KR100273743B1

KR100273743B1 - 콜레스테롤 생합성 억제효과를 가지는 스트렙토마이세츠 스피시즈 yb-401 배양액 추출 제제 마크로락틴 에프

Info

Publication number: KR100273743B1
Application number: KR1019980009554A
Authority: KR
Inventors: 최성원; 박하림; 최학종; 박석준; 여익현; 남승우; 배동훈; 유주현; 오두환
Original assignee: 남승우; 주식회사풀무원; 유주현
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2001-01-15
Also published as: KR19990075383A

Abstract

본 발명은 콜레스테롤 생합성의 억제효과를 나타내는 미생물 배양액으로부터 추출한 마크로락틴 에프에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생체내 콜레스테롤 생합성과정중의 속도조절단계인 스쿠알렌 합성효소(sqalene synthase)의 활성을 저해하는 미생물 배양액 추출 제제인 마크로락틴 에프에 관한 것이다. 마크로락틴 에프는 농도의존적으로 스쿠알렌 합성효소를 저해하는 활성을 가지므로, 마크로락틴 에프로 콜레스테롤 생합성이 저해시키면, 세포에 저밀도 저단백-콜레스테롤 수용체(LDL-cholesterol receptor)의 합성이 촉진되어, 결국 혈액내의 콜레스테롤의 수치가 낮아지게 된다. 아울러, 마크로락틴 에프는 임상실험 등에 의해 본격적으로 약제로 개발될 경우 동맥경화증 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 수 있을 것이다.

Description

콜레스테롤 생합성 억제효과를 가지는 스트렙토마이세츠 스피시즈 YB-401 배양액 추출 제제 마크로락틴 에프

본 발명은 콜레스테롤 생합성의 억제효과를 나타내는 미생물 배양액으로부터 추출한 마크로락틴 에프에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생체내 콜레스테롤 생합성과정중의 속도조절단계인 스쿠알렌 합성효소(sqalene synthase)의 활성을 저해하는, 미생물 배양액 추출 제제인 마크로락틴 에프에 관한 것이다. 미국을 비롯한 외국의 경우는 물론이거니와 한국에서도 사망원인 중 가장 높은 비중을 차지하는 사망원인은 심혈관계 질환인데, 이러한 질환은 혈장의 콜레스테롤 농도수준과 밀접한 관계가 있다는 것으로 알려져있다.

한국인의 혈장콜레스테롤 농도는 서양인의 농도수준에 비하여 아직 낮은 범위이지만 최근 20∼30년 사이에 10mg/㎗이상 높아졌으며, 특히 낮은 연령층에서의 상승이 두드러지고 있다. 그 결과 최근 수년간 고혈압증, 뇌혈관장애, 심질환의 환자수는 해를 거듭할수록 증가하고 있으며, 심근경색환자의 연령은 점차 낮아지고 있다. 이러한 변화는 동물성 지방과 단백질 섭취량이 현저히 증가한 한국인의 식생활 변화에서 그 원인을 찾을 수 있다.

한편, 콜레스테롤은 탄소수 27개로 이루어진, 물에 불용성인 스테로이드(steroid)계 화합물로서, 동물세포의 필수적인 막성분일 뿐만 아니라 프로게스틴(progestins), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 성호르몬인 앤드로겐(androgens)과 에스트로겐(estrogens)의 전구제로 작용하며, 장으로부터 지방이나 지용성 비타민의 흡수에 필요한 담즙산(bile acids)의 형성, 간으로부터 지방을 말초조직으로 운반하기 위해 간에서 형성되는 초저밀도지방단백(VLDL; very-low-density lipoprotein)의 형성에도 사용되어 진다.

콜레스테롤은 그의 축적이나 이용을 하기 위해서 합성 또는 흡수한 조직으로부터 필요로 하는 조직까지 운반되어야 하고 트리글리세라이드(triglyceride)와 마찬가지로 혈장에서 지방단백질형태로 존재하면서 이동되고 대사된다. 이들 지방단백질의 이동 및 대사경로를 보면 식품을 통해 장에서 흡수된 콜레스테롤과 트리글리세라이드(triglyceride)는 유미지립(chylomicrons) 형태로 만들어지고 혈류를 따라 지방 및 근육조직의 모세혈관으로 가서 지단백 분해효소(lipoprotein lipase)의 작용을 받아 트리글리세라이드(triglyceride)가 분해되어 잔여유미지립(chylomicron remnants)이 된다. 이는 간세포에 의해 섭취, 분해되어 콜레스테롤로 유리되며 세포막, 담즙산, 스테로이드 호르몬 형성에 사용된다.

