EA014874B1 - Соединения для ингибирования апоптоза - Google Patents

Соединения для ингибирования апоптоза Download PDF

Info

Publication number
EA014874B1
EA014874B1 EA200801137A EA200801137A EA014874B1 EA 014874 B1 EA014874 B1 EA 014874B1 EA 200801137 A EA200801137 A EA 200801137A EA 200801137 A EA200801137 A EA 200801137A EA 014874 B1 EA014874 B1 EA 014874B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
alkyl
disease
formula
condition
Prior art date
Application number
EA200801137A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801137A1 (ru
Inventor
Энрике Перес Пая
Мария Хесус Висент Докон
Мар Орсаес Калатаюд
Лаура Мондрагон Мартинес
Анхель Мессегуэр Пайпоч
Алехадра Моуре Фернандес
Глория Санклименс Перес Де Росас
Хема Малет Энгра
Original Assignee
Консехо Супериор Де Инвестигасьонес Сьентификас
Лабораториос Сальват, С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Консехо Супериор Де Инвестигасьонес Сьентификас, Лабораториос Сальват, С.А. filed Critical Консехо Супериор Де Инвестигасьонес Сьентификас
Publication of EA200801137A1 publication Critical patent/EA200801137A1/ru
Publication of EA014874B1 publication Critical patent/EA014874B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D243/00—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D243/06—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms having the nitrogen atoms in positions 1 and 4
    • C07D243/08—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms having the nitrogen atoms in positions 1 and 4 not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), а также к лекарственным конъюгатам на основе соединений формулы (I), действующим в качестве ингибиторов апоптоза, а также к способу их получения, к содержащим их фармацевтическим композициям и к их применению в медицине.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям, действующим в качестве ингибиторов апоптоза, а также к способам их получения, к содержащим их фармацевтическим композициям и к их применению в медицине.
Предшествующий уровень техники
Апоптоз представляет интерес как биологический процесс по причине его значимости для целого ряда биологических систем, включая нормальный функциональный цикл клеток, иммунную систему и эмбриональное развитие, и по причине его связи с различными заболеваниями. Неадекватный апоптоз вовлечен во многие патологии человека, включая нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Альцгеймера и Гентингтона, ишемию, автоиммунные заболевания и некоторые формы рака (Кееб 1.С., Тгепбк Мо1. Меб. 2001,7:314-319).
Различные апоптотические стимулы, включая активацию рецепторов смерти на клеточной поверхности, противораковые агенты, облучение, недостаток факторов выживаемости и ишемию (обзор 81та55е А. е! а1., Аппи. Кем. ВюсНет. 2000, 69:217-245) вызывают сигнальные каскады, которые активируют семейство цистеин-аспартил-протеаз, называемых каспазами. Эти протеазы осуществляют процесс апоптоза.
Некоторые апоптотические сигналы активируют опосредованный митохондриями или внутренний путь, в котором в качестве инициатора выступает каспаза-9. Образование макромолекулярного комплекса, называемого апоптосомой, является ключевым событием в данном пути.
Апоптосома представляет собой голоферментный мультипротеиновый комплекс, образованный активируемым цитохромом С Арак-1 (апоптотический фактор активации протеаз), дАТФ (дезоксиаденозинтрифосфат) и прокаспазой-9 (Ь1 Р. е! а1., Се11 1997, 91: 479-489; АсеНап Ό. е! а1., Мо1. Се11 2001,9:423432; Коббеле/ 1. е! а1, Сепек Эеу. 1999, 13: 3179-3184; 8бшуа§и1а 8.М. е! а1., Мо1. Се11 1998, 1:949-957). В этом макромолекулярном комплексе активируется связанная с апоптосомой каспаза-9, и затем, в свою очередь, она активирует эффекторные каспазы.
Для идентификации молекул, которые могли бы оказать положительное влияние на процесс апоптоза, связанный с заболеванием, попытки разработки лекарственных средств первоначально были нацелены на регуляцию активности каспаз, и при этом осуществляли поиск специфических ферментных активаторов или ингибиторов (8сой С’.\У. е! а1., 1. РНагтасок Ехр. ТНег. 2003, 304: 433-440; Сагаа-Сако М., 1. Вюг СНет. 1998, 273: 32608-32613), а не модуляторов предшествующего каскада/пути активации.
Тем не менее, белок-белковые взаимодействия, предшествующие активации каспаз, также могут представлять собой значимые точки для вмешательства при разработке модуляторов сигнальных путей апоптоза. В частности, недавние данные предполагают, что образование апоптосомы является интересной мишенью для разработки модуляторов апоптоза.
Таким образом, имеется интерес в поиске молекул, которые ингибируют активацию апоптоза, опосредованную апоптосомой.
Описание изобретения
Один аспект настоящего изобретения относится к предложению новых соединений общей формулы I
их стереоизомеров и их смесей, их полиморфов и их смесей и их фармацевтически приемлемых сольватов и солей присоединения, где:
К1 представляет собой (С1-С5)алкил, -(СН2)1-3-ЫНСО-(С1-3)алкил, -(СН2)0-3-(3-6)Су, -(СН2)1-3-фенил, -(СН2)1-3-(5-10)Не!аг или -(СН2)0-3-(5-6)Не!су;
К2 представляет собой -(СН2)2-СН(фенил)2;
К3 представляет собой -(СН2)!-3-фенил;
(С1-С5)алкил, возможно, может быть замещен одним или более заместителями, выбранными из групп -О-(С1-С2)алкил, -8-(С;-С2)алкил, -ЫН2, -НН-(С;-С2)алкил и -Ы[(С1-С2)алкил]2;
(С1-С3)алкил, возможно, может быть замещен одним или более атомами галогена;
(3-6)Су представляет собой радикал 3-6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца;
Су и Не!су, возможно, могут быть замещены одним или более заместителями, выбранными из галогена, -Сг3 и -ОН;
(5-6)Не!су представляет собой С- или Ν-радикал 5- или 6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца, содержащего один или два гетероатома, независимо выбранных из О, 8 и Ν;
(5-10)Не!аг представляет собой С- или Ν-радикал ароматического 5-10-членного кольца, содержащего от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из О, 8 и Ν;
фенил и (5-10)Не!аг, возможно, могут быть замещены одним или более заместителями, выбранными
- 1 014874 из галогена и группы -О-(С1-С3)алкил;
при условии, что К2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил.
Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению, которое представляет собой лекарственный конъюгат, содержащий радикал формулы II
его стереоизомеры и их смеси и его фармацевтически приемлемые сольваты и соли присоединения, конъюгированный с полимером, представляющим собой полиглутаминовую кислоту, где К1, К2 и КЗ имеют такие же значения, как определено для соединений формулы I без условия для К2; каждый К4 независимо представляет собой боковую цепь из аминокислоты, выбранной из глицина, фенилаланина, аргинина и валина, и η равно 0, 1, 2 или 3.
Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы III, которое представляет собой указанный выше лекарственный конъюгат
где соотношение у к х составляет от 25-30 до 75-70 мас.%.
В частности, изобретение относится к указанным выше соединениям, где полиглутаминовая кислота представляет собой поли(Ь-глутаминовую кислоту); η равно 2 и К4 представляет собой боковую цепь глицина.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I, как оно определено выше без условия для К2, или соединения формулы II для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза.
В частности, изобретение относится к указанному выше применению, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза, включающий введение соединения формулы I, как оно определено выше без условия для К2, или соединения формулы II и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
В частности, изобретение относится к указанному выше способу, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, которая содержит эффективное количество соединения формулы I или II, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
В частности, изобретение относится к указанной выше фармацевтической композиции в форме наносфер, микрочастиц и наночастиц.
Соединения формулы II содержат различные группировки: радикал формулы I, образующий амид
- 2 014874 ную связь с пептидной цепью из п Ь-аминокислот и амидным производным Ь-лизина, где N его боковой цепи связан с полимером, представляющим собой полиглутаминовую кислоту.
В предыдущих определениях термины (С1-С3)алкил и (С1-С5)алкил означают прямую или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, содержащую от одного до трех и от одного до пяти атомов углерода, соответственно. Примеры (С1-С3)алкила включают, не ограничиваясь этим, метил, этил, пропил, изопропил. Примеры (С1-С5)алкила дополнительно включают, не ограничиваясь этим, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, 1-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил и 2,2-диметилпропил.
Группы (С1-С3)алкил и (С1-С6)алкил, возможно, могут быть замещены в соответствии с описанием, как целесообразно с химической точки зрения.
