ES2330203T3 - Direccion selectiva de celulas apoptoticas. - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto de arsenóxido que tiene la fórmula estructural siguiente: **(Ver fórmula)** en la fabricación de un medicamento para dirigir selectivamente in vivo, a células apoptóticas o células muertas, un agente activo que es un agente diagnóstico seleccionado entre radionucleidos seleccionados del grupo que consiste en: 3 H, 11 C, 14 C, 15 O, 13 N, 32 P, 33 P, 35 S, 18 F, 125 I, 127 I, 111 In, 105 Rh, 153 Sm, 67 Cu, 67 Ga, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re, 188 Re y 99m Tc; iones paramagnéticos seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio (III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III), manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio (III), samario (III) y disprosio (III); y agentes formadores de imágenes por rayos X seleccionados del grupo que consiste en: oro (III), plomo (II), lantano (III) y bismuto (III); en que el compuesto de arsenóxido está enlazado con un primer miembro ligante; y en que el agente activo está unido a dicho primer miembro ligante.
Description
Dirección selectiva de células apoptóticas.
\global\parskip0.930000\baselineskip
El presente invento se refiere, en general, al
suministro dirigido de agentes activos, agentes activos que son
generalmente agentes diagnósticos. Más particularmente, el presente
invento se refiere a la dirección selectiva de un agente activo a
células apoptóticas en un vertebrado al administrar un sistema que
comprende un compuesto de arsenóxido (o un equivalente de
arsenóxido) y al menos un agente activo, compuesto de arsenóxido
que se dirige selectivamente a células apoptóticas y suministra el
agente activo, tal como un agente detectable, a las células
apoptóticas y su entorno.
La muerte celular programada, o apoptosis,
desempeña un papel fundamental en la renovación celular. Un
desequilibrio en la apoptosis, caracterizado por un aumento o una
disminución acusadas de la apoptosis en relación con la
regeneración celular, se asocia a menudo con una enfermedad
(Thompson, 1995). Por ejemplo, una apoptosis excesiva es una
característica de trastornos vasculares (Stefanec, 2000),
enfermedades neurodegenerativas (Rimon et al., 1997),
síndromes mielodisplásicos (Parker y Mufti, 2001), daños por
isquemia/reperfusión (Gottlieb y Engler, 1999), el rechazo de
órganos trasplantados (Krams y Martínez, 1998), tumores y cánceres,
entre otros.
Sin embargo, no hay mediciones específicas de
apoptosis utilizadas en el diagnóstico ni la terapia de pacientes.
Esto se debe, en parte, a la falta de un marcador conveniente y
sensible para determinar apoptosis in vivo. Por lo tanto, un
marcador selectivo de células apoptóticas sería ventajoso en el
diagnóstico y la terapia de enfermedades y también sería
interesante para la formación de imágenes de procesos celulares
normales.
En consecuencia, existe la necesidad de dirigir
selectivamente agentes activos a sitios de interés terapéutico o
diagnóstico. En particular, existe la necesidad de dirigir
selectivamente agentes a células apoptóticas.
El presente invento se refiere a la dirección de
un agente activo a células apoptóticas en un vertebrado, que
comprende administrar al vertebrado un sistema que comprende un
compuesto de arsenóxido y un agente activo tal como se define en la
Reivindicación 1, sistema que se dirige selectivamente a células
apoptóticas. El compuesto de arsenóxido actúa principalmente como
un agente de dirección para suministrar un agente activo, tal como
un agente terapéutico o formador de imágenes, a células apoptóticas
con un grado relativamente elevado de especificidad. Una ventaja
particular del presente invento es que el compuesto de arsenóxido es
selectivamente incorporado por las células apoptóticas y se une a
diversas proteínas dentro de la célula.
En el Documento WO 01/021628 se describe un
compuesto para el que la membrana celular resulta sustancialmente
impermeable, y su uso. D. J. Hnatowich et al., The Journal of
Nuclear Medicine, volumen 28, nº 8, páginas
1294-1302, Agosto de 1987, describen investigaciones
sobre avidina (estreptavidina) y biotina para aplicaciones mediante
formación de imágenes.
De acuerdo con una primera realización del
invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un
agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a
células apoptóticas en un vertebrado, que comprende el compuesto de
arsenóxido de la Reivindicación 1 y el citado agente, sistema que se
dirige selectivamente a células apoptóticas.
Típicamente, el sistema comprende el compuesto
de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con al menos un
agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente
activo.
Más típicamente, el sistema comprende:
(i) un primer componente que comprende el
compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un
primer miembro ligante; y
(ii) un segundo componente que comprende un
segundo miembro ligante, en que dicho segundo miembro ligante es un
agente activo o un agente capaz de llegar a ser un agente
activo.
Típicamente, el primer miembro ligante es una
enzima y el segundo miembro ligante es un sustrato de la enzima.
Típicamente, el sustrato de la enzima es un proagente que es
convertido en un agente activo por la enzima. Aún más típicamente,
el sustrato de la enzima es un profármaco que es convertido en un
fármaco activo por la enzima.
Aún más típicamente, el sistema comprende:
(i) un primer componente que comprende el
compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un
primer miembro ligante; y
(ii) un segundo componente que comprende un
segundo miembro ligante enlazado con al menos un agente activo (o
un agente capaz de llegar a ser un agente activo).
Típicamente, el primer miembro ligante es
biotina y el segundo miembro ligante es avidina o estreptavidina.
Aún típicamente, el primer miembro ligante es avidina o
estreptavidina y el segundo miembro ligante es biotina.
Aún típicamente, el primer miembro ligante es
biotina, el segundo miembro ligante es avidina o estreptavidina, y
el segundo miembro ligante está indirectamente enlazado con un
agente activo en virtud de una interacción ligante más entre la
avidina o la estreptavidina y al menos un resto de biotina adicional
que está directamente enlazado con el agente activo.
Típicamente, el primer miembro ligante es
metotrexato y el segundo miembro ligante es dihidrofolato reductasa
(DHFR). Aún típicamente, el primer miembro ligante es dihidrofolato
reductasa y el segundo miembro ligante es metotrexato.
Típicamente, el primer miembro ligante es
hirudina y el segundo miembro ligante es trombina. Aún típicamente,
el primer miembro ligante es trombina y el segundo miembro ligante
es hirudina.
Típicamente, el primer miembro ligante es un
antígeno y el segundo miembro ligante es un anticuerpo.
Típicamente, el segundo miembro ligante está
directamente enlazado con un agente activo. Aún típicamente, el
segundo miembro ligante está indirectamente enlazado con un agente
activo. Aún más típicamente, el enlace indirecto entre el agente
activo y el segundo miembro ligante es en virtud de una interacción
ligante más entre el segundo miembro ligante y al menos un miembro
ligante adicional, en que el miembro ligante adicional está
directamente enlazado con el agente activo.
El agente activo es un agente diagnóstico.
Típicamente, el agente diagnóstico es un agente
formador de imágenes. Más típicamente, las sustancias que actúan
como agentes diagnósticos son bien conocidas por quienes tienen una
experiencia normal en la técnica, e incluyen marcadores
fluorescentes, radionucleidos, iones paramagnéticos, agentes
formadores de imágenes por rayos X, marcadores quimioluminiscentes
y marcadores que pueden ser detectados por medio de una operación
enzimática o ligante secundaria. Los marcadores fluorescentes
típicos, adecuados para uso en el sistema del invento, incluyen
Cy^{TM}5.5 y fluoresceína. En el Handbook of Fluorescent Probes
and Research Products, 8ª edición, se enumeran otras sondas
fluorescentes comerciales que son adecuadas para uso en el presente
invento.
Los radionucleidos típicos, adecuados para uso
como agentes formadores de imágenes en el invento, son seleccionados
del grupo que consiste en ^{3}H, ^{11}C, ^{14}C, ^{15}O,
^{13}N, ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{18}F, ^{125}I,
^{127}I, ^{111}In, ^{105}Rh, ^{153}Sm, ^{67}Cu, ^{67}Ga,
^{166}Ho, ^{177}Lu, ^{186}Re, ^{188}Re y ^{99m}Tc.
Típicamente, los iones paramagnéticos son
seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio
(III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III),
manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio
(III), samario (III) y disprosio (III). Más típicamente, el ion
paramagnético es gadolinio (III).
Típicamente, los agentes formadores de imágenes
por rayos X son seleccionados del grupo que consiste en: oro (III),
plomo (II), lantano (III) y bismuto (III).
Típicamente, el agente activo se encuentra
dentro de un vehículo para el suministro de dicho agente. Más
típicamente, el vehículo para el agente activo es un liposoma.
El compuesto de arsenóxido se dirige a células
apoptóticas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El compuesto de arsenóxido adecuado para uso en
el presente invento es
4-[N-(S-glutationilacetil)amino]fenilarsenóxido,
que puede ser abreviado GSAO, de acuerdo con la Fórmula IV:
De acuerdo con una segunda realización del
invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un
agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a
células apoptóticas en un vertebrado, sistema que comprende un
primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de
acuerdo con la Reivindicación 1 enlazado con al menos un agente
activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
De acuerdo con una tercera realización del
invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un
agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a
células apoptóticas en un vertebrado, sistema que comprende
un primer componente que comprende el compuesto
de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro
ligante; y
un segundo componente que comprende un segundo
miembro ligante, en que dicho segundo miembro ligante es un agente
activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una cuarta realización del
invento, se proporciona un sistema para dirigir selectivamente un
agente activo (o un agente capaz de llegar a ser un agente activo) a
células apoptóticas en un vertebrado, sistema que comprende
un primer componente que comprende el compuesto
de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro
ligante; y
un segundo componente que comprende un segundo
miembro ligante enlazado con un agente activo (o un agente capaz de
llegar a ser un agente activo).
\vskip1.000000\baselineskip
Típicamente, el segundo miembro ligante está
directamente enlazado con el agente.
Aún típicamente, el segundo miembro ligante está
indirectamente enlazado con el agente. Más típicamente, el enlace
indirecto entre el agente y el segundo miembro ligante es en virtud
de una interacción ligante más entre el segundo miembro ligante y
al menos un miembro ligante adicional, en que el miembro ligante
adicional está directamente enlazado con el agente. Aún más
típicamente, el primer miembro ligante y el miembro ligante
adicional son diferentes. Aún más típicamente, el primer miembro
ligante y el miembro ligante adicional son iguales.
Típicamente, con respecto a cualquiera de las
realizaciones segunda a cuarta del invento, el primer componente
está enlazado con el agente a través de un conector escindible. Más
típicamente, con respecto a la segunda realización del invento, el
primer componente está enlazado con el agente a través de un
conector escindible.
Típicamente, con respecto a la realización
tercera o cuarta del invento, los miembros ligantes primero y
segundo son como se describieron anteriormente de acuerdo con la
primera realización del invento. Aún típicamente, con respecto a
cualquiera de las realizaciones segunda a cuarta del invento, el
compuesto de arsenóxido es como se describió anteriormente de
acuerdo con la primera realización del invento. Aún típicamente, el
agente activo es como se describió anteriormente de acuerdo con la
primera realización del invento.
De acuerdo con una quinta realización del
invento, se proporciona un método para detectar y/o formar imágenes
de células apoptóticas en un vertebrado, método que comprende
administrar a dicho vertebrado una cantidad biológicamente eficaz
de un sistema que comprende el compuesto de arsenóxido de la
Reivindicación 1 y un agente diagnóstico, en que dicho sistema se
dirige selectivamente a células apoptóticas; y detectar dicho agente
diagnóstico.
De acuerdo con una sexta realización del
invento, se proporciona el uso de un sistema que comprende el
compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 y un agente
diagnóstico, para la fabricación de un medicamento para detectar
y/o formar imágenes de células apoptóticas, en que dicho sistema se
dirige selectivamente a células apoptóticas.
Típicamente, con respecto a las realizaciones
quinta y sexta del invento, el sistema es como se definió de
acuerdo con la primera realización del invento. Aún típicamente, el
agente diagnóstico es como se definió de acuerdo con la primera
realización del invento.
Típicamente, el vertebrado es seleccionado del
grupo que consiste en seres humanos, primates no humanos, murinos,
bovinos, ovinos, equinos, caprinos, leporinos, aviarios, felinos y
caninos. Más típicamente, el vertebrado es un ser humano, primate
no humano o murino. Aún más típicamente, el vertebrado es un ser
humano.
De acuerdo con una séptima realización del
invento, se proporciona un kit terapéutico y/o diagnóstico para
dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar
a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, kit
que comprende
un primer componente que comprende el compuesto
de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro
ligante, y
un segundo componente que comprende un segundo
miembro ligante, en que dicho segundo miembro ligante es un agente
activo o un agente capaz de llegar a ser un agente activo,
opcionalmente junto con un vehículo y/o un
diluyente terapéutica y/o diagnósticamente aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una octava realización del
invento, se proporciona un kit terapéutico y/o diagnóstico para
dirigir selectivamente un agente activo (o un agente capaz de llegar
a ser un agente activo) a células apoptóticas en un vertebrado, kit
que comprende
un primer componente que comprende el compuesto
de arsenóxido de la Reivindicación 1 enlazado con un primer miembro
ligante; y
un segundo componente que comprende un segundo
miembro ligante enlazado con un agente activo (o un agente capaz de
llegar a ser un agente activo),
opcionalmente junto con un vehículo y/o un
diluyente terapéutica y/o diagnósticamente aceptables.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
expresión "que comprende" significa "que incluye
principalmente pero no necesariamente de forma única". Además,
variaciones de la expresión "que comprende", tales como
"comprenden" y "comprende", tienen significados
correspondientemente variados.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el
término "arsenóxido" se refiere al grupo -As=O.
En el contexto de esta memoria descriptiva, los
grupos escritos -As=O y -As(OH)_{2} van a ser
considerados sinónimos.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
expresión "equivalente a arsenóxido" se refiere a cualquier
especie ditiólicamente reactiva que muestra esencialmente la misma
afinidad que -As=O o -As(OH)_{2} por los ditioles,
y la expresión incluye, por ejemplo, grupos que comprenden un
elemento de transición, y cualquier compuesto arsenical trivalente
que resulta hidrolizado hasta -As=O o -As(OH)_{2}
cuando se disuelve en medios acuosos (tales como los tampones para
cultivo celular y los fluidos contenidos en el organismo que se
trata).
El término "arsenical", como aquí se
utiliza, incluye cualquier compuesto que contiene arsénico.
El término "acilo", como aquí se utiliza,
incluye los restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y
cicloalquenilo monovalentes y divalentes que poseen un sustituyente
carbonilo terminal, pudiendo tener lugar la fijación por el resto
hidrocarbonado, el resto carbonilo o ambos.
El término "alquilo", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes y
saturados, de cadenas lineales y ramificadas.
El término "alquenilo", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes,
de cadenas lineales y ramificadas, que tienen al menos un doble
enlace.