또한, 간은 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 분비할때 주로 초저밀도지방단백의 형태로 분비하며 이는 혈관벽의 지단백 분해효소의 작용으로 트리글리세라이드가 제거되면서 중간밀도 지단백(IDL; intermediate-density lipoprotein)으로 변하고 중간밀도 지단백은 잔여 트리글리세라이드가 제거되어 저밀도지단백(LDL; low-density lipoprotein)으로 변하게 되는데, 저밀도 지단백은 장기간 혈액내에 체류하게 되며 혈장 콜레스테롤의 대부분(60-70%)은 저밀도 지단백 형태로 존재하게 된다. 혈중 저밀도 지단백은 간 및 말초조직에 의해 다시 섭취된다. 말단조직의 잉여 콜레스테롤은 역전이 시스템(reverse cholesterol transport system)을 거쳐 다시 간으로 수송되어 담즙산염(bile salts)의 형태로 장으로 분비되어 배출된다.

혈중의 LDL은 세포막의 LDL-수용체를 통해 세포내로 이동되는데 세포내 콜레스테롤의 농도가 높을 경우 LDL-수용체의 합성속도는 감소되며 혈액으로부터 콜레스테롤의 흡수가 느려진다. 혈중 콜레스테롤의 수준이 높을 경우에 심각한 병에 이를 수 있는데 생합성에 의한 콜레스테롤과 식품으로 섭취된 콜레스테롤의 양이 세포막, 담즙산, 스테로이드 호르몬의 합성에 필요한 양 이상일 경우에 혈관내에 콜레스테롤의 축적이 일어나 혈관을 좁혀 혈류를 방해할 수도 있으며, 심할 경우에는 혈관의 폐색(관상 동맥경화)이 일어나 혈류를 정지시켜 조직이 사멸되기까지 한다. 현재 이러한 심혈관 질환을 일으키는 주요 위험 요인으로 혈장 콜레스테롤 수준의 증가, 특히 LDL-콜레스테롤의 증가를 들고있는데 따라서 이를 정상 수준으로 유지하는 것이 심혈관 질환을 방지하는 목적이 되고 있다. 사람의 경우 하루에 대략 300∼500mg의 콜레스테롤이 식이중으로 섭취가 되며 700∼900mg정도가 체내에서 합성이 되어지는데 체내 총 콜레스테롤의 2/3가량이 체내에서 직접 합성이 되어지기 때문에 콜레스테롤 생합성을 저해함으로써 LDL-receptor의 합성 속도를 증가시켜 혈장 콜레스테롤 수준을 낮추는 방법이 효과적인 것으로 여겨지고 있다.

지금까지의 심혈관 질환의 치료제는 혈장 콜레스테롤을 낮추는 제제, 동맥 경화증상을 경감·완화시키는 제제, 심혈관 질환의 진전을 차단 또는 역전시키는 제제의 3가지로 구분할 수 있다. 이들 중에서 혈장 콜레스테롤을 낮추는 제제가 가장 광범위하게 사용되고 있으며 주로 혈중 LDL-cholesterol이나 총 콜레스테롤의 수준을 낮추는 작용을 한다. 이 제제는 작용기작에 따라 세포내 콜레스테롤의 이화작용을 촉진함으로써 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 담즙산 격리제(bile acid sequestrant), 피브르산(fibric acid)의 유도체, 니코틴산(nicotinic acid)과 프로부콜(probucol)등이 있으며, 콜레스테롤 생합성 조절효소인 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A reductase)를 저해하여 LDL-수용체의 합성 속도를 증가시켜 혈장 콜레스테롤 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 컴팩틴(compactin) 유도체인 로바스타틴(lovastatin), 프로바스타틴(pravastatin), 심바스타틴(slmvastatin)등이 있으며 콜레스테롤 전달효소인 acyl-Co A: cholesterol acyltransferase (ACAT)의 활성을 저해하여 콜레스테롤의 흡수를 저해시킴으로써 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 일본에서 주로 개발된 퍼팩틴(purpactin), 에피코리퀴논(epicohliquinone), 아카테린(acaterin), 헬민토스포롤(helminthosporols), 락테리틴(lacteritin), 짚세틴(gypsetin), 엔니아틴(enniatins), 글리소프레닌(glisoprenins), 피리피로펜(pyripyropenes), 터펜돌(terpendoles) 등으로 나눌 수 있다.