Термин (3-6)Су обозначает радикал 3-6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца. Как упомянуто выше, он возможно может быть замещен одним или более заместителями, которые могут располагаться в любом доступном положении кольца. Примеры (3-6)Су включают, не ограничиваясь этим, радикалы циклопропана, циклопентана, циклогексана, 1-циклобутена, 2циклобутена, 1-циклопентена, 2-циклопентена, 1-циклогексена, 2-циклогексена и 3-циклогексена.
Термин (5-6)Не1еу обозначает С- или Ν-радикал частично ненасыщенного или насыщенного 5- или 6-членного карбоциклического кольца, содержащего один или два гетероатома, независимо выбранных из О, 8 и Ν, который может быть замещен в соответствии с описанием изобретения по любому доступному положению кольца. Примеры (5-6)Не1еу включают, не ограничиваясь этим, радикалы дигидрофурана, пирролина, пиразолина, имидазолидина, изотиазолидина, изоксазолидина, оксазолидина, пиразолидина, пирролидина, тиазолидина, диоксана, морфолина, пиперазина, пиперидина, пирана, тетрагидропирана, оксазина, оксазолина, пирролина, тиазолина, пиразолина, имидазолина, изоксазолина и изотиазолина.
Термин (5-10)Не1аг обозначает С- или Ν-радикал ароматического 5-10-членного кольца, содержащего от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из О, 8 и Ν, который может быть замещен в соответствии с описанием изобретения по любому доступному положению кольца. Примеры включают, не ограничиваясь этим, радикалы пиррола, фурана, тиофена, имидазола, изоксазола, изотиазола, оксазола, 1,2,4-оксадиазола, 1,2,4-тиадиазола, 1,3,4-оксадиазола, 1,3,4-тиадиазола, 1,2,3-триазола, 1,2,4-триазола, пиридина, пиримидина, пиридазина и пиразина. Примеры (5-10)Не1аг включают дополнительно, не ограничиваясь этим, радикалы бензимидазола, бензофурана, бензотиазола, бензотиофена, имидазопиразина, имидазопиридазина, имидазопиридина, имидазопиримидина, индазола, индола, изоиндола, изохинолина, пиразолопиразина, пиразолопиридина, пиразолопиримидина, пурина, хиназолина, хинолина и хиноксалина.
Выражение возможно замещенная одним или более означает, что группа может быть либо незамещенной, либо замещена одним или более, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, заместителями, при условии, что данная группа имеет 1, 2, 3 или 4 положения, которые могут быть замещены.
На всем протяжении описания и формулы изобретения слово содержит и его вариации, такие как содержащий, не предполагает исключения других добавок, компонентов, элементов или стадий.
В данном контексте термин лечение включает лечение, предупреждение и управление таким состоянием. Термин фармацевтически приемлемый в данном контексте относится к таким соединениям, композициям и/или лекарственным формам, которые в рамках медицинского суждения пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных при отсутствии излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соответственно разумному соотношению польза/риск.
В конкретном воплощении изобретения КТ представляет собой (С1-С5)алкил, -(СН2)0-3-(3-6)Су, -(СН2)0-3-(5-6)Не1еу, -(СН2)1-3-(5-10)Не1аг, -(СН2)1-3-фенил, каждый из которых возможно замещен.
В конкретном воплощении изобретения К1 представляет собой -(СН2)0-3-(5-6)Не1еу, -(СН2)1-3-(5-10)Не1аг, -(СН2)1-3-фенил, каждый из которых возможно замещен.
В другом воплощении К1 представляет собой -(СН2)2-фенил, возможно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогена. В другом воплощении К1 представляет собой 2,4дихлорфенил.
В другом воплощении К2 представляет собой (СН2)2-СН(Рй)2, возможно замещенный, при условии, что К2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил. В другом воплощении К2 представляет собой 3,3дифенилпропил при условии, что К2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил.
В другом воплощении К3 представляет собой возможно замещенный -(СН2)2-фенил. В другом воплощении К3 представляет собой -(СН2)2-фенил, возможно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогена. В другом воплощении К3 представляет собой 2,4-дихлорфенил.
В другом воплощении К2 представляет собой 3,3-дифенилпропил, и К1 и К3 оба представляют собой 2,4-дихлорфенил.
Другое воплощение настоящего изобретения относится к соединению, которое представляет собой лекарственный конъюгат, содержащий соединение формулы II, конъюгированное с полимером, пред
- 3 014874 ставляющим собой полиглутаминовую кислоту, как определено выше, где указанный полимер имеет молекулярную массу от 20 до 60 кДа.
В другом воплощении в соединении формулы III η равно 0. В другом воплощении η равно 2, и К4 представляет собой боковую цепь глицина. В другом воплощении η равно 3, и К4 представляет собой боковую цепь глицина, боковую цепь аргинина и боковую цепь фенилаланина. В другом воплощении η равно 3, и К4 представляет собой боковую цепь валина, боковую цепь аргинина и боковую цепь фенилаланина.
В конъюгате полимера и лекарственного средства полиглутаминовая кислота может представлять собой поли(Ъ-глутаминовую кислоту), поли(Р-глутаминовую кислоту) или поли(рЬ-глутаминовую кислоту). В одном воплощении изобретения полиглутаминовая кислота является поли(Ь-глутаминовой кислотой).
Кроме того, все возможные комбинации вышеупомянутых воплощений также составляют часть данного изобретения.
Соединения формулы I содержат по меньшей мере один хиральный центр. Настоящее изобретение включает как рацемические соединения, так и энантиомерные соединения формулы I, то есть соединения, где конфигурация хирального атома углерода, соединенного с К1, является (8), и соединения, где конфигурация хирального атома углерода, соединенного с К1, является (К), как показано ниже.
Соединения формулы II содержат по меньшей мере два хиральных центра. Настоящее изобретение также включает смеси стереоизомеров и отдельные стереоизомеры формулы II.
Соединения по настоящему изобретению могут содержать один или более основных атомов азота и, таким образом, могут образовывать соли с кислотами, которые также составляют часть данного изобретения. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают среди прочих соли присоединения неорганических кислот, таких как соляная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, азотная, хлорная, серная и фосфорная кислота, а также соли присоединения органических кислот, таких как уксусная, метансульфоновая, трифторметансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, пара-толуолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, миндальная, щавелевая, янтарная, фумаровая, винная и малеиновая кислота. Аналогично, соединения по настоящему изобретению могут содержать один или более кислотных протонов и, таким образом, могут образовывать соли с основаниями, которые также составляют часть данного изобретения. Примеры таких солей включают соли с катионами металлов, такими как, например, ион щелочного металла, ион щелочно-земельного металла или ион алюминия; или они могут образовывать координационное соединение с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают среди прочих диэтиламин и триэтиламин. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия и гидроксид натрия. Соединение может иметь более одного катиона или аниона в зависимости от числа заряженных функциональных групп и от валентности катионов и анионов.
Соли, являющиеся производными от фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклических аминов и основных ионобменных смол, таких как аргинин, бетаин, кофеин, холин, Ν,Ν-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, Ν-этилморфолин, этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминовые смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и им подобные.
Ограничений по типу солей, которые могут быть использованы, нет при условии, что эти соли являются фармацевтически приемлемыми при их применении для терапевтических целей. Соли могут быть синтезированы с помощью традиционных химических способов на основе исходного соединения, содержащего основную или кислотную группировку. Обычно такие соли могут быть получены путем проведения реакции данных соединений в форме свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, таком как диэтиловый эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитил, или в их смеси. Соединения формулы I или формулы III и их соли отличаются по некоторым физическим свойствам, но для целей настоящего изобретения они эквивалентны.
Некоторые из соединений формулы I или формулы III по настоящему изобретению могут существовать как в несольватированной форме, так и в сольватированной форме, например в форме гидратов. Настоящее изобретение охватывает все подобные вышеупомянутые формы, которые являются фарма
- 4 014874 цевтически активными.
Некоторые из соединений общей формулы I могут проявлять полиморфизм, при этом настоящее изобретение охватывает все возможные полиморфные формы и их смеси. Различные полиморфные формы могут быть получены путем кристаллизации при различных условиях или путем нагревания или плавления соединения с последующим постепенным или быстрым охлаждением. Присутствие полиморфов можно определить с помощью твердотельной ЯМР (ядерно-магнитный резонанс) спектроскопии, ИК (инфракрасной) спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии, порошковой дифракции рентгеновских лучей или других подобных методик.
