ES2330203T3 - Direccion selectiva de celulas apoptoticas. - Google Patents

Direccion selectiva de celulas apoptoticas. Download PDF

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Abstract

Uso de un compuesto de arsenóxido que tiene la fórmula estructural siguiente: **(Ver fórmula)** en la fabricación de un medicamento para dirigir selectivamente in vivo, a células apoptóticas o células muertas, un agente activo que es un agente diagnóstico seleccionado entre radionucleidos seleccionados del grupo que consiste en: 3 H, 11 C, 14 C, 15 O, 13 N, 32 P, 33 P, 35 S, 18 F, 125 I, 127 I, 111 In, 105 Rh, 153 Sm, 67 Cu, 67 Ga, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re, 188 Re y 99m Tc; iones paramagnéticos seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio (III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III), manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio (III), samario (III) y disprosio (III); y agentes formadores de imágenes por rayos X seleccionados del grupo que consiste en: oro (III), plomo (II), lantano (III) y bismuto (III); en que el compuesto de arsenóxido está enlazado con un primer miembro ligante; y en que el agente activo está unido a dicho primer miembro ligante.

Description

Dirección selectiva de células apoptóticas.
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Campo técnico
El presente invento se refiere, en general, al suministro dirigido de agentes activos, agentes activos que son generalmente agentes diagnósticos. Más particularmente, el presente invento se refiere a la dirección selectiva de un agente activo a células apoptóticas en un vertebrado al administrar un sistema que comprende un compuesto de arsenóxido (o un equivalente de arsenóxido) y al menos un agente activo, compuesto de arsenóxido que se dirige selectivamente a células apoptóticas y suministra el agente activo, tal como un agente detectable, a las células apoptóticas y su entorno.
Fundamento
La muerte celular programada, o apoptosis, desempeña un papel fundamental en la renovación celular. Un desequilibrio en la apoptosis, caracterizado por un aumento o una disminución acusadas de la apoptosis en relación con la regeneración celular, se asocia a menudo con una enfermedad (Thompson, 1995). Por ejemplo, una apoptosis excesiva es una característica de trastornos vasculares (Stefanec, 2000), enfermedades neurodegenerativas (Rimon et al., 1997), síndromes mielodisplásicos (Parker y Mufti, 2001), daños por isquemia/reperfusión (Gottlieb y Engler, 1999), el rechazo de órganos trasplantados (Krams y Martínez, 1998), tumores y cánceres, entre otros.
Sin embargo, no hay mediciones específicas de apoptosis utilizadas en el diagnóstico ni la terapia de pacientes. Esto se debe, en parte, a la falta de un marcador conveniente y sensible para determinar apoptosis in vivo. Por lo tanto, un marcador selectivo de células apoptóticas sería ventajoso en el diagnóstico y la terapia de enfermedades y también sería interesante para la formación de imágenes de procesos celulares normales.
En consecuencia, existe la necesidad de dirigir selectivamente agentes activos a sitios de interés terapéutico o diagnóstico. En particular, existe la necesidad de dirigir selectivamente agentes a células apoptóticas.
El presente invento se refiere a la dirección de un agente activo a células apoptóticas en un vertebrado, que comprende administrar al vertebrado un sistema que comprende un compuesto de arsenóxido y un agente activo tal como se define en la Reivindicación 1, sistema que se dirige selectivamente a células apoptóticas. El compuesto de arsenóxido actúa principalmente como un agente de dirección para suministrar un agente activo, tal como un agente terapéutico o formador de imágenes, a células apoptóticas con un grado relativamente elevado de especificidad. Una ventaja particular del presente invento es que el compuesto de arsenóxido es selectivamente incorporado por las células apoptóticas y se une a diversas proteínas dentro de la célula.
En el Documento WO 01/021628 se describe un compuesto para el que la membrana celular resulta sustancialmente impermeable, y su uso. D. J. Hnatowich et al., The Journal of Nuclear Medicine, volumen 28, nº 8, páginas 1294-1302, Agosto de 1987, describen investigaciones sobre avidina (estreptavidina) y biotina para aplicaciones mediante formación de imágenes.
Sumario del invento
De acuerdo con una primera realización del invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 y el citado agente, sistema que se dirige selectivamente a células apoptóticas.
Típicamente, el sistema comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con al menos un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
Más típicamente, el sistema comprende:
(i) un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro ligante; y
(ii) un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante, en que dicho segundo miembro ligante es un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
Típicamente, el primer miembro ligante es una enzima y el segundo miembro ligante es un sustrato de la enzima. Típicamente, el sustrato de la enzima es un proagente que es convertido en un agente activo por la enzima. Aún más típicamente, el sustrato de la enzima es un profármaco que es convertido en un fármaco activo por la enzima.
Aún más típicamente, el sistema comprende:
(i) un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro ligante; y
(ii) un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante enlazado con al menos un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo).
Típicamente, el primer miembro ligante es biotina y el segundo miembro ligante es avidina o estreptavidina. Aún típicamente, el primer miembro ligante es avidina o estreptavidina y el segundo miembro ligante es biotina.
Aún típicamente, el primer miembro ligante es biotina, el segundo miembro ligante es avidina o estreptavidina, y el segundo miembro ligante está indirectamente enlazado con un agente activo en virtud de una interacción ligante más entre la avidina o la estreptavidina y al menos un resto de biotina adicional que está directamente enlazado con el agente activo.
Típicamente, el primer miembro ligante es metotrexato y el segundo miembro ligante es dihidrofolato reductasa (DHFR). Aún típicamente, el primer miembro ligante es dihidrofolato reductasa y el segundo miembro ligante es metotrexato.
Típicamente, el primer miembro ligante es hirudina y el segundo miembro ligante es trombina. Aún típicamente, el primer miembro ligante es trombina y el segundo miembro ligante es hirudina.
Típicamente, el primer miembro ligante es un antígeno y el segundo miembro ligante es un anticuerpo.
Típicamente, el segundo miembro ligante está directamente enlazado con un agente activo. Aún típicamente, el segundo miembro ligante está indirectamente enlazado con un agente activo. Aún más típicamente, el enlace indirecto entre el agente activo y el segundo miembro ligante es en virtud de una interacción ligante más entre el segundo miembro ligante y al menos un miembro ligante adicional, en que el miembro ligante adicional está directamente enlazado con el agente activo.
El agente activo es un agente diagnóstico.
Típicamente, el agente diagnóstico es un agente formador de imágenes. Más típicamente, las sustancias que actúan como agentes diagnósticos son bien conocidas por quienes tienen una experiencia normal en la técnica, e incluyen marcadores fluorescentes, radionucleidos, iones paramagnéticos, agentes formadores de imágenes por rayos X, marcadores quimioluminiscentes y marcadores que pueden ser detectados por medio de una operación enzimática o ligante secundaria. Los marcadores fluorescentes típicos, adecuados para uso en el sistema del invento, incluyen Cy^{TM}5.5 y fluoresceína. En el Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 8ª edición, se enumeran otras sondas fluorescentes comerciales que son adecuadas para uso en el presente invento.
Los radionucleidos típicos, adecuados para uso como agentes formadores de imágenes en el invento, son seleccionados del grupo que consiste en ^{3}H, ^{11}C, ^{14}C, ^{15}O, ^{13}N, ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{18}F, ^{125}I, ^{127}I, ^{111}In, ^{105}Rh, ^{153}Sm, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{166}Ho, ^{177}Lu, ^{186}Re, ^{188}Re y ^{99m}Tc.
Típicamente, los iones paramagnéticos son seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio (III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III), manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio (III), samario (III) y disprosio (III). Más típicamente, el ion paramagnético es gadolinio (III).
Típicamente, los agentes formadores de imágenes por rayos X son seleccionados del grupo que consiste en: oro (III), plomo (II), lantano (III) y bismuto (III).
Típicamente, el agente activo se encuentra dentro de un vehículo para el suministro de dicho agente. Más típicamente, el vehículo para el agente activo es un liposoma.
El compuesto de arsenóxido se dirige a células apoptóticas.
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El compuesto de arsenóxido adecuado para uso en el presente invento es 4-[N-(S-glutationilacetil)amino]fenilarsenóxido, que puede ser abreviado GSAO, de acuerdo con la Fórmula IV:
1
De acuerdo con una segunda realización del invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, sistema que comprende un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de acuerdo con la Reivindicación 1 enlazado con al menos un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
De acuerdo con una tercera realización del invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, sistema que comprende
un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro ligante; y
un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante, en que dicho segundo miembro ligante es un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una cuarta realización del invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, sistema que comprende
un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro ligante; y
un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante enlazado con un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo).
\vskip1.000000\baselineskip
Típicamente, el segundo miembro ligante está directamente enlazado con el agente.
Aún típicamente, el segundo miembro ligante está indirectamente enlazado con el agente. Más típicamente, el enlace indirecto entre el agente y el segundo miembro ligante es en virtud de una interacción ligante más entre el segundo miembro ligante y al menos un miembro ligante adicional, en que el miembro ligante adicional está directamente enlazado con el agente. Aún más típicamente, el primer miembro ligante y el miembro ligante adicional son diferentes. Aún más típicamente, el primer miembro ligante y el miembro ligante adicional son iguales.
Típicamente, con respecto a cualquiera de las realizaciones segunda a cuarta del invento, el primer componente está enlazado con el agente a través de un conector escindible. Más típicamente, con respecto a la segunda realización del invento, el primer componente está enlazado con el agente a través de un conector escindible.
Típicamente, con respecto a la realización tercera o cuarta del invento, los miembros ligantes primero y segundo son como se describieron anteriormente de acuerdo con la primera realización del invento. Aún típicamente, con respecto a cualquiera de las realizaciones segunda a cuarta del invento, el compuesto de arsenóxido es como se describió anteriormente de acuerdo con la primera realización del invento. Aún típicamente, el agente activo es como se describió anteriormente de acuerdo con la primera realización del invento.
De acuerdo con una quinta realización del invento, se proporciona un método para detectar y/o formar imágenes de células apoptóticas en un vertebrado, método que comprende administrar a dicho vertebrado una cantidad biológicamente eficaz de un sistema que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 y un agente diagnóstico, en que dicho sistema se dirige selectivamente a células apoptóticas; y detectar dicho agente diagnóstico.
De acuerdo con una sexta realización del invento, se proporciona el uso de un sistema que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 y un agente diagnóstico, para la fabricación de un medicamento para detectar y/o formar imágenes de células apoptóticas, en que dicho sistema se dirige selectivamente a células apoptóticas.
Típicamente, con respecto a las realizaciones quinta y sexta del invento, el sistema es como se definió de acuerdo con la primera realización del invento. Aún típicamente, el agente diagnóstico es como se definió de acuerdo con la primera realización del invento.
Típicamente, el vertebrado es seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, primates no humanos, murinos, bovinos, ovinos, equinos, caprinos, leporinos, aviarios, felinos y caninos. Más típicamente, el vertebrado es un ser humano, primate no humano o murino. Aún más típicamente, el vertebrado es un ser humano.
De acuerdo con una séptima realización del invento, se proporciona un kit terapéutico y/o diagnóstico para dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, kit que comprende
un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro ligante, y
un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante, en que dicho segundo miembro ligante es un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo,
opcionalmente junto con un vehículo y/o un diluyente terapéutica y/o diagnósticamente aceptables.
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De acuerdo con una octava realización del invento, se proporciona un kit terapéutico y/o diagnóstico para dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, kit que comprende
un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro ligante; y
un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante enlazado con un agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo),
opcionalmente junto con un vehículo y/o un diluyente terapéutica y/o diagnósticamente aceptables.
Definiciones
En el contexto de esta memoria descriptiva, la expresión "que comprende" significa "que incluye principalmente pero no necesariamente de forma única". Además, variaciones de la expresión "que comprende", tales como "comprenden" y "comprende", tienen significados correspondientemente variados.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el término "arsenóxido" se refiere al grupo -As=O.
En el contexto de esta memoria descriptiva, los grupos escritos -As=O y -As(OH)_{2} van a ser considerados sinónimos.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la expresión "equivalente a arsenóxido" se refiere a cualquier especie ditiólicamente reactiva que muestra esencialmente la misma afinidad que -As=O o -As(OH)_{2} por los ditioles, y la expresión incluye, por ejemplo, grupos que comprenden un elemento de transición, y cualquier compuesto arsenical trivalente que resulta hidrolizado hasta -As=O o -As(OH)_{2} cuando se disuelve en medios acuosos (tales como los tampones para cultivo celular y los fluidos contenidos en el organismo que se trata).
El término "arsenical", como aquí se utiliza, incluye cualquier compuesto que contiene arsénico.
El término "acilo", como aquí se utiliza, incluye los restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y cicloalquenilo monovalentes y divalentes que poseen un sustituyente carbonilo terminal, pudiendo tener lugar la fijación por el resto hidrocarbonado, el resto carbonilo o ambos.
El término "alquilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes y saturados, de cadenas lineales y ramificadas.
El término "alquenilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes, de cadenas lineales y ramificadas, que tienen al menos un doble enlace.
El término "alquinilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes, de cadenas lineales y ramificadas, que tienen al menos un triple enlace.
El término "alquileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes y saturados de cadena lineal.
El término "alquenileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes de cadena lineal que tienen al menos un doble enlace.
El término "alquinileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes de cadena lineal que tienen al menos un triple enlace.
El término "arilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados aromáticos y monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados.
El término "arileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados aromáticos y divalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados.
La expresión "ditiol estrechamente espaciado", como aquí se usa, incluye en su significado tioles que son químicamente vecinales, así como tioles espacialmente yuxtapuestos en virtud de la conformación molecular.
El término "cicloalquilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados.
El término "cicloalquileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados.
El término "cicloalquenilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, que tienen al menos un doble enlace.
El término "cicloalquenileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, que tienen al menos un doble enlace.
El término "halo", como aquí se usa, incluye fluoro, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroarilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales aromáticos y monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados, que tienen de 1 a 12 átomos, en que de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "heteroarileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales aromáticos y divalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados, que tienen de 1 a 12 átomos, en que de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "heterocicloalquilo", como aquí se usa, incluye en su significado radicales monovalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, en que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "heterocicloalquileno", como aquí se usa, incluye en su significado radicales divalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, en que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "heterocicloalquenilo", como aquí se utiliza, incluye en su significado radicales monovalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, que tienen al menos un doble enlace y en que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "heterocicloalquenileno", como aquí se utiliza, incluye en su significado radicales divalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, que tienen al menos un doble enlace y en que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
La expresión "ácido fenilarsónico", como aquí se utiliza, va a ser considerada sinónima de "ácido bencenoarsónico".
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Síntesis de GSAO. Representación esquemática de la síntesis de GSAO, que muestra la estereoquímica y el esquema de numeración usado en la discusión del espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) 2D de ^{1}H-^{13}C por HMBC.
Figura 2. Asignación de la estructura de GSAO. Una expansión del espectro de ^{1}H-^{13}C de GSAO en DCI/D_{2}O, por HMBC, que muestra la región alifática. El espectro muestra cualquier acoplamiento heteronuclear (^{1}H-^{13}C) de largo alcance como picos cruzados, en línea con las correspondientes señales de ^{1}H y ^{13}C a lo largo de los ejes horizontal y vertical. Los picos cruzados encuadrados corresponden a un acoplamiento ^{1}H-^{13}C entre los metilenos C7 y C11, lo que confirma que la alquilación por BRAO ha tenido lugar en el átomo de azufre del glutatión. Los picos y picos cruzados marcados con "i" son debidos a impurezas; también son observables picos cruzados de un enlace correspondientes al metileno C9 y el metino C2, como dobletes, debido a una filtración incompleta por la secuencia de pulsos de la HMBC.
Figura 3. Representación esquemática de la síntesis de GSAO-A.
Figura 4. Representación esquemática de la síntesis de GSAO-B.
Figura 5. Representación esquemática de la síntesis de GSAO-F.
Figura 6. Representación esquemática de la síntesis de GSAO-Cy^{TM}5.5.
Figura 7. Interacción de GSAO-B con PDI y tiorredoxina. A: Estructura de GSAO-B. B: Se incubó PDI recombinante humana purificada (5 \muM), tiorredoxina recombinante humana (5 \muM) o albúmina sérica bovina (5 \muM) con ditiotreitol (10 \muM) durante 60 minutos a temperatura ambiental para asegurar que el(los) disulfuro(s) de sitios activos de la PDI y la tiorredoxina estaba(n) en forma de ditiol reducido. Luego se añadió GSAO-B (100 \muM) o GSAO-B y DMP (400 \muM) y se incubaron las mezclas de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiental. La PDI (carriles 1 y 2), la tiorredoxina (carriles 3 y 4) y la albúmina (carril 5) marcadas (75 picomoles) fueron resueltas por SDS-PAGE al 4-16%, transferidas a una membrana de PVDF y hechas reaccionar con estreptavidina-peroxidasa para detectar el marcador GSAO-B. Las posiciones de los marcadores de M_{r} se muestran a la izquierda.
Figura 8. GSAO-B marca la célula cultivada ocasional. Se tiñeron células BAE confluentes con GSAO-B y se visualizaron con estreptavidina-Alexa 488. La célula ocasional se teñía muy intensamente (véase la punta de flecha). La inmensa mayoría de las células se unían muy poco a GSAO-B.
Figura 9. GSAO marcó células apoptóticas después de la activación de caspasas
Células HT1080 fueron dejadas sin tratar (partes a y d) o fueron tratadas con camptotecina para provocar apoptosis (partes b y e), y fueron luego separadas y marcadas con anexina V-PE y GSAO-F (partes a y b) o anexina V-PE y GSAA-F (partes b y e). Se representa gráficamente la fluorescencia de la ficoeritrina (PE; del inglés, phyco-erythrin) frente a la fluorescencia de la fluoresceína. El porcentaje de las células totales que resultan brillantemente marcadas con anexina V (cuadrante superior izquierdo), GSAO o GSAA (cuadrante inferior derecho), o tanto con anexina V como con GSAO o GSAA (cuadrante superior derecho) se muestra en las partes c (GSAO) y f (GSAA). En la parte g, las células HT1080 fueron dejadas sin tratar (barras claras) o fueron tratadas con camptotecina para provocar apoptosis (barras oscuras), y fueron luego separadas y marcadas con GSAO-F, anexina V-PE y yoduro de propidio (PI). Se representó gráficamente la fluorescencia de la anexina V-PE frente a la fluorescencia de GSAO-F en todas las células o en todas las células salvo aquellas que habían incorporado yoduro de propidio (> 200 unidades de fluorescencia en FL4). En la parte h, las células HT1080 fueron tratadas con camptotecina en ausencia o presencia de un inhibidor de caspasas de amplio espectro, Z-VAD-FMK, y fueron luego separadas y marcadas con GSAO-F. La fluorescencia media de la población no tratada fue normalizada en dos experimentos, y las barras y los errores representan la media y el rango.
Figura 10. GSAO entró en células apoptóticas y marcó proteínas que contenían ditioles estrechamente espaciados
a) Se trataron células HT1080 con camptotecina para provocar apoptosis y luego se separaron y se marcaron con GSAO-F y anexina V-Alexa 594. Se obtuvieron imágenes de las células por microscopía confocal. Se muestran seis cortes transversales (i a vi) de una célula marcada con anexina V-Alexa 594. La imagen vii muestra una célula que no resultó intensamente marcada mediante anexina V-Alexa-594. b) Se trataron células HT1080 con camptotecina para provocar apoptosis y luego se separaron y se incubaron con anexina V-PE y GSAO-B. Las células fueron distribuidas en poblaciones positivas para anexina V (carril 1) y negativas para anexina V (carril 2). Se lisaron números iguales de células de cada población y se resolvieron por SDS-PAGE, y se detectó GSAO-B con estreptavidina-peroxidasa. Las posiciones de los marcadores de M_{r} se indican a la izquierda. c) Las proteínas marcadas con GSAO-B de la parte b fueron recogidas sobre estreptavidina-Dynabeads, resueltas en SDS-PAGE y sometidas a transferencia Western para PDI. d) Se dejaron células HT1080 sin tratar (carriles 1 y 2) o se trataron con camptotecina (carriles 3 y 4), y luego se separaron y se incubaron con GSAO-B en ausencia (carriles 1 y 3) o presencia (carriles 2 y 4) de dimercaptopropanol. Se lisaron números iguales de células y se resolvieron por SDS-PAGE, y se detectó GSAO-B con estreptavidina-peroxidasa.
Figura 11. GSAO marcó células apoptóticas in vivo y puede ser utilizado para formar imágenes de tumores
a) Se administró GSAO-B o GSAA-B a ratones que portaban tumores subcutáneos BxPC-3 en la superficie dorsal proximal, mediante inyección subcutánea en la ijada trasera. Los tumores fueron extirpados después de 6 horas, seccionados y teñidos para un compuesto marcado con biotina. Micrografías de bajo aumento (i) y alto aumento (ii) de un tumor seccionado muestran la incorporación de GSAO-B por células seleccionadas (marrón). b) Los cortes tumorales descritos en la parte a fueron teñidos para caspasa 3 activada (rojo) y GSAO-B o GSAA-B (verde) y fueron contrateñidos con un tinte para ácido nucleico (azul). Se muestran imágenes rojas, verdes y de superposición. c) Imágenes fluorescentes de un tumor pulmonar murino de Lewis desarrollado subcutáneamente en un ratón C57BL/6, 1 y 24 horas después de la administración de GSAO-Cy^{TM}5.5. Grupo A: imagen del tumor pulmonar de Lewis con luz blanca. Grupo B: tumor y piel dorsal 1 hora después de la inyección de GSAO-Cy^{TM}5.5. Grupos C y D: piel dorsal y tumor 24 horas después de la inyección, respectivamente. d) Tumores pancreáticos BxPC-3 humanos desarrollados subcutáneamente en ratones SCID, 24 horas después de la administración de GSAO-Cy^{TM}5.5, GSAA-Cy^{TM}5.5 o Cy^{TM}5.5. Grupo A: imagen de un tumor BxPC-3 con luz blanca. Grupos B, C y D: tumores después de la inyección de GSAA-Cy^{TM}5.5, GSAO-Cy^{TM}5.5 o Cy^{TM}5.5, respectivamente. e) Tumor prostático espontáneo en un ratón TRAMP 24 horas después de la administración de GSAO-Cy^{TM}5.5. Grupo A: Imagen con luz blanca. Grupo B: Imagen fluorescente. Las flechas indican los márgenes de la vena central y el tumor. Las barras de c, d y e representan 1 mm.
Figura 12. A) Marcación de tTF con MPB. tTF Q219C (5 \mug) no marcado (carril 1) o marcado con MPB (carril 2), resuelto por SDS-PAGE y teñido con azul brillante de Coomassie. B) tTF Q219C (50 ng) no marcado (carril 1) o marcado con MPB (carril 2), resuelto por SDS-PAGE, transferido a poli(fluoruro de vinildietileno) y hecho reaccionar con avidina-peroxidasa para detectar la etiqueta de biotina. Las posiciones de los marcadores de M_{r} se indican a la izquierda.
Figura 13. Formación del complejo GSAO-B-avidina-tTF-B. Se inmovilizó PDI en pocillos para microtitulación, se marcó con GSAO-B y se incubó con tTF-B y relaciones molares crecientes de avidina. Se detectó el tTF unido usando un anticuerpo monoclonal anti-TF y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Las barras y los errores son la media \pm desviación estándar de determinaciones por triplicado.
Figura 14. Dibujo del fundamento relativo al uso de GSAO-B y avidina-tTF-B para producir trombos en vasos sanguíneos tumorales.
Figura 15. Trombosis de la vasculatura tumoral y necrosis del tumor mediante la administración subcutánea de GSAO-B seguida de la administración intravenosa de avidina-tTF-B. Se muestra un corte transversal de un tumor no tratado y un tumor tratado. Es evidente la amplia necrosis del centro del tumor tratado. El recuadro muestra un vaso con trombos en el tumor tratado.
Mejor modo de llevar el invento a cabo
El presente invento se refiere a la detección de células apoptóticas, y en él se utiliza el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 para dirigir selectivamente un agente activo, un agente diagnóstico, a células apoptóticas con un grado relativamente elevado de especificidad con respecto a las células normales.
1. Preparación de compuestos 1.1 Síntesis de GSAO
Como se expone en la Solicitud de Patente Internacional (PCT) nº PCT/AU00/011434 (WO 01/21628), se pueden preparar compuestos de arsenóxido, tales como GSAO, por métodos conocidos generalmente en la técnica, y los expertos en la técnica reconocerán que los diferentes reactivos y reaccionantes pueden ser rutinariamente modificados con objeto de sintetizar cualquier compuesto dado, útil en el invento. Una persona experta en la técnica también reconocerá que el invento también proporciona el uso de compuestos en cualquier estado de ionización, tales como, por ejemplo, sales de ácido, iones dipolares inalterados, aniones de iones dipolares y dianiones.
En una síntesis típica de un compuesto de arsenóxido preferido para uso en el invento, se puede hacer reaccionar glutatión con 4-[N-(bromoacetil)amino]fenilarsenóxido (BRAO) bajo unas condiciones favorables para la formación de un enlace covalente entre el tiol libre del glutatión y la especie química a la que se fija el arsenóxido, para obtener GSAO. Las reacciones que implican un ataque nucleófilo por el tiol del glutatión requerirán, en general, unas condiciones alcalinas. Se puede llevar a cabo el ataque electrófilo de ciertas especies reactivas sobre el átomo de azufre del glutatión; en general, esto requeriría probablemente unas condiciones ácidas. En el Ejemplo 1(a) se proporciona una síntesis de GSAO, síntesis que se representa esquemáticamente en la Figura 1.
1.2 Síntesis de GSAO-B
Mas adelante, en el Ejemplo 1(c) de Referencia, se proporciona un método para la síntesis de GSAO-B, método que se ilustra en la Figura 4.
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2 
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en que n = 1 ó 2.
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1.3 Síntesis de GSAO-F
En el Ejemplo 1(d) de Referencia se proporciona un método para la síntesis de GSAO-F, método que se ilustra en la Figura 5.
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3 
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1.4 Síntesis de GSAO-Cy^{TM}5.5
Más adelante, en el Ejemplo 1(e) de Referencia, se proporciona un método para la síntesis de GSAO-Cy^{TM}5.5, método que se ilustra en la Figura 6.
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4 
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2. Sistemas para dirigir agentes activos a células apoptóticas y/o células muertas
En el presente invento se utilizan sistemas que comprenden el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 para dirigir selectivamente un agente activo a células apoptóticas. GSAO se dirige tanto a células apoptóticas como a células muertas. Como se esboza en el Ejemplo 3(d) de Referencia, al menos siete proteínas incorporaron GSAO en las células apoptóticas. Además, GSAO se unía selectivamente a células tumorales apoptóticas in vivo. Como aquí se describe, se ha utilizado esta unión para formar imágenes de tumores en ratones con un GSAO fluorescentemente marcado en el infrarrojo cercano.
A continuación se muestran esquemáticamente sistemas ejemplares, adecuados para uso en el presente invento.
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2.1 Sistema I
Un sistema adecuado para uso en el presente invento comprende un compuesto de arsenóxido que está directamente enlazado con al menos un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
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De acuerdo con este sistema, el conector puede ser escindible para que el agente activo se "libere" in situ en el sitio diana, como se ilustra a continuación.
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6 
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Los conectores escindibles son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, enlaces enzimáticamente escindibles tales como péptidos y conectores lábiles frente a esterasas.
GSAO-F (Figura 5) y GSAO-Cy^{TM}5.5 (Figura 6) son ejemplos de un sistema útil para detectar y/o formar imágenes de células apoptóticas, en que el compuesto de arsenóxido GSAO está covalentemente enlazado con los fluoróforos fluoresceína y Cy^{TM}5.5, respectivamente. El resto de GSAO se dirige selectivamente a células apoptóticas y, de este modo, proporciona selectivamente el fluoróforo a células apoptóticas (Figuras 9-11).
A modo de otro ejemplo, se puede utilizar GSAO-Cy^{TM}5.5 para detectar células apoptóticas in vivo. Se administra GSAO-Cy^{TM}5.5 a un sujeto. El modo de administración variará de acuerdo con el sitio que se va a detectar. Típicamente, el modo de administración es parenteral, intravenoso, subcutáneo u oral. Después de la administración, se deja que transcurra un periodo de tiempo con objeto de que el GSAO-Cy^{TM}5.5 residual sea aclarado de la circulación general. Típicamente, el periodo de tiempo está entre 1 y 48 horas, más típicamente entre 3 horas y 36 horas, aún más típicamente entre 6 horas y 24 horas. Aún más típicamente, el período de tiempo es 18 horas. La detección del fluoróforo Cy^{TM}5.5 puede ser llevada a cabo utilizando técnicas generales bien conocidas en este campo técnico y permite que se determine la posición de las células apoptóticas (Figura 11).
Cuando el sistema lleva incorporado un agente formador de imágenes, tal como un agente fluorescente o un agente para MRI [por ejemplo, un complejo de ion lantánido paramagnético con DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecanotetraacético) o DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético)], el agente formador de imágenes es selectivamente dirigido a sitios de células apoptóticas. Los métodos estándares para la detección del agente formador de imágenes permitirán luego que esos sitios sean fácilmente identificados.
Gd (III) es un ejemplo de un ion lantánido que ha demostrado ser muy eficaz como agente potenciador del contraste en la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI; del inglés, magnetic resonance imaging). Los esquemas siguientes representan la síntesis de un sistema que comprende un compuesto de arsenóxido (representado por GSAO) que está directamente enlazado con un complejo de ion lantánido, representado por Gd (III) DOTA y GD (III) DPTA, adecuado para uso en el presente invento.
2.1.1 Sistemas detectables que comprenden iones lantánidos (a) Síntesis de GSAO-[Gd (III) DOTA] 
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7 
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(i) (CH_{3})_{2}NCH(OCH_{3})_{2}, tolueno, 120ºC. (ii) bromoacetato de metilo en CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}CO_{3} en agua. (iii) agua, etanol. (iv) ácido bromoacético, Na_{2}CO_{3} en agua. (v) GdCl_{3}\cdot6H_{2}O en agua. (vi) conector XX, NHS catalítico, H_{2}SO_{4} catalítico, (vii) NHS, DCC en acetona. (viii) GSAO, NaHCO_{3} en agua.
(b) Síntesis de GSAO-[Gd (III) DTPA] 
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(i) anhídrido acético, acetato sódico, ácido acético. (ii) ácido iminodiacético, Na_{2}CO_{3} en agua; ácido sulfúrico. (iii) ácido sulfúrico catalítico, agua. (iv) bromoacetato de metilo en CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}CO_{3} en agua; ácido sulfúrico. (v) NHS, H_{2}SO_{4} catalítico. (vi) conector XX, NaHCO_{3} en agua; GdCl_{3}\cdot6H_{2}O en agua. (vii) NHS, DCC, acetona. (viii) GSAO, NaHCO_{3} en agua.
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El grupo conector entre el resto GSAO y el complejo de DOTA o DTPA ejemplificado en los esquemas anteriores puede ser fácilmente preparado por los expertos en la técnica usando reacciones químicas conocidas. A continuación se representa un ejemplo de una ruta sintética.
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9 
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(i) anhídrido cloroacético, Na_{2}CO_{3} en agua; ácido sulfúrico. (ii) NHS, DCC, acetona. (iii) ácido \varepsilon-amino-\eta-caproico, NaHCO_{3} en agua; ácido sulfúrico. (iv) tiourea, etanol; agua.
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En un planteamiento alternativo a la preparación de productos de conjugación de arsenóxido-[complejo de lantánido] se usan los ligandos DOTA y DTPA funcionalizados, tales como los derivados de isotiocianato mostrados a continuación.
10
Todos los ligandos anteriores han sido bien definidos en cuanto a su estabilidad con Gd (III), Y (III) y otros iones lantánidos. En el esquema siguiente se representa un ejemplo de una ruta sintética para productos de conjugación de arsenóxido con los anteriores ligandos, utilizando el ligando CHX-A''. El resto de arsenóxido es ejemplificado mediante GSAO.
11
2.1.3 Sistemas detectables que comprenden radionucleidos
Los radioisótopos son útiles como agentes formadores de imágenes y como agentes terapéuticos. A continuación se muestra una ruta sintética para sistemas adecuados para uso en el presente invento, en la que un resto de arsenóxido (ejemplificado mediante GSAO) está enlazado con un resto radiomarcado.
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(i) butil-litio, cloruro de trimetilestaño. (ii) NHS. (iii) ^{[123]}yoduro sódico, H_{2}O_{2}. (iv) GSAO, NaHCO_{3} acuoso.
En el esquema anteriormente mostrado se utiliza yodo-123; sin embargo, una persona experta en la técnica entenderá fácilmente que la síntesis anterior es general y también se aplica a otros agentes activos y radioisótopos. Por ejemplo, la sustitución del ^{[123]}yoduro sódico por ^{[125]}yoduro sódico o ^{[131]}yoduro sódico daría lugar a un sistema que comprendería el correspondiente radionucleido radioyodado. Como se ilustra a continuación, de una manera similar a la síntesis anterior se puede preparar fácilmente un sistema fluorado con ^{18}F.
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13 
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El ^{18}F es un conocido emisor de positrones y se usa en la tomografía por emisión de positrones (PET; del inglés, positron emission tomography) como un agente formador de imágenes. Otros radioisótopos adecuados para uso en sistemas para PET son bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, ^{86}Y y ^{99}Tc. En consecuencia, un sistema más del invento en que el agente activo directamente enlazado con un resto de arsenóxido es un agente para PET, es el sistema marcado con tecnecio-99, preparado de acuerdo con el esquema siguiente.
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Además de ser usados en MRI, los productos de conjugación de arsenóxido con los ligandos CHX-A'', 1B4M y C-DOTA (anteriores) pueden ser también radiomarcados, por ejemplo, con ^{111}In para uso en gammagrafía o con ^{64}Cu, ^{18}F, ^{86}Y o ^{99}Tc para uso en la formación de imágenes por PET. Otros radioisótopos útiles para fines terapéuticos dentro del alcance del presente invento incluyen renio-188, cobre-64, indio-111, lutecio-177, itrio-90 y bismuto-213. Otros radioisótopos son bien conocidos por los expertos en la técnica. La idoneidad de un radioisótopo para aplicaciones terapéuticas puede ser fácilmente identificada basándose en cinéticas de dirección y en los resultados de estudios sobre biodistribución.
2.2 Sistema II
Otro sistema adecuado para uso en el presente invento, ilustrado esquemáticamente más adelante, comprende (i) un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 que está enlazado con un primer miembro ligante; y (ii) un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante, en que el segundo miembro ligante es un agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
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El resto de arsenóxido, tal como GSAO, se dirige selectivamente a células apoptóticas, suministrando por ello el primer miembro ligante a las células apoptóticas. El primer miembro ligante es capaz de interaccionar con un segundo miembro ligante. Por ejemplo, el primer miembro ligante es una enzima y el segundo miembro ligante es un sustrato para la enzima. El sustrato para la enzima puede ser un profármaco que resulte convertido en un fármaco activo por la enzima en el sitio de las células apoptóticas. En particular, este sistema puede utilizar el "efecto espectador", por el que el fármaco activo se puede difundir a células próximas en el entorno de la(s) célula(s) apoptótica(s) a la(s) que se dirige el sistema anterior.
Se podría administrar el primer componente de este sistema a un sujeto, lo que iría seguido de un período de tiempo para permitir que cualquiera de los componentes no incorporados por las células apoptóticas fuera aclarado de la circulación general. Luego se podría administrar el segundo componente, es decir, el segundo miembro ligante, al sujeto. El modo de administración es típicamente parenteral, subcutáneo, intravenoso u oral. El segundo miembro ligante interaccionará con el primer miembro ligante que está selectivamente situado en células apoptóticas, lo que permitirá que el agente terapéutico o detectable sea aislado en el ambiente de las células apoptóticas.
2.3 Sistema III
Otro sistema adecuado para uso en el presente invento, ilustrado esquemáticamente más adelante, comprende (i) un primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 que está enlazado con un primer miembro ligante; y (ii) un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante enlazado con al menos un agente activo.
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De acuerdo con este sistema, un resto de arsenóxido (tal como GSAO) está enlazado con un primer miembro ligante (tal como biotina); es decir, un ejemplo de un primer componente de este sistema es GSAO-B. Cuando se administra a un sujeto, el resto de arsenóxido dirige selectivamente GSAO-B a células apoptóticas. El segundo componente comprende un segundo miembro ligante que es capaz de interaccionar con el primer miembro ligante. El segundo miembro ligante puede estar enlazado con un agente activo tal como un agente diagnóstico (por ejemplo, un fluoróforo). El segundo miembro ligante puede estar enlazado con un vehículo para el agente activo, tal como un liposoma, y el agente activo se puede encontrar dentro del vehículo, es decir, dentro del liposoma. Cuando se administra el segundo componente al sujeto, se une selectivamente al primer componente en el sitio de las células apoptóticas. En el caso de GSAO-B, en que el primer miembro ligante es biotina, un segundo miembro ligante adecuado es avidina o estreptavidina.
Típicamente, una vez que se ha administrado el primer componente del sistema a un sujeto, se deja transcurrir un período de tiempo para permitir que todo primer componente residual no absorbido por las células apoptóticas sea aclarado de la circulación. Luego se administra el segundo componente.
Mediante los Ejemplos de Referencia 3(d) y 3(e) se proporciona un ejemplo más de este sistema para uso en el presente invento. En el Ejemplo 3(d) de Referencia, las células fueron tratadas con el primer componente GSAO-B in vitro, y el GSAO-B residual fue eliminado por lavado. Luego se añadió el segundo componente, que comprende avidina-peroxidasa. Un método de detección conocido permitió que las células apoptóticas fueran identificadas.
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2.4 Sistema IV
A continuación se representa esquemáticamente otro sistema adecuado para uso en el presente invento.
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En el Ejemplo 5(c) de Referencia se proporciona un ejemplo de este sistema que no pertenece al invento. Como aquí se describe, la propiedad de GSAO para dirigirse a células tumorales apoptóticas ha sido utilizada para proporcionar un agente coagulante a vasos sanguíneos tumorales. El factor tisular (TF; del inglés, tissue factor) es el principal receptor de iniciación para la cascada de la coagulación de la sangre. La unión del factor VII/VIIa al TF activa los factores IX y X, zimógenos serina proteinasas, mediante una proteolisis limitada, lo que conduce a la formación de trombina y, finalmente, de un coágulo sanguíneo. El dominio extracelular de TF (tTF) es una proteína soluble con una actividad activadora del factor X que es aproximadamente cinco órdenes de magnitud menor que la del TF transmembranal nativo en un apropiado entorno de membrana fosfolipídica. Esto es porque el complejo TF:VIIa se une a, y activa, los factores IX y X mucho más eficazmente cuando se asocia con una superficie negativamente cargada.
Cuando se administra a un vertebrado que tiene, por ejemplo, un tumor, el compuesto de arsenóxido suministra el factor tisular casi exclusivamente al sitio de la apoptosis aumentada, es decir, a el(los) sitio(s) del tumor. Una vez localizado en el sitio del tumor, la presencia del factor tisular puede iniciar la cascada de la trombina para provocar una coagulación sanguínea específica del sitio, obstruyendo por ello el flujo sanguíneo al tumor y causando una necrosis grave del tejido tumoral.
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3. Formulaciones farmacéuticas y/o terapéuticas
Además, los componentes de los sistemas del invento a menudo requieren los agentes activos anteriormente esbozados presentes en forma de formulaciones farmacéuticas, es decir, los agentes activos presentes junto con un vehículo, un agente adyuvante y/o un agente diluyente farmacéuticamente aceptables.
Para uso médico, en los sistemas del invento se pueden utilizar sales de los agentes activos, sales que incluyen sales farmacéuticamente aceptables aunque se pueden utilizar otras sales en la preparación del compuesto o de la sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por sal farmacéuticamente aceptable se quiere significar aquellas sales que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin una toxicidad, una irritación y una respuesta alérgica excesivas, y son proporcionales a una razonable relación de beneficio/riesgo. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica.
Por ejemplo, se pueden preparar adecuadas sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos útiles en los sistemas del invento al mezclar un ácido farmacéuticamente aceptable, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido benzoico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido oxálico, ácido carbónico, ácido tartárico o ácido cítrico, con los compuestos del invento. Por lo tanto, las adecuadas sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos útiles en los sistemas del invento incluyen sales por adición de ácido.
Por ejemplo, S. M. Berge et al. describen con detalle sales farmacéuticamente aceptables en J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, 1977. Las sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos usados en los sistemas del invento o, separadamente al hacer reaccionar la función base libre con un ácido orgánico adecuado. Las sales por adición de ácido representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canfosulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato y valerato. Las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos representativas incluyen las de sodio, litio, potasio, calcio y magnesio, así como cationes de amonio, amonio cuaternario y amina atóxicos, incluyendo de amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina y etilamina.
Se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples de los compuestos o las composiciones farmacéuticas con unos niveles y patrones de dosificación que son seleccionados por el médico que trata al paciente. Pase lo que pase, los compuestos o composiciones farmacéuticas útiles en los sistemas del presente invento deben proporcionar una cantidad suficiente del compuesto para tratar eficazmente al paciente.
Un experto en la técnica podría determinar, mediante una experimentación rutinaria, la cantidad atóxica y eficaz de los compuestos o composiciones farmacéuticas utilizadas en el invento que sería necesaria para detectar células apoptóticas y/o tratar o prevenir los trastornos y las enfermedades. En general, se espera que una dosificación eficaz esté en el intervalo de 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por 24 horas; típicamente de 0,001 mg a 750 mg por kg de peso corporal por 24 horas, de 0,01 mg a 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 0,1 mg a 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas, de 0,1 mg a 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas. Más típicamente, se espera que el intervalo de dosis eficaz esté en el intervalo de 1,0 mg a 200 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 100 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 25 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 5,0 mg a 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 5,0 mg a 20 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 5,0 mg a 15 mg por kg de peso corporal por 24 horas.
Alternativamente, una dosificación eficaz puede ser hasta 500 mg/m^{2}. Generalmente, se espera que una dosificación eficaz esté en el intervalo de 25 a 500 mg/m^{2}, preferiblemente de 25 a 350 mg/m^{2}, más preferiblemente de 25 a 300 mg/m^{2}, aún más preferiblemente de 25 a 250 mg/m^{2}, aún más preferiblemente de 50 a 250 mg/m^{2}, y aún más preferiblemente de 75 a 150 mg/m^{2}.
En relación con GSAO, una dosificación eficaz está en el intervalo de 0,0001 mg a 100 mg de GSAO por kg de peso corporal por 24 horas, preferiblemente de 0,001 mg a 100 mg de GSAO por kg de peso corporal por 24 horas, más preferiblemente de 0,01 mg a 50 mg de GSAO por kg de peso corporal por 24 horas, aún más preferiblemente de 0,1 mg a 20 mg de GSAO por kg de peso corporal por 24 horas, y aún más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg de GSAO por kg de peso corporal por 24 horas.
En relación con un agente activo para uso en los sistemas del presente invento, una dosificación eficaz está en el intervalo de 0,0001 mg a 100 mg de agente por kg de peso corporal por 24 horas, preferiblemente de 0,001 mg a 100 mg de agente por kg de peso corporal por 24 horas, más preferiblemente de 0,01 mg a 50 mg de agente por kg de peso corporal por 24 horas, aún más preferiblemente de 0,1 mg a 20 mg de agente por kg de peso corporal por 24 horas, y aún más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg de agente por kg de peso corporal por 24 horas.
Aunque los compuestos utilizados en los sistemas del presente invento pueden ser administrados solos, generalmente es preferible que el compuesto sea administrado como una composición/formulación farmacéutica. En general, las formulaciones farmacéuticas que representan el(los) componente(s) de los sistemas del presente invento pueden ser preparadas de acuerdo con métodos que son conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la técnica, y, en consecuencia, pueden incluir un vehículo, un agente diluyente y/o un agente adyuvante farmacéuticamente aceptables.
Los vehículos, agentes diluyentes y agentes adyuvantes deben ser "aceptables" en términos de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación, y no ser deletéreos para el receptor de los mismos.
Los ejemplos de vehículos o agentes diluyentes farmacéutica y veterinariamente aceptables son agua desmineralizada o destilada; disolución salina; aceites basados en vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo, aceite de Arachis y aceite de coco; aceites de silicona, incluyendo polisiloxanos tales como metil-polisiloxano, fenil-polisiloxano y metilfenil-polisiloxano; siliconas volátiles; aceites minerales tales como parafina líquida, parafina blanda y escualano; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica e hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores tales como, por ejemplo, etanol e isopropranol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, tales como, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol y glicerol; ésteres de ácidos grasos, tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo y oleato de etilo; polivinilpirrolidona; agar; carragenano, goma tragacanto y goma arábiga; y vaselina. Típicamente, el vehículo o los vehículos formarán del 10% al 99,9% en peso de las composiciones.
En una forma preferida, la composición farmacéutica de un compuesto adecuado para uso en el invento comprende una cantidad eficaz de un agente activo, junto con un vehículo, un agente diluyente y/o un agente adyuvante farmacéuticamente aceptables como los mostrados en el Ejemplo 6 de Referencia.
Las composiciones farmacéuticas que representan un componente del sistema del invento pueden ser administradas por vías estándares. En general, las composiciones pueden ser administradas por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutánea o intramuscular). Aún en general, las composiciones que representan un componente del sistema del invento pueden estar en forma de una cápsula adecuada para ingestión oral, en forma de un ungüento, crema o loción adecuada para administración tópica, en una forma adecuada para suministro como gotas oculares, y en una forma aerosólica adecuada para administración por inhalación, tal como por inhalación intranasal o por inhalación oral.
Para administración en forma de disolución o suspensión inyectable, los agentes diluyentes o vehículos atóxicos parenteralmente aceptables pueden incluir disolución de Ringer, disolución salina isotónica, disolución salina tamponada con fosfato, etanol y 1,2-propilenglicol.
Algunos ejemplos de vehículos, agentes diluyentes, excipientes y agentes adyuvantes adecuados para uso oral incluyen aceite de cacahuete, parafina líquida, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato sódico, goma arábiga, goma tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, gelatina y lecitina. Además, estas formulaciones orales pueden contener agentes saboreadores y colorantes adecuados. Cuando se usan en forma de cápsulas, éstas pueden estar revestidas con compuestos tales como monoestearato de glicerilo y diestearato de glicerilo, que retrasan la desintegración de la cápsula.
Los agentes adyuvantes incluyen típicamente emolientes, agentes emulsivos, agentes espesativos, conservantes, bactericidas y agentes tampón.
Las formas sólidas para administración oral pueden contener agentes aglutinantes aceptables en la práctica farmacéutica humana y veterinaria, edulcorantes, agentes disgregantes, diluyentes, agentes saboreadores, agentes de revestimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes para retardo temporal. Los agentes aglutinantes adecuados incluyen goma arábiga, gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto, alginato sódico, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo y sacarina. Los agentes disgregantes adecuados incluyen almidón de maíz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma guar, goma xantano, bentonita, ácido algínico y agar. Los diluyentes adecuados incluyen lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato cálcico, silicato cálcico y fosfato dicálcico. Los agentes saboreadores adecuados incluyen aceite de menta, aceite de Gaulteria, y agentes saboreadores de cereza, naranja y frambuesa. Los agentes de revestimiento adecuados incluyen polímeros y copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zeína, goma laca y gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato sódico, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabeno, propilparabeno y bisulfito sódico. Los lubricantes adecuados incluyen estearato magnésico, ácido esteárico, oleato sódico, cloruro sódico y talco. Los agentes para retardo temporal adecuados incluyen monoestearato de glicerilo y diestearato de glicerilo.
Las formas líquidas para administración oral pueden contener, además de los agentes anteriores, un vehículo líquido. Los vehículos líquidos adecuados incluyen agua, aceites tales como aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de Arachis, aceite de coco, parafina líquida, etilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, triglicéridos, y mezclas de los mismos.
Las suspensiones para administración oral pueden comprender además agentes dispersivos y/o agentes suspendedores. Los agentes suspendedores adecuados incluyen carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, polivinilpirrolidona, alginato sódico y alcohol acetílico. Los agentes dispersivos adecuados incluyen lecitina, ésteres polioxietilénicos de ácidos grasos tales como el ácido esteárico, mono- y di-oleato, -estearato y -laurato de polioxietilen-sorbitol, y mono- y di-oleato, -estearato y -laurato de polioxietilen-sorbitán.
Las emulsiones para administración oral pueden comprender además uno o más agentes emulsivos. Los agentes emulsivos adecuados incluyen agentes dispersivos como los anteriormente ejemplificados y gomas naturales tales como goma guar, goma arábiga y goma tragacanto.
Las formulaciones tópicas para uso en el presente invento comprenden un ingrediente activo junto con uno o más vehículos aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos cualesquiera.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas y semilíquidas adecuadas para penetración a través de la piel hasta el sitio donde se necesita el tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas, ungüentos y pastas, y gotas adecuadas para administración a los ojos, los oídos o la nariz.
Las gotas para uso en el presente invento pueden comprender disoluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles. Éstas se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una disolución acuosa de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, e incluyen opcionalmente un agente tensioactivo. La disolución resultante puede ser luego clarificada por filtración, transferida a un recipiente adecuado y esterilizada. La esterilización se puede llevar a cabo por tratamiento en autoclave o mantenimiento a 90ºC-100ºC durante media hora, o por filtración, lo que va seguido de la transferencia a un recipiente mediante una técnica aséptica. El nitrato o acetato fenilmercúrico (0,002%), el cloruro de benzalconio (0,01%) y el acetato de clorhexidina (0,01%) son ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para inclusión en las gotas. Los disolventes adecuados para la preparación de una disolución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.
Las lociones de acuerdo con el presente invento incluyen las adecuadas para aplicación a la piel o los ojos. Una loción ocular puede comprender una disolución acuosa estéril que contenga opcionalmente un bactericida, y puede ser preparada mediante métodos similares a los anteriormente descritos en relación con la preparación de las gotas. Las lociones o linimentos para aplicación a la piel pueden también incluir un agente que acelere el secado y refresque la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un agente humectante tal como glicerol, o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de Arachis.
Las cremas, ungüentos y pastas de acuerdo con el presente invento son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Se pueden preparar mezclando el ingrediente activo en forma finamente dividida o pulverulenta, solo o en disolución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abejas o un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendras, maíz, Arachis, ricino u oliva; lanolina o sus derivados; o un ácido graso, tal como ácido esteárico u oleico, junto con un alcohol tal como propilenglicol o polietilenglicoles.
La formulación puede llevar incorporado cualquier agente tensioactivo adecuado, tal como un agente tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, tal como ésteres de sorbitán o derivados polioxietilénicos de los mismos. También se pueden incluir agentes suspendedores tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silíceas, y otros ingredientes tales como lanolina.
Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una disolución de un agente activo útil como componente del sistema del presente invento o un cóctel del mismo disuelto en un vehículo aceptable tal como agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicocola al 0,3%, etc., disoluciones que serán estériles y estarán relativamente exentas de materia corpuscular.
Los métodos para preparar composiciones parenteralmente administrables resultan evidentes a los expertos en la técnica y son descritos con mayor detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, EE.UU.
Las composiciones farmacéuticas que representan un componente y/o un agente activo del sistema del invento pueden ser también administradas en forma de liposomas. Los liposomas proceden generalmente de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas y están formados por cristales líquidos hidratados monolaminares o multilaminares que están dispersos en un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier lípido atóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las formulaciones en forma de liposomas pueden contener estabilizadores, conservantes y excipientes. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica, y se hace referencia específica a ellos en Prescott, redactor, "Methods in Cell Biology", volumen XIV, Academic Press, New York, New York, EE.UU. (1976), página 33 y siguientes.
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4. Kits
Los sistemas adecuados para uso de acuerdo con el presente invento pueden estar disponibles como kits en los que están envasados separadamente los respectivos componentes del sistema. Los recipientes adecuados incluyen recipientes de vidrio, recipientes de plástico, y tiras de plástico o papel tales como envases blíster. Los kits incluyen típicamente recipientes para alojar los diversos componentes, e instrucciones para utilizar los componentes del kit de acuerdo con los métodos del presente invento.
Los kits pueden ser utilizados de acuerdo con los métodos de detección del presente invento.
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Ejemplo 1 Síntesis de compuestos de arsenóxido
Se adquirieron los siguientes productos químicos y se utilizaron sin una purificación ulterior: fenilarsenóxido, bromuro de bromoacetilo, dióxido de azufre, d_{6}-dimetilsulfóxido, óxido de deuterio, metanol, ácido sulfúrico al 98%, ácido bromhídrico al 48%, ácido clorhídrico al 37% (Ajax, Auburn, New South Wales, Australia), diclorometano, hidróxido potásico, hidrogenocarbonato sódico, hidróxido sódico (BDH, Kilsyth, Victoria, Australia), gel P-2 extrafino con un corte de pesos moleculares de 1800 (Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.), 2,3-dimercaptopropanol (DMP), cloruro de tionilo (Merck, Darmstadt, Alemania), ácido 6,8-tióctico, ácido etilendiaminatetraacético, N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico), carbonato sódico, cloruro sódico, yoduro sódico (Sigma, Castle Hill, New South Wales, Australia), ácido p-arsanílico (Tokyo Kasei Kogyo, Tokio, Japón), glicocola (ICN, Aurora, Ohio, EE.UU.), y éster succinimidílico del ácido 6-{[6-([biotinoil]amino)hexanoil]amino}hexanoico (biotina-XX, SE) fueron obtenidos de Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU. Todos los demás reactivos fueron de calidad analítica.
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Instrumentación: Se obtuvieron espectros de RMN 1D y 2D usando un espectrómetro Bruker DPX300 de resonancia magnética nuclear, detectándose ^{1}H y ^{13}C a 300,17 MHz y 75,48 MHz, respectivamente. Las absorbancias UV-visibles se registraron en un lector Thermomax Plus de microplacas, de Molecular Devices (Palo Alto, California, EE.UU.).
Preparación de óxido de deuterio acidificado: Se añadió cuidadosamente cloruro de tionilo fresco a óxido de deuterio en exceso. Una vez que hubo cesado el desprendimiento de SO_{2}, se añadió la disolución resultante (0,6 ml) a GSAO (aproximadamente 50 mg) en un tubo de 5 mm para RMN. Se usó esta muestra para obtener los espectros de RMN.
Ejemplo 1(a)
Síntesis de 4-[N-(S-glutationilacetil)amino]fenilarsenóxido (GSAO)
La síntesis total de GSAO se representa esquemáticamente en la Figura 1.
Síntesis del ácido 4-[N-(bromoacetil)amino]fenilarsónico (BRAA)
Se añadió carbonato sódico (40,14 g, 378,7 milimoles) a agua (200 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiental hasta que se disolvió todo el sólido. Se añadió ácido p-arsanílico (29,99 g, 138,2 milimoles), en porciones, a la disolución agitada de carbonato y se completó el volumen de la disolución hasta 300 ml con la adición de más agua. La disolución (pH de 10 a 11) fue dejada en agitación durante 30 minutos y, en caso de necesidad, fue filtrada para separar todo sólido sin disolver antes de ser enfriada durante un periodo de 2 a 3 horas. Se transfirió la disolución a un embudo de decantación y se añadieron trocitos de hielo. Se diluyó bromuro de bromoacetilo (15 ml, 34,76 g, 172,1 milimoles) en diclorometano (50 ml) y se añadió cuidadosamente cerca de la mitad de la disolución en diclorometano a la disolución acuosa fría. Se sacudió cuidadosamente la mezcla, con descarga frecuente de gases para evitar una excesiva acumulación de presión. Después de 1 a 2 minutos, el desprendimiento de dióxido de carbono había remitido y se emprendió un sacudimiento más enérgico. Se añadió cuidadosamente la porción restante de bromuro de bromoacetilo y se repitió el procedimiento. Una vez acabada la reacción, se halló que el pH de la disolución era 7. La capa inferior de diclorometano fue desechada y la capa acuosa fue transferida a un matraz de 1 l de capacidad y fue cuidadosamente acidificada mediante la adición, gota a gota, de ácido sulfúrico al 98%. La precipitación completa del producto blanco requirió la adición de ácido hasta que el pH de la disolución fue aproximadamente 1. El producto crudo fue recogido y fue secado en la bomba, típicamente con rendimientos de 50% a 75%. ^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO): \delta, 4,09 (s, 2H), 7,73 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,83 (d, J = 9 Hz, 2H), 10,87 (s, 1H). ^{13}C-RMN (d_{6}-DMSO): \delta, 30,53, 119,97, 127,34, 131,56, 143,08, 166,00 ppm.
Síntesis de hidrato de 4-[N-(bromoacetil)amino]fenilarsenóxido (BRAO\cdotxH_{2}O)
Se introdujo BRAA (12,15 g, 36 milimoles) en un matraz de fondo redondo y 3 bocas, de 500 ml de capacidad. Se disolvió el sólido en una mezcla de metanol (75 ml) y ácido bromhídrico (48%, 75 ml) con formación de remolinos, para obtener una disolución amarilla transparente. Se filtró la disolución para separar los sólidos residuales. Se añadió yoduro sódico (0,20 g, 1,3 milimoles) como catalizador, tras lo cual el color de la disolución se oscureció hasta un marrón anaranjado, y luego se hizo pasar lentamente dióxido de azufre gaseoso (aproximadamente 2 burbujas por segundo) a través de la disolución agitada durante aproximadamente 2,5 horas. El precipitado blanco resultante fue recogido utilizando un embudo Büchner para obtener el producto (17,43 g) en forma de sólido blanco húmedo. Se determinó que la actividad de una disolución obtenida al disolver una porción del sólido (40,7 mg) en DMSO desoxigenado (800 \mul) era 56 mM (véase más adelante). De aquí se concluye que el peso molecular del BRAO\cdotxH_{2}O es 908,5, es decir, 35% de BRAO en peso/peso y 65% de H_{2}O en peso/peso. Por lo tanto, el peso "anhidro" del producto de BRAO era el 35% de 17,43 g, es decir, 6,10 g (19 milimoles; 53% de rendimiento). ^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO): \delta, 4,85 (s, 2H), 7,78 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,86 (d, J = 9 Hz, 2H), 11,36 (s, 1H). ^{13}C-RMN (d_{6}-DMSO): \delta, 30,55, 119,22, 130,52, 140,04, 145,04, 165,52 ppm.
Síntesis de 4-[N-(S-glutationilacetil)amino]fenilarsenóxido (GSAO)
Se desoxigenó DMSO (10 ml) haciendo pasar una corriente de nitrógeno gaseoso a través de él durante algunos minutos, y se utilizó para disolver el BRAO\cdotxH_{2}O (1,00 g, 2,48 milimoles de arsenóxido activo). Se disolvió glutatión (1,15 g, 3,74 milimoles, 1,5 equivalentes) en tampón de bicarbonato 0,5 M (35 ml), pH de 9,6, y se añadió a la disolución de BRAO\cdotxH_{2}O en DMSO. Se completó el volumen total hasta 50 ml con tampón de bicarbonato 0,5 M y se agitó suavemente la disolución a temperatura ambiental durante la noche. Una cuidadosa neutralización con ácido clorhídrico al 37%, seguida de liofilización, proporcionó un producto pulverulento blanco que pudo ser disuelto en agua sin que quedara sólido residual alguno. Se halló que la concentración de arsenóxido activo de la disolución resultante era 49,6 mM, determinada utilizando el ensayo de DMP/DTNB (véase más
adelante).
El producto fue purificado utilizando filtración en gel (gel P-2 extrafino, corte de 1,8 kDa, 50 g) en una columna de 130 ml de capacidad, usando un tampón de Hepes 20 mM, NaCl 0,14 M, EDTA 1 mM, pH de 7,4, como eluyente con un caudal de 0,10 ml/minuto. Se recogió un volumen total de 144 ml (72 fracciones de 2 ml) que fue analizado por UV (\lambda de 214 nm). Se resolvieron cuatro picos: A, B, C y D. Los picos B y C mostraron actividad en el ensayo de DTNB/DMP (véase más adelante) y fueron asignados a GSAO y BRAO sin reaccionar, respectivamente. Los picos A y D fueron provisionalmente asignados a los productos de oxidación GSAA y BRAA (el producto de oxidación de BRAO), respectivamente (véase más adelante). También se detectó glutatión sin reaccionar (usando DTNB) en las fracciones correspondientes al pico A. Las fracciones correspondientes al pico B fueron combinadas y fueron desoxigenadas con nitrógeno gaseoso para obtener una disolución de GSAO (15 mM, aproximadamente 12 ml). ^{1}H-RMN (D_{2}O): \delta, 1,93 (q, J = 7 Hz, 2H), 2,35 (t, J = 8 Hz, 2H), 2,84 (dd, J = 14 Hz, J = 9 Hz, 1H), 3,05 (dd, J = 14 Hz, J = 5 Hz, 1H), 3,35 (s, 2H), 3,58 (t, J = 6 Hz, 1H), 3,64 (d, J = 2 Hz, 2H), 4,48 (dd, J = 9 Hz, J = 5 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,58 (d, J = 8 Hz, 2H). ^{13}C-RMN (D_{2}O): \delta, 25,93, 31,16, 33,53, 36,01, 42,97, 52,83, 53,89, 121,29, 129,97, 138,77, 144,09, 170,90, 171,73, 173,75, 174,68, 175,76 ppm.
También se usó la espectroscopía de RMN 2D para confirmar la estructura de GSAO. Se halló que toda una serie de espectros de RMN de ^{1}H y ^{13}C, COSY de ^{1}H, ^{13}C y ^{1}H-^{1}H, HMQC de ^{1}H-^{13}C y HMBC de ^{1}H-^{13}C era consistente con la estructura propuesta en la Figura 1. Conjuntamente considerados, todos los espectros permitían la asignación inequívoca de todos los átomos de carbono y todos los átomos de hidrógeno no intercambiables. En la Figura 2, se muestra una ampliación del espectro de ^{1}H-^{13}C de GSAO por HMBC, que muestra la región alifática. La técnica de HMBC de ^{1}H-^{13}C permite correlacionar núcleos de ^{1}H y ^{13}C acoplados, pero filtra directamente los núcleos enlazados. Esto significa que los núcleos de ^{1}H y ^{13}C que están separados por dos, tres o (a veces) cuatro enlaces aparecen como picos cruzados en el espectro. La Figura 2 muestra que C11 está sólo fuertemente acoplado con H7 (en referencia a los protones fijados a C7), mientras que C7 está fuertemente acoplado con H11 además de con H6. Esto confirma que el azufre del glutatión estaba exitosamente alquilado con BRAO.
Ejemplo 1(b) de Referencia
Síntesis del ácido 4-[N-(S-glutationilacetil)amino]fenilarsónico (GSAA)
La síntesis de GSAA se representa esquemáticamente en la Figura 3.
Se disolvieron BRAA (1,00 g, 2,96 milimoles) y glutatión (1,36 g, 4,44 milimoles, 1,5 equivalentes) en tampón de bicarbonato 0,5 M (50 ml), pH de 9,6, y se agitó suavemente la disolución a temperatura ambiental durante la noche. Una liofilización proporcionó un producto pulverulento blanco que era completamente soluble en agua, no quedando residuo sólido alguno. El producto fue purificado mediante filtración en gel en una columna (2,5 x 117 cm) de Bio-Gel P-2 extrafino (BioRad, Hercules, California, EE.UU.), de 570 ml de capacidad, utilizando agua desionizada como eluyente con un caudal de 0,1 ml por minuto. El producto (GSAA) era eluido de la columna en una posición que correspondía al pico A en la purificación de GSAO.
Ejemplo 1(c) de Referencia
Síntesis de 4-{N-[S-(N-{6-[(6-{[biotinoil]amino}hexanoil)amino]hexanoil}glutationil)acetil]amino}fenilarsenóxido (GSAO-B)
La síntesis de GSAO-B se representa esquemáticamente en la Figura 4.
Se disolvió GSAO (0,13 g) en tampón de bicarbonato sódico 0,5 M (5 ml, pH de 8,5), y se determinó que la concentración de compuesto arsenical activo en la disolución resultante era 39 mM. La disolución arsenical tamponada (4,2 ml, que contenía 165 micromoles de compuesto arsenical activo) fue añadida a una disolución de biotina-XX, SE (100 mg, 176 micromoles) en DMSO (1 ml), y la mezcla fue invertida unas cuantas veces y fue luego incubada a 4ºC durante 4 horas. Se añadió glicocola (17,5 mg, 233 micromoles) y se mantuvo la mezcla a 4ºC durante la noche. Se determinó que la concentración de compuesto arsenical trivalente en el producto de GSAO-B era 31 mM y se usó la disolución sin una modificación ulterior.
Ejemplo 1(d) de Referencia
Conjugación de fluoresceína con GSAO o GSAA
Se añadió una disolución de éster succinimidílico de fluoresceína-5-EX (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) (2,4 mg, 4,1 micromoles) en DMSO (240 \mul) a GSAO o GSAA (33,8 mM) en tampón de Mes (5 mM, 473 \mul), pH de 5,5, y la mezcla fue diluida con tampón de bicarbonato (0,5 M, 3,287 ml), pH de 9, y fue dejada en reposo a temperatura ambiental durante 80 minutos. La mezcla de reacción fue luego diluida con glicocola (100 mM) en PBS (4 ml) y fue dejada en reposo a temperatura ambiental durante la noche. La disolución final contenía compuesto arsenical trivalente (2,00 mM) y glicocola (50 mM). La relación molar de fluoresceína-5X a GSAO o GSAA era \sim 1,5:1. Los pesos moleculares de GSAO-fluoresceína y GSAA-fluoresceína (GSAO-F y GSAA-F) son 1024 y 1040, respectivamente. La síntesis de GSAO-F se representa esquemáticamente en la Figura 5.
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Ejemplo 1(e) de Referencia
Conjugación de Cy^{TM}5.5 con GSAO o GSAA
Se mezcló una disolución de Cy^{TM}5.5 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) (266 nanomoles) en tampón de bicarbonato (0,5 M, 968 \mul), pH de 9, con una disolución de GSAO o GSAA (33,8 mM) en tampón de Mes (5 mM, 32 \mul), pH de 5,5, y se dejó la mezcla en reposo a temperatura ambiental durante 80 minutos. La mezcla de reacción fue luego diluida con glicocola (100 mM) en PBS (1 ml) y fue dejada en reposo a temperatura ambiental durante la noche. La disolución final contenía compuesto arsenical trivalente (0,54 mM) y glicocola (50 mM). La relación molar de GSAO o GSAA a Cy^{TM}5.5 era \sim 4:1. Los pesos moleculares de GSAO-Cy^{TM}5.5 y GSAA-Cy^{TM}5.5 son 1447 y 1463, respectivamente. La síntesis de GSAO-Cy^{TM}5.5 se representa esquemáticamente en la Figura 6.
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Ejemplo 2 de Referencia
Ejemplo 2(a)
Ensayo de GSAO-B, GSAO-F y GSAO-Cy^{TM}5.5
Se midieron las concentraciones de GSAO-B, GSAO-fluoresceína (GSAO-F) y GSAO-Cy^{TM}5.5 en disolución titulando con dimercaptopropanol (DMP) y calculando los tioles libres restantes con 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB; Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) (Donoghue et al., 2000). Se disolvió una disolución madre de DMP (5 \mul, 50 micromoles) en DMSO (995 \mul) para obtener una concentración 50 mM de DMP. Una segunda dilución de la disolución madre 50 mM de DMP (10 \mul) en un tampón con un pH de 7,0 (HEPES 0,1 M, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM; 990 \mul) proporcionó una disolución de trabajo de DMP 500 \muM. luego se pudo determinar la actividad del compuesto arsenical mediante la titulación de cantidades variables de compuesto arsenical frente a la disolución de trabajo de DMP (10 \mul) en una placa de 96 pocillos para microtitulación, completándose el volumen total hasta 195 \mul mediante la adición de tampón. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiental, tiempo durante el cual las disoluciones fueron agitadas en un sacudidor de placas, se añadieron 5 \mul de una disolución madre 37,9 mM de DTNB (15 mg) en DMSO (1 ml) y se incubó la placa con sacudimiento durante otros 10 minutos. Se midió la absorbancia a 412 nm, debida a la formación del dianión de TNB, usando un lector Thermomax Plus de microplacas, de Molecular Devices (Palo Alto, California, EE.UU.). El coeficiente de extinción del dianión de TNB a 412 nm y un pH de 7,0 es 14.150 M^{-1}cm^{-1} (Riddles et al., 1983). Los productos de conjugación fueron esterilizados por filtración y fueron almacenados a 4ºC en oscuridad hasta su uso. No hubo pérdida significativa alguna en la concentración activa de las disoluciones madre de los compuestos arsenicales durante al menos una semana cuando se almacenaron bajo estas condiciones. La glicocola lentifica la oxidación de GSAO a GSAA (Donoghue et al., 2000).
Ejemplo 2(b)
Interacción de GSAO-B con PDI y tiorredoxina
La PDI y la tiorredoxina recombinantes humanas se unían a GSAO-B (Figura 7). Se produjo proteína disulfuro isomerasa (PDI) humana recombinante en E. coli y se purificó de acuerdo con Jiang et al. (1999). En el experimento, se incubó PDI, tiorredoxina o albúmina purificadas, esta última como testigo negativo, con un exceso molar de 2 órdenes de magnitud de ditiotreitol durante 60 minutos para asegurar que los disulfuros de sitios activos de la PDI y la tiorredoxina estaban en el estado de ditiol reducido. Luego se incubaron las proteínas con GSAO-B, o con GSAO-B y un exceso molar de 4 órdenes de magnitud de DMP, durante 30 minutos. Moles equivalentes de las proteínas marcadas fueron resueltos mediante SDS-PAGE, transferidos a una membrana de PVDF y hechos reaccionar con estreptavidina-peroxidasa para detectar el marcador GSAO-B. Las muestras fueron resueltas por SDS-PAGE al 4-15% bajo condiciones no reductoras y fueron transferidas a una membrana de PVDF. Las proteínas fueron detectadas por transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal murino anti-PDI (Jiang et al., 1999) (utilizado en una cantidad de 2 \mug por ml). Se usaron anticuerpos anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante, generados en conejo (Dako Corporation, Carpinteria, California, EE.UU.), en una dilución 1:2000. Las proteínas marcadas con GSAO-B fueron hechas reaccionar con estreptavidina-peroxidasa (Amersham, Sidney, New South Wales, Australia) utilizada en una dilución 1:1000. Las proteínas fueron visualizadas usando quimioluminiscencia (DuPont NEN, Boston, Massachusetts, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las películas para quimioluminiscencia fueron analizadas utilizando un densitómetro de imágenes GS-700 y el software Multi-Analyst (Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.).
Tanto la PDI como la tiorredoxina incorporaron GSAO-B, pero la albúmina no. La banda superior de M_{r} del carril 1 de la Figura 7B era una pequeña cantidad de PDI agregada de la preparación (Jiang et al., 1999). Es digno de mención que la densidad de la marcación de PDI era aproximadamente el doble de la densidad de la tiorredoxina, lo que es coherente con los dos ditioles de sitios activos de la PDI frente al único de la tiorredoxina.
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Ejemplo 3 de Referencia
Estudios in vitro e in vivo
Ejemplo 3(a)
Tinción de células adherentes con GSAO-B Métodos
Se sembraron células BAE, con una densidad de 5 x 10^{5} células por pocillo, en portaobjetos de vidrio con cámaras de 2 pocillos (Nunc, Naperville, Illinois, EE.UU.), y se dejó que se fijaran durante la noche. Las células fueron tratadas durante 16 horas con GSAO-B 10 \muM, y fueron luego lavadas dos veces con PBS, fijadas en PBS que contenía formaldehído al 3,7% y permeabilizadas con PBS que contenía formaldehído al 3,7% y TritonX-100 al 0,1%, y fueron después lavadas dos veces e incubadas durante 1 hora a temperatura ambiental con una dilución 1:200 de estreptavidina conjugada con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) en PBS que contenía BSA al 1%. Las células fueron luego lavadas tres veces con PBS y fueron montadas en un agente antidecoloración VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE.UU.). Se tomaron fotografías con un microscopio Olympus BX60 con fluorescencia BX-FLA, y una cámara digital Spot de Diagnostic Instruments y el software v2.2 (Sterling Heights, Michigan, EE.UU.).
Resultados
Cuando las células endoteliales cultivadas se tiñeron con GSAO-B y se visualizaron con estreptavidina-Alexa 488, se observó que la célula ocasional se teñía muy intensamente (Figura 8). La inmensa mayoría de las células se unían muy poco a GSAO-B.
Ejemplo 3(b)
Células apoptóticas marcadas con GSAO después de la activación de caspasas Métodos Cultivo celular
Se cultivaron células de fibrosarcoma humano HT1080 y células endoteliales aórticas bovinas (ATCC, Bethesda, Maryland, EE.UU.) en medio DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS; del inglés, foetal bovine serum) al 10%, L-glutamina 2 mM y 5 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). Se cultivó la línea de células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1; del inglés, human microvascular endothelial cell) (Ades et al., 1992) en medio MCDB131 (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 5 U/ml de penicilina/estreptomicina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) y 1 \mug/ml de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Se separaron las células con PBS que contenía EDTA 10 mM o con una disolución de tripsina/EDTA (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). Las placas para cultivo procedían de Corning Costar, Corning, New York, EE.UU.
Citometría de flujo de células marcadas con GSAO y con anexina V
Las células HT1080 fueron tratadas durante 20 horas con 1 \mug/ml de camptotecina (Calbiochem, San Diego, California, EE.UU.) y fueron luego separadas con PBS que contenía EDTA 2,5 mM y combinadas con las células que se habían separado durante la incubación. Se lavaron las células dos veces con tampón de unión para anexina V (Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, pH de 7,4) y se incubaron 2 x 10^{5} células por tratamiento en 100 \mul de tampón de unión para anexina V que contenía GSAO-F o GSAA-F 10 \muM durante 15 minutos a temperatura ambiental con sacudimiento. Se lavaron las células dos veces y luego se incubaron durante 15 minutos en 100 \mul de tampón de unión para anexina V que contenía 5 \mul de anexina V conjugada con ficoeritrina (anexina V-PE; PharMingen, San Diego, California, EE.UU.) y 1 \mul de una disolución de 100 \mug/ml de yoduro de propidio (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Luego se completó el volumen total hasta 500 \mul con tampón de unión para anexina V y se transfirieron las muestras a hielo. La citometría de flujo se llevó a cabo utilizando un citómetro de flujo FACStar (Becton Dickinson). Los resultados proceden de 10^{4} células por muestra. Para probar el efecto de la inhibición de caspasas sobre la incorporación de GSAO-F, las células fueron tratadas con camptotecina en ausencia o presencia de 10 \mug/ml de Z-VAD-FMK (carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona) (Calbiochem-Novabiochem, San Diego, California, EE.UU.) y fueron luego separadas, lavadas e incubadas en tampón de unión para anexina V que conte-
nía GSAO-F 10 \muM durante 15 minutos. Las células fueron lavadas dos veces y fueron sometidas a citometría de flujo.
Resultados
Se trataron células HT1080 de fibrosarcoma humano con camptotecina, un inhibidor de la topoisomerasa (Kaufmann, 1998), durante 20 horas para provocar apoptosis, y las células no tratadas o las células tratadas con camptotecina se incubaron con una combinación de GSAO o GSAA conjugados con fluoresceína (GSAO-F y GSAA-F), y anexina V conjugada con ficoeritrina (anexina V-PE). Se cuantificó la fluorescencia por citometría de flujo (Figura 9a-f). Resultó evidente un aumento de células apoptóticas y muertas después del tratamiento con camptotecina, con un aumento de 7,3 órdenes de magnitud en la proporción de células que tenían una fluorescencia por ficoeritrina superior a 100 unidades de fluorescencia. Este aumento de células positivas para anexina V se correlacionaba con un aumento de 8,6 órdenes de magnitud en la proporción de células cuya fluorescencia por fluoresceína era superior a 1027 unidades (Figura 9c). Por contraste, el tratamiento con camptotecina no aumentó la proporción de células que se marcaban conjuntamente con GSAA-F y anexina V-PE (Figura 9f). Las fluorescencias medias por fluoresceína de las células no tratadas y marcadas con GSAA-F o GSAO-F eran similares (255 unidades para GSAO-F; 213 unidades para GSAA-F), mientras que, en la población de células tratadas con camptotecina, resultó evidente una clara diferencia en las fluorescencias medias (1400 unidades para GSAO-F; 219 unidades para GSAA-F). Se obtuvieron resultados similares cuando se provocó apoptosis en células endoteliales microvasculares dérmicas humanas usando 1 \mug/ml de camptotecina u homocisteína 10 ó 25 mM durante 24 horas (no mostrado).
Se dejaron células HT1080 sin tratar o se trataron con camptotecina para provocar apoptosis, y luego se separaron y se marcaron con GSAO-F, anexina V-PE y yoduro de propidio, el colorante que se une al ácido nucleico. El yoduro de propidio es incorporado por las células en las últimas fases de la apoptosis y por las células necróticas, mientras que la anexina V se une a las células al principio del programa apoptótico. Se representó gráficamente la fluorescencia por anexina V-PE frente a la fluorescencia por GSAO-F en todas las células y en todas las células salvo aquellas que habían incorporado yoduro de propidio (> 200 unidades de fluorescencia). Se muestra (Figura 9g) el porcentaje de células que se tiñeron intensamente tanto con anexina V-PE (> 200 unidades de fluorescencia) como con GSAO-F (> 1980 unidades de fluorescencia). GSAO-F se unía tanto a células apoptóticas como a células
muertas.
Las caspasas son una clase de aspartato proteasas que son activadas por estímulos apoptóticos en todas las células, desencadenando la proteolisis de dianas celulares tales como el citoesqueleto y la fragmentación del DNA nuclear (Thomberry y Lazebnik, 1998). La activación de caspasas es un componente esencial del programa apoptótico, y se ha utilizado mucho Z-VAD-FMK, un inhibidor de caspasas de amplio espectro, para bloquear procesos dependientes de caspasas (Zhu et al., 1995). Se trataron células HT1080 con camptotecina del modo anterior, en presencia o ausencia de Z-VAD-FMK. El tratamiento con Z-VAD-FMK bloqueaba sustancialmente el aumento de células positivas para GSAO-F visto con el tratamiento con camptotecina, lo que indica que la actividad caspasa es un requisito para la incorporación de GSAO por células apoptóticas.
Ejemplo 3(c)
GSAO entró en células apoptóticas y marcó proteínas que contenían ditioles estrechamente espaciados Métodos Microscopía confocal de células marcadas con GSAO y con anexina V
Se trataron células HT1080 con 1 \mug/ml de camptotecina durante 20 horas, y luego se separaron con PBS que contenía EDTA 10 mM, se lavaron con tampón de unión para anexina V y se incubaron durante 15 minutos en tampón de unión para anexina V que contenía anexina V conjugada con Alexa 594 en relación 1:20 (volumen/volumen) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) y GSAO-F 10 \muM. Las células fueron luego lavadas dos veces con tampón de unión para anexina V y dispuestas sobre un portaobjetos de microscopio con una pipeta. Se capturaron cortes celulares transversales utilizando un microscopio Olympus BX60 y una unidad confocal y un software Optiscan F900e (Optiscan, Notting Hill, Australia).
Marcación de células con GSAO-B
Se trataron células HT1080 con 1 \mug/ml de camptotecina durante 20 horas y se marcaron con anexina V-PE y GSAO-B 10 \muM del modo anteriormente descrito para la marcación con GSAO-F y anexina V-PE. Se separaron las células basándose en su fluorescencia por anexina V-PE y se lavaron tres veces con PBS, y se lisaron 4 x 10^{4} células en 40 \mul de tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5 M, Triton X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 1%, SDS al 0,1%, leupeptina 10 \muM, aprotinina 10 \muM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM, EDTA 5 mM, pH de 8,0) a 4ºC. Se sometieron cantidades iguales del lisado a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS en gradiente de 8-16% (Gradipore, Sydney) y se transfirieron los productos resueltos a una membrana de poli(fluoruro de vinildietileno) (PVDF; Millipore, Bedford, Massachusetts, EE.UU.), y se detectaron las proteínas biotiniladas con una dilución 1:2000 de avidina-peroxidasa (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Para identificar las proteínas que habían incorporado GSAO-B, se incubaron 20 \mul del lisado en RIPA con 5 \mul de estreptavidina-Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) durante 15 minutos a 4ºC. Los glóbulos fueron luego lavados dos veces con tampón RIPA, resuspendidos en 20 \mul de tampón de carga para SDS-PAGE, resueltos por SDS-PAGE y transferidos a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno), y se detectó la PDI por transferencia Western usando 2 \mug/ml de anticuerpos policlonales anti-PDI (Donoghue et al., 2000) y una dilución 1:2000 de anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa, generados en cabra (Dako Corporation, Carpinteria, California, EE.UU.). Las transferencias se desarrollaron usando quimioluminiscencia potenciada ECL (NEN, Boston, Massachusetts, EE.UU.).
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Las células HT1080 no tratadas y las tratadas con camptotecina fueron también marcadas con GSAO-B 10 \muM en ausencia o presencia de dimercaptopropanol 50 \muM durante 15 minutos a 20ºC y con sacudimiento. Se lavaron tres veces las células con PBS y se lisaron 2 x 10^{5} células en 100 \mul de tampón RIPA a 4ºC. Los lisados fueron resueltos por SDS-PAGE y hechos reaccionar con avidina-peroxidasa de la manera anteriormente descrita.
Resultados
Se trataron células HT1080 con camptotecina para provocar apoptosis y luego se separaron y se marcaron con GSAO-F y anexina V-Alexa 594. Se obtuvieron imágenes de las células por microscopía confocal. GSAO-F se distribuía en el citoplasma de las células positivas para anexina V [Figura 10a (i-vi)]. Hubo una insignificante fluorescencia por GSAO-F en las células que no se marcaron con anexina V [Figura 10a (vii)].
Se trataron células HT1080 con camptotecina para provocar apoptosis y luego se separaron y se marcaron con anexina V-PE y GSAO conjugado con biotina (GSAO-B) (Donoghue et al., 2000). Se distribuyeron las células en poblaciones positiva para anexina V (> 100 unidades de fluorescencia) y negativa para anexina V (< 100 unidades), y se resolvieron números equivalentes de células de cada población por SDS-PAGE y se hicieron reaccionar con estreptavidina-peroxidasa para detectar las proteínas marcadas con GSAO-B. En las células positivas para anexina V, aproximadamente siete proteínas incorporaron claramente GSAO-B (Figura 10b). En comparación, el nivel de incorporación de GSAO-B por las células negativas para anexina V resultó insignificante.
Las proteínas marcadas con GSAO-B fueron también recogidas sobre estreptavidina-Dynabeads, resueltas por SDS-PAGE y sometidas a transferencia Western para proteína disulfuro isomerasa (PDI), una proteína que abunda en el retículo endoplásmico y actúa como una chaperona redox (Donoghue et al., 2000; Novia, 1999). La intensidad de la marcación de PDI en las células positivas para anexina V era mucho mayor que la marcación de esta proteína en las células negativas para anexina V (Figura 10c).
Para confirmar que GSAO-B estaba interaccionando con ditioles estrechamente espaciados en las células apoptóticas, se dejaron células HT1080 sin tratar o se trataron con camptotecina y luego se separaron y se marcaron con GSAO-B en ausencia o presencia de dimercaptopropanol (Figura 10d). Este ditiol sintético compite con ditioles proteicos para unirse a GSAO-B (Donoghue et al., 2000). De nuevo, hubo mucha más marcación de la población tratada con camptotecina que de la población no tratada, y la marcación de proteínas celulares apoptóticas por GSAO-B resultó suprimida al incubar las células con un exceso molar de 5 órdenes de magnitud de dimercaptopropanol.
Ejemplo 3(d)
GSAO marcó in vivo células tumorales apoptóticas o muertas Métodos
Se administraron 36 mg/kg de GSAO-B o GSAA-B en 0,2 ml de PBS que contenía glicocola 20 mM a ratones BALB/C desnudos (Biological Resources Centre, Universidad de New South Wales, Sydney, Australia) que portaban tumores subcutáneos BxPC-3 en la superficie dorsal proximal, mediante inyección subcutánea en la ijada trasera. Los ratones fueron sacrificados 6 horas más tarde y los tumores fueron embebidos en compuesto OCT (Sukura, Torrence, California, EE.UU.) y fueron instantáneamente congelados en nitrógeno líquido. Se fijaron cortes de 5 \mum de los tumores con acetona, se tiñeron con StreptABComplex/HRP (Dako Corporation, Carpinteria, California, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se contratiñeron con hematoxilina. También se fijaron cortes con acetona/metanol, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y se tiñeron con anticuerpo de conejo anti-caspasa 3 activada (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.)/anticuerpo anti-conejo generado en cabra y copulado con Texas Red y avidina-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Los cortes fueron contrateñidos con DAPI (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) y montados con Fluoromount-G (Southern Biotechnology, Birmingham, Alabama, EE.UU.).
Resultados
Los ratones que portaban tumores subcutáneos BxPC-3 recibieron GSAO-B o GSAA-B por inyección subcutánea en un sitio alejado del tumor. Se sacrificaron los ratones 6 horas más tarde, se extirparon los tumores y se detectó GSAO-B con estreptavidina-peroxidasa. Había una acumulación de GSAO-B en las regiones del tumor donde predominaban células apoptóticas o muertas (Figura 11a). GSAO-B teñía las células que mostraban signos visibles de apoptosis, incluyendo un núcleo condensado y un citoplasma encogido, pero no las células tumorales sanas. No hubo tinción alguna del tejido tumoral que no había sido incubado con estreptavidina-peroxidasa ni de los tumores de ratones que habían recibido GSAA-B (no mostrado). La marcación de las células apoptóticas fue confirmada tiñendo cortes para caspasa 3 activada y para GSAO-B. La caspasa 3 activada y GSAO-B se localizaban juntos, pero no se detectó GSAA-B en los cortes (Figura 11b). También se detectó GSAO-B en regiones apoptóticas y necróticas de tumores de carcinoma pancreático humano AsPC-1 desarrollados subcutáneamente en ratones SCID (no mostrado).
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Ejemplo 4 de Referencia
Formación de imágenes de tumores in vivo con GSAO marcado con un colorante fluorescente del infrarrojo cercano Métodos
Se administraron 0,8 mg/kg de GSAO-Cy^{TM}5.5, GSAA-Cy^{TM}5.5 o el colorante Cy^{TM}5.5 solo en 0,1 ml de PBS que contenía glicocola 20 mM a ratones C57BL/6 (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, EE.UU.) que portaban tumores pulmonares de Lewis subcutáneos, ratones SCID (Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, EE.UU.) que portaban tumores subcutáneos BxPC-3 o ratones TRAMP (Greenberg et al., 1995), mediante inyección subcutánea en la ijada trasera derecha. Los tumores subcutáneos se establecieron en la superficie dorsal proximal.
El sistema formador de imágenes usaba un microscopio de fluorescencia Leica Microsystems (Allendale, New Jersey, EE.UU.) con una fuente de lámpara halógena de 100 W y un sistema filtrante para Cy^{TM}5.5 (Chroma Technology, Brattleboro, Vermont, EE.UU.). Se confinaron ratones anestesiados en una caja a prueba de luz y se detectó la fluorescencia mediante un dispositivo monocromo de carga acoplada de 12 bits (Photometrics, Tucson, Arizona, EE.UU.). El tiempo de exposición fue 8 segundos, con imágenes digitalmente adquiridas como archivos Tiff de 16 bits en IPLab (Scananalytics, Fairfax, Virginia, EE.UU.). También se adquirieron imágenes de los tumores con luz blanca.
Resultados
Cy^{TM}5.5 es un colorante fluorescente del infrarrojo cercano que ha sido utilizado para formar imágenes de tumores in vivo (Weissleder et al., 1999). Se administraron 0,8 mg/kg de GSAO-Cy^{TM}5.5, mediante inyección subcutánea, a ratones C57BL/6 que portaban tumores pulmonares murinos de Lewis de \sim 0,3 g y se adquirieron imágenes de fluorescencia empezando en la hora 1 y acabando a las 48 horas después de la inyección. En la Figura 11c (A) se muestra la imagen de un tumor pulmonar de Lewis con luz blanca. En la Figura 11c (B) se muestra la misma vista a través del filtro de infrarrojo cercano una hora después de la inyección. Las imágenes muestran que el GSAO-Cy^{TM}5.5 había sido absorbido por la vasculatura y marcaba la piel así como el tumor. En las Figuras 11c (C) y 11c (D) se muestran, respectivamente, imágenes de fluorescencia de la piel dorsal y el tumor 24 horas después de la inyección. El GSAO-Cy^{TM}5.5 había sido aclarado de la mayoría de la vasculatura y sólo quedaba marcado el tumor. Un examen de la orina indicaba la excreción del GSAO-Cy^{TM}5.5 en menos de una hora después de la inyección, con una intensidad máxima a las 4-8 horas (no mostrado). Un examen ulterior de los tumores a las 30, 36 y 48 horas demostró una relación máxima de señal tumoral a señal de fondo a las 24 horas, quedando poca señal a las 48 horas. Ni GSAA-Cy^{TM}5.5 ni Cy^{TM}5.5 marcaron los tumores pulmonares de Lewis (no mostrado). Utilizando GSAO-Cy^{TM}5.5, también se obtuvie-
ron imágenes de tumores de fibrosarcoma T241 murino desarrollados en el dorso de ratones C57BL/6 (no mostrado).
También se marcaron tumores humanos desarrollados en ratones inmunodeficientes, mediante GSAO-Cy^{TM}5.5. Se administraron 0,8 mg/kg de GSAO-Cy^{TM}5.5, mediante inyección subcutánea, a ratones SCID que portaban tumores de carcinoma pancreático BxPC-3 humano de \sim 0,3 g y se adquirieron imágenes de fluorescencia 1 y 24 horas después de la inyección. Se observó de nuevo una excelente relación de señal a fondo para el tumor a las 24 horas usando GSAO-Cy^{TM}5.5 [Figura 11d (C)]. Ni GSAA-Cy^{TM}5.5 [Figura 11d (B)] ni Cy^{TM}5.5 [Figura 11d (D)] marcaron los tumores BxPC-3. Se extirparon el hígado, el corazón, los pulmones, la vejiga y los riñones y se examinaron en cuanto a GSAO-Cy^{TM}5.5. Sólo la vejiga y los riñones presentaban evidencia de una señal en el infrarrojo cercano (no mostrado). Además, usando GSAO-Cy^{TM}5.5, también se obtuvieron imágenes de tumores embrionarios CRL-1973 humanos desarrollados subcutáneamente en el dorso de ratones SCID, y de células prostáticas LnCaP humanas desarrolladas en la próstata de ratones SCID (no mostrado). Estos resultados indican que GSAO-Cy^{TM}5.5 puede formar imágenes de tumores tanto murinos como humanos en diferentes cepas de ratones.
También se usó GSAO-Cy^{TM}5.5 para obtener imágenes de tumores prostáticos espontáneos en ratones TRAMP (Greenberg et al., 1995). Antes de la formación de imágenes, se examinaron los animales con ultrasonido para verificar la presencia de tumores. Se administraron 0,8 mg/kg de GSAO-Cy^{TM}5.5, mediante inyección subcutánea en la ijada superior, a ratones TRAMP que portaban tumores de próstata. Cuando el umbral de detección de profundidad del sistema formador de imágenes actualmente usado fue \leq 1 cm (Weissleder et al., 1999), se abrió el abdomen para revelar el tumor. El campo lumínico se llenó con un tumor grande y una vena central [Figura 11e (A)]. El tumor resultó marcado con GSAO-Cy^{TM}5.5, mientras que la vena central no resultó marcada [Figura 11e (B)].
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Ejemplo 5 de Referencia
Ejemplo 5(a)
Marcación de tTF con MPB Clonación y mutación de tTF
El cDNA del TF humano procedía de Karen Fisher (Fisher et al., 1987). Los cebadores utilizados para multiplicar y mutar el dominio extracelular de TF (tTF, restos 1-219) eran 5'-ATCAGGATCCGGCACTACAAATACTGTG-3' (cebador directo) y 5'-ATCAGGATCCTTAACATCTGAATTCCCCTTTCTCCTG-3' (cebador inverso). Ambos cebadores contienen un sitio BamHI fuera de la secuencia de codificación para facilitar la clonación. Un codón TGT para cisteína está situado en la posición codónica 219 en el cebador inverso, que sustituye al codón GAA para glutamina. Se multiplicó el cDNA de tTF Q219C por PCR usando la DNA polimerasa Pfx y se clonó en el sitio BamHI del vector pTrcHisA (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.). Mediante secuenciación automática se confirmó la integridad del cDNA de tTF y la mutación Q219C. Se usó la construcción vector para transformar E. coli BL21 Star (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.).
Expresión y purificación de tTF y marcación de tTF con biotina
Se hizo que se expresara tTF recombinante del modo descrito por Jiang et al. (1999), se purificó mediante cromatografía de afinidad con ProBond (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.) y se volvió a plegar del modo descrito por Stone et al. (1995). La etiqueta de His fue escindida de la proteína purificada y vuelta a plegar, mediante incubación de 1 unidad de EKMax (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.) por 0,2 mg de tTF durante 16 horas a temperatura ambiental. La etiqueta de His escindida fue separada del tTF mediante cromatografía de intercambio aniónico. La mezcla de reacción fue dializada frente a tampón de Tris-HCl 20 mM, pH de 8,0, y fue aplicada a una columna de Mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) de 1 ml de capacidad, equilibrada con el mismo tampón. La proteína unida fue resuelta con un gradiente lineal de 0 a 0,5 M de NaCl. El tTF resultó eluido con
NaCl \sim 0,4 M.
Se midió el número de tioles en tTF utilizando DTNB. Se incubó el tTF (\sim 10 \muM) con DTNB (\sim 1 mM) en tampón de HEPES 0,1 M, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM, pH de 7,0, durante 10 minutos a temperatura ambiental y se midió el TNB a partir de la absorbancia a 412 nm usando un lector Thermomax Plus de microplacas, de Molecular Devices (Palo Alto, California, EE.UU.). El coeficiente de extinción del dianión de TNB a 412 nm y un pH de 7,0 es 14.150 M^{-1}cm^{-1} (Riddles et al., 1983). Se incubó el tTF con un exceso molar de 20 órdenes de magnitud de 3(N-maleimidilpropionil)biocitina (MPB) (Molecular Probes Incorporated, Eugene, Oregon, EE.UU.) durante 16 horas a temperatura ambiental para marcar la Cys construida. La MPB sin reaccionar fue separada por diálisis.
Se sometieron tTF purificada y tTF marcada con MPB (tTF-B) a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS en gradiente de 8-16% (Gradipore, Sydney, Australia) y se tiñeron con azul brillante de Coomassie (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). En una ocasión, las proteínas fueron transferidas a poli(fluoruro de vinildietileno) (Millipore, Bedford, Massachusetts, EE.UU.) y hechas reaccionar con una dilución 1:2000 de avidina-peroxidasa (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) para detectar el marcador MPB. La transferencia fue desarrollada utilizando quimioluminiscencia potenciada ECL (NEN, Boston, Massachusetts, EE.UU.).
En la Figura 12A se muestra el tTF Q219C. La proteína contenía 0,77 moles de tiol por mol de proteína, que se reducía a 0,13 moles de tiol por mol de proteína tras la reacción con MPB. En la Figura 12B se muestra la incorporación de MPB a tTF Q219C.
Ejemplo 5(b)
Formación del complejo de GSAO-B-avidina-tTF-B ELISA para medir la formación del complejo de GSAO-B-avidina-tTF-B
Se produjo proteína disulfuro isomerasa (PDI) recombinante humana del modo descrito por Jiang et al. (1999). Se hizo que placas Nunc PolySorp de 96 pocillos adsorbieran PDI (100 \mul de una concentración de 5 \mug/ml en tampón de NaHCO_{3} 0,1 M, azida al 0,02%, pH de 8,3) durante la noche a 4ºC en un ambiente húmedo. Se lavaron los pocillos una vez con disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline) que contenía Tween 20 al 0,05% (PBS/Tween), se bloquearon los sitios de unión inespecífica por adición de 200 \mul de BSA al 3% en PBS e incubación durante 90 minutos a 37ºC, y luego se lavó dos veces con PBS/Tween. Todas las incubaciones siguientes fueron durante 30 minutos a temperatura ambiental con sacudimiento orbital, y los pocillos se lavaron tres veces con PBS/Tween después de cada incubación. Se añadió ditiotreitol (100 \mul de una concentración 10 mM) a los pocillos para reducir los disulfuros de sitios activos de la PDI. Se añadió GSAO-B (100 \mul de una concentración 100 \muM) a los pocillos para marcar los ditioles de sitios activos de la PDI. Se añadieron tTF-B (0,1 \muM) y concentraciones crecientes de avidina (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) (volumen final de 100 \mul) a los pocillos para formar complejos de PDI-GSAO-B-avidina-tTF-B. Se añadió un anticuerpo monoclonal murino anti-TF humano (American Diagnostica, Greenwich, Connecticut, EE.UU.) (100 \mul de una concentración de 2 \mug/ml) a los pocillos para detectar el tTF-B unido y se midió, con IgG anti-murino conjugada con peroxidasa y generada en conejo (100 \mul de una dilución 1:500), el anticuerpo murino unido. Se midió la actividad peroxidasa con 100 \mul de H_{2}O_{2} al 0,003%, 1 mg/ml de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) en tampón de citrato 50 mM, pH de 4,5, durante 20 minutos a temperatura ambiental y con sacudimiento orbital. Se leyeron las absorbancias a 405 nm usando un lector Thermomax Kinetic de microplacas, de Molecular Devices (Molecular Devices Corporation, California, EE.UU.). Los resultados fueron corregidos con los pocillos testigo, no revestidos con PDI.
GSAO-B reacciona con los ditioles de sitios activos de la PDI purificada y con la PDI en la superficie celular (Donoghue et al., 2000). Esta interacción ha sido utilizada en una estructura de placas de microtitulación para examinar la formación de complejos de GSAO-B-avidina-tTF-B. Se inmovilizó PDI en pocillos para microtitulación, se marcó con GSAO-B y se incubó con tTF-B y relaciones molares crecientes de avidina. El tTF unido fue detectado utilizando un anticuerpo anti-TF. La relación molar óptima de avidina:tTF-B para la formación de complejos de GSAO-B-avidina-tTF-B era \sim 0,5:1 (Figura 13).
Ejemplo 5(c)
Trombosis de la vasculatura tumoral y necrosis del tumor por administración subcutánea de GSAO-B seguida de administración intravenosa de avidina-tTF-B
Se inyectaron subcutáneamente 2,5 x 10^{6} células AsPC-1 en 0,2 ml de PBS, en la línea media dorsal proximal, a hembras de ratón desnudo Balb/c de 6-8 semanas de edad (Biological Resources Centre, Universidad de New South Wales, Sydney, Australia). Se calculó el volumen del tumor utilizando la relación a\cdotb^{2}\cdot0,52, en que a es el diámetro más largo y b es el diámetro más corto. Se fijaron los tumores y órganos en Buffered Formalde-Fresh (Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey, EE.UU.) y se embebieron en parafina, y se cortaron secciones de 5 \mum de espesor y se colocaron en portaobjetos de vidrio. Los cortes fueron teñidos con hematoxilina y eosina.
Se administraron 7,5 mg/kg de GSAO-B en 0,15 ml de PBS que contenía glicocola 20 mM, mediante inyección subcutánea en la ijada, a ratones SCID que portaban tumores As-PC-1 de \sim 0,6 g. Se dejó que el GSAO-B se aclarara de la circulación general durante 18 horas y luego se administró a los ratones 1 mg/kg de avidina-[tTF-B] (relación molar de 0,5:1) en 0,2 ml de disolución salina mediante inyección intravenosa en la vena de la cola. En la Figura 14 se muestra el principio de este régimen de tratamiento.
Aproximadamente el 75% del tumor resultaba visiblemente morado 2-4 horas después de la administración de avidina-tTF-B. Los ratones fueron sacrificados 10 días después de la administración de avidina-tTF-B, y el tumor fue extirpado y fue examinado histológicamente. Hubo una acusada trombosis de la vasculatura tumoral y una necrosis del tumor tratado (Figura 15). Sólo quedó viable una capa periférica de células tumorales. El peso del ratón tratado no cambió en el curso del experimento. A la conclusión del experimento, se examinaron histológicamente el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones y el bazo del ratón tratado. No hubo signos de trombosis en ninguno de los órganos (no mostrado).
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Ejemplo 6 de Referencia
Formulaciones farmacéuticas
Los compuestos usados como componentes de los sistemas del presente invento pueden ser administrados solos, aunque es preferible que sean administrados en forma de una formulación farmacéutica. Para administración tópica, el ingrediente activo puede comprender de 0,001% a 10% en peso, y más típicamente de 1% a 5% en peso de la formulación, aunque puede comprender tanto como 10% en peso.
De acuerdo con el mejor modo de llevar a cabo el invento aquí proporcionado, se esbozan a continuación composiciones farmacéuticas específicas preferidas, usadas como componentes de los sistemas del presente invento. Lo siguiente ha de ser considerado como ejemplos meramente ilustrativos de formulaciones.
Ejemplo 6(a)
Composición para crema tópica
Se esboza a continuación una composición típica para suministro en forma de crema tópica:
GSAO-Cy^{TM}5.5
1,0 g
Polawax GP 200
25,0 g
Lanolina anhidra
3,0 g
Cera de abejas blanca
4,5 g
Hidroxibenzoato de metilo
0,1 g
Agua desionizada y esterilizada hasta
100,0 g
Se calientan conjuntamente el Polawax, la cera de abejas y la lanolina a 60ºC, se añade una disolución de hidroxibenzoato de metilo y se lleva a cabo una homogeneización utilizando agitación de alta velocidad. Luego se deja que la temperatura baje hasta 50ºC. Luego se añade el componente del presente invento, que es GSAO-Cy^{TM}5.5 en este ejemplo, y se dispersa a fondo, y se deja que la composición se enfríe con agitación de baja velocidad.
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Ejemplo 6(b)
Composición para loción tópica
Se esboza a continuación una composición típica para suministro en forma de loción tópica:
GSAO-Cy^{TM}5.5
1,2 g
Monolaurato de sorbitán
0,8 g
Polisorbato
200,7 g
Alcohol cetoestearílico
1,5 g
Glicerol
7,0 g
Hidroxibenzoato de metilo
0,4 g
Agua esterilizada hasta aproximadamente
100,00 ml
Se disuelven el hidroxibenzoato de metilo y el glicerol en 70 ml del agua a 75ºC. Se funden conjuntamente el monolaurato de sorbitán, el polisorbato 20 y el alcohol cetoestearílico a 75ºC y se añade la mezcla a la disolución acuosa. Se homogeneiza la emulsión resultante y se deja enfriar con agitación continua, y se añade el GSAO-Cy^{TM}5.5 en forma de suspensión en el agua restante. La suspensión completa es agitada hasta que queda homogeneizada.
Ejemplo 6(c)
Composición para gotas oculares
Se esboza a continuación una composición típica para suministro en forma de gotas oculares:
GSAO-Cy^{TM}5.5
0,3 g
Hidroxibenzoato de metilo
0,005 g
Hidroxibenzoato de propilo
0,06 g
Agua purificada hasta aproximadamente
100,00 ml
Se disuelven los hidroxibenzoatos de metilo y propilo en 70 ml de agua purificada, a 75ºC, y se deja que se enfríe la disolución resultante. Luego se añade GSAO-Cy^{TM}5.5 y se esteriliza la disolución por filtración a través de una membrana filtrante (0,22 \mum de tamaño de poro) y se envasa asépticamente en recipientes estériles.
Ejemplo 6(d)
Composición para administración por inhalación
Para un recipiente para aerosoles con una capacidad de 20-30 ml, se dispersa una mezcla de 10 mg de GSAO-Cy^{TM}5.5 con 0,5-0,8% en peso de un agente lubricante, tal como polisorbato 85 o ácido oleico, en un propulsor tal como freón, y se pone la dispersión en un recipiente para aerosoles apropiado para administración por inhalación intranasal u oral.
Ejemplo 6(e)
Composición para administración parenteral
Se podría preparar una composición farmacéutica del presente invento para inyección intramuscular que contuviera 1 ml de agua tamponada estéril y 1 mg de GSAO-Cy^{TM}5.5.
Similarmente, una composición farmacéutica para infusión intravenosa puede comprender 250 ml de disolución estéril de Ringer y 5 mg de GSAO-Cy^{TM}5.5.
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Ejemplo 6(f)
Composición para cápsulas
Se puede preparar una composición farmacéutica de GSAO-Cy^{TM}5.5 en forma de cápsula llenando una cápsula estándar de gelatina dura, de dos piezas, con 50 mg de GSAO-Cy^{TM}5.5 en forma pulverulenta, 100 mg de lactosa, 35 mg de talco y 10 mg de estearato magnésico.
Ejemplo 6(g)
Composición parenteral inyectable
Se puede preparar una composición farmacéutica de este invento en una forma adecuada para administración por inyección mezclando 1% en peso de GSAO-Cy^{TM}5.5 en propilenglicol al 10% en volumen y agua. La disolución se esteriliza por filtración.
Ejemplo 6(h)
Composición para ungüento
Una composición típica para suministro en forma de ungüento incluye 1,0 g de GSAO-Cy^{TM}5.5 dispersado en parafina blanda blanca hasta 100,0 g para producir un producto homogéneo sin grumos.
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Referencias
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Gottlieb, R. A. y R. L. Engler. "Apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion". Ann. N. Y. Acad. Sci. 874, 412-26 (1999).
Greenberg, H. M., F. DeMayo, M. J. Finegold, D. Medina, W. D. Tilley, J. O. Aspinall, G. R. Cunha, A. A. Donjacour, R. J. Matusik y J. M. Rosen. "Prostate cancer in a transgenic mouse". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 3439-3443 (1995).
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Riddles, P. W, R. L. Blakeley y B. Zemer. "Reassessment of Ellman's reagent". Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).
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Zhu, H., H. O. Fearnhead y G. M. Cohen. "An ICE-like protease is a common mediator of apoptosis induced by diverse stimuli in human monocytic THP.1 cells". FEBS Lett. 374: 303-30 1995.

Claims (25)

1. Uso de un compuesto de arsenóxido que tiene la fórmula estructural siguiente:
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18 
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en la fabricación de un medicamento para dirigir selectivamente in vivo, a células apoptóticas o células muertas, un agente activo que es un agente diagnóstico seleccionado entre radionucleidos seleccionados del grupo que consiste en: ^{3}H, ^{11}C, ^{14}C, ^{15}O, ^{13}N, ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{18}F, ^{125}I, ^{127}I, ^{111}In, ^{105}Rh, ^{153}Sm, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{166}Ho, ^{177}Lu, ^{186}Re, ^{188}Re y ^{99m}Tc; iones paramagnéticos seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio (III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III), manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio (III), samario (III) y disprosio (III); y agentes formadores de imágenes por rayos X seleccionados del grupo que consiste en: oro (III), plomo (II), lantano (III) y bismuto (III);
en que el compuesto de arsenóxido está enlazado con un primer miembro ligante; y
en que el agente activo está unido a dicho primer miembro ligante.
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2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el medicamento se dirige selectivamente a células apoptóticas.
3. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el agente diagnóstico es un agente formador de imágenes.
4. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el ion paramagnético es gadolinio (III).
5. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el primer miembro ligante es un ligando seleccionado entre DOTA, DTPA, CHX-A'', 1B4M y C-DOTA.
6. El uso de acuerdo con la Reivindicación 5, en que el ligando es seleccionado entre DTPA y DOTA.
7. El uso de acuerdo con la Reivindicación 5, en que el ligando es seleccionado entre CHX-A'', 1B4M y C-DOTA.
8. Un sistema para uso en la dirección selectiva in vivo, a células apoptóticas o células muertas, de un agente activo que es un agente diagnóstico seleccionado entre radionucleidos seleccionados del grupo que consiste en: ^{3}H, ^{11}C, ^{14}C, ^{15}O, ^{13}N, ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{18}F, ^{125}I, ^{127}I, ^{111}In, ^{105}Rh, ^{153}Sm, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{166}Ho, ^{177}Lu, ^{186}Re, ^{188}Re y ^{99m}Tc; iones paramagnéticos seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio (III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III), manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio (III), samario (III) y disprosio (III); y agentes formadores de imágenes por rayos X seleccionados del grupo que consiste en: oro (III), plomo (II), lantano (III) y bismuto (III);
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sistema que comprende un compuesto de arsenóxido que tiene la fórmula estructural siguiente:
19
en que dicho compuesto de arsenóxido está enlazado con un primer miembro ligante; y
en que el agente activo está unido a dicho primer miembro ligante.
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9. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, que se dirige selectivamente a células apoptóticas.
10. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, en que el agente diagnóstico es un agente formador de imágenes.
11. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, en que el ion paramagnético es gadolinio (III).
12. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, en que el primer miembro ligante es un ligando seleccionado entre DOTA, DTPA, CHX-A'', 1B4M y C-DOTA.
13. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 12, en que el ligando es seleccionado entre DOPA y DTPA.
14. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 13, en que el ligando está complejado con un ion lantánido.
15. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 14, en que el ion lantánido es gadolinio (III).
16. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, que es:
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17. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, que es:
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18. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 12, en que el ligando es seleccionado entre CHX-A'', 1B4M y C-DOTA.
19. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 18, en que el ligando está complejado con un ion lantánido.
20. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 19, en que el ion lantánido es gadolinio (III).
21. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 8, que es:
22
22. Uso de un sistema de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 21 en la fabricación de un medicamento para detectar y/o formar imágenes de células apoptóticas o células muertas, in vivo.
23. Uso de un sistema de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 20 en la fabricación de un agente para MRI.
24. Uso de un sistema de acuerdo con la Reivindicación 21 en la fabricación de un agente para PET.
25. Un kit terapéutico y/o diagnóstico que comprende un sistema de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 21, opcionalmente junto con un vehículo y/o diluyente terapéutica y/o diagnósticamente aceptable.
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