ES2713484T3 - Método para la inhibición de la actividad de desubiquitinación - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la estructura general S-1**Fórmula** en el que, R1, R2 en el doble enlace d1 y R3, R4 en el doble enlace d2 pueden, independientemente entre sí, tener una configuración opuesta a la de la fórmula S-1, X es CO o CS; R1 y R3 son H; R2 y R4 son, independientemente entre sí, H; alquilo C1-6; alquil C1-5-CO; fenilo o heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido con 1-3 de: alquilo C1-6, alcoxi C1-6, CN, -COO-alquilo C1-6, COOH, NO2, F, Cl, CF3, NH2, NHalquilo C1-6, N(alquilo C1-6)2, CONR7R8, con la condición de que uno o más de H en alquilo y alcoxi pueden estar sustituidos con flúor; R5 es cualquiera de H; alquilo C1-6; alquenilo C2-6; alcoxi C1-3-alquil C2-6-; alcoxi C1-3-alquenil C2-6-; aril-C0-6-alquil-; heteroaril-alquil C0-6-; heterociclilo-alquil C0-6-; cicloalquil-alquil C0-6-; -alquil C1-6-COO-alquilo C1-6; -alquil C2-6-ariloxi; COR6; R6 se selecciona de: alquilo C1-6; alquenilo C2-6; alcoxi C1-6; alcoxi C1-3-alquilo C1-6-; alcoxi C1-3-alquenilo C1-6-; aril-alquilo C0-6-; heteroaril-alquil C0-6-; heterociclilo-alquil C0-6-; cicloalquil-alquil C0-6-; -alquil C1-6-COO-alquilo C1-6; NH2; -NH-alquilo C1-6; -N(alquilo C1-6)2; -alquil C0-6-ariloxi; R7, R8 son, independientemente entre sí, H o alquilo C1-3.

Description

DESCRIPCION

Metodo para la inhibicion de la actividad de desubiquitinacion

Campo de la invencion

La invencion se refiere a los compuestos y los compuestos para uso en el tratamiento del cancer en un paciente mediante la inhibicion de la actividad de desubiquitinacion. Mas particularmente, la invencion se refiere a compuestos para uso en un metodo para tratar un cancer en un paciente que ha demostrado ser resistente al tratamiento con al menos un medicamento anticanceroso. Mas particularmente, la invencion se refiere a un compuesto para uso en el metodo y a una composicion farmaceutica que comprende el compuesto.

Antecedentes de la invencion

Las celulas tumorales muestran una mayor sensibilidad a las interrupciones en el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS), lo que hace de este un objetivo atractivo para el desarrollo de terapias contra el cancer (1). Los sustratos marcados con ubiquitina son degradados por el proteasoma 26S, un complejo de multiples subunidades que comprende un nucleo proteolitico 20S (CP 20S) cubierto por particulas reguladoras 19S (RP 19S) (2,3). El CP 20S se ha convertido en un objetivo importante para el desarrollo de farmacos contra el cancer, lo que ha dado como resultado la aprobacion de bortezomib (Velcade®) para el tratamiento de la leucemia mieloide (4).

Se sabe que el compuesto b-AP15 (NSC687852) induce apoptosis independiente de p53 y dependiente de catepsina-D (5, 6).

Objetos de la invencion

Un objeto de la invencion es proporcionar un compuesto para su uso en un metodo para tratar el cancer en un paciente mediante la inhibicion de la actividad de desubiquitinacion, en particular un cancer resistente a la quimioterapia del estado de la tecnica.

El documento WO 2007/007207 divulga compuestos utiles para tratar una variedad de trastornos proliferativos celular tales como canceres. Los compuestos se basan en un nucleo de 6 carbonos que tiene anillos de fenilo unidos y actua inhibiendo la actividad de la tirosina quinasa. No hay discusion sobre la inhibicion del proteasoma mediante el bloqueo absoluto de la ubiquitinacion.

Romantoli et al., (Symmetrical alfa bromoacryloylamido diaryldieone derivatives as a novel serie of antiproliferative agents. Design, synthesis and biological evaluation. Bioorg. Med. Chem. Lett., Vol. 20, No. 9, 2010) divulga compuestos 1,5-diaril-3-oxo-1,4-pentadienilo (Ib) que demuestran actividad anticancerigena. El autor concluye que los compuestos hibridos que contienen las fracciones de bromoalfabromoacriloilo son posibles farmacos anticancerosos. De nuevo, no hay discusion con respecto a la inhibicion de la ubiquitinacion del proteasoma y no hay informacion para desarrollar compuestos de formula general I de la presente solicitud.