이외에도, HDL에 있는 콜레스테롤을 LDL로 전달하는 효소인 cholesterolester transfer protein(CETP)을 저해함으로써 고지혈증을 억제하여 동맥경화증을 예방하고자 하는 시도가 미국의 Upjohn Co., Merck Co.를 비롯한 많은 제약회사에서 진행되고있다. 또한, 콜레스테롤 합성에 관여하는 중요한 효소인 스쿠알렌 합성효소(SQS, squalene synthase)의 저해제를 탐색하는 연구가 최근에 새로이 시작되어 Merk사의 자라고즈산(zaragozic acid) 및 Glaxo사의 스쿠알레스타틴(squalestatin) 등의 신물질을 미생물로부터 분리한 것이 보고되고 있다.

SQS는 아세틸-CoA에서 시작하여 콜레스테롤이 합성되는 콜레스테롤 생합성과정중에서 FPP(farnesyl pyrophosphate)가 스쿠알렌으로 전환되는 단계를 촉매하는 효소이다. SQS 저해제는 상술한 HMG-CoA 저해제와는 달리 콜레스테롤 생합성 경로상 하류(downstream)에 해당하는 효소를 저해하는 것이기 때문에 HMG-CoA에 의해 파생되는 많은 생체내 이소프레노이드(isoprenoid)물질들의 전구체 비생성 현상이 나타나지 않아, HMG-CoA 저해제에 의한 여러 가지 부작용을 막을 수 있을 것으로 기대된다. 즉, 포유동물의 이소프레노이드 합성 경로는 스테롤을 형성할 뿐만 아니라 돌리콜(dolichol), 유비퀴논(ubiquinone), 헴 A의 파네실 그룹(farnesyl groups of heme A), 프레닐화된 단백질의 파네실 & 제라닐제라닐 그룹(farnesyl & geranylgeranyl groups of prenylated proteins), 이소펜테닐 아데닌의 이소펜테닐 곁사슬(isopentenyl side chain of isopentenyl adenine)등도 형성하는데 SQS 저해제는 HMG-CoA 환원효소 저해제와는 달리 이러한 다른 이소프레노이드 합성에는 영향을 주지 않으면서 콜레스테롤 합성을 저해할 수 있을 것으로 예상되기 때문에, 현재 치료제로 개발되어 있는 HMG-CoA 환원효소 저해제에 비해 부작용이 적을 것으로 기대되는 것이다(참조 제1도).

이에, 본 발명자들은 토양 미생물로부터 신규의 SQS저해제를 찾아내고자 노력한 결과, Streptomyces sp. YB-401(KCCM 10119)로부터 분리한 마크로락틴 에프(Macrolactin F)가 선택적인 항균활성, 항암효과, 항바이러스효과 외에, SQS의 활성을 저해하는 신규의 활성도 가지고 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 마크로락틴 에프를 이용한 콜레스테롤 생합성의 저해방법을 제공하는 것이다.

제1도는 아세틸-CoA로부터 콜레스테롤의 생합성과정을 나타내는 그림이다.

제2도는 Streptomyces sp. YB-401(KCCM 10119)의 아세톤추출액을 WK-10 컬럼 크로마토그래피한 크로마토그램이다.

제3도는 HP-20 컬럼 크로마토그래피한 크로마토그램이다.

제4도는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

제5도는 Streptomyces sp. YB-401(KCCM 10119)로부터 정제하여 수득한, 스쿠알렌 합성효소의 저해능을 가진 화합물의¹H-NMR 결과를 나타내는 분광 스펙트럼이다.

제6도는 Streptomyces sp. YB-401(KCCM 10119)로부터 정제하여 수득한, 스쿠알렌 합성효소의 저해능을 가진 화합물의¹⁴C-NMR 결과를 나타내는 분광 스펙트럼이다.

제7도는 마크로락틴 에프의 농도에 따른 스쿠알렌 합성효소의 활성 저해 정도를 나타내는 표이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다.

본 연구자들은 Streptomyces sp. YB-401의 배양액을 아세톤으로 추출하고 그 추출물을 WK-10 컬럼 크로마토그래피하여 활성분획을 모았고 이를 다시 HP-20 컬럼 크로마토그래피하여 활성분획을 모아 에틸아세테이트로 추출하였다. 이 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 결정 화합물을 얻었다. 이 화합물의 여러 가지 물리 화학적 특성을 조사하고 자외선(UV), 질량(MS) 및 핵자기 공명(NMR) 분광기로 그 구조를 분석한 결과 선택적 항균활성, 항암활성, 항바이러스활성을 간지는 것으로 공지된 마크로락틴 에프라는 기지의 물질임을 확인하였다.

