BRPI0618837A2 - compostos para inibição de apoptose - Google Patents

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Maria Jesus Vicent Docon
Mar Orzaez Calatayud
Laura Mondragon Martinez
Angel Messeguer Paypoch
Alejadra Moure Fernandez
Gloria Sanclimens Perez De Rozas
Gema Malet Engra
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Salvat Lab Sa
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Abstract

COMPOSTOS PARA INIBIçãO DE APOPTOSE. A presente invenção relaciona-se a compostos de fórmula (I) bem como a conjugados de medicamentos com base nos compostos de fórmula (I) que agem como inibidores da apoptose, bem como a processos para sua preparaçao, a composições farmacêuticas que os contêm e seu uso em medicina.

Description

COMPOSTOS PARA INIBIÇÃO DE APOPTOSE
A presente invenção relaciona-se a compostos que agem como inibidores da apoptose, bem como a processos para sua preparação, a composições farmacêuticas que os contêm e a seu uso na medicina.
Técnica de fundamento
Apoptose é um processo biológico interessante por causa de sua importância em uma ampla variedade de sistemas biológicos, incluindo turnover celular normal, o sistema imune e desenvolvimento embrionário e sua associação com diferentes doenças. Apoptose inadequada está envolvida em várias patologias humanas, incluindo doenças
neurodegenerativas como Alzheimer e Huntington, isquemia, distúrbios autoimunes e várias formas de câncer (Reed J.C., Trends Mol. Med. 2001, 7: 314-319).
Diversos estímulos apoptóticos, incluindo ativação de receptores de morte de superfície celular, agentes anticâncer, irradiação, ausência de fatores de sobrevivência, e isquemia (revisto em Strasser A. e cols., Annu. Rev. Biochem. 2000, 69: 217-245) induz cascatas de sinalização que ativam uma família de cisteína aspartil proteases chamadas caspases. Essas proteases executam o processo apoptótico.
Alguns sinais apoptóticos ativam a via mediada por mitocôndria ou intrínseca que utiliza caspase-9 como seu iniciador. A formação do complexo macromolecular denominado apoptossomo é um evento chave nessa via.
O apoptossomo é um complexo de holoenzima multiproteína formado por Apaf-I ativado por citocromo c (fator de ativação de protease apoptótica), dATP e procaspase-9 (Li Ρ. e cols., Cell 1997, 91: 479-489; Acehan D e cols., Mol. Cell 2002, 9: 423-432; Rodriguez J. e cols., Genes Dev. 1999, 13: 3179-3184; Srinivasula S.M. e cols., Mol. Cell 1998, 1: 949-957). Nesse complexo macromolecular, caspase-9 associada a apoptossomo é ativada e então, por sua vez, ativa caspases efetoras. Para identificar moléculas que podem melhorar apoptose associada à doença, esforços para a descoberta de medicamentos se focaram inicialmente na atividade de caspase, e portanto, buscam ativadores ou inibidores enzimáticos específicos (Scott C. W. e cols., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304: 433-440; Garcia-Calvo M, J. Biol. Chem. 1998, 273: 32608- 32613), em vez de moduladores na cascata/via de ativação acima.
Todavia, interações proteína-proteína acima da ativação de caspase também podem ser pontos relevantes de intervenção para o desenvolvimento de moduladores de vias de apoptose. Em particular, dados recentes propõem a formação do apoptossomo como um alvo interessante para o desenvolvimento de moduladores apoptóticos.
Portanto há um interesse em encontrar moléculas que inibam a ativação da apoptose mediada por apoptossomo. Descrição da Invenção
Um aspecto da presente invenção relaciona-se ao fornecimento de novos compostos de fórmula geral I,
<formula>formula see original document page 3</formula> seus estereoisômeros e misturas desses, seus polimorfos e misturas desses e os solvatos e sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis desses, em que:
Rl representa (C1-C5) alquil, (C2-C5) alquenil, - (CH2) 1- 3-NHC0- (C1-C3) alquil, (CH2) 1-3-CONRaRb, - (CH2) 0-3-(3-6) Cy, - (CH2) 0-3-(5-6)Hetcy, (CH2) 1-3-fenil, (CH2) 1-3 (1-naftil) , - (CH2)10-(2-naftil) ,- (CH2) 1-3-(5-10) Hetar, (CH2)2- CH (fenil) 2, (CH2) 2-CH(fenil) [ (5-6) Hetar] ou (CH2) 2-CH [ (5- 6)Hetar]2 ;
R2 representa - (CH2) 0-3-(3-6) Cy, - (CH2) 0-3-(5-6) Hetcy, - (CH2) 1-3-fenil, (CH2) 1-3 (1-naftil) , - (CH2) ^3-(2-naftil) , - (CH2) 1-3-(5-10)Hetar, (CH2) 2-CH (fenil) 2, (CH2)2- CH(fenil) [(5-6)Hetar] ou (CH2) 2-CH[(5-6)Hetar]2;
R3 representa - (CH2) 1-3-fenil, (CH2) i_3 (1-naftil) , (CH2) 1-3-(2-naftil) , ou (CH2) 1-3-(5-6) Hetar;
(C1-C5) alquil e - (C2-C5) alquenil podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de - O-(Cx-C2) alquil, -S-(C1-C2) alquil, -NH2, -NH-(C1-C2) alquil e N[(C1-C2) alquil] 2 ;
(C1-C3) alquil pode ser opcionalmente substituído com um ou mais átomos de halogênio;
Ra e Rb representam independentemente -H ou (C1- C3) alquil.
(3-6)Cy representa um radical de um anel carbocíclico parcialmente insaturado ou saturado de 3 a 6 membros;
(5-6) Hetcy representa um radical de C- ou N- de um anel carbocíclico parcialmente insaturado ou saturado de 5 ou 6 membros contendo de um ou dois heteroátomos independentemente selecionados de 0, Se N;
Cy e Hetcy podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de halogênio, -CF3 e - OH;
(5-6)Hetar e (5-10)Hetar representam um radical de C- ou N- de um anel aromático de 5 ou 6 membros e de 5 a 10 membros respectivamente; contendo de um a quatro heteroátomos independentemente selecionados de O, SeN;
fenil, 1-naftil, 2-naftil, (5-6)Hetar e (5-10)Hetar podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de halogênio, -CF3, -0H, 0(Ci- C3) alquil, -CO-(Ci-C3) alquil, -(Ci-C5Jalquil-NRaRb, -NRaRb e -SO2NH2;
desde que R2 não represente 2-(4-fluorfenil)etil.
Um outro aspecto da presente invenção relaciona-se a um composto que é um conjugado de medicamento que compreende um radical de fórmula II
seus estereoisômeros e misturas desses e os solvatos e sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis desses, conjugados a um polímero de ácido poliglutâmico, em que RI, R2 e R3 têm os significados como definido para o composto de fórmula I sem a condição de R2; cada R4 independentemente representa uma cadeia lateral de qualquer um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, e η é 0,1, 2 ou 3 . Portanto, compostos de fórmula II compreendem diferentes porções: um radical de fórmula I, que forma uma ligação de amida a uma cadeia de peptídeo de η L- aminoácidos e um derivado de amida L-lisina, em que o N de sua cadeia lateral é ligada ao polímero de ácido poliglutâmico.