El documento WO 2011/005790 divulga derivados de curcumina, que tienen propiedades antioxidantes y sugiere usarlos para proteger a las celulas normales de los danos oxidativos asociados durante la quimioterapia, aumentando asi la eficacia anticancerigena.

Aleo et al., (Identification of new compounds that trigger apoptosome-independent caspase activation and apoptosis, Cancer Res, Vol. 66, No. 18, 2006) y Berndtssonet al., 2009 (6), ambos divulgan compuestos que tienen un 3,5-di (fenilmetileno)-piperidin-4-ona que actua contra el cancer mediante la inhibicion del sistema ubiquitina-proteasoma. Los compuestos inhiben la actividad isopeptidasa de la ubiquitina del proteasoma e inducen la apoptosis.

Los derivados de chalcona de Aleo et al., 2006, inhiben una gama mas amplia de DUB, es decir, son menos espedficos que los compuestos de la presente invencion. Ambos artfculos guardan silencio con respecto a la subunidad RP 19S del proteasoma, asf como a los canceres resistentes.

El documento WO 2007/059613 divulga derivados de 4-piperidona que tienen efecto anticanceroso pero no divulga compuestos de la presente invencion (anillo de 7-14 miembros) ni discute la accion sobre la unidad 19S del proteasoma 26S.

Otro objeto de la invencion es proporcionar un compuesto del tipo mencionado anteriormente, que tenga una solubilidad mejorada a pH fisiologico con respecto a compuestos funcionalmente equivalentes conocidos en la tecnica. Un objeto adicional de la invencion es proporcionar compuestos para uso en el tratamiento del cancer.

Un objeto adicional de la invencion es proporcionar una composicion farmaceutica que comprende el compuesto. Otros objetos adicionales de la invencion se haran evidentes al estudiar el siguiente resumen de la invencion, una serie de realizaciones preferidas de la misma ilustradas en un dibujo, y las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, se divulga un compuesto de la estructura general S:

capaz de anular la actividad de desubiquitinacion (DUB) de las DUB RP 19S.

El compuesto de la invencion se reconoce como perteneciente a una nueva clase de inhibidores de proteasoma de los cuales el compuesto conocido b-AP15 es un representante.

En particular, de acuerdo con la presente invencion, el compuesto de la invencion inhibe la actividad de dos DUB RP 19S, UCHL5 y USP14, mientras que no afecta a las DUB no proteasomicas. Mas particularmente, el compuesto de la invencion tiene efecto en el tratamiento de un tumor cancengeno resistente a la quimioterapia del estado de la tecnica debido a la sobreexpresion del inhibidor intrmseco de apoptosis Bcl-2.

En otra realizacion preferida, el compuesto es eficaz en el tratamiento de un cancer resistente a cualquier farmaco anticanceroso conocido en la tecnica.

En esta solicitud, "resistente al tratamiento" significa que el tratamiento de un cancer con una dosis unica de un medicamento anticanceroso no reduce sustancialmente la tasa de crecimiento del cancer observado inmediatamente antes del tratamiento, tal como la reduccion de la tasa de crecimiento mensual en no mas del 25 por ciento o el 10 por ciento o incluso el 5 por ciento o menos. Una medida aceptada del crecimiento tumoral es el cambio de volumen de un cancer no diseminado.

Un ejemplo de un cancer susceptible de tratamiento por el metodo de la invencion es el mieloma multiple. Otros ejemplos de canceres susceptibles de tratamiento incluyen cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de colon, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de mama, cancer de cabeza y cuello.

En el compuesto de la invencion de la estructura general S-1,

R1, R2 en el doble enlace d1 y R3, R4 en el doble enlace d2 pueden, independientemente entre sf, tener una configuracion opuesta a la de la formula S-1, X es CO o CS;

R1 y R3 son H;

R2 y R4 son, independientemente entre sf, H; alquilo C^1-6; alquil C^1-5-CO; fenilo o heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido con 1-3 de: alquilo C^1-6, alcoxi C^1-6, CN, -COO-alquilo C^1-6, COOH, NO² , F, Cl, CF³ , NH² , NHalquilo Ci-6, N(alquilo Ci-a)² , CONR7R8, con la condicion de que uno o mas de H en alquilo y alcoxi pueden estar sustituidos con fluor;

