EA018548B1 - Полифункциональные биологически активные соединения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к полифункциональному биологически активному соединению формулы (I), состоящему из иммунорегуляторного фрагмента, связанного с группой стабилизатора, и их фармацевтическим композициям, пригодным для лечения иммунных нарушений и гемопоэтических нарушений, таких как иммунная цитопения, множественная миелома, хронический лимфоидный лейкоз, лимфоцитарная лимфома, лимфосаркома.

Description

Настоящее соединение относится к соединениям, композициям, способам и применениям нового подхода к введению биологически активных соединений пациентам, нуждающимся в этом.

Уровень техники

Лучевая терапия и химиотерапия являются общепризнанными способами лечения злокачественных заболеваний. Клетки, которые быстро растут и делятся, являются наиболее чувствительными к действию облучения и цитотоксических агентов. Среди клеток, которые поражаются, находятся как опухолевые клетки, так и нормальные клетки, включая клетки волос и кишечника, и клетки гемопоэтической и иммунной системы. Часто повреждение нормальных клеток гемопоэтической и иммунной системы под воздействием облучения и цитотоксических агентов имеет угрожающие жизни последствия, и это ограничивает возможность вводить полную терапевтическую дозу.

Проводились интенсивные исследования с целью установления средств, которые будут защищать нормальные гемопоэтические и иммунологические клетки от воздействия лучевой терапии и химиотерапии или с целью восстановления клеток, подвергшихся супрессии в результате проведения данных видов лечения. Например, сообщалось, что трансформирующий фактор роста бета-1 является пригодным для защиты гемопоэтических стволовых клеток от миелотоксического воздействия химиотерапевтических препаратов или лучевой терапии (патент США № 5278145, Ке11ег е! а1.). Также сообщалось, что лиофилизованная композиция, содержащая человеческий альбумин в тимозине альфа-1, проявляет защитную активность в отношении прогрессирования лейкемии у мышей, иммунная система которых сильно поражена под воздействием цитостатиков или лучевой терапии. Гемопоэтические факторы роста, такие как интерлейкин-3 и С8Е (КСФ), применяли для потенцирования иммунного ответа или оказания помощи в восстановлении нормальной крови после супрессии гемопоэтических клеток, вызванной облучением или химиотерапией (\УО 88/05469, Аибегаои е! а1.; патент США 4959455, С1ат1ейа е! а1.; патент США 4999291, 8оиха).

8еш1иа е! а1. (КаШаШопиауа Вю1одуа Кайюеко1ощуа. 33(3), 1993; \УО 89/06134) показали, что левовращающий (Ь) энантиомер дипептида Н-С1и-Тгр-ОН функционирует в качестве иммуностимулятора и может индуцировать пролиферацию клеток. То есть данные дипептиды являются пригодными для восстановления гемопоэтических и иммунных клеток после химиотерапии или лучевой терапии.

Было синтезировано несколько пептидов с иммунорегуляторными свойствами (например, δϋ 1582393; ЕР 230052; патент США 4190646; патент США 5008246 и патент США 5013723). Многие научно-исследовательские лаборатории пытались разработать способы получения синтетических производных природных пептидов, которые являются более активными по сравнению с их природными аналогами (например, Европейский патент 136720 и Европейский патент 137904).

В патенте Австралии АИ-В-29308/89 (соответствует \УО 89/06134) раскрывается получение С1и-Ттр и его применение для лечения иммунодефицитных состояний. В \УО 93/08815, Кйаушкои е! а1. раскрывается пептид С1и-Ттр и его циклические мономеры и полимеры для применения при лечении иммуносупрессии.

Оещш е! а1. в патентах США 6051683, выданном 18 апреля 2000, и 6159940, выданном 12 декабря 2002, описывают иммунорегуляторные пептиды общей формулы

которые могут стимулировать иммунный ответ и модулировать гемопоэз;

где X представляет собой атом водорода, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, Ν-валин, пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, Ό-аланин, Ό-лейцин, Ό-изолейцин, Ό-валин, Ό-Ν-валин, Όпролин, Ό-тирозин, Ό-фенилаланин, Ό-триптофан, γ-аминомасляную кислоту или ξ-аминокапроновую кислоту; Υ представляет собой глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, Ν-валин, пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, Ό-аланин, Ό-лейцин, Ό-изолейцин, Ό-валин, Ό-Ν-валин, Ό-пролин, Ό-тирозин, Ό-фенилаланин, Ό-триптофан, γ-аминомасляную кислоту, ξ-аминокапроновую кислоту, -ОН, ΝΗ₂, Ν₂Η₃ или моно- или дизамещенный амид (С1-С3); и более конкретно Н-11е-С1и-Ттр-ОН.

Оещш е! а1. в патентах США 5736519, выданном 7 апреля 1998; 6103699, выданном 15 августа 2000, и 6410515, выданном 25 июня 2003, описывают иммунорегуляторные пептиды общей формулы

для восстановления клеток после лучевой терапии или химиотерапии, для ингибирования пролиферации клеток и для иммуносупрессии, где X представляет собой атом водорода, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, Ν-валин, пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, Ό-аланин, Ό-лейцин, Όизолейцин, Ό-валин, Ό-Ν-валин, Ό-пролин, Ό-тирозин, Ό-фенилаланин, Ό-триптофан, γ-аминомасляную кислоту или ξ-аминокапроновую кислоту; А представляет собой Ό-глутаминовую кислоту или Ό-γглутаминовую кислоту и Υ представляет собой глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, Ν-валин, пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, Ό-аланин, Ό-лейцин, Ό-изолейцин, Ό-валин, Ό-Ν-валин, Όпролин, Ό-тирозин, Ό-фенилаланин, Ό-триптофан, γ-аминомасляную кислоту, ξ-аминокапроновую кислоту, гидроксильную или амидную группу; и более конкретно Н-','-ОС1и-Тгр-ОН.

Оещш е! а1. в патентах США 6184208, выданном 6 февраля 2001 г., и 6248716, выданном 19 июня

- 1 018548

2001 г., описывают иммунорегуляторные пептиды общей формулы

которые снижают стресс, стимулируют прибавление массы тела, зону роста эпителия, заживление ран и репаративные и анаболические процессы; где X представляет собой атом водорода, аргинин, Όаргинин, орнитин, Ό-орнитин, лизин, Ό-лизин, гомоаргинин, Ό-гомоаргинин, цитруллин, Ό-цитруллин; Туг представляет собой тирозин; Υ представляет собой Ό-аланин, Ό-валин, Ό-лейцин, Ό-изолейцин, Όфенилаланин, Ό-аспарагин, Ό-триптофан, Ό-пролин, Ό-серин, Ό-треонин, Ό-тирозин, Ό-оксипролин, Όцистеин, Ό-цистеилцистеин, Ό-метионин, Ό-лизин, Ό-гомоаргинин, Ό-аргинин, Ό-гистидин, Όаспарагиновую кислоту, Ό-глутаминовую кислоту, Ό-β-аланин или Ό-орнитин; РЬе представляет собой фенилаланин; Ζ представляет собой аланин, Ό-аланин, валин, Ό-валин, лейцин, Ό-лейцин, изолейцин, Όизолейцин, фенилаланин, Ό-фенилаланин, аспарагин, Ό-аспарагин, глицин, глутамин, Ό-глутамин, триптофан, Ό-триптофан, пролин, Ό-пролин, серин, Ό-серин, треонин, Ό-треонин, тирозин, Ό-тирозин, гидроксипролин, Ό-гидроксипролин, цистеин, Ό-цистеин, цистеилцистеин, цистеин-О-цистеин, Όцистеилцистеин, Ό-цистеин-О-цистеин, метионин, Ό-метионин, лизин, Ό-лизин, аргинин, Ό-аргинин, гистидин, Ό-гистидин, аспарагиновую кислоту, Ό-аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, Όглутаминовую кислоту, β-аланин, Ό-β-аланин, орнитин или Ό-орнитин; и А представляет собой гидроксил или замещенный амид (С1-С3); и более конкретно Н-Атд-Туг-0-А1а-Рйе-61у-0Н.

Композиции для доставки, в частности пероральной доставки активных веществ, содержащих систему на основе дикетопиперазина, описаны в нескольких патентах и заявках на патент, принадлежащих Ет18рйеге Тесйпо1од1е8, 1пс., включая, например, патенты США № 6663898, 6395774, 6331318, 5976569 и 5693338, а также заявки на патент США № 20030198658, 20030155993 и 20030028250. В данных композициях, как правило, дикетопиперазин добавляют в виде отдельного компонента.

Остается потребность в эффективных способах доставки биологически активных соединений в организм, которые можно легко приспособить для любых применений или многочисленных применений.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение представляет новую основу для терапевтической доставки полифункциональных биологически активных соединений. Изобретение относится к молекулам, которые обладают иммунорегуляторным фрагментом, связанным с группой стабилизатора. Группа стабилизатора функционирует в качестве эффективного носителя иммунорегулятора в организме. Кроме того, иммунорегулятор и стабилизатор могут быть необязательно соединены с другой функциональной биологически активной молекулой. Биологически активная молекула обладает либо дополнительной иммунорегуляторной активностью, либо активностью, которая дополняет или действует синергически с иммунорегуляторным фрагментом, либо обладает другой терапевтической активностью.

Следовательно, настоящее изобретение включает полифункциональное биологически активное соединение, выбранное из одного или более соединений формулы I:

о

о ι где А представляет собой иммунорегуляторную группу, выбранную из группы, состоящей из Тгр, Туг, РЬе, Н18, арила или гетероарила, где арильная и гетероарильная группы могут быть необязательно замещены 1-6 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из атома галогена, ОН, 0С1_-6алкокси, С1_-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкенилокси, ΝΗ₂, ИН(С1_-6алкила), Х(С1_-6алкил)(С1_-6алкила), СИ, СР₃, 0СР₃, Ν0₂, С(О)С1_-6алкила, С(0)0С1_-6алкила, 80₂С_1-6алкила, 80₂ΝΗ₂, 80₂ЫНС_1-6алкила, фенила и С_1-6алкиленфенила, и где гетероарил представляет собой ароматическое карбоциклическое кольцо, содержащее 5-10 атомов углерода, в котором 1-4 атома углерода заменены гетероатомом, выбранным из одного или более из О, 8 и Ν-В¹, где В¹ выбирают из группы, состоящей из Н, С1_-6алкила, С1_-4алкиленарила, С(О)С_1-6алкила, С(О)арила, 80₂С_1-6алкила и 80₂-арила, когда атом N §р³-гибридизован, или представляет собой одиночную пару электронов, когда атом N §р²-гибридизован;

Ь¹ и Ь², каждый независимо, представляют собой линкер, выбранный из группы, состоящей из простой связи, -С(О)-, С(0)ИК², -ИК²С(0)-, -ΝΚ²-, -С(0)-0-, -0С(0)-, -8-8-, 802ΝΚ²-, ΝΒ²802, -8- и -0-;

В² выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, С_1-4алкиленарила, С(О)С_1-6алкила, С(О)арила, 80₂С_1-6алкила и 80₂-арила;

В⁵ представляет собой Н или С_1-6алкил;

* является Ь- или Ό-конфигурацией или их смесью;

т равно целому числу от 1 до 50;

п равно целому числу от 0 до 50;

Ό выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, любой боковой цепи аминокислоты и любой функционально активной молекулы, и его фармацевтически приемлемые соли, сольваты и пролекарства.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим полифункциональное биологически активное соединение по изобретению и фармацевтически приемле

- 2 018548 мый носитель.

Также в настоящее изобретение входят способы лечения иммунных нарушений и необязательно других нарушений у одного и того же субъекта, включающие введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Кроме того, изобретение относится к применению полифункционального биологически активного соединения по изобретению для лечения иммунных нарушений и необязательно других нарушений у одного и того же субъекта, а также применению полифункционального биологически активного соединения по изобретению для получения лекарственного средства для лечения иммунных нарушений и необязательно других нарушений у одного и того же субъекта.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из последующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают на предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только для иллюстрации, поскольку специалистам в данной области, исходя из подробного описания, станут очевидными различные изменения и модификации, не отступая от сущности и объема изобретения.

Краткое описание чертежей

Далее изобретение будет описано при обращении к чертежам, на которых:

на фиг. 1 представлен ЯМР-спектр цикло-Т-А1а-Т-61и-(Ь-Тгр-0Ме), которое является соединением по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

на фиг. 2 представлен график титрационного разведения ОУА+СЕА;

на фиг. 3 представлен график титрационного разведения соединений 33а, 33Ь, 17 и ОУА;

на фиг. 4 представлен график, показывающий адъювантную активность соединений 17, 19, 26а, 26Ь, 33а, 33Ь и ОУА.

Подробное описание изобретения

ΐ. Определения.

По тексту описания использовали следующие обычные сокращения аминокислотных остатков: А1а

- аланин; Агд - аргинин; Аки - аспарагин; Акр - аспарагиновая кислота; Сук -цистеин; О1и - глутаминовая кислота; Ю1и - изоглутаминовая кислота; О1и - глутамин; Ηίκ - гистидин; Ьук - лизин; Ме! -метионин; §ег

- серин; Т1п - треонин; Р1е - фенилаланин; О1у - глицин; 11е - изолейцин; Ьеи - лейцин; Рго - пролин; Уа1 валин; Νναΐ - Ν-валин; Тгр - триптофан и Туг - тирозин.

Термин Р1 означает фенил.

Термин Вп означает бензил.

Термин Ме означает метил.

Как использовано в данном описании, термин алкил означает алкильные группы с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 6 атомов углерода, и включает метил, этил, пропил, изопропил, трет-бутил, пентил, гексил и т.п.

Как использовано в данном описании, термин алкокси означает алкоксигруппы с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 6 атомов углерода, и включает метокси, этокси, пропилокси, изопропилокси, трет-бутокси, гексилокси и т.п.

Как использовано в данном описании, термин алкенил означает алкенильные группы с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 3 двойных связей, и включает винил, аллил, 1-бутенил, 2-гексенил и т.п.

Как использовано в данном описании, термин алкенилокси означает алкенилоксигруппы с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 3 двойных связей, и включает винилокси, аллилокси, пропенилокси, бутенилокси, гексенилокси и т.п.

Как использовано в данном описании, термин алкилен означает бифункциональные алкильные группы с прямой и/или разветвленной цепью, содержащие определенное количество атомов углерода.

Как использовано в данном описании, термин галоген означает атом галогена и включает атомы хлора, фтора, брома, йода и т.п.

Термин фармацевтически приемлемый означает совместимый с лечением животных, в частности людей.

Термин фармацевтически приемлемая соль означает аддитивную соль кислоты или аддитивную соль основания, которая является подходящей для или совместимой с лечением животных, в частности людей.

Как использовано в данном описании, термин фармацевтически приемлемая аддитивная соль кислоты означает нетоксичную органическую или неорганическую соль любого основного соединения по изобретению или любого из его промежуточных соединений. Основные соединения по изобретению, которые могут образовывать аддитивную соль кислоты, включают соединения с основным атомом азота, например ΝΗ₂ и NΗС1_-4алкил. Иллюстративные неорганические кислоты, которые образуют подходящие соли, включают хлористо-водородную, бромисто-водородную, серную и фосфорную кислоты, а также соли металлов, такие как моногидроортофосфат натрия и гидросульфат калия. Иллюстративные органические кислоты, которые образуют подходящие соли, включают моно-, ди- или трикарбоновые кислоты, такие как гликолевая, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, глутаровая, фумаровая, яблоч

- 3 018548 ная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, бензойная, фенилуксусная, циннамовая и салициловая кислоты, а также сульфоновые кислоты, такие как п-толуолсульфоновая и метансульфоновая кислоты. Могут образоваться соли одно- или двухосновных кислот, и такие соли могут находиться в гидратированной, сольватированной или, по существу, безводной форме. В основном аддитивные соли кислоты соединений по изобретению являются более растворимыми в воде и различных гидрофильных органических растворителях и обычно имеют более высокие значения точки плавления по сравнению с соответствующими свободными основаниями. Специалист в данной области сможет выбрать подходящую соль. Можно использовать другие нефармацевтически приемлемые соли, например оксалаты, например, при выделении соединений по изобретению для применения в лабораторных условиях или для последующего преобразования в фармацевтически приемлемые аддитивные соли кислоты.

Как использовано в данном описании, термин фармацевтически приемлемая аддитивная соль основания означает любую нетоксичную аддитивную соль органического или неорганического основания любого кислого соединения по изобретению. Иллюстративные неорганические основания, которые образуют подходящие соли, включают гидроксид лития, натрия, калия, кальция, магния или бария. Иллюстративные органические основания, которые образуют подходящие соли, включают алифатические, алициклические или ароматические органические амины, такие как метиламин, триэтиламин и пиколин, или аммиак. Специалист в данной области сможет выбрать подходящую соль.

Как использовано в данном описании, термин сольват означает соединение по изобретению или фармацевтически приемлемую соль соединения по изобретению, в которых молекулы подходящего растворителя входят в состав кристаллической решетки. Подходящим растворителем является физиологически переносимый во вводимых дозах. Примерами подходящих растворителей являются этанол, вода и т.п. В том случае, когда растворителем является вода, то молекула относится к гидрату.

Как использовано в данном описании, термин соединение(я) по изобретению означает соединение^) формулы I и/или его (их) фармацевтически приемлемые соли, сольваты и/или пролекарства.

Следует понимать, что настоящее изобретение включает фармацевтически приемлемые соли, сольваты и/или пролекарства соединений по изобретению и смеси, содержащие два или более соединений по изобретению, фармацевтически приемлемых солей соединений по изобретению (в тех случаях, когда они применимы), фармацевтически приемлемых сольватов соединений по изобретению и пролекарств соединений по изобретению.

Как использовано в данном описании, термины эффективное количество или достаточное количество средства означают такое количество, которое достаточно для обеспечения целебного или желаемого эффекта, включая клинические эффекты, и тогда эффективное количество зависит от контекста, в котором термин используется. Например, в контексте введения средства, которое функционирует в качестве иммуномодулятора, эффективным количеством средства является, например, количество, достаточное для обеспечения модуляции иммунного ответа по сравнению с ответом, полученным без введения средства.

Как использовано в данном описании и хорошо понимается в данной области, термин лечение означает подход для получения целебного или желаемого эффекта, включая клинические эффекты. Целебные или желаемые клинические эффекты могут включать, например, но не ограничиваются ими, ослабление или уменьшение одного или более симптомов или состояний, снижение выраженности заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) заболевания, профилактику распространения заболевания, снижение или замедление прогрессирования заболевания, ослабление или облегчение заболевания и ремиссию (частичную или полную), детектируемую или не детектируемую. Лечение также может означать пролонгацию выживаемости по сравнению с предполагаемой выживаемостью при отсутствии лечения.

Облегчение заболевания или нарушения означает, что степень и/или нежелательные клинические проявления нарушения или заболевания ослабляются, и/или замедляется или удлиняется время их прогрессирования по сравнению с отсутствием лечения нарушения.

Как использовано в данном описании, термин модулировать включает подавление или супрессию функции или активности (такой как иммунный ответ), а также повышение функции или активности.

Ингибировать или супрессировать, или снижать функцию или активность, такую как иммунный ответ, означает снижать функцию или активность по сравнению с такими же состояниями, за исключением представляющего интерес состояния или параметра, или, альтернативно, по сравнению с другими состояниями.

Усиливать или увеличивать, или стимулировать функцию или активность, такую как иммунный ответ, означает повышать функцию или активность по сравнению с такими же состояниями, за исключением представляющего интерес состояния или параметра, или, альтернативно, по сравнению с другими состояниями.

Как использовано в данном описании, термин субъект включает всех членов животного мира, включая человека. Предпочтительно субъектом является человек.

ΐΐ. Соединения по изобретению.

Настоящее изобретение относится к соединениям, содержащим иммунорегуляторный фрагмент,

- 4 018548 группу стабилизатора и необязательно дополнительный функционально активный фрагмент. Фрагменты соединяются вместе посредством различных линкеров с обеспечением полифункционального соединения, которое можно использовать для лечения многих нарушений у одного и того же субъекта.

Следовательно, настоящее изобретение включает полифункциональное биологически активное соединение, выбранное из одного или более соединений формулы I о р5 11 'ц+?]-(СН₂)„-Ό-о о I где А представляет собой иммунорегуляторную группу, выбранную из группы, состоящей из Тгр, Туг, Р11С. НЕ, арила или гетероарила, где арильная и гетероарильная группы могут быть необязательно замещены 1-6 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из атома галогена, ОН, ОС1_-6алкокси, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкенилокси, ΝΗ₂, ИН(С_1-6алкила), Н(С_1-6алкил)(С_1-6алкила), ΟΝ, СЕ₃, ОСЕ₃, ΝΟ₂, С(О)С_1-6алкила, С(О)ОС_1-6алкила, 8О₂С_1-6алкила, 8Θ₂ΝΗ₂, 8О₂ЫНС_1-6алкила, фенила и С_1-6алкиленфенила, и где гетероарил представляет собой ароматическое карбоциклическое кольцо, содержащее 5-10 атомов углерода, в котором 1-4 атома углерода заменены гетероатомом, выбранным из одного или более из О, 8 и Ν-К¹, где Я¹ выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, С_1-4алкиленарила, С(О)С_1-6алкила, С(О)арила, 8О₂С_1-6алкила и 8О₂-арила, когда атом Ν §р³-гибридизован, или представляет собой одиночную пару электронов, когда атом Ν §р²-гибридизован;

Ь¹ и Ь², каждый независимо, представляют собой линкер, выбранный из группы, состоящей из простой связи, -С(О)-, С(О)МК²-, -МК²С(О)-, -ΝΚ²-, -С(О)-О-, -ОС(О)-, -8-8-, 8О₂ЯК²-, ХК8О. -8- и -О-;

К² выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, С_1-6алкиленарила, С(О)С_1-6алкила, С(О)арила, 8О₂С_1-6алкила и 8О₂-арила;

К⁵ представляет собой Н или С_1-6алкил;

* является Ь- или Ό-конфигурацией или их смесью;

т равно целому числу от 1 до 50; η равно целому числу от 0 до 50;

Ό выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, любой боковой цепи аминокислоты и любой функционально активной молекулы, и его фармацевтически приемлемые соли, сольваты и пролекарства.

В соединениях по настоящему изобретению А представляет собой иммунорегуляторную группу. Термин иммунорегуляторная группа относится к любой ароматической или гетероароматической группе, обладающей иммуно- или гемосупрессорной активностью или иммуно- или гемостимулирующей активностью. В частности, А выбирают из группы, состоящей из Тгр, Туг, Рйе, НЕ, арила или гетероарила, где арильная и гетероарильная группы могут быть необязательно замещены 1-6 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из атома галогена, ОН, ОС_1-6алкокси, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкенилокси, ΝΗ₂, ЕН(С_1-6алкила), N(С_1-6алкил) (С_1-6алкила), СИ, СЕ₃, ОСЕ₃, NΟ₂, С(О)С_1-6алкила, С(О)ОС_1-6алкила, 8О₂С_1-6алкила, 8О₂ЯН₂, 8О₂МНС_1-6алкила, фенила и С_1-6алкиленфенила, и где гетероарил представляет собой ароматическое карбоциклическое кольцо, содержащее 5-10 атомов углерода, в котором 1-4 атома углерода заменены гетероатомом, выбранным из одного или более из О, 8 и Ν-К¹, где К¹ выбирают из группы, состоящей из Н, С1-6алкила, С1-6алкиленарила, С(О)С16алкила, С(О)арила, 8О2С1-6алкила и 8О2-арила, когда атом Ν §р³-гибридизован, или представляет собой одиночную пару электронов, когда атом Ν §р²-гибридизован. В вариантах осуществления изобретения А выбирают из группы, состоящей из Тгр, Туг, Рйе, НЕ, арила или гетероарила, где арильная и гетероарильная группы могут быть необязательно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из атома галогена, ОН, ОС1-4алкокси, С_1-4алкила, С_2-4алкенила, С_2-4алкенилокси, МН₂, ИН(С_1-4алкила), N(С_1-4алкил)(С_1-4алкила), СК, СЕ₃, ОСЕ₃, NΟ₂, С(О)С_1-4алкила, С(О)ОС_1-4алкила, 8О₂С₁₄алкила, 8О₂НН₂, 8О₂ЫНС_1-4алкила, фенила и С_1-6алкиленфенила, и где гетероарил представляет собой ароматическое карбоциклическое кольцо, содержащее 5-10 атомов углерода, в котором 1-3 атома углерода заменены гетероатомом, выбранным из одного или более из О, 8 и Ν-К¹, где К¹ выбирают из группы, состоящей из Н, С1-4алкила, С1-2алкиленарила, С(О)С1-4алкила, С(О)арила, 8О2С1-4алкила и 8О2арила, когда атом Ν 8р³-гибридизован, или представляет собой одиночную пару электронов, когда атом Ν §р²-гибридизован. В дополнительных вариантах осуществления А выбирают из группы, состоящей из Тгр, арила и гетероарила, где арил представляет собой фенил или нафтил, и гетероарил представляет собой пиридинил, имидазолил, тиенил, фуранил, индолил, изохинолинил, хинолинил, бензотиенил, бензофуранил, бензотиазолил, тиазоло, бензооксазолил, бензоизооксазолил, бензоизотиазолил или тому подобное, при этом индольное кольцо Тгр, арил и гетероарил являются незамещенными или замещены 1-2 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из атома галогена, ОН, ОС1-4алкокси, С₁₄алкила, С_2-4алкенила, С_2-4алкенилокси, НН₂, НН(С_1-4алкила), N(С_1-4алкил)(С_1-4алкила), СН, СЕ₃, ОСЕ₃, NΟ₂, С(О)С_1-4алкила, С(О)ОС_1-4алкила, 8О₂С_1-4алкила, 8О₂ЯН₂, 8Ο₂NНС_1-4алкила, фенила и С1-4алкиленфенила.

В том случае, когда А выбирают из Тгр, Туг, Рйе или НЕ, данная группа может быть соединена с

- 5 018548 линкером посредством аминогруппы или карбоксильной группы. При отсутствии связи с линкером свободная аминогруппа или карбоксильная группа может быть преобразована в производное. Например, аминогруппа может быть моно- или диалкилирована С1_-6алкилом, ацилирована С(О)С1_-6алкилом или преобразована в ΝΗ₃ ⁺ добавлением фармацевтически приемлемой кислоты. Кроме того, карбоксильную группу можно подвергнуть этерификации, например, с образованием С_1-6алкилового эфира, преобразовать в соответствующий амид, который также может быть моно- или диэтерифицирован С_1-6алкилом, преобразован в его соответствующий гидразин или в его соответствующую аддитивную соль основания. В другом аспекте настоящего изобретения было обнаружено, что когда А является Тгр, то иммуно- или гемомодулирующую активность данной группы можно контролировать стереохимией α-углерода. Например, когда стереохимия представляет собой Ό-конфигурацию, то данная группа может обладать иммуно- или гемосупрессорной активностью, и когда она представляет собой Ь-конфигурацию, она может обладать иммуно- или гемостимулирующей активностью. Следовательно, иммуномодулирующую активность молекул по настоящему изобретению можно контролировать и приспосабливать для конкретных применений и комбинированной терапии.

В варианте осуществления изобретения А представляет собой группу формулы II

где В³ выбирают из группы, состоящей из Н, ОС1-6алкила, ΝΗ2, NΗС1-6алкила, ^С1-6алкила)2, ΝΗΝΗ2 и ΟΥ, где Υ представляет собой фармацевтически приемлемый катион; В⁴ представляет собой 14 заместителя, которые независимо выбирают из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОС1-6алкокси, С_1-6алкила, С_1-6алкенила, С_1-6алкенилокси, ΝΗ₂, NΗ(С_1-6алкила), ^С_1-6алкил)(С_1-6алкила), СН СР₃, ОСР₃, ΝΟ₂, С(О)С_1-6алкила, С(О)ОС_1-6алкила, 8О₂С_1-6алкила, 8Ο₂ΝΗ₂, 8О^НС_1-6алкила, фенила и С1-6алкиленфенила; и * является Ь- или Ό-конфигурацией или их смесью.