Nas definições prévias, os termos (C1-C3) alquil e (C1- C5)alquil representam cadeias de hidrocarboneto saturadas lineares ou ramificadas contendo de um a três e de um a cinco átomos de carbono respectivamente. Exemplos de (Cl- C3)alquil incluem, mas não são limitados a, metil, etil, propil, isopropil. Exemplos de (C1-C5)alquil incluem adicionalmente e sem limitação butil, isobutil, sec butil, terc-butil, 1-pentil, 1-metilbutil, 2-metilbutil, 3- metilbutil, 1,1-dimetilpropil, 1,2-dimetilpropil e 2,2- dimetilpropil.
O termo (C2-C5)alquenil representa uma cadeia de hidrocarboneto insaturada linear ou ramificada, contendo de dois a cinco átomos de carbono e uma ou mais ligações duplas, por exemplo etenil, 1 propenil, 2 propenil, 1- butenil, 2-butenil, 3-butenil e 1,3-butadienil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-pentenil, 4-pentenil, 1-metil-2-butenil, 2- metil-3-butenil, 3-metil-l-butenil, 1,1-dimetil-2-propenil e 1,2-dimetil-1-propenil.
Os grupos (C1-C3) alquil, (C1-C5) alquil e (C2- C5)alquenil podem ser opcionalmente substituídos de acordo com a descrição sempre que adequado a partir de um ponto de vista químico.
O termo (3-6)Cy representa um radical de um anel carbocíclico parcialmente insaturado ou saturado de 3 a 6 membros. Como previamente mencionado, ele pode ser opcionalmente substituído com um ou mais substituintes, que podem ser colocados em qualquer posição adequada do anel. Exemplos de (3-6)Cy incluem, sem limitação, radicais de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, 1- ciclobuteno, 2-ciclobuteno, 1-ciclopenteno, 2-ciclopenteno, 1-ciclohexeno, 2-ciclohexeno e 3-ciclohexeno.
0 termo (5-6)Hetcy representa um radical C- ou N- de um anel carbocíclico parcialmente insaturado ou saturado de 5 a 6 membros contendo um ou dois heteroátomos independentemente selecionados de O, Se N, que podem ser substituídos de acordo com a descrição em qualquer posição de anel disponível. Exemplos de (5-6)Hetcy incluem, sem limitação, radicais de dihidrofurano, pirrolina, pirazolina, imidazolidina, isotiazolidina, isoxazolidina, oxazolidina, pirazolidina, pirrolidina, tiazolidina, dioxano, morfolino, piperazina, piperidina, pirano, tetrahidropirano, oxazina, oxazolina, pirrolina, tiazolina, pirazolina, imidazolina, isoxazolina, e isotiazolina.
Os termos (5-6)Hetar e (5-10)Hetar representam um radical de C- ou N- de um anel aromático de 5 ou 6 membros e de 5 a 10 membros respectivamente; contendo de um a quatro heteroátomos independentemente selecionados de O, S e N, que podem ser substituídos de acordo com a descrição em qualquer posição de anel disponível. Exemplos de (5- 6)Hetar incluem, sem limitação, radicais de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, isoxazol, isotiazol, oxazol, 1,2,4- oxadiazol, 1,2,4 -tiadiazol, 1,3,4-oxadiazol, 1,3,4- tiadiazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, piridina, pirimidina, piridazina e pirazina. Exemplos de (5-10)Hetar também incluem, sem limitação, radicais de benzimidazol, benzofurano, benzotiazol, benzotiofeno, imidazopirazina, imidazopiridazina, imidazopiridina, imidazopirimidina, indazol, indol, isoindol, isoquinolina, pirazolopirazina, pirazolopiridina, pirazolopirimidina, purina, quinazolina, quinolina e quinoxalina.
A expressão "opcionalmente substituido com um ou mais" significa que um grupo pode ser não substituido ou substituído com um ou mais, preferivelmente com 1, 2, 3 ou 4 substituintes, desde que esse grupo tenha 1, 2, 3 ou 4 posições suscetíveis de serem substituídas.
Por toda a descrição e reivindicações a palavra "compreende" e variações da palavra, como "que compreende", não deve excluir aditivos, componentes, elementos ou etapas.
Como aqui usado o termo "tratamento" inclui tratamento, prevenção e controle de tal condição. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" como aqui usado refere-se àqueles compostos, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico, adequadas para uso em contato com os tecidos de humanos e animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional com uma proporção razoável de risco/benefício.
Em uma modalidade particular da invenção Rl representa (C1-C5) alquil, (CH2) ^3-CONRaRb, - (CH2) 0-3-(3-6) Cy; (CH2)0-3- (5-6) Hetcy; - (CH2) 1-3-(5-10) Hetar, (CH2) 1-3-fenil, (CH2)1-S (1-naftil) ou - (CH2) ^3-(2-naftil), todos opcionalmente substituídos.
Em uma modalidade particular da invenção Rl representa (CH2) 0-3-(5-6)Hetcy, - (CH2) 1-3-(5-10) Hetar, (CH2) 1-3-fenil, (CH2) 1-3 (l-naftil) ou - (CH2) 1-3-(2-naftil), todos opcionalmente substituídos.
Em uma outra modalidade Rl representa - (CH2) 2-fenil opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de halogênio. Em uma outra modalidade Rl representa 2,4-diclorofenil.
Em uma outra modalidade R2 representa (CH2) χ-3-aril opcionalmente substituído, ou -(CH2)2CH(Ph)2 opcionalmente substituído, desde que R2 não represente 2- (4- fluorfenil) etil-. Em uma outra modalidade R2 representa 3,3-difenilpropil, desde que R2 não represente 2-(4- fluorfenil)etil-.
Em uma outra modalidade R3 representa - (CH2) 3.-3-(5- 6)Hetar ou - (CH2) 2-fenil opcionalmente substituído. Em uma outra modalidade R3 representa - (CH2) 2-fenil opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de halogênio. Em uma outra modalidade R3 representa 2,4- diclorofenil.
Em uma outra modalidade R2 representa 3,3- difenilpropil e Rl e R3 representam 2,4-diclorofenil.
Uma outra modalidade da presente invenção relaciona-se a um composto que é um conjugado de medicamento que compreende um composto de fórmula II conjugado a um polímero de ácido poliglutâmico como previamente definido, em que o referido polímero tem um peso molecular de 20 a 60 kDa.
Uma outra modalidade da invenção relaciona-se a um composto de fórmula III que é um conjugado polímero-medicamento <formula>formula see original document page 10</formula>
em que R1, R2, R3 e R4 têm os significados descritos na fórmula geral II e a proporção de y para χ é 25-30% a 75-70% em peso.
Em uma outra modalidade em um composto de fórmula III n representa 0. Em uma outra modalidade n representa 2 e R4 representa uma cadeia lateral de glicina. Em uma outra modalidade n representa 3 e R4 representa uma cadeia lateral de glicina, uma cadeia lateral de arginina e uma cadeia lateral de fenilalanina. Em uma outra modalidade η representa 3 e R4 representa uma cadeia lateral de valina, uma cadeia lateral de arginina e uma cadeia lateral de fenilalanina.
No conjugado de medicamento polimérico, o ácido poliglutâmico pode ser ácido poli(L-glutâmico), ácido poli(D-glutâmico) ou ácido poli(DL-glutâmico). Em uma modalidade da invenção ácido poliglutâmico é ácido poli(L- glutâmico).
Além disso, todas as possíveis combinações das modalidades acima mencionadas também fazem parte dessa invenção.