El término "alquinilo", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados monovalentes,
de cadenas lineales y ramificadas, que tienen al menos un triple
enlace.
El término "alquileno", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes y
saturados de cadena lineal.
El término "alquenileno", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes de
cadena lineal que tienen al menos un doble enlace.
El término "alquinileno", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes de
cadena lineal que tienen al menos un triple enlace.
El término "arilo", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados aromáticos y
monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y
fusionados.
El término "arileno", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales hidrocarbonados aromáticos y
divalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados.
La expresión "ditiol estrechamente
espaciado", como aquí se usa, incluye en su significado tioles
que son químicamente vecinales, así como tioles espacialmente
yuxtapuestos en virtud de la conformación molecular.
El término "cicloalquilo", como aquí se
usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados
monovalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
fusionados.
El término "cicloalquileno", como aquí se
usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes
y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
fusionados.
El término "cicloalquenilo", como aquí se
usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados
monovalentes y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
fusionados, que tienen al menos un doble enlace.
El término "cicloalquenileno", como aquí se
usa, incluye en su significado radicales hidrocarbonados divalentes
y saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados,
que tienen al menos un doble enlace.
El término "halo", como aquí se usa,
incluye fluoro, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroarilo", como aquí se usa,
incluye en su significado radicales aromáticos y monovalentes,
sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados, que tienen de 1 a
12 átomos, en que de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados
entre O, N y S.
El término "heteroarileno", como aquí se
usa, incluye en su significado radicales aromáticos y divalentes,
sencillos, polinucleares, conjugados y fusionados, que tienen de 1 a
12 átomos, en que de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados
entre O, N y S.
El término "heterocicloalquilo", como aquí
se usa, incluye en su significado radicales monovalentes y
saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, en
que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y
S.
El término "heterocicloalquileno", como
aquí se usa, incluye en su significado radicales divalentes y
saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, en
que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados entre O, N y
S.
El término "heterocicloalquenilo", como
aquí se utiliza, incluye en su significado radicales monovalentes y
saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, que
tienen al menos un doble enlace y en que de 1 a 5 átomos son
heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
El término "heterocicloalquenileno", como
aquí se utiliza, incluye en su significado radicales divalentes y
saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o fusionados, que
tienen al menos un doble enlace y en que de 1 a 5 átomos son
heteroátomos seleccionados entre O, N y S.
La expresión "ácido fenilarsónico", como
aquí se utiliza, va a ser considerada sinónima de "ácido
bencenoarsónico".
Figura 1. Síntesis de GSAO. Representación
esquemática de la síntesis de GSAO, que muestra la estereoquímica y
el esquema de numeración usado en la discusión del espectro de
resonancia magnética nuclear (RMN) 2D de
^{1}H-^{13}C por HMBC.
Figura 2. Asignación de la estructura de GSAO.
Una expansión del espectro de ^{1}H-^{13}C de
GSAO en DCI/D_{2}O, por HMBC, que muestra la región alifática. El
espectro muestra cualquier acoplamiento heteronuclear
(^{1}H-^{13}C) de largo alcance como picos
cruzados, en línea con las correspondientes señales de ^{1}H y
^{13}C a lo largo de los ejes horizontal y vertical. Los picos
cruzados encuadrados corresponden a un acoplamiento
^{1}H-^{13}C entre los metilenos C7 y C11, lo
que confirma que la alquilación por BRAO ha tenido lugar en el átomo
de azufre del glutatión. Los picos y picos cruzados marcados con
"i" son debidos a impurezas; también son observables picos
cruzados de un enlace correspondientes al metileno C9 y el metino
C2, como dobletes, debido a una filtración incompleta por la
secuencia de pulsos de la HMBC.
Figura 3. Representación esquemática de la
síntesis de GSAO-A.
Figura 4. Representación esquemática de la
síntesis de GSAO-B.
Figura 5. Representación esquemática de la
síntesis de GSAO-F.
Figura 6. Representación esquemática de la
síntesis de GSAO-Cy^{TM}5.5.
Figura 7. Interacción de GSAO-B
con PDI y tiorredoxina. A: Estructura de GSAO-B. B:
Se incubó PDI recombinante humana purificada (5 \muM),
tiorredoxina recombinante humana (5 \muM) o albúmina sérica bovina
(5 \muM) con ditiotreitol (10 \muM) durante 60 minutos a
temperatura ambiental para asegurar que el(los)
disulfuro(s) de sitios activos de la PDI y la tiorredoxina
estaba(n) en forma de ditiol reducido. Luego se añadió
GSAO-B (100 \muM) o GSAO-B y DMP
(400 \muM) y se incubaron las mezclas de reacción durante 30
minutos a temperatura ambiental. La PDI (carriles 1 y 2), la
tiorredoxina (carriles 3 y 4) y la albúmina (carril 5) marcadas (75
picomoles) fueron resueltas por SDS-PAGE al
4-16%, transferidas a una membrana de PVDF y hechas
reaccionar con estreptavidina-peroxidasa para
detectar el marcador GSAO-B. Las posiciones de los
marcadores de M_{r} se muestran a la izquierda.
Figura 8. GSAO-B marca la célula
cultivada ocasional. Se tiñeron células BAE confluentes con
GSAO-B y se visualizaron con
estreptavidina-Alexa 488. La célula ocasional se
teñía muy intensamente (véase la punta de flecha). La inmensa
mayoría de las células se unían muy poco a
GSAO-B.
Figura 9. GSAO marcó células apoptóticas
después de la activación de caspasas
Células HT1080 fueron dejadas sin tratar (partes
a y d) o fueron tratadas con camptotecina para
provocar apoptosis (partes b y e), y fueron luego
separadas y marcadas con anexina V-PE y
GSAO-F (partes a y b) o anexina
V-PE y GSAA-F (partes b y
e). Se representa gráficamente la fluorescencia de la
ficoeritrina (PE; del inglés, phyco-erythrin) frente a
la fluorescencia de la fluoresceína. El porcentaje de las células
totales que resultan brillantemente marcadas con anexina V
(cuadrante superior izquierdo), GSAO o GSAA (cuadrante inferior
derecho), o tanto con anexina V como con GSAO o GSAA (cuadrante
superior derecho) se muestra en las partes c (GSAO) y
f (GSAA). En la parte g, las células HT1080 fueron
dejadas sin tratar (barras claras) o fueron tratadas con
camptotecina para provocar apoptosis (barras oscuras), y fueron
luego separadas y marcadas con GSAO-F, anexina
V-PE y yoduro de propidio (PI). Se representó
gráficamente la fluorescencia de la anexina V-PE
frente a la fluorescencia de GSAO-F en todas las
células o en todas las células salvo aquellas que habían
incorporado yoduro de propidio (> 200 unidades de fluorescencia
en FL4). En la parte h, las células HT1080 fueron tratadas
con camptotecina en ausencia o presencia de un inhibidor de
caspasas de amplio espectro,
Z-VAD-FMK, y fueron luego separadas
y marcadas con GSAO-F. La fluorescencia media de la
población no tratada fue normalizada en dos experimentos, y las
barras y los errores representan la media y el rango.
Figura 10. GSAO entró en células apoptóticas
y marcó proteínas que contenían ditioles estrechamente
espaciados
a) Se trataron células HT1080 con camptotecina
para provocar apoptosis y luego se separaron y se marcaron con
GSAO-F y anexina V-Alexa 594. Se
obtuvieron imágenes de las células por microscopía confocal. Se
muestran seis cortes transversales (i a vi) de una célula marcada
con anexina V-Alexa 594. La imagen vii muestra una
célula que no resultó intensamente marcada mediante anexina
V-Alexa-594. b) Se trataron células
HT1080 con camptotecina para provocar apoptosis y luego se
separaron y se incubaron con anexina V-PE y
GSAO-B. Las células fueron distribuidas en
poblaciones positivas para anexina V (carril 1) y negativas para
anexina V (carril 2). Se lisaron números iguales de células de cada
población y se resolvieron por SDS-PAGE, y se
detectó GSAO-B con
estreptavidina-peroxidasa. Las posiciones de los
marcadores de M_{r} se indican a la izquierda. c) Las proteínas
marcadas con GSAO-B de la parte b fueron
recogidas sobre estreptavidina-Dynabeads, resueltas
en SDS-PAGE y sometidas a transferencia Western para
PDI. d) Se dejaron células HT1080 sin tratar (carriles 1 y 2) o se
trataron con camptotecina (carriles 3 y 4), y luego se separaron y
se incubaron con GSAO-B en ausencia (carriles 1 y
3) o presencia (carriles 2 y 4) de dimercaptopropanol. Se lisaron
números iguales de células y se resolvieron por
SDS-PAGE, y se detectó GSAO-B con
estreptavidina-peroxidasa.
Figura 11. GSAO marcó células apoptóticas
in vivo y puede ser utilizado para formar imágenes de
tumores
a) Se administró GSAO-B o
GSAA-B a ratones que portaban tumores subcutáneos
BxPC-3 en la superficie dorsal proximal, mediante
inyección subcutánea en la ijada trasera. Los tumores fueron
extirpados después de 6 horas, seccionados y teñidos para un
compuesto marcado con biotina. Micrografías de bajo aumento (i) y
alto aumento (ii) de un tumor seccionado muestran la incorporación
de GSAO-B por células seleccionadas (marrón). b)
Los cortes tumorales descritos en la parte a fueron teñidos
para caspasa 3 activada (rojo) y GSAO-B o
GSAA-B (verde) y fueron contrateñidos con un tinte
para ácido nucleico (azul). Se muestran imágenes rojas, verdes y de
superposición. c) Imágenes fluorescentes de un tumor pulmonar murino
de Lewis desarrollado subcutáneamente en un ratón C57BL/6, 1 y 24
horas después de la administración de
GSAO-Cy^{TM}5.5. Grupo A: imagen del tumor
pulmonar de Lewis con luz blanca. Grupo B: tumor y piel dorsal 1
hora después de la inyección de GSAO-Cy^{TM}5.5.
Grupos C y D: piel dorsal y tumor 24 horas después de la inyección,
respectivamente. d) Tumores pancreáticos BxPC-3
humanos desarrollados subcutáneamente en ratones SCID, 24 horas
después de la administración de GSAO-Cy^{TM}5.5,
GSAA-Cy^{TM}5.5 o Cy^{TM}5.5. Grupo A: imagen de
un tumor BxPC-3 con luz blanca. Grupos B, C y D:
tumores después de la inyección de
GSAA-Cy^{TM}5.5, GSAO-Cy^{TM}5.5
o Cy^{TM}5.5, respectivamente. e) Tumor prostático espontáneo en
un ratón TRAMP 24 horas después de la administración de
GSAO-Cy^{TM}5.5. Grupo A: Imagen con luz blanca.
Grupo B: Imagen fluorescente. Las flechas indican los márgenes de
la vena central y el tumor. Las barras de c, d y
e representan 1 mm.
Figura 12. A) Marcación de tTF con MPB. tTF
Q219C (5 \mug) no marcado (carril 1) o marcado con MPB (carril
2), resuelto por SDS-PAGE y teñido con azul
brillante de Coomassie. B) tTF Q219C (50 ng) no marcado (carril 1)
o marcado con MPB (carril 2), resuelto por SDS-PAGE,
transferido a poli(fluoruro de vinildietileno) y hecho
reaccionar con avidina-peroxidasa para detectar la
etiqueta de biotina. Las posiciones de los marcadores de M_{r} se
indican a la izquierda.
Figura 13. Formación del complejo
GSAO-B-avidina-tTF-B.
Se inmovilizó PDI en pocillos para microtitulación, se marcó con
GSAO-B y se incubó con tTF-B y
relaciones molares crecientes de avidina. Se detectó el tTF unido
usando un anticuerpo monoclonal anti-TF y un
anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Las barras y los
errores son la media \pm desviación estándar de determinaciones
por triplicado.
Figura 14. Dibujo del fundamento relativo al uso
de GSAO-B y
avidina-tTF-B para producir trombos
en vasos sanguíneos tumorales.
Figura 15. Trombosis de la vasculatura tumoral y
necrosis del tumor mediante la administración subcutánea de
GSAO-B seguida de la administración intravenosa de
avidina-tTF-B. Se muestra un corte
transversal de un tumor no tratado y un tumor tratado. Es evidente
la amplia necrosis del centro del tumor tratado. El recuadro
muestra un vaso con trombos en el tumor tratado.
El presente invento se refiere a la detección de
células apoptóticas, y en él se utiliza el compuesto de arsenóxido
de la Reivindicación 1 para dirigir selectivamente un agente activo,
un agente diagnóstico, a células apoptóticas con un grado
relativamente elevado de especificidad con respecto a las células
normales.
Como se expone en la Solicitud de Patente
Internacional (PCT) nº PCT/AU00/011434 (WO 01/21628), se pueden
preparar compuestos de arsenóxido, tales como GSAO, por métodos
conocidos generalmente en la técnica, y los expertos en la técnica
reconocerán que los diferentes reactivos y reaccionantes pueden ser
rutinariamente modificados con objeto de sintetizar cualquier
compuesto dado, útil en el invento. Una persona experta en la
técnica también reconocerá que el invento también proporciona el uso
de compuestos en cualquier estado de ionización, tales como, por
ejemplo, sales de ácido, iones dipolares inalterados, aniones de
iones dipolares y dianiones.
En una síntesis típica de un compuesto de
arsenóxido preferido para uso en el invento, se puede hacer
reaccionar glutatión con
4-[N-(bromoacetil)amino]fenilarsenóxido (BRAO) bajo
unas condiciones favorables para la formación de un enlace
covalente entre el tiol libre del glutatión y la especie química a
la que se fija el arsenóxido, para obtener GSAO. Las reacciones que
implican un ataque nucleófilo por el tiol del glutatión requerirán,
en general, unas condiciones alcalinas. Se puede llevar a cabo el
ataque electrófilo de ciertas especies reactivas sobre el átomo de
azufre del glutatión; en general, esto requeriría probablemente unas
condiciones ácidas. En el Ejemplo 1(a) se proporciona una
síntesis de GSAO, síntesis que se representa esquemáticamente en la
Figura 1.
Mas adelante, en el Ejemplo 1(c) de
Referencia, se proporciona un método para la síntesis de
GSAO-B, método que se ilustra en la Figura 4.
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en que n = 1 ó
2.
\newpage
En el Ejemplo 1(d) de Referencia se
proporciona un método para la síntesis de GSAO-F,
método que se ilustra en la Figura 5.
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Más adelante, en el Ejemplo 1(e) de
Referencia, se proporciona un método para la síntesis de
GSAO-Cy^{TM}5.5, método que se ilustra en la
Figura 6.
