KR20010002971A

KR20010002971A - 커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민을 이용한 콜레스테롤 생합성

Info

Publication number: KR20010002971A
Application number: KR1019990023059A
Authority: KR
Inventors: 박정민; 최성원; 박하림; 여익현; 남승우; 배동훈; 유주현
Original assignee: 남승우; 주식회사 풀 무 원; 유주현
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2001-01-15

Abstract

본 발명은 커큐민을 이용한 콜레스테롤 생합성의 억제방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생체내 콜레스테롤 생합성과정중의 속도조절단계인 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase)의 활성을 저해하는 커큐마 롱가 엘(Curcuma longa L.)의 추출물 또는 커큐민(Curcumin)을 이용하여 콜레스테롤 생합성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 커큐민은 농도의존적으로 스쿠알렌 합성효소를 저해하는 활성을 가지므로, 커큐민으로 콜레스테롤 생합성이 저해시키면, 세포에 저밀도 지단백-콜레스테롤 수용체(LDL-cholesterol receptor)의 합성이 촉진되어. 결국 혈액내의 콜레스테롤의 수치가 낮아지게 된다. 아울러, 커큐민은 임상실험 등에 의해 본격적으로 약제로 개발되어 동맥경화증 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 수 있을 것이다.

Description

커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민을 이용한 콜레스테롤 생합성의 억제 방법효과{Methods of Inhibition of Cholesterol Biosynthesis by Curcumin and the extract from Curcuma longa L.}

본 발명은 커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민(1,7-bis (4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5- dione)을 이용한 콜레스테롤 생합성의 억제방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생체내 콜레스테롤 생합성과정중의 속도조절단계인 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase)의 활성을 저해하는 커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민을 이용하여 콜레스테롤 생합성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

미국을 비롯한 외국의 경우는 물론이거니와 한국에서도 사망원인 중 가장 높은 비중을 차지하는 사망원인은 심혈관계 질환인데, 이러한 질환은 혈장의 콜레스테롤 농도수준과 밀접한 관계가 있다는 것으로 알려져 있다.

한국인의 혈장 콜레스테롤 농도는 서양인의 농도수준에 비하여 아직 낮은 범위이지만 최근 20∼30년 사이에 10mg/dl이상 높아졌으며, 특히 낮은 연령층에서의 상승이 두드러지고 있다. 그 결과 최근 수년간 고혈압증, 뇌혈관장애, 심질환의 환자수는 해를 거듭할수록 증가하고 있으며, 심근경색환자의 연령은 점차 낮아지고 있다. 이러한 변화는 동물성 지방과 단백질 섭취량이 현저히 증가한 한국인의 식생활 변화에서 그 원인을 찾을 수 있다.

한편, 콜레스테롤은 탄소수 27개로 이루어진 물에 불용성인 스테로이드(steroid)계 화합물로서, 동물세포의 필수적인 막성분일 뿐만 아니라 프로게스틴(progestins), 코르티코스테로이드(corticosteroids), 성호르몬인 앤드로겐(androgens)과 에스트로겐(estrogens)의 전구체로 작용하며, 장으로부터 지방이나 지용성 비타민의 흡수에 필요한 담즙산(bile acids)의 형성, 간으로부터 지방을 말초조직으로 운반하기 위해 간에서 형성되는 초저밀도지방단백(VLDL; very-low-density lipoprotein)의 형성에도 사용되어 진다.

콜레스테롤은 그의 축적이나 이용을 하기 위해서 합성 또는 흡수한 조직으로부터 필요로 하는 조직까지 운반되어야 하고 트리글리세라이드(triglyceride)와 마찬가지로 혈장에서 지방단백질형태로 존재하면서 이동되고 대사된다. 이들 지방단백질의 이동 및 대사 경로를 보면 식품을 통해 장에서 흡수된 콜레스테롤과 트리글리세라이드(triglyceride)는 유미지립(chylomicrons) 형태로 만들어지고 혈류를 따라 지방 및 근육조직의 모세혈관으로 가서 지단백 분해효소(lipoprotein lipase)의 작용을 받아 트리글리세라이드(triglyceride)가 분해되어 잔여유미지립 (chylomicron remnants)이 된다. 이는 간세포에 의해 섭취, 분해되어 콜레스테롤로 유리되며 세포막, 담즙산, 스테로이드 호르몬 형성에 사용된다.