Compostos de fórmula I compreendem pelo menos um centro quiral. A presente invenção inclui tanto os compostos racêmicos quanto os compostos enantioméricos de fórmula I, ou seja compostos em que a configuração do carbono quiral ligado a Rl é (S) e compostos em que a configuração do carbono quiral ligado a Rl é (R)) como mo s t rado abaixo.
<formula>formula see original document page 11</formula>
Compostos de fórmula II compreendem pelo menos dois centros quirais. A presente invenção também inclui misturas de estereoisômeros e estereoisômeros isolados de fórmula II.
Os compostos da presente invenção podem conter um ou mais átomos de nitrogênio básico e, portanto, eles podem formar sais com ácidos, que também fazem parte dessa invenção. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais de adição com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, hidrobrômico, hidroiódico, nitrico, perclórico, sulfúrico e fosfórico, bem como sais de adição de ácidos orgânicos como ácido acético, metanossulfônico, trifluormetanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, p-toluenossulfônico, benzóico, canforsulfônico, mandélico, oxálico, succínico, fumárico, tartárico, e maleico. Da mesma forma, compostos da presente invenção podem conter um ou mais prótons ácidos e, portanto, eles podem formar sais com bases, que também fazem parte dessa invenção. Exemplos desses sais incluem sais com cátions de metal, como, por exemplo, um íon de metal alcalino, um íon de metal alcalino terroso ou um íon de alumínio; ou ele pode ser coordenado com uma base orgânica ou inorgânica. Uma base orgânica aceitável inclui, entre outras, dietilamina e trietilamina. Uma base inorgânica aceitável inclui hidróxido de alumínio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, e hidróxido de sódio. Pode haver mais de um cátion ou ânion dependendo do número de funções com carga e da valência de cátions e anions.
Sais derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas, e resinas de troca iônica básicas, como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolino, etilpiperidina, glucamina, glicosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolino, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, e outros.
Não há limita sobre o tipo de sal que pode ser usado, desde que esses sejam farmaceuticamente aceitáveis quando eles forem usados para objetivos terapêuticos. Sais podem ser sintetizados a partir do composto parente que contém uma porção básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados por reação das formas de ácido ou base livre desses compostos com uma quantidade estoiquiométrica da base ou ácido adequado em água ou em um solvente orgânico, como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila ou em uma mistura de ambos. Os compostos de fórmula I ou formula III e seus sais diferem em algumas propriedades físicas mas eles são equivalentes para os objetivos da presente invenção.
Alguns dos compostos de fórmula I ou formula III da presente invenção podem existir em formas não solvatadas bem como formas solvatadas como, por exemplo, hidratos. A presente invenção engloba todas as formas acima mencionadas que são farmaceuticamente ativas.
Alguns dos compostos de fórmula geral I podem exibir polimorfismo, englobando a presente invenção todas as formas polimórficas possíveis, e misturas dessas. Vários podem ser preparados por cristalização sob diferentes condições ou por aquecimento ou fusão do composto seguida por resfriamento gradual ou rápido. A presença de polimorfos pode ser determinada por espectroscopia de RMN sólida, espectroscopia de RI, calorimetria de rastreamento diferencial, difração de pó de raios X ou outras técnicas.
Compostos de fórmula I da presente invenção compreendem pelo menos um centro quiral. Adicionalmente, eles podem ter centros quirais adicionais. A presente invenção inclui cada um dos possíveis estereoisômeros e misturas desses, particularmente misturas racêmicas desses. Um enantiômero único pode ser preparado por qualquer um dos processos comumente usados, por exemplo, por separação cromatográfica da mistura racêmica em uma fase quiral estacionária, por resolução da. mistura racêmica por técnicas de cristalização fracional dos sais diastereoméricos desses, por síntese quiral, por resolução enzimática ou por biotransformação. Essa resolução pode ser realizada em qualquer intermediário sintético quiral ou em produtos de fórmula geral I. Alternativamente, qualquer enantiômero de um composto de fórmula geral I pode ser obtido por síntese enantio-específica com o uso de materiais de iniciação oticamente puros ou reagentes de configuração conhecida.
Compostos de fórmula I ou formula III podem existir como vários diaesterêoisômeros, e podem ser separados por técnicas convencionais coo cromatografia ou cristalização fracional. Alguns compostos da presente invenção podem exibir isômeros cis/trans. A presente invenção inclui cada um dos isômeros geométricos e suas misturas. A presente invenção abrange todos os isômeros e misturas desses (por exemplo misturas racêmicas) sejam obtidas por síntese our também por mistura física deles.
A presente invenção relaciona-se a um processo para a preparação dos novos compostos acima mencionados, sues derivados, seus análogos, suas formas tautoméricas, seus estereoisômeros, seus polimorfos ou seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.
Os compostos da presente invenção podem ser sintetizados com uso dos métodos descritos abaixo, bem como por outros processos conhecidos no campo de síntese orgânica. Métodos preferidos incluem, mas não são limitados aos processos gerais mostrados nos esquemas anexados. A menos que determinado de outra forma, os grupos RI, R2, R3, R4, η, χ e y têm o significado descrito nas fórmulas gerais I, II e III. Compostos de fórmula I podem ser obtidos com o uso do seguinte método: Método A
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De acordo com o Método A, após desproteção do grupo fluorenilmetoxicarbonil, o suporte sólido amina IV é acilado com um agente de acilação V, em que X representa um grupo de partida, por exemplo, halogênio e Y representa -OH ou halogênio. Quando Y representa halogênio, por exemplo, cloroacetilcloreto a reação pode ser realizada na presença de uma base terciária como trietilamina. Quando Y representa -0H, por exemplo, ácido bromoacético, a reação pode ser realizada na presença de um agente de ligação adequado, por exemplo, N,N'-diisopropilcarbodiimida. Em ambos os casos, a reação pode ser realizada em um solvente inerte capaz de inchar corretamente a resina, como N, N' - dimetilformamida ou diclorometano e em temperatura ambiente ou com o uso de irradiação por microondas, diminuindo o tempo de reação. Então, uma amina VIa é ligada com o uso de uma amina terciária como uma base. A reação pode ser realizada por aquecimento, por exemplo a 60°C, ou por irradiação de microondas.
Um ácido carboxilico VIII, em que PG representa um grupo de proteção, como alil, reage com amina VII para gerar amida IX usando um agente de ligação, por exemplo, a combinação de N,N'-diisopropilcarbodiimida e 1- hidroxibenzotriazol. A seguir, uma amina VIb é introduzida por reação de Michael com o uso de uma base e um solvente como N,N'-dimetilformamida ou dimetilsulfóxido para obter intermediário X. Depois da repetição da acilação e aminação da mesma maneira como descrito para o intermediário VII, XI é obtido. A desproteção é realizada com o uso de PhSiH3 e Pd(PPh3)4 em diclorometano como um solvente (Tetrahedron Lett 1999, 40:2505-2508; Tetrahedron Lett 1997, 38:7275- 7278) ou com KOH aquoso em dioxano gera XII. A ciclização é promovida por formação de amida com o uso de reagentes de ligação padrão para procedimentos de ligação peptídica de fase sólida como uma combinação de hexafluorfosfato de benzotriazol-l-iloxi-tris-pirrolidinofosfônio e 1- hidroxibenzotriazol na presença de uma base terciária com N,N-diisopropiletilamina. Composto final I pode ser liberado da resina usando uma mistura de ácido trifluoracético, diclorometano e água.