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En el presente invento se utilizan sistemas que
comprenden el compuesto de arsenóxido de la Reivindicación 1 para
dirigir selectivamente un agente activo a células apoptóticas. GSAO
se dirige tanto a células apoptóticas como a células muertas. Como
se esboza en el Ejemplo 3(d) de Referencia, al menos siete
proteínas incorporaron GSAO en las células apoptóticas. Además,
GSAO se unía selectivamente a células tumorales apoptóticas in
vivo. Como aquí se describe, se ha utilizado esta unión para
formar imágenes de tumores en ratones con un GSAO fluorescentemente
marcado en el infrarrojo cercano.
A continuación se muestran esquemáticamente
sistemas ejemplares, adecuados para uso en el presente invento.
\newpage
Un sistema adecuado para uso en el presente
invento comprende un compuesto de arsenóxido que está directamente
enlazado con al menos un agente activo o un agente capaz de llegar a
ser un agente activo.
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De acuerdo con este sistema, el conector puede
ser escindible para que el agente activo se "libere" in
situ en el sitio diana, como se ilustra a continuación.
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Los conectores escindibles son bien conocidos
por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, enlaces
enzimáticamente escindibles tales como péptidos y conectores lábiles
frente a esterasas.
GSAO-F (Figura 5) y
GSAO-Cy^{TM}5.5 (Figura 6) son ejemplos de un
sistema útil para detectar y/o formar imágenes de células
apoptóticas, en que el compuesto de arsenóxido GSAO está
covalentemente enlazado con los fluoróforos fluoresceína y
Cy^{TM}5.5, respectivamente. El resto de GSAO se dirige
selectivamente a células apoptóticas y, de este modo, proporciona
selectivamente el fluoróforo a células apoptóticas (Figuras
9-11).
A modo de otro ejemplo, se puede utilizar
GSAO-Cy^{TM}5.5 para detectar células apoptóticas
in vivo. Se administra GSAO-Cy^{TM}5.5 a
un sujeto. El modo de administración variará de acuerdo con el sitio
que se va a detectar. Típicamente, el modo de administración es
parenteral, intravenoso, subcutáneo u oral. Después de la
administración, se deja que transcurra un periodo de tiempo con
objeto de que el GSAO-Cy^{TM}5.5 residual sea
aclarado de la circulación general. Típicamente, el periodo de
tiempo está entre 1 y 48 horas, más típicamente entre 3 horas y 36
horas, aún más típicamente entre 6 horas y 24 horas. Aún más
típicamente, el período de tiempo es 18 horas. La detección del
fluoróforo Cy^{TM}5.5 puede ser llevada a cabo utilizando técnicas
generales bien conocidas en este campo técnico y permite que se
determine la posición de las células apoptóticas (Figura 11).
Cuando el sistema lleva incorporado un agente
formador de imágenes, tal como un agente fluorescente o un agente
para MRI [por ejemplo, un complejo de ion lantánido paramagnético
con DOTA (ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecanotetraacético) o DTPA
(ácido dietilentriaminapentaacético)], el agente formador de
imágenes es selectivamente dirigido a sitios de células
apoptóticas. Los métodos estándares para la detección del agente
formador de imágenes permitirán luego que esos sitios sean
fácilmente identificados.
Gd (III) es un ejemplo de un ion lantánido que
ha demostrado ser muy eficaz como agente potenciador del contraste
en la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI; del
inglés, magnetic resonance imaging). Los
esquemas siguientes representan la síntesis de un sistema que
comprende un compuesto de arsenóxido (representado por GSAO) que
está directamente enlazado con un complejo de ion lantánido,
representado por Gd (III) DOTA y GD (III) DPTA, adecuado para uso
en el presente invento.
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(i)
(CH_{3})_{2}NCH(OCH_{3})_{2}, tolueno,
120ºC. (ii) bromoacetato de metilo en CH_{2}Cl_{2},
Na_{2}CO_{3} en agua. (iii) agua, etanol. (iv) ácido
bromoacético, Na_{2}CO_{3} en agua. (v)
GdCl_{3}\cdot6H_{2}O en agua. (vi) conector XX, NHS
catalítico, H_{2}SO_{4} catalítico, (vii) NHS, DCC en acetona.
(viii) GSAO, NaHCO_{3} en
agua.
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(i) anhídrido acético, acetato
sódico, ácido acético. (ii) ácido iminodiacético, Na_{2}CO_{3}
en agua; ácido sulfúrico. (iii) ácido sulfúrico catalítico, agua.
(iv) bromoacetato de metilo en CH_{2}Cl_{2}, Na_{2}CO_{3}
en agua; ácido sulfúrico. (v) NHS, H_{2}SO_{4} catalítico. (vi)
conector XX, NaHCO_{3} en agua; GdCl_{3}\cdot6H_{2}O en
agua. (vii) NHS, DCC, acetona. (viii) GSAO, NaHCO_{3} en
agua.
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El grupo conector entre el resto GSAO y el
complejo de DOTA o DTPA ejemplificado en los esquemas anteriores
puede ser fácilmente preparado por los expertos en la técnica usando
reacciones químicas conocidas. A continuación se representa un
ejemplo de una ruta sintética.
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(i) anhídrido cloroacético,
Na_{2}CO_{3} en agua; ácido sulfúrico. (ii) NHS, DCC, acetona.
(iii) ácido
\varepsilon-amino-\eta-caproico,
NaHCO_{3} en agua; ácido sulfúrico. (iv) tiourea, etanol;
agua.
\newpage
En un planteamiento alternativo a la preparación
de productos de conjugación de arsenóxido-[complejo de lantánido]
se usan los ligandos DOTA y DTPA funcionalizados, tales como los
derivados de isotiocianato mostrados a continuación.
Todos los ligandos anteriores han sido bien
definidos en cuanto a su estabilidad con Gd (III), Y (III) y otros
iones lantánidos. En el esquema siguiente se representa un ejemplo
de una ruta sintética para productos de conjugación de arsenóxido
con los anteriores ligandos, utilizando el ligando
CHX-A''. El resto de arsenóxido es ejemplificado
mediante GSAO.
Los radioisótopos son útiles como agentes
formadores de imágenes y como agentes terapéuticos. A continuación
se muestra una ruta sintética para sistemas adecuados para uso en el
presente invento, en la que un resto de arsenóxido (ejemplificado
mediante GSAO) está enlazado con un resto radiomarcado.
(i) butil-litio,
cloruro de trimetilestaño. (ii) NHS. (iii) ^{[123]}yoduro sódico,
H_{2}O_{2}. (iv) GSAO, NaHCO_{3}
acuoso.
En el esquema anteriormente mostrado se utiliza
yodo-123; sin embargo, una persona experta en la
técnica entenderá fácilmente que la síntesis anterior es general y
también se aplica a otros agentes activos y radioisótopos. Por
ejemplo, la sustitución del ^{[123]}yoduro sódico por
^{[125]}yoduro sódico o ^{[131]}yoduro sódico daría lugar a un
sistema que comprendería el correspondiente radionucleido
radioyodado. Como se ilustra a continuación, de una manera similar
a la síntesis anterior se puede preparar fácilmente un sistema
fluorado con ^{18}F.
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El ^{18}F es un conocido emisor de positrones
y se usa en la tomografía por emisión de positrones (PET; del
inglés, positron emission tomography) como un
agente formador de imágenes. Otros radioisótopos adecuados para uso
en sistemas para PET son bien conocidos en la técnica, tales como,
por ejemplo, ^{86}Y y ^{99}Tc. En consecuencia, un sistema más
del invento en que el agente activo directamente enlazado con un
resto de arsenóxido es un agente para PET, es el sistema marcado
con tecnecio-99, preparado de acuerdo con el esquema
siguiente.
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Además de ser usados en MRI, los productos de
conjugación de arsenóxido con los ligandos CHX-A'',
1B4M y C-DOTA (anteriores) pueden ser también radiomarcados,
por ejemplo, con ^{111}In para uso en gammagrafía o con ^{64}Cu,
^{18}F, ^{86}Y o ^{99}Tc para uso en la formación de imágenes
por PET. Otros radioisótopos útiles para fines terapéuticos dentro
del alcance del presente invento incluyen renio-188,
cobre-64, indio-111,
lutecio-177, itrio-90 y
bismuto-213. Otros radioisótopos son bien conocidos
por los expertos en la técnica. La idoneidad de un radioisótopo
para aplicaciones terapéuticas puede ser fácilmente identificada
basándose en cinéticas de dirección y en los resultados de estudios
sobre biodistribución.
Otro sistema adecuado para uso en el presente
invento, ilustrado esquemáticamente más adelante, comprende (i) un
primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la
Reivindicación 1 que está enlazado con un primer miembro ligante; y
(ii) un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante,
en que el segundo miembro ligante es un agente activo o un agente
capaz de llegar a ser un agente activo.
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El resto de arsenóxido, tal como GSAO, se dirige
selectivamente a células apoptóticas, suministrando por ello el
primer miembro ligante a las células apoptóticas. El primer miembro
ligante es capaz de interaccionar con un segundo miembro ligante.
Por ejemplo, el primer miembro ligante es una enzima y el segundo
miembro ligante es un sustrato para la enzima. El sustrato para la
enzima puede ser un profármaco que resulte convertido en un fármaco
activo por la enzima en el sitio de las células apoptóticas. En
particular, este sistema puede utilizar el "efecto
espectador", por el que el fármaco activo se puede difundir a
células próximas en el entorno de la(s) célula(s)
apoptótica(s) a la(s) que se dirige el sistema
anterior.
Se podría administrar el primer componente de
este sistema a un sujeto, lo que iría seguido de un período de
tiempo para permitir que cualquiera de los componentes no
incorporados por las células apoptóticas fuera aclarado de la
circulación general. Luego se podría administrar el segundo
componente, es decir, el segundo miembro ligante, al sujeto. El
modo de administración es típicamente parenteral, subcutáneo,
intravenoso u oral. El segundo miembro ligante interaccionará con
el primer miembro ligante que está selectivamente situado en
células apoptóticas, lo que permitirá que el agente terapéutico o
detectable sea aislado en el ambiente de las células
apoptóticas.
Otro sistema adecuado para uso en el presente
invento, ilustrado esquemáticamente más adelante, comprende (i) un
primer componente que comprende el compuesto de arsenóxido de la
Reivindicación 1 que está enlazado con un primer miembro ligante; y
(ii) un segundo componente que comprende un segundo miembro ligante
enlazado con al menos un agente activo.
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De acuerdo con este sistema, un resto de
arsenóxido (tal como GSAO) está enlazado con un primer miembro
ligante (tal como biotina); es decir, un ejemplo de un primer
componente de este sistema es GSAO-B. Cuando se
administra a un sujeto, el resto de arsenóxido dirige
selectivamente GSAO-B a células apoptóticas. El
segundo componente comprende un segundo miembro ligante que es
capaz de interaccionar con el primer miembro ligante. El segundo
miembro ligante puede estar enlazado con un agente activo tal como
un agente diagnóstico (por ejemplo, un fluoróforo). El segundo
miembro ligante puede estar enlazado con un vehículo para el agente
activo, tal como un liposoma, y el agente activo se puede encontrar
dentro del vehículo, es decir, dentro del liposoma. Cuando se
administra el segundo componente al sujeto, se une selectivamente al
primer componente en el sitio de las células apoptóticas. En el
caso de GSAO-B, en que el primer miembro ligante es
biotina, un segundo miembro ligante adecuado es avidina o
estreptavidina.
Típicamente, una vez que se ha administrado el
primer componente del sistema a un sujeto, se deja transcurrir un
período de tiempo para permitir que todo primer componente residual
no absorbido por las células apoptóticas sea aclarado de la
circulación. Luego se administra el segundo componente.
Mediante los Ejemplos de Referencia 3(d)
y 3(e) se proporciona un ejemplo más de este sistema para uso
en el presente invento. En el Ejemplo 3(d) de Referencia,
las células fueron tratadas con el primer componente
GSAO-B in vitro, y el GSAO-B
residual fue eliminado por lavado. Luego se añadió el segundo
componente, que comprende avidina-peroxidasa. Un
método de detección conocido permitió que las células apoptóticas
fueran identificadas.
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A continuación se representa esquemáticamente
otro sistema adecuado para uso en el presente invento.
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En el Ejemplo 5(c) de Referencia se
proporciona un ejemplo de este sistema que no pertenece al invento.
Como aquí se describe, la propiedad de GSAO para dirigirse a
células tumorales apoptóticas ha sido utilizada para proporcionar
un agente coagulante a vasos sanguíneos tumorales. El factor tisular
(TF; del inglés, tissue factor) es el principal
receptor de iniciación para la cascada de la coagulación de la
sangre. La unión del factor VII/VIIa al TF activa los factores IX y
X, zimógenos serina proteinasas, mediante una proteolisis limitada,
lo que conduce a la formación de trombina y, finalmente, de un
coágulo sanguíneo. El dominio extracelular de TF (tTF) es una
proteína soluble con una actividad activadora del factor X que es
aproximadamente cinco órdenes de magnitud menor que la del TF
transmembranal nativo en un apropiado entorno de membrana
fosfolipídica. Esto es porque el complejo TF:VIIa se une a, y
activa, los factores IX y X mucho más eficazmente cuando se asocia
con una superficie negativamente cargada.
Cuando se administra a un vertebrado que tiene,
por ejemplo, un tumor, el compuesto de arsenóxido suministra el
factor tisular casi exclusivamente al sitio de la apoptosis
aumentada, es decir, a el(los) sitio(s) del tumor.
Una vez localizado en el sitio del tumor, la presencia del factor
tisular puede iniciar la cascada de la trombina para provocar una
coagulación sanguínea específica del sitio, obstruyendo por ello el
flujo sanguíneo al tumor y causando una necrosis grave del tejido
tumoral.
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Además, los componentes de los sistemas del
invento a menudo requieren los agentes activos anteriormente
esbozados presentes en forma de formulaciones farmacéuticas, es
decir, los agentes activos presentes junto con un vehículo, un
agente adyuvante y/o un agente diluyente farmacéuticamente
aceptables.
Para uso médico, en los sistemas del invento se
pueden utilizar sales de los agentes activos, sales que incluyen
sales farmacéuticamente aceptables aunque se pueden utilizar otras
sales en la preparación del compuesto o de la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo. Por sal farmacéuticamente aceptable se quiere
significar aquellas sales que, dentro del alcance del buen juicio
médico, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres
humanos y animales inferiores sin una toxicidad, una irritación y
una respuesta alérgica excesivas, y son proporcionales a una
razonable relación de beneficio/riesgo. Las sales farmacéuticamente
aceptables son bien conocidas en la técnica.
Por ejemplo, se pueden preparar adecuadas sales
farmacéuticamente aceptables de los compuestos útiles en los
sistemas del invento al mezclar un ácido farmacéuticamente
aceptable, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido
metanosulfónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico,
ácido benzoico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido oxálico,
ácido carbónico, ácido tartárico o ácido cítrico, con los compuestos
del invento. Por lo tanto, las adecuadas sales farmacéuticamente
aceptables de los compuestos útiles en los sistemas del invento
incluyen sales por adición de ácido.
