JPH07506818A - 自己アセンブリ性ジケトピペラジン薬物送達系 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 自己アセンブリ性ジケトピペラジン薬物送達系発明の背景 本発明は、一般に薬物送達系の分野に関し、そして特にピペラジンの特定の２． ５−ジケト−誘導体による薬物の可逆的マイクロカプセル化に関する。

薬物の送達は、長年にわたって主要な課題であった。送達されるべき化合物を被 験者に投与したとき、化合物が標的部位に到達する前に、遭遇した条件下で不安 定な場合は特に問題である。例えば、多くの場合、薬物を経口投与するのが、特 に投与の簡便性、被験者の応諾、そして低減されたコストの見地から好ましい。

しかし、多くの化合物は経口投与した場合に、効果がないかあるいは低い効力ま たは変動する効力を示す。多分、このことは、薬物が消化管中の条件に対して不 安定であるから、または薬物が吸収されると効力が無くなることによる。

経口薬物送達の分野は、胃を通って安全にそして効果的に送達され得る化合物を 移送する加圧錠剤などの単純に機械的に作られたキャリアから、消化工程の後期 および胃腸管下部において、カプセル化された化合物の放出を遅らせる腸溶コー ティングまでの、送達系範囲の広い範囲を網羅する。種々の腸溶コーティングが 、小腸に到達するまでに薬物をカプセル化または保護するために使用されている 。特定の場合には・これらは効果的である。しかし、小腸中の条件に対して不安 定な薬物があり、それ故、この薬物が小腸で放出される場合は、血流にまで貫通 する有効量に対して、より多（の投与量が投与されなければならない。これらの 場合、コーティングが、消化管中の条件に対しておよび被験者に対して投与する 前の保存される条件下で安定であるのみでなく、カプセル化された薬物が血流中 にまで到達させ得る機構を有することが必要である。

薬物送達系設計における他の因子として、系が非毒性であること、送達されるべ き薬やと非反応性であること、製造するのに高価すぎずそして困難すぎないこと 、容易に入手し得る成分で形成されること、そして、最終組成物および安定性お よび放出速度を含む物理学的特性が一致していなければならないことなどが挙げ られる。系はまた、正常な代謝工程によって容易に除去される物質で形成されな ければならない。

多くの異なる系が提案されているが、大部分は、ペプチドまたは生分解性の天然 または合成ポリマー、例えば、天然の多糖またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、 ポリオルトエルテル、またはポリ酸無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）に 基づき、これらは、単独または適切な腸溶コーティング（例えば、ＵＡＢ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎおよび５ｏｕｔｈｅｒｎＲｅｓｅａｒｃｈ 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅによる欧州特許出願第０３３３５２３号に記載）を有する 。この例外として、合成ポリマーの系および２つのタンパク質に基づく系、つま り５ｔｅｉｎ６ｒおよびＲｏｓｅｎに対する、米国特許第４．９２５．６７３号 、第４、９８３，４０２号、および第４．９７６、９６８号に記載のプロティノ イドマイクロスフェア、およびＥｎｚｙｔｅｃｈによるＰＣＴ出願番号ＷＯ９１ １０６２８７号に記載のゼインマイクロスフェアがあるが、これらの系のいずれ もが、宵の中の条件に対して安定ではない。プロティメイド系のみが、特に胃の より低いｐＨに対して安定であり、そして血液のより高いｐＨに対して不安定で あるように設計されている。

製造の観点から最も所望される送達系は、目的のｐＨ，１度および溶媒範囲にわ たり安定であり、またプロテアーゼの迅速な攻撃に耐える、単純な、化学的に規 定された前駆体からの自己アセンブリ性の送達系である。理想的には、これらの 前駆体は、利用可能な技術を用い、生産規模で経済的でおよび入手可能である。

最も知られた自己アセンブリ性カプセル化系の一つは、５ｌｄｎｅｙ　Ｆｏｘ博 士によって最初に開拓されたアミノ酸ポリマー自己アセンブリ性マイクロカプセ ルである（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｏｒｉ ｇｉｎ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）。初期の実験は、「プロティノイド」で行われ、それ は「天然に存在するアミノ酸の混合物の直線状熱縮合ポリマー」であって、薬物 送達の同一の系が続いて５ｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｓｅｎにより特許された。こ れは、実際に、初期の変化に適切な条件下で、自己組織化の活性を示しているが 、系の挙動はカプセル化技術としては望ましくない。

前駆体の確率的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）な性質および直線状ポリマーの自己ア センブリ性のさらなる確率的な性質は、制御可能な工程には不適切である。

従って、胃腸管で僅かしか吸収されず、または胃腸管中で不安定である治療薬剤 を、経口送達および放出する効果的な方法について、経済的および医学的に顕著 な必要性が依然として存在している。

それ故、本発明の目的は薬物送達系を提供することである。

本発明のさらなる目的は、系の構造を意図的に改変することによって、種々の生 理学的条件中で安定または不安定にされ得る系を提供することである。

本発明の他の目的は、自己アセンブリ性でありそして一般的に入手可能な試薬か ら経済的に製造され得る系を提供することである。

発明の要旨 薬物送達系は、ジケトピペラジンのマイクロパーティクルの形成を基礎に開発さ れた。好ましい実施態様では、マイクロパーティクルは低ｐＩ（で安定であり、 そしてｐＨ約６．５またはそれ以上で崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅ）　Ｌ、 そして特に経口薬物送達に有用である。最も好ましい実施態様では、マイクロパ ーティクルは、送達すべき薬物（例えば、インシュリンまたはヘパリン）の存在 下で形成される。好ましくは、ジケトピペラジンのマイクロパーティクルは、カ プセル化されるべき薬物の存在下で、１つまたはそれ以上のカルボン酸基を含む ジケトピペラジン誘導体の弱アルカリ性溶液を酸性化することにより形成される 。

