,5 g (Varemærke for en række polyethylenglycoler fremstillet af Union Carbide Corp., N.Y., USA)

Carbowax 6000 45,0 g

Majsstivelse 30,0 g Tørret natriumlaurylsulfat 3,0 g Tørret magnesiumstearat 3,0 g

Ethanol q. s.

Den omhandlede pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904, citronsyre, lactose, dicalciumphosphat, Pluronic F-68 og natriumlaurylsulfat blandedes grundigt til fremstilling af en 10 blanding. Den fremstillede blanding sigtedes gennem en sigte nr. 60, hvorefter den sigtede pulverblanding underkastedes vådgranulering med en ethanolopløsning indeholdende polyvinylpyrrolidon, Carbowax 1500 og Carbowax 6000. Pulverblandingen formedes til pastalignende klumper ved 15 eventuelt at tilsætte en passende mængde ethanol. Majssti- 24 DK 170617 B1 velse sattes til disse klumper, og der æltedes grundigt til omdannelse af klumperne til granuler med ensartet partikelstørrelse. De fremstillede granuler sigtedes gennem en sigte nr. 10, hvorefter de sigtede granuler anbragtes 5 på en bakke og tørredes 12-14 timer i en ovn ved 100 °C. De tørrede granuler sigtedes gennem en nr. 16 sigte og sattes herefter til tørret natriumlaurylsulfat og tørret magnesi-umstearat, hvorefter hele blandingen blandedes grundigt og blev slået til den ønskede form under anvendelse af en 10 tabletteringsmaskine, hvorved der opnåedes tabletter, der kunne anvendes som kernedele i overtrukne tabletter. Kernedelene behandledes med lak, og den behandlede overflade blev herefter overtrukket med talkum for at forhindre, at overfladen absorberede fugtighed. Den behandlede overflade 15 af kernedelene blev yderligere overtrukket med en primær beklædning og herefter yderligere overtrukket med en lak for at opnå et tilstrækkeligt antal lag til at fremstille overtrukne tabletter til peroral administrering. For at fremstille overtrukne kernedele af tabletterne af fuld-20 stændig sfæriske former og for at gøre den behandlede overflade glat, blev de overtrukne tabletter yderligere overtrukket med primære overtrækslag og glatte overtrækslag. Den overtrukne tablet blev farveovertrukket, indtil der opnåedes den ønskede farveoverflade. Herefter tørredes 25 de overtrukne tabletter, og overfladen poleredes til opnåelse af en ensartet glans.

Λ

Claims (4)

1. Pyrazinoxidforbindelse NF-1616-904, kendeteg-5 net ved, at den har formlen (1) och3 -ί

10 J (1) N II H 0

2. Fremgangsmåde til fremstilling af pyrazinoxidforbindel- sen NF-1616-904 med formlen (1), kendetegnet ved, at man hydrolyserer mellemproduktet NF-1616-902, der er fraskilt et dyrkningssubstrat af mikroorganismen Thie-lavia minor OFR-1561 (FERM BP-1908). 20

3. Farmaceutisk præparat til anvendelse som lægemiddel ved behandling af sygdomme, der skyldes superoxidgrupper, kendetegnet ved, at det som aktiv ingrediens indeholder pyrazinoxidforbindelsen NF-1616-904 med formlen 25 (I) ifølge krav 1.

4. Farmaceutisk præparat til anvendelse som lægemiddel ved behandling af nephritis, kendetegnet ved, at det som den aktive bestanddel indeholder pyrazinoxidfor- 30 bindeisen NF-1616-904 med formlen (1) ifølge krav 1.