Соединения формулы I по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один хиральный центр. Кроме того, они могут иметь дополнительные хиральные центры. Настоящее изобретение включает все возможные стереоизомеры и их смеси, в особенности их рацемические смеси. Отдельный энантиомер может быть получен посредством любого из общепринятых способов, например посредством хроматографического разделения рацемической смеси на стационарной хиральной фазе, посредством разделения рацемической смеси с помощью методик фракционной кристаллизации ее диастереоизомерных солей, посредством хирального синтеза, посредством ферментативного разделения или посредством биотрансформации. Данное разделение может быть проведено для любого хирального синтетического промежуточного соединения или для продуктов общей формулы I. В качестве альтернативы любой энантиомер соединения общей формулы I может быть получен с помощью энантиоспецифического синтеза с использованием оптически чистых исходных материалов или реагентов известной конфигурации.
Соединения формулы I или формулы III могут существовать в виде нескольких диастереоизомеров и могут быть разделены с помощью общепринятых методик, таких как хроматография или фракционная кристаллизация. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут иметь цис/транс изомеры. Настоящее изобретение включает все геометрические изомеры и их смеси. Настоящее изобретение охватывает все изомеры и их смеси (например рацемические смеси), полученные путем синтеза и также путем их физического смешивания.
Настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанных новых соединений, их производных, их аналогов, их таутомерных форм, их стереоизомеров, их полиморфов или их фармацевтически приемлемых солей и сольватов.
Соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы с помощью описанных ниже способов, а также с помощью других способов, известных в области органического синтеза. Предпочтительные способы включают, не ограничиваясь этим, общие способы, изображенные на приложенных схемах. Если не указано иное, группы К.1, К2, К3, К.4, п, х и у имеют значения, описанные в общих формулах I, II и III.
Соединения формулы I могут быть получены с помощью следующего способа.
Способ А.
Согласно способу А при удалении защиты в виде флуоренилметоксикарбонильной группы амин с твердой подложкой IV подвергают ацилированию ацилирующим агентом V, где X представляет собой уходящую группу, например галоген, и Υ представляет собой -ОН или галоген. Если Υ представляет собой галоген, например в случае хлорацетилхлорида, реакцию можно проводить в присутствии третичного основания, такого как триэтиламин. Если Υ представляет собой -ОН, например в случае бромуксусной кислоты, реакцию можно проводить в присутствии подходящего агента сочетания, например Ν,Ν'
- 5 014874 диизопропилкарбодиимида. В обоих случаях реакцию можно проводить в инертном растворителе, в котором смола способна к правильному набуханию, таком как Ν,Ν'-диметилформамид или дихлорметан, и при комнатной температуре или с использованием микроволнового излучения, снижающего время реакции. Затем осуществляют сочетание с амином У1а, используя третичный амин в качестве основания. Реакцию можно проводить с нагреванием, например при 60°С, или с использованием микроволнового излучения.
Карбоновую кислоту VIII, где РС представляет собой защитную группу, такую как аллил, подвергают взаимодействию с амином VII с получением амида IX, используя агент сочетания, например комбинацию Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола. Далее осуществляют взаимодействие с амином νφ посредством реакции Михаэля, используя основание и растворитель, такой как Ν,Ν'диметилформамид или диметилсульфоксид, с получением промежуточного соединения X. После повтора ацилирования и аминирования таким же образом, как описано для промежуточного соединения VII, получают XI. Удаление защиты, проводимое с использованием Рй§1Н3 и Рб(РРй3)4 в дихлорметане в качестве растворителя (Те!гайебгои Ьей 1999, 40:2505-2508; Те!гайебгои Ьей 1997, 38:7275-7278) или с водным КОН в диоксане позволяет получить XII. Замыканию кольца способствует образование амида с использованием стандартных агентов сочетания для процедур твердофазного пептидного сочетания, таких как комбинация гексафторфосфата бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония и 1гидроксибензотриазола, в присутствии третичного основания, такого как Ν,Ν-диизопропилэтиламин. Конечное соединение I может быть освобождено от смолы с помощью смеси трифторуксусной кислоты, дихлорметана и воды.
Альтернативная стратегия получения соединения формулы I включает ацилирование аминов IV и X аминокислотами формул XШа и XШЬ соответственно (способ Б).
Способ Б.
Как будет очевидно специалисту в области, для получения соединения формулы I можно комбинировать определенные стадии способа А с определенными стадиями способа Б.
Исходные первичные амины ^а, VΊЬ и ^с имеются в продаже или могут быть получены с помощью известных методик (Магсй, Абтаисеб Огдашс Сйет181гу, 1991, Еб. 1ойи \Убеу & §ои8) или с помощью, например, схемы, описанной ниже.
Схема 1
2) ΝΗ5ΝΗ2.Η2Ο
Амин может быть получен посредством реакции Мицунобу с исходными материалами в виде спирта и фталимида калия в присутствии, например, диэтилазодикарбоксилата ДЭАД) и трифенилфосфина в тетрагидрофуране в качестве растворителя с последующим расщепления с помощью гидрата гидразина (МйкииоЬи, I. Ат. Сйет. 8ос. 1972, 94, 679-680).
Ν-замещенные глицины XШа и XШЬ можно синтезировать с помощью описанных ниже способов, либо посредством восстановительного аминирования соответствующего глицина с помощью подходящего альдегида (схема 2) с использованием восстановителей, таких как NаΒН4, NаΒН3СN или NаΒН(АсО)3, либо посредством нуклеофильного замещения эфира подходящим амином Ε-ΝΗ2 (схема 3).
- 6 014874
Схема 2
Схема 3
Соединения формулы II могут быть получены, используя реакции, аналогичные описанным выше.
Таким образом, для получения соответствующей карбоновой кислоты формулы I, а именно соединения формулы 1а, используют ту же последовательность, что и для синтеза соединения формулы I (используя способы А и/или Б), за исключением того, что исходная твердая подложка (IV;·!) содержит реакционно-способные атомы галогенов вместо аминогруппы.
Пептид XVI для присоединения к соединению I;·! получают также с помощью стандартных реакций для синтеза пептидов. Таким образом, амин с твердой подложкой IV сначала подвергают взаимодействию с защищенным лизином (XIV;) и возможно затем проводят реакцию с другой защищенной аминокислотой (XIVЬ). После сочетания защитную группу удаляют. Эту последовательность можно повторять вплоть до трех раз.
Затем проводят реакцию карбоновой кислоты I; с амином XVI и после удаления защитной группы получают соединение На. Амидное сочетание между На и полиглутаминовой кислотой XVII; (полученной из соответствующей соли XVII) позволяет получить лекарственный конъюгат III.
- 7 014874
III
Соединения по настоящему изобретению являются ингибиторами араГ-1. Следовательно, они полезны для лечения или предупреждения состояния, связанного с избыточным апоптозом.
У взрослых постмитотические клетки, такие как нейроны и клетки сердечной мышцы, редко обновляются. Таким образом, их потеря может вызывать неврологические и сердечные расстройства. Эти клетки подвергаются клеточной смерти путем апоптоза при целом ряде острых и хронических дегенеративных заболеваний. Аналогично септический шок, ишемия и интоксикация могут вызывать обширный апоптоз во многих органах. Инфекции могут вызывать повышенный апоптотический метаболизм определенных клеточных типов, например лимфоцитов при СПИДе (синдром приобретенного иммунодефицита) или клеток слизистой оболочки желудка при инфекции НейсоЬас!ег ру1оп. Случаи апоптоза также существенны в процедурах при ишемии и для консервации и реперфузии в трансплантации органов. Таким образом, данные заболевания являются кандидатами для терапевтического подавления клеточной смерти.
Другие состояния или заболевания, связанные с апоптозом, включают, не ограничиваясь этим, удар, травматическое состояние, повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, менингит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Кеннеди, рассеянный склероз, заболевания, связанные с прионами, а также другие острые или хронические сердечно-сосудистые заболевания, патологии, связанные с алкоголизмом, и лечение алопеции.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению данных соединений для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения вышеупомянутых заболеваний или состояний.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы I без учета условия для К2 или соединения, являющегося конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или состояния, ассоциированного с апоптозом.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза, включающему введение соединения формулы I без учета условия для К2 или соединения, являющегося конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предупреждения удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, трансплантации органов, патологий, связанных с алкоголизмом, и лечения алопеции, включающему введение соединения формулы I без учета условия для К2 или соединения,
- 8 014874 являющегося конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы I или соединение, которое является конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, его фармацевтически приемлемую соль или сольват, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами, в виде единичной или множественной дозы. Примеры упомянутых ниже эксципиентов служат только для иллюстрации и не должны восприниматься как ограничивающие объем изобретения.
Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде любой фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция зависит от природы активного соединения и способа введения. Может быть использован любой способ введения, например пероральный, трансбуккальный, легочный, местный, парентеральный (включая подкожный, внутримышечный и внутривенный), трансдермальный, окулярный (офтальмологический), ингаляция, интраназальный, ушной, трансмукозальный, имплантант или ректальное введение. Однако предпочтительным является пероральное, местное или парентеральное введение.
Твердые композиции для перорального введения включают среди прочих таблетки, грануляты и твердые желатиновые капсулы, в виде препаратов с немедленным высвобождением или с модифицированным высвобождением.
В качестве альтернативы соединения по настоящему изобретению могут быть включены в жидкие пероральные препараты, такие как эмульсии, растворы, дисперсии, суспензии, сиропы, эликсиры, или могут иметь вид мягких желатиновых капсул. Они могут содержать общеупотребительные инертные разбавители, такие как очищенная вода, этанол, сорбит, глицерин, полиэтиленгликоли (макроголы) и пропиленгликоль. Вспомогательные композиции также могут содержать коадъюванты, такие как смачивающие, суспендирующие агенты, подсластители, корригенты, консерванты, буферы, хелатирующие агенты и антиоксиданты.
Препараты для инъекций для парентерального введения содержат стерильные растворы, суспензии или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать коадъюванты, такие как суспендирующие, стабилизирующие агенты, агенты для регулирования тоничности или диспергирующие агенты.
Соединение также может быть приготовлено в виде препарата для местного введения. Препараты включают кремы, лосьоны, гели, порошки, препараты в форме шампуня, пероральную пасту, препараты для полоскания рта и пластыри, где соединение распределено или растворено в подходящих эксципиентах.
В одном воплощении изобретения фармацевтическая композиция имеет форму наносфер, микрочастиц и наночастиц.
Эффективная дозировка активного ингредиента может различаться в зависимости от конкретного вводимого соединения, способа введения, природы и серьезности заболевания, подлежащего лечению, а также возраста, общего состояния и массы тела пациента, среди других факторов. Типичный пример подходящего диапазона дозировки составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, что может быть введено в виде единичной дозы или раздельными дозами. Однако вводимая дозировка обычно остается на усмотрение врача.
Токсичность и выживание клеток в анализе МТТ
Анализ МТТ оценивает пролиферацию клеток, а также снижение жизнеспособности клеток в случае, если метаболические процессы ведут к апоптозу или некрозу. Его также можно использовать для оценки уровня выживаемости данной клеточной линии при ее инкубации в присутствии ксенобиотиков. Снижение уровня солей тетразолия принимают в качестве надежного способа анализа клеточной пролиферации. Уровень желтого тетразолия МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолия) снижается за счет метаболически активных клеток и приводит к внутриклеточному образованию пурпурного формазана, уровень которого можно измерить с помощью спектрофотометра после солюбилизации в ДМСО (диметилсульфоксиде).
В данном изобретении МТТ анализ был использован для оценки токсичности соединений в различных концентрациях. Для анализа их возможного негативного влияния на клеточную жизнеспособность, соединения добавляли к клеточным линиям 8ао§-2 и И937 в различных концентрациях и инкубировали в течение различных периодов времени. Результаты выражены в процентах жизнеспособности клеток.
- 9 014874 % жизнеспособности клеток ч, мкМ 48 ч, мкМ
10 5 1 10 5 1
Клеточ- 1.1 96 100 99 100 100 100
ная линия 1.10 91 100 76 100 100 100
Заоз-2 Ι.2 99 99 100 91 100 100
1.11 82 98 100 74 91 100
Ι.4 100 97 100 99 98 100
Ι.9 82 96 100 66 76 97
Ι.3 100 93 97 100 100 100
Ι.7 98 99 95 100 100 100
Ι.8 99 100 100 100 100 97
Клеточ- 1.1 95 98 100 99 97 100
ная линия 1.10 89 99 96 99 98 100
иэз7 Ι.2 97 100 100 83 99 100
1.11 79 95 100 75 89 98
Ι.4 87 99 100 95 94 99
Ι.9 88 98 100 59 69 93
Ι.3 95 95 100 98 100 100
Ι.7 93 95 99 97 100 100
Ι.8 99 98 100 99 98 100
Время (ч) % жизнеспособности клеток 1.1 (мкМ) % жизнеспособности клеток На.2 (мкМ)
50 25 10 5 1 50 25 10 5 1
24 19 63 100 100 99 10 25 77 100 98
Заоз- 48 11 19 97 94 97 но 11 98 97 100
2 72 НО 8 80 88 89 но но НО НО НО
24 27 59 87 90 100 но но НО НО НО
11937 48 НО НО 83 94 100 но НО НО НО НО
72 НО НО 67 89 98 но НО НО а НО НО
Время (ч) % жизнеспособности клеток III.1 (мкМ лекарственный эквивалент)
500 250 100 50 20
24 35 75 93 99 96
Заоз-2 48 НО НО 95 87 95
72 НО НО 68 63 86
24 27 50 84 96 98
иэз7 48 НО НО НО НО НО
72 НО НО НО НО НО
Анализ МТТ также использовали для оценки восстановления клеток посредством добавления соединений в клеточные линии с индуцированным апоптозом. Для клеточной линии 8ао§-2 индукцию апоптоза производили посредством добавления доксициклина 2 мкМ; в случае клеточных линий И937, НеЬа, И2-О8 апоптоз индуцировали доксорубицином в концентрациях 0,25, 1,5, 2 мкМ, соответственно. Результаты выражены в % жизнеспособности клеток с учетом того, что добавление доксициклина и доксорубицина индуцирует 100%-ную клеточную гибель и 0% выживания клеток в линиях 8ао§-2 и НеЬа, И2-О8 или И937, соответственно.
- 10 014874
Клеточные линии % выживания клеток 1.1
Время (ч) 10 мкМ 5 мкМ 1 мкМ
НеБа 24 30 31 29
48 3 78 75
72 2 33 34
112-05 24 72 0 0
48 18 54 58
72 3 25 1
иэз7 24 52 19 0
48 3 19 14
72 4 46 12
Заоз-2 24 15 6 76
48 8 25 23
72 2 1 3
% восстановления клеток
Ли- 1.10 .2 1.11 .9 .4 .3 .7 .8
НИИ Вре- 5 Ί 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1
клеток мя (ч) μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ μΜ
8аоз- 24 57 0 10 41 0 22 16 36 9 34 12 18 41 64 23 57
2 48 24 0 21 21 8 20 22 31 10 24 21 14 19 27 51 24
НО: не определено
Время (ч) % восстановления клеток 111.1
100 мкМ 50 мкМ 20 мкМ
8ао$-2 24 25 28 15
48 18 49 13
72 15 31 14
11937 24 9 34 5
48 20 9 1
72 10 15 0
Анализ ингибирования каспаз
Было проанализировано зависимое от времени ингибирование каспаз, вызванное соединениями, описанными в данном изобретении. Клеточные линии выращивали в присутствии или в отсутствие соединений (50 мкМ) в течение разных периодов времени. Активность каспаз анализировали, используя экстракты клеток Бао8-2 или И937 и Ас-ОЕУО-аГс(М-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-аГс(7-амино-4трифторметилкумарин)) в качестве субстрата (20 мкМ). Активность каспаз непрерывно контролировали по высвобождению флуоресцентного аГс, используя флуориметр Су1оГ1ног 4000 (возбуждение 400 нм, излучение 508 нм) в течение 1 ч. Влияние соединений на активность каспаз выражали в виде процента ингибирования флуоресцентного сигнала обработанных клеток против необработанных (контрольных).