ｉ１例は、インシュリンのカプセル化とラット中への投与により、血中グルコー スが制御される結果を例示する。ヘパリンのカプセル化もまた、生理的条件下で ヘパリンの制御された放出結果をもたらし、そして血液凝固を阻害する。

図面の簡単な説明 図１は、２．５−ジケト−３，６−ｇ（４−スクシニルアミノブチル）ピペラジ ンの合成図式である。

図２８は、体重１ｋｇ当り１ｍｌの、カプセル化されたインシュリンを投与され た、４および５の被験体のそれぞれについて、種々の時間間隔（時間）で測定さ れた血中グルコース濃Ｗ　（ｍｇ／ｄｌ）の平均の減少パーセントのグラフであ る。

図２ｂは、インシュリンを含有しないマイクロパーティクル投与後の、ｍｇ／ｄ ｉで測定された血中グルコースの平均減少ノく−セントのグラフである。

図３８は、カプセル化されたヘパリンを、経口強制栄養法により投与された動物 からの血漿の、経時（分）の、ベースラインに対する％で表した凝血時間（秒） のグラフである０図３ｂは、ヘパリンを含有しないマイクロパ−ティクルを、経 口強制栄養法により投与された動物からの血漿の、経時（分）の、ベースライン に対する％で表した凝血時間（秒）のグラフである。

（以下余白） 発明の詳細な説明 本発明は、ジケトピペラジンを用いる薬物送達系であって、送達すべき薬物をカ プセル化してマイクロパーティクルヲ形成する。

本明細書中で用いた用語「マイクロパーティクル」は、コア物質を囲む外殻を有 するマイクロカプセル；スフェア中ニ分散された薬物を含有するマイクロスフェ ア；そして不規則な形態のマイクロパーティクルを含む。好ましい実施態様では 、マイクロパーティクルは直径が０．１〜１０ミクロンの間のマイクロスフェア である。

本明細書中で用いた用語「薬物」および「カーゴ（ｃａｒｇｏ）Ｊは、マイクロ パーティクル内に取り込まれた薬理学的に活性な薬剤を指す。

臨床的に使用可能なマイクロカプセル化の系は、理想的には、化学的に規定され た合成サブユニットから構築される。

このサブユニｙトは、最小限の複雑さを有すべきで、ロフトからロットの偏差が 受容可能な狭い範囲であり、安全性および再現性のある生体有効性の両者を確立 するのに導かれるべき、毒性および有効性データを許容する。

系は、厳密に制御可能な条件下で、自己アセンブリ性であり、この条件は、カプ セル化されるべき活性な薬物範囲に応じて適切に選択される。カーゴの電荷の分 布、可溶性および疎水性は、明らかにアセンブリに特定の影響を与えるが、適切 に選択された系は、わずかの改変を有する、薬物カーゴの範囲を受容する。特定 のカーゴに対して、系の物質は主要でない構造を操作することで最適化され得る 。

自己アセンブリ性の系の基礎的な構築ブロックは、構造が非直線状で、そして公 知の非確率的な出発構造を提供するために合成される。さらに、ｐＨ依存性アセ ンブリ／非アセンブリ範囲は、厳密に制御され、そして規定される。

有用で、そして安定な自己アセンブリ性の系を構成し得る、充分に剛直（ｒｉｇ ｉｄ）な種々の構造体がある。このような剛直な構造体は、アミノ酸および他の 成分を含有する。平面的な環の使用は良好な硬直性（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を提 供し、自由度を減少させ、それ故に挙動の変動を減少させる。核酸のアデニンお よびグアニンは、端を５員環と共有している６員環を包含する、充分な硬直性を 示す構造体の型の例である。この剛直性および安定性は、二重螺旋を橋渡しする ことにおいて、立体的な安定性を担う遺伝コード要素としてそれらの進化的な選 択を説明し得る。同様に、ピログルタメート（５員環の結合剤）などのポリマー 上の「末端牛ヤノプ」を使用すると、架橋ンートに対して正味の屈曲を提供する ［表面タイル張り（ｓｕｒｆａｃｅ　ｔｉｌｉｎｇ）ｊを促進することによって 、系の安定性が増加する。

改変合成のために、良好な硬直性および適切な付着部位を提供する好ましい平面 層要素は、ジケトピペラジンまたはその置換誘導体の一つであり、それにはジケ トモルホリン、ジケトジオキサンなどが含まれる。ジケトピペラジン構造要素こ こで１位および４位の環原子Ｘは、０またはＮのいずれに基づく系は、所望のサ イズの分布、および、ｐＨ範囲および良好なカーゴ耐性を備えたマイクロパーテ ィクルを形成する。