또한, 간은 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 분비할때 주로 초저밀도지방단백의 형태로 분비하며 이는 혈관벽의 지단백 분해효소의 작용으로 트리글리세라이드가 제거되면서 중간밀도 지단백(LDL; intermediate-density lipoprotein)으로 변하고 중간밀도 지단백은 잔여 트리글리세라이드가 제거되어 저밀도지단백(LDL; low-density lipoprotein)으로 변하게 되는데, 저밀도 지단백은 장기간 혈액 내에 체류하게 되며 혈장 콜레스테롤의 대부분(60-70%)은 저밀도 지단백 형태로 존재하게 된다. 혈중 저밀도 지단백은 간 및 말초조직에 의해 다시 섭취된다. 말단조직의 잉여 콜레스테롤은 역전이 시스템(reverse cholesterol transport system)을 거쳐 다시 간으로 수송되어 담즙산염(bile salts)의 형태로 장으로 분비되어 배출된다.

혈중의 저밀도지방단백은 세포막의 저밀도지방단백-수용체를 통해 세포내로 이동되는데 세포내 콜레스테롤의 농도가 높을 경우 저밀도지방단백-수용체의 합성속도는 감소되며 혈액으로부터 콜레스테롤의 흡수가 느려진다. 혈중 콜레스테롤의 수준이 높을 경우에 심각한 병에 이를 수 있는데 생합성에 의한 콜레스테롤과 식품으로 섭취된 콜레스테롤의 양이 세포막, 담즙산, 스테로이드 호르몬의 합성에 필요한 양 이상일 경우에 혈관내에 콜레스테롤의 축적이 일어나 혈관을 좁혀 혈류를 방해할 수도 있으며, 심할 경우에는 혈관의 폐색(관상 동맥경화)이 일어나 혈류를 정지시켜 조직이 사멸되기까지 한다. 현재 이러한 심혈관 질환을 일으키는 주요 위험 요인으로 혈장 콜레스테롤 수준의 증가, 특히 저밀도지방단백-콜레스테롤의 증가를 들고있는데 따라서 이를 정상 수준으로 유지하는 것이 심혈관 질환을 방지하는 목적이 되고 있다. 사람의 경우 하루에 대략 300∼500mg의 콜레스테롤이 식이중으로 섭취가 되며 700∼900mg정도가 체내에서 합성이 되어지는데 체내 총 콜레스테롤의 2/3가량이 체내에서 직접 합성이 되어지기 때문에 콜레스테롤 생합성을 저해함으로써 저밀도지방단백-receptor의 합성 속도를 증가시켜 혈장 콜레스테롤 수준을 낮추는 방법이 효과적인 것으로 여겨지고 있다.

지금까지의 심혈관 질환의 치료제는 혈장 콜레스테롤을 낮추는 제제, 동맥경화증상을 경감·완화시키는 제제, 심혈관 질환의 진전을 차단 또는 역전시키는 제제의 3가지로 구분할 수 있다. 이들 중에서 혈장 콜레스테롤을 낮추는 제제가 가장 광범위하게 사용되고 있으며 주로 혈중 저밀도지방단백-cholesterol이나 총 콜레스테롤의 수준을 낮추는 작용을 한다. 이 제제는 작용기작에 따라 세포내 콜레스테롤의 이화작용을 촉진함으로써 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 담즙산 격리제(bile acid sequestrant), 피브르산(fibric acid)의 유도체, 니코틴산(nicotinic acid)과 프로부콜(probucol)등이 있으며, 콜레스테롤 생합성 조절효소인 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A reductase)를 저 해하여 저밀도지방단백-수용체의 합성 속도를 증가시켜 혈장 콜레스테롤 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 컴팩틴(compactin) 유도체인 로바스타틴(lovastatin), 프로바스타틴(pravastatin), 심바스타틴(simvastatin)등이 있으며 콜레스테롤 전달효소인 acyl-Co A: cholesterol acyltransferase(ACAT)의 활성을 저해하여 콜레스테롤의 흡수를 저해시킴으로써 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 일본에서 주로 개발된 퍼팩틴(purpactin), 에피코리퀴논(epicohliquinone), 아카테린(acaterin), 헬민토스포롤(helminthosporols), 락테리틴(lacteritin), 짚세틴(gypsetin), 엔니아틴(enniatins), 글리소프레닌(glisoprenins), 피리피로펜(pyripyropenes), 터펜돌(terpendoles) 등으로 나눌 수 있다.

