KR20080091103A - 세포자살 억제 화합물 - Google Patents

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엔리끄 페레즈 파야
마리아 제수스 빈센트 도콘
마르 오르제즈 칼라타유드
로라 몽드래곤 마르티네즈
앤젤 메쎄구어 페이포쉬
페르난데즈 알레쟈드라 모레
글로리아 산크리멘스 페레즈 드 로자스
젬마 말레 앙그라
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라보라토리오스 살바트, 에스.에이.
콘세호 수페리오르 데 인베스티가시오네스 시엔티피카스
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Abstract

본 발명은 식(I)의 화합물 및 세포자살 억제제로 작용하는 식(I)의 화합물에 기초한 약물 결합체, 이들의 제조방법과 이들을 함유하는 약제학적 조성물, 및 약제에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

세포자살 억제 화합물 {COMPOUND FOR THE INHIBITION OF APOPTOSIS}
본 발명은 세포자살 억제제 역할을 하는 화합물과 그 제조방법, 및 이를 함유하는 약제학적 조성물과 약제에 대한 이의 용도에 관한 것이다.
세포자살(apoptosis)은 정상적인 세포회전(cell turnover), 면역계와 배아 발생 및 각종 질병에 대한 이의 연계성 등을 포함하는 광범위한 생물계에서의 중요성 때문에 주목을 받는 생물학적 과정이다. 알츠하이머병 및 헌팅톤병 같은 퇴행성 신경질환, 허혈증, 자가면역질환 및 몇몇 암종을 포함하는 다수의 인체 병리 소견에는 부적절한 세포자살이 수반된다 (Reed J.C., Trends Mol. Med. 2001, 7:314-319 참조).
세포표면 사멸 수용체의 활성화, 항암제, 방사선 조사, 생존 인자의 결핍 및 허혈증 등을 포함하는 다양한 세포자살 자극이, 시스테인 아스파틸 프로테아제 소위 카스파제(caspase) 종류를 활성화시키는 신호전달 연속반응을 유도한다. 이러한 프로테아제 즉 단백질 분해효소가 세포자살 공정을 실행하는 것이다.
세포자살 신호 중에는 카스파제-9를 억제제로 활용하는 미토콘드리아-조절성 혹은 내성 경로를 활성화하는 것도 있다. 아폽토좀(apoptosome: 자발적 세포 사멸체)라고 부르는 거대분자 복합체의 형성이 이 경로에서 일어나는 핵심 현상이다.
아폽토좀은 사이토크롬 c-활성화 Apaf-1 (세포자살성 프로테아제 활성 인자), dATP 및 프로카스파제-9에 의해 형성되는 완전효소(holoenzyme) 다중단백질 복합체이다 (Li, P. et al., Cell 1997, 91:479-489; Acehan D et al., Mol. Cell 2002, 9: 423-432; Rodriguez J. et al., Genes Dev. 1999, 13: 3179-3184; Srinivasula S.M. et al., Mol. Cell 1998, 1:949-957 참조). 상기 거대분자 복합체에서, 아폽토좀 관련 카스파제-9가 활성화되어 이펙터 카스파제를 활성화한다. 질병관련 세포자살을 완화시킬 수 있는 분자를 확인하기 위하여, 초기의 약물 개발은 카스파제 활성을 목표로 하였으며 이에, 상향 활성화 연속반응/경로의 조절제가 아닌 특이적 효소 활성화제나 억제제를 찾고자 노력해왔다 (Scott C.W. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304:433-440; Garcia-Calvo M, J. Biol. Chem. 1998, 273:32608-32613 참조).
그럼에도 불구하고, 카스파제 활성화를 상향시키는 단백질간 상호작용은 세포자살 경로의 조절제 개발에서 실질적으로 중요한 중재적 역할을 할 수 있다. 특히, 최근의 연구 자료에서는 아폽토좀을 세포자살 조절제 개발에서 흥미로운 목표로 제시하고 있다.
따라서, 현재 아폽토좀 조절성 활성화 세포자살을 억제할 분자들을 발견하는데 관심이 모아지고 있다.
본 발명의 한 측면은 하기의 식(I)으로 표현되는 새로운 화합물, 이의 입체 이성질체와 그 혼합물, 이의 동질이상체와 그 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 이의 용매 화합물과 부가염을 제공하는 것이다.
Figure 112008044661058-PCT00001
여기서,
R1은 (C1-C5)알킬, (C2-C5)알케닐, -(CH2)1-3-NHCO-(C1-C3)알킬, -(CH2)1-3-CONRaRb, -(CH2)0-3-(3-6)Cy, -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸), -(CH2)1-3-(2-나프틸), -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)2-CH(페닐)2, -(CH2)2-CH(페닐)[(5-6)Hetar] 또는 -(CH2)2-CH[(5-6)Hetar]2를 나타내고;
R2는 -(CH2)0-3-(3-6)Cy, -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸), -(CH2)1-3-(2-나프틸), -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)2-CH(페닐)2, -(CH2)2-CH(페닐)[(5-6)Hetar] 또는 -(CH2)2-CH[(5-6)Hetar]2를 나타내고;
R3은 -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸), -(CH2)1-3-(2-나프틸) 또는 -(CH2)1-3-(5-10)Hetar를 나타내고;
상기의 (C1-C5)알킬 및 (C2-C5)알케닐은 -O-(C1-C2)알킬, -S-(C1-C2)알킬, -NH2, -NH-(C1-C2)알킬 및 -N[(C1-C2)알킬]2 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되고;
(C1-C3)알킬은 하나 이상의 할로겐에 의해 선택적으로 치환될 수 있으며;
Ra 및 Rb 는 서로 독립적으로 -H 또는 -(C1-C3)알킬을 나타내고;
(3-6)Cy는 부분 불포화 혹은 포화된 3- 또는 6-위치 탄소고리를 나타내고;
(5-6)Hetcy는 0, S 및 N 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 혹은 포화된 5- 또는 6-위치 탄소고리의 C- 혹은 N-라디칼을 나타내고;
Cy 및 Hetcy는 할로겐, -CF3 및 -OH 중에서 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환될 수 있으며;
(5-6)Hetar 및 (5-10)Hetar는 각각, 0, S 및 N 중에서 독립적으로 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5- 또는 6-위치 고리 및 5- 내지 10-위치 고리의 C- 혹은 N-라디칼을 나타내고;
페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, (5-6)Hetar 및 (5-10)Hetar는 할로겐, -CF3, -OH, -O-(C1-C3)알킬, -CO-(C1-C5)알킬, -(C1-C5)알킬-NRaRb, -NRaRb 및 -SO2NH2 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환되고, 단 이 경우 R2는 2-(4-플로로페닐)에틸이 아닌 것을 조건으로 한다.
본 발명의 또다른 측면은, 다음 식(II)의 라디칼을 포함하는 것으로서 폴리글루탐산 고분자에 결합된 약물 결합체인 화합물, 이의 입체 이성질체와 그 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 용매 화합물과 부가염을 제공하는 것이다.
Figure 112008044661058-PCT00002
여기서,
R1, R2 및 R3은 R2에 관한 조건을 제외하고 상기 식(I)의 화합물에 대해 정의된 것과 동일한 의미를 갖고; 각각의 R4는 20개의 자연발생 아미노산 중 어느 하나에서의 측쇄를 독립적으로 나타내며; 또한 n은 0, 1, 2 또는 3이다.
따라서, 상기 식(II)의 화합물은 각종 성분들, 즉, n개의 L- 아미노산 및 하나의 아미드 L-리신 유도체의 펩티드 사슬에 대하여 아미드 결합을 형성하고 이때 측쇄의 N은 폴리글루탐산 고분자에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 식(I)의 라디칼을 포함한다.
상술한 정의에 있어서, (C1-C3)알킬 및 (C1-C5)알킬은 각각, 1개 내지 3개 및 1개 내지 5개의 탄소 원자를 가진 직쇄 혹은 분지쇄의 포화 탄화수소 사슬을 나타낸다. (C1-C3)알킬의 예는 특별히 한정되지 않으나, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. 또한 (C1-C5)알킬은 특별히 한정되지 않으나 상기의 예에 추가적으로, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 1-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필 및 2,2-디메틸프로필 등을 포함한다.
(C2-C5)알케닐은 2개 내지 5개의 탄소 원자 및 1개 이상의 2중 결합을 포함하는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬을 나타내며, 예를 들면, 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐 및 1,3-부타디에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-메틸-2-부테닐, 2-메틸-3-부테닐, 3-메틸-1-부테닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐 및 1,2-디메틸-1-프로페닐을 포함한다.