Uma estratégia alternativa para obtenção de um composto de fórmula I envolve a acilação das aminas IV e X com aminoácidos de fórmulas XIIIa e XIIIb respectivamente (Método B). <formula>formula see original document page 17</formula>
Método B
Como estará óbvio para a pessoa habilitada na técnica, é possível combinar algumas etapas do método A com algumas some etapas do método B para obter um composto de fórmula I.
Aminas primárias de iniciação Via, VIb e VIc são comercialmente disponíveis, ou podem ser obtidas por métodos conhecidos (March, Advanced Organic Chemistry, 1991, Ed. John Wiley & Sons) ou com ouso, por exemplo, do esquema abaixo descrito.
Esquema 1
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Uma amina pode ser obtida por reação de Mitsunobu iniciando a partir de um álcool e ftalimida de potássio na presença de, por exemplo, azodicarboxilato de dietila (DEAD) e trifenilfosfino em tetrahidrofurano como um solvente e também clivagem com hidrato de hidrazina (Mitsunobu, J. Am. Chem. Soe. 1972, 94, 679-680).
Glicinas N-substituídas XIIIa e XIIIb podem ser sintetizadas pelos métodos mostrados abaixo por aminação redutora da glicina correspondente com o aldeído adequado (Esquema 2) usando agentes de redução como NaBH4, NaBH3CN ou NaBH(AcO)3, ou por substituição nucleofilica de um éster com a amina adequada E-NH2 (Esquema 3).
Esquema 2
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Esquema 3
<formula>formula see original document page 18</formula>
Compostos de fórmula II podem ser obtidos com o uso de reações análogas àquelas acima descritas.
<formula>formula see original document page 18</formula> Portanto, para obter o ácido carboxílico correspondente de fórmula I, ou seja, um composto de fórmula Ia, a mesma seqüência para a síntese de um composto de fórmula I é usada (usando métodos A e/ou Β), exceto pelo suporte sólido de iniciação (IVa) ter átomos de reativos em vez de um grupo amino.
O peptídeo XVI a ser ligado ao composto Ia é obtido também com o uso de reações padrão para a síntese de peptídeos. Portanto, o suporte sólido amina IV primeiramente reage com uma Lisina protegida (XIVa) e opcionalmente subseqüentemente reage com um outro aminoácido protegido (XIVb). Depois da ligação dos grupos de proteção ser removida. Essa seqüência pode ser repetida em até três vezes.
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Ácido carboxílico Ia reage, então com amina XVI e depois da desproteção o composto IIa é obtido. A ligação da amida entre IIa e ácido poliglutâmico XVIIa (obtido do sal correspondente XVII) gera o conjugado de medicamento III. <formula>formula see original document page 20</formula>
Os compostos da presente invenção são inibidores da apaf-1. Portanto, eles são úteis párea o tratamento ou prevenção de uma condição associada com o excesso de apoptose.
Em adultos, células pós-mitóticas, como neurônios e células do músculo cardíaco são raramente renovadas. Portanto sua perda pode causar distúrbios neurológicos e cardíacos. Essas células passam por morte celular apoptótica em uma variedade de doenças degenerativas agudas e crônicas. De modo similar, choque séptico, isquemia, e intoxicação podem causar apoptose em mass em órgãos múltiplos. Infecções podem causar um elevado turnover apoptótico de tipos celulares específicos, por exemplo, linfócitos em AIDS ou células da mucosa gástrica em infecção por Helicobacter pylori. Os eventos de apoptose são também de importância em procedimentos para reperfusão isquêmica e de preservação em transplante de órgãos. Essas doenças são, portanto, candidata para supressão de morte terapêutica celular. Outras condições ou doenças relacionadas com apoptose incluem, sem limitação, AVC, traumatismos, dano cerebral, dano à medula espinhal, meningite, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Kennedy, esclerose múltipla, Doenças relacionadas a príons, bem como outras doenças cardiovasculares agudas e crônicas, patologias relacionadas com álcool, e tratamento de alopécia.
Portanto, a presente invenção relaciona-se ao uso desses compostos para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção das doenças ou condições acima mencionadas.
Um outro aspecto da presente invenção relaciona-se ao uso de um composto de fórmula I sem a condição de R2 ou um composto que é um conjugado polímero-medicamento como previamente definido para a manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com apoptose.
Um outro aspecto da presente invenção relaciona-se a um método para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com a inibição de apoptose que compreende a administração de um composto de fórmula I sem a condição de R2 ou um composto que é um conjugado polímero-medicamento como previamente definido e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Um outro aspecto da presente invenção relaciona-se a um método para o tratamento ou prevenção de AVC, traumatismos, dano cerebral, dano à medula espinhal, meningite, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Kennedy, esclerose múltipla, Doenças relacionadas a príons, isquemia miocárdica, bem como outras doenças cardiovasculares agudas e crônicas, transplante de órgãos, patologias relacionadas com álcool, e tratamento de alopécia, que compreende a administração de um composto de fórmula I sem a condição de R2 ou um composto que é um conjugado polimero-medicamento como previamente definido e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
A presente invenção também fornece composições
farmacêuticas que compreendem i, composto de fórmula I ou um composto que é um conjugado polimero-medicamento como previamente definido, um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável desse, junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em doses únicas ou múltiplas.
Os exemplos dos excipientes abaixo mencionados são dados por via de ilustração apenas e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.
Os compostos da presente invenção podem ser administrados na forma de qualquer formulação farmacêutica.
A formulação farmacêutica dependerá da natureza do composto ativo e de sua via de administração. Qualquer via de administração pode ser usada, por exemplo como administração oral, bucal, pulmonar, tópica, parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, e intravenosa), transdérmica, ocular (oftálmica), inalação, intranasal, ótica, transmucosa, implante ou retal. No entanto, a administração tópica ou parenteral é preferida.
Composições sólidas para administração oral incluem, entre outras, comprimidos, granulados e cápsulas de gelatina dura, formuladas como formulações de liberação imediata release ou de liberação modificada.
Alternativamente, os compostos da presente invenção podem ser incorporados em preparações líquidas orais como emulsões, soluções, dispersões, suspensões, xaropes, elixires ou na forma de cápsulas de gelatina macia. Eles podem conter diluentes inertes comumente usados, como água purificada, etanol, sorbitol, glicerol, polietileno glicóis (macrogols) e propileno glicol. Composições de auxílio também podem conter coadjuvantes como agente umectantes, de suspensão, adoçantes, flavorizantes, conservantes, tampões, agentes quelantes e antioxidantes.
Preparações injetáveis para administração parenteral compreendem soluções, suspensões ou emulsões estéreis em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter coadjuvantes, como agentes de suspensão, estabilizantes, de tonicidade ou agentes de dispersão.
O composto também pode ser formulado para usa aplicação tópica. Formulações incluem cremes, loções, géis, pós, soluções, preparações em xampu, pasta oral, preparações de colutório oral e emplastros em que o composto é disperso ou dissolvido em excipientes adequados.
Em uma modalidade da invenção a composição farmacêutica está na forma de nanoesferas, micropartículas e nanopartículas.