R5 es H; alquilo Ci-a; alquenilo C^2-6; alcoxi C i^-3-alquil C^2-6-; alcoxi C i^-3-alquenil C^2-6-; aril-Co-a-alquil-; heteroaril-alquil C⁰-6-; heterociclilo-alquil C^0-6-; cicloalquil-alquil C^0-6-; -alquil Ci-6-COO-alquilo C^1-6; -alquil C^2-6-ariloxi; COR6;

R6 se selecciona de: alquilo Ci-6; alquenilo C^2-6; alcoxi Ci-6; alcoxi C i^-3-alquilo Ci-6-;

alcoxi C i^-3-alquenilo Ci-6-; aril-alquilo C^0-6-; heteroaril-alquil C^0-6-; heterociclilo-alquil C^0-6-; cicloalquil-alquil C^0-6-; -alquil Ci-6-COO-alquilo Ci-6; NH² ; -NH-alquilo Ci-6; -N(alquilo C i^-6)² ; -alquil C^0-6-ariloxi;

R7, R8 son, independientemente entre si, H o alquilo C i^-3.

Se prefiere que tanto R2 como R4 sean H; alquilo Ci-6; alquil C i^-5-CO; fenilo o heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido con i-3 de: alquilo Ci-6, alcoxi Ci-6, CN,

COO-alquilo Ci-6, COOH, NO² , F, Cl, CF³ , NH² , NH-alquilo Ci-6, N(alquilo C i^-6)² , CONR7R8, con la condicion de que uno o mas de H en alquilo y alcoxi puede estar sustituido con fluor, y en el que la sustitucion de fenilo es preferiblemente en una o mas de las posiciones 3, 4, 5.

Se prefiere particularmente que tanto R2 como R4 sean fenilo sustituido en una o mas de las posiciones 3, 4, 5 por 1­ 3, preferiblemente por i o 2, de: alquilo Ci-6, alcoxi Ci-6, CN, -COO-alquilo Ci-6, COOH, NO² , F, Cl, CF³ , NH² , NH-alquilo Ci-6, N(alquilo C i^-6)² , CONR7R8, con la condicion de que uno o mas de H en alquilo y alcoxi pueden estar sustituidos con fluor. Los mas preferidos son los sustituyentes que retiran electrones, en particular F, Cl, trifluorometilo, NO2, CN.

Se prefiere que R5 se seleccione del grupo que consiste en H, metilo, acetilo, COCH=CH² , 2-acetoxietilo.

De acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, X = CO. Segun otro aspecto preferido de la invencion, R1 y R3 son ambos H. De acuerdo con un tercer aspecto preferido de la invencion, R2 y R4 son, independientemente entre sf, fenilo o heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido con i-3 de: alquilo Ci-6, alcoxi Ci-6, CN, -COO-alquilo Ci-6, COOH, NO² , F, Cl, CF³ , NH² , NH-alquilo Ci-6, N(alquilo C i^-6)² , CONR7R8, siendo preferido fenilo y siendo preferida la sustitucion de fenilo, si lo hubiera, en una o mas de las posiciones 3, 4, 5.

De acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, R1, R2 en el enlace doble d i y R3, R4 en el enlace doble d2 tienen la configuracion de la formula S-i; X es CO o CS; R1 y R3 son, independientemente uno del otro, H; R2 y R4 son, independientemente entre sf, H; alquilo Ci-6; alquil C^1-5-CO; fenilo o heteroarilo de 6 miembros

sustituido con 1-3 de: CN, NO² , F, Cl, NH² , NH-alquilo Ci-6, N(alquilo C i^-6)² , CO-alquilo Ci-6; R5 es H, alquilo Ci-6, alquenilo C^2-6, alcoxi C i^-3-alquilo Ci-6, alcoxi C i^-3-alquenilo Ci-6, arilo, heteroarilo, heterociclilo, alquil Ci-6-heteroarilo, alquil Ci-6-heterociclilo, alquil Ci-6-cicloalquilo, alquilarilo Ci-6, CO-alquilo Ci-6, CO-vinilo, CO-alilo, CO-arilo, CO-cicloalquilo. Se prefiere, independientemente uno del otro, que X sea CO, que R2 y R4 sean fenilo sustituido, que R5 se seleccione de COR6, en particular de CO-alquilo Ci-6, CO-cicloalquilo, CO-vinilo, CO-alilo.

