JP2009545534A - 多機能生物活性化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫細胞減少症、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ肉腫などの免疫障害および造血障害の治療において有用な、安定剤部分に連結された免疫調節部分からなる式（I）の多機能生物活性化合物およびその薬学的組成物を開示する。

Description

発明の分野
本発明は、生物活性化合物を、それを必要としている患者に投与するための新規アプローチの化合物、組成物、方法、および適用に関する。

発明の背景
放射線療法および化学療法は、悪性疾患に対する十分に確立された治療方法である。急速に成長し、分裂する細胞は、放射線および細胞毒性物質の影響を最も受けやすい。影響を受けるものの中には、腫瘍細胞や、毛および腸細胞、ならびに造血系および免疫系の細胞を含む正常細胞がある。放射線および細胞毒性物質による造血系および免疫系の正常細胞への損傷は生命を脅かす結果を招くことが多く、全治療用量を投与する能力を制限する。

放射線療法および化学療法の影響から正常な造血細胞および免疫細胞を保護する、またはこれらの療法によって抑制された細胞の再構成を助ける薬剤を特定するために、大規模な研究が行われている。例えば、形質転換成長因子ベータ-1は化学療法剤または放射線療法の骨髄毒性から造血幹細胞を保護するのに有用であると報告されている（Kellerらの米国特許第5,278,145号）。チモシンアルファ1中にヒトアルブミンを含む凍結乾燥組成物が、免疫系が細胞分裂抑制剤による治療または放射線治療によって重度の損傷を受けたマウスの白血病進行に対して防止活性を発揮することも報告された。放射線または化学療法誘導性の造血細胞抑制後に、免疫応答を増強するため、または正常血液の再構成を補助するために、インターロイキン-3およびCSFなどの造血成長因子が用いられている（Andersonらの国際公開公報第88/05469号、Ciarlettaらの米国特許第4,959,455号；Souzaの米国特許第4,999,291号）。

Seminaら（Radiatsionnaya Biologiya Radioekologiya 33(3), 1993；国際公開公報第89/06134号）は、ジペプチドH-Glu-Trp-OHの左旋性（L）鏡像異性体が免疫賦活薬として作用し、細胞の増殖を誘導しうることを明らかにしている。したがって、これらのジペプチドは、化学療法および放射線療法後に造血細胞および免疫細胞を再構成する際に有用である。

免疫調節特性を有するいくつかのペプチドが合成されている（例えば、SU 1,582,393；EP 230,052；US 4,190,646；US 5,008,246；およびUS 5,013,723）。多くの科学研究室が、天然ペプチドよりも活性が高いそれらの合成誘導体の調製法を開発しようとしてきた（例えば、EP 136,720；およびEP 137,904）。

豪州特許第AU-B-29308/89（国際公開公報第089/06134号に対応）は、Glu-Trpの調製と、免疫不全状態を治療するためのその使用を教示している。Khavinsonらに発行された国際公開公報第93/08815号は、免疫抑制の治療において用いるための、ペプチドGlu-Trpおよびその環状モノマーおよびポリマーを開示している。

Deiginらの2000年4月18日発行の米国特許第6,051,683号および2002年12月12日発行の第6,159,940号は、免疫応答を刺激し、造血を調整しうる、下記の一般式の免疫調節ペプチドを記載している：
X-Glu-Trp-Y
式中、Xは水素、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、N-バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、D-アラニン、D-ロイシン、D-イソロイシン、D-バリン、D-N-バリン、D-プロリン、D-チロシン、D-フェニルアラニン、D-トリプトファン、γ-アミノ酪酸またはξ-アミノカプロン酸であり；Yはグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、N-バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、D-アラニン、D-ロイシン、D-イソロイシン、D-バリン、D-N-バリン、D-プロリン、D-チロシン、D-フェニルアラニン、D-トリプトファン、γ-アミノ酪酸、ξ-アミノカプロン酸、-OH、NH₂、N₂H₃、または一もしくは二置換アミド（C1〜C3）であり；特にH-Ile-Glu-Trp-OHである。

Deignらの1998年4月7日発行の米国特許第5,736,519号；2000年8月15日発行の第6,103,699号および2003年6月25日発行の第6,410,515号は、放射線または化学療法後の細胞の再構成のため、細胞増殖を阻害するため、および免疫抑制のための、下記の一般式の免疫調節ペプチドを記載している：
X-A-D-Trp-Y
式中、Xは水素、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、N-バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、D-アラニン、D-ロイシン、D-イソロイシン、D-バリン、D-N-バリン、D-プロリン、D-チロシン、D-フェニルアラニン、D-トリプトファン、γ-アミノ酪酸またはξ-アミノカプロン酸であり；AはD-グルタミン酸またはD-γ-グルタミン酸であり；かつYはグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、N-バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、D-アラニン、D-ロイシン、D-イソロイシン、D-バリン、D-N-バリン、D-プロリン、D-チロシン、D-フェニルアラニン、D-トリプトファン、γ-アミノ酪酸、ξ-アミノカプロン酸、ヒドロキシル、またはアミド基であり；特にH-γ-DGlu-Trp-OHである。

Deiginらの2001年2月6日発行の米国特許第6,184,208号および2001年6月19日発行の第6,248,716号は、ストレスを軽減し、体重増加、上皮成長帯、創傷治癒ならびに修復および同化プロセスを刺激する、下記の一般式の免疫調節ペプチドを記載している：
X-Tyr-Y-Phe-Z-A
式中、Xは水素、アルギニン、D-アルギニン、オルニチン、D-オルニチン、リジン、D-リジン、ホモアルギニン、D-ホモアルギニン、シトルリン、D-シトルリンであり；Tyrはチロシンであり；YはD-アラニン、D-バリン、D-ロイシン、D-イソロイシン、D-フェニルアラニン、D-アスパラギン、D-トリプトファン、D-プロリン、D-セリン、D-トレオニン、D-チロシン、D-ヒドロキシプロリン、D-システイン、D-システイル-システイン、D-メチオニン、D-リジン、D-ホモアルギニン、D-アルギニン、D-ヒスチジン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-β-アラニン、またはD-オルニチンであり；Pheはフェニルアラニンであり；Zはアラニン、D-アラニン、バリン、D-バリン、ロイシン、D-ロイシン、イソロイシン、D-イソロイシン、フェニルアラニン、D-フェニルアラニン、アスパラギン、D-アスパラギン、グリシン、グルタミン、D-グルタミン、トリプトファン、D-トリプトファン、プロリン、D-プロリン、セリン、D-セリン、トレオニン、D-トレオニン、チロシン、D-チロシン、ヒドロキシプロリン、D-ヒドロキシプロリン、システイン、D-システイン、システイル-システイン、システイン-D-システイン、D-システイルシステイン、D-システイン-D-システイン、メチオニン、D-メチオニン、リジン、D-リジン、アルギニン、D-アルギニン、ヒスチジン、D-ヒスチジン、アスパラギン酸、D-アスパラギン酸、グルタミン酸、D-グルタミン酸、β-アラニン、D-β-アラニン、オルニチン、またはD-オルニチンであり；かつAはヒドロキシルまたは置換アミド（C1〜C3）であり；特にH-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OHである。

ジケトピペラジン系を含む活性薬剤の送達、特に経口送達のための組成物が、例えば、米国特許第6,663,898号、同第6,395,774号、同第6,331,318号、同第5,976,569号および同第5,693,338号、ならびに米国特許出願公開第20030198658号、同第20030155993号および同第20030028250号を含む、Emisphere Technologies, Inc.が所有するいくつかの特許および特許出願において記載されている。これらの組成物において、ジケトピペラジンは典型的には別の成分として加えられる。

任意の適用または複数の適用のために容易に調整しうる、生物活性化合物を体内に送達するための有効な方法がいまだに必要とされている。

本発明は、多機能生物活性化合物の治療的送達のための新しいプラットフォームに関する。本発明は、安定剤部分に連結された免疫調節部分を有する分子に関する。安定剤部分は免疫調節剤の体内への有効な担体として作用する。さらに、免疫調節剤および安定剤は任意にもう一つの機能性生物活性分子に連結されていてもよい。生物活性分子はさらなる免疫調節活性、免疫調節部分を補う、もしくは協同する活性、または異なる治療活性のいずれかを有する。

したがって、本発明は、式Iの一つまたは複数の化合物から選択される多機能生物活性化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグを含む：

式中
AはTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される免疫調節ラジカルであり、ここでアリールおよびヘテロアリール基は、ハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜6つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜4個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜6アルキル、C_1〜4アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対であり；
L¹およびL²はそれぞれ独立に、一重結合、-C(O)- -C(O)NR²-、-NR²C(O)-、-NR²-、-C(O)-O-、-OC(O)-、-S-S-、SO₂NR²-、NR²SO₂、-S-および-O-からなる群より選択されるリンカー基であり；
R²はH、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択され；
R⁵はHまたはC_1〜6アルキルであり；
^*はLもしくはD配置またはその混合物であり；
mは1〜50の整数であり；
nは0〜50の整数であり；かつ
DはH、C_1〜6アルキル、アミノ酸の任意の側鎖および任意の機能性活性分子からなる群より選択される。