A dosagem eficaz de ingrediente ativo pode variar dependendo do composto particular administrado, da via de administração, as natureza e severidade da doença a ser tratada, bem como da idade, da condição geral e peso corporal do paciente, entre outros fatores. Um exemplo representativo de uma faixa de dosagem adequada é de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/Kg de peso corporal por dia, que pode ser administrada como uma dose única ou doses divididas. No entanto, a dosagem administrada será determinada pelo médico.
Toxicidade e recuperação celular através do ensaio de MTT
O ensaio de MTT mede a proliferação celular bem como a redução na viabilidade da célula quando eventos metabólicos levam à apoptose ou necrose. Ele também pode ser usado para avaliar a taxa de sobrevida de uma dada linha de células quando ela é incubada na presença de xenobióticos. A redução de sais de tetrazólio é aceita como uma via confiável para analisar a proliferação celular. 0 tetrazólio MTT amarelo (brometo de 3 -(4,5-dimetiltiazolil- 2) -2, 5-difeniltetrazolio) é reduzido por células metabolicamente ativas e resulta na formação intracelular de formazan roxo que pode ser espectrofotometricamente medido após solubilização com DMSO.
O ensaio de MTT foi usado nessa invenção para avaliar a toxicidade de compostos em diferentes concentrações. Para analisar sua deterioração potencial em viabilidade celular, os compostos foram adicionados a linhas de células Saos-2 e U93 7 em diferentes concentrações e incubados em diferentes tempos. Os resultados são expressos por percentual de viabilidade celular.
<table>table see original document page 24</column></row><table> <table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table>
O ensaio de MTT também foi usado para avaliar a recuperação celular pela adição de compostos em linhas de células induzidas por apoptose. Para a linha de células Saos-2, a indução da apoptose foi realizada pela adição de doxiciclina 2 μΜ; no caso de U93 7, HeLa, U2-0S, a apoptose foi induzida por doxorrubicina 0,25 μΜ, 1,5 μΜ, 2 μΜ, respectivamente. Os resultados são expressos como % de viabilidade celular considerando que a adição de doxiciclina e doxorrubicina induz 100% de morte celular e 0% de recuperação celular em Saos-2 e HeLa, U2-OS ou U937, respectivamente.
<table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table> Ensaio de ligação de caspase
A inibição de caspase dependente de tempo induzida pelos compostos descritos nessa invenção foi analisada. As linhas de células cresceram na presença ou ausência de compostos (50 μΜ) em diferentes tempos. A atividade de caspase foi analisada usando extratos de células Saos-2 ou U937 e Ac-DEVD-afc (N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-afc(7-amino-4- trifluorometil cumarin)) como substrato (20 μΜ). A atividade de caspase foi continuamente monitorada pela liberação de afc fluorescente com o uso de um fluorímetro Cytofluor 4000 (excitação 400 nra; emissão 508 nm) por 1 hora. 0 efeito dos compostos sobre a atividade de caspase foi expresso como a percentagem de inibição no sinal de fluorescência de células tratadas vs as células não tratadas (controle).
<table>table see original document page 28</column></row><table> <table>table see original document page 29</column></row><table>
ND: não determinado
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<table>table see original document page 29</column></row><table>
Inibição de apoptose induzida por Apaf-1
A atividade dos compostos em relação a seu alvo específico na operação apoptótica foi avaliada. A oligomerização de Apaf-1 é um evento molecular que leva à ativação da formação de apoptossomo, que termina na indução de apoptose. Esses experimentos foram realizados em ensaios livres de células e em ensaios celulares.
Para os ensaios livres de células, extratos citoplasmáticos Hek-293 foram preparados como descrito antes (Malet e cols., 2005) e a divisão do extrato celular completo foi realizada. Concomitantemente, Apaf-I recombinante foi purificada de acordo com Malet e cols., 2005. A fração de FT (contendo caspase-3 e -9 mas sem Apaf- 1) , foi incubada com Apaf-I recombinante na presença de diferentes concentrações dos compostos (veja figura 1) . A atividade dos compostos foi analisada pela inibição de atividade de caspase (veja acima).
Para ensaios celulares, células Saos-2 e U937 foram tratadas com um ativador de apoptossomo (Nguyen e Wells, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003, 100:7533-7538), que induz especificamente a oligomerização de Apaf-I. Logo depois, os compostos foram adicionados às células (50 μΜ) e incubados por 24 ou 48 horas. A capacidade dos compostos de inibir a apoptose induzida por Apaf-I foi analisada pela inibição da atividade de caspase (veja acima).
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Ligação de Ila.l a domínio CARD de Apaf-I: ensaio de polarização de fluorescência
As medições de polarização de fluorescência foram feitas em um contador Victor2V 1420 Multilabel HTS. Uma solução de 60 nM de IIa.1 rotulado com 5'-6'- carboxifluoresceína (denominado CF-IIA.1; λexc=480 nm,- λem = 535 nm) em tampão A (volume total da reação foi 200 ml) foi titulada com soluções concentradas de proteína. Os dados foram registrados pelo uso de um programa Wallac 1420 Workstation. Os valores de Kd foram calculados com o uso de um modelo de dois estados (veja a Figura 2).
Para caracterizar inicialmente o sítio de ligação dos peptóides ao apoptossomo, nós sintetizamos um análogo fluorescente de IIa.1 (CF-IIa.1). CF-IIa.1 ligado ao domínio Apaf-I CARD, mas não ao citocromo c e outras proteínas de controle (Malet e cols, 2005), com constante de dissociação (Kd) 60 nM como determinado em um ensaio de polarização de fluorescência (Figura 2). Todavia, o valor da constante de ligação contrastou com a concentração de IIa.1 que foi necessária para inibir 50% da atividade de caspase em nossos ensaios (IC50 = 30 mM, Figura 1). Uma explicação aceita para reconciliar esses dados é que o lisado de reticulócitos usado para traduzir in vitro procaspase-9 continha componentes que diminuíram a concentração efetiva de IIa.1.
EXEMPLOS
As abreviações a seguir foram usadas nos exemplos: Boc: tert-butoxicarbonil DCM: diclorometano DIC: N,N'-diisopropilcarbodiimida DIPEA: diisopropiletilamina DMF: Ν,N1-dimetilforraamida eq: equivalente molar EtOAc: acetato de etila Fmoc: fluorenilmetoxicarbonil Glicina: G HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio hexafIuor - fosfato HOBT: 1-hidroxibenzotriazol Lisina: K PGA: ácido poli(L-glutâmico) Fenilalanina: F PyBOP: benzotriazol-l-iloxi-tris-pirrolidinofosfônio hexafluorfosfato R: Arginina rt: tempo de retenção TFA: ácido trifluoracético Valina:V
A presente invenção será também ilustrada pelos exemplos a seguir. Os exemplos são dados por via de ilustração apenas e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.
Resina de poliestireno AM RAM (0,75 mmol/g) foi adquirido de Rapp Polymere GmbH (Germany) . Resina de 2- Clorotritil cloreto (1.4 mmol/g) foi adquirida de Novabiochem. RP-HPLC semi-preparatória foi realizada com um sistema Waters (Milford, MA, U.S.A.) usando uma coluna X- Terra C18 (19 χ 25 cm, 5 mm); eluente: A= 0,1% TFA em água, B = 0,1% TFA em acetonitrila, gradiente: 0 min 20% B 20 min 80% B. Espectros de massa de alta resolução (HRMS-FAB) foram registrados no "Mass Spectrometry Service of the University of Santiago de Compostela" (Espanha).