% ингибирования каспаз
Линии I. 1 1.10 Ι.2 1.11 Ι.9 Ι.4 Ι.3 1.7 1.8
клеток Время (ч) 5 мкМ 1 мкМ 5 мкМ 5 мкМ 5 мкМ 5 мкМ 5 мкМ 5 мкМ 5 мкМ 5 мкМ
24 31 29 1 1 14 0 48 9 6 5
- 11 014874
Не1_а 48 78 75 6 46 0 0 14 21 7 3
72 33 34 НО 59 62 41 35 29 11 6
24 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
и2-О8 48 54 58 22 54 31 34 23 29 31 16
72 25 1 64 27 50 61 54 22 33 24
24 19 0 0 0 11 3 0 12 10 5
иэз7 48 19 14 5 3 0 4 12 16 8 15
72 46 12 2 0 4 63 0 1 2 23
24 53 21 13 11 45 50 55 29 0 1
Заоз-2 48 19 17 4 0 7 2 9 16 24 0
72 4 4 НО НО НО НО НО НО НО НО
НО: не определено
Клеточные линии Время (ч) ΙΙΙ.1 % ингибирования каспаз
(50 мкМ лекарственный эквивалент)
24 67
Заов-2 48 72
72 100
24 74
ΙΙ937 48 85
72 100
Ингибирование апоптоза, индуцированного АраГ-1
Оценивали активность соединений в отношении их специфической мишени в аппарате апоптоза. Олигомеризация АраГ-1 представляет собой событие на молекулярном уровне, которое ведет к активации образования апоптосомы, которое приводит к индукции апоптоза. Эти эксперименты проводили в бесклеточном анализе и в анализах на клетках.
Для бесклеточного анализа цитоплазматические экстракты Нек-293 получали, как описано ранее (Ма1е1 с1 а1., 2005), и выполняли фракционирование полного клеточного экстракта. Параллельно очищали рекомбинантный АраГ-1 согласно Ма1е1 е1 а1., 2005. Фракцию РТ (содержащую каспазу-3 и -9, но не содержащую АраГ-1) инкубировали с рекомбинантным АраГ-1 в присутствии разных концентраций соединений (см. фиг. 1). Активность соединений анализировали по ингибированию активности каспаз (см. выше).
Для анализа на клетках клетки 8ао§-2 и И937 обрабатывали активатором апоптосомы (Ыдиуеп аиб ^е115, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 2003, 100:7533-7538), который специфически индуцирует олигомеризацию АраГ-1 После этого соединения добавляли к клеткам (50 мкМ) и инкубировали в течение 24 или 48 ч. Способность соединений ингибировать апоптоз, вызванный АраГ-1, анализировали по ингибированию активности каспаз (см. выше).
- 12 014874
Клеточные линии Время (ч) III.1 % ингибирования активности каспаз
(50 мкМ лекарственный эквивалент)
Заоз-2 24 22
48 54
и937 24 27
48 95
Связывание Па.1 с САКЭ доменом (домен активации и рекрутирования каспазы) АраГ-1: анализ поляризации флуоресценции.
Измерения поляризации флуоресценции производили на счетчике V^сΐο^2V 1420 Ми1П1аЬе1 НТ8. 60 нМ раствор меченого 5'-6'-карбоксифлуоресцеином Па.1 (называемого СЕ-ПА.1; λ возбуждения = 480 нм; λ излучения = 535 нм) в буфере А (общий объем реакционной смеси составлял 200 мкл) титровали с помощью концентрированных белковых растворов. Данные записывали с помощью программного обеспечения Аа11ае 1420 Аогк51а1юп. Величины КО вычисляли с помощью модели двух состояний (см. фиг. 2).
Для исходной характеристики сайта связывания пептоидов с апоптосомой авторы изобретения синтезировали флуоресцентный аналог Па.1 (СЕ-Па.1). СЕ-Па. 1 связывался с САКО доменом АраГ-1, но не с цитохромом С и другими контрольными белками (Ма1е! а! а1, 2005) с константой диссоциации (КО) 60 нМ, как было определено в анализе поляризации флуоресценции (фиг. 2). Тем не менее величина константы связывания отличалась от концентрации Па.1, необходимой для ингибирования 50% активности каспаз в анализах (4050 составляла приблизительно 30 мкМ, фиг. 1). Предполагаемое объяснение для согласования этих данных заключается в том, что лизат ретикулоцитов, используемый для трансляции прокаспазы-9 ΐη νίΙΐΌ. содержал компоненты, которые снижали эффективную концентрацию Па.1.
Примеры
В примерах использовали следующие аббревиатуры:
Вос: трет-бутоксикарбонил
ОСМ: дихлорметан
ОГО: Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид
ОГРЕА: диизопропилэтиламин
ОМЕ: Ν,Ν'-диметилформамид экв.: молярный эквивалент
ЕЮАс: этилацетат
Етос: флуоренилметоксикарбонил
Глицин:6
НАТИ: гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1 -ил)-Ы,^№,№-тетраметилурония
НОВТ: 1-гидроксибензотриазол
Лизин: К
РОА: поли(Ь-глутаминовая кислота)
Фенилаланин: Е
РуВОР: гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония
К: аргинин
П: время удерживания
ТФУ: трифторуксусная кислота
Валин: V
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами. Примеры приведены только для иллюстрации и не должны рассматриваться, как ограничивающие объем изобретения.
Полистирольную смолу АМ КАМ (0,75 ммоль/г) приобретали у Карр Ро1утеге 6тЬН (Германия). Смолу на основе 2-хлортритилхлорида (1,4 ммоль/г) приобретали у NονаЬ^οсйет. Полупрепаративную ОФ-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) проводили в системе Аа1ег5 (МПГогД, МА, И8А), используя колонку У-Тегга С18 (19x25 см, 5 мкм); элюент: А = 0,1% ТФУ в воде, В = 0,1% ТФУ в ацетонитриле, градиент: 0 мин 20% В - 20 мин 80% В. Масс-спектры высокого разрешения (НКМ8-ЕАВ (бомбардировка быстрыми атомами)) регистрировали в Службе массспектрометрии в Университете Сантьяго де Компостела (Испания).
Используемая в данном документе номенклатура основана на АυТОNОМ (Автоматическая номенклатура), компьютеризованной системе Института ВеИбЯеш для генерации систематической номенклатуры ГОРАС (Международного союза по теоретической и прикладной химии).
- 13 014874
Промежуточное соединение VIII.
VIII: моноаллиловый эфир (2)-бут-2-ендиовой кислоты
К раствору 2 г малеинового ангидрида (20 ммоль) в хлороформе добавляли 1,8 мл аллилового спирта (26 ммоль, 1,3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 50 мин под микроволновым облучением. Полученный раствор обрабатывали 1 н. НС1 и экстрагировали хлороформом. Органические экстракты промывали солевым раствором, затем сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали посредством колоночной хроматографии с получением промежуточного соединения VIII в виде масла (чистота 95%, выход 85%).
Соединения формулы I.
1.1: карбамоилметил-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]амид 1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-4-(3,3-дифенилпропил)-3,7-диоксо [1,4] -диазепан-5 -карбоновой кислоты.
Амидную смолу Ринка (500 мг, 0,4 ммоль) обрабатывали 3 мл 20%-ного пиперидина в ΌΜΕ, и смесь перемешивали в микроволновом реакторе в течение 2 мин при 60°С. Смолу отфильтровывали и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). Смолу обрабатывали раствором бромуксусной кислоты (V, 275 мг, 5 экв.) и ОШ (306 мкл, 5 экв.) в ΌΜΕ (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 мин при 60°С в микроволновом реакторе. Смолу высушивали и промывали ЭСМ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΌΜΕ (3x3 мл). Раствор 2,4-дихлорфенетиламина (А1а, 300 мкл, 5 экв.) и триэтиламина (275 мкл, 5 экв.) в 3 мл ΌΜΕ добавляли к смоле, и суспензию перемешивали в течение 2 мин при 90°С с микроволной активацией. Надосадочную жидкость удаляли и остаток сушили и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΩΟΜ (3x3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором моноаллилового эфира (2)-бут-2-ендиовой кислоты (VIII, 310 мг, 5 экв.), НОВТ (267 мг, 5 экв. и ΟΚ’ (306 мкл, 5 экв.) в Ό'Μ:ΌΜΕ (2:1, 3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, фильтровали и реакцию повторяли при тех же условиях. Смолу высушивали и промывали Ό'Μ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΌΜΕ (3x3 мл). Затем к смоле добавляли раствор 3,3-дифенилпропиламина (А1Ь, 418 мг, 5 экв.) и триэтиламина (275 мкл, 5 экв.) в 3 мл ΌΜΕ и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Реакцию повторяли в течение ночи при той же температуре. Надосадочную жидкость удаляли и остаток сушили, и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и Ό'Μ (3x3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором бромуксусной кислоты (V, 275 мг, 5 экв.) и ОК.' (306 мкл, 5 экв.) в ΌΜΕ (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 мин при 60°С в микроволновом реакторе. Смолу высушивали и промывали Ό'Μ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΌΜΕ (3x3 мл). Раствор 2,4-дихлорфенетиламина (А1с, 200 мкл, 5 экв.) и триэтиламина (210 мкл, 5 экв.) в 3 мл ΌΜΕ добавляли к смоле и суспензию перемешивали в течение 2 мин при 90° с микроволновой активацией. Надосадочную жидкость удаляли и смолу высушивали и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и Ό'Μ (3x3 мл). Затем смолу обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием(0) (46 мг, 0,1 экв.) и фенилсиланом (490 мкл 10 экв.) в безводном Ό'Μ в течение 15 мин при комнатной температуре в атмосфере аргона. Данную процедуру повторяли три раза. Надосадочную жидкость удаляли и смолу высушивали, и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и Ό'Μ (3x3 мл). Замыканию кольца способствовала обработка РуВОР (308 мг, 1,5 экв.), НОВТ (80 мг, 1,5 экв.) и ΩΦΕΑ (203 мкл, 3 экв.) в ΌΜΕ (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и фильтровали. Смолу высушивали и промывали Ό'Μ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΌΜΕ (3x3 мл). Наконец, с помощью обработки смолы смесью 60:40:2 ТФУ:^СΜ:вода получали неочищенную реакционную смесь, содержащую указанное в заголовке соединение I.!, которую фильтровали. Растворители удаляли из фильтрата путем выпаривания при пониженном давлении с последующей лиофилизацией. Полученный остаток очищали посредством полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ, используя градиент водного ацетонитрила (42% ацетонитрила 80% ацетонитрила, 35 мин), с получением 91 мг желаемого продукта (выход 30%, не менее 98% чистоты).