(C1-C3)알킬, (C1-C5)알킬 및 (C2-C5)알케닐은 화학적 관점에서 적절한 경우, 본 발명의 상세한 설명에 근거하여 선택적으로 치환될 수 있다.
(3-6)Cy는 부분 불포화 혹은 포화된 3- 내지 6-위치 탄소 고리의 라디칼을 나타낸다. 상술한 바와 같이, 이것은 고리의 적절한 위치에서 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. (3-6)Cy의 예는 특별히 한정되지 않으나, 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로헥산, 1-시클로부텐, 2-시클로부텐, 1-시클로펜텐, 2-시클로펜텐, 1-시클로헥센, 2-시클로헥센 및 3-시클로헥센의 라디칼을 포함한다.
(5-6)Hetcy는 0, S 및 N 중에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 부분 불포화 혹은 포화된 5- 또는 6-위치 탄소 고리의 C- 또는 N-라디칼을 나타내며 이것은 적절한 고리 위치에서 상술한 바와 같이 치환될 수 있다. (5-6)Hetcy의 예는 특별히 한정되지 않으나, 디히드로푸란, 피롤린, 피라졸린, 이미다졸리딘, 이소티아졸리딘, 이소옥사졸리딘, 옥사졸리딘, 피라졸리딘, 피롤리딘, 티아졸리딘, 디옥산, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피란, 테트라히드로피란, 옥사진, 옥사졸린, 피롤린, 티아졸린, 피라졸린, 이미다졸린, 이소옥사졸린 및 이소티아졸린 등의 라디칼을 포함한다.
(5-6)Hetar 및 (5-10)Hetar는 각각, 0, S 및 N 중에서 독립적으로 선택된 1개 내지 2개의 헤테로원자를 함유하는 것으로서 방향족 5- 또는 6-위치 및 5- 내지 10-위치 고리를 나타내며 이들은 적절한 고리 위치에서 상술한 바와 같이 치환될 수 있다. (5-6)Hetar의 예는 특별히 한정되지 않으나, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 이소옥사졸, 이소티아졸, 옥사졸, 1,2,4-옥사디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 1,3,4-옥사디아졸, 1,3,4-티아디아졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진 및 피라진 등의 라디칼을 포함한다. 또한, (5-10)Hetar의 예는 특별히 한정되지 않으나 상기의 예에 추가적으로, 벤즈이미다졸, 벤조푸란, 벤조티아졸, 벤조티오펜, 이미다조피라진, 이미다조피리다진, 이미다조피리딘, 이미다조피리미딘, 인다졸, 인돌, 이소인돌, 이소퀴놀린, 피라졸로피라진, 피라졸로피리딘, 피라졸로피리미딘, 퓨린, 퀴나졸린 및 퀴녹살린 등의 라디칼을 포함한다.
본 명세서에서 "하나 이상의..에 의해 선택적으로 치환되는 기" 라는 표현은 하나 이상, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개의 치환기에 의해 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 것으로서, 치환되기 쉬운 1, 2, 3 또는 4개의 위치를 갖는 기를 뜻한다.
본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 "포함한다" 는 표현 및, "포함하는" 등과 같은 이의 유사한 표현은 기타의 첨가제, 성분, 요소 또는 단계를 배제하는 것으로 해석하지 않는다.
"치료"는 어떤 상태를 치료, 예방 또는 관리하는 것을 포함한다. "약제학적으로 허용되는"은 의학적 판단 범위에서 타당한 유익한 효과/적당한 위험 비율에 상응하여, 과다한 독성, 자극, 알레르기 반응 혹은 기타의 문제나 합병증을 야기하지 않고 인간 및 동물의 조직과 적절히 접촉 사용할 수 있는 화합물, 조성물 및/또는 복용 형태 등을 뜻한다.
본 발명의 한 구현예에서, R1은 (C1-C5)알킬, -(CH2)1-3-CONRaRb, -(CH2)0-3-(3-6)Cy, -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸) 또는 (CH2)1-3-(2-나프틸)을 나타내고, 이들은 모두 선택적으로 치환될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, R1은 -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸) 또는 (CH2)1-3-(2-나프틸)을 나타내고, 이들은 모두 선택적으로 치환될 수 있다.
또다른 구현예에서, R1은 할로겐으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적 치환되는 -(CH2)2-페닐을 나타낸다. 또다른 구현예에서 R1은 2,4-디클로로페닐을 타나낸다.
또다른 구현예에서, R2는 2-(4-플루오로페닐)에틸이 아닌 조건하에 선택적으로 치환되는 -(CH2)1-3-아릴 또는 선택적으로 치환되는 (CH2)2-CH(Ph)2을 나타낸다. 또다른 구현예에서, R2는 2-(4-플루오로페닐)에틸이 아닌 조건하에 3,3-디페닐프로필을 타낸다.
또다른 구현예에서, R3은 선택적으로 치환되는 -(CH2)1-3-(5-10)Hetar 또는 -(CH2)1-3-페닐을 나타낸다. 또다른 구현예에서, R3은 할로겐으로부터 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환되는 -(CH2)2-페닐을 나타낸다. 또다른 구현예에서, R3는 2,4-디클로로페닐을 나타낸다.
또다른 구현예에서, R4는 3,3-디페닐프로필을 나타내며 R1 및 R3은 모두 2,4-디클로로페닐을 나타낸다.
본 발명의 또다른 구현예는 상기에서 정의된 바와 같이 폴리글루탐산 고분자에 결합된 식(II)의 화합물을 포함하는 약물 결합체인 화합물에 관한 것으로서, 상기 고분자는 20 내지 60kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 또다른 구현예는 고분자-약물 결합체로서 하기의 식(III)으로 표현되는 화합물에 관한 것이다.
Figure 112008044661058-PCT00003
여기서,
R1, R2, R3 및 R4는 상기의 식(II)에서 정의된 것과 동일한 의미를 갖고, ㅌx에 대한 y의 상대비 (즉, y:x)는 25 내지 30중량% 대 75 내지 70중량% 이다.
상기 식(III)의 화합물에 관한 구현예에서, n은 0을 나타낸다. 또다른 구현예에서, n은 2이고 R4는 글리신 측쇄를 나타낸다. 또다른 구현예에서, n은 4이고 R4는 글리신 측쇄, 아르기닌 측쇄 및 페닐알라닌 측쇄를 나타낸다. 또다른 구현예에서, n은 3이고 R4는 발린 측쇄, 아르기닌 측쇄 및 페닐알라닌 측쇄를 나타낸다.
고분자 약물 결합체에서, 폴리글루탐산은 폴리(L-글루탐산), 폴리(D-글루탐산) 또는 폴리(DL-글루탐산)이다. 본 발명의 구현예에서 폴리글루탐산은 폴리(L-글루탐산)이다.
또한, 상술한 구현예의 모든 조합도 본 발명에 포함된다.
식(I)의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 포함한다. 본 발명은 식(I)의 라세미 화합물 및 에난시오머 화합물, 즉, 하기에서 보는 바와 같이 R1에 부착된 키랄 탄소가 (S) 배열인 화합물 및 R1에 부착된 키랄 탄소가 (R) 배열인 화합물을 모두 포함한다.
Figure 112008044661058-PCT00004
식(II)의 화합물은 두개 이상의 키랄 중심을 포함한다. 본 발명은 또한, 식(II)의 입체이성질체 및 고립 입체이성질체의 혼합물도 포함한다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 염기성 질소 원자를 함유함으로써 산과 함께 염을 형성하며 이것 또한 본 발명에 포함된다. 약제학적으로 허용되는 염의 예로서, 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 과염소산, 황산 및 인산 등의 무기산과 함께 형성된 부가염 및, 아세트산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 벤조익산, 캄포술폰산, 만델린산, 옥살산, 숙신산, 푸마르산, 주석산 및 말레인산 등의 유기산의 부가염을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 산의 양성자를 함유함으로써 염기와 함께 염을 형성하며 이것 또한 본 발명에 포함된다. 이들 염의 예로서, 알칼리금속 이온, 알칼리토금속 이온 혹은 알루미늄 이온 등의 금속 양이온과 함께 형성된 염을 포함하거나; 또는 유기 염기나 무기 염기를 가진 유기 화합물과 배위결합을 형성하기도 한다. 허용되는 무기 염기는 수산화알루미늄, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨 및 수산화나트륨을 포함한다. 전하를 띤 작용기 수와 양이온 및 음이온의 원자가에 따라 하나 이상의 양이온 혹은 음이온이 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 무독성의 유기 염기류에서 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 자연발생형 치환 아민을 포함한 치환 아민, 고리형 아민의 염류, 또한, 예를 들어, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N- 에틸모르폴린, 에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히드티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등의 염기성 이온 교환 수지를 포함한다.