마크로락틴 에프의 SQS에 대한 활성 저해 정도를 농도별로 측정한 결과 농도 의존적으로 SQS 활성을 억제함을 확인하였다.

따라서, 마크로락틴 에프로 콜레스테롤 생합성을 저해시키면, LDL-콜레스테롤 수용체의 합성이 촉진되어, 혈액내의 콜레스테롤 수치가 낮아지게 된다. 아울러, 마크로락틴 에프는 임상실험 등에 본격적으로 약제로 개발되어 동맥경화증 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[돼지의 간으로부터 SQS의 제조]

SQS를 제조하기 위해 돼지 간 100g을 잘게 썰어서 충분히 다지고 200ml의 균질화 용액(0.3M 수크로즈/ 5mM DTT/ 10mM MgCl₂/ 50mM KCl를 포함한 0.1M 인산완충액 pH 7.4)을 가하여 균질화시킨 다음, 4,0OO×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취하고 다시 15,000×g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이어, 수득한 상등액을 105,000×g에서 1시간동안 초원심분리하여 마이크로좀(microsome)을 침전시키고 50ml의 상기 균질화 용액을 첨가해 세척한 후에 충분히 균질화시키고 105,000×g에서 30분간 초원심분리하여 마이크로좀을 침전시켰다. 이렇게 침전된 microsome을 2ml의 균질화 용액을 현탁시켜 SQS의 효소 원으로 사용하였다.

[실시예 2]

[백쥐의 간으로부터 SQS의 제조]

수컷 백쥐(Sprague-Dawley계, 150-25Og)를 에테르를 이용하여 마취시켜 개복한 후 간문맥에 0.25 M 수크로스용액을 주사기로 주입하여, 간내의 혈액을 최대한 제거하였다. 간을 조심스럽게 잘라내어 잘게 썰어서 충분히 다지고, 2배 부피의 균질화 완충액을 첨가한 다음 균질화시켰다. 다시 상등액을 취해 105,000×g에서 1시간 초원심분리를 해 마이크로좀을 침전시켰다. 세척을 목적으로 50ml의 균질화 완충액을 첨가해 균질화시키고 105,000×g에서 30분간 초원심분리를 다시 하여 침전된 마이크로좀을 2ml의 균질화 완충액에 현탁시켜 SQS의 효소원으로 사용하였다.

[실시예 3]

[Candida albicans 배양액으로부터 SQS의 제조]

Candida albicans는 abouraud dextrose broth에서 18시간 동안 28℃에서 배양한 후, 원심분리기를 이용하여 균을 회수하였으며 멸균된 증류수로 2번 세척한 후, 완충용액에 부유시켜서 균질화하여 세포를 파괴한 후, 8000×g에서 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 회수하였다. 다시 상등액을 취해 105,000×g에서 1시간 초원심분리를 하여 마이크로좀을 침전시키고 50 ml의 균질화 완충액을 첨가해 균질화시키고 105,000×g에서 30분간 초원심분리를 다시 하여 침전된 마이크로좀을 2ml의 균질화 완충액에 현탁시켜 SQS의 효소원으로 사용하였다.

[실시예 4]

[Hep G2 세포로부터 SQS의 분리]

Hep G2 cell을 2×10⁶세포/플라스크의 농도에서 배양액(90% RPMI-1640, 10% FBS) 12ml의 T-75 플라스크에 접종하였고 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 7일간 배양하였으며 3일과 5일째에 배지를 교환하여 주었다. Hep G2 세포의 분리는 배양액을 제거한 후 인산염완충액으로 3회 충분하게 씻어준 후 1ml의 인산염완충액을 이용하여 세포들을 긁어모은 후, 12,000×g에서 10분간 원심분리하여 세포들을 모았다. 여기에 균질화 완충액을 첨가한 다음 균질화장치를 사용하여 완전히 부유화시켜 SQS의 효소원으로 사용하였다.