ΗΒΜ8 (М + Н)+: вычислено для '39Η38'14Ν4Ο4 767,1647; найдено 767,1720.
Следуя процедуре, аналогичной описанной для примера П, но с использованием других аминов, были получены следующие продукты:
- 14 014874
Пример Название соединения НВМЗ (М + Н)+:
Вычислено Найдено
1.2 Карбамоилметилциклопропиламид 1-[2- (2,4-дихлорфенил)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты 635,2114 635,2186
1.3 (2-ацетиламиноэтил)карбамоилметиламид 1 -(2-(2,4-д ихлорфени л)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты 680,2328 680,2401
1.4 Карбамоил(тетрагидрофуран-2илметил)амид 1-)2-(2,4-диxлορφенил)эτил]-4-(3,3-диφенилπροπил)-3,7диоксо[1,4]-диазепан-5-карбоновой кислоты СззНдоСЬМдОб 679,2376 679,2449
Ι.5 Карбамоилметил-[2-(4метокси фени л)этил] ам ид 1 -)2-(2,4диxлορφенил)эτил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты СдоНдгСЬМдОб 729,2532 729,2605
Ι.6 Карбамоилметилциклогексиламид 1-[2- (2,4-дихл орфен ил )этил )-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты ¢37442012^04 677,2583 677,2656
Ι.7 Карбамоилметил-[2-(2метоксифенил)этил]амид 1-)2-(2,4дихл орфен и л)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты Сз4НзбС1гМ4О4 729,2532 729,2605
Ι.8 Ка рба мои лметил [2-(4хлорфенил)этил]амид 1-)2-(2,4дихлорфенил)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты Сз9НздС1зМ4О4 733,2037 733,2110
1.9 Карбамоил метил [2-(2фторфенил)этил]амид 1-)2-(2,4дихлорфенил)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты θ3βΗ39ΟΙ2ΡΝ4 о4 717,2332 717,2405
1.10 Карбамоил метил [2-(4фторфенил)этил]амид 1-)2-(2,4дихлорфенил)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты ο39η39οι2ρν4 о4 717,2332 717,2405
1.11 Бутил карбамоил метилам ид 1-)2-(2,4дихлорфенил)этил]-4-(3,3дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан5-карбоновой кислоты Сз5Н4оС12Ы404 651,2427 651,2499
Промежуточное соединение 1а.
1а: {[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-[1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-4-(3,3-дифенил пропил )-3,7-диоксо [1,4] диазепан-5-карбонил]амино }уксусная кислота
Смолу 2-хлортритилхлорида (1Уа, 700 мг, 0,98 ммоль) обрабатывали раствором хлоруксусной кислоты (V, 463 мг, 5 экв.) и ΌΙΡΕΆ (840 мкл, 5 экв.) в ИСМ (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию гасили с помощью метанола (550 мкл) и перемешивание продолжали в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, остаток высушивали и промывали ИСМ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΌΜΕ (3x3 мл). К смоле добавляли раствор 2,4-дихлорфенетиламина (νΐα, 740 мкл, 5 экв.) и ΌΙΡΕΆ (840 мкл, 5 экв.) в 4 мл ΌΜΕ и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ИСМ (3x3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором моноаллилового эфира (2)-бут-2-ендиовой кислоты (VIII) (765 мг, 5 экв.), НОВТ (662 мг, 5 экв.) и И1С (760 мкл, 5 экв.) в смеси 2:1 ПСМ:ИМЕ (4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтровали и повторяли реакцию при тех же условиях. Затем к смоле добавляли раствор 3,3-дифенилпропиламина (νΐό. 1,0 г, 5 экв.) и ΌΙΡΕΆ (840 мкл, 5 экв.) в 4 мл ОМЕ и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Реакцию повторяли и перемешивание продолжали в течение 16 ч при той же температуре. Надосадочную жидкость удаляли, осадок сушили и промывали ОМЕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ОСМ (3x3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором хлоруксусной кислоты (V, 463 мг, 5 экв.) и ΌΙΟ (760 мкл, 5 экв.) в смеси 2:1 ОС’МПМЕ (4 мл). Реакци
- 15 014874 онную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу высушивали и промывали ЭСМ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ΌΜΕ (3x3 мл). Раствор 2,4-дихлорфенетиламина (УК, 740 мкл, 5 экв.) и О[РЕЛ (840 мкл, 5 экв.) в 4 мл ΌΜΕ добавляли к смоле и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и промывали ΌΜΕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). Затем смолу обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием(0) (114 мг, 0,1 экв.) и фенилсиланом (1,2 мл, 10 экв.) в безводном ЭСМ в течение 15 мин при комнатной температуре в аргоновой атмосфере. Данную стадию синтеза выполняли три раза. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и промывали ЭСМ (3 х 3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ОМЕ (3x3 мл). Замыканию кольца способствовала обработка РуВОР (765 мг, 1,5 экв.), НОВТ (199 мг, 1,5 экв.) и ΩΦΕΑ (505 мкл, 3 экв.) в ОМЕ (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч и фильтровали. Смолу высушивали и промывали ОМЕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). Наконец, с помощью обработки смолы смесью 5:95 ТФУГОСМ получали неочищенную реакционную смесь, которую фильтровали. Растворители удаляли из фильтрата при пониженном давлении с последующей лиофилизацией с получением соединения Е1 (460 мг, выход 61%, не менее 55% чистоты) в виде бесцветного твердого вещества.
Промежуточные соединения 11а
С амидной смолы Ринка (IV, 505 мг, 0,4 ммоль) снимали защитную группу с помощью 3 мл 20%ного пиперидина в ОМЕ. Смесь перемешивали в микроволновом реакторе в течение 2 мин при 60°С. Смолу отфильтровывали и промывали ОМЕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). Етос-Ь-Еу8(Вос)-ОН (Х^а, 2 экв.) связывали со смолой, используя НОВТ (108 мг, 2 экв.) и ЭЮ (125 мкл, 2 экв.). Смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Смолу высушивали и промывали ОМЕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). После удаления группы Етос с помощью 3 мл 20%-ного пиперидина в ОМЕ (30 мин) смолу промывали ОМЕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). При необходимости присоединяли другие аминокислоты (XIVЬ) в тех же условиях, что описаны выше для получения промежуточного соединения XVI.
К промежуточному соединению XVI, набухшему в ОМЕ, добавляли кислоту Е1 (460 мг, 1,5 экв.) в присутствии НАТи (228 мг, 1,5 экв.) и ΩΦΕΑ (205 мкл, 3 экв.) в ОМЕ (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и фильтровали. Смолу высушивали и промывали ЭМЕ (3x3 мл), изопропиловым спиртом (3x3 мл) и ЭСМ (3x3 мл). С помощью обработки смолы смесью 80:20:2,5:2,5 ТФУ/ОСМ/вода/триизопропилсилан получали неочищенную реакционную смесь, содержащую соединение Па, которую фильтровали. Растворители удаляли из фильтрата при пониженном давлении с последующей лиофилизацией. Полученный остаток очищали путем полупрепаративной ОФВЭЖХ, используя градиент смеси воды и ацетонитрила.