広い範囲で安定性および再現可能な特性が、付着部位を適切に操作することで生 じ得、その結果、物質収量および良好な再現性が得られる。

前駆体を直接合成すると、これまでの系で問題であった生体有効性における変動 が減少し、そして、多分より重要なことには、予測不可能な毒性現象の脅威が取 り除かれる。毒性、サイズ、ｐｉｆ範囲およびカーゴ能力は、安定で、実験的に 証明可能な系のパラメーターである。

ジケトピペラジン ジケトピペラジンまたはそれらの置換類似体は、対向するヘテロ原子および非結 合電子対を有する、剛直な平面状の６員環である。１つまたは両方の窒素は、酸 素で置換され得、置換類似体であるジケトモルホリンおよびジケトジオキサンを それぞれ生成する。窒素を硫黄原子で置換するのが可能であるが、この場合、安 定な構造を生じない。ジケトピペラジンおよびその類似体の一般式を以下に示す 。

状二量体化によって、Ｋｏｐｐｌｅら、ムーリ」工」１１工３３（２）、　８６ ２かであり；そして 組成物が経口送達に対して用いられ、そしてｐＨ依存性のアセンブリ性−非アセ ンブリ性を示す場合は、３位および６位の側鎖置換基Ｒの少な（とも１つは、カ ルボキシル基のようなイオン化基を含み、Ｒのうち１つまたは両方は、放出条件 を制御するためにイオン化可能でなければならない。本明細書中で用いた用語「 ジケトピペラジン」は、上記の一般式の範囲に入るジケトピペラジンおよびそれ らの誘導体およびその改変体を含む。

好ましい化合物の例は、以下に示す２．５−ジケト−３，６−ジ（４−スクシニ ルアミノブチル）ピペラジンであり、ここでＸはＮであり、そしてＲ３およびＲ ４は（ＣＨ２）＜−ＮＨ−Ｃｏ−（ＣＨｚ）　２−ＣＯＯ１１であるニ ジケトピペラジンの合成方法 ジケトピペラジンは、Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉら、Ｊ、　Ａｖｅｒ、　Ｃｈｅｔ　 ５ｏｃ６８、８？９−８１１０　（１９４６）に記載の、アミノ酸エステル誘導 体の環−８６４（１９６８＞に記載の、ジペプチドエステル誘導体の環状化によ ってまたは高温沸騰溶媒中でのアミノ酸誘導体の熱脱水によって形成され得る。

これらの教示は本明細書に援用される。

２．５−ジケト−３，６−ジ（アミノブチル）ピペラジン（Ｋａｔｃｈａｌｓｋ ｉらは、これをリシン酸無水物（ｌｙｓｉｎｅ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と呼ぶ） は、Ｌ−幻」工四加」工のＫｏｐｐｌｅ法と同様に、溶融フェノール中でＮ−イ プシロン−Ｚ−（−リシンの環状二量体化を経て簡便に調製され、その後、酢酸 中の４，３ＭのＨＢｒで保護している（Ｚ）−基を除去する。

この経路は好適であり、何故なら、それは商業上入手可能な出発物質を使用、生 成物中で出発物質の立体化学が保存されることが報告されている反応条件を含み 、そして全ての工程が容易に大規模製造にスケールアップし得るからである。

２．５−ジケト−３，６−ジ（４−スクシニルアミノブチル）ピペラジンの合成 を、図１の図式に示す。２．５−ジケト−３，６−ジ（アミノブチル）ピペラジ ンは、温和なアルカリ性水溶液中で無水コハク酸で完全にスクシニル化され生成 物を生ずる。この生成物は、弱アルカリ性水溶液に容易に溶解するが、酸性水溶 液中では極めて溶けにくい。弱アルカリ性媒体中のこの化合物の濃縮溶液は、適 切な条件下で素早（酸性化されるとき、この物質はマイクロパーティクルとして 溶液から分離する。

スクシニル化化合物である２、５−ジケト−３，６−ジ（４−スクシニルアミノ ブチル）ピペラジンであって、Ｒ３およびＲ４が（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃｏ（Ｃ ）Ｉ２ｈ−Ｃｏｏｌであるものは、上記に示される。

マイクロパーティクルおよびカプセル化薬物の形成方法好ましい実施態様では、 薬物は、ジケトピペラジンを炭酸水素塩または他の塩基性溶液に溶解する工程、 薬物を溶液または懸濁液に添加しカプセル化する工程、次いでＩＭのクエン酸な どの酸を添加することによって該構造を固化する工程により、マイクロパーティ クル内にカプセル化される。

マイクロパーティクルは、乾燥状態で保存し得、そして被験者への投与のために 再構築され得る。好ましい実施態様では、再構築されたマイクロパーティクルは 酸性媒体中でそれらの安定性を維持し、そしてこの媒体がｐＨ６，５の範囲の生 理学的なｐＨに近づくにつれ開放される。しかし、シクロ−Ｌｙｓ（Ｚ）−１、 ｙｓ（Ｚ）合成中間体などの物質は、酢酸中で限定された量のＨＢｒで処理され 、両Ｚ基よりはむしろ１つのＺ基が除去され、弱酸性水溶液中で可溶性であり、 そして溶液が炭酸水素ナトリウムで弱アルカリ性に調製される場合は沈澱し、そ して、例えば、リゾソーム中への食作用（ｐｈａｇｏｅｙｔｏｓｉｓ）および飲 食作用（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）に続く酸性条件下での放出を達成するのが目 的の薬物送達に用いるマイクロパーティクル形成に用いられ得る。ｐＨに対して この応答を示す他の物質は、ジケトピペラジンを無水コハク酸とトルエン還流下 で加熱して得られ、これは環の１位および４位でＮ−スクシニル化されたジケト ピペラジン誘導体である。