Por ejemplo, S. M. Berge et al. describen
con detalle sales farmacéuticamente aceptables en J.
Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, 1977. Las
sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y
la purificación finales de los compuestos usados en los sistemas
del invento o, separadamente al hacer reaccionar la función base
libre con un ácido orgánico adecuado. Las sales por adición de ácido
representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato,
ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato,
butirato, canforato, canfosulfonato, citrato,
ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato,
fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato,
hexanoato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro,
2-hidroxi-etanosulfonato,
lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato,
malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato,
nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato,
persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato,
pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato,
tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato y valerato. Las sales de
metales alcalinos y alcalinotérreos representativas incluyen las de
sodio, litio, potasio, calcio y magnesio, así como cationes de
amonio, amonio cuaternario y amina atóxicos, incluyendo de amonio,
tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina,
trimetilamina, trietilamina y etilamina.
Se pueden llevar a cabo administraciones únicas
o múltiples de los compuestos o las composiciones farmacéuticas con
unos niveles y patrones de dosificación que son seleccionados por el
médico que trata al paciente. Pase lo que pase, los compuestos o
composiciones farmacéuticas útiles en los sistemas del presente
invento deben proporcionar una cantidad suficiente del compuesto
para tratar eficazmente al paciente.
Un experto en la técnica podría determinar,
mediante una experimentación rutinaria, la cantidad atóxica y
eficaz de los compuestos o composiciones farmacéuticas utilizadas en
el invento que sería necesaria para detectar células apoptóticas
y/o tratar o prevenir los trastornos y las enfermedades. En general,
se espera que una dosificación eficaz esté en el intervalo de
0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por 24 horas;
típicamente de 0,001 mg a 750 mg por kg de peso corporal por 24
horas, de 0,01 mg a 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de
0,1 mg a 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas, de 0,1 mg a
250 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 250 mg por
kg de peso corporal por 24 horas. Más típicamente, se espera que el
intervalo de dosis eficaz esté en el intervalo de 1,0 mg a 200 mg
por kg de peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 100 mg por kg de
peso corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 50 mg por kg de peso
corporal por 24 horas; de 1,0 mg a 25 mg por kg de peso corporal
por 24 horas; de 5,0 mg a 50 mg por kg de peso corporal por 24
horas; de 5,0 mg a 20 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de
5,0 mg a 15 mg por kg de peso corporal por 24 horas.
Alternativamente, una dosificación eficaz puede
ser hasta 500 mg/m^{2}. Generalmente, se espera que una
dosificación eficaz esté en el intervalo de 25 a 500 mg/m^{2},
preferiblemente de 25 a 350 mg/m^{2}, más preferiblemente de 25 a
300 mg/m^{2}, aún más preferiblemente de 25 a 250 mg/m^{2}, aún
más preferiblemente de 50 a 250 mg/m^{2}, y aún más
preferiblemente de 75 a 150 mg/m^{2}.
En relación con GSAO, una dosificación eficaz
está en el intervalo de 0,0001 mg a 100 mg de GSAO por kg de peso
corporal por 24 horas, preferiblemente de 0,001 mg a 100 mg de GSAO
por kg de peso corporal por 24 horas, más preferiblemente de 0,01
mg a 50 mg de GSAO por kg de peso corporal por 24 horas, aún más
preferiblemente de 0,1 mg a 20 mg de GSAO por kg de peso corporal
por 24 horas, y aún más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg de GSAO
por kg de peso corporal por 24 horas.
En relación con un agente activo para uso en los
sistemas del presente invento, una dosificación eficaz está en el
intervalo de 0,0001 mg a 100 mg de agente por kg de peso corporal
por 24 horas, preferiblemente de 0,001 mg a 100 mg de agente por kg
de peso corporal por 24 horas, más preferiblemente de 0,01 mg a 50
mg de agente por kg de peso corporal por 24 horas, aún más
preferiblemente de 0,1 mg a 20 mg de agente por kg de peso corporal
por 24 horas, y aún más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg de agente
por kg de peso corporal por 24 horas.
Aunque los compuestos utilizados en los sistemas
del presente invento pueden ser administrados solos, generalmente
es preferible que el compuesto sea administrado como una
composición/formulación farmacéutica. En general, las formulaciones
farmacéuticas que representan el(los) componente(s) de
los sistemas del presente invento pueden ser preparadas de acuerdo
con métodos que son conocidos por quienes tienen una experiencia
normal en la técnica, y, en consecuencia, pueden incluir un
vehículo, un agente diluyente y/o un agente adyuvante
farmacéuticamente aceptables.
Los vehículos, agentes diluyentes y agentes
adyuvantes deben ser "aceptables" en términos de ser
compatibles con los demás ingredientes de la formulación, y no ser
deletéreos para el receptor de los mismos.
Los ejemplos de vehículos o agentes diluyentes
farmacéutica y veterinariamente aceptables son agua desmineralizada
o destilada; disolución salina; aceites basados en vegetales, tales
como aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de oliva,
aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo,
aceite de Arachis y aceite de coco; aceites de silicona,
incluyendo polisiloxanos tales como
metil-polisiloxano,
fenil-polisiloxano y
metilfenil-polisiloxano; siliconas volátiles;
aceites minerales tales como parafina líquida, parafina blanda y
escualano; derivados de celulosa tales como metilcelulosa,
etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica e
hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores tales como, por
ejemplo, etanol e isopropranol; aralcanoles inferiores;
polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, tales
como, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol,
etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol y
glicerol; ésteres de ácidos grasos, tales como palmitato de
isopropilo, miristato de isopropilo y oleato de etilo;
polivinilpirrolidona; agar; carragenano, goma tragacanto y goma
arábiga; y vaselina. Típicamente, el vehículo o los vehículos
formarán del 10% al 99,9% en peso de las composiciones.
En una forma preferida, la composición
farmacéutica de un compuesto adecuado para uso en el invento
comprende una cantidad eficaz de un agente activo, junto con un
vehículo, un agente diluyente y/o un agente adyuvante
farmacéuticamente aceptables como los mostrados en el Ejemplo 6 de
Referencia.
Las composiciones farmacéuticas que representan
un componente del sistema del invento pueden ser administradas por
vías estándares. En general, las composiciones pueden ser
administradas por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal,
intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal,
intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa,
intraespinal, subcutánea o intramuscular). Aún en general, las
composiciones que representan un componente del sistema del invento
pueden estar en forma de una cápsula adecuada para ingestión oral,
en forma de un ungüento, crema o loción adecuada para administración
tópica, en una forma adecuada para suministro como gotas oculares,
y en una forma aerosólica adecuada para administración por
inhalación, tal como por inhalación intranasal o por inhalación
oral.
Para administración en forma de disolución o
suspensión inyectable, los agentes diluyentes o vehículos atóxicos
parenteralmente aceptables pueden incluir disolución de Ringer,
disolución salina isotónica, disolución salina tamponada con
fosfato, etanol y 1,2-propilenglicol.
Algunos ejemplos de vehículos, agentes
diluyentes, excipientes y agentes adyuvantes adecuados para uso oral
incluyen aceite de cacahuete, parafina líquida,
carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato sódico, goma
arábiga, goma tragacanto, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol,
gelatina y lecitina. Además, estas formulaciones orales pueden
contener agentes saboreadores y colorantes adecuados. Cuando se usan
en forma de cápsulas, éstas pueden estar revestidas con compuestos
tales como monoestearato de glicerilo y diestearato de glicerilo,
que retrasan la desintegración de la cápsula.
Los agentes adyuvantes incluyen típicamente
emolientes, agentes emulsivos, agentes espesativos, conservantes,
bactericidas y agentes tampón.
Las formas sólidas para administración oral
pueden contener agentes aglutinantes aceptables en la práctica
farmacéutica humana y veterinaria, edulcorantes, agentes
disgregantes, diluyentes, agentes saboreadores, agentes de
revestimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes para retardo
temporal. Los agentes aglutinantes adecuados incluyen goma arábiga,
gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto, alginato sódico,
carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los edulcorantes adecuados
incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo y sacarina. Los
agentes disgregantes adecuados incluyen almidón de maíz,
metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma guar, goma xantano,
bentonita, ácido algínico y agar. Los diluyentes adecuados incluyen
lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato
cálcico, silicato cálcico y fosfato dicálcico. Los agentes
saboreadores adecuados incluyen aceite de menta, aceite de
Gaulteria, y agentes saboreadores de cereza, naranja y
frambuesa. Los agentes de revestimiento adecuados incluyen
polímeros y copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o
sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zeína, goma laca y gluten. Los
conservantes adecuados incluyen benzoato sódico, vitamina E,
alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabeno,
propilparabeno y bisulfito sódico. Los lubricantes adecuados
incluyen estearato magnésico, ácido esteárico, oleato sódico,
cloruro sódico y talco. Los agentes para retardo temporal adecuados
incluyen monoestearato de glicerilo y diestearato de glicerilo.
Las formas líquidas para administración oral
pueden contener, además de los agentes anteriores, un vehículo
líquido. Los vehículos líquidos adecuados incluyen agua, aceites
tales como aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sésamo,
aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de Arachis,
aceite de coco, parafina líquida, etilenglicol, propilenglicol,
polietilenglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes
grasos, triglicéridos, y mezclas de los mismos.
Las suspensiones para administración oral pueden
comprender además agentes dispersivos y/o agentes suspendedores.
Los agentes suspendedores adecuados incluyen carboximetilcelulosa
sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa,
polivinilpirrolidona, alginato sódico y alcohol acetílico. Los
agentes dispersivos adecuados incluyen lecitina, ésteres
polioxietilénicos de ácidos grasos tales como el ácido esteárico,
mono- y di-oleato, -estearato y -laurato de
polioxietilen-sorbitol, y mono- y
di-oleato, -estearato y -laurato de
polioxietilen-sorbitán.
Las emulsiones para administración oral pueden
comprender además uno o más agentes emulsivos. Los agentes
emulsivos adecuados incluyen agentes dispersivos como los
anteriormente ejemplificados y gomas naturales tales como goma
guar, goma arábiga y goma tragacanto.
Las formulaciones tópicas para uso en el
presente invento comprenden un ingrediente activo junto con uno o
más vehículos aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes
terapéuticos cualesquiera.
Las formulaciones adecuadas para administración
tópica incluyen preparaciones líquidas y semilíquidas adecuadas
para penetración a través de la piel hasta el sitio donde se
necesita el tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas,
ungüentos y pastas, y gotas adecuadas para administración a los
ojos, los oídos o la nariz.
Las gotas para uso en el presente invento pueden
comprender disoluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles.
Éstas se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una
disolución acuosa de un agente bactericida y/o fungicida y/o
cualquier otro conservante adecuado, e incluyen opcionalmente un
agente tensioactivo. La disolución resultante puede ser luego
clarificada por filtración, transferida a un recipiente adecuado y
esterilizada. La esterilización se puede llevar a cabo por
tratamiento en autoclave o mantenimiento a
90ºC-100ºC durante media hora, o por filtración, lo
que va seguido de la transferencia a un recipiente mediante una
técnica aséptica. El nitrato o acetato fenilmercúrico (0,002%), el
cloruro de benzalconio (0,01%) y el acetato de clorhexidina (0,01%)
son ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para
inclusión en las gotas. Los disolventes adecuados para la
preparación de una disolución oleosa incluyen glicerol, alcohol
diluido y propilenglicol.
Las lociones de acuerdo con el presente invento
incluyen las adecuadas para aplicación a la piel o los ojos. Una
loción ocular puede comprender una disolución acuosa estéril que
contenga opcionalmente un bactericida, y puede ser preparada
mediante métodos similares a los anteriormente descritos en relación
con la preparación de las gotas. Las lociones o linimentos para
aplicación a la piel pueden también incluir un agente que acelere
el secado y refresque la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un
agente humectante tal como glicerol, o un aceite tal como aceite de
ricino o aceite de Arachis.
Las cremas, ungüentos y pastas de acuerdo con el
presente invento son formulaciones semisólidas del ingrediente
activo para aplicación externa. Se pueden preparar mezclando el
ingrediente activo en forma finamente dividida o pulverulenta, solo
o en disolución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con
una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos
tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de
abejas o un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural
tal como aceite de almendras, maíz, Arachis, ricino u oliva;
lanolina o sus derivados; o un ácido graso, tal como ácido esteárico
u oleico, junto con un alcohol tal como propilenglicol o
polietilenglicoles.
La formulación puede llevar incorporado
cualquier agente tensioactivo adecuado, tal como un agente
tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, tal como ésteres de
sorbitán o derivados polioxietilénicos de los mismos. También se
pueden incluir agentes suspendedores tales como gomas naturales,
derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices
silíceas, y otros ingredientes tales como lanolina.
Las composiciones para administración parenteral
comprenderán comúnmente una disolución de un agente activo útil
como componente del sistema del presente invento o un cóctel del
mismo disuelto en un vehículo aceptable tal como agua, agua
tamponada, disolución salina al 0,4%, glicocola al 0,3%, etc.,
disoluciones que serán estériles y estarán relativamente exentas de
materia corpuscular.
Los métodos para preparar composiciones
parenteralmente administrables resultan evidentes a los expertos en
la técnica y son descritos con mayor detalle en, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Science, 15ª edición, Mack Publishing
Company, Easton, Pennsylvania, EE.UU.
Las composiciones farmacéuticas que representan
un componente y/o un agente activo del sistema del invento pueden
ser también administradas en forma de liposomas. Los liposomas
proceden generalmente de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas
y están formados por cristales líquidos hidratados monolaminares o
multilaminares que están dispersos en un medio acuoso. Se puede
utilizar cualquier lípido atóxico, fisiológicamente aceptable y
metabolizable capaz de formar liposomas. Las formulaciones en forma
de liposomas pueden contener estabilizadores, conservantes y
excipientes. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las
fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Los
métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica, y se hace
referencia específica a ellos en Prescott, redactor, "Methods in
Cell Biology", volumen XIV, Academic Press, New York, New York,
EE.UU. (1976), página 33 y siguientes.
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Los sistemas adecuados para uso de acuerdo con
el presente invento pueden estar disponibles como kits en los que
están envasados separadamente los respectivos componentes del
sistema. Los recipientes adecuados incluyen recipientes de vidrio,
recipientes de plástico, y tiras de plástico o papel tales como
envases blíster. Los kits incluyen típicamente recipientes para
alojar los diversos componentes, e instrucciones para utilizar los
componentes del kit de acuerdo con los métodos del presente
invento.
Los kits pueden ser utilizados de acuerdo con
los métodos de detección del presente invento.