Пример Название соединения вэжх-мс
г1 т/ζ
На.1 (ΚΘΘ- 1а.1) {[({[(5-амино-1-карбамоилпентилкарбамоил)метил]карбамоил}метил)карбамоил]метил}-[2-(2,4дихлорфенил)этил]амид 1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]4-(3,3-дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан-5карбоновой кислоты 17,0 1011,506
04 ώ | го — [(5-амино-1-карбамоилпентилкарбамоил)метил]-[2(2,4-дихлорфенил)этил]амид 1-(2-(2,4дихл орфени л)эти л[-4-(3,3-дифени л проп ил )-3,7диоксо[1,4[-диазепан-5-карбоновой кислоты 17,6 895
Па.З {[({1-[1-(5-амино-1-карбамоилпентилкарбамоил)-4- 13,6 1257,629
(ΚΡΓΘ- 1а.1) гуанидинобутилкарбамоил]-2фенилэтилкарбамоил}метил]карбамоил}метил)карбамоил]метил}-[2-(2,4дихлорфенил)этил]амид 1 -(2-(2,4-дихлорфенил)этил]4-(3,3-дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан-5карбоновой кислоты
На.4 (ККЕУ- 1а.1) [(1-(1 -[1 -(5-амино-1 -карбамоилпентилкарбамоил)-4гуанидинобутилкарбамоил]-2-фенилэтилкарбамоил}2-метил пропилкарба моил) метил [-2-(2,4дихлорфенил)этиламид 1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил[4-(3,3-дифенил проп ил)-3,7-д иоксо[ 1,4]-диазеп ан-5карбоновой кислоты 17,4 1299,650
- 16 014874
Соединения формулы III
ΙΙΙ.1 РОЛ-Па.1
К раствору натриевой соли РОЛ (XVII, 0,1 г, 0,5 ммоль) с молекулярной массой (М„) в диапазоне 17000-43000 Да в воде добавляли 0,2 М НС1 до тех пор, пока рН раствора не достигал 2,0. Осадок собирали, проводили диализ против воды и подвергали лиофилизации. Затем РОЛ в протонной форме (ΧνΗο) растворяли в сухом ΌΜΡ (7,5 мл), добавляли Э!С (3 экв.) и НОВТ (3 экв.) и оставляли с перемешиванием на 15 мин. Затем добавляли промежуточное соединение Па.1 (0,052 ммоль (12 мол.%) 1 экв.) и доводили рН до 8 с помощью ОГРЕЛ (1,5 мл). Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 36 ч. Тонкослойная хроматография (ТСХ, диоксид кремния) показала полную конверсию Па.1 (КГ=0,5) в полимерный конъюгат (КГ=0, МеОН:Н2О:АсОН=85:10:5). Для прекращения реакции смесь выливали в СНС13. Полученный осадок собирали и сушили под вакуумом. Натриевую соль конъюгата РОАпептоид III. 1 получали посредством растворения продукта в 1,0 М ЫаНСО3. Проводили диализ этого водного раствора против дистиллированной воды (М„СО 6000-8000 Да). Лиофилизация продукта диализа позволяла получить продукт в виде белого порошка. Общее содержание пептоида в полимере, определенное с помощью ультрафиолета (λ = 282 нм), находилось в диапазоне 25-30% (мас./мас.) (10-12 мол.% функционализации), содержание свободного лекарственного средства составляло менее 1 мас.% от общего содержания лекарственного средства.
Среднюю молекулярную массу (М„), полидисперсность (М„/Мп) и поведение III. 1 и контрольного XVII в растворе анализировали с помощью гель-хроматографии (8ЕС) и аналитического ультрацентрифугирования (АИС). Обе методики показали, что III. 1 имеет более компактную конформационную структуру с меньшим гидродинамическим объемом и большим коэффициентом седиментации (8), чем XVII (!г = 12,5 мин и 8 = 3,5 ± 0,4 с против ίτ = 11,6 мин и 8 = 1,9 ± 0,1 с для III. 1 и XVII, соответственно). С помощью метода седиментационного равновесия М„ определили, как равную 26700 Да для XVII и 58600 Да для Ш.1, однако с помощью гель-проникающей хроматографии с использованием РЕО (полиэтиленгликоль) стандартов М\с была определена как равная 36000 Да (М„/Мп = 1,8) и 38000 Да (М„/Мп = 1,5) для XVII и Ш.1, соответственно.
Определение общего содержания лекарственного средства путем УФ спектроскопии
Готовили исходный раствор Па в МеОН (1 мг/мл). Для получения калибровочной кривой образцы разводили, используя МеОН, до концентрации в диапазоне 0-1 мг/мл. Общее содержание лекарственного средства в конъюгатах определяли посредством измерения оптической плотности при 272 нм и 281 нм в Н2О. В качестве контроля использовали РОА в том же диапазоне концентраций, что и анализируемый конъюгат III (0-5 мг/мл) в Н2О. Коэффициент экстинкции для Па при 281 нм в МеОН при комнатной температуре составлял
Я = 713 л моль см ’1.
Определение содержания свободного лекарственного средства с помощью ВЭЖХ
Готовили водные растворы Ш.1 (1 мг/мл), аликвоту (100 мкл) добавляли в полипропиленовую пробирку и доводили водой до 1 мл. рН образцов доводили до 8 буфером на основе формиата аммония (100 мкл, 1 М, рН 8,5) и затем добавляли СНС13 (5 мл). Затем образцы тщательно перемешивали с помощью встряхивания (3 х 10 с). Верхний водный слой осторожно удаляли и растворитель выпаривали в атмосфере Ν2. Сухой остаток растворяли в 200 мкл ацетонитрила для ВЭЖХ. Параллельно ту же процедуру выполняли для исходного соединения Па.1 (используя 200 мкл исходного водного раствора 1 мг/мл). Добавление 1 мл ацетонитрила для повторного растворения продукта позволяло получить базовый раствор с концентрацией 200 мкг/мл, из которого получали растворы с различной концентрацией (от 2 до 100 мкг/мл). Свободное количество лекарственного средства в конъюгатах определяли с помощью ВЭЖХ, используя колонку ЫсЬтокрЕег® С18 (150 х 3,9 мм) со скоростью потока 1 мл/мин, используя градиент ацетонитрила в водной 0,1%-ной ТФУ (от 20 до 100% ацетонитрила в 20 мин). Время удерживания составляло Гг = 14,3 мин для Па.1 (λ = 220 нм).
Следуя данной процедуре, как для Ш1, были получены следующие соединения.
Пример Название соединения 5ЕСа
ΓΪ Ми/
III.1: РСА- Па.1 конъюгат Конъюгат поли-Г-глутаминовой кислоты и {[({[(5-амино-1карбамоилпентилкарбамоил)метил]карбамоил}метил)карбамоил]метил}-[2-(2,4дихлорфенил)этил]амида 1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-4(3,3-дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-Диазепан-5карбоновой кислоты 12,5 36000
ΙΙΙ.2: Р6А- Па.2 конъюгат Конъюгат поли-Ь-глутаминовой кислоты и [(5-амино-1карбамоилпентилкарбамоил)метил1-[2-(2,4дихлорфенил)этил]амида 1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-4(3,3-дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан-5карбоновой кислоты 13,3 34000
Определено с помощью гель-хроматографии
- 17 014874
Описание графических материалов
Фиг. 1 - бесклеточный анализ ингибирования каспаз с использованием ЕТ цитоплазматической фракции Нек-293 после инкубации с рекомбинантным АраТ-1 в присутствии различных концентраций соединения Па. 1;
фиг. 2 - анализ взаимодействия СКАЭ/Па.Т 240 нм раствора СЕ-Па.1 в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) титровали возрастающими концентрациями СКАО-АраР, и измеряли поляризацию флуоресценции при 30°С. Данные (среднее, стандартное отклонение; п=3) записывали в единицах миллиполяризации (тР).