[실시예 5]

[SQS활성 저해능 측정]

SQS의 활성을 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 SQS의 효소원인 마이크로좀(5mg 단백질/ml) 50㎕와 반응용액(5mM MgCl₂, 100mM KCl, 10mM DTT, 2mM NADPH를 포함한 100mM 인산완충용액(pH 7.4)) 150㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 방치시킨 후 [³H]-파네실 피로포스페이트(0.05μCi) 20㎕의 기질을 첨가시켜 37℃에서 다시 30분간 반응시킨다. 그런 다음, 200㎕의 냉각에탄올을 첨가해 반응을 정지시키고 n-헥산 900㎕를 가하여 3분간 격렬하게 섞어준 후, 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 헥산층을 수득하였다. 이렇게 수득한 500㎕의 hexane층과 5ml의 칵테일용액을 혼합하여, 신틸레이션 카운터하는 방법으로 효소활성을 측정하였다. 그 결과 반응용액에 저해제를 넣지 않고 양성대조군의 cpm값이 20,000정도로 나타났으며, 마이크로좀 대신에 반응용액을 50㎕첨가한 음성 대조군의 cpm값은 400정도이었다.

SQS 활성의 저해정도는 상기 마이크로좀 50㎕와 반응용액 150㎕에 후술하는 실시예 3의 저해제 20㎕를 넣고 반응시킨 샘플의 cpm값으로 결정하였는데, 이 저해활성의 측정원리는 다음과 같다: 스쿠알렌이 되기 전 단계인 파네실 피로포스페이트는 극성이 강한 수용성물질이고, SQS의 효소작용으로 파네실 피로포스페이트로부터 합성된 스쿠알렌은 극성이 낮은 지용성 물질이므로, SQS의 효소활성이 클수록 합성되는 스쿠알렌의 양도 많으며, n-헥산에 추출되는 스쿠알렌의 양도 당연히 많아지게 되어 cpm값도 높아지게된다. 반대로 SQS 효소활성이 저해되어 합성되는 스쿠알렌의 양이 적어지면 그에 따라 n-헥산층에 추출되는 스쿠알렌의 양도 적어져 cpm값이 낮아지게 된다.

이에 따라 저해율(%)은 다음과 같은 식에 의해 구하였다.

[실시예 6]

[Streptomyces sp. YB-401의 배양액으로부터 SQS 저해물질의 정제]

SQS 저해물질을 정제하기 위하여, 1997년 12월 10일 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센타(KCCM)에 기탁번호 10119로 기탁된 YB-401 명명의 토양방선균을 이용하였다. Streptomyces sp. YB-401로부터 SQS 저해물질의 생산은 1.5% 포도당, 1.0% 효모추출물, 0.4% NaCl, 0.4% CaC0₃, 0.3% K₂HP0₄, pH 7.0로 구성된 배지를 사용하였으며, 종균을 150ℓ의 배지를 함유한 300ℓ의 발효조에 3%(v/v)로 접종하여 통기량 1.5vvm, 교반속도 150rpm, 배양온도 30℃에서 120시간 배양하였다.

Streptomyces sp. YB-401이 생산하는 SQS 저해물질은 세포 내·외에 모두 존재하므로 최적 배양 조건에서 배양한 배양액을 8,000 rpm에서 연속원심분리기를 이용하여 원심분리하여 상등액을 회수하고, 원심분리하여 얻은 균체는 acetone을 가하여 교반하고 다시 원심분리하여 균체 내부의 저해물질들을 회수하였으며 acetone을 제거한 액과 상등액을 혼합하여 다음 정제과정의 시료로 사용하였다.

WK-10 H⁺이온교환수지를 이용하여 불순물은 제거하고 저해물질은 통과시킬 목적으로 활성화시킨 WK-10 이온교환수지 5 L를 컬럼(11 × 50 cm)에 충진하고 전처리한 배양액을 pH 7.0로 조정해 통과시킨 후 pH 7.0의 증류수로 수지용량의 5배 가량을 통과시켜 이온교환이 되지않은 물질들을 충분히 세척하였다. A_254nm로 분석하여 더 이상 물질이 흘러나오지 않을 때까지 용리한 이후 0.05, 0.1 M NH₄OH을 이용하여 용리하였다. 이 경우 저해물질의 대부분이 이온교환이 일어나지 않고 통과하였으며 활성분획을 모아 다음 정제단계에 사용하였다(참조 제2도)

HP-20 흡착 수지 5L를 채운 컬럼(5 × 11 cm)에 WK-10 컬럼을 통과한 활성분획을 pH 3.0으로 조정한 후에 통과하였다. 먼저 증류수로 A_254nm에서 흡광되는 물질이 흘러나오지 않을 때까지 용리하여 불순물을 제거하고 흡착된 물질을 용리하기 위하여 30, 50, 100% 이소프로필알콜로 순차적으로 극성을 변화시키면서 탈착시켰다. 대부분의 저해물질은 수지에 흡착되었으며 30% 이소프로필알콜로 용리하였을 때 저해활성은 거의 없는 색소물질들이 용출되어 나왔고 50% 이소프로필알콜로 용리하였을 때 저해물질의 대부분이 용출되었다. 50% 이소프로필알콜에서 탈착된 활성분획을 모아 다음 정제과정을 진행하였다(참조 제3도).