（以下余白） カプセル化され得る物質 薬剤送達で、治療用、予防用、および診断用の活性を有する生物学的に活性な薬 剤が送達され得る。これらの薬剤は、有機化合物または無機化合物、タンパク質 、またはビタミン、ミネラル、アミノ酸および脂質などの栄養剤を包含する広範 な他の化合物であり得る。好ましい実施態様では、これらの物質は、経口送達さ れた後、Ｇｌ管からの輸送後に、循環系で放出されるべき生物学的に活性な薬剤 である。例としては、タンパク質およびペプチド（インシニリンおよび他のホル モンなど）（ここで、タンパク質は１００アミノ酸残基またはそれ以上からなる と定義され、ペプチドは１００以下のアミノ酸残基からなると定義される）、多 糖（ヘパリンなど）、核酸（アンチセンスなど）、脂質およびリボ多糖、および 多くの抗生物質、抗炎症剤、抗ウィルス剤、血管作動性のおよび神経活性薬剤な どの生物学的活性を有する有機分子が挙げられる。特定の例としては、ホルモン 、抗凝固薬、免疫調節薬剤、細胞毒性薬剤、抗生物質、抗ウィルス剤、アンチセ ンス、抗原および抗体が挙げられる。特定の例では、タンパク質は抗体または抗 原であり、別にそれは適切な応答を引き出すために注射で投与され得る。

好ましい実施態様では、これらの生物学的薬剤は胃酸中で不安定であり、胃腸膜 を通してゆっくりと拡散し、および／または胃腸管中で酵素によって破壊され易 い。生物学的薬剤は、血流中に放出する前に、胃腸管中でそれらを保護するため にカプセル化される。好ましい実施態様では、保護物質であるジケトピペラジン は生物学的に活性ではなく、そして治療用薬剤の薬理学的性質を変えない。

マイクロパーティクルは、酸安定性である故買の酸性環境に耐える。さらに、そ れらは胃での酵素分解にも耐える。マイクロパーティクルは、内皮を通って血液 中へ入り、血液のほぼ中性ｐＨ中で可溶性となり、薬理学的な活性な化合物を放 出する。

薬剤の例としては、ホルモン、抗原、抗生物質、ステロイド、うっ血除去薬、神 経活性薬剤、および麻酔薬、または鎮静薬が挙げられる。これら薬剤は、非荷電 分子または分子複合体成分などの様々な形態であり得る。酸性薬物としては、金 属塩、アミンまたは有機カチオン（例えば、第四級アンモニウム）が特定の場合 に使用され得る。所望の保持特性および放出特性を有する薬剤の単純誘導体（エ ーテル、エステル、およびアミドなど）もまた使用され得る。マイクロパーティ クルの形成を制御するために酸および塩基が使用されている場合、薬剤の塩形態 を別に調整するのは不可能である。マイクロパーティクルが、ジケトピペラジン を炭酸水素ナトリウム溶液に溶解することによって、そして濃縮クエン酸を加え ることによって形成される場合、薬剤分子を塩基のない（ｆｒｅｅ−ｂａｓｅ） または塩酸塩形態に−するのは不可能である。

造影剤（ｉ■ａｇｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）は、金属、放射性同位体、放射線不透過 薬剤および放射線透過薬剤を包含する。放射性同位体および放射線不透過性薬剤 は、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム 、およびリンを包含する。

製薬組成物 マイクロパーティクルは、懸濁液で、あるいは、腸溶コーティングまたはアルブ ミンまたはラクトースなどの安定剤などの他の物質中にカプセル化して投与され 得る。これらの物質およびその使用方法は、製菓業当業者に周知である。製薬組 成物は、マイクロパーティクルのみからなるか、あるいはさらにカプセル化され た化合物または他の化合物を含む。例えば、胃を通過するには安定で、次いで腸 管内で１回の投与量が素早く吸収される化合物を投与するのが望ましく、続いて 、マイクロパーティクル（すなわち、化合物がカプセル化に耐性なら、腸溶とし て保護された、塩基安定性の、中性の、可溶性のマイクロパーティクル）から同 一または別の化合物の放出が起こる。

マイクロパーティクルは、非経口投与または経腸的投与によって、局所または全 身投与され得る。

経腸的投与 生物学的に活性な薬剤を有するマイクロ、４−ティクルは、好ましくは経口的に 投与される。これらのマイクロパ−ティクルは、化学的性質およびサイズに依存 して胃腸管の上皮内層に吸収されるか、または貫通して、血流中またはリンパ系 に入る。

非経口投与 ５ミクロン以下のマイクロパーティクルは、容易に静脈投与用の針を通り抜ける 。適切な製薬上キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）は公知であり、商 業的に入手可能である。

静脈投与は、取り込まれた化合物の、例えば、駆虫性薬剤または抗旧Ｖ薬剤の貧 食細胞への標的された送達に好適であり得る。ここで感染源もまたこれらの細胞 の型に対して選択的である。マイクロパーティクルは、中性ｐＨで安定で、低ｐ Ｈで可溶性であり、経口系とは逆である。