A nomenclatura usada nesse documento é baseada em AUTONOM (Automatic Nomenclature), um sistema computadorizado do "Beilstein Institute" para a geração de nomenclatura sistemática IUPAC.
Intermediário VIII
VIII: monoalil éster de ácido (Z)-but-2-enediõico
A uma solução de 2 g de anidrido maleico (20 mmol) em clorofórmio, 1,8 ml de alil álcool (26 mmol, 1,3 eq.) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada a 60°C por 50 minutos sob irradiação de microondas. A solução resultante foi tratada com 1N HCl e extraída com clorofórmio. Os extratos orgânicos foram lavados com salmoura, então secos sobre sulfato de magnésio anidro e filtrados. O solvente foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna para obter intermediário VIII como um óleo (pureza 95%, rendimento 85%).
Compostos de fórmula I
I.1: 1-[2-(2,4-Diclorofenil)etil]-4-(3,3-difenilpropil) - 3,7-dioxo[1,4]-diazepano-5-ácido carboxílico carbamoilmetil- [2-(2,4-diclorofenil)-etil]amida
A resina Rink amida (500 mg, 0,4 mmol) foi tratada com 3 mL de 20% piperidina em DMF e a mistura foi agitada em um reator de microondas por 2 minutos a 60°C. A resina foi filtrada e lavada com DMF (3x3 mL), álcool isopropílico (3x3 mL) e DCM (3x3 mL). A resina foi tratada com uma solução de ácido bromoacético (V, 275 mg, 5 eq.) e DIC (306 pL, 5 eq.) em DMF (3 mL). A mistura de reação foi agitada por 2 minutos a 60°C em um reator de microondas. A resina foi drenada e lavada com DCM (3 χ 3 mL) , álcool isopropílico (3 χ 3 mL) e DMF (3 χ 3 mL) . Uma solução de 2,4-diclorofenetilamina (Via, 300 pL, 5 eq.) e trietilamina (275 pL, 5 eq. ) em 3 mL de DMF foi adicionada à resina e a suspensão foi agitada por 2 minutos a 90 0C sob ativação de microondas. O sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3x3 mL), álcool isopropílico (3 χ 3 mL) e DCM (3x3 mL). Então, a resina foi tratada com uma solução de monoalil éster de ácido (Z)-but-2-enedióico (VIII, 310 mg, 5 eq.), HOBT (267 mg, 5 eq.) e DIC (306 mL, 5 eq.) em DCM: DMF (2:1, 3 mL) . A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 30 minutos, filtrada e a reação foi repetida sob as mesmas condições. A resina foi drenada e lavada com DCM (3x3 mL), álcool isopropílico (3 χ 3 mL) e DMF (3 χ 3 mL) . Então, uma solução de 3,3- difenilpropilamina (VIb, 418 mg, 5 eq.) e trietilamina (275 mL, 5 eq.) em 3 mL de DMF foi adicionada à resina e a suspensão foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente. A reação foi repetida de um dia para o outro na mesma temperatura. O sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3x3 mL), álcool isopropílico (3 χ 3 mL) e DCM (3x3 mL) . Então, a resina foi tratada com uma solução de ácido bromoacético (V, 275 mg, 5 eq.) e DIC (306 pL, 5 eq.) em DMF (3 mL) . A mistura de reação foi agitada por 2 minutos a 60 °C em um reator de microondas. A resina foi drenada e lavada com DCM (3 χ 3 mL) , álcool isopropílico (3x3 mL) e DMF (3 χ 3 mL) . Uma solução de 2,4-diclorofenetilamina (VIc, 200 mL, 5 eq.) e trietilamina (210 mL, 5 eq.) em 3 mL de DMF foi adicionada à resina e a suspensão foi agitada por 2 minutos a 90 °C sob ativação de microondas. 0 sobrenadante foi removido, e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3x3 mL) , álcool isopropílico (3 χ 3 mL) e DCM (3x3 mL) . Então, a resina foi tratada com tetracis(trifenilfosfino)paládio (0) (46 mg, 0,1 eq.) e fenilsilano (490 mL, 10 eq.) em DCM anidro por 15 minutos em temperatura ambiente sob uma atmosfera de argônio. Esse procedimento foi repetido três vezes. 0 sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3x3 mL) , álcool isopropílico (3x3 mL) e DCM (3x3 mL) . A ciclização foi promovida por tratamento com PyBOP (308 mg, 1,5 eq.), HOBT (80 mg, 1,5 eq.) e DIPEA (203 mL, 3 eq.) em DMF (3 mL) . A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 16 horas e filtrada. A resina foi drenada e lavada com DCM (3x3 mL), álcool isopropílico (3x3 mL) e DMF (3 χ 3 mL) . Finalmente, tratamento da resina com uma mistura de 60:40:2 TFA/DCM/água liberou uma mistura de reação bruta contendo o composto de título 1.1, que foi filtrado. Os solventes do filtrado foram removidos por evaporação sob pressão reduzida seguida por Iiofilização. 0 resíduo obtido foi purificado por RP-HPLC semi-preparatória usando gradiente de acetonitrila aquosa (42% acetonitrila 80% acetonitrila, 35 min) para gerar 91 mg do produto desejado (rendimento 30%, > 98% pureza).
HRMS (M + H) + : Cale. para C39H38Cl4N4O4, 767,1647; encontrado, 767,1720
Seguindo um procedimento análogo àquele descrito para I.1 mas usando diferentes aminas, os seguintes produtos foram obtidos:
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Intermediário Ia
Ia: ácido {[2-(2,4-Diclorofenil)etil]-[1-[2-(2 , 4- diclorofenil)etil]-4-(3,3-di-fenilpropil)-3,7- dioxo[1,4]diazepano-5-carbonil]amino}acético
A resina de 2-clorotritil cloreto (IVa, 700 mg, 0,98 mmol) foi tratada com uma solução de ácido cloroacético (V, 463 mg, 5 eq.) e DIPEA (840 mL, 5 eq.) em DCM (4 mL) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora, a reação foi extinta com metanol (550 pL) e a agitação foi prolongada por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DCM (3 χ 3 mL) , álcool isopropílico (3x3 mL) e DMF (3x3 mL) . Uma solução de 2,4 -diclorof enetilamina (Via, 740 pL, 5 eq.) e DIPEA (840 mL, 5 eq.) em 4 mL de DMF foi adicionada à resina e a suspensão foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3x3 mL), álcool isopropílico (3x3 mL) e DCM (3x3 mL). Então, a resina foi tratada com uma solução de monoalil éster de ácido (Z)-but-2-enedióico (VIII) (765 mg, 5 eq.), HOBT (662 mg, 5 eq.) e DIC (760 mL, 5 eq.) em 2:1 DCM:DMF (4 mL). A mistura de reação foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente, filtrada e repetida sob as mesmas condições. Então, uma solução de 3,3- difenilpropilamina (VIb, 1,0 g, 5 eq.) e DIPEA (840 mL, 5 eq.) em 4 mL de DMF foi adicionada à resina e a suspensão foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente. A reação foi repetida e a agitação foi prolongada por 16 horas na mesma temperatura. 0 sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3 χ 3 mL) , álcool isopropílico (3x3 mL) e DCM (3x3 mL) . Então, a resina foi tratada com uma solução de ácido cloroacético (V, 463 mg, 5 eq.) e DIC (760 mL, 5 eq.) em 2:1 DCM: DMF (4 mL) . A mistura de reação foi agitada por 3 0 minutos em temperatura ambiente. A resina foi drenada e lavada com DCM (3x3 mL) , álcool isopropilico (3 χ 3 mL) e DMF (3 χ 3 mL) . Uma solução de 2,4-diclorofenetilamina (VIc, 740 pL, 5 eq.) e DIPEA (840 mL, 5 eq.) em 4 mL de DMF foi adicionada à resina e a suspensão foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido, e o resíduo foi drenado e lavado com DMF (3x3 mL), álcool isopropilico (3 χ 3 mL) e DCM (3x3 mL) . Então, a resina foi tratada com tetracis(trifenilfosfino)paládio (0) (114 mg, 0,1 eq.) e fenilsilano (1,2 mL, 10 eq. ) em DCM anidro por 15 minutos em temperatura ambiente sob uma atmosfera de argônio. Essa etapa sintética foi realizada em triplicata. O sobrenadante foi removido e o resíduo foi drenado e lavado com DCM (3 χ 3 mL), álcool isopropilico (3x3 mL) e DMF (3x3 mL). A ciclização foi promovida por tratamento com PyBOP (765 mg, 1,5 eq.), HOBT (199 mg, 1,5 eq.) e DIPEA (505 mL, 3 eq.) em DMF (4 mL) . A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 4 8 horas e filtrada. A resina foi drenada e lavada com DMF (3x3 mL), álcool isopropilico (3x3 mL) e DCM (3x3 mL). Finalmente, tratamento da resina com uma mistura de 5:95 TFA/DCM liberou uma mistura de reação bruta que foi filtrada. Solventes do filtrado foram removidos sob pressão reduzida seguido por liofilização para gerar o composto Ia (460 mg, rendimento 61%, > 55% pureza) como um sólido incolor.