Claims (10)

1. Соединение общей формулы I его стереоизомеры и их смеси, его полиморфы и их смеси и его фармацевтически приемлемые сольваты и соли присоединения, где
К1 представляет собой (С1-С5)алкил, -(СН2)1-3-ЫНСО-(С1-3)алкил, -(СН2)0-3-(3-6)Су, -(СН2)1-3-фенил, -(СН2)1-3-(5-10)Не!аг или -(С1Р) ;-(5-6)Не1е\;
К2 представляет собой -(СН2)2-СН(фенил)2;
К3 представляет собой -(СН2)!-3-фенил;
(С1-С5)алкил возможно может быть замещен одним или более заместителями, выбранными из групп -О-(С1-С2)алкил, -8-(С1-С2)алкил, -ΝΉ2, -NН-(С1-С2)алкил и -Ы[(С1-С2)алкил]2;
(С1-С3)алкил возможно может быть замещен одним или более атомами галогена;
(3-6)Су представляет собой радикал 3-6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца;
Су и Не1су возможно могут быть замещены одним или более заместителями, выбранными из галогена, -Се3 и -ОН;
(5-6)Не1су представляет собой С- или Ν-радикал 5- или 6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца, содержащего один или два гетероатома, независимо выбранных из О, 8 и Ν;
(5-10)Не1аг представляет собой С- или Ν-радикал ароматического 5-10-членного кольца, содержащего от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из О, 8 и Ν;
фенил и (5-10)Не!аг возможно могут быть замещены одним или более заместителями, выбранными из галогена и группы -О-(С1-С3)алкил;
при условии, что К2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил.
2. Соединение, которое представляет собой лекарственный конъюгат, содержащий радикал формулы II его стереоизомеры и их смеси и его фармацевтически приемлемые сольваты и соли присоединения, конъюгированный с полимером, представляющим собой полиглутаминовую кислоту, где К1, К2 и К3 имеют такие же значения, как определено в п.1 без условия для К2; каждый К4 независимо представляет собой боковую цепь из аминокислоты, выбранной из глицина, фенилаланина, аргинина и валина, и п равно 0, 1, 2 или 3.
3. Соединение формулы III, которое представляет собой лекарственный конъюгат по п.2
- 18 014874 где соотношение у и х составляет от 25-30 до 75-70 мас.%.
4. Соединение по п.2 или 3, где полиглутаминовая кислота представляет собой поли(Ьглутаминовую кислоту); η равно 2 и К4 представляет собой боковую цепь глицина.
5. Применение соединения формулы I, как определено в п.1 без условия для К2, или соединения, как определено в п.2, для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза.
6. Применение по п.5, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.
7. Способ лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза, включающий введение соединения формулы I, как определено в п.1 без условия для К2, или соединения, как определено в п.2, и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
8. Способ по п.7, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.
9. Фармацевтическая композиция, которая содержит эффективное количество соединения формулы I, как определено в п.1, или соединения, как определено в п.2, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
10. Фармацевтическая композиция по п.9 в форме наносфер, микрочастиц и наночастиц.
EA200801137A 2005-11-23 2006-11-22 Соединения для ингибирования апоптоза EA014874B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200502890A ES2296484B1 (es) 2005-11-23 2005-11-23 Composicion farmaceutica para inhibir la apoptosis.
PCT/IB2006/003312 WO2007060524A1 (en) 2005-11-23 2006-11-22 Compounds for the inhibition of apoptosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801137A1 EA200801137A1 (ru) 2008-12-30
EA014874B1 true EA014874B1 (ru) 2011-02-28

Family

ID=37846980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801137A EA014874B1 (ru) 2005-11-23 2006-11-22 Соединения для ингибирования апоптоза

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20090298781A1 (ru)
EP (1) EP1963357B1 (ru)
JP (1) JP2009516733A (ru)
KR (1) KR20080091103A (ru)
CN (1) CN101370820A (ru)
AT (1) ATE451385T1 (ru)
AU (1) AU2006318131B2 (ru)
BR (1) BRPI0618837A2 (ru)
CA (1) CA2630926A1 (ru)
DE (1) DE602006011053D1 (ru)
EA (1) EA014874B1 (ru)
EC (1) ECSP088464A (ru)
ES (2) ES2296484B1 (ru)
IL (1) IL191670A0 (ru)
NZ (1) NZ568472A (ru)
WO (1) WO2007060524A1 (ru)
ZA (1) ZA200804499B (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2293834B1 (es) * 2006-07-20 2009-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas.
ES2727711T3 (es) * 2009-07-30 2019-10-18 Spiral Therapeutics Inc Compuestos inhibidores de Apaf-1
ES2611185T3 (es) 2013-05-20 2017-05-05 Fundación Comunidad Valenciana Centro De Investigación Principe Felipe Conjugados polímero-fármaco para el tratamiento de la amiloidosis
US10561736B1 (en) 2019-01-09 2020-02-18 Spiral Therapeutics, Inc. Apoptosis inhibitor formulations for prevention of hearing loss
WO2023225277A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Ohio State Innovation Foundation Peptidyl flavor modifiers

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999046248A1 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 1,2-diazepane derivatives as interleukin-1beta converting enzyme inhibitors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2169690B1 (es) * 2000-10-06 2004-03-16 Diverdrugs Sl Trimeros de n-alquilglicina capaces de proteger a neuronas contra agresiones excitotoxicas, y composiciones que los contienen.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999046248A1 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 1,2-diazepane derivatives as interleukin-1beta converting enzyme inhibitors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASHWELL S.: "Caspases: Recent advances in small molecule inhibitors", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS, ASHLEY PUBLICATIONS, GB, vol. 11, no. 10, 2001, pages 1593-1603, XP002315131, ISSN: 1354-3776, compounds *
LURA R. ET AL.: "Role of peptide conformation in the rate and mechanism of deamidation of asparaginyl residues", BIOCHEMISTRY 1988, UNITED STATES, vol. 27, no. 20, 1988, pages 7671-7677, XP002426034, ISSN: 0006-2960, Compound II in page 7673 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200804499B (en) 2009-10-28
AU2006318131B2 (en) 2011-07-21
BRPI0618837A2 (pt) 2011-09-13
AU2006318131A1 (en) 2007-05-31
US20090298781A1 (en) 2009-12-03
DE602006011053D1 (de) 2010-01-21
WO2007060524A1 (en) 2007-05-31
EP1963357A1 (en) 2008-09-03
ES2296484B1 (es) 2009-04-01
JP2009516733A (ja) 2009-04-23
ATE451385T1 (de) 2009-12-15
ES2338164T3 (es) 2010-05-04
IL191670A0 (en) 2008-12-29
KR20080091103A (ko) 2008-10-09
NZ568472A (en) 2011-05-27
CN101370820A (zh) 2009-02-18
CA2630926A1 (en) 2007-05-31
ES2296484A1 (es) 2008-04-16
EA200801137A1 (ru) 2008-12-30
EP1963357B1 (en) 2009-12-09
ECSP088464A (es) 2008-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8642554B2 (en) Smac mimetic dimers and trimers useful as anti-cancer agents
US6552043B1 (en) Benzimidazolinyl piperidines as CGRP ligands
AU2008229725B2 (en) Beta-secretase inhibitors and methods of use
CA2971766A1 (en) Hemiasterlin derivatives for conjugation and therapy
JP2009530424A (ja) 小分子アポトーシスプロモーター
DE19541283A1 (de) Neue Aminosäurederivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
US11142546B2 (en) Neuropeptide S receptor (NPSR) agonists
JP5685440B2 (ja) ３位において二置換されているインドール−２−オン誘導体、これらの調製およびこれらの治療上の使用
CZ272098A3 (cs) Isochinoliny vhodné jako analgetika
EA014874B1 (ru) Соединения для ингибирования апоптоза
TW202321272A (zh) 肽衍生物和作為食慾激素促效劑之相關用途
EP1806141B1 (en) Par-2 antagonists
CN110028508B (zh) 一种抗肿瘤的重氮双环类细胞凋亡蛋白抑制剂
FR2530238A1 (ru)
EP3438118A1 (en) Peptide derivative and use thereof
CN108484640B (zh) 一种抗肿瘤的细胞凋亡蛋白抑制剂
WO2020022892A1 (en) Tubulysin derivatives and methods for preparing the same
JP2015054844A (ja) シクロアルカン誘導体
EP1511728B1 (fr) Derives d oxophenyl-cyclohexyl-propanolamine, leur preparati on et leur application en therapeutique
US20070037845A1 (en) Peptido-mimetic compounds containing rgd sequence useful as integrin inhibitors, and intermediates thereof
MX2008006684A (es) Compuestos para la inhibicion de la apoptosis
WO1998049186A1 (en) Dipeptide surrogates containing asparagine-derived tetrahydropyrimidinones
Harmat et al. Insertion of 2-carboxysuccinate and tricarballylic acid fragments into cyclic-pseudopeptides: new antagonists for the human tachykinin NK-2 receptor
WO2017142040A1 (ja) 環状デプシペプチド化合物
JPH0827156A (ja) アミノ酸誘導体の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU