ES2296484B1 - Composicion farmaceutica para inhibir la apoptosis. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica para inhibir la apoptosis. La presente invención se refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de apoptosis celular que comprende una cantidad química y/o farmacéuticamente eficaz de al menos un compuesto de fórmula general I, y/o al menos un compuesto de fórmula general II y/o al menos un excipiente o adyuvante química y/o farmacéuticamente aceptable que de forma selectiva inhibe al factor de activación de apoptosis 1 (Apaf-1). Esta invención también protege el uso de la composición farmacéutica en la preparación de un medicamento para inhibir la apoptosis celular.
Description
Composición farmacéutica para inhibir la
apoptosis.
Esta invención está dentro del campo de la
química médica. En particular, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende moléculas orgánicas
denominadas peptoides y/o moléculas denominadas
1-[2'-(2'',4''-Diclorofenil)etil]-4-(3',3'-difenilpropil)-3,7-dioxo-[1,4]diazepan-5-sustituidos,
así como los correspondientes derivados de ambos optimizados
farmacológicamente que son inhibidores del factor de activación de
apoptosis 1 (Apaf-1) y por tanto inhibidores
generales del proceso de muerte programa (apoptosis).
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica con capacidad inhibidora general de
apoptosis celular para reducción o tratamiento de procesos
patológicos relacionados con apoptosis.
Dicha composición comprende una cantidad química
y/o farmacéuticamente eficaz de al menos un compuesto de fórmula
general (I):
donde:
- -
- R_{1} es un radical N-(aminocarbonilmetil)aminocarbonil en sus formas enantioméricas R, S y/o mezclas racémicas de los mismos que contiene como sustituyentes del nitrógeno los sustituyentes seleccionados del grupo formado por:
- -
- H, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquiletil, cicloalquilmetil, aminocarbonilalquil, furilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, arifetil, arilmetil,
- -
- ariletil-R_{4} donde R_{4} es un sustituyente del anillo y se selecciona del grupo formado por H, fluor, cloro o bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi, alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino,
- -
- arilmetil-R_{5} donde R_{5} es un sustituyente del anillo y se selecciona del grupo formado por fluor, cloro, bromo, triflorometilo, hidroxi, alcoxi, alquilcarbonil, alquilamino, sulfonilamino,
- -
- R_{2} se selecciona del grupo formado por H y 2,2-difenilo.
- -
- R_{3} se selecciona del grupo formado por H y 2,4-diclorofenilo.
y/o al menos un compuesto de fórmula general
(II):
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\vskip1.000000\baselineskip
y/o al menos un excipiente o
adyuvante química y/o farmacéuticamente aceptable, la composición
se caracteriza por inhibir de forma selectiva al factor de
activación de apoptosis 1
(Apaf-1).
Las interacciones
proteína-proteína desempeñan un papel crítico en
casi todos los procesos biológicos y celulares. En consecuencia,
las interacciones entre proteínas representan puntos de
intervención química para obtener mejoras terapéuticas en los
procesos biológicos relacionados con las enfermedades. La apoptosis
es un proceso biológico interesante dada su importancia en una
amplia variedad de sistemas biológicos, incluido el de renovación
celular normal, el sistema inmunitario y el desarrollo embrionario
y su asociación con diversas enfermedades.
La apoptosis inapropiada participa en muchas
patologías humanas, incluidas enfermedades neurodegenerativas como
la enfermedad de Alzheimer y Huntington, isquemia, desordenes
autoinmunitarios y varios tipos de cáncer [Reed JC (2001)
Apoptosis-regulating proteins as targets for drug
discovery. Trends Mol Med 7: 314-319]. Diversos
estímulos apoptóticos, incluida la activación de receptores de
muerte de superficie celular, agentes anticancerígenos,
irradiación, falta de factores de supervivencia e isquemia
[Strasser A, O'Connor L, Dixit VM (2000) Apoptosis signaling.
Annu Rev Biochem 69: 217-245] inducen cascadas
de señales que activan una familia de cisteína aspartil proteasas
llamadas caspasas. Son estas proteasas las que llevan a cabo el
proceso de apoptosis.
Las caspasas efectoras (por ejemplo,
caspasas-3 y -7) son responsables de la
desmantelación de los componentes celulares mientras que las
caspasas iniciadoras (por ejemplo, caspasas-8, -9 y
-10) son responsables de la activación de las caspasas efectoras.
Mientras que distintos estímulos apoptóticos activan distintos
iniciadores, estos iniciadores activan un mismo conjunto de caspasas
efectoras. Debido a las consecuencias criticas de un
malfuncionamiento de la apoptosis, la activación de las caspasas se
controla escrupulosamente.
Algunas señales apoptóticas activan la ruta
intrínseca o mediada por mitocondrias que utiliza la
caspasa-9 como iniciador. La activación de la
caspasa-9 se desencadena por la liberación al
citosol de las proteínas proapoptóticas del espacio intermembrana
de la mitocondria, en particular el citocromo-c y Smac/Diablo
[Zou H, Li Y, Liu X, Wang X (1999) An APAF-1
cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that
activates procaspase-9. J Biol Chem 274:
11549-11556; Chai J, Du C, Wu JW, Kyin S, Wang X,
Shi Y (2000) Structural and biochemical basis of apoptotic
activation by Smac/DIABLO. Nature 406: 855-862].
La formación del complejo macromolecular llamado apoptosoma es el
proceso clave de esta ruta.
El apoptosoma es un complejo multiproteico
holoenzimático formado por Apaf-1 activado por el
citocromo-c (factor activador de la proteasa apoptótica),
dATP y procaspasa-9 [Li P, Nijhawan D,
Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X (1997)
Cytochrome c and dATP-dependent formation of
Apaf-1/caspase-9 complex initiates
an apoptotic protease cascade. Cell 91: 479-489;
Acehan D, Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW (2002)
Three-dimensional structure of the apoptosome:
implications for assembly, procaspase-9 binding, and
activation. Mol Cell 9: 423-432; Rodriguez J,
Lazebnik Y (1999) Caspase-9 and
APAF-1 form an active holoenzyme. Genes Dev 13:
3179-3184; Srinivasula SM, Ahmad M,
Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES (1998)
Autoactivation of procaspase-9 by
Apaf-1-mediated oligomerization. Mol
Cell 1: 949-957]. En este complejo
macromolecular la caspasa-9 asociada al apoptosoma
se activa y entonces, a su vez, activa las caspasas efectoras. Para
identificar moléculas que pudieran mejorar la apoptosis relacionada
a enfermedades, los esfuerzos de desarrollo de fármacos se han
centrado inicialmente en la actividad de la caspasa
[US694951682; US694302282; US687874382; US685268782; Scott CW,
Sobotka-Briner C, Wilkins DE, Jacobs RT, Folmer JJ,
Frazee WJ, Bhat RV, Ghanekar SV, Aharony D (2003) Novel small
molecule inhibitors of caspase-3 block cellular and
biochemical features of apoptosis. J Pharmacol Exp Ther 304:
433-440; Garcia-Calvo M, Peterson
EP, Leiting B, Ruel R, Nicholson DW, Thornberry NA (1998)
Inhibition of human caspases by peptide-based and
macromolecular inhibitors. J Biol Chem 273:
32608-32613] más que en la activación.
No obstante, las interacciones
proteína-proteína al principio de la ruta de
activación de caspasas también pueden ser puntos de intervención
importantes para el desarrollo de moduladores de las rutas de
apoptosis. En particular, datos recientes proponen la formación del
apoptosoma como una diana interesante para el desarrollo de
moduladores apoptóticos [Zhu S, Stavrovskaya IG, Drozda M, Kim
BY, Ona V, Li M, Sarang S, Liu AS, Hartley DM, Wu du C, Gullans S,
Ferrante RJ, Przedborski S, Kristal BS, Friedlander RM (2002)
Minocycline inhibits cytochrome c release and delays progression of
amyotrophic lateral sclerosis in mice. Nature 417:
74-78; Wang X, Zhu S, Drozda M, Zhang W,
Stavrovskaya IG, Cattaneo E, Ferrante RJ, Kristal BS, Friedlander
RM, Kim BY, Ona V, Li M, Sarang S, Liu AS, Hartley DM, Wu du C,
Gullans S, Przedborski S (2003) Minocycline inhibits
caspase-independent and -dependent mitochondrial
cell death pathways in models of Huntington's disease. Proc Natl
Acad Sci U S A 100: 10483-10487; Mochizuki H,
Hayakawa H, Migita M, Shibata M, Tanaka R, Suzuki A,
Shimo-Nakanishi Y, Urabe T, Yamada M, Tamayose K,
Shimada T, Miura M, Mizuno Y (2001) An AAV-derived
Apaf-1 dominant negative inhibitor prevents MPTP
toxicity as antiapoptotic gene therapy for Parkinson's disease.
Proc Wat/ Acad Sci U S A 98: 10918-10923; Martin
AG, Fearnhead HO (2002) Apo cytochrome c blocks
caspase-9 activation and Bax-induced
apoptosis. J Biol Chem 277: 50834-50841].
En ausencia de información estructural
detallada, los métodos convencionales usados para la identificación
de moduladores del apoptosoma se han basado en medidas indirectas
de la activación inducida por el citocromo-c y dATP de
actividad similar a la caspasa-3 en extractos
citosólicos definidos [Lademann U, Cain K,
Gyrd-Hansen M, Brown D, Peters D, Jaattela M (2003)
Diarylurea compounds inhibit caspase activation by preventing the
formation of the active 700-kilodalton apoptosome
complex. Mol Cell Biol 23: 7829-7837; Nguyen JT,
Wells JA (2003) Direct activation of the apoptosis machinery as a
mechanism to target cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100:
7533-7538]. Usando esta metodología, Lademann
et al. [Lademann U, Cain K, Gyrd-Hansen
M, Brown D, Peters D, Jaattela M (2003) Diarylurea compounds
inhibit caspase activation by preventing the formation of the
active 700-kilodalton apoptosome complex. Mol Cell
Biol 23: 7829-7837] han identificado
inhibidores del apoptosoma mediante la selección de pequeñas
moléculas usando extractos citosólicos de células seleccionadas
mientras que Nguyen et al. [Nguyen JT, Wells JA (2003)
Direct activation of the apoptosis machinery as a mechanism to
target cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100:
7533-7538] anunciaron la identificación de
activadores. En ninguno de estos se ejemplos se ha demostrado una
unión directa a ninguna de las proteínas que forman el apoptosoma,
como por ejemplo Apaf-1.
En la presente invención comenzó con un estudio
y determinación de un programa de desarrollo empleando un
apoptosoma activo reconstituido in vitro formado a partir de
sus proteínas recombinantes constituyentes. En la presente invención
se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad
química y/o farmacéuticamente eficaz de al menos un compuesto
seleccionado del grupo formado por un compuesto de fórmula general
(I), y/o un compuesto de fórmula general (II) y/o un compuesto de
fórmula general (III) y al menos un excipiente o adyuvante química
y/o farmacéuticamente aceptable, la composición se caracteriza por
inhibir de forma selectiva al factor de activación de apoptosis 1
(Apaf-1).
Estos compuestos de formula general (I) y (II)
y/o sus productos derivados optimizados para ser transportados al
citosol celular son eficaces inhibiendo la apoptosis en modelos
celulares y por tanto tienen utilidad terapéutica. Por esta razón
en el presente documento se describe la identificación de compuestos
que inhiben la activación mediada por el apoptosoma de la
procaspasa-9 a partir de la selección de grupos
funcionales de potencial actividad a partir de una quimioteca de
N-alquilglicinas. Los grupos funcionales insertados
en distintos esqueletos químicos y oportunamente optimizados
generan moléculas que se unen e inhiben de forma selectiva y
específica la actividad tanto de Apaf-1 recombinante
como de Apaf-1 endógeno humano. El mecanismo
molecular de actividad determinado en la presente invención es no
competitivo con citocromo-c e inhibe el reclutamiento de la
procaspasa-9 al apoptosoma. Estos ligandos o
compuestos de fórmula general (I) y (II) específicos de
Apaf-1 identificados disminuyen el fenotipo
apoptótico en modelos celulares de apoptosis mediada por
mitocondria.
Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente, el
diseño de moléculas sintéticas dirigidas al reconocimiento de
superficies proteicas y que posean la capacidad de modular
interacciones proteína-proteína de relevancia
biológica es considerado como uno de los mayores retos de la
biotecnología en el punto de confluencia entre la Química y la
Biología y de un enorme potencial en la terapéutica.
En particular la modulación de interacciones
proteína-proteína que regulan el proceso de muerte
celular programada (apoptosis) mediante la identificación de
inhibidores puede ser de relevancia para aplicaciones terapéuticas.
Se han descrito numerosos procesos patológicos en los que está
implicada la apoptosis, incluyendo a modo de ejemplo y de forma no
limitativa: isquemia cerebral, traumatismos, daño cerebral, daño en
médula espinal, meningitis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy,
esclerosis múltiple, afecciones relacionadas con priones, infarto de
miocardio, así como otras formas de enfermedades crónicas o agudas
de corazón, transplante de órganos; también se ha relacionado con
estados patológicos relacionados con hepatitis alcohólica y otras
posibles aplicaciones se pueden relacionar con tratamientos de
alopecia.
La presente invención proporciona una solución
sencilla, eficaz y sin riesgos para inhibir de forma selectiva y
efectiva Apaf-1 y de este modo inhibir los
mecanismos de apoptosis celular.
Por lo tanto, un primer aspecto de esta
invención se refiere una composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular que contiene una cantidad química
y/o farmacéuticamente eficaz de al menos un compuesto de fórmula
general (I), y/o un compuesto de fórmula general (II) y/o un
compuesto de fórmula general (III) capaz de inhibir de forme
afectiva y selectiva Apaf-1.
La apoptosis es un proceso clave para el
correcto funcionamiento de diferentes sistemas biológicos entre los
que se incluyen el recambio celular normal, el sistema
inmunológico, el desarrollo embrionario y la muerte celular inducida
por diferentes agentes químicos [Nicholson, 2000 From bench to
clinic with apopotosis-based therapeutic agents.
Nature 407, 810-816]. Pero si se desencadena el
proceso en un momento inapropiado puede inducir la muerte en
células cruciales.
Actualmente, es bien conocido que en el control
de la apoptosis es determinante el papel de la mitocondria y la
regulación dependiente de tres tipos de proteínas: las proteínas de
la familia Bcl-2
(P-Bcl-2), el factor regulador de
apoptosis Apaf-1 y las caspasas. Estas últimas son
proteasas de cisteína y se consideran como las auténticas efectoras
del proceso a través de la hidrólisis de proteínas clave para el
mantenimiento funcional de la célula [Thornberry, 1998 Caspases:
enemies within. Science, 281, 1312-1316].
La proteína Apaf-1 posee un
papel importante y está implicada en la activación de caspasas
mediante un mecanismo dependiente de la liberación de
citocromo-c (Cc) desde la mitocondria [Zou,H.,
Henzel, W.J., Liu, X., Lutschg, A., and Wang, X. 1997
Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans
CED-4, participates in cytochrome
c-dependent activation of caspase-3.
Cell, 90, 405-413]. Como consecuencia de la
perturbación de la mitocondria como señalización de inicio del
proceso de apoptosis se produce la liberación de Cc, que una
vez en el citosol interacciona con Apaf-1. Este
complejo (citocromo-c-Apaf-1) puede catalizar
el autoprocesamiento de caspasa-9 [Zou, H.,
Yang, R., Nao, J., Wang, J., Sun, C., Fesik, S.W., Wu, J. C.,
Tomaselli, K.J. and Amstrong, R.C. 2003 Regulation of the
Apaf-1/caspase-9 apoptosome by
caspase-3 and XIAP. J. Biol. Chem, 278,
8091-8098] la cual una vez activada puede a su
vez activar a otras caspasas, como por ejemplo a
caspasa-3. A partir de ese momento el destino de la
célula es ya irreversible y se produce la hidrólisis de proteínas
clave y la célula es destinada a una muerte no necrótica y sin
activación de procesos inflamatorios.
Por esta razón la inhibición de
Apaf-1 es de relevancia para la inhibición de la
activación del proceso de apoptosis y por ello, el objetivo de la
presente invención es proporcionar una composición farmacéutica con
capacidad inhibidora selectiva y específica de
Apaf-1.
En la presente invención se describe una
composición farmacéutica que comprende una cantidad química y/o
farmacéuticamente eficaz de compuestos de fórmula general (I) y
(II) como inhibidores selectivos de Apaf-1. Este
compuesto de formula general (I) y (II) como y/o sus productos
derivados optimizados para ser transportados al citosol celular es
eficaz inhibiendo la apoptosis en modelos celulares y por tanto
pueden tener utilidad tera-
péutica.
péutica.
Es conocido que la apoptosis es un proceso
biológico que guarda relación con estados de enfermedad humana y
que está fuertemente regulado a través de la formación de complejos
proteína-proteína. Estos complejos representan
puntos de intervención química interesantes para el desarrollo de
moléculas que podrían modular la apoptosis celular. El apoptosoma
es un complejo multiproteico holoenzimático formado por
Apaf-1 (factor de activación de apoptosis 1)
activado por citocromo-c (factor activador de la proteasa
apoptótica), dATP y procaspasa-9 que relaciona la
disfunción mitocondrial con la activación de las caspasas efectoras
y a su vez, resulta de interés para el desarrollo de moduladores
apoptóticos y composiciones farmacéuticas que los contengan. En la
presente invención se describen una serie de compuestos química y/o
farmacéuticamente aceptables, la composición que los contiene y la
identificación de los mismos como inhibidores de la activación de
procaspasa-9 mediada por apoptosoma mediante la
selección a partir de una biblioteca química o quimioteca.
Cuando comenzó el estudio de moléculas capaces
de inhibir la apoptosis celular de la presente invención se
determinó que existía una problemática relacionada con el mecanismo
de apoptosis. Anteriormente a esta invención existían patentes
[US6949516B2, US6943022B2, US6878743B2, US6852687B2] que
protegen compuestos inhibidores de apoptosis mediante un mecanismo
de inhibición de caspasas pero ninguno de éstos era un inhibidor
específico y selectivo de Apaf-1. También existen
patentes anteriores en el estado de la técnica [ES200002414]
que protegen compuestos inhibidores de apoptosis mediante un
mecanismo de bloqueo de receptores de L-glutamato
que no tiene nada que ver con el efecto sorprendente que aquí
reivindicamos de compuestos inhibidores específicos y selectivos de
Apaf-1. En este sentido, la presente invención
pretende dar solución a este problema y describe una composición
farmacéutica con capacidad inhibidora selectiva y específica de
Apaf-1 y que por consiguiente permite inhibir la
apoptosis celular de una forma monitorizada y controlada.
Las moléculas activas de fórmula general (I) y
(II) fueron identificadas a partir de la deconvolución subsiguiente
al cribado de una quimioteca de N-alquilglicinas,
seguida de optimización química de las moléculas activas
identificadas para obtener moléculas que capaces de formar uniones
tanto con Apaf-1 recombinante como con
Apaf-1 endógeno humano en un mecanismo no
competitivo con el citocromo-c que inhibe la recuperación de
la procaspasa-9 por el apoptosoma. Estos ligandos
de Apaf-1 o moléculas de fórmula general (I) y (II)
han sido recientemente identificados y se ha determinado que
sorprendentemente disminuyen el fenotipo apoptótico en modelos
mediados por mitocondrias de apoptosis celular.
Figuras 1 y
2
rApaf-1 fue purificado en
Ni^{2+}-NTA-agarosa y en un
segundo paso de purificación rApaf-1 (5 \mug) fue
pasado a través de una columna Superose-6
H-R y eluido (perfil de elución muestra una línea
negra delgada; registrándose mAU a 280 nm) en 50 mM NaCl, Hepes 20
mM pH 7.0, 0.1% Chaps, 5% sucrosa, 5 mM DTT, tasa de flujo 0.5
ml/min. Las fracciones fueron recogidas (0.5 ml) y una alícuota de 5
\mul fue usada para la medida de actividad DEVDasa (ver línea
fina circundada en la figura 1). A todas las fracciones del
panel A se les hizo un ensayo inmunoblott usando un
anticuerpo monoclonal contra Apaf-1. Las posiciones
de elución de los marcadores están indicadas mediante flechas (ver
figura 2).
Figura
3
La activación del Apoptosoma dependiente de la
procaspasa-9 fue seguida mediante incubación in
vitro transcrito-traducido de
[^{35}S]-Met procaspasa-9,
rApaf-1, citocromo c y las diferentes
mezclas fabricando la librería tal cual está descrita en la
invención. La procaspasa-9 fue activada
proteolíticamente en sus subunidades grande y pequeña en presencia
de rApaf-1 y citocromo c (carril 3) pero no
en ausencia de rApaf-1 (carril 1) o citocromo
c (carril 2). Carriles 4 a 12 muestran ejemplos
representativos de la secuenciación de las mezclas de la librería a
una concentración final de 0.2 mg/ml. Mezclas 12 y 14 (carriles 6 y
7, respectivamente) pero no otras mezclas, inhibieron el
procesamiento de la procaspasa-9.
Figura
4
Cada barra en el panel representa el
1/(porcentaje de actividad) por cada mezcla de peptoide, con el eje
X representando la posición definida amino (O). Cada sublibrería
está representada en color: las barras negras son los valores para
las mezclas con la primera posición definida (OXX), las barras
grises y blancas son para XOX y XXO, respectivamente.
Figura
5
Peptoide 1a y peptoide 1b son medidos en una
concentración dependiente de la capacidad para inhibir el
apoptosoma dependiente de la activación de la
procaspasa-9.
Figura
6
En el panel de la izquierda: Traducción
in vitro de [^{35}S]-Met
procaspasa-9 y procaspasa-3 fueron
incubadas en presencia de rApaf-1, citocromo c y en
presencia o ausencia del peptoide 1a (20 \muM).
En el panel de la derecha: Traducción
in vitro de procaspasa-9 y
[^{35}S]-Met procaspasa-3 fueron
incubados en presencia de rApaf-1, citocromo
c y en presencia o ausencia del peptoide 1a.
Figura
7
La actividad de DEVDasa en extractos FT fue
medida en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de
ambos peptoides 1a (\Box) y el peptoide 1b (\blacklozenge).
rApaf-1 fue incubada con los peptoides a 30ºC
durante 30 min y combinados con alícuotas de 5 \mul del extracto
de FT. La actividad de DEVDasa fue medida y seguida mediante un
control positivo (100% de actividad).
Figura
8
A una solución 60 nM del peptoide 1a en un
tampón A fue tritiada (tratada con tritio) con incremento de
concentraciones de rApaf-1 (\sqbullet), citocromo
c (\blacklozenge), RNAasa A (\medcirc), tetramesisación
sintética en el dominio de p53 (\medbullet), aldolasa (\Box),
catalasa (\lozenge) y polarización de fluorescencia fue medida a
30ºC. Los datos (medio s.d.; n=3) fueron tomados en unidades de
millipolarización (mP) y ajustados a un modelo de 2 puntos de
unión.
Figura
9
La activación del apoptosoma dependiente de la
procaspasa-9 fue seguida mediante incubación in
vitro transcrito-traducción
[^{35}S]-Met de la procaspasa-9 y
rApaf-1 en presencia o ausencia del peptoide 1a (20
\muM) a diferentes concentraciones del citocromo c.
Figura
10
Tres ejemplos diferentes de preparación de
rApaf-1 fueron usados en conjunción con alícuotas
FT de células lisadas para determinar la actividad de procesamiento
de la caspasa mediante la medición de la actividad DEVDasa. Ejemplo
a, contiene rApaf-1 pero no citocromo c;
ejemplo b y ejemplo c contienen rApaf-1, citocromo
c y dATP en ausencia (b) o en presencia (c) del peptoide 1a
(50 \muM) que fue incubado con rApaf-1 durante 30
min s 30ºC previa adición de las alícuotas de FT.
Figura
11
Ejemplos a, b y c fueron aplicados a una columna
Superosa 6 H-R y las fracciones eluidas fueron
usadas en conjunción con alícuotas de FT para determinar la
actividad DEVDasa (diamantes, cuadrados rellenos y triángulos
blancos denotan actividad para las fracciones de los ejemplos a, b
y c, respectivamente). La actividad DEVDasa de las alícuotas de la
fracción 22 fueron también determinadas en ausencia (F22) o en
presencia del peptoide 1a (F22 + peptoide 1a).
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Figura
12
rApaf-1-mediada
por ensayos pull-down de
procaspasa-9. Alícuotas de los ejemplos a, b y c
fueron combinadas con una alícuota de 5 \mul de una reacción in
vitro de traslación de [^{35}S]-Met
no-fraccionada procaspasa-9 (mutante
D315/330A de la procaspasa-9) y mezclado con gotas
de Ni^{2+}-NTA-agarosa. Después de
la centrifugación el material eluido desde las gotas fue unido a
SDS-PAGE. Carril 1, Control no
rApaf-1; carril 2 a 4, recuperación de los ejemplos
a, b y c, respectivamente.
Figura
13
El peptoide 1a inhibe Apaf-1
humano endógeno mediante la activación de las caspasas. 3 \mul de
alícuotas del extracto F1 fueron incubados a 30ºC durante 15 min en
presencia o ausencia del peptoide 1a (50 \muM) y luego combinado
con alícuota de 5 \mul del extracto FT, 1 mM dATP y
posteriormente incubado a 37ºC durante 30 min. La actividad DEVDasa
fue medida para cada uno de los dos ejemplos (F1 y F1 + peptoide
1a) y para un control negativo buffer A.
Figura
14
Células U937 fueron cultivadas en ausencia
(barras blancas) o en presencia de doxorubicina 0.5 \muM (barras
negras), o doxorubicina 0.5 \muM plus peptoide de penetración
GG-peptoid 1, 5 \muM (barras grises suaves), o
doxorubicina 0.5 \muM plus ciclo-peptoide 1a, 5
\muM (barras grises oscuras). La apoptosis fue evaluada mediante
citometría de flujo como el porcentaje de células expuestas a
fosfatidilserina (anexina V-PE positiva) y bajo
\Delta\psi_{m} (\Delta\psi_{m}^{low}).
Figura
15
Análisis mediante citometría de flujo expuesto a
PS y \Delta\psi_{m} de células tratadas con los mismos
procedimiento que en la figura 14. En el control izquierdo,
doxorubicina, doxorubicina con peptoide de penetración GG 1, y
doxorubicina con ciclo-peptoide 1a,
respectivamente. Los números se refieren a los porcentajes de
células en las diferentes regiones.
Figura
16
Células Saos-2 fueron cultivadas
en ausencia (control) o en presencia de doxiciclina 2 \muM (Doxi)
o doxyciclina 2 \muM con el peptoide PGA-GG 1 20
\muM (Doxi + peptoide PGA-GG- 1) a tiempos de
incubación de 24 horas (barras grises), 48 horas (barras blancas) y
72 horas (barras negras). La actividad de la caspasa 3 en extractos
de células Saos-2 fueron medidas mediante ensayos
de fluorometría DEVDasa.
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan aquí sirven para ilustrar la naturaleza de la presente
invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines
ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la
invención que aquí se reivindica.
Para identificar inhibidores directos del
apoptosoma, primero expresamos y purificamos el
rApaf-1 con cola de His. La proteína
rApaf-1 se purificó con cromatografía de afinidad a
Ni^{2+} seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. La
absorción UV (a 280 nm) mostró que la proteína eluía como un único
pico principal y con un peso molecular aparente de aproximadamente
150 kDa (ver figura 1), lo que concuerda con el tamaño de
Apaf-1 monomérico [Zou H, Henzel WJ, Liu X,
Lutschg A, Wang X (1997) Apaf-1, a human protein
homologous to C. elegans CED-4, participates in
cytochrome c-dependent activation of
caspase-3. Cell 90: 405-413; Zou H,
Yang R, Hao J, Wang J, Sun C, Fesik SIN, Wu JC, Tomasellí KJ,
Armstrong RC (2003) Regulation of the
Apaf-1/caspase-9 apoptosome by
caspase-3 and XIAP. J Biol Chem 278:
8091-8098]. Entonces se ensayó si las
fracciones obtenidas de la cromatografía de exclusión por tamaño
activaban caspasas mezclándolas con FE, una fracción de extractos de
células 293 que no contiene Apaf-1 pero contiene
caspasa-9, caspasa-3 y
citocromo-c [Martin AG, Fearnhead HO (2002) Apo
cytochrome c blocks caspase-9 activation and
Bax-induced apoptosis. J Biol Chem 277:
50834-50841; Fearnhead HO, Rodriguez J, Govek EE,
Guo W, Kobayashi R, Hannon G, Lazebnik YA (1998)
Oncogene-dependent apoptosis is mediated by
caspase-9. Proc Natl Acad Sci U S A 95:
13664-13669]. Como muestra la figura 1, la
activación de la caspasa se desencadenó mediante una fracción
correspondiente a 150 kDa. Finalmente, la presencia de
Apaf-1 en esta fracción se confirmó por
inmunotransferencia (ver figura 2).
Los derivados trímeros, pentámeros,
fluorescentes de N-alquilglicina, la quimioteca y
los compuestos 3,7,
dioxo-[1,4]diazepan-5-sustituidos
se sintetizaron siguiendo procedimientos similares a los descritos
previamente [Masip, 1., Cortés, N., Abad, M.J., Guardiola, M.,
Perez-Paya E., Ferragut, J.,
Ferrer-Montiel, A., and, Messeguer A (2005) Design
and síntesis o fan optimised positional scanning library of
peptoids: identification of novel multidrug resistance reversal
agents. Bioorg. Med. Chem. 13: 1929-1936].
\global\parskip1.000000\baselineskip
La molécula híbrida
penetratina-GG-peptoide 1, también
denominada PEN-GG-peptoide 1,
denominada de este modo porque es un derivado de la estructura
química del peptoide 1 fusionado a un péptido sintético descrito
como agente permeabilizador de células (penetratin®) se preparó por
medio de una síntesis en fase sólida basada en Fmoc- en un
sintetizador de péptidos de Applied Biosystems modelo 433, en el
que se introdujo la resina con peptidil 1 previamente cargada.
La pureza de los peptoides se confirmó por HPLC
y espectrometría de masas. Los análisis en HPLC se llevaron a cabo
usando una columna Kromasil 100 C8 (15 x 0,46 cm, 5 \mum), con
mezclas de CH_{3}CN/H_{2}O que contienen TFA al 0,1% a 1 ml/min
como fase móvil y monitorizando a 220 nm se encontraron purezas
superiores al 80% para todos los peptoides individuales. Se
obtuvieron los espectros de masas de alta resolución (HRMS) en el
Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad de Santiago
de Compostela (España).
Para sintetizar el conjugado
PGA-GG-peptoide 1, denominado de
este modo por tratarse de un compuesto en el que el peptoide 1 se
fusiona covalentemente a un polímero biocompatible denominado
poliglutámico (PGA), se usó la sal sódica del ácido poli
(L-glutámico) con un peso molecular (M_{w}) de
unos 20000 Da (Sigma) como vehículo.
NH_{2}-GG-peptoide
1 se conjugó al vehículo de PGA mediante un enfoque de acoplamiento
mediado por una carbodiimida. Para detener la reacción, la mezcla se
vertió en cloroformo. El precipitado resultante se recogió y secó
al vacío para obtener 20 mg de conjugado
polímero-fármaco (98%). La sal de sodio del
conjugado PGA-peptoide se obtuvo disolviendo el
producto en NaHCO_{3} 1,0 M.
La solución acuosa de conjugado
PGA-peptoide se dializó frente a agua destilada
(M_{W}CO 12,000) y se liofilizó para dar el conjugado esperado con
un 22% (p/p) de carga del peptoide según se determinó por UV.
Apaf-1
recombinante-XL (rApaf-1) se obtuvo
como se describe [Zou H, Li Y, Liu X, Wang X (1999) An
APAF-1 cytochrome c multimeric complex is a
functional apoptosome that activates procaspase-9.
J Biol Chem 274: 11549-11556]. Brevemente, el
ADNc de Apaf-1 (generosamente proporcionado por G.
Nuñez, Universidad de Michigan) se subclonó en el vector pFastBac 1
con una cola de 9 His en el extremo C-terminal. El
plásmido de expresión se transformó en células de Escherichia
coli DF10Bac. Los bácmidos recombinantes se purificaron tal como
recomienda el fabricante (Invitrogen) y se usaron para transfectar
células de insectos SF9. La reserva de virus se amplificó y se usó
para infectar cultivos en suspensión. Las células infectadas se
recogieron tras 40 horas, se lavaron en PBS fría, y se
resuspendieron en 5 volúmenes de solución tampón A
(HEPES-KOH 20 mM, pH 8,0, KCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5
mM, DTT 1 mM) complementado con Complete Protease Inhibitor
Cocktail (Roche) (Inhibidor de proteasa completo). Las células se
lisaron con un homogeneizador Dounce (homogeneizador mecánico) y la
proteína recombinante se purificó usando una columna de
Ni-NTA
(Ni^{2+}-nitrilotriacetato)-agarosa.
La proteína recombinante rApaf-1
eluída se concentró por filtración usando membranas Microcon YM10
(Millipore), se dializó frente al tampón A y se almacenó en
múltiples partes alícuotas que contenían glicerol al 20% a -80ºC
tras congelación repentina en nitrógeno líquido.
Los ensayos se llevaron a cabo incubando 200 ng
de rApaf-1 purificado con 30 ng de
citocromo-c de corazón de caballo
(Sigma-Aldrich), 3 \mul de
procaspasa-9 marcada en
[^{35}S]-Met traducida in vitro (obtenida
usando el kit TNT de Promega), dATP 0,1 mM, en un volumen total de
20 \mul de tampón A (HEPES-KOH 20 mM, pH 7,5, KCl
10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM NaEDTA 1 mM, NaEGTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF
0,1 mM). Las muestras se incubaron a 30ºC durante 1 hora y las
proteínas se resolvieron por SDS-PAGE. Los geles se
secaron y el tratamiento de la caspasa-9 se detectó
mediante obtención de imágenes en un sistema de detección y
cuantificación de la radiactividad Fujifilm
FLA-3000. Para la selección de la quimioteca
combinatoria y los compuestos finales definidos, cada mezcla de la
quimioteca (en una concentración final de 0,2 mg/ml) o compuesto
definido (en las concentraciones detalladas en el texto y las
figuras) se preincubó con rApaf-1 durante 30
minutos a 30ºC en un volumen total de 16 \mul antes de añadir el
citocromo-c, y la procaspasa-9 marcada en
[^{35}S]-Met traducida in vitro y se evaluó
el tratamiento de la caspasa-9 tal como se
describió anteriormente.
Se cultivaron células 293 (línea celular de
riñón de embrión humano), en un medio Eagle modificado por Dulbecco,
10% de suero bovino fetal en 10% de CO_{2}. Las células se
sembraron en placas de 15 cm con 1-2 x 10^{6}
células por placa y se recogieron cuando fueron confluentes
(aproximadamente 10^{7} células por placa). Se prepararon
extractos de S-100 de células 293 a partir de 2 x
10^{8} células y se fraccionaron básicamente tal como se describe
[Fearnhead HO, Rodriguez J, Govek EE, Guo W, Kobayashi R, Hannon
G, Lazebnik YA (1998) Oncogene-dependent apoptosis
is mediated by caspase-9. Proc Natl Acad Sci U S A
95: 13664-13669]. Brevemente, el
fraccionamiento de los extractos se llevó a cabo por una
cromatografía de intercambio iónico usando una columna
Mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech). Se separó un
extracto de S-100 en tres fracciones (F1, F2 y FE)
y su composición se confirmó por inmunotransferencia. F1 (5 \mug
de proteína/\mul) contenía Apaf-1 y FE (30 \mug
de proteína/\mul) contenía caspasas-3 y -9, y
citocromo-c. Ninguna de estas fracciones presentaba
actividad de caspasa, pero una combinación de F1 y FE reconstituyó
la activación de la caspasa.
La línea celular de linfoma histiocítico humano
U937 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Colección
Americana de Cultivos Tipo) (Rockville, MD). Las células se
hicieron crecer en suspensión en un medio RPMI-1640
(Cellgro; Fischer Scientific) complementado con 10% de suero bovino
fetal (FCS; Omega Scientific), penicilina (100 \mug/ml),
estreptomicina (100 \mug/ml) y L-glutamina 2 mM
(Gibco, RU). Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera de
5% de dióxido de carbono y 95% de aire y se sometieron a pases dos
veces por semana. La línea celular Saos-2 y FER
fueron amablemente proporcionadas por Karin Vousden (Cancer
Research RU, Glasgow). Las células se hicieron crecer en un medio
Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO) complementado con 10% de
suero bovino fetal (SFT, GIBCO). Las células se mantuvieron a 37ºC
en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire.
Los extractos de Saos-2 se
prepararon de células sembradas en placas de 3,5 cm con 1x10^{5}
células por placa. Tras diferentes tratamientos, las células se
recogieron y los sedimentos se resuspendieron en 30 \mul de
tampón de extracción (PIPES 50 mM, KCl 50 mM, EGTA 5 mM, MgCl_{2}
2 mM, DTT 2 mM complementado con cóctel inhibidor de proteasa de
Sigma) y se mantuvieron en hielo durante 5 minutos. Tras repetir 3
veces el proceso de congelación y descongelación, los lisados
celulares se centrifugaron a 14000 rpm durante 5 minutos se
recogieron los sobrenadantes. La cuantificación de la concentración
total de proteína de estos extractos de células se llevó a cabo
usando el método de ácido bicinconínico (Pierce).
Se añadió rApaf-1
(5-10 ng) a la fracción FE (5 \mul) y se incubó
con ATP o dATP 1 mM a 37ºC durante 30 min. Entonces, una parte
alícuota de 3 \mul se mezcló con 200 \mul de solución tampón de
ensayo de caspasa (PBS, glicerol al 10%, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM) que
contiene Ac-DEVD-afc 20 \muM
(Biomol). La actividad de la caspasa se monitorizó continuamente
siguiendo la liberación de afc fluorescente a 30ºC usando un
fluorímetro Cytofluor 4000 (\lambdaexc = 400 nm; \lambdaem = 508
nm). La actividad de la DEVDasa se expresó bien como un incremento
de las unidades de fluorescencia relativa por minuto
(\DeltaFU/min) o como un porcentaje del valor de la señal de
fluorescencia inicial obtenido en ausencia de inhibidor cuando se
evaluó la actividad inhibidora de los compuestos.
Se realizó un ensayo de MTT de viabilidad para
medir la recuperación de las células de osteosarcoma humano
Saos-2. Las células Saos-2 se
sembraron en placas de microtítulo con 96 pocillos estériles con
una densidad de sembrado de 10^{5} células/ml y se preincubaron
durante 24 h. Se les añadió entonces doxiciclina (2 \mug/ml en
PBS) y tras 30 min también se añadieron los compuestos a analizar
(esterilizados con filtros de 0,2 \mum) para dar una concentración
final de 5-20 \muM
fármaco-equivalentes. Tras 19 h, 43 h y 67 h de
incubación, se añadió MTT (20 \mul de una solución de 5 mg/ml) en
cada pocillo, y las células se incubaron durante otras 5 h. Tras
retirar el medio, los cristales de formarán precipitados se
disolvieron en DMSO (100 \mul), y las placas se leyeron a 570 nm
usando una estación de trabajo Wallac 1420.
Se incubó rApaf-1 (5 \mug) en
ausencia o presencia de citocromo-c (1 \muM) a 30ºC
durante 15 min con ATP (1 mM) en el tampón A, se cargó en una
columna de Superose-6 de Alta Resolución (High
Resolution, H-R) (Amersham Pharmacia Biotech) y se
eluyó con NaCl 50 mM, HEPES-KOH 20 mM pH 7,0,Chaps
al 0,1%, sacarosa al 5%, DTT 5 mM, velocidad de flujo de 0,5
ml/min. Se recogieron las fracciones (de 0,5 ml) y para determinar
cuales activaban las caspasas, 4 \mul de cada fracción se
mezclaron con FE (5 \mul) y se incubaron a 37ºC durante 30
minutos, tras ese tiempo la actividad de caspasa se determinó tal
como se describió anteriormente.
Se incubaron 250 ng de rApaf-1
con peptoide 1a o tampón A durante 30 min a 30ºC en un volumen de
reacción total de 20 \mul.
Entonces se añadieron ATP 1 mM, citocromo
c 1 \muM y una alícuota de 5 \mu de una reacción
traducida in vitro de procaspasa-9 marcada en
[^{35}S]-Met no escindible
(procaspasa-9 mutante D315/330A) [Bratton SB,
Walker G, Roberts DL, Cain K, Cohen GM (2001)
Caspase-3 cleaves Apaf-1 into an
approximately 30 kDa fragment that associates with an
inappropriately oligomerized and biologically inactive
approximately 1.4 MDa apoptosome complex. Cell Death Differ 8:
425-433] y se continuó la incubación durante
otros 30 min a 37ºC. La reacción se diluyó 1:10 en tampón A frío y
se usaron 20 \mul de perlas de
Ni^{2+}-NTA-agarosa para disociar
los complejos de rApaf-1 durante 1 h a 4ºC. Tras
tres lavados con solución tampón A fría, las muestras se
resolvieron con SDS-PAGE y la
caspasa-9 se detectó por autorradiografía.
Las medidas de polarización por fluorescencia se
realizaron en un contador modelo Victor2 V 1420 Multilabel HTS®.
Una disolución 60 nM de peptoide 1a marcado con
5'-6'-carboxifluoresceína (llamado
peptoide f1a; \lambda_{exc} = 480 nm; \lambda_{em} = 535 nm)
en tampón A (el volumen de reacción total era de 200 \mul) se
valoró con disoluciones de proteínas concentradas. Los datos se
grabaron usando un programa Wallac 1420 Workstation®. Los valores de
Kd se calcularon usando un modelo de dos estados.
Se trataron células U937 en placas con 24
pocillos (1 ml/pocillo) durante los tiempos indicados, con
doxorrubicina 0,5 \muM. En los ensayos de inhibición de la
apoptosis, las células se trataron con
penetratina-GG-peptoide 1 o
compuestos 3,7, dioxo-[1,4] diazepánicos-C5
sustituidos 5 \muM. La apoptosis se analizó por citometría de
flujo determinando los cambios en la dispersión hacia delante y
lateral de la célula y determinando simultáneamente la exposición
de fosfatidilserina (PS) y la pérdida de potencial de membrana
mitocondrial (\Delta\Psim) con anexina V-PE
(Caltag) y DiOC6 (3) (sondas moleculares), respectivamente.
Selección de una quimioteca de exploración de la
posición de peptoides como fuente para inhibidores de
apoptosoma
Los oligómeros de
N-alquilglicinas, también conocidos como peptoides,
constituyen una familia de moléculas no naturales atractiva para el
proceso de desarrollo de fármacos debido a su amplia variedad de
actividades biológicas y a la estabilidad proteolítica que
demuestran [Simon RJ, Kania RS, Zuckermann RN, Huebner VD,
Jewell DA, Banville S, Ng S, Wang L, Rosenberg S, Marlowe CK,
Spellmeyer DC, Tan R, Frankel AD, Santi DV, Cohen FE, Bartlett PA
(1992) Peptoids: a modular approach to drug discovery. Proc Natl
Acad Sci USA 89: 9367-9371; Burkoth TS, Beausoleil
E, Kaur S, Tang D, Cohen FE, Zuckermann RN (2002) Toward the
synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic
helical peptoid assembly. Chem Biol 9: 64
7-654].
Se partió de una quimioteca de de trímeros de
N-alquilglicinas [Masip, I., Cortés, N., Abad,
M.J., Guardiola, M., Perez-Paya E., Ferragut, J.,
Ferrer-Montiel, A., and, Messeguer A (2005) Desígn
and síntesis o fan optimised positional scanning library of
peptoids: identification of novel multidrug resistance reversal
agents. Bioorg. Med. Chem. 13: 1929-1936] como
fuente de diversidad química.
La quimioteca consiste en 52 mezclas controladas
y un total de 5120 compuestos. Las mezclas 1 a 20 (O_{1}XX)
contenían como posición definida una de las 20 aminas primarias
seleccionadas disponibles comercialmente, mientras que en las
posiciones "X" (posiciones de mezcla) se usó un conjunto de 16
aminas primarias. Las mezclas 21 a 36 (XO_{2}X) y 37 a 52
(XXO_{3}) contenían en la posición definida sólo el conjunto de
16 aminas. Las mezclas que forman cada
sub-quimioteca se seleccionaron por su capacidad
para evitar la activación de la procaspasa-9
dependiente del apoptosoma. El apoptosoma se reconstituyó in
vitro incubando rApaf-1, citocromo-c,
dATP y procaspasa-9 marcada en
[^{35}S]-Met (como ya se ha descrito). Las
muestras se sometieron a SDS-PAGE y el tratamiento
de caspasa-9 se visualizó posteriormente usando
obtención de imágenes mediante detección y cuantificación de
radioactividad (phospho-imaging). La
procaspasa-9 se procesó únicamente cuando todos los
componentes de la reacción estaban presentes (figura 3) y dependía
del tiempo.
Estos resultados validan el procedimiento de
ensayo. Algunas mezclas definidas de la quimioteca inhibieron la
activación dependiente del apoptosoma (figura 3). La cuantificación
de los resultados para toda la quimioteca se representa en la figura
2B de donde seleccionamos las mezclas más activas para definir los
valores de CI_{50} mediante un ensayo de dilución en serie doble.
Por lo tanto, en la posición "01", los grupos funcionales
seleccionados fueron la 2,4-diclorofeniletilamina
(de la mezcla 12, CI_{50} < 0,05 mg/ml); y la
3,3-difenilpropilamina (de la mezcla 14, CI_{50}
< 0,01 mg/ml); en la posición "O_{2}" la 3,3
difenilpropilamina (de la mezcla 34, CI_{50} < 0,05 mg/ml);
finalmente, en la posición "O_{3}", la
2,4-diclorofeniletilamina (de la mezcla 48,
CI_{50} < 0,05 mg/ml); y la
3,3-difenilpropilamina (de la mezcla 50, CI50 <
0,05 mg/ml) se seleccionaron de nuevo.
Cuando se analizan conjuntamente los datos
derivados del cribado de la quimioteca se deduce la identidad
química de los peptoides bioactivos en la quimioteca [Humet M,
Carbonell T, Masip I, Sanchez-Baeza F, Mora P,
Canton E, Gobernado M, Abad C, Perez-Paya E,
Messeguer A (2003) A Positional Scanning Combinatorial Library of
Peptoids As a Source of Biological Active Molecules: Identification
of Antimicrobials. J Comb Chem 5: 597-605;
Garcia-Martinez C, Humet M,
Planells-Cases R, Gomis A, Caprini M, Viana F, De
La Pena E, Sanchez-Baeza F, Carbonell T, De Felipe
C, Perez-Paya E, Belmonte C, Messeguer A,
Ferrer-Montiel A (2002) Attenuation of thermal
nociception and hyperalgesia by VR1 blockers. Proc Natl Acad Sci U
S A 99: 2374-237]. De ese modo, se sintetizaron
cuatro compuestos diferenciados como trímeros de alquilglicina tal
como se muestran a continuación (peptoides
1-4):
\vskip1.000000\baselineskip
Los cuatro peptoides inhibieron la activación de
la procaspasa-9 dependiente del apoptosoma en
distintas medidas dependiendo de la concentración. Un peptoide de
nuestra colección se utilizó como control negativo. El inhibidor más
potente fue el peptoide 1. No obstante, probablemente debido a la
hidrofobicidad general intrínseca de los cuatro compuestos, se
encontraron problemas de reproducibilidad de un lote a otro de los
peptoides solubilizados. Por tanto se descartan los trímeros de
alquilglicina como posibles inhibidores de Apaf-1.
Se generaron análogos del peptoide 1 más solubles.
La experiencia anterior en el diseño de péptidos
bioactivos [Gonzalez-Navarro H, Mora P, Pastor
M, Serrano L, Mingarro I, Perez-Paya E (2000)
Identification of peptides that neutralize bacterial endotoxins
using beta-hairpin conformationally restricted
librarles. Mol Divers 5: 117-126; Pastor MT, Lopez
de la Paz M, Lacroix E, Serrano L, Perez-Paya E
(2002) Combinatorial approaches: a new tool to search for highly
structured beta-hairpin peptides. Proc Natl Acad Sci
U S A 99: 614-619] sugería que la presencia de
cadenas laterales con cargas positivas en los extremos N y
C-terminal de los péptidos incrementaban la
solubilidad general del péptido sin modificar sus propiedades
conformacionales o biológicas. Además, en nuestra invención hemos
usado un pentámero de N-alquilglicina
N-sustituida compuesto por residuos que contenían un
anillo bencénico simple o un resto amino terciario unido a una
secuencia peptídica para incrementar tanto su solubilidad acuosa
como su permeabilidad en la membrana celular.
Con estos precedentes, se sintetizaron los
pentámeros de alquilglicina denominados peptoide 1a y 1b que
contenían dos residuos de N-alquilglicina
adicionales en los extremos C y N-terminales,
respectivamente, y se probó su actividad in vitro. Estos dos
pentámeros de alquilglicinas inhibieron la activación de la
procaspasa-9 mediada por el apoptosoma con una
reproducibilidad excelente de un lote a otro y una CI_{50}
cercana a 10 \muM.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
El análisis preliminar de la relación
estructura-actividad de la familia sugirió que el
resto diclorofeniletilamina es importante para la actividad. Por
ejemplo, el peptoide 1d, que deriva del peptoide 1b con una
deleción en el extremo C-terminal de una
N-diclorofeniletilglicina tenía una actividad
inhibidora reducida comparada con la del peptoide 1b en el ensayo
de la actividad del apoptosoma in vitro.
El peptoide 1a inhibió el tratamiento de la
caspasa-3 (figura 6) cuando se siguió la actividad
del apoptosoma en presencia de rApaf-1,
citocromo-c, dATP, y tanto la procaspasa-9
marcada en [^{35}S]-Met como
procaspasa-3 marcada en
[^{35}S]-Met traducidas in vitro. Además,
probamos la activación de la caspasa-3 dependiente
del apoptosoma añadiendo rApaf-1 a un extracto de
células que no tenía Apaf-1 [Martin AG,
Fearnhead HO (2002) Apo cytochrome c blocks
caspase-9 activation and Bax-induced
apoptosis. J Biol Chem 277: 50834-50841] y
midiendo la hidrólisis de
Ac-DEVD-afc (actividad de DEVDasa,
figura 7).
Esto confirmó una actividad inhibidora de los
peptoides dependiente de la dosis en este ensayo que se
correspondía con su capacidad para inhibir la formación del
apoptosoma (figura 5). También se observó que la actividad de una
caspasa-3 recombinante en un ensayo in vitro
(Calbiochem) mostró que las propiedades inhibidoras del peptoide 1a
no eran debidas a la inhibición directa de la
caspasa-3.
El apoptosoma se forma cuando siete
heterodímeros de Apaf-1:citocromo-c
oligomerizan para formar una estructura de "rueda" que tiene la
capacidad de reagrupar procaspasa-9 [Acehan D,
Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW (2002)
Three-dimensional structure of the apoptosome:
implications for assembly, procaspase-9 binding,
and activation. Mol Cell 9: 423-432; Bratton SB,
Walker G, Roberts DL, Cain K, Cohen GM (2001)
Caspase-3 cleaves Apaf-1 into an
approximately 30 kDa fragment that associates with an
inappropriately oligomerized and biologically inactivo
approximately 1.4 MDa apoptosome complex. Cell Death Differ 8:
425-433; Qin H, Srinivasula SM, Wu G,
Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES, Shi Y (1999)
Structural basis of procaspase-9 recruitment by the
apoptotic protease-activating factor 1. Nature 399:
549-557; Hill MM, Adrain C, Duriez PJ, Creagh EM,
Martin SJ (2004) Analysis of the composition, assembly kinetics and
activity of native Apaf-1 apoptosomes. Embo J 23:
2134-2145].
Para caracterizar inicialmente el sitio de unión
de los peptoides al apoptosoma, sintetizamos un análogo
fluorescente del peptoide 1a (peptoide f1a). El peptoide f1a se une
al rApaf-1, pero no al citocromo-c y otras
proteínas control (figura 8), con una constante de disociación (Kd)
57 \pm 12 nM determinada en un ensayo de polarización
fluorescente. No obstante, el valor de la constante de unión
contrastaba con la concentración de peptoide 1a que se necesitaba
para inhibir al 50% la actividad de la caspasa en nuestros ensayos
(CI_{50}\sim10 \muM, figura 3C). Una posible explicación para
reconciliar estos datos es que el lisado de reticulocitos usado
para traducir in vitro la procaspasa-9
contenía componentes que disminuían la concentración efectiva del
peptoide 1a. Después evaluamos si el peptoide 1a inhibe la unión
del citocromo-c a rApaf-1.
En el ensayo de polarización de fluorescencia,
la constante de disociación para la interacción
rApaf-1/peptoide-f1a no se vio
influenciada por la presencia de un exceso de hasta 5 veces molar
de citocromo-c. Más aún, también llevamos a cabo el ensayo
de reconstitución del apoptosoma in vitro en presencia de
concentraciones crecientes de citocromo-c. Sin
importar la concentración usada de citocromo-c, el peptoide
1a ejerció su actividad inhibidora de la escisión de la
procaspasa-9 dependiente del apoptosoma (figura 9).
Estos resultados sugieren que el peptoide 1a se une directamente a
rApaf-1 en un sitio de unión distinto al sitio de
unión del citocromo-c e induce un cambio conformacional en
Apaf-1 que impide el procesamiento de
procaspasa-9.
En principio, el peptoide puede haber evitado
cualquiera de las etapas que llevan a la activación de la
caspasa-9, incluida la oligomerización de
Apaf-1 y la unión de procaspasa-9
al apoptosoma [Bratton SB, Walker G, Roberts DL, Cain K, Cohen
GM (2001) Caspase-3 cleaves Apaf-1
into an approximately 30 kDa fragment that associates with an
inappropriately oligomerized and biologically inactive
approximately 1.4 MDa apoptosome complex. Cell Death Differ 8:
425-433].
Para probar qué etapa de unión de la
procaspasa-9 a Apaf-1 y la
consiguiente activación de caspasa se bloqueó,
rApaf-1 se incubó en presencia y ausencia del
peptoide 1a, citocrorno-c y dATP y se evaluó la capacidad
para activar caspasas a partir de lisados de células antes y
después de realizar una cromatografía de filtración en gel en una
columna analítica con
Superose-6-H-R.
Antes de la filtración con gel (figura 10; la muestra a es un
control que sólo contiene extracto de FE) la muestra que contiene
rApaf-1, citocromo-c y dATP (muestra b) pudo
activar caspasas y se inhibía por el peptoide 1a (muestra c).
Alícuotas de las muestras a, b y c se sometieron a cromatografía de
filtración en gel y se evaluó la actividad de DEVDasa de las
fracciones recuperadas (figura 11).
El perfil de elución de la muestra b mostró un
pico principal, con actividad de DEVDasa, centrado en la fracción
22 que corresponde a un tamaño de \sim700 kDa. Esto concuerda con
el tamaño notificado del apoptosoma activo [Cain K, Brown DG,
Langlais C, Cohen GM (1999) Caspase activation involves the
formation of the aposome, a large (approximately 700 kDa)
caspase-activating complex. J Biol Chem 274:
22686-22692; Cain K, Bratton SB, Langlais C, Walker
G, Brown DG, Sun XM, Cohen GM (2000) Apaf-1
oligomerizes into biologically active approximately
700-kDa and inactive approximately
1.4-MDa apoptosome complexes. J Biol Chem 275:
6067-6070]. La actividad de DEVDasa de la
fracción 22 se inhibió en presencia del peptoide 1a (insertado en
figura 11).
\global\parskip1.000000\baselineskip
No obstante, el perfil de elución de la muestra
c mostró una actividad de DEVDasa muy baja cerca de la fracción 18
y no se pudo detectar la presencia de Apaf-1 en
esta fracción por inmunotransferencia (no mostrado). Estos datos
sugieren que en presencia de citocromo-c y dATP, puede
inducirse a rApaf-1 monomérico a formar un complejo
activo de \sim700 kDa.
El peptoide 1a podría unirse al
rApaf-1 en estado de monómero o complejado e
inducir un cambio conformacional en rApaf-1 creando
una conformación poco activa. Para determinar si el apoptosoma
inhibido por el peptoide 1a puede o no reagrupar la
procaspasa-9 llevamos a cabo un experimento de
pull-down o de precipitación por arrastre mediado
por rApaf-1 (figura 12). Una proteína mutante no-
escindible de procaspasa-9 marcada en
[^{35}S]-Met se coprecipitó con
rApaf-1 en presencia de citocromo-c y dATP
(carril 3, figura 12). Sin embargo la presencia del peptoide 1a
impide la unión de procaspasa-9 por el apoptosoma y
no se observa precipitación de ésta (carril 4, figura 12).
Después probamos si el peptoide 1a puede inhibir
Apaf-1 celular igual que inhibe
rApaf-1. Usamos un sistema libre de células obtenido
de células 293 [Fearnhead HO (2001) Cell-free
systems to study apoptosis. Methods Cell Blof 66:
167-185]. Dicho extracto se fraccionó en una
columna Q-Sepharose que como se ha mencionado
anteriormente, da como resultado en una fracción (llamada F1) rica
en Apaf-1 endógeno y una fracción de elución
(llamada FE) que contiene citocromo-c y caspasas,
separando de este modo los componentes necesarios para la activación
de la caspasa-9/3. Estas dos fracciones podían
reconstituir eficazmente la activación de caspasa. No obstante,
cuando la fracción F1 se preincubó con el peptoide 1a y luego se
mezcló con la fracción FE, no se pudo detectar ninguna activación
de caspasa (figura 13). Estos resultados indican que el peptoide 1a
inhibe tanto al Apaf-1 endógeno celular como al
rApaf-1.
El examen inicial de su capacidad para inhibir
la apoptosis en células intactas, sugirió que el peptoide 1a tiene
una baja capacidad para atravesar las membranas celulares. Este
resultado sugiere que los pentámeros de alquilglicina aunque
presentan actividad en ensayos in vitro y en ensayos con
extractos celulares no son apropiados para la inhibición de
Apaf-1 en modelos celulares. Se sintetizaron nuevas
moléculas que portasen los grupos químicos funcionales identificados
en el cribado de la quimioteca.
Primero se sintetizó una molécula híbrida
péptido/peptoide en la que el que los grupos químicos funcionales
se situaron como sustituyentes en el átomo de N de un esqueleto de
glicinas fusionado al péptido vehículo bien caracterizado,
penetratina, derivado de la secuencia del factor de transcripción
de la Drosofila, antenapedia [Thoren PE, Persson D,
Esbjorner EK, Goksor M, Lincoln P, Norden B (2004) Membrane binding
and translocation of cell-penetrating peptides.
Biochemistry 43: 3471-3489; Thoren PE, Persson D,
Karlsson M, Norden B (2000) The antennapedia peptide penetratin
translocates across lipid bilayers - the first direct observation.
FEBS Lett 482: 265-268].
En segundo lugar, se sintetizaron compuestos
3,7, dioxo-[1,4] diazepánicos-C5 sustituidos. En
concreto, Acido
1-[2-(2,4-Diclorofenil)-etil]-4-(3,3-difenilpropil)-3,7-dioxo-[1,4]diazepan-5-carboxilico
y
carbamoilmetil-[2-(2,4-dicloro-fenil)-etil]-amida
(compuesto diazepánico-1). En tercer lugar, también
se sintetizó un conjugado poli-(ácido L-glutámico)
(PGA)-peptoide 1,
PGA-GG-peptoide 1, para explorar el
enfoque de internalización endocítica [Duncan R (2003) The
dawning era of polymer therapeutics. Nat Rev Drug Discov 2:
347-360].
La
penetratina-GG-peptoide 1 y el
compuesto diazepánico-1 fueron activos en los
ensayos in vitro y en extractos celulares anteriormente
mencionados y mostraron una toxicidad celular menor que permitió su
uso en ensayos con modelos de células. Los experimentos sin células
no son apropiados para una prueba preliminar de actividad para
profármacos, tales como el derivado
PGA-GG-peptoide 1, porque los
conjugados poliméricos adoptan una estructura de micelar
unimolecular en 3D en solución ocultando el principio activo
hidróbofo en el centro [Mendichi R, Rizzo V, Gigli M, Schieroni
AG (2002) Fractionation and characterization of a conjugate between
a polymeric drug-carrier and the antitumor drug
camptothecin. Bioconjug Chem 13:
1253-1258].
Para investigar si esas moléculas podrían
inhibir la apoptosis mediada por mitocondrias, se realizaron
ensayos con cultivos de: células U937 de linfoma histiocítico
humano expuestas a doxorrubicina; células Saos-2 de
osteosarcoma humano con expresión condicional de la proteína
pro-apoptótica Bax (Saos Bax tet-ON)
y fibroblastos de embriones de ratones (FER) expuestos a
TNF-\alpha.
En el primer modelo celular, la doxorrubicina
induce una apoptosis a través de un daño del ADN que se transduce a
la mitocondria alterando el potencial de membrana mitocondrial
(PMM) y activando las caspasas ejecutoras con la implicación del
apoptosoma. Tras 12 h, las células tratadas con doxorrubicina
mostraron tinción por anexina V-PE (que se une
específicamente a la fosfatidilserina expuesta, marcador de
apoptosis) y perdieron PMM (figuras 14 y 15).
Cuando se trataron las células con doxorrubicina
en presencia de
penetratina-GG-peptoide-1
o de compuesto diazepánico-1, el grado de apoplosis
inducida por doxorrubicina disminuyó notablemente, tal como
determina el bajo porcentaje de células con fenotipo apoptótico
(figura 14 y 15). En el modelo de la célula Saos-2,
la apoptosis se induce por la expresión condicional de Bax a través
del sistema de tet-ON (Clontech).
La Bax es un miembro
pro-apoptótico de la familia de los
Bcl-2 que induce apoptosis por medio de la
liberación de citocromo-c de la mitocondria,
[Bouillet P, Strasser A (2002) BH3-only proteins
- evolutionarily conserved proapoptotic Bcl-2
family members essential for initiating programmed cell death. J
Cell Sci 115: 1567-1574] por lo que la
activación de la apoptosis se basa únicamente en la ruta
mitocondrial.
En este modelo, el
PGA-GG-peptoide 1 mostró una
prevención de la perdida de viabilidad celular inducida por la
expresión de Bax que dependía del tiempo y la dosis, como se pudo
medir en los ensayos de MTT (datos no mostrados). Además y de
manera más relevante para el presente estudio, se observó una
inhibición de la actividad de la caspasa-3
dependiente del tiempo (hasta 72 h) (figura 16), consistente con la
inhibición de la apoptosis dependiente de Apaf-1 por
el PGA-GG-peptoide 1. La
dependencia del tiempo del proceso se debe al mecanismo
lisosomotrópico de administración intracelular del fármaco asociado
al PGA-GG-peptoide 1 [Duncan R
(2003) The dawning era of polymer therapeutics. Nat Rev Drug Discov
2: 34 7-360].
Para evaluar la especificidad del peptoide 1
para la ruta mitocondrial, se indujo la apoptosis por TNF\alpha
en FER. Este es un sistema de tipo 1 en el que la apoptosis se
induce por unión de los receptores de muerte de la familia del TNF
sin la intervención de la liberación de citocromo-c de la
mitocondria. Ninguna de las moléculas descritas anteriormente
mostró un efecto inhibitorio detectable en la apoptosis inducida
por TNF\alpha lo cual indica que sólo la ruta mitocondrial de la
activación de la caspasa es inhibida por las moléculas
descritas.
Durante la última década se ha realizado un
enorme progreso en el entendimiento de la base molecular de la
apoptosis, al tiempo que se producía un aumento del interés en las
posibles aplicaciones clínicas de las moléculas que podrían modular
los acontecimientos clave de la maquinaria de la apoptosis. Debido a
la indeseada activación del programa de apoptosis en varias
enfermedades, los esfuerzos iniciales se dirigieron a la inhibición
de las caspasas.
La caspasa-3 ha sido una de las
enzimas más intensamente estudiadas en lo que se refiere a su
posibilidad de ser diana en enfermedades neurodegenerativas y
accidentes cerebrovasculares [US6949516B2; US694302282;
US687874382; US685268782; Reed JC (2001)
Apoptosis-regulating proteins as targets for drug
discovery. Trends Mol Med 7: 314-319; Scott CW,
Sobotka-Briner C, Wilkins DE, Jacobs RT, Folmer JJ,
Frazee WJ, Bhat RV, Ghanekar SV, Aharony D (2003) Novel small
molecule inhibitors of caspase-3 block cellular and
biochemical features of apoptosis. J Pharmacol Exp Ther 304:
433-440; Lee D, Long SA, Murray JH, Adams JL,
Nuttall ME, Nadeau DP, Kikly K, Winkler JD, Sung CM, Ryan MD, Levy
MA, Keller PM, DeWolf WE, Jr. (2001) Potent and selective
nonpeptide inhibitors of caspases 3 and 7. J Med Chem 44:
2015-2026]. De todos modos, como ocurre con
otras rutas celulares importantes en terapia para una posible
intervención terapéutica, más de una proteína debe ser seleccionada
como diana para aumentar el valor terapéutico. Del mismo modo, la
identificación de nuevos posibles fármacos para el tratamiento de
enfermedades caracterizadas por una excesiva apoptosis debe ser
evaluada y desarrollada.
Para perseguir este objetivo, hemos realizado un
ensayo con un apoptosoma reconstruido in vitro adaptado a la
selección de grupos farmacóforos a partir de colecciones de alta
diversidad de compuestos químicos (quimiotecas de moléculas).
Una aplicación relevante de esta invención es la
identificación de una clase novedosa de moléculas que inhiben la
activación de la caspasa-9 dependiente del
apoptosoma. Los compuestos aquí identificados se unen de manera
reversible a Apaf-1 en un mecanismo no competitivo
con el citocromo-c y excluye la reagrupación y activación de
la procaspasa-9. De hecho, aquí se muestra que
rApaf-1 en ausencia de dATP y citocromo-c se
comporta en una columna de exclusión por tamaño como una proteína
de 140 kDa que al incorporarse a extractos celulares que contienen
caspasas (extractos de FE) es capaz de activar estas enzimas
(figura 1). Además, se obtiene un apoptosoma funcional (\sim700
kDa) cuando rApaf-1 se somete a cromatografía de
exclusión por tamaño en presencia de los extractos de FE y la
actividad enzimática se ve inhibida cuando dicha fracción eluída de
la columna se trata con las moléculas identificadas (figura 11). No
obstante, cuando rApaf-1 en presencia del extracto
de FE y alguna de las moléculas identificadas, por ejemplo con la
denominada peptoide 1a, se somete a cromatografía de exclusión por
tamaño la proteína eluye como pico principal centrado en los
volúmenes de elución que corresponden a un complejo mayor que
podría estar relacionado con el complejo de apoptosoma previamente
notificado [Cain K, Bratton SB, Langlais C, Walker G, Brown DG,
Sun XM, Cohen GM (2000) Apaf-1 oligomerizes into
biologically active approximately 700-kDa and
inactive approximately 1.4-MDa apoptosome
complexes. J Biol Chem 275: 6067-6070] de
\sim1,4 kDa, menos activo (figura 11).
Es tentador especular que las moléculas aquí
identificadas, por ejemplo la denominada peptoide 1a, o los
compuestos diazepánicos promuevan el acontecimiento de
oligomerización mediante su unión a Apaf-1 y la
inducción de un conformación no apropiada para la correcta
oligomerización de la proteína. Si esto es cierto, es posible que
Apaf-1 pueda tener un sitio alostérico que podría
unirse a inhibidores intrínsecos aún no identificados que podría
participar en la desactivación fisiológica del programa de
apoptosis en ciertas células.
El peptoide 1 original pone de manifiesto una
baja permeabilidad de la membrana mostrando por tanto no se puede
utilizar para parar la apoptosis en modelos celulares. Para superar
este problema, se diseñaron moléculas más permeables para las
células y se mostró su eficacia en tres modelos independientes de
células. El tratamiento de células U937 expuestas a doxorrubicina
con los compuestos
penetratina-GG-peptoide-1
o compuesto diazepánico-1 disminuye los marcadores
de fenotipo de la apoptosis. Cuando el compuesto inhibidor de
Apaf-1 denominado
PGA-GG-peptoide 1 se suministró
mediante administración lisosomotrópica, protegió las células
Saos-1 de la apoptosis inducida por
sobre-expresión de la proteína
pro-apoptótica Bax específica para la ruta
mitocondrial. Más aún, estos inhibidores no pudieron evitar la
muerte celular activada por TNF\alpha en un modelo de
fibroblastos de embrión de ratón, lo que indica que sólo la
apoptcsis inducida por la ruta mitocondrial puede bloquearse por
los nuevos compuestos aquí descritos de fórmula general (I) y
(II).
De forma preferida los estudios realizados en
esta invención se centraron en el perfeccionamiento y depuración de
ligandos o compuestos específicos de fórmula general (I) y (II)
capaces de inhibir de forma selectiva y específica
Apaf-1.
Es necesario hacer hincapié en que la presente
invención comenzó con la identificación de una familia de- trímeros
de alquilglicina (peptoide) como inhibidores de
Apaf-1. Los compuestos originalmente identificados
(protegidos por la patente española de número 2169690) tuvieron una
aplicación limitada y tuvieron que ser químicamente
modificados.
El peptoide 1 (denominado
N15-20-15C; protegido por la patente
española 2169690) se utilizó como cabeza de serie de baja actividad
ya que en nuestra invención ibamos buscando inhibidores específicos
de Apaf-1 y el compuesto denominado
N15-20-15C (peptoide 1a) era un
inhibidor selectivo de receptores de L-glutamato.
Dada su baja actividad como inhibidor selectivo y específico de
Apaf-1 se procedió a la modificación química
mediante su conversión a un pentámero de
N-alquilglicina mediante la extensión de dos
unidades de alquilglicina por el N- o C-terminal de
la molécula original (denominados
N15-20-15C-Pos-Fiyd
o peptoide 1b y
Pos-Hyd-N15-20-15C
o peptoide 1a).
Como se ha mencionado anteriormente los
peptoides 1a y 1b demostraron actividad inhibidora de
Apaf-1 en experimentos in vitro con proteínas
recombinantes. La actividad inhibidora de Apaf-1 se
manifiesta por la inhibición de la activación de la
procaspasa-9. Sin embargo los peptoides 1a y 1b
demostraron cierta toxicidad inespecífica en ensayos celulares lo
que aconsejo un mayor desarrollo.
Partiendo de estos estudios se sintetizaron
derivados en los que la estructura química del peptoide 1 se
fusiona a un péptido sintético descrito como agente permeabilizador
de células (penetratin®) obteniéndose de forma preferida el
compuesto PEN-GG-peptoide 1 en el
que el peptoide 1 está separado por dos aminoácidos glicina de la
secuencia transportadora.
De forma preferida también se procedió a la
síntesis de un heterociclo funcionalizado con los grupos o
funcionalidades químicas que podían ser de relevancia en la
actividad del peptoide 1. Los compuestos
PEN-GG-peptoide 1 y
3,7-dioxo-[1,4jdiazepan-5-derivados
tuvieron actividad inhibiendo apoptosis inducida por un inductor de
apoptosis como es la doxorrubicina en un modelo celular utilizando
células de leucemia U937. Las estructuras químicas de estos
compuestos PEN-GG-peptoide 1 y
3,7-dioxo-[1,4]diazepan
-5-derivados se muestran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
De forma preferida también se sintetizó un
compuesto en el que el peptoide 1 se fusiona covalentemente a un
polímero biocompatible denominado poliglutámico (PGA) generando el
compuesto PGA-GG-peptoide 1. Este
compuesto es muy eficaz inhibiendo la apoptosis mediante inhibición
de Apaf-1 en un modelo celular cuyo mecanismo está
bien establecido ya que se induce apoptosis en células por
sobrexpresión de la proteína pro-apoptósica Bax.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- Según un primer aspecto importante la presente invención se refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de apoptosis celular que comprende una cantidad química y/o farmacéuticamente eficaz de al menos un compuesto de fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- donde:
- -
- R_{1} es un radical N-(aminocarbonilmetil)aminocarbonil en sus formas enantioméricas R, S y/o mezclas racémicas de los mismos que contiene como sustituyentes del nitrógeno los sustituyentes seleccionados del grupo formado por:
- -
- H, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquiletil, cicloalquilmetil, aminocarbonilalquil, furilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, ariletil, arilmetil,
- -
- ariletil-R_{4} donde R_{4} es un sustituyente del anillo y se selecciona del grupo formado por H, fluor, cloro o bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi, alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino,
- -
- arilmetil-R_{5} donde R_{5} es un sustituyente del anillo y se selecciona del grupo formado por fluor, cloro, bromo, triflorometilo, hidroxi, alcoxi, alquilcarbonil, alquilamino, sulfonilamino,
- -
- R_{2} se selecciona del grupo formado por H y 2,2-difenilo.
- -
- R_{3} se selecciona del grupo formado por H y 2,4-diclorofenilo.
y/o al menos un compuesto de fórmula general
(II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o al menos un excipiente o
adyuvante química y/o farmacéuticamente aceptable caracterizada por
inhibir de forma selectiva al factor de activación de apoptosis 1
(Apaf-1).
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto de
fórmula general (I) y al menos un excipiente o adyuvante química y/o
farmacéuticamente aceptable.
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto de
fórmula general (II) y al menos un excipiente o adyuvante química
y/o farmacéuticamente aceptable.
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto de
fórmula general (II) fusionado con un péptido sintético
permeabilizador de células y al menos un excipiente o adyuvante
química y/o farmacéuticamente aceptable.
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto de
fórmula general (II) fusionado el polímero biocompatible
poliglutámico y al menos un excipiente o adyuvante química y/o
farmacéuticamente aceptable.
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto con
la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y al menos un excipiente o
adyuvante química y/o farmacéuticamente
aceptable.
\newpage
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto con
la siguiente estructura:
y al menos un excipiente o
adyuvante química y/o farmacéuticamente
aceptable
De forma preferida la siguiente invención se
refiere a una composición farmacéutica con actividad inhibidora de
apoptosis celular que comprende de forma preferida el compuesto con
la siguiente estructura:
y al menos un excipiente o
adyuvante química y/o farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto importante la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular en la que de forma adicional hay
una cantidad adicional química y/o farmacéuticamente eficaz de un
agente activo seleccionado del grupo formado por un agente activo de
origen sintético o un extracto vegetal.
Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en la que el compuesto de fórmula general
(I) está incorporado a un vehículo química y/o farmacéuticamente
aceptable seleccionado del grupo formado por nanoesferas,
micropartículas y nanopartículas.
Un aspecto importante de la presente invención
es el uso del compuesto de fórmula general (I) o sus sales química
y/o farmacéuticamente aceptables en la preparación de una
composición farmacéutica que inhibe la apoptosis celular.
Otro aspecto importante de la presente invención
es el uso del compuesto de fórmula general (I) o sus sales química
y/o farmacéuticamente aceptables en la preparación de una
composición farmacéutica que inhibe inhibiendo de forma específica
al factor de activación de apoptosis 1.
Un aspecto importante de la presente invención
es el uso del compuesto de fórmula general (II) o sus sales química
y/o farmacéuticamente aceptables en la preparación de una
composición farmacéutica que inhibe la apoptosis celular.
Otro aspecto importante de la presente invención
es el uso del compuesto de fórmula general (II) o sus sales química
y/o farmacéuticamente aceptables en la preparación de una
composición farmacéutica que inhibe inhibiendo de forma específica
al factor de activación de apoptosis 1.
Un aspecto importante de la presente invención
es el uso de la combinación del compuesto de fórmula general (I) y
del compuesto de fórmula general (II) o sus sales química y/o
farmacéuticamente aceptables en la preparación de una composición
farmacéutica que inhibe la apoptosis celular inhibiendo de forma
específica al factor de activación de apoptosis 1.
Un aspecto importante en la presente invención
es el uso de la composición que comprende un compuesto de fórmula
(I) o de sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación
de medicamento, el uso de la composición que comprende un compuesto
de fórmula (I) o de sus sales farmacéuticamente aceptables en la
preparación de un medicamento que inhibe la apoptosis celular y el
uso de la composición que comprende un compuesto de fórmula (I) o de
sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un
medicamento que inhibe de forma específica al factor de activación
de apoptosis 1.
Un aspecto importante de la presente invención
es el uso de la composición que comprende un compuesto de fórmula
(II) o de sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación
de medicamento, el uso de la composición que comprende un compuesto
de fórmula (II) o de sus sales farmacéuticamente aceptables en la
preparación de un medicamento que inhibe la apoptosis celular y el
uso de la composición que comprende un compuesto de fórmula (II) o
sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de
medicamento que inhibe de forma específica al factor de activación
de apoptosis 1.
Un último aspecto importante de la presente
invención es el uso de la composición que comprende una combinación
del compuesto de fórmula general (I) y del compuesto de fórmula
general (II) o sus sales farmacéuticamente aceptables en la
preparación de un medicamento que inhibe la apoptosis celular y el
uso de la composición que comprende una combinación del compuesto
de fórmula general (I) y del compuesto de fórmula general (II) o
sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un
medicamento que inhibe de forma específica del factor de activación
de apoptosis 1.
Claims (17)
1. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular caracterizada porque
comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un
compuesto de fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
- -
- R_{1} es un radical N-(aminocarbonilmetil)aminocarbonil en sus formas enantioméricas R, S y/o mezclas racémicas de los mismos que contiene como sustituyentes del nitrógeno los sustituyentes seleccionados del grupo formado por:
- -
- H, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquiletil, cicloalquilmetil, aminocarbonilalquil, furilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, ariletil, arilmetil,
- -
- ariletil-R_{4} donde R_{4} es un sustituyente del anillo y se selecciona del grupo formado por H, fluor, cloro o bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi, alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino,
- -
- arilmetil-R_{5} donde R_{5} es un sustituyente del anillo y se selecciona del grupo formado por fluor, cloro, bromo, triflorometilo, hidroxi, alcoxi, alquilcarbonil, alquilamino, sulfonilamino,
- -
- R_{2} se selecciona del grupo formado por H y 2,2-difenilo.
- -
- R_{3} se selecciona del grupo formado por H y 2,4-diclorofenilo.
y/o al menos un compuesto de fórmula general
II:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o al menos un excipiente o
adyuvante farmacéuticamente aceptable que inhibe de forma selectiva
al factor de activación de apoptosis
1.
2. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según reivindicación 1
caracterizada porque comprende el compuesto de fórmula
general I, y al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
3. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según reivindicación 1
caracterizada porque comprende el compuesto de fórmula
general II y al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
\newpage
4. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 caracterizada porque comprende el
compuesto de fórmula general II fusionado con un péptido sintético
permeabilizador de células y al menos un excipiente o adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
5. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 caracterizada porque comprende el
compuesto de fórmula general II fusionado el polímero biocompatible
poliglutámico y al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
6. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según reivindicación 1
caracterizada porque comprende de forma preferida el
compuesto con la siguiente estructura:
y al menos un excipiente o
adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
7. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizada porque hay una cantidad
adicional química y/o farmacéuticamente eficaz de un agente activo
seleccionado del grupo formado por un agente activo de origen
sintético o un extracto vegetal.
8. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el compuesto de
fórmula general I está incorporado a un vehículo farmacéuticamente
aceptable seleccionado del grupo formado por nanoesferas,
micropartículas y nanopartículas.
9. Composición farmacéutica con actividad
inhibidora de apoptosis celular según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el compuesto de
fórmula general II está incorporado a un vehículo farmacéuticamente
aceptable seleccionado del grupo formado por nanoesferas,
micropartículas y nanopartículas.
10. Uso de la composición que comprende un
compuesto de fórmula general I según reivindicación 1 o de sus
sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de
medicamento.
11. Uso de la composición que comprende un
compuesto de fórmula general I según reivindicación 1 o de sus
sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un
medicamento que inhibe la apoptosis celular.
12. Uso de la composición que comprende un
compuesto de fórmula general I según reivindicación 1 o de sus
sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un
medicamento que inhibe de forma específica al factor de activación
de apoptosis 1.
13. Uso de la composición que comprende un
compuesto de fórmula general II según reivindicación 1 o de sus
sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de
medicamento.
14. Uso de la composición que comprende un
compuesto de fórmula general 11 según reivindicación 1 o de sus
sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un
medicamento que inhibe la apoptosis celular.
15. Uso de la composición que comprende un
compuesto de fórmula general II según reivindicación 1 o sus sales
farmacéuticamente aceptables en la preparación de medicamento que
inhibe de forma específica al factor de activación de apoptosis
1.
16. Uso de la composición según reivindicación 1
que comprende una combinación del compuesto de fórmula general I y
del compuesto de fórmula general (II) o sus sales farmacéuticamente
aceptables en la preparación de un medicamento que inhibe la
apoptosis celular.
17. Uso de la composición según reivindicación 1
que comprende una combinación del compuesto de fórmula general I y
del compuesto de fórmula general II o sus sales farmacéuticamente
aceptables en la preparación de un medicamento que inhibe de forma
específica del factor de activación de apoptosis 1.
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