Intermediário IIa
A resina Rink amida (IV, 5 05 mg, 0,4 mmol) foi desprotegida com 3 mL de 20% piperidina em DMF. A mistura foi agitada em um reator de microondas por 2 minutos a 60 °C. A resina foi filtrada e lavada com DMF (3 χ 3 mL) , álcool isopropílico (3x3 raL) e DCM (3x3 mL). Fmoc-L- Lys(Boc)-OH (XlVa, 2 eq) foi ligado à resina usando HOBT (108 mg, 2 eq.) e DIC (125 pL, 2 eq.). A mistura foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. A resina foi drenada e lavada com DMF (3x3 mL), álcool isopropílico (3 χ 3 mL) e DCM (3x3 mL). Com a remoção do grupo Fmoc com 3 mL de 20% piperidina em DMF (30 min), a resina foi lavada com DMF (3x3 mL), álcool isopropílico (3x3 mL) e DCM (3 χ 3 mL). Se necessário, os outros aminoácidos (XIVb) foram ligados sob as mesmas condições como acima descrito para gerar intermediário XVI.
Ao intermediário XVI inchado em DMF, ácido Ia (4 6 0 mg, 1,5 eq.) doi adicionado na presença de HATU (228 mg, 1,5 eq.) e DIPEA (205 mL, 3 eq.) em DMF (3 mL). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas e filtrada. A resina foi drenada e lavada com DMF (3x3 mL) , álcool isopropílico (3x3 mL) e DCM (3x3 mL). Tratamento da resina com uma mistura de 80:20:2.5:2.5 TFA/DCM/água/ triisopropilsilano gerou uma mistura de reação bruta contendo o composto IIa, que foi filtrado. Solventes do filtrado foram removidos sob pressão reduzida, seguido por liofilização. O resíduo obtido foi purificado por RP-HPLC semi-preparatória usando uma mistura de gradiente aquoso- acetonitrila.
<table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> Compostos de formula III III.1: PGA-IIa.1
A uma solução de sal PGA sódio (XVII, 0,1 g, 0,5 mmol) com uma faixa de peso molecular (Mw) de 17.000-43.000 Da em água, 0,2 M HCl foi adicionado até o pH da solução estar ajustado a 2,0. O precipitado foi coletado, dialisado contra água, e liofilizado. Então PGA em sua forma protínica (XVIIa) foi dissolvido em DMF seco (7,5 mL) e DIC (3 eq) e HOBt (3 eq) foram adicionados e deixados em agitação por 15 minutos. Então intermediário IIa.1 (0,052 mmol (12 mol%) 1 eq) foi adicionado e o pH ajustado a 8 com DIPEA (1,5 mL) . A reação foi deixada para prosseguir em temperatura ambiente por 3 6 horas. Cromatografia de camada fina (TLC, sílica) mostrou completa conversão de Ila.l (Rf = 0,5) ao polímero conjugado (Rf = 0
MeOH:H2O:AcOH=8 5:10:5) . Para interromper a reação, a mistura foi despejada em CHCl3. O precipitado resultante foi coletado e seco in vacuum. O sal de sódio de PGA- peptóide conjugado III.1 foi obtido por dissolução do produto em 1,0 M NaHCO3. Essa solução aquosa foi dialisada contra água destilada (MWCO 6.000-8.000 Da). A liofilização do dialisado gerou o produto como um pó branco. O conteúdo total de peptóide no polímero como determinado por UV (λ= 282 nm) foi na faixa de 25-30 % (w/w) (10-12 mol% funcionalização), conteúdo de medicamento livre < 1% em peso de medicamento total.
O peso molecular médio (Mw), polidispersibilidade (Mw/Mn) e o comportamento de III. 1 e controle XVII em solução foram analisados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e ultracentrifugação analítica (AUC). Ambas técnicas mostraram III.1 como uma estrutura conformacional mais compacta com menor volume hidrodinâmico e maior coeficiente de sedimentação (S) que XVII (tr = 12,5 min e S= 3,5 ± 0,4 s vs. tr = 11,6 min e S= 1,9 ± 0,1 s para III.1 e XVII, respectivamente). Por equilíbrio de sedimentação o Mw foi determinado como 26.700 Da para XVII e 58.600 Da para III.1, no entanto o Mw de 36.000 Da (Mw/Mn = 1,8) e 38.000 Da (Mw/Mn= 1,5) foram determinados para XVII e III.1, respectivamente, por GPC usando padrões PEG.
Determinação de conteúdo total de medicamento por espectroscopia de UV
Uma solução de estoque de IIa em MeOH foi preparada (1 mg/mL). Para obter uma curva de calibração, amostras foram diluídas com o uso de MeOH para gerar uma faixa de concentração de 0-1 mg/mL. A carga total de medicamento dos conjugados foi determinada por medição da densidade ótica a 272 nm e 281 nm em H2O. PGA na mesma faixa de concentração como conjugado III analisado (0-5 mg/mL) em H2O foi usada como vazio. 0 coeficiente de extinção encontrado para IIa a 281 nm em MeOH em RT foi ITL = 713 L mol"1 cm"1.