皮下、筋肉内および腹腔内投与 上記のように生成されたマイクロパーティクルは充分に小さく、取り込まれた薬 物の引き続く放出のために、皮下または腹膜中に標準口径の針を通って注射され る。マイクロパーティクルの腹膜への付着は、取り込まれた薬物の局在化した放 出を促進する。マイクロパーティクルはまた、免疫化または血流中のより遅い放 出が望ましい他の目的のために、移植され得または筋肉内注射され得る。リン酸 緩衝化生理食塩水のようなキャリア、またはオイルのようなアジニバントが、マ イクロパーティクルの対するキャリアとして使用され得る。

製薬的に受容可能なキャリアは、当業者に公知である。

局所投与 マイクロパーティクルは、キャリアおよび投与部位に適切な方法を用いて、投与 に適切な製薬キャリア中に懸濁される。

例えば、マイクロパーティクルは、ｐＨ約７．４の緩衝化生理食塩水溶液中また はミネラルオイルなどの軟膏中で、目に投与される。投与量は、放出させるべき 化合物、および放出速度に依存し得る。マイクロパーティクル、または、マイク ロパーティクルと取り込まれた化合物とのフィルム、ディスク、または錠剤中へ の凝集は、軟膏またはクリーム中で皮膚に投与され得る。適切な製薬キャリアは 、当業者に公知であり、商業的に入手可能である。

広がった傷には、抗生物質または成長因子はミノ酸、ペプチド、またはタンパク 質成長因子）の持続する送達が、様々の医学的および外科学的状況において、特 に治療上重要であり、これらの状況には、これらに限られるのではないが、熱に よるやけど、化学的なやけど、外科的な傷、糖尿病の潰瘍および血管機能不全症 が含まれる。

診断への適用 放射線不透過化合物、放射性同位体、または放射線透過化合物を含有するマイク ロパーティクルは、診断手法での使用に特に適している。マイクロパーティクル は、非経口的、または経腸的に投与され得る。粘膜に結合するマイクロパーティ クルは特に、これらの適用に好ましく、とりわけ鼻管、咽頭管、胃腸管、および 尿生殖器管のイメージングに好ましい。

造影剤を含有するマイクロパーティクルの静脈内投与は、特に、肝臓、肺臓およ び肺のイメージングに有用である。

標的投与 特定細胞、特に貧食細胞および器官への送達Ｐｅｙｅｒ板内の貧食細胞は、経口 投与されたマイクロパーティクルを選択的に捕らえるようである。静脈投与され た場合、網内皮細胞系の貧食細胞もまた、マイクロパーティクルを捕うエル。５ ミクロン以下の直径のマイクロパーティクルは、塞栓性（ｅｍｂｏｌｙＬｉｃ） の合併症なしに注射され得る。マクロファージによるマイクロパーティクルの飲 食作用は、肺臓、骨髄、肝臓およびリンパ節（ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ＞にマイ クロパーティクルを標的するのに用いられ得る。

マイクロパーティクルの電荷および脂肪親和性は、タンパク質キャリアの性質を 変えるのに使用される。例えば、マイクロカプセルの内表面の脂肪親和性は、脂 肪親和性基を結合することにより改変され得、特定の薬物の可溶性を増加し、そ れによって薬物カーゴ能力が増加する。他の改変物は、形成後のその改変が、取 り込まれた化合物に有害な影響を及ぼさない限り、マイクロパーティクル形成の 前後に作られ得る。

被験者へのマイクロパーティクルの投与好ましい実施態様では、マイクロパーテ ィクルは引き続く経口投与のために、凍結乾燥または標準ゲルカプセル物質中に カプセル化されて保存される。投薬量は、カプセル化された薬物の量、胃腸管申 出の放出速度、および化合物の薬物速度論（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔ　１ｃｓ） によって決定される。

特定の実施態様では、マイクロパーティクルはまた、静脈内、筋肉内または皮下 の注射によって局所的に、あるいは放出が皮膚の低ｐＨと接触することにより活 性化される（逆の安定性製剤）経皮性あて布（ｐａｔｃｈ）の手段によっても投 与され得る。

本発明は、以下のインシニリン含有ジケトピペラジンマイクロパーティクルの調 製および投与の、限定されない実施例を参照して、さらに理解され得る。

実施例１ニジケトピペラジンマイクロパーテイクルの調製シフｏ　−Ｌｙｓ（Ｚ ）−Ｌｙｓ（Ｚ）（トイプシロンー（Ｚ）−！、−リシンの環状二量体化）合成 方法を、図１の図式に示す。

Ｅｐｈｒａｉｍ　Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ、　ｌ５ｓａｃ　Ｇｒｏｓｓｆｅｌｄ、 およびＭａｘ　Ｆｒａｎｋｅｌの［リジン酸無水物の合成Ｊ　Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ　６８．８ ７９−８８０　（１９４６）、およびＫｅｎｎｅｔｈ　Ｄ、　Ｋ。