치료 목적으로 사용시 약제학적으로 허용되는 한, 사용가능한 염의 종류에는 특별한 제한이 없다. 염류는 염기 부분이나 산 부분을 함유하는 모계 화합물로부터 종래의 화학적 방법에 따라 합성할 수 있다. 일반적으로 이러한 염류는 유리산 혹은 염기 형태의 화합물을 화학량론적 양의 적절한 염기 혹은 산과 함께 물 혹은, 에테르, 에틸아세테이트, 에탄올, 이소프로판올이나 아세토니트릴 같은 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 속에서 반응시켜 제조할 수 있다. 식(I) 또는 (II)의 화합물 및 이들의 염은 일부 물성이 상이하나 본 발명의 목적 측면에서는 동등하다.
본 발명에 따른 식(I) 또는 (II)의 화합물 중에는, 예를 들어, 수화물 같은 용매 화합물 형태 이외에 용매 화합물이 아닌 형태로 존재하는 것도 있다. 본 발명은 약제학적 활성을 갖는 상술한 모든 형태를 포함한다.
식(I)의 화합물 중 일부는 다형성 특징을 나타내기도 하며 본 발명은 가능한 모든 다형태물 및 이의 혼합물을 포함한다. 각종 다형태물은 상이한 조건하에 결정화 반응에 의해, 또는 화합물을 가열하거나 용융한 후 천천히 혹은 급속히 냉각함으로써 제조하기도 한다. 다형물의 존재 여부는 고체 NMR 분광법, IR 분광법, 미분주사열량 측정법, 분말 X선 회절법, 혹은 기타의 기술로 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 식(I)의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 포함한다. 또한 이외에 또다른 키랄 중심을 가질 수도 있다. 본 발명은 입체이성질체와 그 혼합물, 특히 라세미체와 그 혼합물 중 하나를 포함한다. 단일 에난시오머는 통상적으로 이용되는 방법, 예를 들어, 라세미 혼합물을 고정 키랄상(phase)에서 크로마토그래피 분리하는 방법, 디아스테레오머 염류를 분별결정화 처리하여 라세미 혼합물을 분리반응시키는 방법, 키랄 합성법, 효소적 분리법, 또는 생체변환법 등을 이용함으로써 제조할 수 있다. 상기의 분리법은 키랄 합성 중간체 혹은 식(I)의 산물에 대해 행할 수 있다. 이와 별도로, 식(I)의 화합물의 에난시오머는 광학적 순수 출발물질이나 공지된 구성의 시약을 이용하여 에난시오-특이적(enantiospecific) 합성에 따라 수득할 수 있다.
식(I) 또는 (II)의 화합물은 각종 디아스테레오머로 존재하거나 또는 크로마토그래피 혹은 분별결정법 등의 종래 기술에 따라 분리된다. 본 발명의 화합물 중에는 시스/트랜스 이성체로 존재하는 것도 있다. 본 발명은 기하 이성체 및 그의 혼합물도 포함한다. 본 발명은 합성법이나 물리적 혼합으로 얻은 이성체 및 그 혼합물 (예, 라세미 혼합물)을 모두 포함한다.
본 발명은 상술한 신규의 화합물, 이들의 유도체, 유사체, 호변이성체(tautomeric form), 입체이성체, 다형체 혹은 이들의 약제학적으로 허용되는 염 및 용매 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 하기의 방법 및 유기합성 분야에서 공지된 다른 방법들을 이용하여 합성할 수도 있다. 바람직한 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 하기의 화학 반응식에서 보는 바와 같은 일반적인 방법들을 포함한다. 별도의 언급이 없을 경우, R1, R2, R3, R4, n, x 및 y 는 식(I), (II) 및 (III)에서 정의된 바와 같다.
식(I)의 화합물은 다음의 방법을 이용하여 생성할 수 있다:
방법 A
Figure 112008044661058-PCT00005
(표- 탈보호화 , 1)아미드 커플링, 2)수지 분할)
방법 A에 따르면, 플루오레닐메톡시카르보닐기로부터 탈보호시, 고체 지지 아민(IV)은 아실화제(V)에 의해 아실화되며 여기서 X는 할로겐 등의 이탈기를, Y는 OH 또는 할로겐을 나타낸다. Y가 클로로아세틸클로라이드 같은 할로겐인 경우 반응은 트리에틸아민 같은 3차 염기의 존재하에 행해질 수 있다. Y가 -OH인 경우, 즉, 브로모아세트산인 경우 반응은 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 같은 적절한 커플링제의 존재하에 행해질 수 있다. 양쪽 모두에서, 반응은 실온에서 N,N'-디메틸포름아미드나 디클로로메탄 같은 수지를 적절히 팽윤시킬 수 있는 불활성 용매 내에서 수행되거나 혹은 전자파 조사로 반응시간을 단축할 수 있다. 따라서, 아민(VIa)은 염기인 3차 아민에 의해 커플링 결합된다. 반응은 60℃에서 가열하거나 전자파 조사하여 행할 수 있다.
PG가 알릴 같은 보호기로 존재하는 카르복실산(VIII)은 커플링제, 예컨대, N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸의 조합물을 이용하여 아민(VII)과 반응시킴으로써 아미드(IX)를 생성한다. 이어서, 염기 및, N,N'-디메틸포름아미드나 디메틸술폭시드 같은 용매를 이용하여 아민(VIb)을 마이클 반응에 의해 도입함으로써 중간체(X)를 수득한다. 중간체(VII)에 관하여 기술된 바과 동일한 방식으로 아실화 및 아민화 반응을 반복함으로써 XI를 수득한다. 용매인 디클로로메탄 내에서 PhSiH3 및 Pd(PPh3)4를 이용하거나 (Tetrahedron Lett 1999, 40:2505-2508; Tetrahedron Lett 1997, 38:7275-7278 참조) 혹은 디옥산에 용해된 KOH 수용액을 이용하여 탈보호 반응을 행함으로써 화합물(XII)을 얻는다. N,N-디이소프로필에틸아민 같은 3차 아민의 존재 하에 행하는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 및 1-히드록시벤조트리아졸의 조합과 같이, 고리화 반응은 고체상 펩티드 결합법에 이용되는 표준 커플링 시약을 이용하는 아미드 형성법에 의해 촉진된다. 트리플루오로아세트산, 디클로로메탄 및 물의 혼합물을 이용하면 최종 화합물(I)을 수지로부터 분리할 수 있다.
식(I)의 화합물을 제조하는 또다른 방안으로서 아민(IV) 및 (X)을 식(XIIIa) 및 식(XIIIb)으로 표현되는 아미노산과 각각 아실화 반응시키는 것도 포함한다 (방법 B).
Figure 112008044661058-PCT00006
방법 B
당업자에게 명백한 바와 같이, 방법 A의 단계 중 일부를 방법 B의 단계 중 일부와 조합하여 식(I)의 화합물을 생성할 수 있다.
출발물질인 1차 아민(VIa), (VIb) 및 (VIc)은 상용 제품이거나, 공지의 방법 (March, Advanced Organic Chemistry, 1991, Ed. John Wiley & Sons 참조) 또는 하기의 반응식을 이용하여 생성할 수 있다.
반응식 1
Figure 112008044661058-PCT00007
아민은 예를 들어, 디에틸 아조디카르복실레이트(DEAD) 및 트리페닐포스핀의 존재하에, 용매인 테트라히드로푸란에 용해된 알코올 및 프탈리미드 칼륨으로부터 출발하는 미츠노부 반응 및, 히드라진 수화물을 이용한 분할에 의해 수득할 수 있다 (Mitsunobu, J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 679-680 참조).
하기에 나타낸 바와 같이, N-치환 글리신(XIIIa) 및 (XIIIb)은 이에 상응하는 글리신을 NaBH4, NaBH3CN 또는 NaBH(AcO)3 등의 환원제를 이용하여 적절한 알데히드와 환원성 아민화 반응시키거나(반응식 2), 또는 적절한 아민 E-NH2를 이용한 에스테르의 친핵성 환원반응(반응식 3)에 의해 합성할 수 있다.
반응식 2
Figure 112008044661058-PCT00008
(식 - 2) 환원)
반응식 3
Figure 112008044661058-PCT00009
식(II)의 화합물은 상술한 것과 유사한 반응을 이용하여 생성할 수 있다.
Figure 112008044661058-PCT00010
(표 - 탈보호화 , 1)아민 커플링, 2) 수지 분할)
따라서, 식(I)에 상응하는 카르복실산, 즉, 식(Ia)의 화합물을 수득하기 위해, 출발 고체 지지체(IVa)가 아미노기 대신 반응성 할로겐 원자를 갖는 것 이외에는 식(I)의 화합물을 합성하는 것과 동일한 순서를 이용한다 (즉, 방법 A 및/또는 B를 이용한다).
화합물(Ia)에 결합되는 펩티드(XVI)는 펩티드 합성에 관한 표준 반응을 이용하여 생성한다. 따라서 고체 지지체 아민(IV)은 우선 보호된 리신(XIVa)와 반응한 후 선택적으로 또다른 보호된 아미노산(XVb)와 반응한다. 보호기는 커플링시켜 제거한다. 이 순서를 3차례까지 반복할 수 있다.
Figure 112008044661058-PCT00011
(식 - 1)커플링, 2) 탈보호화 , 이 순서를 n회 반복함)
카르복실산(Ia)은 다시 아민(XVI)과 반응되며 이를 탈보호 처리하여 화합물(IIa)을 생성한다. 화합물(IIa)과 폴리글루탐산(XVIIa)(이에 상응하는 염(XVII)으로부터 생성된)간의 아미드 커플링을 통해 약물 결합체(III)를 수득한다.
Figure 112008044661058-PCT00012
(식 - 1) 커플링제 , 2)분할)
본 발명의 화합물은 apaf-1 억제제이다. 따라서, 과다한 세포자살에 관련된 상태를 치료 혹은 예방하는데 유용하다.
성인의 후-유사분열성 세포, 예를 들어, 뉴우런 및 심근 세포는 거의 재생되지 않는다. 이들 세포가 손실될 경우 신경학적 질환 혹은 심장 질환을 일으킬 수 있다. 이들 세포는 각종 급성 및 만성 퇴행성 질환에서 세포자살적 세포 사멸을 겪게 된다. 이와 유사하게, 패혈성 쇼크, 허혈증 및 중독 등은 다수의 기관에서 대량의 세포자살을 야기할 수 있다. 감염은 헬리코박터 파일로리 감염시의 위장 점막 세포 혹은 AIDS에서 림파구 등과 같은 특이적 세포종의 세포자살형 세포회전율을 증가시킬 수도 있다. 세포자살은 또한 기관 이식에서 허혈 및 재관류 조치에 중대한 영향을 미친다. 이러한 질환은 또한 치료학적으로 세포사멸 억제가 필요한 대상이다.
세포자살에 관련된 기타의 상태 혹은 질환은 특별히 한정되지 않으나, 뇌졸증, 외상질환, 뇌손상, 척수손상, 수막염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 케네디병, 다발성 경화증, 프리온계 질환, 및 기타 급성 혹은 만성적 심혈관 질환, 알코올 관련 병리 소견, 탈모증 등을 포함한다.
따라서 본 발명은 상술한 질환이나 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서의 본 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 세포자살 관련 질환이나 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, R2에 관한 조건이 없는 식(I)의 화합물 또는 상기 정의된 바와 같은 고분자-약물 결합체인 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 상기 정의된 바와 같은 고분자-약물 결합체인 화합물 혹은 R2에 관한 조건이 없는 식(I)의 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 세포자살의 억제에 관련된 상태의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 R2에 관한 조건이 없는 식(I)의 화합물 또는 상기 정의된 바와 같은 고분자-약물 결합체인 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 뇌졸증, 외상질환, 뇌손상, 척수손상, 수막염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 케네디병, 다발성 경화증, 프리온계 질환, 심근 허혈증, 및 기타 급성 혹은 만성적 심혈관 질환, 장기 이식, 알코올 관련 병리 소견 등의 치료 또는 예방 및 탈모증 치료 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 식(I)의 화합물 또는 상기 정의된 바와 같은 고분자-약물 결합체인 화합물, 이들의 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 1회 복용 혹은 다수회 복용량으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하기와 같은 부형제는 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 해석하지 않는다.
본 발명의 화합물은 약제학적 제형의 형태로 투여할 수 있다. 약제학적 제형은 투여 경로 및 활성 화합물의 성질에 따라 달라진다. 투여 경로는 예를 들어, 경구, 구강, 폐, 국소, 비경구(피하, 근육내 및 정맥내), 경피, 안구(안과용), 흡입, 비강내, 귀, 경점막, 임플란트 또는 직장 투여 등을 포함할 수 있다. 경구, 국소 혹은 비경구 투여가 바람직하다.
경구 투여용 고체 조성물은 태블릿 중에서도 특히 즉시 방출 혹은 방출 조절 제형으로 제조되는 과립 및 경질 젤라틴 캡슐을 포함한다.
이와 별도로, 본 발명의 화합물은 에멀젼, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 엘릭실(elixir) 또는 연질 젤라틴 캡슐 형태로 포함되기도 한다. 이들은 상용의 불활성 희석제, 예컨대, 정제수, 에탄올, 소르비톨, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜(마크로골) 및 프로필렌글리콜 등을 함유할 수도 있다. 또한 보조제 조성물은 공용보조제(coadjuvant)로서 습윤제, 현탁제, 감미제, 향제, 보존제(방부제), 완충제, 킬레이트화제 및 항산화제 등을 함유할 수 있다.
비경구 투여용 주사제는 유성 혹은 수성 비히클에 용해한 멸균 용액, 현탁액 혹은 에멀젼을 포함하며 또한 현탁제, 안정화제, 강장제 혹은 분산제 같은 공용보조제를 함유하기도 한다.
본 발명의 화합물은 국소 응용 형태로 제형화 할 수도 있다. 이러한 제형은 크림, 로션, 겔, 파우더, 용액, 샴푸제, 치약, 구강세정제 및 패치류 등을 포함하며 이들은 화합물이 적절한 부형제에 분산 혹은 용해된 형태이다.
본 발명의 한 구현예에서 약제학적 조성물은 나노소구체, 미세입자 및 나노입자 형태이다.
활성 성분의 유효 복용량은 다수의 요인 중에서도 특히, 투여될 특정 화합물, 투여 경로, 치료할 질병의 특성 및 경중, 또한 환자의 연령과 전신 상태 및 체중 등에 따라 달라질 수 있다. 적정 복용량의 대표적인 예를 들면 체중 1kg당 일일 0.001 내지 100mg 정도로서 1회 혹은 분할하여 투여할 수 있다. 그러나 투여량은 대체로 의사의 판단에 따른다.
MTT 분석에 의한 독성 및 세포 회복률 평가
MTT 분석으로 대사 이상에 따른 세포자살 혹은 괴사가 일어날 때의 세포 생존율 감소 및 세포 증식률을 측정한다. 이 방법은 생체 이물의 존재하에 배양되는 세포주의 생존율을 평가하는데 이용될 수 있다. 테트라졸륨염의 환원반응이 세포 증식을 분석하는 신뢰성 있는 방법으로 수용되고 있다. 황색 테트라졸륨 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)는 대사적 활성 세포에 의해 환원되며 이 결과 자주색 포르마잔이 세포 내에 형성되므로, DMSO로 가용화 처리한 후 분광광도계로 측정할 수 있다.
본 발명은 MTT 분석법을 이용하여 다양한 농도에서 화합물의 독성을 분석하였다. 세포 생존율의 감소 가능성을 분석하기 위해, 본 발명의 화합물을 상이한 농도로 Saos-2 및 U937 세포주에 가하여 상이한 시간 동안 배양했다. 그 결과를 세포 생존율(백분율)로 표시한다.