Determinação de conteúdo de medicamento livre por HPLC
Soluções aquosas de III.1 (1 mg/mL) foram preparadas, e uma alíquota (100 mL) foi adicionada a um tubo de polipropileno até 1 mL com água. O pH das amostras foi ajustado a 8 com tampão de formato de amônio (100 mL, 1 M, pH 8,5), e então CHCl3 (5 mL) foi adicionado. As amostras foram então completamente extraídas por turbilhonamento (3 χ 10 segundos). A camada aquosa superior foi cuidadosamente removida e o solvente foi evaporado sob N2. O resíduo seco foi dissolvido em 200 mL de acetonitrila grau HPLC. Em paralelo o mesmo procedimento foi realizado para o composto parente IIa.1 (usando 200mL de uma solução aquosa de estoque a 1 mg/mL). Adição de 1 mL de acetonitrila para redissolver o produto gerou um estoque de 200 mg/mL do qual uma faixa de concentrações foi preparada (2 a 100 mg/mL). A quantidade livre de medicamento nos conjugados foi determinada por HPLC usando uma coluna Lichrospher® C18 (150 χ 3., 9 mm). Txa de fluxo 1 mL/min usando um gradiente de acetonitrila em 0,1% TFA aquoso (de 20 a 100% de acetonitrila em 20 min). O tempo de retenção foi tr = 14,3 minutos para IIa.1 (λ = 220 nm).
Seguindo esse procedimento como para III.1, os seguintes exemplos foram obtidos:
<table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table>
a Determinada por Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)
Descrição dos desenhos
FIGURA 1: Ensaio de inibição de caspase livre de células que usa fração citoplasmática Hek-293 FT incubada com Apaf-I recombinante na presença de diferentes concentrações do composto IIa.1.
FIGURA 2: Análise da interação CARD/Ila.l. Uma solução de 240 nM de CF-IIa.1 em tampão PBS foi titulada com concentrações crescentes de CARD-Apaf e polarização de fluorescência foi medida a 30 °C. Os dados (s.d. média; n=3) foram registrados em unidades de milipolarização (mP).

Claims (13)

1. Composto caracterizado por ter a fórmula geral I, <formula>formula see original document page 46</formula> seus estereoisômeros e misturas desses, seus polimorfos e misturas desses e os solvatos e sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis desses, em que: Rl representa (C1-C5) alquil, (C2-C5) alquenil, - (CH2)1- a-NHCO- (C1-C3) alquil, (CH2)1-S-CONRaRb, - (CH2) 0-3-(3-6) Cy/ - (CH2) 0-3-(5-6)Hetcy, (CH2)1-3-fenil, (CH2) 1-3(1-naftil), - (CH2) 1-3-(2-naftil) , - (CH2) 1-3-(5-10) Hetar, (CH2)2- CH (fenil) 2, (CH2) 2-CH (fenil) [ (5-6) Hetar] ou (CH2) 2-CH [ (5- 6)Hetar]2 ; R2 representa - (CH2) 0-3-(3-6) Cy, - (CH2) 0-3-(5-6) Hetcy, - (CH2) 1-3-fenil, (CH2) 1-3 (1-naftil) , - (CH2) 1-3-(2-naftil) , - (CH2) 1-3-(5-10)Hetar, (CH2) 2-CH (fenil) 2, (CH2)2- CH(fenil) [ (5-6) Hetar] ou (CH2) 2-CH [ (5-6) Hetar] 2 ; R3 representa - (CH2) 1-3-fenil, (CH2) 1-3 (1-naftil) , (CH2) 1-3-(2-naftil) , ou (CH2) 1-3-(5-6) Hetar; (C1-C5) alquil e - (C2-C5) alquenil podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de - O-(C1-C2) alquil, -S-(C1-C2) alquil, -NH2, -NH-(C1-C2) alquil e N [(C1-C2) alquil] 2; (1i-C3)alquil pode ser opcionalmente substituído com um ou mais átomos de halogênio; Ra e Rb representam independentemente 0 -H ou (C1- C3) alquil. (3-6)Cy representa um radical de um anel carbocíclico parcialmente insaturado ou saturado de 3 a 6 membros; (5-6) Hetcy representa um radical de C- ou N- de um anel carbocíclico parcialmente insaturado ou saturado de 5 ou 6 membros contendo de um ou dois heteroátomos independentemente selecionados de O, Se N; Cy e Hetcy podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de halogênio, -CF3 e - OH; (5-6)Hetar e (5-10)Hetar representam um radical de C- ou N- de um anel aromático de 5 ou 6 membros e de 5 a 10 membros respectivamente; contendo de um a quatro heteroátomos independentemente selecionados de O, Se N; fenil, 1-naftil, 2-naftil, (5-6)Hetar e (5-10)Hetar podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de halogênio, -CF3, -0H, O(C1- C3) alquil, -CO- (C1-C3) alquil, -(C1-C5Jalquil-NRaRb, -NRaRb e -SO2NH2; desde que R2 não represente 2-(4-fluorfenil)etil.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Rl representa - (CH2) 0-3- (3- -6) Cy; - (CH2) 1.3-(5-10)Hetar, (CH2) 1-3-fenil, (CH2) 1-3 (1- naftil) ou - (CH2) 1-3-(2-naftil) , ali todos opcionalmente substituídos.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que R2 representa (CH2) 1-3- fenil, (CH2) i-3 (1-naftil) , (CH2) 1-3-(2-naftil) ou -(CH2)2 CH(fenil)2/ todos opcionalmente substituídos, desde que R2 não represente 2-(4-fluorfenil)etil.
4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 caracterizado pelo fato de que R3 representa - (CH2) 1-3-(5-6) Hetar ou - (CH2) 2-fenil, ambos opcionalmente substituídos.
5. Composto caracterizado por ser um conjugado de medicamento que compreende um radical de fórmula II <formula>formula see original document page 48</formula> seus estereoisômeros e misturas desses e os solvatos e sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis desses, conjugado a um polímero de ácido poliglutâmico, em que R1, R2 e R3 têm os significados como definido na reivindicação 1 sem a condição de R2; cada R4 independentemente representa uma cadeia lateral de qualquer um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, e η é 0,1, 2 ou 3.
6. Composto caracterizado por ter a fórmula III que é um conjugado de medicamento de acordo com a reivindicação 2, <formula>formula see original document page 48</formula> em que a proporção de y para χ é de 25-30% a 75-70% em peso.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 5 ou 6 caracterizado pelo fato de que o ácido poliglutâmico é ácido poli(L-glutâmico); η representa 2 e R4 representa uma cadeia lateral de glicina.
8. Uso de um composto de fórmula I como definido na reivindicação 1, sem a condição de R2 ou um composto como definido na reivindicação 5, caracterizado para a manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com a inibição de apoptose.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada de AVC, traumatismos, dano cerebral, dano à medula espinhal, meningite, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Kennedy, esclerose múltipla, Doenças relacionadas a príons, isquemia miocárdica, bem como outras doenças cardiovasculares agudas e crônicas, transplantes de órgãos, patologias relacionadas com álcool, ou tratamento de alopécia.
10. Método para o tratamento ou prevenção de uma condição associada com a inibição de apoptose que caracterizado por compreende a administração de um composto de fórmula I como definido na reivindicação 1, sem a condição de R2 ou um composto como definido na reivindicação 5 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada de AVC, traumatismos, dano cerebral, dano à medula espinhal, meningite, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Kennedy, esclerose múltipla, Doenças relacionadas a príons, isquemia miocárdica, bem como outras doenças cardiovasculares agudas e crônicas, transplantes de órgãos, patologias relacionadas com álcool, ou tratamento de alopécia.
12. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de um composto de fórmula I como definido na reivindicação 1 ou um composto como definido na reivindicação 5, um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável desse, e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por estar na forma de nanoesferas, micropartículas e nanopartículas.
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