本発明はさらに、本発明の多機能生物活性化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。

同様に、免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害の治療方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法も本発明に含まれる。さらに、免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害を治療するための本発明の多機能生物活性化合物の使用、ならびに免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害治療用の薬剤を調製するための本発明の多機能生物活性化合物の使用も提供される。

本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、当業者であればこの詳細な説明から本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変が明らかになるため、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、例示のために示すにすぎないことが理解されるべきである。

本発明を図面に関連して記載する。

図1は、本発明の一つの態様の化合物である、シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OMe)のNMRスペクトルを示す図である。 図2は、OVA＋CFAの抗体価希釈グラフを示す図である。 図3は、化合物33a、33b、17およびOVAの抗体価希釈グラフを示す図である。 図4は、化合物17、19、26a、26b、33a、33bおよびOVAのアジュバント活性を例示するグラフを示す図である。

発明の詳細な説明
（i）定義
以下のアミノ酸残基の標準的略語を本明細書の全体を通して用いる：Ala−アラニン；Arg−アルギニン；Asn−アスパラギン；Asp−アスパラギン酸；Cys−システイン；Glu−グルタミン酸；iGlu−イソ-グルタミン酸；Gln−グルタミン；His−ヒスチジン；Lys−リジン；Met−メチオニン；Ser−セリン；Thr−トレオニン；Phe−フェニルアラニン；Gly−グリシン；Ile−イソロイシン；Leu−ロイシン；Pro−プロリン；Val−バリン；Nval−N-バリン；Trp−トリプトファン；およびTyr−チロシン。

「Ph」なる用語はフェニルを意味する。

「Bn」なる用語はベンジルを意味する。

「Me」なる用語はメチルを意味する。

本明細書において用いられる「アルキル」なる用語は、1〜6個の炭素原子を含む直鎖および/または分枝鎖アルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。

本明細書において用いられる「アルコキシ」なる用語は、1〜6個の炭素原子を含む直鎖および/または分枝鎖アルコキシ基を意味し、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシル、イソプロピルオキシ、t-ブトキシ、ヘキシルオキシなどが含まれる。

本明細書において用いられる「アルケニル」なる用語は、2〜6個の炭素原子および1〜3つの二重結合を含む直鎖および/または分枝鎖アルケニル基を意味し、ビニル、アリル、1-ブテニル、2-ヘキセニルなどが含まれる。

本明細書において用いられる「アルケニルオキシ」なる用語は、2〜6個の炭素原子および1〜3つの二重結合を含む直鎖および/または分枝鎖アルケニルオキシ基を意味し、ビニルオキシ、アリルオキシ、プロペニルオキシル、ブテニルオキシ、ヘキセニルオキシなどが含まれる。

本明細書において用いられる「アルキレン」なる用語は、規定の数の炭素原子を含む二官能性の直鎖および/または分枝鎖アルキルラジカルを意味する。

本明細書において用いられる「ハロ」なる用語は、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨードなどが含まれる。

「薬学的に許容される」なる用語は、動物、特にヒトの治療に適合性であることを意味する。

「薬学的に許容される塩」なる用語は、動物、特にヒトの治療に適しているかまたは適合性である、酸付加塩または塩基付加塩を意味する。

本明細書において用いられる「薬学的に許容される酸付加塩」なる用語は、本発明の任意の塩基化合物、または任意のその中間体の任意の非毒性の有機塩または無機塩を意味する。酸付加塩を形成しうる本発明の塩基性化合物には、塩基性窒素、例えば、NH₂およびNHC_1〜4アルキルを有するものが含まれる。適当な塩を形成する例示的無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの金属塩が含まれる。適当な塩を形成する例示的有機酸には、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸およびサリチル酸などのモノ、ジ、およびトリカルボン酸、ならびにp-トルエンスルホン酸およびメタンスルホン酸などのスルホン酸が含まれる。一または二酸塩のいずれかを形成することができ、そのような塩は水和、溶媒和または実質的に無水型のいずれかで存在しうる。一般に、本発明の化合物の酸付加塩は、それらの遊離塩基型に比べて、水および様々な親水性有機溶媒への溶解性が高く、一般には高い融点を示す。適当な塩の選択は当業者には公知であると考えられる。他の薬学的に許容されない塩、例えばシュウ酸塩を、例えば、本発明の化合物の単離において、実験用に、または薬学的に許容される酸付加塩へのその後の変換のために用いてもよい。

本明細書において用いられる「薬学的に許容される塩基性付加塩」なる用語は、本発明の任意の酸化合物の任意の非毒性の有機または無機塩基付加塩を意味する。適当な塩を形成する例示的無機塩基には、水酸化リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムまたはバリウムが含まれる。適当な塩を形成する例示的有機塩基には、メチルアミン、トリメチルアミンおよびピコリンまたはアンモニアなどの脂肪族、脂環式または芳香族有機アミンが含まれる。適当な塩の選択は当業者には公知であると考えられる。

本明細書において用いられる「溶媒和物」なる用語は、適当な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている、本発明の化合物、または本発明の化合物の薬学的に許容される塩を意味する。適当な溶媒は投与する用量で生理的に耐容される。適当な溶媒の例は、エタノール、水などである。水が溶媒である場合、分子は「水和物」と呼ぶ。

本明細書において用いられる「本発明の化合物」なる用語は、式Iの化合物、ならびに/またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物および/もしくはプロドラッグを意味する。

本発明が、本発明の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグ、ならびに複数の本発明の化合物、本発明の化合物の薬学的に許容される塩（適用可能な場合）、本発明の化合物の薬学的に許容される溶媒和物、および本発明の化合物のプロドラッグを含む混合物を含むことは明白であるべきである。

本明細書において用いられる物質の「有効量」または「十分量」なる用語は、臨床結果を含む有益または所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」はそれが適用される文脈に依存する。例えば、免疫調整剤として作用する物質を投与する文脈において、物質の有効量は、例えば、物質を投与せずに得られる応答に比べて免疫応答の調整を達成するのに十分な量である。

本明細書において用いられ、当技術分野において十分に理解される通り、「治療」とは、臨床結果を含む有益または所望の結果を得るためのアプローチである。有益または所望の臨床結果は、検出可能または検出不能のいずれであろうと、一つまたは複数の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減弱、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の拡散の防止、疾患進行の遅延または低速化、疾患状態の改善または緩和、および緩解（部分的または全体的のいずれであろうと）を含みうるが、それらに限定されるわけではない。「治療」は、治療を受けない場合に予想されるものと比べて、生存を延長することも意味しうる。

疾患または障害を「緩和すること」とは、障害を治療しない場合に比べて、障害もしくは疾患状態の程度および/もしくは望ましくない臨床徴候が減少すること、ならびに/または進行の時間経過が遅くなる、もしくは延長されることを意味する。

本明細書において用いられる「調整する」なる用語は、機能または活性（免疫応答など）の阻害または抑制、ならびに機能または活性の増強を含む。

免疫応答などの機能または活性を「阻害する」または「抑制する」または「低減させる」とは、対象となる状態またはパラメーター以外は同じ条件と比べた場合、あるいは別の条件と比べた場合に、機能または活性を低減させることである。

免疫応答などの機能または活性を「増強する」または「増大させる」または「刺激する」とは、対象となる状態またはパラメーター以外は同じ条件と比べた場合、あるいは別の条件と比べた場合に、機能または活性を増大させることである。

本明細書において用いられる「被験体」なる用語は、ヒトを含む動物界のすべてのメンバーを含む。被験体は好ましくはヒトである。

（ii）本発明の化合物
本発明の化合物は、免疫調節タンパク質、安定剤部分および任意にさらなる機能性活性部分を含む化合物に関する。これらの部分は様々なリンカー基を介して一緒になって、同じ被験体の複数の障害を治療するために用いうる多機能化合物を提供する。

したがって、本発明は、式Iの一つまたは複数の化合物から選択される多機能生物活性化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグを含む：

式中
AはTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される免疫調節ラジカルであり、ここでアリールおよびヘテロアリール基は、ハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜6つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜4個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜6アルキル、C_1〜4アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対であり；
L¹およびL²はそれぞれ独立に、一重結合、-C(O)- -C(O)NR²-、-NR²C(O)-、-NR²-、-C(O)-O-、-OC(O)-、-S-S-、SO₂NR²-、NR²SO₂、-S-および-O-からなる群より選択されるリンカー基であり；
R²はH、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択され；
R⁵はHまたはC_1〜6アルキルであり；
^*はLもしくはD配置またはその混合物であり；
mは1〜50の整数であり；
nは0〜50の整数であり；かつ
DはH、C_1〜6アルキル、アミノ酸の任意の側鎖、および任意の機能性活性分子からなる群より選択される。

本発明の化合物において、Aは免疫調節ラジカルである。「免疫調節ラジカル」なる用語は、免疫抑制活性もしくは血液抑制活性または免疫刺激活性もしくは血液刺激活性を有する、任意の芳香族またはヘテロ芳香族含有基を意味する。具体的には、AはTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリール基はハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜6つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜4個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対である。本発明の態様において、AはTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリール基はハロ、OH、OC_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキル、C_2〜4アルケニル、C_2〜4アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜4アルキル)、N(C_1〜4アルキル)(C_1〜4アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、SO₂C_1〜4アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜4アルキル、フェニルおよびC_1〜4アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜3つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜3個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜4アルキル、C_1〜2アルキレンアリール、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜4アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対である。本発明のさらなる態様において、AはTrp、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアリールはフェニルまたはナフチルであり、かつヘテロアリールはピリジニル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、インドリル、イソキノリニル、キノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、チアゾロ、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾイソチアゾリルなどであり、Trpのインドール環、アリールおよびヘテロアリールは無置換であるか、またはハロ、OH、OC_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキル、C_2〜4アルケニル、C_2〜4アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜4アルキル)、N(C_1〜4アルキル)(C_1〜4アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、SO₂C_1〜4アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜4アルキル、フェニルおよびC_1〜4アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜2つの置換基で置換されている。