이외에도, HDL에 있는 콜레스테롤을 저밀도지방단백로 전달하는 효소인 cholesterol ester transfer protein(CETP)을 저해함으로써 고지혈증을 억제하여 동맥경화증을 예방하고자 하는 시도가 미국의 Upjohn Co., Merck Co.를 비롯한 많은 제약회사에서 진행되고 있다.

현재 알려져 있는 콜레스테롤 합성 저해제는 다음과 같다. 콜레스테롤 합성에 관여하는 중요한 효소인 스쿠알렌 합성효소(SQS, squalene synthase)의 저해제를 탐색하는 연구가 최근에 새로이 시작되어 Merk사의 자라고즈산(zaragozic acid) 및 Glaxo사의 스쿠알레스타틴(squalestatin) 등의 신물질을 미생물로부터 분리한 것이 보고되고 있다.

스쿠알렌 합성효소는 아세틸-CoA에서 시작하여 콜레스테롤이 합성되는 콜레스테롤 생합성과정중에서 FPP(farnesyl pyrophosphate)가 스쿠알렌으로 전환되는 단계를 촉매하는 효소이다. 스쿠알렌 합성효소 저해제는 상술한 HMG-CoA 저해제와는 달리 콜레스테롤 생합성 경로상 하류(downstream)에 해당하는 효소를 저해하는 것이기 때문에 HMG-CoA에 의해 파생되는 많은 생체내 이소프레노이드(isoprenoid)물질들의 전구체 비생성 현상이 나타나지 않아, HMG-CoA 저해제에 의한 여러 가지 부작용을 막을 수 있을 것으로 기대된다. 즉, 포유동물의 이소프레노이드 합성 경로는 스테롤을 형성할 뿐만아니라 돌리콜(dolichol), 유비퀴논(ubiquinone), 헴 A의 파네실 그룹(farnesyl groups of heme A), 프레닐화된 단백질의 파네실 & 제라닐제라닐 그룹(farnesyl & geranylgeranyl groups of prenylated proteins), 이소펜테닐 아데닌의 이소펜테닐 곁사슬(isopentenyl side chain of isopentenyl adenine)등도 형성하는데 스쿠알렌 합성효소 저해제는 HMG-CoA 환원효소 저해제와는 달리 이러한 다른 이소프레노이드 합성에는 영향을 주지 않으면서 콜레스테롤 합성을 저해할 수 있을 것으로 예상되기 때문에, 현재 치료제로 개발되어 있는 HMG-CoA 환원효소 저해제에 비해 부작용이 적을 것으로 기대되는 것이다.

이에, 본 발명자들은 토양 미생물과 약용제재, 식물추출물로부터 신규의 스쿠알렌 합성효소 저해제를 찾아내고자 노력한 결과, 커큐마 롱가 엘로부터 분리한 커큐민(curcumin)이 선택적인 항균활성, 항암효과, 항염증효과 외에, 스쿠알렌 합성효소의 활성을 저해하는 신규의 활성도 가지고 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 커큐민을 이용한 콜레스테롤 생합성의 저해방법을 제공하는 것이다.

제 1도는 커큐마 롱가 엘의 용매별 추출성을 나타내는 그림이다.

제 2도는 커큐마 롱가 엘의 아세톤 추출액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피한 크로마토그램이다.

제 3도는 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

제 4도는 커큐마 롱가 엘 추출물로부터 정제하여 수득한, 스쿠알렌 합성효소의 저해능을 가진 화합물의¹H-NMR 결과를 나타내는 분광 스펙트럼이다.

제 5도는 커큐마 롱가 엘 추출물로부터 정제하여 수득한, 스쿠알렌 합성효소의 저해능을 가진 화합물의¹⁴C-NMR 결과를 나타내는 분광 스펙트럼이다.

제 6도는 커큐민의 농도에 따른 스쿠알렌 합성효소의 활성 저해 정도를 나타내는 표이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다.