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Se adquirieron los siguientes productos químicos
y se utilizaron sin una purificación ulterior: fenilarsenóxido,
bromuro de bromoacetilo, dióxido de azufre,
d_{6}-dimetilsulfóxido, óxido de deuterio,
metanol, ácido sulfúrico al 98%, ácido bromhídrico al 48%, ácido
clorhídrico al 37% (Ajax, Auburn, New South Wales, Australia),
diclorometano, hidróxido potásico, hidrogenocarbonato sódico,
hidróxido sódico (BDH, Kilsyth, Victoria, Australia), gel
P-2 extrafino con un corte de pesos moleculares de
1800 (Bio-Rad, Hercules, California, EE.UU.),
2,3-dimercaptopropanol (DMP), cloruro de tionilo
(Merck, Darmstadt, Alemania), ácido 6,8-tióctico,
ácido etilendiaminatetraacético,
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido
2-etanosulfónico), carbonato sódico, cloruro sódico,
yoduro sódico (Sigma, Castle Hill, New South Wales, Australia),
ácido p-arsanílico (Tokyo Kasei Kogyo, Tokio,
Japón), glicocola (ICN, Aurora, Ohio, EE.UU.), y éster
succinimidílico del ácido
6-{[6-([biotinoil]amino)hexanoil]amino}hexanoico
(biotina-XX, SE) fueron obtenidos de Molecular
Probes, Eugene, Oregon, EE.UU. Todos los demás reactivos fueron de
calidad analítica.
\newpage
Instrumentación: Se obtuvieron espectros
de RMN 1D y 2D usando un espectrómetro Bruker DPX300 de resonancia
magnética nuclear, detectándose ^{1}H y ^{13}C a 300,17 MHz y
75,48 MHz, respectivamente. Las absorbancias
UV-visibles se registraron en un lector Thermomax
Plus de microplacas, de Molecular Devices (Palo Alto, California,
EE.UU.).
Preparación de óxido de deuterio
acidificado: Se añadió cuidadosamente cloruro de tionilo fresco
a óxido de deuterio en exceso. Una vez que hubo cesado el
desprendimiento de SO_{2}, se añadió la disolución resultante
(0,6 ml) a GSAO (aproximadamente 50 mg) en un tubo de 5 mm para RMN.
Se usó esta muestra para obtener los espectros de RMN.
Ejemplo
1(a)
La síntesis total de GSAO se representa
esquemáticamente en la Figura 1.
Se añadió carbonato sódico (40,14 g, 378,7
milimoles) a agua (200 ml) y se agitó la mezcla a temperatura
ambiental hasta que se disolvió todo el sólido. Se añadió ácido
p-arsanílico (29,99 g, 138,2 milimoles), en
porciones, a la disolución agitada de carbonato y se completó el
volumen de la disolución hasta 300 ml con la adición de más agua.
La disolución (pH de 10 a 11) fue dejada en agitación durante 30
minutos y, en caso de necesidad, fue filtrada para separar todo
sólido sin disolver antes de ser enfriada durante un periodo de 2 a
3 horas. Se transfirió la disolución a un embudo de decantación y
se añadieron trocitos de hielo. Se diluyó bromuro de bromoacetilo
(15 ml, 34,76 g, 172,1 milimoles) en diclorometano (50 ml) y se
añadió cuidadosamente cerca de la mitad de la disolución en
diclorometano a la disolución acuosa fría. Se sacudió cuidadosamente
la mezcla, con descarga frecuente de gases para evitar una excesiva
acumulación de presión. Después de 1 a 2 minutos, el
desprendimiento de dióxido de carbono había remitido y se emprendió
un sacudimiento más enérgico. Se añadió cuidadosamente la porción
restante de bromuro de bromoacetilo y se repitió el procedimiento.
Una vez acabada la reacción, se halló que el pH de la disolución
era 7. La capa inferior de diclorometano fue desechada y la capa
acuosa fue transferida a un matraz de 1 l de capacidad y fue
cuidadosamente acidificada mediante la adición, gota a gota, de
ácido sulfúrico al 98%. La precipitación completa del producto
blanco requirió la adición de ácido hasta que el pH de la
disolución fue aproximadamente 1. El producto crudo fue recogido y
fue secado en la bomba, típicamente con rendimientos de 50% a 75%.
^{1}H-RMN (d_{6}-DMSO):
\delta, 4,09 (s, 2H), 7,73 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,83 (d, J = 9 Hz,
2H), 10,87 (s, 1H). ^{13}C-RMN
(d_{6}-DMSO): \delta, 30,53, 119,97, 127,34,
131,56, 143,08, 166,00 ppm.
Se introdujo BRAA (12,15 g, 36 milimoles) en un
matraz de fondo redondo y 3 bocas, de 500 ml de capacidad. Se
disolvió el sólido en una mezcla de metanol (75 ml) y ácido
bromhídrico (48%, 75 ml) con formación de remolinos, para obtener
una disolución amarilla transparente. Se filtró la disolución para
separar los sólidos residuales. Se añadió yoduro sódico (0,20 g,
1,3 milimoles) como catalizador, tras lo cual el color de la
disolución se oscureció hasta un marrón anaranjado, y luego se hizo
pasar lentamente dióxido de azufre gaseoso (aproximadamente 2
burbujas por segundo) a través de la disolución agitada durante
aproximadamente 2,5 horas. El precipitado blanco resultante fue
recogido utilizando un embudo Büchner para obtener el producto
(17,43 g) en forma de sólido blanco húmedo. Se determinó que la
actividad de una disolución obtenida al disolver una porción del
sólido (40,7 mg) en DMSO desoxigenado (800 \mul) era 56 mM (véase
más adelante). De aquí se concluye que el peso molecular del
BRAO\cdotxH_{2}O es 908,5, es decir, 35% de BRAO en peso/peso y
65% de H_{2}O en peso/peso. Por lo tanto, el peso "anhidro"
del producto de BRAO era el 35% de 17,43 g, es decir, 6,10 g (19
milimoles; 53% de rendimiento). ^{1}H-RMN
(d_{6}-DMSO): \delta, 4,85 (s, 2H), 7,78 (d, J =
9 Hz, 2H), 7,86 (d, J = 9 Hz, 2H), 11,36 (s, 1H).
^{13}C-RMN (d_{6}-DMSO):
\delta, 30,55, 119,22, 130,52, 140,04, 145,04, 165,52 ppm.
Se desoxigenó DMSO (10 ml) haciendo pasar una
corriente de nitrógeno gaseoso a través de él durante algunos
minutos, y se utilizó para disolver el BRAO\cdotxH_{2}O (1,00 g,
2,48 milimoles de arsenóxido activo). Se disolvió glutatión (1,15
g, 3,74 milimoles, 1,5 equivalentes) en tampón de bicarbonato 0,5 M
(35 ml), pH de 9,6, y se añadió a la disolución de
BRAO\cdotxH_{2}O en DMSO. Se completó el volumen total hasta 50
ml con tampón de bicarbonato 0,5 M y se agitó suavemente la
disolución a temperatura ambiental durante la noche. Una cuidadosa
neutralización con ácido clorhídrico al 37%, seguida de
liofilización, proporcionó un producto pulverulento blanco que pudo
ser disuelto en agua sin que quedara sólido residual alguno. Se
halló que la concentración de arsenóxido activo de la disolución
resultante era 49,6 mM, determinada utilizando el ensayo de
DMP/DTNB (véase más
adelante).
adelante).
El producto fue purificado utilizando filtración
en gel (gel P-2 extrafino, corte de 1,8 kDa, 50 g)
en una columna de 130 ml de capacidad, usando un tampón de Hepes 20
mM, NaCl 0,14 M, EDTA 1 mM, pH de 7,4, como eluyente con un caudal
de 0,10 ml/minuto. Se recogió un volumen total de 144 ml (72
fracciones de 2 ml) que fue analizado por UV (\lambda de 214 nm).
Se resolvieron cuatro picos: A, B, C y D. Los picos B y C mostraron
actividad en el ensayo de DTNB/DMP (véase más adelante) y fueron
asignados a GSAO y BRAO sin reaccionar, respectivamente. Los picos
A y D fueron provisionalmente asignados a los productos de oxidación
GSAA y BRAA (el producto de oxidación de BRAO), respectivamente
(véase más adelante). También se detectó glutatión sin reaccionar
(usando DTNB) en las fracciones correspondientes al pico A. Las
fracciones correspondientes al pico B fueron combinadas y fueron
desoxigenadas con nitrógeno gaseoso para obtener una disolución de
GSAO (15 mM, aproximadamente 12 ml). ^{1}H-RMN
(D_{2}O): \delta, 1,93 (q, J = 7 Hz, 2H), 2,35 (t, J = 8 Hz,
2H), 2,84 (dd, J = 14 Hz, J = 9 Hz, 1H), 3,05 (dd, J = 14 Hz, J = 5
Hz, 1H), 3,35 (s, 2H), 3,58 (t, J = 6 Hz, 1H), 3,64 (d, J = 2 Hz,
2H), 4,48 (dd, J = 9 Hz, J = 5 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,58
(d, J = 8 Hz, 2H). ^{13}C-RMN (D_{2}O):
\delta, 25,93, 31,16, 33,53, 36,01, 42,97, 52,83, 53,89, 121,29,
129,97, 138,77, 144,09, 170,90, 171,73, 173,75, 174,68, 175,76
ppm.
También se usó la espectroscopía de RMN 2D para
confirmar la estructura de GSAO. Se halló que toda una serie de
espectros de RMN de ^{1}H y ^{13}C, COSY de ^{1}H, ^{13}C y
^{1}H-^{1}H, HMQC de
^{1}H-^{13}C y HMBC de
^{1}H-^{13}C era consistente con la estructura
propuesta en la Figura 1. Conjuntamente considerados, todos los
espectros permitían la asignación inequívoca de todos los átomos de
carbono y todos los átomos de hidrógeno no intercambiables. En la
Figura 2, se muestra una ampliación del espectro de
^{1}H-^{13}C de GSAO por HMBC, que muestra la
región alifática. La técnica de HMBC de
^{1}H-^{13}C permite correlacionar núcleos de
^{1}H y ^{13}C acoplados, pero filtra directamente los núcleos
enlazados. Esto significa que los núcleos de ^{1}H y ^{13}C que
están separados por dos, tres o (a veces) cuatro enlaces aparecen
como picos cruzados en el espectro. La Figura 2 muestra que C11
está sólo fuertemente acoplado con H7 (en referencia a los protones
fijados a C7), mientras que C7 está fuertemente acoplado con H11
además de con H6. Esto confirma que el azufre del glutatión estaba
exitosamente alquilado con BRAO.
Ejemplo 1(b) de
Referencia
La síntesis de GSAA se representa
esquemáticamente en la Figura 3.
Se disolvieron BRAA (1,00 g, 2,96 milimoles) y
glutatión (1,36 g, 4,44 milimoles, 1,5 equivalentes) en tampón de
bicarbonato 0,5 M (50 ml), pH de 9,6, y se agitó suavemente la
disolución a temperatura ambiental durante la noche. Una
liofilización proporcionó un producto pulverulento blanco que era
completamente soluble en agua, no quedando residuo sólido alguno.
El producto fue purificado mediante filtración en gel en una columna
(2,5 x 117 cm) de Bio-Gel P-2
extrafino (BioRad, Hercules, California, EE.UU.), de 570 ml de
capacidad, utilizando agua desionizada como eluyente con un caudal
de 0,1 ml por minuto. El producto (GSAA) era eluido de la columna
en una posición que correspondía al pico A en la purificación de
GSAO.
Ejemplo 1(c) de
Referencia
La síntesis de GSAO-B se
representa esquemáticamente en la Figura 4.
Se disolvió GSAO (0,13 g) en tampón de
bicarbonato sódico 0,5 M (5 ml, pH de 8,5), y se determinó que la
concentración de compuesto arsenical activo en la disolución
resultante era 39 mM. La disolución arsenical tamponada (4,2 ml,
que contenía 165 micromoles de compuesto arsenical activo) fue
añadida a una disolución de biotina-XX, SE (100 mg,
176 micromoles) en DMSO (1 ml), y la mezcla fue invertida unas
cuantas veces y fue luego incubada a 4ºC durante 4 horas. Se añadió
glicocola (17,5 mg, 233 micromoles) y se mantuvo la mezcla a 4ºC
durante la noche. Se determinó que la concentración de compuesto
arsenical trivalente en el producto de GSAO-B era
31 mM y se usó la disolución sin una modificación ulterior.
Ejemplo 1(d) de
Referencia
Se añadió una disolución de éster
succinimidílico de fluoresceína-5-EX
(Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) (2,4 mg, 4,1 micromoles)
en DMSO (240 \mul) a GSAO o GSAA (33,8 mM) en tampón de Mes (5 mM,
473 \mul), pH de 5,5, y la mezcla fue diluida con tampón de
bicarbonato (0,5 M, 3,287 ml), pH de 9, y fue dejada en reposo a
temperatura ambiental durante 80 minutos. La mezcla de reacción fue
luego diluida con glicocola (100 mM) en PBS (4 ml) y fue dejada en
reposo a temperatura ambiental durante la noche. La disolución final
contenía compuesto arsenical trivalente (2,00 mM) y glicocola (50
mM). La relación molar de fluoresceína-5X a GSAO o
GSAA era \sim 1,5:1. Los pesos moleculares de
GSAO-fluoresceína y
GSAA-fluoresceína (GSAO-F y
GSAA-F) son 1024 y 1040, respectivamente. La
síntesis de GSAO-F se representa esquemáticamente en
la Figura 5.
\newpage
Ejemplo 1(e) de
Referencia
Se mezcló una disolución de Cy^{TM}5.5
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) (266 nanomoles) en
tampón de bicarbonato (0,5 M, 968 \mul), pH de 9, con una
disolución de GSAO o GSAA (33,8 mM) en tampón de Mes (5 mM, 32
\mul), pH de 5,5, y se dejó la mezcla en reposo a temperatura
ambiental durante 80 minutos. La mezcla de reacción fue luego
diluida con glicocola (100 mM) en PBS (1 ml) y fue dejada en reposo
a temperatura ambiental durante la noche. La disolución final
contenía compuesto arsenical trivalente (0,54 mM) y glicocola (50
mM). La relación molar de GSAO o GSAA a Cy^{TM}5.5 era \sim 4:1.
Los pesos moleculares de GSAO-Cy^{TM}5.5 y
GSAA-Cy^{TM}5.5 son 1447 y 1463, respectivamente.