AがTrp、Tyr、PheまたはHisであるとき、この基はアミンまたはカルボキシル基を介してリンカーに連結されていてもよい。リンカーに連結されていない場合、遊離アミンまたはカルボキシル基を誘導体化してもよい。例えば、アミンをC_1〜6アルキルでモノまたはジアルキル化してもよく、C(O)C_1〜6アルキルでアシル化してもよく、または薬学的に許容される酸を加えることによりNH₃ ⁺に変換してもよい。さらに、カルボキシル基を、例えば、C_1〜6アルキルエステルとしてエステル化してもよく、C_1〜6アルキルでモノまたはジエステル化されていてもよい対応するアミドに変換してもよく、その対応するヒドラジンまたはその対応する塩基性付加塩に変換してもよい。本発明のもう一つの局面において、AがTrpであるとき、この基の免疫調整活性および血液調整活性はα-炭素の立体化学によって制御しうることが明らかにされている。例えば、立体化学がD配置であるとき、この基は免疫抑制活性および血液抑制活性を有し、L配置であるとき、この基は免疫刺激活性および血液刺激活性を有しうる。したがって、本発明の分子の免疫調整活性は特定の使用および併用療法のために制御し、調整することが可能である。

本発明の一つの態様において、Aは式IIを有する基である：

式中、R³はH、OC_1〜6アルキル、NH₂、NHC_1〜6アルキル、N(C_1〜6アルキル)₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択され、ここでYは薬学的に許容されるカチオンであり；
R⁴はH、ハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルケニル、C_1〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜4つの置換基であり；かつ
^*はLもしくはD配置またはその混合物である。

本発明は、R³がH、OC_1〜6アルキル、NH₂、NHC_1〜6アルキル、N(C_1〜6アルキル)₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択され、ここでYは薬学的に許容されるカチオンである、式Iの化合物を含む。本発明の態様において、R³はH、OC_1〜4アルキル、NH₂、NHC_1〜4アルキル、N(C_1〜4アルキル)₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択される。本発明のさらなる態様において、R³はH、Me、NH₂、NHMe、NMe₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択される。カチオン「Y」は任意の薬学的に許容されるカチオン、例えば、Na⁺、K⁺およびZn²⁺でありうる。

式Iの化合物は、R⁴がH、ハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルケニル、C_1〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜4つの置換基であるものも含む。本発明の態様において、R⁴はH、ハロ、OH、OC_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキル、C_2〜4アルケニル、C_2〜4アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜4アルキル)、N(C_1〜4アルキル)(C_1〜4アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、SO₂C_1〜4アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜4アルキル、フェニルおよびC_1〜4アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜3つの置換基である。本発明のさらなる態様において、R⁴はH、ハロ、OH、OMe、Me、ビニル、ビニルオキシ、NH₂、NHMe、NHMe₂、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)Me、C(O)OMe、SO₂Me、SO₂NH₂、SO₂NHMe、フェニルおよびベンジルからなる群より独立に選択される1〜3つの置換基である。本発明のさらなる態様において、R⁴はH、ハロ、OH、OMe、Me、ビニル、ビニルオキシ、NH₂、NHMe、NHMe₂、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)Me、C(O)OMe、SO₂Me、SO₂NH₂、SO₂NHMe、フェニルおよびベンジルからなる群より選択される1つの置換基である。本発明のさらなる態様において、R⁴はHである。

本発明の多機能生物活性化合物において、L¹およびL²はそれぞれ、一重結合、-C(O)-、-C(O)NR²-、-NR²C(O)-、-NR²-、-C(O)-O-、-OC(O)-、-S-S-、SO₂NR²-、NR²SO₂、-S-および-O-からなる群より独立に選択されるリンカー基であり、ここでR²はH、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択される。本発明の態様において、L¹およびL²はそれぞれ、一重結合、-C(O)-、-C(O)NR²-、-NR²C(O)-、-NR²-、-C(O)-O-、-OC(O)-および-O-からなる群より独立に選択される。本発明のさらなる態様において、L¹およびL²はそれぞれ、-C(O)-、-NR²-、-C(O)NR²-および-NR²C(O)-からなる群より独立に選択される。本発明の他の態様において、R²はH、C_1〜4アルキル、C_1〜4アルキレンアリール、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)Ph、SO₂C_1〜4アルキルおよびSO₂Phからなる群より選択される。本発明のさらなる態様において、R²はH、Me、Bn、C(O)Me、C(O)Ph、SO₂MeおよびSO₂Phからなる群より選択される。本発明のさらなる態様において、R²はHである。

本発明の生物活性化合物において、mは1〜50の整数である。本発明の態様において、mは1〜25の整数である。本発明のさらなる態様において、mは1〜10の整数である。本発明のさらなる態様において、mは1〜6の整数である。

本発明の多機能生物活性化合物は、nが0〜50の整数であるものを含む。本発明の態様において、nは0〜25の整数である。本発明のさらなる態様において、nは0〜10の整数である。

式Iの化合物は、R⁵がHおよびC_1〜6アルキルからなる群より選択され、かつ^*がDもしくはL配置またはその混合物を意味するものを含む。本発明の態様において、R⁵はHおよびC_1〜4アルキル、具体的にはHおよびMeから選択される。本発明のさらなる態様において、両方の^*は実質的にD配置であるか、または両方とも実質的にL配置である。

本発明の多機能生物活性化合物は、DがH、C_1〜6アルキル、アミノ酸の任意の側鎖および任意の機能性活性分子からなる群より選択されるものも含む。本発明の態様において、DはH、C_1〜4アルキル、アミノ酸の任意の側鎖および任意の機能性活性分子からなる群より選択される。機能性活性分子とは、被験体において薬理作用を有する任意の分子を意味する。この薬理作用は、免疫調節基Aを補う、増強する、もしくは協同するものであってもよく、または本発明の生物活性化合物を被験体に投与したときに、併用療法が行われるような、別の治療作用を提供してもよい。複数機能性の生物活性分子を用いてもよい。機能性活性分子の例には、パルミトイルなどのアジュバント；ペプチド鎮痛薬などの鎮痛薬；デルモルフィン、モルフィン、ナロキソンおよびその誘導体などのオピエートおよび解毒剤；抗原決定基、すなわちT-エピトープおよびB-エピトープなどの合成ワクチン；フシジン酸などの抗生物質、メトトレキセート、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、ケトプロフェンなどの小分子を含む薬学的ファーマコフォア；糖類；脂質、ならびにヌクレオチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本発明の一つの態様において、式Iの多機能生物活性化合物は下記の式を有する：

式中、L¹、L²、D、R³、R⁴、R⁵、m、nおよび^*は前述の意味を有する。

本発明のさらなる態様において、式Iの多機能生物活性化合物は下記の式を有する：

式中、L²、D、R³、R⁴、R⁵、m、nおよび^*は前述の意味を有する。

本発明の特定の態様を表す多機能生物活性化合物ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグの例を表1および表9に示す。

本発明の化合物はすべて、複数の不斉中心を有する。本発明の化合物が複数の不斉中心を有する場合、化合物はジアステレオマーとして存在しうる。そのような異性体および任意の比率のその混合物はすべて本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。本明細書において示す任意の所与の化合物において、本発明の化合物の相対的立体化学は示す通りでありうるが、そのような本発明の化合物は別の立体化学を有する本発明の化合物の特定の量（例えば、20％未満、好ましくは10％未満、より好ましくは5％未満）も含みうることが理解されるべきである。

本発明の化合物は、公知の出発原料から、当技術分野において公知の方法を用いて調製することができる。一般に、化合物は複数の実体の、例えば、標準のカップリング化学（例えば、ペプチド結合、アミド結合、ジスルフィド結合、エステル結合などの形成）を用いてのカップリングによって調製する。ジケトピペラジン部分を公知の化学を用いて調製してもよい。例えば、ジケトピペラジンは、Katchalski et al. in J. Amer. Chem. Soc., 68, 879-880 (1946)によって記載された通りのアミノ酸エステル誘導体のシクロ二量体化により、ジペプチドエステル誘導体の環化により、またはKopple et al. in J. Org. Chem., 33 (2), 862-864 (1968)によって記載された通りのアミノ酸誘導体および高沸点溶媒の熱脱水により生成することができる。

いくつかの場合には、本発明の化合物を調製するために用いる化学を、例えば、置換基として結合されている反応性基などの反応性基による副反応を防止するために、保護基の使用によって改変しなければならないこともある。これは、“Protective Groups in Organic Chemistry” McOmie, J.F.W. Ed., Plenum Press, 1973およびGreene, T.W. and Wuts, P.G.M., “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 3^rd Edition, 1999に記載の通常の保護基によって達成しうる。