Настоящее изобретение включает соединения формулы I, где В³ выбирают из группы, состоящей из Н, ОС1-6алкила, ΝΗ2, ННС1-6алкила, ^С^алкилаХ, ΝΗΝΗ2 и ΟΥ, где Υ представляет собой фармацевтически приемлемый катион. В вариантах осуществления В³ выбирают из группы, состоящей из Н, ОС1-4алкила, ΝΗ₂, ННС_1-4алкила, М(С_1-4алкила)₂, ΝΗΝΗ₂ и ΟΥ. В дополнительных вариантах осуществления изобретения В³ выбирают из группы, состоящей из Н, Ме, ΝΗ₂, ΝΗΜο. ΝΜο₂. ΝΗΝΗ₂ и ΟΥ. Катион Υ может представлять любой фармацевтически приемлемый катион, например Να', К⁺ и Ζη⁺.

Соединения формулы I также включают соединения, где В⁴ представляет собой 1-4 заместителя, которые независимо выбирают из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОС1-6алкокси, С1-6алкила, С1-6алкенила, С1-6алкенилокси, ΝΗ2, НЩС^алкила), ^С^алкилХС^алкила), ΟΝ, СР3, ОСР3, NΟ2, С(О)С1-6алкила, С(О)ОС1-6алкила, 8О2С1-6алкила, 8Ο2NΗ2, 8Ο2NΗС1-6алкила, фенила и С1-6алкиленфенила. В вариантах осуществления изобретения В⁴ представляет собой 1-3 заместителя, которые независимо выбирают из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОС1-4алкокси, С_1-4алкила, С_2-4алкенила, С_2-4алкенилокси, ΝΗ₂, НЩС^алкила), ^С^алкилХС^алкила), ΟΝ, СР₃, ОСР₃, NΟ₂, С(О)С_1-4алкила, С(О)ОС_1-4алкила, 8О₂С_1-4алкила, 8Ο₂NΗ₂, 8Ο₂NΗС_1-4алкила, фенила и С_1-4алкиленфенила. В других вариантах осуществления В⁴ представляет собой 1-3 заместителя, которые независимо выбирают из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОМе, Ме, винила, винилокси, ΝΗ2, ΝΗΜο, ΝΜο2, ΟΝ, СР3, ОСР3, NΟ2, С(О)Ме, С(О)ОМе, 8О2Ме, 8Ο2NΗ2, 8Ο2NΗΜе, фенила и бензила. В еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретения В⁴ является заместителем, выбранным из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОМе, Ме, винила, винилокси, ΝΗ2, NΗΜе, ЯМе₂, СЫ, СР₃, оСр₃, ΝΟ₂, С(О)Ме, С(О)ОМе, 8О₂Ме, 8Ο₂NΗ₂, 8Ο₂NΗΜе, фенила и бензила. В еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретения В⁴ является Н.

В полифункциональных биологически активных соединениях по настоящему изобретению каждый из Ь¹ и Ь² является линкером, независимо выбранным из группы, состоящей из простой связи, С(О)-, -С(О)МВ²-, -МВ²С(О)-, -ЯВ²-, -С(О)-О-, -ОС(О)-, -8-8-, 8О2ЯВ²-, ЯВ²8О2, -8- и -О-, где В² выбирают из группы, состоящей из Н, С1-6алкила, С1-6алкиленарила, С(О)С1-6алкила, С(О)арила, 8О2С1-6алкила и 8О2арила. В вариантах осуществления изобретения каждый Ь¹ и Ь² независимо выбирают из группы, состоящей из простой связи, -С(О)-, -С(О)КВ²-, -ИВ²С(О)-, -КВ²-, -С(О)-О-, -ОС(О)- и -О-. В дополнительных вариантах осуществления изобретения каждый из Ь¹ и Ь² независимо выбирают из группы, состоящей из -С(О)-, -ΝΒ²-, -ί’(Ο)ΝΒ²- и -ΝΒ^:ί’(Ο)-. В других вариантах осуществления В² выбирают из группы, состоящей из Н, С1-4алкила, С_1-4алкиленарила, С(О)С_1-4алкила, С(О)РЦ 8О₂С_1-4алкила и 8О₂Р11. В еще одних вариантах осуществления изобретения В² выбирают из группы, состоящей из Н, Ме, Вп, С(О)Ме, С(О)РЦ 8О₂Ме и 8О₂РН. В еще одних дополнительных вариантах осуществления изобретения В² является Н.

- 6 018548

В биологически активных соединениях по изобретению т равно целому числу от 1 до 50. В вариантах осуществления изобретения т равно целому числу от 1 до 25. В других вариантах осуществления изобретения т равно целому числу от 1 до 10. В еще одних вариантах осуществления изобретения т равно целому числу от 1 до 6.

Полифункциональные биологически активные соединения по изобретению включают соединения, где η равно целому числу от 0 до 50. В вариантах осуществления изобретения η равно целому числу от 0 до 25. В других вариантах осуществления изобретения η равно целому числу от 0 до 10.

Соединения формулы I включают соединения, где В⁵ выбирают из группы, состоящей из Н и С1_-6алкила, и * является Ό- и Ь-конфигурацией или их смесью. В вариантах осуществления изобретения В⁵ выбирают из группы, состоящей из Н и С^алкила, конкретно Н и Ме. В других вариантах осуществления изобретения обе *, по существу, находятся в Ό-конфигурации или обе находятся, по существу, в Ьконфигурации.

Полифункциональные биологически активные соединения по изобретению также включают соединения, где Ό выбирают из группы, состоящей из Н, С1_-6алкила, любой боковой цепи аминокислоты и любой функциональной биологически активной молекулы. В вариантах осуществления изобретения Ό выбирают из группы, состоящей из Н, С1_-4алкила, любой боковой цепи аминокислоты и любой функциональной биологически активной молекулы. Под функциональной биологически активной молекулой понимается любая молекула, оказывающая фармакологическое воздействие на субъекта. Данное фармакологическое воздействие может представлять воздействие, которое дополняет, повышает или действует синергически с иммунорегуляторной группой А, или оно может обеспечивать другое терапевтическое действие таким образом, что когда биологически активные соединения по изобретению вводят субъекту, обеспечивается комбинированная терапия. Можно использовать более чем одну функциональную биологически активную молекулу. Примеры функциональных биологически активных молекул включают, но не ограничиваются ими, адъюванты, такие как пальмитоил; анальгетики, такие как пептидные анальгетики; опиаты и антидоты, такие как дерморфин, морфин, налоксон и их производные; синтетические вакцины, такие как антигенные детерминанты - Т- и В-эпитопы; антибиотики, такие как фусидовые кислоты, фармацевтические фармакофоры, включая малые молекулы, такие как метотрексат, диклофенак, ибупрофен, индометацин, напроксен, кетопрофен; сахара; липиды и нуклеотиды.

В варианте осуществления настоящего изобретения полифункциональные биологически активные соединения формулы I имеют следующую формулу:

где Ь¹, Ь², Ό, В³, В⁴, В⁵, т, η и * имеют значения, определенные выше.

В дополнительном варианте осуществления изобретения полифункциональные биологически активные соединения формулы I имеют следующую формулу:

где Ь², Ό, В³, В⁴, В⁵, т, η и * имеют значения, определенные выше.

Примеры полифункциональных биологически активных соединений и их фармацевтически приемлемых солей, сольватов и пролекарств, представляющих конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, приведены в табл. 1 и 9.

Все соединения по изобретению содержат более чем один асимметричный центр. В тех случаях, когда соединения по изобретению обладают более чем одним асимметричным центром, они могут находиться в виде диастереоизомеров. Следует понимать, что все такие изомеры и их смеси в любом соотношении входят в объем настоящего изобретения. Следует понимать, что, хотя, относительная стереохимия соединений по изобретению может быть показана в любом конкретном соединении, представленном в данном описании, такие соединения по изобретению также могут содержать определенные количества (например, менее чем 20%, предпочтительно менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 5%) соединений по изобретению с альтернативной стереохимией.

Соединения по изобретению можно получить из известных исходных соединений с использованием способов, известных в данной области. Как правило, соединения получают сочетанием двух или более молекул вместе, например, с использованием обычной химии сочетания (например, образования пептидных связей, амидных связей, дисульфидных связей, сложноэфирных связей и т.п.). Дикетопиперазино

- 7 018548 вую группу можно получить с использованием известной химии. Например, дикетопиперазины можно получить циклодимеризацией эфиров аминокислот, как описано Κηΐοΐιηΐδΐ/ί с1 а1. в 1. Атег. Сйет. 8ос, 68, 879-880 (1946), циклизацией дипептидных сложноэфирных производных или термической дегидратацией аминокислотных производных и высококипящих растворителей, как описано Корр1е е1 а1. в 1. Отд. Сйет., 33(2), 862-864 (1968).

В некоторых случаях химические способы получения соединений по изобретению можно модифицировать, например, с использованием защитных групп для предотвращения протекания побочных реакций за счет присутствия реакционноспособных групп, таких как реакционноспособные группы, присоединенные в качестве заместителей. Этого можно достичь с помощью использования обычных защитных групп, например, описанных в Рто1еейуе Стоирз ίη Огдашс Сйет1з1ту МсОт1е, 1.Р.^. Еб., Р1епит Ргезз, 1973 и у Сгеепе Т.^. апб \Уи1з Р.С.М., Рто1есйуе Стоирз ίη Огдашс 8уп1йез1з, 1ойп ^11еу & 8опз, 3^гб Еб1йоп, 1999.

Желаемую соль соединения получают с использованием стандартных способов. Например, нейтральное соединение обрабатывают кислотой или основанием в подходящем растворителе и образовавшуюся соль выделяют фильтрованием, экстракцией или любым другим подходящим способом.

Получение сольватов соединений по изобретению будет варьировать в зависимости от соединения и сольвата. Как правило, сольваты образуются при растворении соединения в соответствующем растворителе и выделении сольвата при охлаждении или использовании антирастворителя. Обычно сольват сушат или подвергают азеотропной отгонке в условиях окружающей среды.

Настоящее изобретение включает в свой объем пролекарства соединений по изобретению. В основном такие пролекарства представляют собой функциональные производные соединения по изобретению, которые легко превращаются в условиях ш у1уо в соединение, из которого его обычно получают. Пролекарства соединений по изобретению могут представлять собой обычные сложные эфиры, образованные имеющейся гидроксильной, тиольной, аминогруппой или карбоксильной группой. Например, доступные группы ОН и ΝΗ₂ в соединении по изобретению можно ацилировать с использованием активированной кислоты в присутствии основания и необязательно в инертном растворителе (например, хлорангидрид кислоты в пиридине). Некоторые обычные сложные эфиры, которые используют в качестве пролекарств, представляют собой сложные фениловые эфиры, (С₈-С₂₄) алифатические эфиры, ацилоксиметиловые эфиры, карбаматы и эфиры аминокислот. В других вариантах осуществления пролекарства соединений по изобретению являются соединениями, где одна или более гидроксильных групп замаскированы в виде групп, которые можно преобразовывать в гидроксигруппы в условиях ш у1уо. Обычные методы выбора и получения подходящих пролекарств описаны, например, в Эезлдп о! Ртобтидз, еб. Η. Випбдаагб, Е1зеу1ет, 1985.

Настоящее изобретение включает радиоактивно меченые соединения по изобретению, например соединения по изобретению, меченные включением в их структуру ³Н или ¹⁴С, или радиоактивного атома галогена, такого как ¹²⁵1. Радиоактивно меченое соединение по изобретению можно получить с использованием обычных способов, известных в данной области. Например, в соединение по изобретению можно включить тритий с использованием обычных методов, например, гидрированием подходящего предшественника в соединение по изобретению с использованием газообразного трития и катализатора.

Альтернативно, соединение по изобретению, содержащее радиоактивный йод, можно получить из соответствующего производного триалкилолова (соответственно триметилолова) с использованием условий стандартного йодирования, таких как использование [¹²⁵1]йодида натрия в присутствии хлораминаТ в подходящем растворителе, таком как диметилформамид. Производное триалкилолова можно получить из соответствующего нерадиоактивного галогенсодержащего, соответственно йодсодержащего, соединения с использованием обычного станнилирования с катализатором палладием, например, гексаметилдиолова в присутствии тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) в инертном растворителе, таком как диоксан, и при повышенной температуре, соответственно в пределах примерно от 50 до 100°С.

ίίί. Применения.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям формулы I. Следовательно, настоящее изобретение включает все применения соединений по изобретению, включая их применение в терапевтических способах и фармацевтических композициях, их применение в диагностических тестах и их применение в качестве исследовательских инструментов.

Настоящее изобретение, в частности, относится к фармацевтическим композициям, содержащим полифункциональное биологически активное соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Также в настоящее изобретение входят способы лечения иммунных нарушений и необязательно других нарушений у одного и того же субъекта, включающие введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Кроме того, предлагается применение полифункционального биологически активного соединения по изобретению для лечения иммунных нарушений и необязательно других нарушений у одного и того же субъекта, а также применение полифункционального биологически активного соединения по изобретению для получения лекарственного средства для лечения иммунных нарушений и необязательно других

- 8 018548 нарушений у одного и того же субъекта.

В одном аспекте изобретение относится к способу модуляции иммунной системы и/или гемопоэза у животного, включающему введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

В варианте осуществления изобретение относится к способу стимуляции иммунной системы, включающему введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу восстановления гемопоэза у животного с нарушенным гемопоэзом, например, вызванным облучением или цитостатическими средствами, включающему введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения гемопоэтических нарушений, например, но не ограничиваясь ими, иммунной цитопении, множественной миеломы, хронического лимфоидного лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, лимфосаркомы и, в частности, В-клеточного лимфоидного лейкоза, включающему введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения иммунных и/или гемопоэтических нарушений, таких как рак, у животных, включающему введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом, возможно в комбинации с цитостатическим средством. Цитостатическое средство может представлять, например, оксимочевину или гипертермию.

В еще одном варианте осуществления изобретение также относится к способу иммуносупрессии иммунной системы у животного, включающему введение эффективного количества полифункционального биологически активного соединения по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления соединение можно вводить перед трансплантацией органа или костного мозга. Иммунорегуляторные свойства соединений по изобретению можно контролировать, например, стереохимией фрагмента А или * в соединении.

Соединения по изобретению можно использовать в виде свободного основания, свободной кислоты, в виде солей, сольватов и/или пролекарств. Все формы входят в объем изобретения.