La síntesis de GSAO-Cy^{TM}5.5 se representa
esquemáticamente en la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 de
Referencia
Ejemplo
2(a)
Se midieron las concentraciones de
GSAO-B, GSAO-fluoresceína
(GSAO-F) y GSAO-Cy^{TM}5.5 en
disolución titulando con dimercaptopropanol (DMP) y calculando los
tioles libres restantes con 5,5'-ditiobis(ácido
2-nitrobenzoico) (DTNB; Sigma, St. Louis, Missouri,
EE.UU.) (Donoghue et al., 2000). Se disolvió una disolución
madre de DMP (5 \mul, 50 micromoles) en DMSO (995 \mul) para
obtener una concentración 50 mM de DMP. Una segunda dilución de la
disolución madre 50 mM de DMP (10 \mul) en un tampón con un pH de
7,0 (HEPES 0,1 M, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM; 990 \mul) proporcionó
una disolución de trabajo de DMP 500 \muM. luego se pudo
determinar la actividad del compuesto arsenical mediante la
titulación de cantidades variables de compuesto arsenical frente a
la disolución de trabajo de DMP (10 \mul) en una placa de 96
pocillos para microtitulación, completándose el volumen total hasta
195 \mul mediante la adición de tampón. Después de una incubación
de 10 minutos a temperatura ambiental, tiempo durante el cual las
disoluciones fueron agitadas en un sacudidor de placas, se añadieron
5 \mul de una disolución madre 37,9 mM de DTNB (15 mg) en DMSO (1
ml) y se incubó la placa con sacudimiento durante otros 10 minutos.
Se midió la absorbancia a 412 nm, debida a la formación del dianión
de TNB, usando un lector Thermomax Plus de microplacas, de
Molecular Devices (Palo Alto, California, EE.UU.). El coeficiente
de extinción del dianión de TNB a 412 nm y un pH de 7,0 es 14.150
M^{-1}cm^{-1} (Riddles et al., 1983). Los productos de
conjugación fueron esterilizados por filtración y fueron almacenados
a 4ºC en oscuridad hasta su uso. No hubo pérdida significativa
alguna en la concentración activa de las disoluciones madre de los
compuestos arsenicales durante al menos una semana cuando se
almacenaron bajo estas condiciones. La glicocola lentifica la
oxidación de GSAO a GSAA (Donoghue et al., 2000).
Ejemplo
2(b)
La PDI y la tiorredoxina recombinantes humanas
se unían a GSAO-B (Figura 7). Se produjo proteína
disulfuro isomerasa (PDI) humana recombinante en E. coli y
se purificó de acuerdo con Jiang et al. (1999). En el
experimento, se incubó PDI, tiorredoxina o albúmina purificadas,
esta última como testigo negativo, con un exceso molar de 2 órdenes
de magnitud de ditiotreitol durante 60 minutos para asegurar que los
disulfuros de sitios activos de la PDI y la tiorredoxina estaban en
el estado de ditiol reducido. Luego se incubaron las proteínas con
GSAO-B, o con GSAO-B y un exceso
molar de 4 órdenes de magnitud de DMP, durante 30 minutos. Moles
equivalentes de las proteínas marcadas fueron resueltos mediante
SDS-PAGE, transferidos a una membrana de PVDF y
hechos reaccionar con estreptavidina-peroxidasa para
detectar el marcador GSAO-B. Las muestras fueron
resueltas por SDS-PAGE al 4-15% bajo
condiciones no reductoras y fueron transferidas a una membrana de
PVDF. Las proteínas fueron detectadas por transferencia Western
usando un anticuerpo monoclonal murino anti-PDI
(Jiang et al., 1999) (utilizado en una cantidad de 2 \mug
por ml). Se usaron anticuerpos anti-ratón conjugados
con peroxidasa de rábano picante, generados en conejo (Dako
Corporation, Carpinteria, California, EE.UU.), en una dilución
1:2000. Las proteínas marcadas con GSAO-B fueron
hechas reaccionar con estreptavidina-peroxidasa
(Amersham, Sidney, New South Wales, Australia) utilizada en una
dilución 1:1000. Las proteínas fueron visualizadas usando
quimioluminiscencia (DuPont NEN, Boston, Massachusetts, EE.UU.) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las películas para
quimioluminiscencia fueron analizadas utilizando un densitómetro de
imágenes GS-700 y el software
Multi-Analyst (Bio-Rad, Hercules,
California, EE.UU.).
Tanto la PDI como la tiorredoxina incorporaron
GSAO-B, pero la albúmina no. La banda superior de
M_{r} del carril 1 de la Figura 7B era una pequeña cantidad de
PDI agregada de la preparación (Jiang et al., 1999). Es
digno de mención que la densidad de la marcación de PDI era
aproximadamente el doble de la densidad de la tiorredoxina, lo que
es coherente con los dos ditioles de sitios activos de la PDI frente
al único de la tiorredoxina.
\newpage
Ejemplo 3 de
Referencia
Ejemplo
3(a)
Se sembraron células BAE, con una densidad de 5
x 10^{5} células por pocillo, en portaobjetos de vidrio con
cámaras de 2 pocillos (Nunc, Naperville, Illinois, EE.UU.), y se
dejó que se fijaran durante la noche. Las células fueron tratadas
durante 16 horas con GSAO-B 10 \muM, y fueron
luego lavadas dos veces con PBS, fijadas en PBS que contenía
formaldehído al 3,7% y permeabilizadas con PBS que contenía
formaldehído al 3,7% y TritonX-100 al 0,1%, y
fueron después lavadas dos veces e incubadas durante 1 hora a
temperatura ambiental con una dilución 1:200 de estreptavidina
conjugada con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.)
en PBS que contenía BSA al 1%. Las células fueron luego lavadas tres
veces con PBS y fueron montadas en un agente antidecoloración
VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE.UU.).
Se tomaron fotografías con un microscopio Olympus BX60 con
fluorescencia BX-FLA, y una cámara digital Spot de
Diagnostic Instruments y el software v2.2 (Sterling Heights,
Michigan, EE.UU.).
Cuando las células endoteliales cultivadas se
tiñeron con GSAO-B y se visualizaron con
estreptavidina-Alexa 488, se observó que la célula
ocasional se teñía muy intensamente (Figura 8). La inmensa mayoría
de las células se unían muy poco a GSAO-B.
Ejemplo
3(b)
Se cultivaron células de fibrosarcoma humano
HT1080 y células endoteliales aórticas bovinas (ATCC, Bethesda,
Maryland, EE.UU.) en medio DMEM que contenía suero bovino fetal
(FBS; del inglés, foetal bovine serum) al 10%,
L-glutamina 2 mM y 5 U/ml de
penicilina/estreptomicina (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland,
EE.UU.). Se cultivó la línea de células endoteliales
microvasculares humanas (HMEC-1; del inglés,
human microvascular endothelial cell)
(Ades et al., 1992) en medio MCDB131 (Gibco BRL,
Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al
10%, L-glutamina 2 mM, 5 U/ml de
penicilina/estreptomicina, 10 ng/ml de factor de crecimiento
epidérmico (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) y 1 \mug/ml
de hidrocortisona (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Se
separaron las células con PBS que contenía EDTA 10 mM o con una
disolución de tripsina/EDTA (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland,
EE.UU.). Las placas para cultivo procedían de Corning Costar,
Corning, New York, EE.UU.
Las células HT1080 fueron tratadas durante 20
horas con 1 \mug/ml de camptotecina (Calbiochem, San Diego,
California, EE.UU.) y fueron luego separadas con PBS que contenía
EDTA 2,5 mM y combinadas con las células que se habían separado
durante la incubación. Se lavaron las células dos veces con tampón
de unión para anexina V (Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 2,5
mM, pH de 7,4) y se incubaron 2 x 10^{5} células por tratamiento
en 100 \mul de tampón de unión para anexina V que contenía
GSAO-F o GSAA-F 10 \muM durante 15
minutos a temperatura ambiental con sacudimiento. Se lavaron las
células dos veces y luego se incubaron durante 15 minutos en 100
\mul de tampón de unión para anexina V que contenía 5 \mul de
anexina V conjugada con ficoeritrina (anexina V-PE;
PharMingen, San Diego, California, EE.UU.) y 1 \mul de una
disolución de 100 \mug/ml de yoduro de propidio (Molecular
Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Luego se completó el volumen total
hasta 500 \mul con tampón de unión para anexina V y se
transfirieron las muestras a hielo. La citometría de flujo se llevó
a cabo utilizando un citómetro de flujo FACStar (Becton Dickinson).
Los resultados proceden de 10^{4} células por muestra. Para
probar el efecto de la inhibición de caspasas sobre la incorporación
de GSAO-F, las células fueron tratadas con
camptotecina en ausencia o presencia de 10 \mug/ml de
Z-VAD-FMK
(carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona)
(Calbiochem-Novabiochem, San Diego, California,
EE.UU.) y fueron luego separadas, lavadas e incubadas en tampón de
unión para anexina V que conte-
nía GSAO-F 10 \muM durante 15 minutos. Las células fueron lavadas dos veces y fueron sometidas a citometría de flujo.
nía GSAO-F 10 \muM durante 15 minutos. Las células fueron lavadas dos veces y fueron sometidas a citometría de flujo.
Se trataron células HT1080 de fibrosarcoma
humano con camptotecina, un inhibidor de la topoisomerasa (Kaufmann,
1998), durante 20 horas para provocar apoptosis, y las células no
tratadas o las células tratadas con camptotecina se incubaron con
una combinación de GSAO o GSAA conjugados con fluoresceína
(GSAO-F y GSAA-F), y anexina V
conjugada con ficoeritrina (anexina V-PE). Se
cuantificó la fluorescencia por citometría de flujo (Figura
9a-f). Resultó evidente un aumento de células
apoptóticas y muertas después del tratamiento con camptotecina, con
un aumento de 7,3 órdenes de magnitud en la proporción de células
que tenían una fluorescencia por ficoeritrina superior a 100
unidades de fluorescencia. Este aumento de células positivas para
anexina V se correlacionaba con un aumento de 8,6 órdenes de
magnitud en la proporción de células cuya fluorescencia por
fluoresceína era superior a 1027 unidades (Figura 9c). Por
contraste, el tratamiento con camptotecina no aumentó la proporción
de células que se marcaban conjuntamente con GSAA-F
y anexina V-PE (Figura 9f). Las fluorescencias
medias por fluoresceína de las células no tratadas y marcadas con
GSAA-F o GSAO-F eran similares (255
unidades para GSAO-F; 213 unidades para
GSAA-F), mientras que, en la población de células
tratadas con camptotecina, resultó evidente una clara diferencia en
las fluorescencias medias (1400 unidades para
GSAO-F; 219 unidades para GSAA-F).
Se obtuvieron resultados similares cuando se provocó apoptosis en
células endoteliales microvasculares dérmicas humanas usando 1
\mug/ml de camptotecina u homocisteína 10 ó 25 mM durante 24 horas
(no mostrado).
Se dejaron células HT1080 sin tratar o se
trataron con camptotecina para provocar apoptosis, y luego se
separaron y se marcaron con GSAO-F, anexina
V-PE y yoduro de propidio, el colorante que se une
al ácido nucleico. El yoduro de propidio es incorporado por las
células en las últimas fases de la apoptosis y por las células
necróticas, mientras que la anexina V se une a las células al
principio del programa apoptótico. Se representó gráficamente la
fluorescencia por anexina V-PE frente a la
fluorescencia por GSAO-F en todas las células y en
todas las células salvo aquellas que habían incorporado yoduro de
propidio (> 200 unidades de fluorescencia). Se muestra (Figura
9g) el porcentaje de células que se tiñeron intensamente tanto con
anexina V-PE (> 200 unidades de fluorescencia)
como con GSAO-F (> 1980 unidades de
fluorescencia). GSAO-F se unía tanto a células
apoptóticas como a células
muertas.
muertas.
Las caspasas son una clase de aspartato
proteasas que son activadas por estímulos apoptóticos en todas las
células, desencadenando la proteolisis de dianas celulares tales
como el citoesqueleto y la fragmentación del DNA nuclear (Thomberry
y Lazebnik, 1998). La activación de caspasas es un componente
esencial del programa apoptótico, y se ha utilizado mucho
Z-VAD-FMK, un inhibidor de caspasas
de amplio espectro, para bloquear procesos dependientes de caspasas
(Zhu et al., 1995). Se trataron células HT1080 con
camptotecina del modo anterior, en presencia o ausencia de
Z-VAD-FMK. El tratamiento con
Z-VAD-FMK bloqueaba sustancialmente
el aumento de células positivas para GSAO-F visto
con el tratamiento con camptotecina, lo que indica que la actividad
caspasa es un requisito para la incorporación de GSAO por células
apoptóticas.
Ejemplo
3(c)
Se trataron células HT1080 con 1 \mug/ml de
camptotecina durante 20 horas, y luego se separaron con PBS que
contenía EDTA 10 mM, se lavaron con tampón de unión para anexina V y
se incubaron durante 15 minutos en tampón de unión para anexina V
que contenía anexina V conjugada con Alexa 594 en relación 1:20
(volumen/volumen) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) y
GSAO-F 10 \muM. Las células fueron luego lavadas
dos veces con tampón de unión para anexina V y dispuestas sobre un
portaobjetos de microscopio con una pipeta. Se capturaron cortes
celulares transversales utilizando un microscopio Olympus BX60 y una
unidad confocal y un software Optiscan F900e (Optiscan, Notting
Hill, Australia).
Se trataron células HT1080 con 1 \mug/ml de
camptotecina durante 20 horas y se marcaron con anexina
V-PE y GSAO-B 10 \muM del modo
anteriormente descrito para la marcación con GSAO-F
y anexina V-PE. Se separaron las células basándose
en su fluorescencia por anexina V-PE y se lavaron
tres veces con PBS, y se lisaron 4 x 10^{4} células en 40 \mul
de tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5 M, Triton
X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 1%, SDS al
0,1%, leupeptina 10 \muM, aprotinina 10 \muM, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 2 mM, EDTA 5 mM, pH de 8,0) a 4ºC. Se
sometieron cantidades iguales del lisado a electroforesis en un gel
de poliacrilamida-SDS en gradiente de
8-16% (Gradipore, Sydney) y se transfirieron los
productos resueltos a una membrana de poli(fluoruro de
vinildietileno) (PVDF; Millipore, Bedford, Massachusetts, EE.UU.), y
se detectaron las proteínas biotiniladas con una dilución 1:2000 de
avidina-peroxidasa (Molecular Probes, Eugene,
Oregon, EE.UU.). Para identificar las proteínas que habían
incorporado GSAO-B, se incubaron 20 \mul del
lisado en RIPA con 5 \mul de
estreptavidina-Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo,
Noruega) durante 15 minutos a 4ºC. Los glóbulos fueron luego lavados
dos veces con tampón RIPA, resuspendidos en 20 \mul de tampón de
carga para SDS-PAGE, resueltos por
SDS-PAGE y transferidos a una membrana de
poli(difluoruro de vinilideno), y se detectó la PDI por
transferencia Western usando 2 \mug/ml de anticuerpos
policlonales anti-PDI (Donoghue et al., 2000)
y una dilución 1:2000 de anticuerpos anti-conejo
conjugados con peroxidasa, generados en cabra (Dako Corporation,
Carpinteria, California, EE.UU.). Las transferencias se
desarrollaron usando quimioluminiscencia potenciada ECL (NEN,
Boston, Massachusetts, EE.UU.).
\newpage
Las células HT1080 no tratadas y las tratadas
con camptotecina fueron también marcadas con GSAO-B
10 \muM en ausencia o presencia de dimercaptopropanol 50 \muM
durante 15 minutos a 20ºC y con sacudimiento. Se lavaron tres veces
las células con PBS y se lisaron 2 x 10^{5} células en 100 \mul
de tampón RIPA a 4ºC. Los lisados fueron resueltos por
SDS-PAGE y hechos reaccionar con
avidina-peroxidasa de la manera anteriormente
descrita.
Se trataron células HT1080 con camptotecina para
provocar apoptosis y luego se separaron y se marcaron con
GSAO-F y anexina V-Alexa 594. Se
obtuvieron imágenes de las células por microscopía confocal.
GSAO-F se distribuía en el citoplasma de las
células positivas para anexina V [Figura 10a
(i-vi)]. Hubo una insignificante fluorescencia por
GSAO-F en las células que no se marcaron con anexina
V [Figura 10a (vii)].
Se trataron células HT1080 con camptotecina para
provocar apoptosis y luego se separaron y se marcaron con anexina
V-PE y GSAO conjugado con biotina
(GSAO-B) (Donoghue et al., 2000). Se
distribuyeron las células en poblaciones positiva para anexina V
(> 100 unidades de fluorescencia) y negativa para anexina V (<
100 unidades), y se resolvieron números equivalentes de células de
cada población por SDS-PAGE y se hicieron reaccionar
con estreptavidina-peroxidasa para detectar las
proteínas marcadas con GSAO-B. En las células
positivas para anexina V, aproximadamente siete proteínas
incorporaron claramente GSAO-B (Figura 10b). En
comparación, el nivel de incorporación de GSAO-B
por las células negativas para anexina V resultó insignificante.
Las proteínas marcadas con
GSAO-B fueron también recogidas sobre
estreptavidina-Dynabeads, resueltas por
SDS-PAGE y sometidas a transferencia Western para
proteína disulfuro isomerasa (PDI), una proteína que abunda en el
retículo endoplásmico y actúa como una chaperona redox (Donoghue
et al., 2000; Novia, 1999). La intensidad de la marcación de
PDI en las células positivas para anexina V era mucho mayor que la
marcación de esta proteína en las células negativas para anexina V
(Figura 10c).
Para confirmar que GSAO-B estaba
interaccionando con ditioles estrechamente espaciados en las células
apoptóticas, se dejaron células HT1080 sin tratar o se trataron con
camptotecina y luego se separaron y se marcaron con
GSAO-B en ausencia o presencia de dimercaptopropanol
(Figura 10d). Este ditiol sintético compite con ditioles proteicos
para unirse a GSAO-B (Donoghue et al., 2000).
De nuevo, hubo mucha más marcación de la población tratada con
camptotecina que de la población no tratada, y la marcación de
proteínas celulares apoptóticas por GSAO-B resultó
suprimida al incubar las células con un exceso molar de 5 órdenes de
magnitud de dimercaptopropanol.
Ejemplo
3(d)
Se administraron 36 mg/kg de
GSAO-B o GSAA-B en 0,2 ml de PBS que
contenía glicocola 20 mM a ratones BALB/C desnudos (Biological
Resources Centre, Universidad de New South Wales, Sydney, Australia)
que portaban tumores subcutáneos BxPC-3 en la
superficie dorsal proximal, mediante inyección subcutánea en la
ijada trasera. Los ratones fueron sacrificados 6 horas más tarde y
los tumores fueron embebidos en compuesto OCT (Sukura, Torrence,
California, EE.UU.) y fueron instantáneamente congelados en
nitrógeno líquido. Se fijaron cortes de 5 \mum de los tumores con
acetona, se tiñeron con StreptABComplex/HRP (Dako Corporation,
Carpinteria, California, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante y se contratiñeron con hematoxilina. También se
fijaron cortes con acetona/metanol, se permeabilizaron con Triton
X-100 al 0,1% y se tiñeron con anticuerpo de conejo
anti-caspasa 3 activada (Promega, Madison,
Wisconsin, EE.UU.)/anticuerpo anti-conejo generado
en cabra y copulado con Texas Red y avidina-Alexa
Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Los cortes
fueron contrateñidos con DAPI (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.)
y montados con Fluoromount-G (Southern
Biotechnology, Birmingham, Alabama, EE.UU.).
Los ratones que portaban tumores subcutáneos
BxPC-3 recibieron GSAO-B o
GSAA-B por inyección subcutánea en un sitio alejado
del tumor. Se sacrificaron los ratones 6 horas más tarde, se
extirparon los tumores y se detectó GSAO-B con
estreptavidina-peroxidasa. Había una acumulación de
GSAO-B en las regiones del tumor donde predominaban
células apoptóticas o muertas (Figura 11a). GSAO-B
teñía las células que mostraban signos visibles de apoptosis,
incluyendo un núcleo condensado y un citoplasma encogido, pero no
las células tumorales sanas. No hubo tinción alguna del tejido
tumoral que no había sido incubado con
estreptavidina-peroxidasa ni de los tumores de
ratones que habían recibido GSAA-B (no mostrado). La
marcación de las células apoptóticas fue confirmada tiñendo cortes
para caspasa 3 activada y para GSAO-B. La caspasa 3
activada y GSAO-B se localizaban juntos, pero no se
detectó GSAA-B en los cortes (Figura 11b). También
se detectó GSAO-B en regiones apoptóticas y
necróticas de tumores de carcinoma pancreático humano
AsPC-1 desarrollados subcutáneamente en ratones SCID
(no mostrado).
\newpage
Ejemplo 4 de
Referencia
Se administraron 0,8 mg/kg de
GSAO-Cy^{TM}5.5, GSAA-Cy^{TM}5.5
o el colorante Cy^{TM}5.5 solo en 0,1 ml de PBS que contenía
glicocola 20 mM a ratones C57BL/6 (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine,
EE.UU.) que portaban tumores pulmonares de Lewis subcutáneos,
ratones SCID (Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts,
EE.UU.) que portaban tumores subcutáneos BxPC-3 o
ratones TRAMP (Greenberg et al., 1995), mediante inyección
subcutánea en la ijada trasera derecha. Los tumores subcutáneos se
establecieron en la superficie dorsal proximal.
El sistema formador de imágenes usaba un
microscopio de fluorescencia Leica Microsystems (Allendale, New
Jersey, EE.UU.) con una fuente de lámpara halógena de 100 W y un
sistema filtrante para Cy^{TM}5.5 (Chroma Technology,
Brattleboro, Vermont, EE.UU.). Se confinaron ratones anestesiados en
una caja a prueba de luz y se detectó la fluorescencia mediante un
dispositivo monocromo de carga acoplada de 12 bits (Photometrics,
Tucson, Arizona, EE.UU.). El tiempo de exposición fue 8 segundos,
con imágenes digitalmente adquiridas como archivos Tiff de 16 bits
en IPLab (Scananalytics, Fairfax, Virginia, EE.UU.). También se
adquirieron imágenes de los tumores con luz blanca.
Cy^{TM}5.5 es un colorante fluorescente del
infrarrojo cercano que ha sido utilizado para formar imágenes de
tumores in vivo (Weissleder et al., 1999). Se
administraron 0,8 mg/kg de GSAO-Cy^{TM}5.5,
mediante inyección subcutánea, a ratones C57BL/6 que portaban
tumores pulmonares murinos de Lewis de \sim 0,3 g y se adquirieron
imágenes de fluorescencia empezando en la hora 1 y acabando a las
48 horas después de la inyección. En la Figura 11c (A) se muestra
la imagen de un tumor pulmonar de Lewis con luz blanca. En la Figura
11c (B) se muestra la misma vista a través del filtro de infrarrojo
cercano una hora después de la inyección. Las imágenes muestran que
el GSAO-Cy^{TM}5.5 había sido absorbido por la
vasculatura y marcaba la piel así como el tumor. En las Figuras 11c
(C) y 11c (D) se muestran, respectivamente, imágenes de
fluorescencia de la piel dorsal y el tumor 24 horas después de la
inyección. El GSAO-Cy^{TM}5.5 había sido aclarado
de la mayoría de la vasculatura y sólo quedaba marcado el tumor. Un
examen de la orina indicaba la excreción del
GSAO-Cy^{TM}5.5 en menos de una hora después de
la inyección, con una intensidad máxima a las 4-8
horas (no mostrado). Un examen ulterior de los tumores a las 30, 36
y 48 horas demostró una relación máxima de señal tumoral a señal de
fondo a las 24 horas, quedando poca señal a las 48 horas. Ni
GSAA-Cy^{TM}5.5 ni Cy^{TM}5.5 marcaron los
tumores pulmonares de Lewis (no mostrado). Utilizando
GSAO-Cy^{TM}5.5, también se obtuvie-
ron imágenes de tumores de fibrosarcoma T241 murino desarrollados en el dorso de ratones C57BL/6 (no mostrado).
ron imágenes de tumores de fibrosarcoma T241 murino desarrollados en el dorso de ratones C57BL/6 (no mostrado).
También se marcaron tumores humanos
desarrollados en ratones inmunodeficientes, mediante
GSAO-Cy^{TM}5.5. Se administraron 0,8 mg/kg de
GSAO-Cy^{TM}5.5, mediante inyección subcutánea, a
ratones SCID que portaban tumores de carcinoma pancreático
BxPC-3 humano de \sim 0,3 g y se adquirieron
imágenes de fluorescencia 1 y 24 horas después de la inyección. Se
observó de nuevo una excelente relación de señal a fondo para el
tumor a las 24 horas usando GSAO-Cy^{TM}5.5
[Figura 11d (C)]. Ni GSAA-Cy^{TM}5.5 [Figura 11d
(B)] ni Cy^{TM}5.5 [Figura 11d (D)] marcaron los tumores
BxPC-3. Se extirparon el hígado, el corazón, los
pulmones, la vejiga y los riñones y se examinaron en cuanto a
GSAO-Cy^{TM}5.5. Sólo la vejiga y los riñones
presentaban evidencia de una señal en el infrarrojo cercano (no
mostrado). Además, usando GSAO-Cy^{TM}5.5, también
se obtuvieron imágenes de tumores embrionarios
CRL-1973 humanos desarrollados subcutáneamente en el
dorso de ratones SCID, y de células prostáticas LnCaP humanas
desarrolladas en la próstata de ratones SCID (no mostrado). Estos
resultados indican que GSAO-Cy^{TM}5.5 puede
formar imágenes de tumores tanto murinos como humanos en diferentes
cepas de ratones.
También se usó GSAO-Cy^{TM}5.5
para obtener imágenes de tumores prostáticos espontáneos en ratones
TRAMP (Greenberg et al., 1995). Antes de la formación de
imágenes, se examinaron los animales con ultrasonido para verificar
la presencia de tumores. Se administraron 0,8 mg/kg de
GSAO-Cy^{TM}5.5, mediante inyección subcutánea en
la ijada superior, a ratones TRAMP que portaban tumores de próstata.
Cuando el umbral de detección de profundidad del sistema formador
de imágenes actualmente usado fue \leq 1 cm (Weissleder et
al., 1999), se abrió el abdomen para revelar el tumor. El campo
lumínico se llenó con un tumor grande y una vena central [Figura 11e
(A)]. El tumor resultó marcado con
GSAO-Cy^{TM}5.5, mientras que la vena central no
resultó marcada [Figura 11e (B)].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 de
Referencia
Ejemplo
5(a)
El cDNA del TF humano procedía de Karen Fisher
(Fisher et al., 1987). Los cebadores utilizados para
multiplicar y mutar el dominio extracelular de TF (tTF, restos
1-219) eran
5'-ATCAGGATCCGGCACTACAAATACTGTG-3'
(cebador directo) y
5'-ATCAGGATCCTTAACATCTGAATTCCCCTTTCTCCTG-3'
(cebador inverso). Ambos cebadores contienen un sitio BamHI fuera
de la secuencia de codificación para facilitar la clonación. Un
codón TGT para cisteína está situado en la posición codónica 219 en
el cebador inverso, que sustituye al codón GAA para glutamina. Se
multiplicó el cDNA de tTF Q219C por PCR usando la DNA polimerasa
Pfx y se clonó en el sitio BamHI del vector pTrcHisA (Invitrogen,
San Diego, California, EE.UU.). Mediante secuenciación automática se
confirmó la integridad del cDNA de tTF y la mutación Q219C. Se usó
la construcción vector para transformar E. coli BL21 Star
(Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.).
Se hizo que se expresara tTF recombinante del
modo descrito por Jiang et al. (1999), se purificó mediante
cromatografía de afinidad con ProBond (Invitrogen, San Diego,
California, EE.UU.) y se volvió a plegar del modo descrito por
Stone et al. (1995). La etiqueta de His fue escindida de la
proteína purificada y vuelta a plegar, mediante incubación de 1
unidad de EKMax (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.) por 0,2
mg de tTF durante 16 horas a temperatura ambiental. La etiqueta de
His escindida fue separada del tTF mediante cromatografía de
intercambio aniónico. La mezcla de reacción fue dializada frente a
tampón de Tris-HCl 20 mM, pH de 8,0, y fue aplicada
a una columna de Mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) de 1 ml de capacidad, equilibrada con el mismo
tampón. La proteína unida fue resuelta con un gradiente lineal de 0
a 0,5 M de NaCl. El tTF resultó eluido con
NaCl \sim 0,4 M.
NaCl \sim 0,4 M.
Se midió el número de tioles en tTF utilizando
DTNB. Se incubó el tTF (\sim 10 \muM) con DTNB (\sim 1 mM) en
tampón de HEPES 0,1 M, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM, pH de 7,0, durante 10
minutos a temperatura ambiental y se midió el TNB a partir de la
absorbancia a 412 nm usando un lector Thermomax Plus de microplacas,
de Molecular Devices (Palo Alto, California, EE.UU.). El
coeficiente de extinción del dianión de TNB a 412 nm y un pH de 7,0
es 14.150 M^{-1}cm^{-1} (Riddles et al., 1983). Se
incubó el tTF con un exceso molar de 20 órdenes de magnitud de
3(N-maleimidilpropionil)biocitina
(MPB) (Molecular Probes Incorporated, Eugene, Oregon, EE.UU.)
durante 16 horas a temperatura ambiental para marcar la Cys
construida. La MPB sin reaccionar fue separada por diálisis.
Se sometieron tTF purificada y tTF marcada con
MPB (tTF-B) a electroforesis en un gel de
poliacrilamida-SDS en gradiente de
8-16% (Gradipore, Sydney, Australia) y se tiñeron
con azul brillante de Coomassie (Sigma, St. Louis, Missouri,
EE.UU.). En una ocasión, las proteínas fueron transferidas a
poli(fluoruro de vinildietileno) (Millipore, Bedford,
Massachusetts, EE.UU.) y hechas reaccionar con una dilución 1:2000
de avidina-peroxidasa (Molecular Probes, Eugene,
Oregon, EE.UU.) para detectar el marcador MPB. La transferencia fue
desarrollada utilizando quimioluminiscencia potenciada ECL (NEN,
Boston, Massachusetts, EE.UU.).
En la Figura 12A se muestra el tTF Q219C. La
proteína contenía 0,77 moles de tiol por mol de proteína, que se
reducía a 0,13 moles de tiol por mol de proteína tras la reacción
con MPB. En la Figura 12B se muestra la incorporación de MPB a tTF
Q219C.
Ejemplo
5(b)
Se produjo proteína disulfuro isomerasa (PDI)
recombinante humana del modo descrito por Jiang et al.
(1999). Se hizo que placas Nunc PolySorp de 96 pocillos adsorbieran
PDI (100 \mul de una concentración de 5 \mug/ml en tampón de
NaHCO_{3} 0,1 M, azida al 0,02%, pH de 8,3) durante la noche a 4ºC
en un ambiente húmedo. Se lavaron los pocillos una vez con
disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate buffered saline) que contenía Tween
20 al 0,05% (PBS/Tween), se bloquearon los sitios de unión
inespecífica por adición de 200 \mul de BSA al 3% en PBS e
incubación durante 90 minutos a 37ºC, y luego se lavó dos veces con
PBS/Tween. Todas las incubaciones siguientes fueron durante 30
minutos a temperatura ambiental con sacudimiento orbital, y los
pocillos se lavaron tres veces con PBS/Tween después de cada
incubación. Se añadió ditiotreitol (100 \mul de una concentración
10 mM) a los pocillos para reducir los disulfuros de sitios activos
de la PDI. Se añadió GSAO-B (100 \mul de una
concentración 100 \muM) a los pocillos para marcar los ditioles de
sitios activos de la PDI. Se añadieron tTF-B (0,1
\muM) y concentraciones crecientes de avidina (Sigma, St. Louis,
Missouri, EE.UU.) (volumen final de 100 \mul) a los pocillos para
formar complejos de
PDI-GSAO-B-avidina-tTF-B.
Se añadió un anticuerpo monoclonal murino anti-TF
humano (American Diagnostica, Greenwich, Connecticut, EE.UU.) (100
\mul de una concentración de 2 \mug/ml) a los pocillos para
detectar el tTF-B unido y se midió, con IgG
anti-murino conjugada con peroxidasa y generada en
conejo (100 \mul de una dilución 1:500), el anticuerpo murino
unido. Se midió la actividad peroxidasa con 100 \mul de
H_{2}O_{2} al 0,003%, 1 mg/ml de
2,2'-azino-bis(ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
en tampón de citrato 50 mM, pH de 4,5, durante 20 minutos a
temperatura ambiental y con sacudimiento orbital. Se leyeron las
absorbancias a 405 nm usando un lector Thermomax Kinetic de
microplacas, de Molecular Devices (Molecular Devices Corporation,
California, EE.UU.). Los resultados fueron corregidos con los
pocillos testigo, no revestidos con PDI.
GSAO-B reacciona con los
ditioles de sitios activos de la PDI purificada y con la PDI en la
superficie celular (Donoghue et al., 2000). Esta interacción
ha sido utilizada en una estructura de placas de microtitulación
para examinar la formación de complejos de
GSAO-B-avidina-tTF-B.
Se inmovilizó PDI en pocillos para microtitulación, se marcó con
GSAO-B y se incubó con tTF-B y
relaciones molares crecientes de avidina. El tTF unido fue detectado
utilizando un anticuerpo anti-TF. La relación molar
óptima de avidina:tTF-B para la formación de
complejos de
GSAO-B-avidina-tTF-B
era \sim 0,5:1 (Figura 13).
Ejemplo
5(c)
Se inyectaron subcutáneamente 2,5 x 10^{6}
células AsPC-1 en 0,2 ml de PBS, en la línea media
dorsal proximal, a hembras de ratón desnudo Balb/c de
6-8 semanas de edad (Biological Resources Centre,
Universidad de New South Wales, Sydney, Australia). Se calculó el
volumen del tumor utilizando la relación a\cdotb^{2}\cdot0,52,
en que a es el diámetro más largo y b es el diámetro
más corto. Se fijaron los tumores y órganos en Buffered
Formalde-Fresh (Fisher Scientific, Fair Lawn, New
Jersey, EE.UU.) y se embebieron en parafina, y se cortaron
secciones de 5 \mum de espesor y se colocaron en portaobjetos de
vidrio. Los cortes fueron teñidos con hematoxilina y eosina.
Se administraron 7,5 mg/kg de
GSAO-B en 0,15 ml de PBS que contenía glicocola 20
mM, mediante inyección subcutánea en la ijada, a ratones SCID que
portaban tumores As-PC-1 de \sim
0,6 g. Se dejó que el GSAO-B se aclarara de la
circulación general durante 18 horas y luego se administró a los
ratones 1 mg/kg de avidina-[tTF-B] (relación molar
de 0,5:1) en 0,2 ml de disolución salina mediante inyección
intravenosa en la vena de la cola. En la Figura 14 se muestra el
principio de este régimen de tratamiento.
Aproximadamente el 75% del tumor resultaba
visiblemente morado 2-4 horas después de la
administración de avidina-tTF-B.
Los ratones fueron sacrificados 10 días después de la administración
de avidina-tTF-B, y el tumor fue
extirpado y fue examinado histológicamente. Hubo una acusada
trombosis de la vasculatura tumoral y una necrosis del tumor
tratado (Figura 15). Sólo quedó viable una capa periférica de
células tumorales. El peso del ratón tratado no cambió en el curso
del experimento. A la conclusión del experimento, se examinaron
histológicamente el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones y
el bazo del ratón tratado. No hubo signos de trombosis en ninguno
de los órganos (no mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 de
Referencia
Los compuestos usados como componentes de los
sistemas del presente invento pueden ser administrados solos,
aunque es preferible que sean administrados en forma de una
formulación farmacéutica. Para administración tópica, el
ingrediente activo puede comprender de 0,001% a 10% en peso, y más
típicamente de 1% a 5% en peso de la formulación, aunque puede
comprender tanto como 10% en peso.
De acuerdo con el mejor modo de llevar a cabo el
invento aquí proporcionado, se esbozan a continuación composiciones
farmacéuticas específicas preferidas, usadas como componentes de los
sistemas del presente invento. Lo siguiente ha de ser considerado
como ejemplos meramente ilustrativos de formulaciones.
Ejemplo
6(a)
Se esboza a continuación una composición típica
para suministro en forma de crema tópica:
- GSAO-Cy^{TM}5.5
- 1,0 g
- Polawax GP 200
- 25,0 g
- Lanolina anhidra
- 3,0 g
- Cera de abejas blanca
- 4,5 g
- Hidroxibenzoato de metilo
- 0,1 g
- Agua desionizada y esterilizada hasta
- 100,0 g
Se calientan conjuntamente el Polawax, la cera
de abejas y la lanolina a 60ºC, se añade una disolución de
hidroxibenzoato de metilo y se lleva a cabo una homogeneización
utilizando agitación de alta velocidad. Luego se deja que la
temperatura baje hasta 50ºC. Luego se añade el componente del
presente invento, que es GSAO-Cy^{TM}5.5 en este
ejemplo, y se dispersa a fondo, y se deja que la composición se
enfríe con agitación de baja velocidad.
\newpage
Ejemplo
6(b)
Se esboza a continuación una composición típica
para suministro en forma de loción tópica:
- GSAO-Cy^{TM}5.5
- 1,2 g
- Monolaurato de sorbitán
- 0,8 g
- Polisorbato
- 200,7 g
- Alcohol cetoestearílico
- 1,5 g
- Glicerol
- 7,0 g
- Hidroxibenzoato de metilo
- 0,4 g
- Agua esterilizada hasta aproximadamente
- 100,00 ml
Se disuelven el hidroxibenzoato de metilo y el
glicerol en 70 ml del agua a 75ºC. Se funden conjuntamente el
monolaurato de sorbitán, el polisorbato 20 y el alcohol
cetoestearílico a 75ºC y se añade la mezcla a la disolución acuosa.
Se homogeneiza la emulsión resultante y se deja enfriar con
agitación continua, y se añade el GSAO-Cy^{TM}5.5
en forma de suspensión en el agua restante. La suspensión completa
es agitada hasta que queda homogeneizada.
Ejemplo
6(c)
Se esboza a continuación una composición típica
para suministro en forma de gotas oculares:
- GSAO-Cy^{TM}5.5
- 0,3 g
- Hidroxibenzoato de metilo
- 0,005 g
- Hidroxibenzoato de propilo
- 0,06 g
- Agua purificada hasta aproximadamente
- 100,00 ml
Se disuelven los hidroxibenzoatos de metilo y
propilo en 70 ml de agua purificada, a 75ºC, y se deja que se
enfríe la disolución resultante. Luego se añade
GSAO-Cy^{TM}5.5 y se esteriliza la disolución por
filtración a través de una membrana filtrante (0,22 \mum de
tamaño de poro) y se envasa asépticamente en recipientes
estériles.
Ejemplo
6(d)
Para un recipiente para aerosoles con una
capacidad de 20-30 ml, se dispersa una mezcla de 10
mg de GSAO-Cy^{TM}5.5 con
0,5-0,8% en peso de un agente lubricante, tal como
polisorbato 85 o ácido oleico, en un propulsor tal como freón, y se
pone la dispersión en un recipiente para aerosoles apropiado para
administración por inhalación intranasal u oral.
Ejemplo
6(e)
Se podría preparar una composición farmacéutica
del presente invento para inyección intramuscular que contuviera 1
ml de agua tamponada estéril y 1 mg de
GSAO-Cy^{TM}5.5.
Similarmente, una composición farmacéutica para
infusión intravenosa puede comprender 250 ml de disolución estéril
de Ringer y 5 mg de GSAO-Cy^{TM}5.5.
\newpage
Ejemplo
6(f)
Se puede preparar una composición farmacéutica
de GSAO-Cy^{TM}5.5 en forma de cápsula llenando
una cápsula estándar de gelatina dura, de dos piezas, con 50 mg de
GSAO-Cy^{TM}5.5 en forma pulverulenta, 100 mg de
lactosa, 35 mg de talco y 10 mg de estearato magnésico.
Ejemplo
6(g)
Se puede preparar una composición farmacéutica
de este invento en una forma adecuada para administración por
inyección mezclando 1% en peso de GSAO-Cy^{TM}5.5
en propilenglicol al 10% en volumen y agua. La disolución se
esteriliza por filtración.
Ejemplo
6(h)
Una composición típica para suministro en forma
de ungüento incluye 1,0 g de GSAO-Cy^{TM}5.5
dispersado en parafina blanda blanca hasta 100,0 g para producir un
producto homogéneo sin grumos.
\vskip1.000000\baselineskip
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1995.
Claims (25)
1. Uso de un compuesto de arsenóxido que tiene
la fórmula estructural siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la fabricación de un medicamento
para dirigir selectivamente in vivo, a células apoptóticas o
células muertas, un agente activo que es un agente diagnóstico
seleccionado entre radionucleidos seleccionados del grupo que
consiste en: ^{3}H, ^{11}C, ^{14}C, ^{15}O, ^{13}N,
^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{18}F, ^{125}I, ^{127}I,
^{111}In, ^{105}Rh, ^{153}Sm, ^{67}Cu, ^{67}Ga,
^{166}Ho, ^{177}Lu, ^{186}Re, ^{188}Re y ^{99m}Tc; iones
paramagnéticos seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III),
gadolinio (III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio
(III), manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III),
itrio (III), samario (III) y disprosio (III); y agentes formadores
de imágenes por rayos X seleccionados del grupo que consiste en:
oro (III), plomo (II), lantano (III) y bismuto
(III);
en que el compuesto de arsenóxido está enlazado
con un primer miembro ligante; y
en que el agente activo está unido a dicho
primer miembro ligante.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que el medicamento se dirige selectivamente a células
apoptóticas.
3. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que el agente diagnóstico es un agente formador de imágenes.
4. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que el ion paramagnético es gadolinio (III).
5. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
que el primer miembro ligante es un ligando seleccionado entre
DOTA, DTPA, CHX-A'', 1B4M y C-DOTA.
6. El uso de acuerdo con la Reivindicación 5, en
que el ligando es seleccionado entre DTPA y DOTA.
7. El uso de acuerdo con la Reivindicación 5, en
que el ligando es seleccionado entre CHX-A'', 1B4M y
C-DOTA.
8. Un sistema para uso en la dirección selectiva
in vivo, a células apoptóticas o células muertas, de un
agente activo que es un agente diagnóstico seleccionado entre
radionucleidos seleccionados del grupo que consiste en: ^{3}H,
^{11}C, ^{14}C, ^{15}O, ^{13}N, ^{32}P, ^{33}P,
^{35}S, ^{18}F, ^{125}I, ^{127}I, ^{111}In, ^{105}Rh,
^{153}Sm, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{166}Ho, ^{177}Lu,
^{186}Re, ^{188}Re y ^{99m}Tc; iones paramagnéticos
seleccionados del grupo que consiste en: cromo (III), gadolinio
(III), hierro (II), hierro (III), holmio (III), erbio (III),
manganeso (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), itrio
(III), samario (III) y disprosio (III); y agentes formadores de
imágenes por rayos X seleccionados del grupo que consiste en: oro
(III), plomo (II), lantano (III) y bismuto (III);
\newpage
sistema que comprende un compuesto de arsenóxido
que tiene la fórmula estructural siguiente:
en que dicho compuesto de
arsenóxido está enlazado con un primer miembro ligante;
y
en que el agente activo está unido a dicho
primer miembro ligante.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, que se dirige selectivamente a células apoptóticas.
10. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, en que el agente diagnóstico es un agente formador de
imágenes.
11. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, en que el ion paramagnético es gadolinio (III).
12. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, en que el primer miembro ligante es un ligando seleccionado entre
DOTA, DTPA, CHX-A'', 1B4M y C-DOTA.
13. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
12, en que el ligando es seleccionado entre DOPA y DTPA.
14. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
13, en que el ligando está complejado con un ion lantánido.
15. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
14, en que el ion lantánido es gadolinio (III).
16. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, que es:
17. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, que es:
18. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
12, en que el ligando es seleccionado entre CHX-A'',
1B4M y C-DOTA.
19. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
18, en que el ligando está complejado con un ion lantánido.
20. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
19, en que el ion lantánido es gadolinio (III).
21. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación
8, que es:
22. Uso de un sistema de acuerdo con cualquiera
de las Reivindicaciones 8 a 21 en la fabricación de un medicamento
para detectar y/o formar imágenes de células apoptóticas o células
muertas, in vivo.
23. Uso de un sistema de acuerdo con cualquiera
de las Reivindicaciones 8 a 20 en la fabricación de un agente para
MRI.
24. Uso de un sistema de acuerdo con la
Reivindicación 21 en la fabricación de un agente para PET.
25. Un kit terapéutico y/o diagnóstico que
comprende un sistema de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 21, opcionalmente junto con un vehículo y/o
diluyente terapéutica y/o diagnósticamente aceptable.
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