본 연구자들은 커큐마 롱가 엘을 아세톤으로 추출하고 그 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 활성분획을 모았고 이를 다시 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피하여 단일 화합물을 얻었다. 이 화합물의 여러 가지 물리 화학적 특성을 조사하고 자외선(UV), 질량(MS) 및 핵자기공명(NMR) 분광기로 그 구조를 분석한 결과 선택적 항균활성, 항암활성, 항염증활성을 가지는 것으로 공지된 커큐민이라는 기지의 물질임을 확인하였다.

커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민의 스쿠알렌 합성효소에 대한 활성 저해 정도를 농도별로 측정한 결과 농도 의존적으로 스쿠알렌 합성효소 활성을 억제함을 확인하였다.

따라서, 커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민으로 콜레스테롤 생합성을 저해시키면, 저밀도지방단백-콜레스테롤 수용체의 합성이 촉진되어, 혈액내의 콜레스테롤 수치가 낮아지게 된다. 아울러, 커큐마 롱가 엘 추출물 또는 커큐민은 임상실험 등에 본격적으로 약제로 개발되어 동맥경화증 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 것이다.

본 연구원들은 콜레스테롤 합성효소를 저해하는 신규물질을 발명하기 위해 미생물과 식물을 이용하여 탐색하였다. 커큐마 롱가 엘의 추출물과 추출물을 정제하여 얻은 커큐민이 콜레스테롤 생합성 작용을 저해한다. 이 물질이 신규작용하는 것을 발명하였기에 실시예를 설명한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 돼지의 간으로부터 스쿠알렌 합성효소의 제조

스쿠알렌 합성효소를 제조하기 위해 돼지 간 100g을 각각 잘게 썰어서 충분히 다지고 200ml의 균질화 용액(0.3M 수크로즈/ 5mM DTT/ 10mM MgCl₂/ 50mM KCl를 포함한 0.1M 인산완충액 pH 7.4)을 가하여 균질화시킨 다음, 4,000×g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취하고 다시 15,000×g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이어, 수득한 상등액을 105,000×g에서 1시간동안 초원심분리하여 마이크로좀(microsome)을 침전시키고 50ml의 상기 균질화 용액을 첨가해 세척한 후에 충분히 균질화시키고 105,000×g에서 30분간 초원심분리하여 마이크로좀을 침전시켰다. 이렇게 침전된 microsome을 2 ml의 균질화 용액을 현탁시켜 스쿠알렌 합성효소의 효소원으로 사용하였다.

실시예 2: 스쿠알렌 합성효소활성 저해능 측정

스쿠알렌 합성효소의 활성을 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 스쿠알렌 합성효소의 효소원인 마이크로좀 (5mg 단백질/ml) 50μl와 반응용액(5mM MgCl₂, 100mM KCl, 10mM DTT, 2mM NADPH를 포함한 100mM 인산완충용액(pH 7.4)) 150μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 방치시킨 후 [³H]-파네실 피로포스페이트(0.05μCi) 20μl의 기질을 첨가시켜 37℃에서 다시 30분간 반응시킨다. 그런 다음, 200μl의 냉각에탄올을 첨가해 반응을 정지시키고 n-헥산 900μl를 가하여 3분간 격렬하게 섞어준 후, 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 헥산층을 수득하였다. 이렇게 수득한 500μl의 hexane층과 5ml의 칵테일용액을 혼합하여, 신틸레이션 카운터하는 방법으로 효소활성을 측정하였다. 그 결과 반응용액에 저해제를 넣지 않고 양성대조군의 cpm값이 20,000정도로 나타났으며, 마이크로좀 대신에 반응용액을 50μl 첨가한 음성 대조군의 cpm값은 400정도이었다.

스쿠알렌 합성효소 활성의 저해정도는 상기 마이크로좀 50μl와 반응용액 150μl에 후술하는 실시예 3의 저해제 20μl를 넣고 반응시킨 샘플의 cpm값으로 결정하였는데, 이 저해활성의 측정원리는 다음과 같다: 스쿠알렌이 되기 전 단계인 파네실 피로포스페이트는 극성이 강한 수용성물질이고, 스쿠알렌 합성효소의 효소작용으로 파네실 피로포스페이트로부터 합성된 스쿠알렌은 극성이 낮은 지용성 물질이므로, 스쿠알렌 합성효소의 효소활성이 클수록 합성되는 스쿠알렌의 양도 많으며, n-헥산에 추출되는 스쿠알렌의 양도 당연히 많아지게 되어 cpm값도 높아지게된다. 반대로 스쿠알렌 합성효소 효소활성이 저해되어 합성되는 스쿠알렌의 양이 적어지면 그에 따라 n-헥산층에 추출되는 스쿠알렌의 양도 적어져 cpm값이 낮아지게 된다.

이에 따라 저해율(%)은 다음과 같은 식에 의해 구하였다.

실시예 3: Curcuma longa L. 추출물로부터 스쿠알렌 합성효소저해물질의 정제

커큐마 롱가 엘을 각각 에탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 메탄올을 사용하여 추출하고 이 추출물을 사용하여 스쿠알렌 합성효소 활성을 측정한 결과 추출물질 모두가 효소활성을 저해하고 콜레스테롤 합성량이 감소하는 새로운 사실을 알았으며 이 중 아세톤에서 가장 높은 저해물질 추출성을 나타내었다 (참조 제 1 도). 스쿠알렌 합성효소 저해물질을 정제하기 위하여 커큐마 롱가 엘에 아세톤을 가하여 12시간 동안 추출한 후 원심분리 및 여과하였으며 회수된 침천물로 이 과정을 3회 반복하였다. 얻어진 추출액은 감압 농축하여 아세톤을 제거한 후 소량의 에틸아세테이트에 녹여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 하기 위한 시료로 사용하였다.

실리카겔을 컬럼(4 x 30 cm)에 채우고 위의 시료를 충진하여 n-헥산/에틸아세테이트 혼합용액의 조성이 8:2, 6:4, 4:6, 2:8으로 조합된 용매를 이용하여 순차적으로 용리하였다. 이 경우 n-헥산/에틸아세테이트의 조성이 7:3의 용매에서 스쿠알렌 합성효소 저해활성을 갖는 물질이 분리되어 용리되는 것을 관찰할 수 있었고 이를 다음 정제과정의 시료로 사용하였다.(참조 제 2 도).

실리카겔에서 용출된 활성 분획을 모아 감압농축하여 소량의 메탄올에 용해한 후 100% 메탄올로 충진된 세파덱스 LH-20 컬럼(1.8 x 82 cm)에 충진한 후 동일 용매 조건에서 용리시켰으며 (참조 제 3 도) 여기서 분리된 스쿠알렌 합성효소 저해활성을 나타내는 분획을 TLC(Thin Layer Chromatography)와 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 각각 분석하여 단일 물질임을 확인하였다.

실시예 4: 결정화합물의 구조식

상기 실시예 3에서 수득한 단일 화합물의 화학적 구조를 확인하기 위하여, 자외선(UV), 질량(MS) 및 핵자기공명(NMR) 분광기로 측정한 결과 결정 화합물의 이화학적 및 분광학적 특성은 다음과 같았다. 또한,¹H-NMR 및¹³C-NMR 결과는 제 4 도 및 제 5 도에 각각 나타내었다.

UV λ_max(MeOH)nm : 241, 421

MS (m/z) : 369

이상의 이화학적 및 분광학적 결과로부터, 스쿠알렌 합성효소 활성을 저해하는 결정화합물은 선택적인 항균활성, 항암효과, 항염증효과를 가지는 것으로 알려진 커큐민임을 확인하였다.

아울러 커큐민의 스쿠알렌 합성효소에 대한 활성 저해정도를 물질의 농도별로 측정한 결과, 농도가 증가함에 따라 스쿠알렌 합성효소의 저해정도가 증가하고 콜레스테롤 합성을 저해하는 사실을 처음 발견하였다 (참조 제 6 도).

이상에서 설명하고 입증하였듯이, 커큐민은 농도의존형으로 스쿠알렌 합성효소 활성을 저해하는 신규의 활성을 가지므로, 커큐민으로 콜레스테롤 생합성을 저해시키면, 저밀도지방단백-콜레스테롤 수용체의 합성이 촉진되어, 결국 혈중 콜레스테롤의 수치가 낮아지게 된다. 아울러, 커큐민은 임상실험 등에 본격적으로 약제로 개발되어 동맥경화 및 관상동맥증과 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료제로서 이용될 수 있다.

Claims

커큐마 롱가 엘로부터 추출한 물질 또는 커큐민을 사용하여 콜레스테롤 생합성 경로의 스쿠알렌 합성효소 (squalene synthase)의 활성을 저해하는 것을 특징으로하는 콜레스테롤 생합성의 억제 방법