所望の化合物の塩の生成は標準の技術を用いて達成する。例えば、中性化合物を適当な溶媒中、酸または塩基で処理し、生成した塩をろ過、抽出、または任意の他の適当な方法によって単離する。

本発明の化合物の溶媒和物の生成は、化合物および溶媒和物に応じて変動することになる。一般には、溶媒和物は、化合物を適した溶媒に溶解し、冷却または貧溶媒の使用によって溶媒和物を単離することにより生成する。溶媒和物は、典型的には周囲条件下で乾燥または共沸させる。

本発明は、その範囲内に、本発明の化合物のプロドラッグを含む。一般に、そのようなプロドラッグは、それが概念的に誘導された元の化合物にインビボで容易に変換される、本発明の化合物の機能性誘導体である。本発明の化合物のプロドラッグは、利用可能なヒドロキシ、チオール、アミノまたはカルボキシル基によって形成される通常のエステルであってもよい。例えば、本発明の化合物における利用可能なOHまたはNH₂基を、塩基存在下、任意に不活性溶媒中の活性化酸（例えば、ピリジン中の酸塩化物）を用いてアシル化してもよい。プロドラッグとして用いられているいくつかの一般的エステルは、フェニルエステル、脂肪族（C₈〜C₂₄）エステル、アシルオキシメチルエステル、カルバメートおよびアミノ酸エステルである。さらなる態様において、本発明の化合物のプロドラッグは、化合物の一つまたは複数のヒドロキシ基が、インビボでヒドロキシ基に変換されうる基としてマスクされているものである。適当なプロドラッグを選択および調製するための通常の方法は、例えば、“Design of Prodrugs” ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されている。

本発明は、本発明の化合物の放射性標識型、例えば、構造内に³Hもしくは¹⁴Cまたは¹²⁵Iなどの放射性ハロゲンを組み込むことにより標識した本発明の化合物を含む。放射性標識された本発明の化合物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて調製してもよい。例えば、トリチウムを本発明の化合物に、標準の技術、例えばトリチウムガスおよび触媒を用いて適当な前駆体を本発明の化合物に水素添加することにより組み込んでもよい。または、放射性ヨードを含む本発明の化合物を、対応するトリアルキルスズ（適当にはトリメチルスズ）誘導体から、ジメチルホルムアミドなどの適当な溶媒中、クロラミン-T存在下、[¹²⁵I]ヨウ化ナトリウムなどの標準的ヨウ素化条件を用いて調製してもよい。トリアルキルスズ化合物は、対応する非放射性ハロ、適当にはヨード化合物から、標準のパラジウム触媒スズ化条件、例えば、ジオキサンなどの不活性溶媒中、高温、適当には約50〜100℃で、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)存在下、ヘキサメチル2スズを用いて調製してもよい。

（iii）使用
本発明は式Iの新規化合物を提供する。したがって、本発明は、治療方法および薬学的組成物におけるそれらの使用、診断アッセイ法におけるそれらの使用、ならびに研究用の手段としてのそれらの使用を含む、本発明の化合物のすべての使用を含む。

本発明は特に、本発明の多機能生物活性化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。

同様に、免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害の治療方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法も本発明に含まれる。さらに、免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害を治療するための本発明の多機能生物活性化合物の使用、ならびに免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害治療用の薬剤を調製するための本発明の多機能生物活性化合物の使用も提供する。

一つの局面において、本発明は動物の免疫系および/または造血を調整する方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法を提供する。

本発明の一つの態様において、免疫系を刺激する方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法を提供する。もう一つの態様において、本発明は、例えば、放射線照射または細胞分裂抑制剤が原因で造血が損なわれている動物の造血を回復する方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法を提供する。

さらにもう一つの態様において、本発明は、造血障害、例えば、それらに限定されるわけではないが、免疫細胞減少症、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ肉腫、特にB細胞リンパ性白血病の治療方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法を提供する。

もう一つの態様において、本発明は、動物の癌などの免疫および/または造血障害の治療方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に、可能であれば細胞分裂抑制剤との併用で投与する段階を含む方法を提供する。細胞分裂抑制剤は、例えば、オキシ尿素または温熱療法でありうる。

さらにもう一つの態様において、本発明は、動物の免疫系の免疫抑制方法であって、本発明の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む方法にも関する。一つの態様において、化合物は臓器または骨髄移植の前に投与してもよい。本発明の化合物の免疫調節特性は、例えば、化合物の「A」部分および「^*」の立体化学によって制御しうる。

本発明の化合物は、遊離塩基、遊離酸の形、塩、溶媒和物および/またはプロドラッグの形で用いてもよい。すべての形は本発明の範囲内である。

本発明の方法に従い、記載する化合物、その塩、プロドラッグまたは溶媒和物を、当業者には理解されると考えられる通り、選択した投与経路に応じて様々な形で患者に投与してもよい。本発明の組成物を、例えば、経口、非経口、口腔内、舌下、鼻内、直腸内、パッチ、ポンプまたは経皮（局所）投与により投与してもよく、薬学的組成物をそれに応じて製剤化してもよい。非経口投与には、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻内、肺内、クモ膜下、直腸内および局所投与様式が含まれる。非経口投与は、選択した期間にわたる持続注入によって投与されてもよい。

本発明の化合物は、例えば、不活性希釈剤もしくは同化可能な食用担体と共に経口投与してもよく、またはゼラチン硬もしくは軟カプセル中に封入してもよく、または圧縮して錠剤としてもよく、または食物と共に直接組み込んでもよい。経口による治療的投与のために、本発明の化合物を賦形剤と共に組み込み、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウェーハ(wafer)などの剤形で用いてもよい。

本発明の化合物は、非経口投与してもよい。本発明の化合物の溶液を水中で、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合して調製することができる。分散剤も、アルコールを含むかまたは含まない、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、DMSOおよびその混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防止するために保存剤を含む。当業者であれば、適当な製剤をいかに調製するかを知っているであろう。適当な製剤の選択および調製のための通常の方法および成分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (2003 - 20th edition)および1999年発行の米国薬局方：米国国民医薬品集（USP 24 NF19）に記載されている。

注射による使用に適した薬学的剤形には、滅菌水性液剤または分散剤、および滅菌注射用液剤または分散剤の即時調製用の滅菌散剤が含まれる。すべての場合に、剤形は無菌でなければならず、容易に注射操作可能な程度に流動性でなければならない。アンプルは好都合な単位用量である。

鼻内投与用の組成物は、エアロゾル、滴剤、ゲルおよび散剤として都合よく製剤化しうる。エアロゾル製剤は典型的には、生理的に許容される水性または非水性溶媒中の活性物質の溶液または微細な懸濁液を含み、通常は密封容器中、無菌型の1回または複数回用量で提供され、カートリッジの形または噴霧器具と共に用いるための補充品の形を取りうる。または、密封容器は使い捨てが意図される1回用量の鼻吸入器または計量弁付きのエアロゾルディスペンサーなどの単位投薬器具であってもよい。剤形がエアロゾルディスペンサーを含む場合、これは圧縮空気などの圧縮ガスまたはフッ化塩素化炭化水素(fluorochlorohydrocarbon)などの有機噴射剤でありうる噴射剤を含むことになる。エアロゾル剤形はポンプ噴霧器の形を取ることもできる。

口腔内または舌下投与に適した組成物には、錠剤、ロゼンジ、および香錠が含まれ、ここで活性成分を糖、アカシア、トラガカント、またはゼラチンおよびグリセリンなどの担体と共に製剤化する。直腸内投与用の組成物は、カカオ脂などの通常の坐剤基剤を含む坐剤の形が好都合である。

局所投与用の組成物には、例えば、プロピレングリコール、イソプロピルアルコール、鉱油およびグリセリンが含まれうる。局所投与に適した製剤には、リニメント、ローション、塗布剤などの液体もしくは半液体製剤；クリーム、軟膏もしくはペーストなどの水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤；または滴剤などの液剤もしくは懸濁剤が含まれる。前述の成分に加えて、局所製剤は、希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル（抗酸化剤を含む）、乳化剤などの一つまたは複数の追加の成分を含んでいてもよい。

持続または直接放出組成物を、例えば、リポソーム、またはマイクロカプセル化、多層コーティングなどによる活性化合物が区別して分解されるコーティングで保護されているものとして製剤化することができる。本発明の化合物を凍結乾燥し、例えば、注射用製剤を調製するために、得られた凍結乾燥品を用いることも可能である。

前述の通り、本発明の化合物を単独または薬学的に許容される担体と組み合わせて被験体に投与してもよく、その比率は化合物の溶解性および化学的性質、選択した投与経路、ならびに標準の薬学的慣例によって決定される。

本発明の化合物および/または組成物の用量は、化合物の薬力学的性質、投与様式、受容者の年齢、健康および体重、症状の特性および程度、治療の頻度および併用治療を行っている場合にはそのタイプ、ならびに治療する被験体における化合物の排出速度などの多くの因子に応じて変動しうる。当業者であれば、前述の因子に基づき、適当な用量を決定することができる。例えば、局所治療において、1〜1000μg/gの本発明の化合物を含む軟膏、クリームまたはローションを塗布しうる。経口製剤は、好ましくは、用量単位あたり0.5〜1000μgの本発明の化合物を含む錠剤、カプセル剤、または滴剤として製剤化してもよい。本発明の化合物は、最初は適当な剤形で投与してもよく、臨床反応に応じて必要があれば調節してもよい。短期間、例えば、30分〜1時間またはそれ以上の細胞のエクスビボ治療のために、長期インビボ療法よりも高い用量の化合物を用いてもよい。

前述の治療的使用に加えて、本発明の組成物は診断アッセイ法、スクリーニングアッセイ法において、および研究手段として、有用である。

診断アッセイ法において、本発明の化合物は免疫障害を特定または検出する際に有用でありうる。そのような態様において、本発明の化合物を放射性標識（本明細書において前述した通り）し、細胞集団と接触させてもよい。細胞上の放射性標識の存在が免疫障害を示しうる。

スクリーニングアッセイ法において、免疫応答を調整する他の化合物を特定するために本発明の化合物を用いてもよい。そのようなアッセイ法において、化合物を放射性標識してもよい。

以下の非限定例は本発明の例示である。

実施例
材料と方法
NMR実験をBruker Avance DRX 500分光計で実施した。スペクトルは30℃の(CD₃)₂SO 0.6μl（99.95％重水、Deiton、S.Peterburg）中で得た。5.0秒の緩和遅延を用いた。¹Hの化学シフトを(CH₃)₂SOシグナル（30℃で2.5ppmとして任意に選択）に対して求めた。

HPLC分析をSystem Gold Beckman分析勾配クロマトグラフィ装置で実施した。カラム：Ultrasphere-ODS、5μ、205×4.6mm。検出：UV分光計、λ214nm。周囲温度。勾配：アセトニトリル中0.02Mリン酸トリエチルアンモニウム緩衝液（pH=3.0）（緩衝液A 0％から緩衝液B 100％）。緩衝液A：アセトニトリル中0.02Mリン酸トリエチルアンモニウム15％。緩衝液B：アセトニトリル中0.02Mリン酸トリエチルアンモニウム50％。

質量スペクトルをVISION 2000 MALDI質量分析計で得た。

実施例1：シクロ-L-Ala-L-Glu(OH)の調製
（a）Boc-L-Ala-L-Glu(OBzl)-OHの調製
Boc-L-Ala-ONSu（56.5g、0.1mol）およびH-L-Glu(OBzl)-OH 26.1g（0.11mol）を、ジオキシン/水（1：1）500mlおよびN-メチルモルホリン（11.7ml）と、pH約9〜9.2に達するまで混合した。室温で12〜18時間後に懸濁液は溶解した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留油状物をEtOAc 500mlに溶解し、これを次いで分液漏斗に移し、5％H₂SO₄水溶液3×200mlでpHが中性になるまで洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥後、EtOAcを減圧下で蒸発させた。粗生成物は油状物で、収量は40.5g（約100％）であった。R_f=0.6（CHCl₃：Et-Ac：MeOH=6：3：1）。

（b）Boc-L-Ala-L-Glu(OBzl)-ONpの調製
Boc-L-Ala-L-Glu(OBzl)-OH（40.5g、0.1mol）をEtOAc 300mlに溶解し、p-ニトロフェノール17g（0.12mol）と混合した。反応混合物を0℃で1時間維持した。次いでDCC（24.7g、0.12mol）を加えた。反応混合物を0℃で1時間と室温で4時間撹拌した。DCUの沈澱をろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。次いで、残留油状物をエーテルに溶解した。沈澱をろ過し、エーテルおよびへキサンで洗浄した。収量は35g（64％）であった。R_f=0.7（CHCl₃：Et-Ac：MeOH=6：3：1）。

（c）シクロ-L-Ala-L-Glu(OBzl)の調製
Boc-L-Ala-L-Glu(OBzl)-ONp（56.0g、0.1mol）を溶解し、-15℃まで冷却した。TFAを加え、混合物を1時間撹拌し、徐々に室温まで昇温させた。反応の完了をTLCでCHCl₃：Et-OAc：MeOH=6：3：1の系を用いてモニターした。反応完了後、混合物を減圧下で蒸発させ、次いでイソプロパノールと共に2回蒸発させ、EtOAc 500mlに溶解した。N-メチルモルホリンを、混合物のpHレベルが9〜9.5に達するまで加えた。12時間後、シクロ-L-Ala-L-Glu(OBzl)が沈澱した。沈澱をろ過し、EtOAc、エーテルおよびヘキサンで洗浄した。収量は21.0g（70％）であった。R_f=0.55（CHCl₃：Et0Ac：Me0H：Ac0H=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間15.9分。

（d）シクロ-L-Ala-L-Glu(OH)の調製
シクロ-L-Ala-L-Glu(OBzl)（14.5g、0.05mol）をトリフルオロエタノール200mlに溶解し、次いでパラジウム黒1.5gを加えた。水素を懸濁液に通気し、混合物を48時間撹拌した。反応の完了をTLCでモニターした。反応完了後、触媒をろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留ペプチドを蒸留水200mlに溶解し、不純物をEtOAc 3×100mlで抽出した。水相を合わせ、減圧下で蒸発させた。沈澱をエーテルおよびヘキサンで洗浄し、次いで風乾した。収量は10.2g（94％）であった。R_f=0.2（CHCl₃：EtOAc：MeOH：AcOH=6：3：1：0.1）；R_f=0.5（CHCl₃：EtOAc：MeOH：32％AcOH=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間6.7分。

実施例2：シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)の調製
（a）シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OMe)の調製
シクロ-L-Ala-L-Glu-(OH)（2.2g、0.01mol）をDMF 50mlに溶解し、次いで60℃に加熱した。ペプチドを溶解した後、混合物を-15℃に冷却した。-15℃に冷却したクロロギ酸イソ-ブチル（1.5ml、0.012mol）を加え、続いてN-メチルモルホリン 1.4ml（0.012mol）を加えた。反応混合物を-15℃で5分間撹拌し、いずれも-15℃に冷却したDMF 20ml中のHCl H-L-Trp-OMe 2.8g（0.011mol）の溶液およびN-メチルモルホリン1.4ml（0.012mol）を加えた。0℃で1時間撹拌した後、反応混合物を室温まで4時間かけて徐々に加熱した。沈澱をろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留油状物をn-ブタノール/水の混合物100mlに溶解し、分液漏斗に移した。有機層を分離し、5％H₂SO₄ 3×50mlおよび5％NaHCO₃水溶液3×50mlで洗浄した。N-ブタノールを減圧下で蒸発させ、エーテルを残留油状物に加えた。沈澱をろ過し、エーテルおよびヘキサンで洗浄した。収量は3.4g（80％）であった。R_f=0.7（CHCl₃：Et-Ac：MeOH：AcOH=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間16.6分。シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OMe)のスペクトルを図1に示す。

（b）シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)の調製
シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OMe)（1.1g、0.0025mol）をEtOH 50mlに懸濁し、水25ml中のNaOH 0.15g（0.0075mol）を加えた。混合物を約2時間撹拌した。反応完了後、混合物がpH約7に達するまでHClを加えた。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留混合物を分液漏斗に移し、n-ブタノール50mlおよびpH=3の水を加えた。有機層を分離し、水で中性pHになるまで洗浄し、次いで減圧下で蒸発させた。残渣をイソプロパノールと共に2回蒸発させ、次いでエーテルを加えた。沈澱をろ過し、エーテルおよびヘキサンで洗浄した。収量は0.9g（82％）であった。R_f=0.5（CHCl₃：Et-Ac：MeOH：AcOH=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間9.3分；質量分析データ： [M+H⁺+Na]=407.7。

同様の様式で、下記のその他の化合物を調製した。これらの化合物のいくつかの質量スペクトルデータを以下に示す。
シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OMe)
シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=407.7
シクロ-D-Ala-D-Glu-(D-Trp-OMe)
シクロ-D-Ala-D-Glu-(D-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=407.9
シクロ-L-Ala-L-Glu-(D-Trp-OMe)
シクロ-L-Ala-L-Glu-(D-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=408.1
シクロ-D-Ala-D-Glu-(L-Trp-OMe)
シクロ-D-Ala-D-Glu-(L-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=407.6
シクロ-D-Ala-D-Asp-(D-Trp-OMe)
シクロ-D-Ala-D-Asp-(D-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=394.1
シクロ-D-Ala-D-Asp-(L-Trp-OMe)
シクロ-D-Ala-D-Asp-(L-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=394.7
シクロ-L-Ala-L-Asp-(D-Trp-OMe)
シクロ-L-Ala-L-Asp-(D-Trp-OH)
シクロ-L-Ala-L-Asp-(L-Trp-OMe)
シクロ-L-Ala-L-Asp-(L-Trp-OH)：質量スペクトルデータ：[M+H⁺+Na]=395.3

実施例3：シクロ-L-Lys(H₂N)-L-Glu-(L-Trp-NH₂)の調製
（a）Fmoc-L-Lys(Boc)-L-Glu(OBzl)-OHの調製
Fmoc-L-Lys(Boc)-ONSu（56.5g、0.1mol）およびH-L-Glu(OBzl)-OH 26.1g（0.11mol）をジオキシン/水（1：1）500mlおよびN-メチルモルホリン（11.7ml）と、pH約9〜9.2に達するまで混合した。室温で12〜18時間後に懸濁液は溶解した。溶媒を減圧下で蒸発させた。次いで、残留油状物をEtOAc 500mlに溶解し、これを次いで分液漏斗に移し、5％H₂SO₄水溶液3×200mlでpHが中性になるまで洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥後、EtOAcを減圧下で蒸発させた。粗生成物は油状物で、収量は69.0g（約100％）であった。R_f=0.8（CHCl₃：Et-Ac：MeOH=6：3：1）。