ｐｐｌｅおよびＨａｙｏｐ　Ｇ、　Ｇｈａｚａｒｉａｎの［２，５−ジケトピペ ラジンの簡便な合成Ｊ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒ　３３．８６２−８６４（１９６８）の方法は、以下のように使用に適合さ せた。Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉらは、異なった合成経路にによる標的化合物の合成 を記載しているＨ　Ｋｏｐｐｌｅらは、本明細書で使用した方法と似た合成方法 を記載しているが、リシンベースのジベブチドヲ用いず、同じ標的化合物を生じ ない。文字ｒＺＪは、アミ７基を保護するのに使用されるベンジルオキシカルボ ニル基またはカルボベンゾキシ基を示すために使用している。

トイプシロンーｚ−（−リシン Ｎ−イプシロン−ｚ−１−リシン（Ｓｉｇ＋＊ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、 　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、　５０グラム）を、以下のように環状化した。

化合物を結晶フェノールの２５０グラムと共に、緩やかな窒素ガス（前精製等級 ）流下で、５０ｈＬ樹脂反応釜に入れた。反応混合物の温度を１７５℃まで上げ （加熱マントル）、そして窒素下で１８時間この１度を保った。反応釜を加熱マ ントルから取り出し、容器の外側をされっても熱くなくなるまで、そして結晶が まさに反応混合物中で形成し始めるまで冷却した。次いで、反応混合物を１．５ Ｌの無水エーテルと攪拌しながら混合し、微細な白色粉末を沈澱させた。この沈 澱物を焼結ガラス漏斗上（粗グリッド）に集め、そしてフィルター上で無水エー テルで洗浄した。

フィルター上で風乾後、生成物（ＪＧ４７）は３３．７グラムの重量であった。

生成物の一部（５グラム）を、分析のために取り分けた。

シクロ−Ｌｙｓ（Ｚ）−１７ｓ（ｚ） この物質を５０＋＊Ｌの温い氷酢酸に溶解し、そしてこの溶液を濾過して少量の 不溶性物質を取り除いた。冷却中に、酢酸溶液から固体が結晶化した。この物質 を濾過して集め、次いで２００ｍＬの１＝１の水：メタノールに懸濁した。この 懸濁液を緩やかに還流し、次いで室温に２日間放置した。精製された生成物（Ｊ Ｇ４ｇ）を濾過して集め、そしてフィルター上で風乾した。

この手法で、３．７グラムの精製されたシクロ−Ｌｙｓ（Ｚ）−１ｙｓ（ｚ）が 得られた。

２．５−ジケト−３，６−ジ（トスクシニルアミノブチル）ピペラジンジヒドロ ブロマイド （シフｏ　−Ｌｙｓ（Ｚ）Ｌｙｓ（Ｚ）の脱保護）側鎖上の末端アミ７基を脱保 護および除去するために、２０グラムのシクロ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｌｙｓ（ｚ）　 （ＪＧ４７、微細に粉末化）を５０ｍＬの氷酢酸に攪拌して懸濁した。この懸濁 液に、５０ｍＬの氷酢酸中の４．３ｊ４ＨＢｒを添加し、２−基を除去した。一 時急速なガス（二酸化炭素）発生があり、そして固体生成物はほとんど完全に溶 解した；次いで固体生成物は、反応混合物から分離し始めた。

ＨＢｒ溶液を添加した２時間後、１５０ｇ＋Ｌの無水エーテルを混合液に添加し 、生成物を完全に沈澱させた。沈澱生成物をエーテルで繰り返し洗浄し、次いで 乾燥窒素気流下で乾燥した。

結晶残渣をスクシニル化に直接使用した。

２、トジケトー３．６−ジ（４−アミノブチル）ピペラジン前述の手順で得られ たシクロ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓジヒドロブロマイドを、無水コハク酸でアシル化し、 ２．５−ジケト−３，６−ジ（４−アミノブチル）ピペラジンを得た。先ず、そ れを、室温で２００ｗ１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解した。この溶 解をゆっくり行い、炭酸ガスは混合物を泡にして容器からこぼすことなく放出し 得た。溶液を濾過し、少量の不溶性物質を除去した。そしてフィルターをさらに ５ｈｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、この洗浄液を濾液に加えた。

溶液を効率的なマグネチノクスクーラーで攪拌し、ガラス電極を用いてｐＨをモ ニターし続けた。初期ｐｉは、８．７であった。

無水コハク酸（３０グラム）を、１０回に分けて添加した。反応混合物のｐＨは 、この添加毎に下がって７．５になった。それを叱ＮａＯＨで８．７に再調整し た。無水コハク酸がすべて溶解して、最終ｐＨが安定するまで、同じパターンで 無水フハク酸を添加し続け、ｐＨを調整し続けた（無水コハク酸の最後の部分を 添加後、約半時間）。

マイクロパーティクルを沈澱させるために、クエン酸（１０グラム）を反応混合 物に添加した。次いで、ｐＨを濃ＨＣＩでゆっ（り調整して２．２にした。（こ の工程中、二酸化炭素が激しく発生し、ゆっくりとＨＣＩを添加することでガス 発生が制御される。）約３−３．５のｐ）ｌで、固体生成物が溶液から分離し始 めた。ｐＨ２゜２で、溶液は微細粒子（ｆｉｎｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）で満たさ れた。この混合物を一晩冷蔵庫に入れ、次いで生成物を濾過して集め、水で洗浄 しフィルター上で風乾した。収量は、１１．７グラムの白色（ｏｆｆ−ｗｈｉｔ ｅ）粉末（ＪＧ５２）であった。