세포생존율(%) 24 h, μM 48 h, μM
10 5 1 10 5 1
Saos -2 세포주 I.1 100 99 100 100 100 100
I.10 91 100 76 100 100 100
I.2 99 99 100 91 100 100
I.11 82 98 100 74 91 100
I.4 100 97 100 99 98 100
I.9 82 96 100 66 76 97
I.3 100 93 97 100 100 100
I.7 98 99 95 100 100 100
I.8 99 100 100 100 100 97
U937 세포주 I.1 95 98 100 99 97 100
I.10 89 99 96 99 98 100
I.2 97 100 100 83 99 100
I.11 79 95 100 75 89 98
I.4 87 99 100 95 94 99
I.9 88 98 100 59 69 93
I.3 95 95 100 98 100 100
I.7 93 95 99 97 100 100
I.8 99 98 100 99 98 100
시간 (h) I.1의 세포생존율(%) (μM) IIa .2의 세포생존율(%) (μM)
50 25 10 5 1 50 25 10 5 1
Saos -2 24 19 63 100 100 99 10 25 77 100 98
48 11 19 97 94 97 ND 11 98 97 100
72 ND 8 80 88 89 ND ND ND ND ND
U937 24 27 59 87 90 100 ND ND ND ND ND
48 ND ND 83 94 100 ND ND ND ND ND
72 ND ND 67 89 98 ND ND ND ND ND
시간 (h) III.1의 세포생존율(%) (μM 약물- 몰당량 )
500 250 100 50 20
Saos -2 24 35 75 93 99 96
48 ND ND 95 87 95
72 ND ND 68 63 86
U937 24 27 50 84 96 98
48 ND ND ND ND ND
72 ND ND ND ND ND
MTT 분석은 또한 세포자살-유래의 세포주에 화합물을 첨가하여 세포회복률을 평가하는데도 이용했다. Saos-2 세포주의 경우, 세포자살 유발은 독시사이클린 2μM 첨가시 일어났으며, U937, HeLA, U2-OS의 경우 세포자살은 각각 독소루비신 0.25μM, 1.5μM 및 2μM 에 의해 유발되었다. 이 결과는 독소사이클린 및 독소루비신 첨가시 Saos-2에서 100%의 세포치사율을 또한 HeLa, U2-O2 혹은 U937에서 0%의 세포회복률을 각각 유발한다는 것을 고려하여 세포생존율을 % 단위로 표시한다.
세포주 세포회복률(%) I.1
시간 (h) 10μM 5μM 1μM
HeLa 24 30 31 29
48 3 78 75
72 2 33 34
U2 -OS 24 72 0 0
48 18 54 58
72 3 25 1
U937 24 52 19 0
48 3 19 14
72 4 46 12
Saos -2 24 15 6 76
48 8 25 23
72 2 1 3
세포주 세포회복률(%)
I.10 I.2 I.11 I.9 I.4 I.3 I.7 I.8
Time (h) 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM 5 μM 1 μM
Saos -2 24 57 0 10 41 0 22 16 36 9 34 12 18 41 64 23 57
48 24 0 21 21 8 20 22 31 10 24 21 14 19 27 51 24
ND: 측정 안됨
세포회복률(%) III.1
100μM 50μM 20μM
Saos -2 24 25 28 15
48 18 49 13
72 15 31 14
U937 24 9 34 5
48 20 9 1
72 10 15 0
카스파제 억제 분석
본 발명의 화합물에 의한 시간의존적 카스파제 억제 반응을 분석했다. 세포주는 화합물(50μM)의 존재하에서 혹은 존재하지 않는 조건에서 상이한 시간 동안 성장시켰다. 카스파제 활성은 Saos-2 또는 US937 세포 추출물 및 Ac-DEVD-afc (N- 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-afc(7-아미노-4-트리플루오로메틸 쿠마린))을 기질(20μM)로 이용하여 분석했다. 사이토플루오러(Cytofluor) 4000 형광분석기 (여기 파장 400nm; 방출 파장 508nm)로 형광 afc의 분리를 행하여 카스파제 활성을 1시간 연속으로 관찰하였다. 카스파제 활성에 대한 화합물의 효과를 처리 세포 대 무처리 세포(대조군)의 형광신호 억제율(%)로 나타냈다.
세포주 카스파제 억제율(%)
I.1 I.10 I.2 I.11 I.9 I.4 I.3 I.7 I.8
시간 (h) 5μM 1μM 5μM 5μM 5μM 5μM 1μM 5μM 5μM 5μM
HeLa 24 31 29 1 1 14 0 48 9 6 5
48 78 75 6 46 0 0 14 21 7 3
72 33 34 ND 59 62 41 35 29 11 6
U2 -OS 24 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
48 54 58 22 54 31 34 23 29 31 16
72 25 1 64 27 50 61 54 22 33 24
U937 24 19 0 0 0 11 3 0 12 10 5
48 19 14 5 3 0 4 12 16 8 15
72 46 12 2 0 4 63 0 1 2 23
Saos -2 24 53 21 13 11 45 50 55 29 0 1
48 19 17 4 0 7 2 9 16 24 0
72 4 4 ND ND ND ND ND ND ND ND
ND: 측정 안됨
시간 (h) IIa . 2 의 카스파제 억제율(%) (5μM)
Saos -2 24 41
48 23
72 1
U937 24 23
48 11
72 5
세포주 시간 (h) III.1의 카스파제 억제율(%)
(50μM 약물-몰 당량 )
Saos -2 24 67
48 72
72 100
U937 24 74
48 85
72 100
Apaf -1-유발 세포자살의 억제
세포자살 장치에 수용된 특정 타겟에 관한 본 발명 화합물의 활성을 분석평가했다. Apaf-1 올리고머화는 아폽토좀 형성을 활성화하는 분자 현상이며 결과적으로 세포자살을 유도한다. 이 실험은 무세포 분석 및 세포 분석에 따라 행하였다.
무세포 분석시, Hek-293 세포질 추출물을 상술한 바와 같이 조제하고 (Malet et al., 2005 참조) 완전 세포 추출물을 격리했다. 이에 수반하여, 재조합 Apaf-1 를 Malet et al.(2005)에 따라 정제했다. FT 분획물(카스파제-3 및 -9를 함유하는 대신 Apaf-1이 결핍됨)을 상이한 농도의 화합물 존재하에 재조합 Apaf-1로 배양했다 (도 1 참조). 이 화합물의 활성도를 분석하여 카스파제 활성 억제율로 했다 (상기 참조).
세포 분석에서, Saos-2 및 U937 세포는 아폽토좀 활성화제로 처리하여 (Nguyen and Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100:7533-7538), Apaf-1 올리고머화를 유발시켰다. 그 후, 이 화합물을 세포(50μM)에 가하여 24시간 또는 48시간 배양했다. Apaf-1 유발 세포자살을 억제하는 화합물의 용량을 분석하여 카스파제 활성 억제율로 했다 (상기 참조).
세포주 시간 (h) III.1 카스파제 활성 억제율(%)
(50μM 약물- 몰당량 )
Saos -2 24 22
48 54
U937 24 27
48 95
Apaf -1 CARD 도메인에 대한 IIa .1 의 결합: 형광 편광성 분석
형광 편광성은 Victor2V 1420 멀티라벨 HTS 계수기로 측정했다. 완충액 A에 용해된 60nM의 5'-6'-카르복시플루오레신 라벨화된 IIa.1 (CF-IIA.1 라고 함; λexc=480nm; λem=535nm) 용액(총 반응부피는 200㎕)을 농축 단백질 용액으로 적정했다. Wallac 1420 워크스테이션 소프트웨어를 이용하여 데이타를 기록했다. Kd값을 2단계 모델을 통해 계산했다 (도 2 참조).
아폽토좀에 대한 펩토이드 결합 부위를 초기 특성화하기 위해, IIa.1의 형광 유사체(CF-IIa.1)를 합성했다. CF-IIa.1은 Apaf-1 CARD 도메인에 결합되었으나, 사이토크롬 c 및 기타의 대조군 단백질 (Malet et al., 2005)에는 결합되지 않았으며 형광 편광성 분석에서 측정된 해리상수(Kd)가 60nM이었다 (도 2 참조). 그럼에도 불구하고, 분석 결과 결합상수값은 카스파제 활성 억제율 50%을 달성하는데 필요한 IIa.1의 농도와 뚜렷한 대조를 보였다 (IC50
Figure 112008044661058-PCT00013
30μM, 도 1 참조). 이 데이타를 감수하여 추정하면, 프로카스파제-9를 시험관내 번역하는데 이용되는 망상적혈구 융해물은 IIa.1 의 유효농도가 점차 감소한 성분들을 함유한다고 생각된다.
도 1은 상이한 농도의 화합물(IIa.1)의 존재하에 재조합 Apaf-1로 배양한 Hek-293 FT 세포질 분획물을 이용하여 실시한 세포유리 카스파제 억제율 분석 결과를 도시하고;
도 2는 CARD/IIa.1 상호작용의 분석 결과를 도시하며, 이를 위해 PBS 완충액에 용해된 240nM CF-IIa.1 용액을 CARD-Apaf 농도 증가와 함께 적정하고 30℃에서 형광 편광성을 측정하였으며 데이타 (평균±표준편차; n=3)는 밀리편극 단위(mP)로 기록하였다.
다음의 약어를 본 실시예에서 이용하였다:
Boc: tert-부톡시카르보닐
DCM: 디클로로메탄
DIC: N,N'-디이소프로필에틸아민
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
DMF: N,N'-디메틸프롬아미드
eq.: 몰 당량
EtOAc: 에틸아세테이트
Fmoc: 플루오레닐메톡시카르보닐
글리신: G
HATU: O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HOBT: 1-히드록시벤조트리아졸
리신: K
PGA: 폴리(L-글루탐산)
페닐알라닌: F
PyBOP: 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스-피롤리디노포스포늄
헥사플루오로포스페이트
R: 아르기닌
rt: 체류시간
TFA: 트리플루오로아세트산
발린: V
본 발명을 다음의 실시예에서 구체적으로 예시한다. 이들 실시예는 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하지 않는다.
폴리스티렌 AM RAM 수지 (0.75mmol/g)을 Rapp 폴리메르 게엠베하 (독일)에서 구입하였다. 염화 2-클로로트리틸 수지 (1.4mmol/g)을 노바바이오켐에서 구입하였다. 준분취형(semipreparative) RP-HPLC를 X-Terra C18 컬럼 (19×25cm, 5㎛)을 이용하는 워터스 장비 (밀포드, MA, 미국)로 실시했다; 용리액: A= 물에 용해된 O.1% TFA 용액, B= 아세토니트릴에 용해된 0.1% TFA 용액, 구배: 0분일 때 20% B에서 20분 후 80% B (즉, 20% B → 80% B, 20분). 산티아고 데 콤포스텔라 대학(스페인)의 매스 스펙트로메트리 서비스에 고해상도 질량 스펙트럼(HRMS-FAB)이 등록되어 있다.
본 명세서에서 사용하는 명칭들은 IUPAC의 명칭체계에 따른 바일스타인 연구소의 컴퓨터 시스템인 AUTONOM (자동 명칭 부여기)에 근거한다.
중간체 (VIII)
VIII: (Z)- 부트 -2- 엔디온산 모노알릴에스테르
클로로포름에 용해된 2g의 말레인산 무수물(20mmol) 용액에, 1.8ml의 알릴알코올(26mmol, 1.3eq.)을 첨가했다. 반응 혼합물을 60℃에서 50분간 전자파 조사 하에 교반했다. 결과로 얻은 용액을 1N HCl로 처리한 후 클로로포름으로 추출 처리했다. 유기 추출물을 염수로 세척한 후 무수 황산마그네슘으로 건조 및 여과했다. 용매를 감압하에 증류 제거하고 남은 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 오일 형태의 중간체(VIII)를 수득했다 (순도 95%, 수율 85%).
식(I)의 화합물
I.1: 1-[2-(2,4- 디클로로페닐 )에틸]-4-(3,3- 디페닐프로필 )-3,7-디옥소[1,4]- 디아제판 -5- 카르복실산 카르바모일메틸 -[2-(2,4- 디클로로페닐 )에틸]아미드
링크 아미드 수지(500mg, 0.4mmol)을 DMF에 용해된 3mL의 20% 피페리딘으로 처리하고 그 혼합물을 60℃에서 2분간 전자파 반응기 안에서 교반했다. 수지를 여과 및 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 다시 수지를 DMF(3mL)에 브로모아세트산(V, 275mg, 5eq.) 및 DIC(306μL, 5eq.)를 용해한 용액으로 처리했다. 반응 혼합물을 60℃에서 2분간 전자파 혼합기 안에서 교반했다. 수지를 분리하여 DCM(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. 3mL의 DMF에 2,4-디클로로페네틸아민(VIa, 300μL, 5eq.) 및 트리에틸아 민(275μL, 5eq.)을 용해한 용액을 상기 수지에 첨가하고 이에 의해 얻어진 현탁액을 전자파 작용 하에 90℃에서 2분간 교반했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 다시, 수지를 DCM:DMF(2:1, 3mL)에 (Z)-부트-2-엔디온산 모노알릴에스테르(VIII, 310mg, 5eq.), HOBT(267mg, 5eq.) 및 DIC(306μL, 5eq.)를 용해한 용액으로 처리했다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 뒤 여과 후 동일한 조건에서 상기 반응을 반복했다. 수지를 분리하여 DCM(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. 이어서, 3mL의 DMF에 3,3-디페닐프로필아민(VIb, 418mg, 5eq.) 및 트리에틸아민(275μL, 5eq.)을 용해한 용액을 상기 수지에 첨가하고 이에 의해 얻어진 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 동일한 온도에서 하룻밤 동안 상기 반응을 반복했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 그 다음, 수지를 DMF(3mL)에 브로모아세트산(V, 275mg, 5eq.) 및 DIC(306μL, 5eq.)을 용해한 용액으로 처리했다. 반응 혼합물을 60℃에서 2분간 전자파 반응기 안에서 교반했다. 수지를 분리하여 DMC(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. 3mL의 DMF에 2,4-디클로로페네틸아민(VIc, 200μL, 5eq.) 및 트리에틸아민(275μL, 5eq.)을 용해한 용액을 상기 수지에 첨가하고 이에 의해 얻어진 현탁액을 전자파 작용하에 90℃에서 2분간 교반했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 그 다음, 수지를 무수 DCM에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(46mg, 0.1eq.) 및 페닐실란(490μ L, 10eq.)을 용해한 용액으로 아르곤 분위기하에 실온에서 15분간 처리했다. 이 절차를 3회 반복했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. DMF(3mL)에 PyBOP(308mg, 1.5eq.), HOBT(80mg, 1.5eq.) 및 DIPEA(203μL, 3eq.)를 용해한 용액으로 처리하여 고리화 반응을 촉진시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 교반한 후 여과했다. 수지를 분리하여 DCM(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. 마지막으로 60:40:2 비율의 TFA/DCM/물의 혼합물로 수지를 처리하여 목적 화합물(I.1)을 함유하는 반응 혼합물 원액을 수득, 이를 여과하였다. 여액 내의 용매는 감압하에 증발 처리 및 후속의 동결건조를 통해 제거했다. 얻어진 잔류물은 수성 아세토니트릴 구배(42% 아세토니트릴 → 80% 아세토니트릴, 35분)를 이용하여 준분취형 RP-HPLC로 분리한 결과 91mg의 목적 생성물을 수득했다 (수율 30%, 순도 98% 이상).
HRMS (M+H)+: C39H38Cl4N4O4 에 대한 계산치, 767.1647; 실측치, 767.1720.
상이한 아민류를 이용하는 것을 제외하고 I.1에 대해 상술한 것과 유사한 절차에 따라 다음의 산물을 수득했다:
실시예 화합물명 HRMS (M + H) + :
계산치 실측치
I.2 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸시클로프로필아미드 C34H36Cl2N4O4 635.2114 635.2186
I.3 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산(2-아세틸아미노에틸)카르바모일메틸아미드 C35H39Cl2N5O5 680.2328 680.2401
I.4 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)- 3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸(테트라히드로푸란-2-일메틸)아미드 C35H40Cl2N4O5 679.2376 679.2449
I.5 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸-[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미드 C40H42Cl2N4O5 729.2532 729.2605
I.6 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸시클로헥실아미드 C37H42Cl2N4O4 677.2583 677.2656
I.7 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸-[2-(2-메톡시페닐)에틸]아미드 C40H42Cl2N4O5 729.2532 729.2605
I.8 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸[2-(4-클로로페닐)에틸]아미드 C39H39Cl3N4O4 733.2037 733.2110
I.9 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸[2-(2-플루오로페닐)-에틸]아미드 C39H39Cl2FN4O4 717.2332 717.2405
I.10 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 카르바모일메틸[2-(4-플루오로페닐)에틸]아미드 C39H39Cl2FN4O4 717.2332 717.2405
I.11 1-[2-(2,4-디클로로-페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐-프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산 부틸-카르바모일메틸아미드 C35H40Cl2N4O4 651.2427 651.2499
중간체 ( Ia )
Ia : {[2-(2,4- 디클로로페닐 )에틸]-[1-[2-(2,4- 디클로로페닐 )에틸]-4-(3,3-디-페 닐프로필 )-3,7- 디옥소[1,4]디아제판 -5-카르보닐]아미노}아세트산
DCM(4mL)에 클로로아세트산(V, 463mg, 5eq.) 및 DIPEA(840μL, 5eq.)을 용해한 용액으로 염화 2-클로로트리틸 수지(IVa, 700mg, 0.98mmol)를 처리했다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후 메탄올(550μL)로 반응 중단시키고 다시 10 분간 더 교반했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DCM(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. 4mL의 DMF에 2,4-디클로로페네틸아민(VIa, 740μL, 5eq.) 및 DIPEA(840μL, 5eq.)을 용해한 용액을 수지에 가하고 이에 의해 얻은 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 다시 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 이어서, 수지를 2:1 비율의 DCM:DMF(4mL)에 (Z)-부트-2-엔디온산 모노알릴에스테르(VIII, 765mg, 5eq.), HOBT(662mg, 5eq.) 및 DIC(760μL, 5eq.)를 용해한 용액으로 처리했다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반, 여과한 후 동일한 조건에서 반응을 반복했다. 그 다음, 4mL의 DMF에 3,3-디페닐프로필아민(VIb, 1.0g, 5eq.) 및 DIPEA(840μL, 5eq.)를 용해한 용액을 수지에 가하고 이에 의해 얻은 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 반응을 동일한 온도에서 교반 하에 16시간 동안 반복했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 다시, 수지를 2:1 비율의 DCM:DMF(4mL)에 클로로아세트산(V, 463mg, 5eq.) 및 DIC(760μL, 5eq.)를 용해한 용액으로 처리했다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반했다. 수지를 분리하여 DCM(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. 4mL의 DMF에 2,4-디클로로페닐아민(VIc, 740μL, 5eq.) 및 DIPEA(840μL, 5eq.)을 용해한 용액을 수지에 가하고 이에 의해 얻은 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물을 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 다시, 수지를 무수 DCM에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔 라듐(0)(114mg, 0.1eq.) 및 페닐실란(1.2mL, 10eq.)을 용해한 용액으로 아르곤 분위기 하에 실온에서 15분간 처리했다. 이 합성 단계를 3회 반복했다. 상등액을 제거하고 남은 잔류물은 분리하여 DCM(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DMF(3×3mL)로 세척했다. DMF(4mL)에 PyBOP(765mg, 1.5eq.), HOBT(199mg, 1.5eq.) 및 DIPEA(505μL, 3eq.)를 용해한 용액으로 처리하여 고리화 반응을 촉진시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 교반한 후 여과했다. 수지를 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 마지막으로 5:95 비율의TFA/DCM 혼합물로 수지를 처리하여 반응 혼합물 원액을 수득, 여과하였다. 여액 내의 용매를 감압하에 증발 처리 및 후속의 동결건조를 통해 제거함으로써 목적 화합물(I)을 무색의 고체 형태로 수득했다 (460mg, 수율 61%, 순도 55% 이상).
중간체( IIa )
링크 아미드 수지(IV, 500mg, 0.4mmol)을 DMF에 용해된 3mL의 20% 피페리딘으로 탈보호 처리했다. 이 혼합물을 60℃에서 2분간 전자파 반응기 안에서 교반했다. 수지를 여과 및 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. HOBT(108mg, 2eq.) 및 DIC(125μL, 2eq.)를 이용하여 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (XIVa, 2eq.)를 수지에 결합시켰다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반했다. 수지를 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. DMF에 용해된 3mL의 20% 피페리딘 용액으로 Fmoc 작용기를 제거하고(30분), 수지를 다시 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 필요할 경우, 그 밖의 아미노산(XIVb)을 상술한 바와 같이 중간체(XVI)를 수득하기 위한 것과 동일한 조건 하에 커플링 결합시켰다.
DMF에 팽윤된 중간체(XVI)에 대하여, DMF(3mL)에 HATU(228mg, 1.5eq.) 및 DIPEA(205μL, 3eq.)을 용해하여 얻은 용액의 존재하에 산(Ia)(460mg, 1.5eq.)을 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후 여과했다. 수지를 분리하여 DMF(3×3mL), 이소프로필알코올(3×3mL) 및 DCM(3×3mL)로 세척했다. 80:20:2.5:2.5 비율의 TFA/DCM/물/트리이소프로필실란의 혼합물로 수지를 처리함으로써 화합물(IIa)을 함유하는 반응 혼합물 원액을 수득, 이를 여과하였다. 여액 내의 용매는 감압하에 증발 처리 및 후속의 동결건조를 통해 제거했다. 얻어진 잔류물은 수성 아세토니트릴 구배 혼합물을 이용하여 준분취형 RP-HPLC로 정제하였다.
실시예 화합물명 HPLC -MS
rt m/z
IIa.1 (KGG-Ia.1) 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-3-(3,3-디페닐-프로필)-3,7-디옥소[1,4] 디아제판-5-카르복실산 {[({[(5-아미노-1-카르바모일펜틸카르바모일) 메틸]-카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]아미드 17.0 1011,506
IIa.2 (K-Ia.1) 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4] 디아제판-5-카르복실산 [(5-아미노-1-카르바모일펜틸카르바모일)메틸]- [2-(2,4-디클로로페닐)에틸]아미드 17.6 895
IIa.3 (KRFG-Ia.1) 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4] 디아제판-5-카르복실산 {[({1-[1-(5-아미노-1-카르바모일펜틸카르바모일)-4-구아니디노부틸카르바모일]-2-페닐에틸카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]아미드 13.6 1257,629
IIa.4 (KRFV-Ia.1) 1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필-3,7-디옥소[1,4] 디아제판-5-카르복실산 [(1-{1-[1-(5-아미노-1-카르바모일펜틸카르바모일)-4-구아니디노부틸카르바모일]-2-페닐에틸카르바모일}-2-메틸프로필카르바모일)메틸]-2-(2,4-디클로로페닐)에틸아미드 17.4 1299,650
식(III)의 화합물
III.1: PGA- IIa .1
분자량(Mw) 17000 내지 43000 Da의 PGA 나트륨염(XVII, 0.1g, 0.5mmol)을 물에 용해하여 얻은 용액에, 용액의 pH가 2.0으로 조정될 때까지 0.2M HCl을 가했다. 침전물을 수거하여 물에 투석처리한 후 동결건조했다. 양성자형 PGA(XVIIa)을 무수 DMF(7.5mL)에 용해한 후 DIC(3eq.) 및 HOBt(3eq.)를 첨가하고 15분간 교반했다. 이어서, 중간체(IIa.1)(0.052mmol (12몰%) 1eq.)를 가하고 DIPEA(1.5mL)을 이용하여 pH를 8로 조정했다. 반응을 실온에서 36시간 동안 진행시켰다. 박층 크로마토그래피(TLC, 실리카) 분석 결과, 중간체(IIa.1)(Rf=0.5)가 고분자 결합체(Rf=0, MeOH:H2O:AcOH=85:10:5)로 완전히 변환된 것으로 나타났다. 반응을 중단시키기 위해 혼합물을 CHCl3 에 부었다. 이 결과로 얻은 침전물을 수거하여 감압 건조했다. 생성물을 1.0M NaHCO3에 용해하여 PGA-펩토이드 결합체(III.1)의 나트륨염을 수득했다. 이 수용액을 증류수에 투석처리했다 (MwCO 는 6000 내지 8000 Da). 투석물을 동결건조하여 백색 분말 형태의 생성물을 수득했다. UV(λ=282nm) 측정시, 고분자의 총 펩토이드 함량은 25 내지 30중량% (w/w)(10 내지 12몰% 작용화 반응)이었고 유리 약물의 함량은 약물 총량의 1중량% 미만이었다.
평균분자량(Mw), 다분산성(Mw/Mn), 결합체(III.1) 및 대조군(XVII)의 용액내 거동 등을 크기배제 크로마토그래피(SEC) 및 분석형 초원심분리(AUC)로 분석했다. 이들 방법으로 분석한 결과, 결합체(III.1)는 대조군(XVII)과 비교시 더 치밀한 입체배위 구조, 더 축소된 유체역학적 부피 및 더 큰 침전계수(S)를 갖는 것으로 나 타났다 (결합체(III.1) 및 대조군(XVII) 각각에 대하여, tr=12.5분 및 S=3.5±0.4s 대 tr=11.6분 및 S=1.9±0.1s). 침강평형에 따르면 Mw은 대조군(XVII)이 26700 Da인 반면 결합체(III.1)는 58600 Da 이었으나, PEG 표준을 이용한 GPC 측정의 경우, Mw은 대조군(XVII) 및 결합체(III.1) 각각에 대하여 36000 Da (Mw/Mn=1.8) 및 38000 Da (Mw/Mn=1.5)로 측정되었다.
UV 분광측정법에 의한 총 약물 함량의 결정
MeOH에 화합물(IIa)을 용해하여 원액을 준비했다 (1mg/mL). 보상곡선을 얻기 위하여, MeOH로 시료를 희석하여 0 내지 1mg/mL 범위의 농도로 만들었다. 결합체의 총 약물 함량은 H2O 내에서 272nm 및 281nm일 때의 광학밀도를 측정함으로써 확인 결정했다. H2O 내에서 분석된 결합체(III)와 동일한 농도 범위(0 내지 5mg/mL)의 PGA를 블랭크로 이용했다. RT에서 MeOH 내의 화합물(IIa)에 대해 확인된 281nm일 때의 흡광계수(η)는 713L mol-1cm- 1 이었다.
HPLC 에 의한 유리 약물 함량의 결정
결합체(III.1)의 수용액을 준비하고(1mg/mL) 분취액(100μL)을 폴리프로필렌관에 가한 뒤 물을 넣어 1mL로 만들었다. 포름산암모늄 완충액(100μL, 1M, pH8.5)을 가하여 시료의 pH를 8로 조정한 뒤 CHCl3(5mL)을 추가했다. 시료는 강하게 교반하여(3×10초) 완전히 추출되도록 했다. 상층의 수성상을 조심스럽게 제거하고 용매는 N2 하에 증발시켰다. 무수 잔류물을 200μL의 HPLC급 아세토니트릴에 용해했 다. 마찬가지로 동일한 절차를 모계 화합물(IIa.1)에 대해서도 실시했다 (1mg/mL 수용성 원액 중 200μL을 이용함). 1mL의 아세토니트릴을 가하여 생성물을 재용해시켜 200㎍/mL의 원액으로 만들고 이것으로 소정 범위의 농축물을 제조했다 (2 내지 100㎍/mL). 결합체의 약물 유리량은 리크로스퍼 C18 컬럼(150×3.9mm)을 이용하여 HPLC에 의해 측정했다. 컬럼의 유속은 1mL/분이며 0.1%의 수용성 TFA 내에서 소정의 아세토니트릴 구배(20% → 100% 아세토니트릴, 20분)를 갖는다. 화합물(IIa.1)의 체류시간은 tr=14.3분이었다 (λ=220nm).
결합체(III.1)에 관하여 실시한 것과 동일한 절차에 따라 다음과 같은 예시물을 수득했다:
실시예 화합물명 SEC a
rt Mw
III.1: PGA-IIa.1 결합체 폴리-L-글루탐산-[1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-3-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산-{[({[(5-아미노-1-카르바모일펜틸카르바모일)메틸]-카르바모일}메틸)카르바모일]메틸}-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]아미드] 결합체 12.5 36000
III.2: PGA-IIa.2 결합체 Poly-L-글루탐산-[1-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]-4-(3,3-디페닐프로필)-3,7-디옥소[1,4]디아제판-5-카르복실산-[(5-아미노-1-카르바모일펜틸카르바모일)메틸]-[2-(2,4-디클로로페닐)에틸]아미드] 결합체 13.3 34000
a 크기배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정됨

Claims (13)

  1. 하기의 식(I)으로 표현되는 새로운 화합물로서, 이의 입체 이성질체와 그 혼합물, 이의 동질이상체와 그 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 이의 용매 화합물과 부가염을 포함하는 화합물:
    Figure 112008044661058-PCT00014
    여기서,
    R1은 (C1-C5)알킬, (C2-C5)알케닐, -(CH2)1-3-NHCO-(C1-C3)알킬, -(CH2)1-3-CONRaRb, -(CH2)0-3-(3-6)Cy, -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸), -(CH2)1-3-(2-나프틸), -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)2-CH(페닐)2, -(CH2)2-CH(페닐)[(5-6)Hetar] 또는 -(CH2)2-CH[(5-6)Hetar]2를 나타내고;
    R2는 -(CH2)0-3-(3-6)Cy, -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸), -(CH2)1-3-(2-나프틸), -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)2-CH(페닐)2, -(CH2)2-CH(페닐)[(5-6)Hetar] 또는 -(CH2)2-CH[(5-6)Hetar]2를 나타내고;
    R3은 -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸), -(CH2)1-3-(2-나프틸) 또는 -(CH2)1-3-(5-10)Hetar를 나타내고;
    상기의 (C1-C5)알킬 및 (C2-C5)알케닐은 -O-(C1-C2)알킬, -S-(C1-C2)알킬, -NH2, -NH-(C1-C2)알킬 및 -N[(C1-C2)알킬]2 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되고;
    (C1-C3)알킬은 하나 이상의 할로겐에 의해 선택적으로 치환될 수 있으며;
    Ra 및 Rb 는 서로 독립적으로 -H 또는 -(C1-C3)알킬을 나타내고;
    (3-6)Cy는 부분 불포화 혹은 포화된 3- 또는 6-위치 탄소고리를 나타내고;
    (5-6)Hetcy는 0, S 및 N 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 혹은 포화된 5- 또는 6-위치 탄소고리의 C- 혹은 N-라디칼을 나타내고;
    Cy 및 Hetcy는 할로겐, -CF3 및 -OH 중에서 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환될 수 있으며;
    (5-6)Hetar 및 (5-10)Hetar는 각각, 0, S 및 N 중에서 독립적으로 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 5- 또는 6-위치 고리 및 5- 내지 10-위치 고리의 C- 혹은 N-라디칼을 나타내고;
    페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, (5-6)Hetar 및 (5-10)Hetar는 할로겐, -CF3, -OH, -O-(C1-C3)알킬, -CO-(C1-C5)알킬, -(C1-C5)알킬-NRaRb, -NRaRb 및 -SO2NH2 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환되고, 단 이 경우 R2는 2-(4-플로로페닐)에틸이 아닌 것을 조건으로 한다.
  2. 제 1항에 있어서,
    R1은 -(CH2)0-3-(5-6)Hetcy, -(CH2)1-3-(5-10)Hetar, -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸) 또는 (CH2)1-3-(2-나프틸)을 나타내고, 이들은 모두 선택적으로 치환될 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    R2는 -(CH2)1-3-페닐, -(CH2)1-3-(1-나프틸) 또는 (CH2)1-3-(2-나프틸)을 나타내고, 이들은 모두 선택적으로 치환될 수 있으며, 단 R2는 2-(4-플루오로페닐)에틸이 아닌 것을 조건으로 하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3은 -(CH2)1-3-(5-10)Hetar 또는 -(CH2)1-3-페닐을 나타내고, 이들은 모두 선택적으로 치환될 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 하기의 식(II)의 라디칼을 포함하는 것으로서 폴리글루탐산 고분자에 결합된 약물 결합체인 화합물, 이의 입체 이성질체와 그 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 용매 화합물과 부가염을 포함하는 화합물:
    Figure 112008044661058-PCT00015
    여기서,
    R1, R2 및 R3은 R2에 관한 조건을 제외하고 제 1항에서 정의된 것과 동일한 의미를 갖고; R4는 20개의 자연발생 아미노산 중 어느 하나에서의 측쇄를 각각 독립적으로 나타내며; 또한 n은 0, 1, 2 또는 3이다.
  6. 제 2항에 따른 고분자-약물 결합체로서 하기의 식(III)으로 표현되는 화합물:
    Figure 112008044661058-PCT00016
    여기서,
    x에 대한 y의 상대비(y:x)는 25 내지 30중량% 대 75 내지 70중량% 이다.
  7. 제 5항 또는 6항에 있어서,
    폴리글루탐산은 폴리(L-글루탐산)이고; n은 2이고 R4는 글리신 측쇄를 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 세포자살의 억제에 관련된 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, R2에 관한 조건 없이 제 1항에서 정의된 식(I)로 표현되는 화합물 또는 제 5항에서 정의된 화합물의 용도.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기의 상태는 뇌졸증, 외상질환, 뇌손상, 척수손상, 수막염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 케네디병, 다발성 경화증, 프리온계 질환, 및 기타 급성 혹은 만성적 심혈관 질환, 알코올 관련 병리 소견, 탈모증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. R2에 관한 조건 없이 제 1항에서 정의된 바와 같은 식(I)으로 표현되는 화합물 혹은 제 5항에서 정의된 바와 같은 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 세포자살의 억제에 관련된 상태의 치료 또는 예방 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기의 상태는 뇌졸증, 외상질환, 뇌손상, 척수손상, 수막염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 케네디병, 다발성 경화증, 프리온계 질환, 및 기타 급성 혹은 만성적 심혈관 질환, 알코올 관련 병리 소견, 탈모증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방 방법.
  12. 제 1항에서 정의된 바와 같은 식(I)으로 표현되는 화합물 혹은 제 5항에서 정의된 바와 같은 화합물, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    나노소구체, 미세입자 및 나노입자의 형태로 형성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2023225277A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Ohio State Innovation Foundation Peptidyl flavor modifiers

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999046248A1 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 1,2-diazepane derivatives as interleukin-1beta converting enzyme inhibitors
ES2169690B1 (es) * 2000-10-06 2004-03-16 Diverdrugs Sl Trimeros de n-alquilglicina capaces de proteger a neuronas contra agresiones excitotoxicas, y composiciones que los contienen.

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