Согласно способам по изобретению описанные соединения, их соли, пролекарства или сольваты можно вводить пациенту в различных формах в зависимости от выбранного пути введения, как это понятно специалистам в данной области. Композиции по изобретению можно вводить, например, пероральным, парентеральным, буккальным, сублингвальным, внутриназальным, ректальным путем, в виде пластыря, насосного устройства или трансдермально (местно) и с использованием соответствующим образом формулированных фармацевтических композиций. Парентеральное введение включает внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, трансэпителиальный, внутриназальный, внутрипульмонарный, интратекальный, ректальный и местный пути введения. Парентеральное введение можно проводить непрерывной инфузией в течение выбранного периода времени.

Соединение по изобретению можно вводить перорально, например, с использованием инертного разбавителя или подвергающегося деградации пищевого носителя, или его можно включить в твердые или мягкие желатиновые капсулы, или его можно прессовать в таблетки, или его можно включить непосредственно в пищевые продукты рациона. Для перорального введения соединение по изобретению можно включить с эксципиентом и использовать в виде принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п.

Соединение по изобретению также можно вводить парентерально. Растворы соединения по изобретению можно изготовить в воде, соответствующим образом смешав с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также можно изготовить дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, ДМСО и их смесях с или без спирта, и в маслах. Для хранения и применения в обычных условиях данные препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Специалистам в данной области известно, каким образом получить подходящие композиции. Обычные методы и ингредиенты для выбора и получения подходящих композиций описаны, например, в Кетшдΐοη'δ Рйаттасеи11са1 8с1епсе5 (2003-20⁴¹¹ ебйюи) и в ТНе Цийсб 81а1е5 Рйаттасоре1а: ТНе Νηΐίοηηΐ Ротти1агу (И8Р 24 ΝΕ19), опубликованной в 1999 г.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для изготовления экстемпоральных стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Во всех случаях формы должны быть стерильными и текучими до такой степени, чтобы их можно было легко набирать шприцом. Ампулы представляют удобные единичные дозированные формы.

Композиции для интраназального введения можно соответственно формулировать в виде аэрозолей, капель, гелей и порошков. Как правило, аэрозольные композиции содержат раствор или мелкую суспензию активного вещества в физиологически приемлемом водном или неводном растворителе, и обычно они находятся в виде единичной или в виде множественной дозы в стерильной форме в запаян

- 9 018548 ном контейнере, который может иметь форму картриджа или для применения с помощью распыляющего устройства. Альтернативно, запаянный контейнер может представлять собой единичное распределительное устройство, такое как ингалятор для носа с одной дозой, или аэрозольное распределительное устройство, снабженное дозирующим клапаном, который предназначен для распределения после нажатия на него. В том случае, когда дозированная форма содержит аэрозольное распределительное устройство, она будет содержать пропеллент, который может представлять собой находящийся под давлением газ, такой как находящийся под давлением воздух или органический пропеллент, такой как фторхлоруглерод. Аэрозольные дозированные формы также могут находиться в форме распылителя с насосом.

Композиции, подходящие для буккального или сублигвального введения, включают таблетки, таблетки неправильной формы и пастилки, в которых активный ингредиент формулирован с носителем, таким как сахар, аравийская камедь, трагакант или желатин и глицерин. Композиции для ректального введения соответственно находятся в форме суппозиториев, содержащих обычную для суппозиториев основу, такую как какао-масло.

Композиции для местного применения могут включать, например, пропиленгликоль, изопропиловый спирт, минеральное масло и глицерин. Препараты, подходящие для местного применения, включают жидкие или полужидкие препараты, такие как линименты, лосьоны, аппликанты, эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле, такие как кремы, мази или пасты; или растворы или суспензии, такие как капли. В дополнении к указанным выше ингредиентам препараты для местного применения могут включать один или несколько дополнительных ингредиентов, таких как разбавители, буферы, вкусовые вещества, связующие вещества, поверхностно-активные вещества, загустители, лубриканты, консерванты, например метилоксибензоат (включая антиоксиданты), эмульгаторы и т.п.

Можно формулировать композиции с замедленным или прямым высвобождением, например липосомы, или композиции, в которых активное вещество защищено оболочками, способными разрушаться дифференцированно, как полученные с использованием микроинкапсулирования, множественных оболочек и т.п. Также можно подвергнуть соединения по изобретению сушке вымораживанием и использовать полученные лиофилизаты, например, для получения продуктов для инъекций.

Соединения по изобретению можно вводить субъекту как таковые или в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями, которые указаны выше, содержание которых определяется растворимостью и химической природой соединения, выбранным путем введения и стандартной фармацевтической практикой.

Дозировка соединений и/или композиций по изобретению может варьировать в зависимости от многих факторов, таких как фармакодинамические свойства соединения, способ введения, возраст, состояние здоровья и масса реципиента, природа и степень проявления симптомов, частота лечения и тип сопутствующего лечения, если таковое имеется, и клиренса соединения у субъекта, который подвергается лечению. Специалист в данной области может определить соответствующую дозировку с учетом указанных выше факторов. Например, при местном применении можно наносить мази, кремы или лосьоны, содержащие 1-1000 мкг/г соединения по изобретению. Препараты для перорального введения можно формулировать, предпочтительно в виде таблеток, капсул или капель, содержащих 0,5-1000 мкг соединения по изобретению на единичную дозу. Соединения по изобретению можно первоначально вводить в подходящей дозе, которую можно скорректировать при необходимости в зависимости от клинического ответа. Для обработки клеток ех νίνο в течение короткого периода времени, например от 30 мин до 1 ч или более, можно использовать более высокие дозы по сравнению с длительной терапией ίη νίνο.

В дополнение к указанным выше терапевтическим применениям соединения по изобретению полезны для постановки диагностических тестов, скрининговых тестов и в качестве исследовательских инструментов.

В диагностических тестах соединения по изобретению могут быть полезны для идентификации или детектирования иммунного нарушения. В таком варианте осуществления соединения по изобретению могут быть радиоактивно меченными (как описано выше) и контактировать с популяцией клеток. Присутствие радиоактивной метки в клетках может указывать на наличие иммунного нарушения.

В скрининговых тестах соединения по изобретению можно использовать для идентификации других соединений, которые модулируют иммунные ответы. В таких тестах соединения также могут содержать радиоактивную метку.

Последующие, неограничивающие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Примеры

Материалы и методы.

ЯМР-спектры записывали на спектрометре Вгикег Лтапсе ΌΒΧ 500. Спектры снимали в 0,6 мкл (СЭ₃)₂8О при 30°С (99,95% дейтерия, Эейоп Санкт-Петербург). Использовали замедление релаксации, составляющее 5,0 с. Ή химические сдвиги определяли относительно сдвигов (выбранные произвольно как 2,5 м.д. при 30°С) сигнала (СН₃)₂8О.

ВЭЖХ анализ проводили на аналитическом хроматографе с градиентом 8уйет Со1б Весктап. Колонка иИтакрИеге-ОЭЗ, 5 мк, 205x4,6 мм. Детектирование - УФ-спектрофотометр, λ=214 нм. Комнатная температура. Градиент 0,02 М триэтиламмоний фосфат (рН 3,0) в ацетонитриле (от 0% буфера А до

- 10 018548

100% буфера В). Буфер А - 15% 0,02 М триэтиламмоний фосфат в ацетонитриле. Буфер В - 50% 0,02 М триэтиламмоний фосфат в ацетонитриле.

Масс-спектры снимали на масс-спектрометре νΐδΙΟΝ 2000 ΜΑΣΌΙ.

Пример 1. Получение цикло-Ь-А1а-Ь-61и(0Н).

a. Получение Вос-Е-А1а-Е-С1н(ОВх1)ОН.

Вос-Ь-А1а-О№и (56,5 г, 0,1 моль) и 26,1 г (0,11 моль) Н-Ь-С1и(ОВ71)ОН смешивали с 500 мл смеси диоксин/вода (1:1) и Ν-метилморфолином (11,7 мл) до тех пор, пока рН смеси не становился равным примерно 9-9,2. Суспензия растворялась после 12-18 ч выдерживания при комнатной температуре. Растворители выпаривали в вакууме и остаточное масло растворяли в 500 мл ЕЮАс, которое затем переносили в делительную воронку и промывали 3x200 мл 5% Н₂§О₄ в воде до нейтрального рН. Органический слой отделяли и сушили над безводным сульфатом натрия. После сушки ЕЮАс выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт представлял собой масло, и выход составлял 40,5 г (»100%). К.(=0,6 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН=6:3:1).

b. Получение Вос-Е-А1а-Б-С1и(ОВх1)-Опр.

Вос-Е-А1а-Е-С1н(ОВх1)ОН (40,5 г, 0,1 моль) растворяли в 300 мл ЕЮАс и объединяли с 17 г (0,12 моль) п-нитрофенола. Реакцию проводили при 0°С в течение 1 ч. Затем добавляли ОСС (24,7 г, 0,12 моль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 0°С и в течение 4 ч при комнатной температуре. Осадок ОСИ отфильтровывали и растворитель выпаривали в вакууме. Остаточное масло растворяли в диэтиловом эфире. Осадок отфильтровывали и промывали диэтиловым эфиром и гексаном. Выход составлял 35 г (64%). К,- 0,7 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН=6:3:1).

c. Получение цикло-Е-А1а-Ь-С1и(ОВ71).

Вос-Е-А1а-Е-С1и(ОВ/1)-ОХр (56,0 г, 0,1 моль) растворяли и охлаждали до -15°С. Добавляли ТЕА, смесь перемешивали в течение 1 ч и постепенно нагревали до комнатной температуры. Ход реакции отслеживали по данным ТСХ с использованием системы СНС1₃:Е1-ОАс:МеОН=6:3:1. После окончания реакции смесь упаривали в вакууме, затем дважды упаривали с изопропанолом и растворяли в 500 мл ЕЮАс. Добавляли Ν-метилморфолин до тех пор, пока рН смеси не становился равным 9-9,5. Через 12 ч цикло-Е-А1а-Ь-С1и(ОВ71) выпадал в осадок. Осадок отфильтровывали, промывали ЕЮАс. диэтиловым эфиром и гексаном. Выход составлял 21,0 г (70%).

К.(=0,55 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН:АсОН=6:3:1:0,1); данные ВЭЖХ: время удерживания 15,9 мин.

б. Получение цикло-Е-А1а-Ь-С1и(ОН).

Цикло-Е-А1а-Ь-С1и(ОВ71) (14,4 г, 0,05 моль) растворяли в 200 мл трифторэтанола и затем добавляли 1,5 г палладиевой черни. Через суспензию барботировали водород и смесь перемешивали в течение 48 ч. Ход реакции отслеживали по данным ТСХ. После окончания реакции катализатор отфильтровывали и растворитель выпаривали в вакууме. Остаточный пептид растворяли в 200 мл дистиллированной воды и примеси экстрагировали 3x100 мл ЕЮАс. Водную фазу объединяли и выпаривали в вакууме. Осадок промывали диэтиловым эфиром и гексаном и затем сушили на воздухе. Выход составлял 10,2 г (94%).

В(=0,2 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН:АсОН=6:3:1:0,1);

В(=0,5 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН:32%АсОН=6:3:1:0,1);

данные ВЭЖХ: время удерживания 6,7 мин.

Пример 2. Получение цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОН).

a. Получение цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОМе).

Цикло-Е-А1а-Ь-С1и-(ОН) (2,2 г, 0,01 моль) растворяли в 50 мл ДМФА и затем нагревали до 60°С. После растворения пептида смесь охлаждали до -15°С. Добавляли охлажденный до -15°С изобутилхлорформиат (1,5 мл, 0,012 моль) с последующим добавлением 1,4 мл (0,012 моль) Ν-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин при -15°С и добавляли раствор 2,8 г (0,011 моль) НС1-НЬ-Ттр-ОМе в 20 мл ДМФА и 1,4 мл (0,012 моль) Ν-метилморфолина, оба охлажденные до -15°С. Через 1 ч перемешивания при 0°С реакционную смесь постепенно нагревали до комнатной температуры в течение 4 ч. Осадок отфильтровывали и растворитель выпаривали в вакууме. Остаточное масло растворяли в 100 мл смеси н-бутанол/вода и переносили в делительную воронку. Органический слой отделяли и промывали 3x50 мл 5% Н₂§О₄ и 3x50 мл 5% NаНСΟ₃ в воде. н-Бутанол выпаривали в вакууме и к остаточному маслу добавляли диэтиловый эфир. Осадок отфильтровывали и промывали диэтиловым эфиром и гексаном. Выход составлял 3,4 г (80%).

Κ.ί=0,7 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН:АсОН=6:3:1:0,1); данные ВЭЖХ: время удерживания 16,6 мин. Спектр цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОМе) приведен на фиг. 1.

b. Получение цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОН).

Цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОМе) (1,1 г, 0,0025 моль) суспендировали в 50 мл ЕЮН и добавляли 15 г №ЮН (0,0075 моль) в 25 мл воды. Смесь перемешивали в течение приблизительно 2 ч. После окончания реакции добавляли НС1 до тех пор, пока рН смеси не становился равным примерно 7. Растворитель выпаривали в вакууме. Остаточную смесь переносили в делительную воронку и добавляли 50 мл смеси нбутанол-вода с рН 3. Органический слой отделяли, промывали водой до нейтрального рН и затем выпаривали в вакууме. Остаток выпаривали дважды с изопропанолом и затем добавляли диэтиловый эфир.

- 11 018548

Осадок отфильтровывали и промывали диэтиловым эфиром и гексаном. Выход составлял 0,9 г (82%).

В(=0,5 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН:АсОН=6:3:1:0,1);

данные ВЭЖХ: время удерживания 9,3 мин;

данные масс-спектра: |М+Н'+№1|=407.7.

Аналогичным образом получали следующие дополнительные соединения. Масс-спектры некоторых из данных соединений приведены ниже:

цикло-Е-А1а-Е-61и-(Ь-Тгр-0Ме);

цикло-Е-А1а-Е-61и-(Ь-Тгр-0Н): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=407,7; цикло-О-А1а-О-С1и-(П-Тгр-ОМе);

цикло-0-А1а-0-61и-(О-Ттр-0Н): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=407,9; цикло-Е-А1а-Е-С1и-(О-Тгр-ОМе);

цикло-Е-А1а-Е-С1и-(О-Тгр-ОН): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=408,1;

цикло - О -А1а-0-61и-(Ь -Т гр-ОМе);

цикло-О-А1а-О-С1и-(Е-Тгр-ОН): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=407,6;

цикло - О -А1а-0-Л5р-(Э-Т гр-ОМе);

цикло-0-А1а-0-А8р-(О-Ттр-ОН): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=394,1; цикло-О-А1а-О-А8р-(Е-Ттр-ОМе);

цикло-О-А1а-О-А8р-(Е-Ттр-ОН): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=394,7;

цикло-Е-А1а-Ь-А8р-(П -Т гр-ОМе); цикло-Е-А1а-Е-А8р-(О -Т гр-ОН); цикло-Е-А1а-Е-А8р-(Е-Ттр-ОМе); цикло-Е-А1а-Е-А8р-(Е-Ттр-ОН): масс-спектр: [М+Н⁺+Ыа]=395,3. Пример 3. Получение цикло-Ь-Бук (Н₂Х)-Б-С1и(Б-Тгр-ХН₂).

a. Получение Б1пос-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВ/1)ОН.

Етос-Е-Еу8(Вос)ОМ8и (56,5 г, 0,1 моль) и 26,1 г (0,11 моль) Н-Б-С1и(ОВ71)ОН смешивали с 500 мл смеси диоксин/вода (1:1) и Ν-метилморфолином (11,7 мл) до тех пор, пока рН смеси не становился равным примерно 9-9,2. Суспензия растворялась после 12-18 ч выдерживания при комнатной температуре. Растворители выпаривали в вакууме. Остаточное масло растворяли в 500 мл ЕЮАс, которое затем переносили в делительную воронку и промывали 3x200 мл 5% Н₂8О₄ в воде до нейтрального рН. Органический слой отделяли и сушили над безводным сульфатом натрия. После сушки ЕЮАс выпаривали в вакууме. Неочищенный продукт представлял собой масло, и выход составлял 69,0 г (»100%). В(=0,8 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН=6:3:1).

b. Получение Н-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВх1)ОН.

Бтос-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВ/1)ОН (69,0 г, 0,1 моль) растворяли в 300 мл 20% пиперидина в диоксане и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Растворитель выпаривали в вакууме и остаточное масло растворяли в 0,1% АсОН. Осадок отфильтровывали и промывали 0,1% АсОН и водой до нейтрального рН. Выход составлял 43,7 г (94%). К₍=0,5 (СНС1₃:МеОН:32% АсОН=5:3:1).

c. Получение цикло-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВ/1).

Н-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВ/1)ОН (23,0 г, 0,05 моль) растворяли в 100 мл пиридина и кипятили с обратным холодильником в течение приблизительно 4 ч. Ход реакции отслеживали по данным ТСХ с использованием системы СНС1₃:МеОН:32% АсОН=5:3:1. После окончания реакции смесь упаривали в вакууме и добавляли 500 мл 0,1% АсОН. Цикло-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВ/1) выпадал в осадок. Осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 40°С. Выход составлял 20,9 г (86%). В(=0,75 (СНС1₃:МеОН:32%АсОН=5:3:1); данные ВЭЖХ: время удерживания 19,2 мин.

б. Получение цикло-Б-Бу8(Вос)-Б-С1и(ОН).

Цикло-Б-Бу5(Вос)-Б-С1и(ОВ/1) (22,2 г, 0,05 моль) растворяли в 200 мл трифторэтанола и затем добавляли 1,5 г палладиевой черни. Через суспензию барботировали водород при перемешивании в течение 48 ч. Ход реакции отслеживали по данным ТСХ. После окончания реакции катализатор отфильтровывали и растворитель выпаривали в вакууме. Остаточный пептид растворяли в 200 мл дистиллированной воды и примеси экстрагировали 3x100 мл ЕЮАс. Водную фазу объединяли и выпаривали в вакууме. Осадок промывали диэтиловым эфиром и гексаном и затем сушили на воздухе. Выход составлял 16,7 г (90%).

В(=0,4 (СНС1₃:ЕЮАс:МеОН:32%АсОН=6:3:1:0,1); данные ВЭЖХ: время удерживания 12,7 мин.

е. Получение цикло-Б-Бу8(Вос)-Б-61и-(Б-Тгр^Н₂).

Цикло-Б-Бу8(Вос)-Б-С1и-(ОН) (3,7 г, 0,01 моль) растворяли в 50 мл пиридина и добавляли 0,012 моль ТВТи с последующим добавлением 1,4 мл (0,012 моль) Ν-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре и добавляли раствор 2,8 г (0,011 моль) НС1Н-Б-Тцэ^Н_; в 20 мл пиридина и 1,4 мл (0,012 моль) Ν-метилморфолина. Ход реакции отслеживали по данным ТСХ. Через 4 ч перемешивания растворитель выпаривали в вакууме, остаточное масло растворяли в 100 мл смеси н-бутанол/вода и переносили в делительную воронку. Органический слой отделяли и промывали 3x50 мл 5% Н₂8О₄ и 3x50 мл 5% NаНСО₃ в воде. н-Бутанол выпаривали в вакууме и к оста

- 12 018548 точному маслу добавляли диэтиловый эфир. Осадок отфильтровывали и промывали диэтиловым эфиром и гексаном. Выход составлял 5,0 г (88%).

К.(=0,6 (СНС1з:Е1ОАс:МеОН:32%АсОН=6:3:1:0,1); данные ВЭЖХ: время удерживания 18,6 мин.

£. Получение цикло-Е-Еу8(Н₂Х)-Е-С1и-(Е-Тгр-ХН₂).

Цикло-Е-Еу8(Вос)-Е-С1и-(Е-Тгр-МН₂) (2,9 г, 0,005 моль) растворяли в 50 мл смеси 50% ТЕА/СН₂С1₂ с 0,1% дитиотреитола. Смесь перемешивали в течение приблизительно 1 ч. После окончания реакции растворители выпаривали в вакууме. Остаточное масло растворяли в 50 мл воды и переносили в делительную воронку. Добавляли этилацетат (50 мл). Остаточные примеси экстрагировали. Органический слой отделяли и затем отбрасывали. Воду выпаривали в вакууме, масло растворяли в 50 мл дистиллированной воды и лиофилизировали. Выход составлял 2,7 г (92% в виде трифторацетата).

Κ.ί=0,35 (СНС1₃:Е1ОАс:МеОН: АсОН=6:3:1:0,1); данные ВЭЖХ: время удерживания 7,9 мин.

Пример 4. Действие иммуносупрессоров в условиях ίη νίνο.

В условиях ίη νίνο оценивали действие тестируемых соединений на интактный костный мозг. Пептиды вводили мышам различным образом: подкожно, внутрибрюшинно (в/б) и через рот интактным мышам-донорам в дозах 10-1000 мкг/кг. Через 2 суток после введения препаратов мышей подвергали эвтаназии. Г отовили суспензию костного мозга и вводили внутривенно мышам, получившим летальную дозу облучения. На 8 сутки оценивали колониеобразующую активность. Опытными животными были мыши (СВАхС57В1) Е1 (30 мышей на опыт, в среднем из 3 опытов).

Как следует из данных табл. 2, было обнаружено, что введение тимодепрессина и новых циклических пептидов по настоящему изобретению интактным мышам приводило к снижению популяции КОЕС в костном мозге.

Сравнительный анализ данных по активности новых циклических пептидов по настоящему изобретению и тимодепрессина в отношении супрессии популяции КОЕ-С в костном мозге приведен в табл. 3.

Пример 5. Действие иммуностимуляторов в условиях ίη νίνο.

Проводили исследование с целью сравнения активности неогена и новых циклических пептидов по настоящему изобретению в отношении ослабления отрицательного действия ионизирующего облучения.

В данном опыте применяли метод экзогенных колоний селезенки. Суспензию интактных клеток костного мозга облучали ех νίνο в дозе 1 г. Неоген или циклические пептиды вводили в различных дозах в/б, в/м, подкожно или перорально реципиентам, получившим летальную дозу облучения, в течение 1 ч после введения облученных клеток костного мозга. Колонии подсчитывали на 8 сутки. Все данные в каждой группе выражены в виде средних значений по трем опытам.

Данные, приведенные в табл. 4, показывают, что неоген может стимулировать регенерацию после разрушительного действия облучения на гемопоэтические клетки-предшественники. Было показано, что данный процесс более эффективен при в/м или в/б введении, но не при введении через рот. Новые циклические пептиды, которые подвергались исследованию, обладали аналогичным уровнем активности при системном введении и были активными при пероральном применении в диапазоне доз 10-100 мкг/кг.

Пример 6. Адъювантная активность цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОХа).

Адъювантную активность оценивали на 5 группах мышей (С57В16). Каждая группа состояла из 5 животных. Проводили три иммунизации.

Первая иммунизация.

1. Группа с введением полного адъюванта Фрейнда (СЕА).

2. Группа с введением овальбумина (яичный ОУА) (25 мкг/мышь).

3. Группа с введением СЕА+овальбумина (25 мкг/мышь).

4. Группа с введением овальбумина (25 мкг/мышь)+пептид 1 мкг/мышь.

5. Группа с введением овальбумина (25 мкг/мышь)+пептид 10 мкг/мышь.

Вторая иммунизация.

Введение по той же схеме через 21 сутки после первой иммунизации при введении 12,5 мкг овальбумина/мышь животным групп 2-5.

Третья иммунизация.

Введение по той же схеме через 35 суток после второй иммунизации при введении 12,5 мкг овальбумина/мышь животным групп 2-5.

На 42 сутки отбирали образцы крови от каждой мыши. Кровь от мышей каждой группы объединяли. Сравнивали значения индекса стимуляции для каждой группы. Индекс стимуляции рассчитывали в виде соотношения оптической плотности (ОИ=1) разведенных пулов групп 3-5 к оптической плотности (ОИ=1) разведенных пулов группы 2 (контрольная без адъюванта).

Как следует из данных табл. 5, результаты данного опыта показывают, что один циклический пептид цикло-Ь-А1а-Е-С1и-(Е-Тгр-ОХа), даже без дополнительной модификации сочетанием сахара или пальмитоила, обладает адъювантной активностью и приводит к повышению титров антител к овальбумину на 74%.

Пример 7. Адъювантная активность цикло-Ь-А1а-Е-С1и-(Е-Тгр-ОН) (соединение 17).

Адъювантную активность оценивали на 6 группах мышей. Каждая группа состояла из 5 животных. Проводили три иммунизации следующим образом.

- 13 018548

Первая иммунизация.

1. Мыши 1-5 - введение полного адъюванта Фрейнда (СЕА=контроль).

2. Мыши 6-10 - введение овальбумина (яичного ОУА) 25 мкг/животное+адъювант 100 мкг/животное.

3. Мыши 11-15 - введение овальбумина 25 мкг/животное+СЕА.

4. Мыши 16-20 - введение овальбумина 25 мкг/животное.

5. Мыши 21-25 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант 1 мкг/животное.

6. Мыши 26-30 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант 10 мкг/животное.

Вторая иммунизация.

Введение по той же схеме через 21 сутки после первой иммунизации при введении 12,5 мкг овальбумина/мышь мышам 6-30.

Третья иммунизация.

Введение по той же схеме через 35 суток после второй иммунизации при введении 12,5 мкг овальбумина/мышь мышам 6-30.

На 42 сутки отбирали образцы крови от каждой мыши. Сравнивали значения индекса стимуляции для каждой группы. Индекс стимуляции рассчитывали делением разведения тестированной объединенной сыворотки с получением ОЭ=1 (оптическая плотность) на разведение объединенной сыворотки от мыши, иммунизированной без адъюванта, с получением ΟΌ=1. Результаты приведены в табл. 6.

Пример 8. Адъювантная активность цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Ттр-ОН) (соединения 17), цикло[ЬЕу8(пальмитоил)-Е-С1и-(П-Тгр-ОН) (соединения 26а), цикло[П-Еу8(пальмитоил)-П-С1и-(П-Тгр-ОН) (соединения 26Ь), цикло-Е-Еу8(П-ацетилглюкозамин-П-ацетилмурамил)-Е-С1и-(Е-Тгр-ОН) (соединения 33а) и цикло-О-Еу8(Н-ацетилглюкозамин-П-ацетилмурамил)-О-С1и-(Е-Тгр-ОН) (соединения 33Ь).

Стадия 1.

Адъювантную активность оценивали на 11 группах мышей Ва1Ь/с (полученных из питомника 81о1Ьоуауа ВгссФпд 8ΐ;·ιΙίοη). Каждая группа состояла из 7 животных. Проводили три иммунизации следующим образом.

Первая иммунизация.

Группа 1 - введение овальбумина 25 мкг/животное (мыши 1-7);

группа 2 - введение овальбумина 25 мкг/животное+СЕА (полный адъювант Фрейнда) (мыши 8-14);

группа 3 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 33а 100 мкг/животное (мыши 15-21);

группа 4 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 33а 10 мкг/животное (мыши 22-27);

группа 5 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 33а 1 мкг/животное (мыши 28-35);

группа 6 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 33Ь 100 мкг/животное (мыши 36-42);

группа 7 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 33Ь 10 мкг/животное (мыши 43-49);

группа 8 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 33Ь 1 мкг/животное (мыши 50-56);

группа 9 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 17 100 мкг/животное (мыши 57-63);

группа 10 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 17 10 мкг/животное (мыши 64-70);

группа 11 - введение овальбумина 25 мкг/животное+адъювант соединение 17 1 мкг/животное (мыши 71-77).

Вторая иммунизация.

Введение по той же схеме через 14 суток после первой иммунизации при введении 12,5 мкг овальбумина/мышь мышам 1-77.

Третья иммунизация.

Введение по той же схеме через 28 суток после второй иммунизации при введении 12,5 мкг овальбумина/мышь мышам 1-77.

На 35 сутки после первой иммунизации отбирали пробы крови от каждой мыши.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А).

Раствор ОУА (10 мкг/мл) в 0,05 М натриевом карбонатном буфере (рН 9,5) вносили в лунки планшета из расчета 0,1 мл на лунку и инкубировали при 4°С в течение 16 ч. Затем раствор ОУА удаляли и планшет промывали 4 раза РВ8 с 0,05% твина-20. Такое промывание проводили после каждой стадии инкубации. Серийные двукратные разведения сыворотки крови (начиная от 1:100 или 1:1000) вносили в лунки из расчета 0,1 мл на лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 ч с последующей инкубацией (1 ч, 37°С) с НКР-конъюгированными козьими антимышиными 1дС-антителами (0,1 мл, 1 мг/мл в РВ8) и затем с 0,1 мл раствора субстрата - 0,05% Н₂О₂ и 0,05% о-фенилендиамин в 0,05 М натриевом цитратном

- 14 018548 буфере с рН 4,5. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 12,5% Н₂80₄. Поглощение определяли при длине волны 492 нм с использованием МиНЬсан Р1и8 ΜΚΙΙ (Ноте ЬаЬогаНпек, Великобритания). Высокий титр антител против белка (для отдельных сывороток) определяли в виде разведения сыворотки при поглощении более чем 0,1 0Όυ, и минимальное значение превышало контрольный уровень в 3 раза. Представлен титр антител и -1од разведения (фиг. 2 и 3). Индекс стимуляции для объединенной сыворотки рассчитывали делением разведения тестированной объединенной сыворотки с получением ΟΌ=1 на разведение объединенной сыворотки от мыши, иммунизированной без адъюванта, с получением ΟΌ=1. Результаты по оценке адъювантной активности цикло-Ь-Л1а-Ь-С1и-(Ь-Тгр-0Н) (соединения 17), цикло-ЬЬу8(М-ацетилглюкозамин-Ы-ацетилмурамил)-Ь-С1и-(Ь-Тгр-0Н) (соединения 33а) и цикло-О-Ьу8(Иацетилглюкозамин-Ы-ацетилмурамил)-0-С1и-(Ь-Тгр-0Н) (соединения 33Ь) приведены в табл. 7 и по оценке адъювантной активности цикло[Ь-Ьу8(пальмитоил)-Ь-С1и-(П-Тгр-ОН)] (соединения 26а) и цикло[П-Ьу8(пальмитоил)-О-С1и-(П-Тгр-ОН)] (соединения 26Ь) приведены в табл. 8, а также на фиг. 4, на которой также представлены результаты оценки адъювантной активности цикло-Ь-Ьу8-Ь-С1и-(Ь-Тгр-0Н) (соединения 19). Следует отметить, что пептиды соединения 26а и 26Ь растворяли в 0,1% ИН₄0Н в концентрации 1 мг на 1-2 мл. Пептиды оставались растворимыми при титровании 0,1% АсОН до рН 8,4-8,5. Как следует из результатов оценки адъювантной активности соединений, представленных на фиг. 4, соединение 17 является активным в дозе 1, 10 и 100 мкг/кг; соединение 19 активно в дозе 100 мкг/кг; соединение 33а активно в дозе 100 мкг/кг; соединение 33Ь не является активным соединением; соединение 26а активно в дозе 10 мкг/кг и соединение 26Ь не является активным соединением.

Пример 9. Исследование новых аналогов дерморфина.

1. Оценка периферической опиоидной активности.

Периферическую опиоидную активность пептидов определяли по их способности ингибировать индуцированные электрическими импульсами сокращения изолированной подвздошной кишки морской свинки (СР1) (Ко8(ег111х Н.\У. е1 а1. ТНе еГГес! оГ абгеиаНие. иогабгеиабие аиб 18оргеиа1те οη шЫЬйюп ааиб Ь-абгеиогесерЮг5 ίη 1Не ^идНибни-б ти§с1е оГ 1Не дитеа ρί§ бейт, Βηΐ. ί. РНагтасоГ уо1. 39, р. 398413, 1970).

Отрезок СР1 длиной примерно 1 см помещали в баню для органов емкостью 10 мл с раствором Кребса при 34°С. Состав раствора Кребса был следующим (мМ): ЫаС1 - 118; КС1 - 4,70; СаС1₂ - 2,52; КН₂Р0₄ - 0,93; Мд80₄ - 1,27; ЫаНС0₃ - 25; глюкоза - 11,0. Напряжение покоя органа равнялось 1 г. Отрезок СР1 стимулировали одиночными импульсами продолжительностью 1 мс с 0,1 Гц при 80 В. Раствор изолированных органов постоянно аэрировали. Сокращения регистрировали в изометрическом режиме с помощью датчика К 30 (Нидо 8асЬ§ Е1ек1гошс КС) с использованием бумажного самописца В1кабеик15епе5 (Япония).

Тестируемые соединения растворяли в дистиллированной воде и вносили кумулятивно в баню для органов в объеме 5-30 мкл. Каждое следующее соединение добавляли после того, как изолированные органы промывали 3-4 раза в течение 12-15 мин. На основе полученных данных строили кривые зависимости доза-эффект и активность соединений выражали в виде 1С₅₀ или ρϋ₂. Показатель ρϋ₂ равнялся отрицательному десятичному логарифму концентрации соединения, вызывающего 50% максимальный эффект.

Статистическую обработку данных проводили с использованием ΐ-теста Стьюдента.

Новые аналоги дерморфина тестировали на стандартной модели теста связывания на изолированной подвздошной кишке морской свинки. Для каждой молекулы определяли значение ЕС₅₀ в виде концентрации соединения, вызывающего снижение амплитуды сокращения на 50% по сравнению с исходным значением.

Стандартом во всех опытах был дерморфин. Для подтверждения опиоидной активности использовали специфический антагонист налоксон в концентрации 10^-5 М. Каждую молекулу тестировали в 5 независимых параллелях и относительную активность рассчитывали в виде отрицательного логарифма ЕС50 (ρϋζ).

Как можно видеть из данных табл. 9, все тестированные пептиды обладали различной опиоидной активностью в пределах от 10^-9 до 10^-5 М, за исключением пептидов Н-Туг-Туг-Рго-8ег-ИН₂ (соединения 51) и П-А1а-Э-С1и-(П-Тгр)ОН (соединения 54).

ίί. Анальгетическая активность новых опиоидных пептидных аналогов.

220 мышей Е1 (СВАх С57И16) первого поколения гибридов использовали для тестирования анальгетической активности с использованием теста отдергивание хвоста. Температура воды равнялась 48°С. Максимальный эффект продолжался в течение 30 с. Все пептиды вводили внутрибрюшинно в дозах 5, 10 или 20 мг/кг. Анальгетическое действие определяли через 15-20 мин после введения пептида. Для статистической обработки данных использовали тест Стьюдента с ΐ-критерием. Статическая значимость была на уровне р<0,05. Результаты тестов приведены в табл. 10.

ίίί. Анальгетическая активность дерморфина и аналогов после перорального введения и внутрибрюшинного введения.

Для установления активности новых циклических пептидов по настоящему изобретению при пероральном введении использовали тест отдергивания хвоста. Результаты сравнивали с результатами, по

- 15 018548 лученными с использованием внутрибрюшинного введения.

Антиноцицептивную активность пептидов по настоящему изобретению определяли в опытах на мышах ВАЬВ/с с массой тела 22-24 г. Пептиды растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно или в желудок.

Тест отдергивания хвоста (Р'Атоиг Е.Е. с1 а1. А МеИой Гог Ос1спшшпд Ьокк о£ Раш Зеикайои, 1. Р11агтасо1. Ехр. ТЬег.. Уо1. 72, р. 74-79, 1941) проводили на анальгезиметре типа 812, Нидо 8асЬз Е1ек1гошс КС. Антиноцицептивную активность определяли в виде отсутствия отдергивания хвоста в ответ на стимуляцию сфокусированным пучком теплового излучения продолжительностью 6 с по сравнению с фоновой реакцией продолжительностью 2,0-3,0 с.

Статистическую обработку данных проводили с использованием парного 1-теста Стьюдента. Результаты данных тестов приведены в табл. 11 и 12. Как следует из результатов опытов, только циклические аналоги нейропептидов проявляли активность при пероральном (в желудок) введении.

Не смотря на то что настоящее изобретение было описано со ссылкой на представленные в данном описании предпочтительные примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивается раскрытыми примерами. В противоположность, изобретение предназначено для включения различных модификаций, и эквивалентные схемы входят в изобретение, не отступая от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патент включены в данное описание в полном объеме в той степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально или индивидуально включены для сведения в полном объеме. В тех случаях, когда термин в настоящем описании определен иначе чем в ссылке, включенной для сведения, то приводится определение, которое служит для определения термина.

Таблица 1

Примеры полифункциональных биологически активных соединений и их фармацевтически приемлемых солей, сольватов и пролекарств по настоящему изобретению о

А-Ь>-(СНД,-<ук_я,

О

а. Тестированные иммуно- и гемосупрессоры.

Соед.	А	—г—	т	*	η	I?	Ώ	нь
1	О-Тгр-ОМе	-со-	2	β-β	1	связь	н	Η
2	β-Тгр-ОН	-со-	2	β-β	1	связь	и	Η
3	ϋ-Тгр-ОМе	-со-	2	β-β	1	связь	Βζ	Η
4	ϋ-Тгр-ОН	-со-	2	β-β	1	связь	Βζ	Η
5	β-ΊΎρ-ΟΝΗ2	-со-	2	β-β	1	связь	Βζ	Η
6	Э-Тгр-ОМе	-со-	2	β-β	1	связь	РН	Η
7	ϋ-Тгр-ОН	-со-	2	β-β	1	связь	РО	Η
8	ο-τγρ-νη2	-со-	2	β-β	1	связь	Ρίΐ	Η
9	ϋ-ΤΓρ-ΝΗ2	-со-	2	β-β	4	связь	η2ν	Η
10	В-Тгр-ОМе	-со-	2	β-β	1	связь	Η	Η
11	Ь-Тгр-ОН	-со-	2	β-β	1	связь	Η	Η
12	β-Тгр-ОМе	-со-	1	β-β	1	связь	Η	Η
13	β-Тгр-ОН	-со-	1	β-β	1	связь	Η	Η
14	Ь-Тгр-ОМе	-со-	1	β-β	1	связь	Η	Η
15	Ь-Тгр-ОН	-со-	1	β-β	1	связь	Η	Η

Ь. Тестированные иммуно- и гемостимуляторы.

Соед.	Α	I*1	ш	*	η		ϋ	κ1
16	Ь-Тгр-ОМе	-со-	2	ь-ъ	1	СВЯЗЬ	н	Η
17	Ь-Тгр-ОН	-со-	2	ь-ь	1	связь	н	Η
18	Ь-Тгр-ЫН2	-со-	2	ъ-ь	4	связь	Н2Н	Η
19	Ь-Тгр-ОН	-со-	2	ь-ь	4	связь	н2и	Η
20	ъ-тгр-оме	-со-	2	ь-ь	4	связь	η2ν	Η
21	ϋ-Тгр-ОМе	-со-	1	ь-ь	1	связь	Η	Η
22	ϋ-Тгр-ОН	-со-	1	ь-ь	1	связь	Η	Η
23	Ъ-Тгр-ОМе	-со-	1	ь-ь	1	связь	Η	Η
24	Ь-Тгр-ОН	-со-	1	Ь-Ц	1	связь	Η	Η

- 16 018548

с. Тестированные адъюванты.

Соед.	А	I/	т	*	η	ъ2	В
25	Ъ-ТгрОМе	-со-	2		4	-ΝΗ-	Ра1т*	и
26а	Ь-Тгр- он	-со-	2	ь-ъ	4	-ΝΗ-	Ра1т	н
2 6Ь	Ь-Тгрон	-со-	2	ϋ-Ρ	4	-ΝΗ-	Ра 1т	н
27	Ь-Тгрνη2	-со-	2	ь-ъ	4	-ΝΗ-	Ра1т	н
	28	ϋ-Тгр- ОМе	-со-	1	ь-ь	4	-ΝΗ-	Ра1т	Н
29	Б-ТгрОН	-со-	1	ь-ь	4	-ΝΗ-	Ра1т	н
30	Ь-Тгр- ОМе	-со-	1	ь-ь	4	-ΝΗ-	Е=а1т	н
31	Ъ-Тгр- ОН	-со-	1	ь-ь	4	-ΝΗ-	Ра1т	н
32	Ь-Тгр- νη2	-со-	2	ь-ъ	4	-ΝΗ-	Ν- ацетилглюкозамин(1- 4)-Ы-ацетилмурамил	н
33а	Ь-Тгр- ОН	-со-	2	ь-ъ	4	-ΝΗ-	Ν- ацетилглюкозамин(Ι- Ο -Ν-ацетилмурамил	н
ззь	Ь-ТгрОН	-со-	2	0-0	4	-ΝΗ-	Ν- ацетилглюкозамин(1- 4)-Ν-ацетилмурамил	н

*Ра1т=пальмитоил (гексадеканоил)

й. Пептидные анальгетики+иммунологически активные производные.

Соед.	А		ш	*	η	ъ1	В	к
34	О-Тгр- ОМе	-СО-	2	Ο-ϋ	4	-ΝΗ-	Туг-0-А1а-РЬе-0- А1а-Туг-Рго-5ег-	н
35	υ-тгр-он	-со-	2	0-0	4	-ΝΗ-	Туг-0-А1а-РЬе-0- А1а-Туг-₽го~5ег-	н
36	О-Тгр- νη2	-со-	2	ϋ-0	4	-ΝΗ-	Туг-О~А1а-РЬе-Р- А1а-Туг-Рго-Зег-	н
37	Ь-Тгр- ОМе	-со-	2	ь-ъ	4	-ΝΗ-	Туг-Р-А1а-Р1пе-Р- А1а-Туг-Рго-Зег-	н
38	Ь-Тгр-ОН	-со-	2	ь-ъ	4	-ΝΗ-	Туг-Р-А1а-₽Не-0- А1а-Туг-₽го-5ег-	н
39	Ь-Тгр- νη2	-со-	2	ь-ь	4	-ΝΗ-	Туг-0-А1а-Р1эе-0А1а-Туг-Рго-5ег-	н
40	Э-Тгр- оме	-со-	1	ϋ-ϋ	4	-ΝΗ-	Туг-0-А1а-РЬе-0- А1а-Туг-Рго-2ег-	н
41	ϋ-Тгр-ОН	-со-	1	0-0	4	-ΝΗ-	Туг-0-А1а-РЬе-0- А1а-Туг-Рго-Зег-	н
42	Ь-Тгр- ОМе	-со-	1	ϋ-ϋ	4	-ΝΗ-	Туг-0-А1а-РЬе-Р- А1а-Туг-Рго-2ег-	н
43	Ъ-Тгр-ОН	-со^1	1	υ-υ	4	-ΝΗ-	Туг-Р-А1а-РЬе-Р- А1а-Туг-Рго-5ег-	н

Таблица 2

Образование колоний селезенки клетками костного мозга у мышей, обработанных новыми пептидами

Обработка донора и способ введения	Количество колонии КОЕ8-С на 105 клеток м±м	% супресси и
Контроль	11,2+0,4	-
цикло-ОА1а-0С1и-(0Тгр-0№) (е/б)	5,0+0, 3*	70
цикло-0А1а-061и-{ϋΤτρ-ΟΝ^) (через рот)	6, 0±0,7*	58
цИ'-'ЛО-СА1з“СС1и-(ОТгр-ОМе) (п/к)	6, 8+0,4*	47
цикло-0А1а-0С1и-(ОТгр-ОМе) (через рот)	7,4 + 0, 4*	40
цикло-ЪА1а-ЬС1и-(ЬТгр-ОЫа) (в/б)	11,7+0,8	0
цикло-ЬА1а-ЬС1и-(ОТгр-ОЫа) (1/р)	8, 8+0,2*	20
цикло-0А1а-0Аэр-{ОТгр-ОН) (через рот)	9,0+0,2	26, 5
цикло-0РНе-0С1и-(ΟΤτρ-ΟΝδ) (через рот)	8,1±0,4*	28
цикло-ОТуг-ОС1и-(ПТгр-ОН) (через рот)	6, 3±0,9*	44
уОС1и-ОТгр (тимодепрессин) (в/б)	6,3±0,6*	55

*Р<0,05 по сравнению с контролем

- 17 018548

Таблица 3

Сравнение активности новых соединений по изобретению и тимодепрессина на супрессию КОЕ-С популяции в костном мозге

Соединение (доза - мкг/мышь)	Количество колоний КОЕ-8-С на 105 клеток М±м	% супресси и
Контроль	9,9+0,7	-
γϋΘΐυ-ΌΊΈρ (тимодепрессин) 200,0 (через рот)	5,1±0,2‘	52
уПС1и-ОТгр (тимодепрессин) 20,0 (через рот)	б,4±0,5*	41
уОС1и-ОТгр (тимодепрессин) 2,0 (через рот)	8,0+0,5	33
уиС1и-0Тгр (тимодепрессин)0, 2 (через рот)	10,2±0,3	0
уЭС1и-0Тгр (тимодепрессин) 0,2 (в/б)	5,7+0,4*	51
цикло-бА1а-0С1и-(ЦТгр-ОЫа) 0,2 (через рот)	5,3+0,6*	59
цикло-ОА1а-ОС1и-(БТгр-ОМе) 0,2 (через рот)	б,5±0,5*	42
цикло-0А1а-0Азр-(ОТгр-ОМе) 0,2 (через рот)	8,4+0,6*	28
цикло-0А1а-0Азр-(ПТгр-ОЫа) 0,2 (через рот)	6,8+0,8*	55
цикло-0РЬ1е-031и- (ОТгр-ОЫа) 0,2 (через рот)	8,1±0,4*	28
цикло-ОТуΓ-ϋΟΙυ-(ϋΤτρ-ΟΝβ) 0,2 (через рот)	б,3±0,9*	44

*Р<0,05 по сравнению с контролем

Таблица 4

Влияние неогена или новых циклических пептидов по изобретению на образование экзогенных колоний селезенки под действием облучения 1 г костного мозга в условиях ίη νίίτο

Доза облуче НИЯ	Пептид	Доза пептида, мкг/кг	Путь введения	Колич-в© колонии	% стимуляции
-	-	-	-	11,9+0,4	100
1 Су	-	-	-	6,2±0,6**	0
1 Су	Неоген	10	в/б	9,7±0,4*	81,5
1 Су	Неоген	100	в/б	9,2±0,7*	77, 3
1 Су	Неоген	10	в/м	11,6+0,8*	97,5
1 Су	Неоген	100	в/м	11,8 + 0, 9*	99,1
1 Су	Неоген	100	через рот	6,7+0, 5	0
1 Су	Неоген	1000	через рот	6, 1±0, 3	0
1 Су	Цикло-ЬА1а- ЕС1и-(ЬТгр-ОИа)	100	в/б	9, 6+0, 7*	80,7
1 Су	Цикло-ЬА1а- ЬС1и-(ЬТгр-ОИа)	10	в/б	8,0±0,4*	67,2
1 Су	Цикло-ЬА1аЬС1и- (ЬТгр-ΟΝβ)	100	через рот	11,7+0,6*	98,3
1 Су	Цикло-ЬА1а- ЬС1и-(ЬТгр-ОМе)	100	через рот	8,9±0,5*	74,8
1 Су	Цикло-ЬА1а- ЬС1и-(ЬТгр-ОМе)	100	л/к	8,0+0, 5*	67,2

Таблица 5

Адъювантная активность цикло-Е-А1а-Е-С1и-(Е-Тгр-ОМа)

Тестированный продукт	Индекс стимуляции
СГА (группа 1)	-
Контроль (группа 2)	1, 00
Группа с введением СРА+овальбумин (25 мкг/мьпыь) (группа 3)	2, 40
Цикло-Ъ-А1а-Ь-С1и-(Ь-Тгр-ОИа) 1 мкг/мышь (группа 4)	1, 16
Цикло-Ь-А1а-Ь-С1и-(Ь-Тгр-ОМа) 10 мкг/мышь (группа 5)	1, 74

- 18 018548

Таблица 6

Адъювантная активность цикло-Ь-А1а-Ь-С1и-(Ь-Тгр-ОН) (соединения 17)

Адъювант	Индекс стимуляции
Соединение 17 в дозе 100 мкг	1,14
Соединение 17 в дозе 10 мкг	1,74
Соединение 17 в дозе 1 мкг	1,16
Полный адъювант Фрейнда	2,40
Мыши 6-20 - овальбумин в дозе 25 мкг на животное	1,0

Таблица 7

Титры антител против ОУА после иммунизации белком-адъювантом и соответствующие индексы стимуляции

Иммуноген	Адъювант	Доза, мкт на животное	Титр антител против белка (для отдельных проб сыворотки)	Титр антител против белка (для объединенных проб сыворотки)	Индекс стимуляции
Овальбумин	Соед. 33а	100	4,8	4,8	5,4	5, 1	6,4	5, 1	5, 7	5,5	6, 8
10	4,4	5,7	4,7	5,7	5,7	5,7	5, 4	5,1	3, 5
	5, 1	4,2	5,4	4,1	5,1	5,4	5, 4	4,8	2,9
Соед. ЗЗЬ	100	4, 8	5,4	4,2	5,1	5,1	5,4	5,4	4,8	2,9
10	4,8	4,5	5,2	5,1	5, 4	4,3	5,4	5,4	4, 1
	5,2	4,8	4,8	4,8	4,5	5,1	4,8	5,1	3,5
Соед. 17	100	4,5	4,2	4,2	4,2	5,1	5,1	4,8	4,8	2,3
10	4,8	4,2	4,1	4,5	5,4	4,5	3,9	4,5	1, 9
	5, 1	4,2	4,5	5,1	5,4	5,1	4,5	4,8	2, 6
С ГА		5,3	6,8	6,2	5,3	6,2	6,8	5,9	6,2	13
Без адъюванта		4,2	4,5	4,2	4,5	4,8	4,5	3, 9	4,5	1

Таблица 8

Индексы стимуляции для адъювантов соединений 26а и 26Ь

Иммуноген	Адъювант	Доза, мкг на животное	Титр антител против белка (для отдельных проб сыворотки)	Титр антител против белка (ДЛЯ объединенных проб сыворотки)	Индекс стимуляции
Овальбумин	Соед. 26Ь	100	15	16	17	18	19	20	21	4,8	2,6
4,5	4,5	4,8	4,8	4,2	4,8
10	29	30	31	32	33	34	35	4,8	2,7
4,7	5,1	4,7	4,8	4,7	-	4,8
1	36	37	38	39	40	41		5,1	4,9
5,4	4,5	3,8	3,5	5,1	5,4
Соед. 26а	100	22	23	24	25	26	27	28	5,1	3, 3
4,8	4,4	4,8	5,1	4,8	4,8	5,4
10	42	43	44	45	46	47	48	5,7	6, 5
5,5	5,5	5,8	5,5	5,7	5,7	5,5
	49	50	51	21	53	54	55	4,4	2,0
4,8	5,1	4,5	4,4	5,1	5,1	5,1
С ГА		8	9	10	11	12	13	14	6,2	18
	6,2	5,9	6,2	6,2	6,2	6,2	5,9
Без адъюванта		1	2	3	4	5	6	7	3,9	1
	4,1	4,2	4,2	3,9	4,5	3,9	3,5

Таблица 9

Результаты тестов оценки в условиях ίη уйго (по активности связывания с μ-рецептором СР1) опиоидной активности пептидов

Соединение	Аналоги деморфина	Среднее значение ЕС50 в М	Значение рО2 (М±т)	Антагонизм с налоксоном
44	Цикло-[ Ъ-Ьуз(Н-Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а)-Ь- С1и(ОН)]	5,7x10·’	6,15±0,10	+
45	Цикло-[ Д-Ъуз(Н-Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а)-ЬС1и(Ь-Тгр-ОМе) ]	210 ъ	5,68±0,09	+
46	Цикло-[ Ь-1уз(Н-Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-ТугРго-Зег) -Ь-С1и (Д-Тгр-ИН2)]	Ϊ, 1x10'“	7,9б±0,02	+
47	Цикло-( Ъ-Ьуз(Н-Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-Туг- Рго-Зег)-Ь-С1и(Ъ-Тгр-ОН) ]	3, 3«10 в	7,52±0,07	+
48	(Дерморфин) Н-Туг-О-А1а-Рке-С1у-Туг-РгоЗег-ЫНг	2,5х10 ч	8,56±0,12	+
49	Н-Туг-0-А1а-РЬе-0-А1а-Туг-Рго-Зег-ЫН2	3x10'·	7,55±0,11	+
50	Н-Туг-0-А1а-РЬе-0-А1а-Туг-Рго-Зег-ЫН-СНз	9, 5*10’а	7,95±0,07	+
51	Н-Туг-Туг-Рго-Зег-ЫН2	—	—	—
52	Агд-Туг-О-А1а-РНе-(31у-ОН	3x10'*	5,50±0,07	+
53	Н-Агд-Туг-0-А1а-РЬе-О-А1аОН	1«10'ь	6,06±0,12	+
54	0-А1а-О-С1и-(Ο-Тгр)-ОН	—	—	—
55	Н-Туг-0-А1а-РЬе-С1у-ОН	1х10'6	5,81±0,16	+
56	Н-Туг-О-А1а-С1у-РИе-Ъеи-Агд-ОН	5*10’в (1х10-8)	7,53±0,22	+

- 19 018548

Таблица 10

Анальгетическая активность аналогов опиоидных пептидов

Структура	Доза (мг/кг)	Номер мыши	Уровень первоначальной чувствительности (сек)	Время после введения пептида (мин)
				15	30	45	60	90	120
					Продолжительность	действия	(сех)
Дерморфин:	5	8	3,6±0,2	11,011,0	14,413,0	17,212,4	13,213,2	4,7+0,3	-
Туг-ОА1аРЬе-й1уТуг-РгоЗег-ЫНг	10	10	4,4±0,3	11,711,0	16,612,2	17,012,3	10,211,2	3,9 + 0,2
Опилонг:	5	10	3,0±0,1	9,011,7	10,312,6	14,313,7	10,811,9	6,411,5	3,510,2
Туг-ОАДаРЬе-ОА1аТуг-РгоЗег-ЦНМе	10	10	2,9±0,2	5,910,7	10,710,8	12,212,6	7,211,2	6,911,4	3,7 + 0,4
Цикло( Д-	10	15	3,710,2	6,810,6	6,310,7	8,411,4	7,711,7	6,711,0	4,610,3
Дуз(Н-Туг0-А1а-РЬе0=А1а-ТугРго~5ег)-ДС1ы(Ъ-Тгронн	20	10	3,410,2	7,810,5	8,310,8	8,711,2	9,511,2	9,711,3	8,211,7
ЦиклсН Д-	10	10	3,210,3	11,611,7	15,511,6	15,711,2	13,011,5	9,9+1,5	6,810,5
ДуЗ(Н-ТуГО-А1а-РЬе0-А1а-ТугРго-Зег)-Д- С1и(д-тгрνη2 ) 1	20	10	3,010,2	1,411,6	18,112,3	16,812,2	12,711,8	11,711,2	6,310,6

Статистически достоверные данные (Р<0,05) показаны жирным шрифтом.

Таблица 11

Анальгетическая активность дерморфина и аналогов после перорального введения по данным теста отдергивания хвоста

Структура	Доза (мг/кг)	Номер мыши	Уровень первоначальной чувствительност и (сек)	Время после введения пептида (мин)
				15	30	60	90	120
				Продолжительность действия (сек)
Туг-ОАДа-РЬеСДу-Туг-Рго5θγ-ΝΗ2 Дерморфин	50	6	2,210,1	2,410,1	2,3+0,1	2,3+0,1	3,410, 5
Туг-БАДа-РЕеОАДа-Туг-РгоЗег-ЫНМе Опилонг	50	7	2,6+0,1	3, 3+0,6	2,310, Д	-	4,3+0,6
Цикло[ Д-Дуз (НТуг-Д-А1а~РЕе0-А1а-Туг-Рго2ег)-Д-С1и(ДТгр-ОН) ]	50	8	2,210,1	3,7*10,5	3,9*10,5	4,1*10,5	4,0*10,5	-
Цикло[ Д-Дуз (НТуг-Б-АДа-РЬе0-А1а-Туг-РгоЗег)-Д-С1и(ДТгр-ИН2)]	50	6	2,7+0, 1	4,5*10,1	4,1*10,5	5,5*10,5	5,5*10,4	5,5*10,5
Трамадол	50	6	2,6±0,1	2,610,1	4,б+0,5	4,4* +0,5	4,4*10,6	4,4*10,5

Статистически достоверные данные (Р<0,05) показаны жирным шрифтом. Таблица 12

Анальгетическая активность дерморфина и аналогов после внутрибрюшинного введения

Структура	Доза (мг/кг)	Номер мыши	Уровень первоначальной чувствительност и (сек)	Время после введения пептида (мин)
				15	30	45	60	90	120
				Продолжительность действия (сек)
Туг-БА1а-РЬе- С1у-Туг-РгоЗег-ЫН2 Дерморфин	10	8	2,2+0,2	5,6*10,4	6,0*10
Туг-БАДа-РЪеБА1а-Туг-РгоЗег-ЦНМе Опилонг	10	6	2,0+0,1	3,6+0,7	5,6*10,4	5,5*10,6	5,2*10,6	-	-
Цикло[ Д-Дуз (НТуг-Б-А1а-РНеБ-АДа-Туг-Рго5ег)-Д-С1и(ДТгр-ОН)]	10	9	2,1+0,1	4,1+0,4	5,6*10,4	4,8*10,6	-	-	-
Цикло[ Д-Дуз (НТуг-О-А1а-РЬеБ-АДа-Туг-РгоЗег)-Д-С1и(ДТгр-ΝΗ:)]	10	5	2,110,1	3,910,8	5,3*10,7	5,2*10,6	-	-	-
Агд-Туг-БАДа- РИе-БА1а-ОН	10	9	2,410,1	2,710,1

Статистически достоверные данные (Р<0,05) показаны жирным шрифтом.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полифункциональное биологически активное соединение формулы I о

   А-Ь'-_(Сн_2)т—I» о I где А представляет собой иммунорегуляторную группу, выбранную из группы, состоящей из Тгр, Туг, РЬе, Н18, арила и гетероарила, где арильные и гетероарильные группы могут быть необязательно замещены 1-6 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, ОН,

   - 20 018548

   ОС1_-6алкокси, С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С_2-6алкенилокси, ΝΗ₂, ИН(С1_-6алкил), Ы(С1_-6алкил)(С1_-6алкил), СЫ, СЕ₃, ОСЕ₃, ЫО₂, С(О)С1_-6алкил, С(О)ОС1_-6алкил, 8О₂С_1-6алкил, 8О₂ЫН₂, 8О₂ЫНС1_-6алкил, фенил и С1-6алкиленфенил, и где гетероарил представляет собой ароматическое карбоциклическое кольцо, содержащее от 5 до 10 атомов углерода, в котором от 1 до 4 атомов углерода заменены на гетероатом, выбранный из одного или более О, 8 и Ν-Я¹, где Я¹ выбран из группы, включающей Н, С_1-6алкил, С_1-4алкиленарил, С(О)С_1-6алкил, С(О)арил, 8О₂С_1-6алкил и 8О₂-арил, когда атом N §р³-гибридизован, или представляет одиночную пару электронов, когда атом N §р²-гибридизован;

   Ь¹ выбирают из группы, состоящей из -С(О)-, ^^ΝΒ², ^Я²С(О)-, -ΝΚ²-, -С(О)-О-, -ОС(О)-, -8-8-, 8О2NК²-, ΝΙΙΥΟ·- -8- и -О-;

   Ь² выбирают из группы, состоящей из простой связи, -С(О)-, -Ο^ΝΒ², -№²С(О)-, -ΝΒ²-, -С(О)-О-, -ОС(О)-, -8-8-, 80-^^-, 1МЯ²8О2, -8- и -О-;

   Я² выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, С_1-6алкиленарила, С(О)С_1-6алкила, С(О)арила, 8О₂С_1-6алкила и 8О₂-арила;

   Я⁵ представляет собой Н или С_1-6алкил;

   * означает Ь- или Ό-конфигурацию или их смесь;

   т равно целому числу от 1 до 50;

   η равно целому числу от 0 до 50;

   Ό выбирают из группы, состоящей из Н, С_1-6алкила, любой боковой цепи аминокислоты и любой функционально активной молекулы, которую выбирают из группы, состоящей из адъювантов, анальгетиков, опиатов, антидотов, синтетических вакцин, фармацевтических фармакофоров, сахаров; липидов и нуклеотидов, и когда А представляет собой иммунорегуляторную группу, выбранную из арила и гетероарила, Ό представляет собой функционально активную молекулу, которую выбирают из группы, состоящей из адъювантов, анальгетиков, опиатов, антидотов, синтетических вакцин, фармацевтических фармакофоров, сахаров; липидов и нуклеотидов;

   или его фармацевтически приемлемые соли или сольваты либо сложные эфиры или амиды, при условии, что соединение не представляет собой:

   цикло [Л8р(ТугОВп)Л8р(ТугОВп)];

   цикло [Л8р(ТугОН)Л8р(ТугОН)];

   цикло [Л8р(РйеОВп)Л8р(РйеОВп)];

   цикло [Л8р(РйеОН)Л8р(РйеОН)];

   цикло |С1и(Р11еОВп)С1и(Р11еОВп)|;

   цикло [61и(РЕеОН)61и(РЕеОН)];

   цикло [Л8р(РйеОН)Лгд];

   цикло [Л8р(ТугОН)Л8р(ТугОН)];

   цикло[Α8р(РйеNН₂)^еи] или цикло [А8р[РЕе^Ме)(Вп)]Рйе].
2. 2. Соединение по п.1, где сложные эфиры или амиды представляют собой алифатический сложный эфир, фениловый сложный эфир, ацилоксиметиловый сложный эфир, карбамат или сложный эфир аминокислоты.
3. 3. Соединение по п.1, где А представляет собой группу формулы II

   ΗΝ-\ где Я³ выбирают из группы, состоящей из Н, ОС1-6алкила, ΝΉ2, NНС1-6алкила, ^С1-6алкила)2, ΝΉΝΉ2 и ОУ, где Υ представляет собой фармацевтически приемлемый катион; Я⁴ представляет собой 14 заместителя, которые независимо выбирают из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОС1-6алкокси, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкенилокси, ΝΉ₂, NН(С_1-6алкила), ^С_1-6алкил)(С_1-6алкила), ΌΝ, СЕ₃, ОСЕ₃, NО₂, С(О)С_1-6алкила, С(О)ОС_1-6алкила, 8О₂С_1-6алкила, 8О₂Ж₂, 8О^НС_1-6алкила, фенила и С1-6алкиленфенила; и * означает Ь- или Ό-конфигурацию или их смесь.
4. 4. Соединение по п.3, где Я³ выбирают из группы, состоящей из Н, Ме, ΝΉ₂, NНМе, NМе₂, ΝΉΝ^ и ΘΥ.
5. 5. Соединение по любому из пп.3, 4, где Υ выбирают из группы, состоящей из Να', К⁺ и Ζ1Ε.
6. 6. Соединение по любому из пп.3-5, где Я⁴ представляет собой заместитель, выбранный из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОМе, Ме, винила, винилокси, ΝΌ₂, NНМе, NМе₂, ΌΝ, СЕ₃, ОСЕ₃, NО₂, С(О)Ме, С(О)ОМе, 8О₂Ме, 8О^Н₂, 8О^НМе, фенила и бензила.
7. 7. Соединение по п.6, где Я⁴ является Н.

   - 21 018548
8. 8. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый из Ь¹ и Ь² независимо выбирают из группы, состоящей из -С(О)-, -ΝΚ²-, -С(О)ИК²- и -ХН'С(О)-.
9. 9. Соединение по любому из пп.1-8, где К² выбирают из группы, состоящей из Н, Ме, Вп, С(О)Ме, С(О)РЬ, 8О₂Ме и 8О₂Рй.
10. 10. Соединение по п.9, где К² является Н.
11. 11. Соединение по любому из пп.1-10, где т равно целому числу от 1 до 6.
12. 12. Соединение по любому из пп.1-11, где п равно целому числу от 0 до 10.
13. 13. Соединение по любому из пп.1-12, где К⁵ представляет собой Н и Ме.
14. 14. Соединение по любому из пп.1-13, где обе * в дикетопиперазиновом кольце находятся, по существу, в Ό-конфигурации или обе * находятся, по существу, в Ь-конфигурации.
15. 15. Соединение по любому из пп.1-14, где функционально активную молекулу выбирают из группы, состоящей из адъювантов, таких как пальмитоил; анальгетиков, таких как пептидные анальгетики; опиатов и антидотов, таких как дерморфин, морфин, налоксон и их производные; синтетических вакцин, таких как антигенные детерминанты - Т- и В-эпитопы; фармацевтических фармакофоров, включая малые молекулы, такие как метотрексат, диклофенак, ибупрофен, индометацин, напроксен и кетопрофен; сахаров; липидов и нуклеотидов.
16. 16. Полифункциональное биологически активное соединение формулы I по п.1, имеющее следующую формулу:

    где К³ выбирают из группы, состоящей из Н, ОС1-6алкила, ΝΉ2, NНС1-6алкила, И(С1-6алкила)2, ИНИН2 и ОУ, где Υ представляет собой фармацевтически приемлемый катион; К⁴ представляет собой 14 заместителя, которые независимо выбирают из группы, состоящей из Н, атома галогена, ОН, ОС1-6алкокси, С1_-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкенилокси, Ν4₂, ИН(С1_-6алкила), И(С_1-6алкил)(С_1-6алкила), СИ, СЕ₃, ОСЕ₃, NΟ₂, С(О)С1_-6алкила, С(О)ОС1_-6алкила, 8О₂С)_-6алкила, 8О¥Н₂, 8О₂ИНС)_-6алкила, фенила и С1-6алкиленфенила.
17. 17. Полифункциональное биологически активное соединение по п.1, выбранное из соединений, представленных ниже о

    ^Κ'Ν (СН₂)„-Ь²-Ц

    А-ьЧснл-!)!! К_к;

    о I

    Соед. А —?— т * η ---57---- Е к⁵ 1 Е-Тгр-ОМе -со- 2 Ώ-Ε 1 связь н н 2 ϋ-Тгр-ОН -со- 2 В-Е 1 связь н н 3 В-Тгр-ОМе -со- 2 η-η 1 связь Βζ н 4 и-тгр-он -со- 2 Γ-Ό 1 связь Βζ н 5 Ώ-Тгр-ОННг -со- 2 Ό-Ε 1 связь Βζ н 6 ϋ-Тгр-ОМе -со- 2 ϋ-ϋ 1 связь РЬ н 7 О-Тгр-ОН -со- 2 Ε-ϋ 1 связь РЬ Н 8 Р-Тгр-ЦН₂ -со- 2 ϋ-β 1 связь РЬ н 9 Р-Тгр-ИНг -со- 2 ϋ-ϋ 4 связь Н₂И н 10 Ь-Тгр-ОМе -со- 2 ϋ-ϋ 1 связь н и 11 ь-тгр-он -со- 2 ϋ-ϋ 1 связь н н 12 о-тгр-оме -со- 1 Β-Ε 1 связь н н 13 р-тгр-он -со- 1 ϋ-Ε 1 связь н н 14 Ь-Тгр-ОМе -со- 1 ΕΈ 1 связь н н 15 Ь-Тгр-ОН -со- 1 Ε-Ε 1 связь н н 16 Ь-Тгр-ОМе -со- 2 Ь-Ь 1 связь н н 17 Ъ-Тгр-ОН -со- 2 ь-ь 1 связь н н 18 Ε-Ττρ-ΝΗ2 -со- 2 ь-ь 4 связь Н₂М н 19 Ъ-Тгр-ОН -со- 2 ь-ь 4 связь Н₂М н 20 ь-тгр-оме -со- 2 ь-ь 4 связь η₂ν н 21 Ц-Тгр-ОМе -со- 1 ь-ь 1 связь н н 22 Ц-Тгр-ОН -со- 1 ь-ь 1 связь н Н 23 Ь-Тгр-ОМе -со- 1 Е-Ь 1 связь н н 24 Ь-Тгр-ОН -со- 1 ь-ь 1 связь н н

    - 22 018548

    Соед. А I? т * и Β Н^ь 25 Ь-Тгр-ОМе -СО- 2 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т* Н 26а Ь-Тгр-ОН -со- 2 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т Н 26Ь Ь-Тгр-ОН -со- 2 ϋ-ϋ 4 -ΝΗ- Ра1т Н 27 Ь-Τφ-ΝΗ, -со- 2 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т Н 28 Э-Тгр-ОМе -со- 1 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т н 29 П-Тгр-ОН -со- 1 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т н 30 Ь-Тгр-ОМе -со- 1 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т н 31 Ь-Тгр-ОН -со- 1 ь-ь 4 -ΝΗ- Ра1т Н 32 Ь-Тгр-КН₂ -со- 2 ъ-ь 4 -ΝΗ- 14-ацетилглюкозамин(1-4)Ν-ацетилмурамил- н 33а Ь-Тгр-ОН -со- 2 ь-ь 4 -ΝΗ- Ν-аиетил гл кжозамнн(1-4)Ν-ацетилмурамил- н ззь Ь-Тгр-ОН -со- 2 ϋ-ϋ 4 -ΝΗ- Ы-ацетилглюкозамин( 1-4)Ν-ацетил му рамил- н 34 О-Тгр-ОМе -со- 2 ϋ-ϋ 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-Туг- Рго-8ег- н 35 О-Тгр-ОН -со- 2 ϋ-Γ 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-Туг- Рго-8ег- н

    36 Ο-Τιρ-ΝΗ, -СО- 2 ϋ-ϋ 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РНе-О-А1а-Туг- Рго-8ег- Н 37 Ь-Тгр-ОМе -СО- 2 ь-ъ 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-Туг- Рго-8ег- Н 38 Ь-Тгр-ОН -СО- 2 ь-ъ 4 -ΝΗ- Туг-Г)-А1а-Р11е-О-А1а-Туг- Рго-8ег- Н 39 Ь-Тгр-ЫН, -СО- 2 ь-ь 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-Туг- Рго-8ег- Н 40 О-Тгр-ОМе -СО- 1 п-о 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-ТугРго-Зег Н 41 О-Тгр-ОН -СО- 1 ϋ-Ο 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-Туг- Рго-8ег- Н 42 Ь-Тгр-ОМе -СО- 1 Ώ-Ο 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а-ТугРго-8ег- Н 43 Ь-Тгр-ОН -СО- 1 и-э 4 -ΝΗ- Туг-О-А1а-РЬе-1>А1а-Туг- Рго-8ег- Н 45 Ь-Тгр-ОМс -СО- 2 ь-ь 4 -ΝΗ- Н-Туг-О-А1а-РЬе-О-А1а Н
18. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая полифункциональное биологически активное соединение по любому из пп.1-17 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. 19. Применение соединения по любому из пп.1-17 в качестве лекарственного средства для лечения иммунных нарушений.
20. 20. Применение соединения по любому из пп.1-17 для лечения иммунных нарушений.