HP-20 흡착 컬럼 크로마토그라피에서의 활성분획은 감압농축하여 이소프로필알콜을 제거한 후 pH를 3.0으로 조절하여 동량의 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸아세테이트층을 황산나트륨으로 탈수시키고 여과한 다음 감압농축하여 소량의 에틸아세테이트에 녹여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 하기 위한 시료로 사용하였다. 실리카겔 400 ml를 컬럼(4 × 30 cm)에 채우고 위의 시료를 충진하여 n-헥산-에틸아세테이트의 조성이 7:3, 3:7, 0:10으로 조합된 용매를 이용하여 순차적으로 용리하였다. 이 경우 각각의 용매에서 3 종류의 SQS 저해활성을 갖는 물질이 분리되어 용리되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, n-헥산-에틸아세테이트의 조성이 7:3의 용매에서 용출된 활성분획을 YBF I, n-헥산-에틸아세테이트의 조성이 3:7의 용매에서 용출된 활성분획을 YBF II, III라 각각 명명하였다(참조 제4도).

실리카겔 컬럼 크로마토그라피에서 얻어진 YBF II을 감압농축하여 55% 메탄올에 녹인 후 Prep-HPLC column(Water Delta pak Cl8, 7.8 ×300 mm)에 injection하고 55% 메탄올을 이동상으로하여 24분에서 얻어진 활성분획을 분리하였다. Prep.-HPLC에서 분리한 시료를 감압농축하여 소량의 메탄올에 녹인 후 여기에 소량의 3차 증류수를 첨가하여 4℃에서 방치하면서 메탄올을 서서히 증발시킨 결과 침상의 흰색결정을 얻을 수 있었다.

[실시예 7]

[결정화합물의 동정(Identification)]

상기 실시예 3에서 수득한 결정 화합물의 화학적 구조를 확인하기 위하여, 융점 측정과 함께 자외선(UV), 적외선(IR), 질량(MS) 및 핵자기공명(NMR) 분광기로 측정한 결과 결정 화합물의 이화학적 및 분광학적 특성은 다음과 같았다. 또한,¹H-NMR 및¹³C-NMR 결과는 제5도 및 제6도에 각각 나타내었다.

융점(mp): 75-78℃

UV λmax (MeOH)nm : 227, 260

IR νmax (KBr)cm^-1: 3500, 1705, 1695, 1638, 1602

MS (m/z) : 402.530

이상의 이화학적 및 분광학적 결과로부터, SQS 활성을 저해하는 결정 화합물은 선택적인 항균활성, 항암효과, 항바이러스효과를 가지는 것으로 알려진 마크로락틴 에프임을 확인하였다.

아울러 마크로락틴 에프의 SQS에 대한 활성 저해정도를 물질의 농도별로 측정한 결과, 농도가 증가함에 따라 SQS의 저해정도가 증가함을 확인하였다(참조 제7도).

이상에서 설명하고 입증하였듯이, 마크로락틴 에프는 농도의존형으로 SQS 활성을 저해하는 신규의 활성을 가지므로, 마크로락틴 에프로 콜레스테롤 생합성을 저해시키면, LDL-콜레스테롤 수용체의 합성이 촉진되어, 결국 혈중 콜레스테롤의 수치가 낮아지게 된다. 아울러, 마크로락틴 에프는 임상실험 등에 본격적으로 약제로 개발될 경우 동맥경화 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 수 있을 것이다.

Claims

마크로락틴 에프를 생산하는 Streptomyces sp. YB-401(KCCM 10119) 균주.
콜레스테롤 생합성 경로의 스쿠알렌 합성효소(sqalene synthase)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 생합성의 억제 효과에 이용된 Streptomyces sp. YB-401(KCCM 10119) 균주의 배양 추출 제제 마크로락틴 에프.