（b）H-L-Lys(Boc)-L-Glu(OBzl)-OHの調製
Fmoc-L-LyS(BoC)-L-Glu(OBzl)-OH（69.0g、0.1mol）をジオキサン中20％ピペリジン300mlに溶解し、室温で1時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留油状物を0.1％AcOHに溶解した。沈澱をろ過し、0.1％AcOHおよび水でpHが中性になるまで洗浄した。収量は43.7（94％）であった。R_f=0.5（CHCl₃：MeOH：32％AcOH=5：3：1）。

（c）シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu(OBzl)の調製
H-L-Lys(Boc)-L-Glu(OBzl)-OH（23.0、0.05mol）をピリジン100mlに溶解し、約4時間還流した。反応をTLCでCHCl₃：MeOH：32％AcOH=5：3：1の系を用いてモニターした。反応完了後、混合物を減圧下で蒸発させ、0.1％AcOH 500mlを加えた。シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu(OBzl)が沈澱した。沈澱をろ過し、水で洗浄し、40℃の減圧乾燥器で乾燥させた。収量は20.9（86％）であった。R_f=0.75（CHCl₃：MeOH：32％AcOH=5：3：1）；HPLCデータ：保持時間19.2分。

（d）シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu(OH)の調製
シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu(OBzl)（22.2g、0.05mol）をトリフルオロエタノール200mlに溶解し、パラジウム黒1.5gを加えた。水素を懸濁液に撹拌しながら48時間通気した。反応をTLCでモニターした。反応完了後、触媒をろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留ペプチドを蒸留水200mlに溶解し、不純物をEtOAc 3×100mlで抽出した。水相を合わせ、減圧下で蒸発させた。沈澱をエーテルおよびヘキサンで洗浄し、風乾した。収量は16.7g（90％）であった。R_f=0.4（CHCl₃：EtOAc：MeOH：32％AcOH=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間12.7分。

（e）シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu-(L-Trp-NH₂)の調製
シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu-(OH)（3.7g、0.01mol）をピリジン50mlに溶解し、TBTU 0.012molを加え、続いてN-メチルモルホリン1.4ml（0.012mol）を加えた。反応混合物を室温で5分間撹拌し、ピリジン20ml中のHCl H-L-Trp-NH₂ 2.8g（0.011mol）の溶液およびN-メチルモルホリン1.4ml（0.012mol）を加えた。反応をTLCでモニターした。4時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留油状物をn-ブタノール/水の混合物100mlに溶解し、分液漏斗に移した。有機層を分離し、5％H₂SO₄ 3×50mlおよび5％NaHCO₃水溶液3×50mlで洗浄した。N-ブタノールを減圧下で蒸発させ、エーテルを残留油状物に加えた。沈澱をろ過し、エーテルおよびヘキサンで洗浄した。収量は5.0g（88％）であった。
R_f=0.6（CHCl₃：EtOAc：MeOH：32％AcOH=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間18.6分。

（f）シクロ-L-Lys(H₂N)-L-Glu-(L-Trp-NH₂)の調製
シクロ-L-Lys(Boc)-L-Glu-(L-Trp-NH₂)（2.9g、0.005mol）を0.1％ジチオスレイトールを含む50％TFA/CH₂Cl₂ 50mlに溶解した。混合物を約1時間撹拌した。反応完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留油状物を水50mlに溶解し、分液漏斗に移した。酢酸エチル（50mL）を加えた。残留不純物を抽出した。有機層を分離して、廃棄した。水を減圧下で蒸発させ、油状物を蒸留水50mlに溶解し、凍結乾燥させた。収量は2.7g（トリフルオロ酢酸塩として92％）であった。R_f=0.35（CHCl₃：Et-Ac：MeOH：AcOH=6：3：1：0.1）；HPLCデータ：保持時間7.9分。

実施例4：インビボでの免疫抑制剤の効果
無傷の骨髄に対する試験物質の効果をインビボで試験した。ペプチドをマウスに異なる様式で導入した。すなわち、無傷のドナーマウスに10〜1000μg/kgの用量で皮下注射、腹腔内注射（IP）または経口で導入した。製剤投与の2日後、マウスを屠殺した。骨髄懸濁液を調製し、致死的に放射線照射したマウスの静脈内に注射した。コロニー形成活性を第8日目に評価した。試験動物は（CBA×C57 B1）F1マウスであった（1回に30匹、3試験からの平均）。

表2に示す通り、無傷のマウスにサイモデプレッシン（thymodepressin）および本発明の新規シクロペプチドを導入すると、骨髄のCFU-S集団が減少することが判明した。

骨髄におけるCFU-S集団の抑制に対する本発明の新規シクロペプチドとサイモデプレッシンとの活性の比較を、表3に示す。

実施例5：インビボでの免疫賦活薬の効果
イオン化放射線の有害効果減少におけるネオジェン（Neogen）および本発明の新しい環状ペプチドの活性を比較する試験を行った。

この試験において、外因性脾臓コロニーの方法を適用した。無傷の骨髄細胞の懸濁液をエクスビボで1Gyの線量で放射線照射した。致死的に放射線照射した受容マウスに、放射線照射した骨髄の注射後1時間以内に、異なる用量のネオジェンまたは環状ペプチドをIP、IM、皮下注射、または経口導入した。コロニーを第8日目に計数した。各群のデータはすべて3試験の平均であった。

表4のデータは、ネオジェンが、造血前駆細胞に対する放射線の有害効果後の再生過程を刺激しうることを示している。この過程はIMまたはIP注射では効果的であるが、経口投与では無効であることが示された。研究中の新しい環状ペプチドは全身投与中に同じ範囲の活性を有し、経口では10〜100μg/kgの用量範囲で活性である。

実施例6：シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-ONa)のアジュバント活性
アジュバント活性を5群のマウス（C57B16）で試験した。各群は5匹のマウスで構成された。3回の免疫化を実施した。
第1回免疫化：
1. 完全フロイントアジュバント（CFA）群
2. オボアルブミン（OVA卵）（25マイクログラム/マウス）群
3. CFA＋オボアルブミン（25マイクログラム/マウス）群
4. オボアルブミン（25マイクログラム/マウス）＋ペプチド1マイクログラム/マウス群
5. オボアルブミン（25マイクログラム/マウス）＋ペプチド10マイクログラム/マウス群

第2回免疫化：
第1回免疫化の21日後にオボアルブミン12.5マイクログラム/マウスを第2〜5群に注射することによる同じセット。

第3回免疫化：
第1回免疫化の35日後にオボアルブミン12.5マイクログラム/マウスを第2〜5群に注射することによる同じセット。

第42日目に、各マウスから全血を採取した。各群のマウスからの血液をプールした。各群の刺激指標を比較した。刺激指標は、第3〜5群の希釈プールの光学密度（OD=1）と第2群（アジュバントなしの対照群）の希釈プールの光学密度（OD=1）との間の比で計算した。

表5に示す通り、この実験の結果からシクロペプチドであるシクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-ONa)は単独で、糖またはパルミトイル官能基をカップリングすることによるさらなる改変なしでもアジュバント活性を有し、オボアルブミンに対する抗体価を74％高めることが明らかである。

実施例7：シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物17）のアジュバント活性
アジュバント活性を6群のマウスで試験した。各群は5匹のマウスで構成された。3回の免疫化を以下の通りに実施した。
第1回免疫化：
1. マウスNo.1〜5−完全フロイントアジュバント（CFA=対照群）
2. マウスNo.6〜10−オボアルブミン（OVA卵）25マイクログラム/マウス＋アジュバント100マイクログラム/マウス
3. マウスNo.11〜15−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋CFA
4. マウスNo.16〜20−オボアルブミン25マイクログラム/マウス
5. マウスNo.21〜25−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋アジュバント1マイクログラム/マウス
6. マウスNo.26〜30−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋アジュバント10マイクログラム/マウス

第2回免疫化：
第1回免疫化の21日後にオボアルブミン12.5マイクログラム/マウスをマウスNo.6〜30に注射することによる同じセット。

第3回免疫化：
第1回免疫化の35日後にオボアルブミン12.5マイクログラム/マウスをマウスNo.6〜30に注射することによる同じセット。

第42日目に、各マウスから血液試料を採取した。各群の刺激指標を比較した。刺激指標は、OD=1となるプールした試験血清希釈液をOD=1となるアジュバントなしで免疫化したマウスからプールした血清希釈液で割ることにより計算した。結果を表6に示す。

実施例8：シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物17）、シクロ[L-Lys(パルミトイル)-L-Glu(D-Trp-OH)]（化合物26a）、シクロ[D-Lys(パルミトイル)-D-Glu(D-Trp-OH)]（化合物26b）、シクロ-L-Lys(N-アセチル-グリコサミン-N-アセチル-ムラミル)-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物33a）、およびシクロ-D-Lys(N-アセチル-グリコサミン-N-アセチル-ムラミル)-D-Glu-(L-Trp-OH)（化合物33b）のアジュバント活性
段階1：
アジュバント活性をBalb/cマウス（Stolbovaya Breeding Stationから入手）11群で試験した。各群は7匹のマウスで構成された。3回の免疫化を以下の通りに実施した。
第1回免疫化：
第1群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス（マウスNo.1〜7）
第2群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋CFA（完全フロイントアジュバント）（マウスNo.8〜14）
第3群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物33aのアジュバント100マイクログラム/マウス（マウスNo.15〜21）
第4群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物33aのアジュバント10マイクログラム/マウス（マウスNo.22〜27）
第5群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物33aのアジュバント1マイクログラム/マウス（マウスNo.28〜35）
第6群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物33bのアジュバント100マイクログラム/マウス（マウスNo.36〜42）
第7群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物33bのアジュバント10マイクログラム/マウス（マウスNo.43〜49）
第8群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物33bのアジュバント1マイクログラム/マウス（マウスNo.50〜56）
第9群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物17のアジュバント100マイクログラム/マウス（マウスNo.57〜63）
第10群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物17のアジュバント10マイクログラム/マウス（マウスNo.64〜70）
第11群−オボアルブミン25マイクログラム/マウス＋化合物17のアジュバント1マイクログラム/マウス（マウスNo.71〜77）

第2回免疫化：
第1回免疫化の14日後にオボアルブミン12.5マイクログラム/マウスをマウスNo.1〜77に注射することによる同じセット。

第3回免疫化：
第1回免疫化の28日後にオボアルブミン12.5マイクログラム/マウスをマウスNo.1〜77に注射することによる同じセット。

第1回免疫化後第35日目に、各マウスから血液試料を採取した。

酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）：
0.05M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）中のOVA（10マイクログラム/ml）溶液をプレートのウェルに0.1ml/ウェルで加え、4℃で16時間インキュベートした。次いで、OVA溶液を除去し、プレートを0.05％Tween-20を含むPBSで4回洗浄した。そのような洗浄を各インキュベーション段階の後に実施した。血清の二倍段階希釈液（1：100または1：1000から開始）をウェルに0.1ml/ウェルで加え、37℃で1時間インキュベートした後、HRP結合ヤギ抗マウスIgG抗体（PBS中1mg/mlを0.1ml）と、次いで基質溶液−0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH4.5中、0.05％H₂O₂および0.05％o-フェニレンジアミン0.1mLと共にインキュベートした（37℃で1時間）。12.5％H₂SO₄ 100μlを加えることにより反応を停止した。吸光度を、492nmの波長でMultiscan Plus MKII (Flow Laboratories, Great Britain)を用いて測定した。有意な抗タンパク質抗体価（個々の血清）を、0.1 ODUよりも高い吸光度を示す血清希釈液として評価し、最小値は対照レベルの3倍を超える。抗体価を希釈の-logとして示した（図2および3）。プールした血清の刺激指標を、OD=1となるプールした試験血清希釈液をOD=1となるアジュバントなしで免疫化したマウスからプールした血清希釈液で割ることにより計算した。シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物17）、シクロ-L-Lys(N-アセチル-グリコサミン-N-アセチル-ムラミル)-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物33a）およびシクロ-D-Lys(N-アセチル-グリコサミン-N-アセチル-ムラミル)-D-Glu-(L-Trp-OH)（化合物33b）のアジュバント活性の結果を表7に示し、シクロ[L-Lys(パルミトイル)-L-Glu(D-Trp-OH)]（化合物26a）およびシクロ[D-Lys(パルミトイル)-D-Glu(D-Trp-OH)]（化合物26b）のアジュバント活性を表8に示し、かつ図4にも示すが、これはシクロ-L-Lys-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物19）のアジュバント活性の結果も含む。化合物26aおよび26bのペプチドは0.1％NH₄OHに1〜2mlあたり1mgの濃度で可溶性であることが注目される。これらのペプチドは0.1％AcOHでpH=8.4〜8.5に滴定した場合でも可溶性のままである。図4に示す化合物のアジュバント活性の結果から明らかである通り、化合物17は1、10および100μg/kgで活性であり；化合物19は100μg/kgで活性であり；化合物33aは100μg/kgで活性であり；化合物33bは活性化合物ではなく、化合物26aは10μg/kgで活性であり；かつ化合物26bは活性化合物ではない。

実施例9：新しいデルモルフィン類縁体に対する試験
（i）末梢オピオイド活性の評価
ペプチドの末梢オピオイド活性を、単離モルモット回腸（GPI）の電気的に誘導した収縮を阻害する能力に基づいて評価した（Kosterlitz, H.W. et al., “The effect of adrenaline, noradrenaline and isoprenaline on inhibition a- and b-adrenoreceptors in the longitudinal muscle of the guinea pig ileum”, Brit. J. Pharmacol, Vol. 39., Pages 398 to 413, 1970）。

長さ約1cmのGPI切片を、34℃のクレブス液を含む10mlの器官槽に設置した。クレブス液の組成は次の通りであった（mM）：NaCl−118；KCl−4.70；CaCl₂−2.52；KH₂PO₄−0.93；MgSO₄−1.27；NaHCO₃−25；グルコース−11.0。器官の静止張力は1gであった。GPIの切片を80V、0.1Hzで持続時間1msのシングルパルスにより刺激した。単離器官を入れた溶液を常に通気した。収縮をセンサーK 30（Hugo Sachs Elektronic KG）および紙記録器Rikadenki-series（日本）により等尺モードで記録した。

試験物質を蒸留水に溶解し、器官槽に5〜30mclの量で累積的に加えた。単離器官を3〜4回、12〜15分間洗浄した後、後の各物質を加えた。得られたデータに基づき、用量-効果曲線をプロットし、物質の活性をIC₅₀またはpD₂で表した。pD₂指標は最大効果の50％を生じる物質濃度の負の常用対数であった。

結果の統計処理をスチューデントt-検定により行った。

新しいデルモルフィン類縁体をモルモット回腸結合試験の標準モデルで試験した。各分子について、EC₅₀を収縮幅の基準レベルから50％の低下を引き起こす物質の濃度として求めた。

すべての実験で標準製剤はデルモルフィンであった。オピオイド活性の確認のために、特異的拮抗剤であるナロキソンを10^-5Mの濃度で用いた。各分子を5回別々に繰り返して試験し、相対活性をEC₅₀の負の対数（pD₂）として計算した。

表9に示す通り、試験したペプチドは、H-Tyr-Tyr-Pro-Ser-NH₂（化合物51）およびD-Ala-D-Glu-(D-Trp)-OH（化合物54）以外はすべて、10^-9〜10^-5Mの範囲の異なるレベルのオピオイド活性を有していた。

（ii）新しいオピオイドペプチド類縁体の鎮痛活性
220匹のマウスF1（CBA×C57D16）第一世代雑種を用いて、「テールフリック」試験により鎮痛活性を試験した。水温は48℃であった。最大効果は30秒間であった。すべてのペプチドを5、10または20mg/kgの用量で腹腔内注射した。鎮痛効果をペプチド注射後15〜120分の間隔で推定した。結果の統計計算にはスチューデントt基準を用いた。統計学的有意性はp≦0.05のレベルであった。試験の結果を表10に示す。

（iii）デルモルフィンおよび類縁体の経口投与および腹腔内投与後の鎮痛活性
本発明の新規シクロペプチドの経口活性を推定するために、「テールフリック」試験を用いた。結果を、腹腔内投与を用いて得たものと比較した。

本発明のペプチドの抗侵害受容活性を、体重22〜24gのBALB/c雄マウスによる実験で評価した。ペプチドを食塩水に溶解し、腹腔内または胃内投与した。

「テールフリック」試験（D'Amour, F.E. et al. “A Method for Determining Loss of Pain Sensation”, J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol. 72, Pages 74 to 79, 1941）を無痛覚計812型、Hugo Sachs Electronick KGで実施した。抗侵害受容活性は、ベースライン反応が2.0〜3.0秒の場合に6秒間の集束熱放射線によって刺激しても、テールフリック反応がないこととして定義した。

結果の統計処理を対応スチューデントt検定により行った。これらの試験の結果を表11および12に示す。実験から明らかである通り、神経ペプチドのシクロ類縁体のみが経口（胃内）投与で活性である。

本発明を現在好ましい実施例と考えられるものに関して記載してきたが、本発明は開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。これとは反対に、本発明は添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な改変および等価の配列を対象とすることが意図される。

すべての出版物、特許および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により本明細書に組み入れられると示された場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本出願における用語が本明細書に組み入れられる文書において異なる定義をされていることが判明した場合、本明細書に示した定義がその用語の定義となる。

（表１）
本発明の多機能生物活性化合物ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグの例

本発明の多機能生物活性化合物ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグの例（続き）

（表２）新規ペプチドで処置したマウスの骨髄細胞による脾臓コロニー形成

^*対照と比較してP<0.05

（表３）骨髄におけるCFU-S集団の抑制に対する本発明の新規化合物とサイモデプレッシンとの活性の比較

^*対照と比較してP<0.05

（表４）インビトロで骨髄を1Gyで照射することによる外因性脾臓コロニー形成に対するネオジェンおよび本発明の新規環状ペプチドの効果

^**有意性をこの群に対して計算した
^*P<0.05

（表５）シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-ONa)のアジュバント活性

（表６）シクロ-L-Ala-L-Glu-(L-Trp-OH)（化合物17）のアジュバント活性

（表７）タンパク質-アジュバント免疫化後の抗OVA抗体価および対応する刺激指標

（表８）アジュバント化合物26aおよび26bの刺激指標

（表９）ペプチドの末梢オピオイド活性のインビトロ（GPI−μ-受容体結合活性）試験結果

（表１０）オピオイドペプチド類縁体の鎮痛活性

統計学的に有意なデータ（p≦0.05）を太字で示す。

（表１１）「テールフリック」試験で決定した経口投与後のデルモルフィンおよび類縁体の鎮痛活性

統計学的に有意なデータ（p≦0.05）を太字で示す。

（表１２）腹腔内投与後のデルモルフィンおよび類縁体の鎮痛活性

統計学的に有意なデータ（p≦0.05）を太字で示す。

Claims (33)

1. 式Iの一つまたは複数の化合物から選択される多機能生物活性化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグ：
   

   

   式中
   AはTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される免疫調節ラジカルであり、ここでアリールおよびヘテロアリール基は、ハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜6つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜4個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜6アルキル、C_1〜4アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対であり；
   L¹およびL²はそれぞれ独立に、一重結合、-C(O)- -C(O)NR²-、-NR²C(O)-、-NR²-、-C(O)-O-、-OC(O)-、-S-S-、SO₂NR²-、NR²SO₂、-S-および-O-からなる群より選択されるリンカー基であり；
   R²はH、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択され；
   R⁵はHまたはC_1〜6アルキルであり；
   ^*はLもしくはD配置またはその混合物であり；
   mは1〜50の整数であり；
   nは0〜50の整数であり；かつ
   DはH、C_1〜6アルキル、アミノ酸の任意の側鎖および任意の機能性活性分子からなる群より選択される。
2. AがTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリール基はハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜6つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜4個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルキレンアリール、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜6アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対である、請求項1記載の化合物。
3. AがTrp、Tyr、Phe、His、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリール基はハロ、OH、OC_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキル、C_2〜4アルケニル、C_2〜4アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜4アルキル)、N(C_1〜4アルキル)(C_1〜4アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、SO₂C_1〜4アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜4アルキル、フェニルおよびC_1〜4アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜3つの置換基で置換されてもよく、かつここでヘテロアリールは、1〜3個の炭素原子がO、SおよびN-R¹の一つまたは複数から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、5〜10個の炭素原子を含む芳香族炭素環であり、ここでR¹は、N原子がsp³混成である場合、H、C_1〜4アルキル、C_1〜2アルキレンアリール、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)アリール、SO₂C_1〜4アルキルおよびSO₂アリールからなる群より選択されるか、またはN原子がsp²混成である場合、孤立電子対である、請求項2記載の化合物。
4. AがTrp、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでアリールはフェニルまたはナフチルであり、かつヘテロアリールはピリジニル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、インドリル、イソキノリニル、キノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、チアゾロ、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾイソチアゾリルなどであり、Trpのインドール環、アリールおよびヘテロアリールは無置換であるか、またはハロ、OH、OC_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキル、C_2〜4アルケニル、C_2〜4アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜4アルキル)、N(C_1〜4アルキル)(C_1〜4アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、SO₂C_1〜4アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜4アルキル、フェニルおよびC_1〜4アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜2つの置換基で置換されている、請求項3記載の化合物。
5. Aが式IIを有する基である、請求項1記載の化合物：
   

   

   式中、R³はH、OC_1〜6アルキル、NH₂、NHC_1〜6アルキル、N(C_1〜6アルキル)₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択され、ここでYは薬学的に許容されるカチオンであり；
   R⁴はH、ハロ、OH、OC_1〜6アルコキシ、C_1〜6アルキル、C_1〜6アルケニル、C_1〜6アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜6アルキル)、N(C_1〜6アルキル)(C_1〜6アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜6アルキル、C(O)OC_1〜6アルキル、SO₂C_1〜6アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜6アルキル、フェニルおよびC_1〜6アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜4つの置換基であり；かつ
   ^*はLもしくはD配置またはその混合物である。
6. R³がH、OC_1〜4アルキル、NH₂、NHC_1〜4アルキル、N(C_1〜4アルキル)₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択される、請求項5記載の化合物。
7. R³がH、Me、NH₂、NHMe、NMe₂、NHNH₂およびOYからなる群より選択される、請求項6記載の化合物。
8. YがNa⁺、K⁺およびZn²⁺からなる群より選択される、請求項5〜7のいずれか一項記載の化合物。
9. R⁴がH、ハロ、OH、OC_1〜4アルコキシ、C_1〜4アルキル、C_2〜4アルケニル、C_2〜4アルケニルオキシ、NH₂、NH(C_1〜4アルキル)、N(C_1〜4アルキル)(C_1〜4アルキル)、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)OC_1〜4アルキル、SO₂C_1〜4アルキル、SO₂NH₂、SO₂NHC_1〜4アルキル、フェニルおよびC_1〜4アルキレンフェニルからなる群より独立に選択される1〜3つの置換基である、請求項5〜8のいずれか一項記載の化合物。
10. R⁴がH、ハロ、OH、OMe、Me、ビニル、ビニルオキシ、NH₂、NHMe、NHMe₂、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)Me、C(O)OMe、SO₂Me、SO₂NH₂、SO₂NHMe、フェニルおよびベンジルからなる群より独立に選択される1〜3つの置換基である、請求項9記載の化合物。
11. R⁴がH、ハロ、OH、OMe、Me、ビニル、ビニルオキシ、NH₂、NHMe、NHMe₂、CN、CF₃、OCF₃、NO₂、C(O)Me、C(O)OMe、SO₂Me、SO₂NH₂、SO₂NHMe、フェニルおよびベンジルからなる群より選択される1つの置換基である、請求項10記載の化合物。
12. R⁴がHである、請求項11記載の化合物。
13. L¹およびL²がそれぞれ、一重結合、-C(O)-、-C(O)NR²-、-NR²C(O)-、-NR²-、-C(O)-O-、-OC(O)-および-O-からなる群より独立に選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物。
14. L¹およびL²がそれぞれ、-C(O)-、-NR²-、-C(O)NR²-および-NR²C(O)-からなる群より独立に選択される、請求項13記載の化合物。
15. R²がH、C_1〜4アルキル、C_1〜4アルキレンアリール、C(O)C_1〜4アルキル、C(O)Ph、SO₂C_1〜4アルキルおよびSO₂Phからなる群より選択される、請求項13または14記載の化合物。
16. R²がH、Me、Bn、C(O)Me、C(O)Ph、SO₂MeおよびSO₂Phからなる群より選択される、請求項15記載の化合物。
17. R²がHである、請求項16記載の化合物。
18. mが1〜25の整数である、請求項1〜17のいずれか一項記載の化合物。
19. mが1〜10の整数である、請求項18記載の化合物。
20. mが1〜6の整数である、請求項19記載の化合物。
21. nが0〜25の整数である、請求項1〜20のいずれか一項記載の化合物。
22. nが0〜10の整数である、請求項21記載の化合物。
23. R⁵がHまたはC_1〜4アルキルである、請求項1〜22のいずれか一項記載の化合物。
24. R⁵がHまたはMeである、請求項23記載の化合物。
25. ジケトピペラジン環の両方の^*が実質的にD配置であるか、または両方の^*が実質的にL配置である、請求項1〜24のいずれか一項記載の化合物。
26. DがH、C_1〜4アルキル、アミノ酸の任意の側鎖、および任意の機能性活性分子からなる群より選択される、請求項1〜25のいずれか一項記載の化合物。
27. 機能性活性分子が、パルミトイルなどのアジュバント；ペプチド鎮痛薬などの鎮痛薬；デルモルフィン、モルフィン、ナロキソンおよびその誘導体などのオピエートおよび解毒剤；抗原決定基、すなわちT-エピトープおよびB-エピトープなどの合成ワクチン；メトトレキセート、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセンおよびケトプロフェンなどの小分子を含む薬学的ファーマコフォア；糖類；脂質；ならびにヌクレオチドからなる群より選択される、請求項26記載の化合物。
28. 下記の式を有する式Iの多機能生物活性化合物：
    

    

    式中、L¹、L²、D、m、n、R⁵および^*は請求項1で定義した通りであり；かつR³およびR⁴は請求項5で定義した通りである。
29. 下記の式を有する式Iの多機能生物活性化合物：
    

    

    式中、L²、D、m、n、R⁵および^*は請求項1で定義した通りであり；かつR³およびR⁴は請求項5で定義した通りである。
30. 表1の化合物1〜43の一つまたは複数から選択される、請求項1記載の多機能生物活性化合物。
31. 表9の化合物44〜56の一つまたは複数から選択される、請求項1記載の多機能生物活性化合物。
32. 請求項1〜31のいずれか一項記載の多機能生物活性化合物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
33. 免疫障害、および同じ被験体の任意の他の障害の治療方法であって、請求項1〜31のいずれか一項記載の多機能生物活性化合物の有効量を、それを必要としている被験体に投与する段階を含む、方法。

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