小量の生成物試料を、沸点温度の最小量の水に溶解した。

冷却して分離した固体を遠心によって集め、水で洗浄し次いで遠心ペレットを凍 結乾燥した（ＪＧ７？）。

（以下余白） 実ｍ例ｚ：インシュリンの経口投与による血中グルコース抑制 力〕友： ピペラジンを炭酸水素ナトリウムの飽和溶液に溶解し、１２５ｍｇピペラジン／ ｌｌＬ溶液を調製し、次いで、この溶液を、取り込まれるインシュリンをインシ ュリン２０■ｇ／ｇ＋１の濃度で含有すル等量のＩＭのクエン酸溶液と混合する ことにより、ブタインシュリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓ Ｌ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，比活性約２６０／ｍｇ）を、２．５−ジケト−３， ６−ジ（４−スクシニルアミノブチル）ピペラジン中にカプセル化した。この手 順で、約６７．５−ｇマイクロパーティクルフｍｌの懸濁液を得た。

それぞれの体重が約２５０ｇそして正常な血中グルコース濃度を有する全部で９ 匹のオスラットに、体重１ｋｇ当り１．２５冒ｇから２．０ｍｇとの間の計算さ れた投与量で、カプセル化されたインシュリンを経口強制栄養法により投与した 。コントロールとして、ラットにポリマーの非晶質（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）沈澱 物、従ってスフェアの中にインシュリンがカプセル化されないが最終溶液のイン シュリン濃度はもとの調製物中で用いた濃度と同じである、を与えた。この懸濁 液を、体重１ｋｇ当り１■ｌの懸濁液の投与量で、４匹のコントロールラットに 経口強制栄養法で投与した場合、血中グルコースの著しい低下は見られなかった 。さらに、被験体に皮下注射で、水溶液および非結晶沈澱物の形態の両方のイン シュリンを投与し、インシュリン自体の生物学的活性を証明した。

治療後の種々の時間で尾から採取した試料について、血中グルコースを測定し、 そしてＧｌｕｃｏｆ＋ｌ■片上に、絞り取った尾の血液１滴を用いて、血液１ｄ ｌ当りのグルコース■ｇを測定した。

片栗： 図２ａは、種々の時間間隔で、ＬＯｗ＋ｇ／ｋｇ体重の濃度で、カプセル化され たインシュリン懸濁液１ｍｌを投与した、９匹の被検体に対して（ｍｇ／ｄｌ） で測定した血中グルコースの平均の低下パーセントを示す。カプセル化されたイ ンシュリンは、経口投与した場合に、著しく血中グルコースを下げる。図２ｂに 示したように、同量のインシュリンを含むポリマーの非結晶性澱物溶液を経口投 与しても、血中グルコースは著しく変化しなかった。同じ溶液を皮下注射で投与 すると、血中グルコースが特徴的に低下した；純粋なインシュリン溶液を注射し た場合に生じたものと同じである。カプセル化されていないインシュリンを経口 投与した場合に、薬理学的効果がないことは、動物およびヒトの両方により高い 投与量で実施された文献中の他の研究の知見と一致する。図２ａでは、血中グル コース濃度が、２４０分間で投与前の値に戻ることを示す。

実施ｆ１４３＝マイクロカプセル化ヘパリンによる血中の凝固阻害 ２．５−デケト（ｄｅｋｅｔｏ）−３，６−ジ（４−アミノブチル）ピペラジン のジスクツニル誘導体を、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液に、濃度がピペラジン １２［１ｍｇ／ｍｌ、溶液となるように溶解し、次いで、これを、同量のＩＭの クエン酸（ヘパリンナトリウム１００■ｇ／醜Ｌクエン酸を含有する）と混合す ることにより、ヘパリン（Ｓ１ｇ■ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ１．３ｊ、　ｌ □ｕｉｓ、　ＭＯ，非活性２６Ｕ／ｍｇ）を、上記のようにカプセル化した。

最終懸濁液は、懸濁液１＊ｌ当り５０ｍｇのヘパリンを含有した。

この中では、約２０％がカプセル化されており、懸濁液１＊ｌ当りｌｈｇのカプ セル化されたヘパリンの理論最大濃度を得た。

カプセル化されたヘパリンを含有する溶液を、体重約２５０グラムの８匹のラッ トに、経口強制栄養法によって投与した。

ラットは、処置前に一晩絶食させた。各ラットは、体重１ｋｇ当り１＊ｌの懸濁 液を与えられた。さらに、ヘパリンが入っていない、ＩＭのクエン酸中に形成さ れたマイクロカプセルの懸濁液を、４匹のコントロール群のラットに投与した。

０分、６０分、１２０分、２４０分、および３６０分で、血液を９＝１の比でク エン酸塩加ンリンジ中へ抜き取った。この血液を直ちに遠心分離し、そして標準 薬剤を有するＡＰＴＴア・ｙセイを用いて、血漿をアッセイした。結果を図３８ に示す。結果は、ヘパリンの経口投与が血液凝固時間の延長に有効であることを 明確に示している。

図３ｂは、コントロール群の結果を示す。これらの結果はマイクロパーティクル ｄ身は凝固時間に感知し得るほどに作用しないことを明瞭に示す。

本発明の方法を改変および変形することは、前記の詳細な説明から当業者に自明 である。このような改変および変形は、添付の請求項の範囲に入ることが意図さ れている。

ＦＩ６．　１ 令 ＦＩＧ、２σ 少 Ｆｌ（、９ｂ 冷 ＦＩｏ、３σ 揚 １″ｌ″ｌｉ″Ｅ＊９１ 平成７年２月２３日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．薬物送達のためのマイクロパーティクル系であって；タンパク質、ペプチド 、多糖、脂質、リポ多糖、核酸および他の生物学的に活性な有機分子からなる群 から選択される生物学的に活性な薬剤を取り込んだジケトピペラジンのマイクロ パーティクルを含有するマイクロパーティクル系；ここで、該マイクロパーティ クルが、第１の規定されたＰＨでジケトピペラジンの会合および沈澱により安定 であり、そして第２の規定されたＰＨでジケトピペラジンの解離により不安定で ある。
2. ２．前記ジケトピペラジンが、以下の一般構造を有する請求項１に記載の系： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、１位および４位の環の原子Ｘが、ＯまたはＮのいずれかであり；そして ３位および６位の側鎖置換基Ｒの少なくとも１つが、カルボキシル基を含む。
3. ３．前記構造が、グルタミン酸、アスバラギン酸、リシン、オルニチンおよびジ アミノプロピオン酸からなる群から選択される、請求項２に記載の系。
4. ４．前記構造が、２，５−ジケト−３，６−ジ（アミノブチル）ピペラジンおよ び２，５−ジケト−３，６−ジ（４−スクシニルアミノブチル）ピペラジンから なる群から選択される、請求項３に記載の系。
5. ５．前記マイクロパーティクルが、酸性ＰＨで安定であり、そしてより塩基性側 のＰＨで不安定である、請求項１に記載の系。
6. ６．前記マイクロパーティクルが、酸性ＰＨで不安定であり、そしてより塩基性 側のＰＨで安定である、請求項１に記載の系。
7. ７．前記生物学的薬剤がインシュリンである、請求項１に記載の系。
8. ８．前記生物学的薬剤がヘパリンである、請求項１に記載の系。
9. ９．薬物送達のためのマイクロパーティクル系の製造方法であって、以下の工程 を包含する方法；ジケトピペラジンが可溶性である第１の規定されたＰＨの溶液 中でジケトピペラジンを形成する工程；および該ジケトピペラジン溶液に、タン パク質、ペプチド、多糖、脂質、リポ多糖、核酸および他の生物学的に活性な有 機分子、造影剤、および細胞特異的標的薬剤からなる群から選択される生物学的 に活性な薬剤を添加し、第２の規定されたＰＨを有する溶液中で生物学的に活性 な薬剤を含有するジケトピペラジンを沈澱させ、マイクロパーティクルを形成す る工程。
10. １０．前記ジケトピペラジンが、以下の一般構造を有する請求項９に記の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、１位および４位の環の原子Ｘが、ＯまたはＮのいずれかであり；そして ３位および６位の側鎖置換基Ｒの少なくとも１つが、カルボキシル基を含む。
11. １１．前記構造が、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、オルニチンおよび ジアミノプロピオン酸からなる群から選択されるアミノ酸から形成される、請求 項９に記載の方法ここで、該ジアミノプロピオン酸は、遊離β−アミノ基を保護 し、窒素下熱フェノール中で１７５℃に相当する温度で加熱し、そして保護基を 除去することにより環状化される。
12. １２．遊離アミノ基を有するジケトピペラジンの側鎖をスクシニル化する工程を さらに包含する請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記構造が、２，５−ジケト−３，６−ジ（アミノブチル）ピペラジンお よび２，５−ジケト−３，６−ジ（４−スクシニルアミノブチル）ピペラジンか らなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
14. １４．生物学的に活性な薬剤を被験者に投与する方法であって、タンパク質、ペ プチド、多糖、脂質、リポ多糖、核酸および他の生物学的に活性な有機分子、造 影剤、および細胞特異的標的薬剤からなる群から選択される薬剤を、ジケトピペ ラジンでなるマイクロパーティクルと組合せて提供する工程を包含する方法； ここで、該マイクロパーティクルが第１の規定されたＰＨにおいてジケトピペラ ジンの会合および沈澱により安定であり、第２の規定されたＰＨにおいてジケト ピペラジンの解離により不安定である、方法。
15. １５．前記マイクロパーティクルが、さらに、生物学的に活性な薬剤の安定剤お よびカプセル化されていない生物学的に活性な薬剤からなる群から選択される化 合物を包含する、請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記薬剤が、ホルモン、抗凝固薬、免疫調節薬剤、細胞毒性薬剤、抗生物 質、抗ウイルス剤、アンチセンス、抗原および抗体からなる群から選択される、 請求項１４に記載の方法。
17. １７．前記マイクロパーティクルが、さらに腸溶コーティング物内にカプセル化 される、請求項１４に記載の方法。
18. １８．前記マイクロパーティクルが酸性ＰＨで安定であり、そして中性または塩 基性ＰＨで不安定である、請求項１４に記載の方法。
19. １９．前記マイクロパーティクルが酸性ＰＨで不安定であり、そして中性または 塩基性ＰＨで安定である、請求項１４に記載の方法。
20. ２０．前記生物学的薬剤がインシュリンである、請求項１４に記載の方法。
21. ２１．前記生物学的薬剤がへパリンである、請求項１４に記載の方法。