"Arilo" se refiere a un hidrocarburo monodclico o bidclico de 6 a 10 atomos de carbono que comprende al menos un anillo aromatico. "Ariloxi" se refiere a un grupo arilo unido a un atomo de oxfgeno. "Heteroarilo" representa un sistema de anillo monodclico que tiene 5 o 6 atomos en el anillo, de los cuales uno o mas se seleccionan independientemente de oxfgeno, nitrogeno, azufre. "Alquilo" denota alquilo lineal o ramificado. "Alquenilo" denota alquenilo lineal o ramificado. "Alcoxi" denota alcoxi lineal o ramificado. "Cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo monodclico saturado de 3 a 7 atomos de carbono.

Los compuestos preferidos de la invencion de la estructura general S-1 se divulgan en las Tablas 1 y 2.

T l 1. m r f ri l inv n i n.

Debido a la protonacion de su grupo amino, la solubilidad en medios acuosos de los compuestos de azepanona de la invencion de los cuales R5 no es acilo, asf como de piperidin-4-onas sustituidas correspondientemente aumenta con un pH decreciente. Sin embargo, de acuerdo con un aspecto importante, los compuestos de azepanona de la invencion de los cuales R5 no es acilo (es decir, no -COR6) tienen una solubilidad superior en medios acuosos a pH fisiologico en comparacion con las piperidin-4-onas sustituidas correspondientemente. Si bien la solubilidad de estas azepanonas y piperidin-4-onas aumenta al pasar de un pH alto a un pH bajo, el aumento comienza con valores de pH mas altos para las azepanonas que para las piperidin-4-onas correspondientes. En esta solicitud, el "pH fisiologico" es un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, en particular de 7,0 a 7,5.

La solubilidad en medios acuosos de compuestos de la invencion de los cuales R5 es acilo (es decir, -COR6) es sustancialmente independiente del pH.

Los compuestos particularmente preferidos de la invencion son los compuestos nos. 1561, 1562, 1567, 1570, 1571, 1586, 1591, 1600, 1612, 1618, 1622, 1625, 1643, 1647, 1648, 1649, 1652, 1653, 1656, 1657, 1658, 1662. Los compuestos mas preferidos de la invencion son los compuestos nos. 1570, 1571, 1625, 1662.

Dado que el compuesto de la invencion comprende una fraccion 1,4-penteno-3-ona disustituida en 1,5, puede existir en cuatro isomeros cis/trans EE, ZE, ES, ZZ. Al definir el compuesto de la invencion, este isomerismo se definio anteriormente como "R1, R2 en el doble enlace d1 y R3, R4 en el doble enlace d2 puede, independientemente uno del otro, tener una configuracion opuesta a la de formula S1". El compuesto de la invencion comprende cualquiera de tales isomeros y cualquier mezcla de tales isomeros.

En sintesis, el compuesto de la invention se obtiene como una mezcla de isomeros pero a veces tambien en forma del isomero con la solubilidad mas baja en el disolvente particular, del cual precipita o cristaliza. Mientras que los isomeros puros se pueden obtener de este modo bajo condiciones controladas, el efecto farmacologico del compuesto es exhibido por todos los isomeros. La razon de esto es su equilibrio en presencia de agua u otro disolvente o agente hidroxilico o sulfhidrflico, que se acelera por la catalisis acida y basica.

Por consiguiente, el termino "compuesto de la invencion", como se usa en este documento, comprende un isomero puro del tipo mencionado anteriormente, asi como una mezcla de dos o mas de tales isomeros. La velocidad de equilibrio del compuesto de la invencion en fluido corporal acuoso es suficiente para proporcionar un equilibrio sustancial dentro de un unico periodo de tratamiento.

El compuesto de la invencion comprende una fraction azepano, preferiblemente una fraction azepan-4-ona. De acuerdo con un aspecto importante de la invencion, el compuesto de la invencion exhibe una actividad citotoxica superior a la de un compuesto estructuralmente correspondiente que comprende una fraccion de piperidina, tal como una fraccion de 4-piperidinona.

De acuerdo con otro aspecto importante de la invencion, el compuesto de la invencion que comprende una fraccion azepano, en particular una fraccion azepan-4-ona presenta una solubilidad en un vehiculo Kquido adecuado para la administration a un paciente, tal como dimetilsulfoxido, superior a la de un compuesto estructuralmente correspondiente que comprende una fraccion de piperidina, tal como una fraccion de 4-piperidinona.

Un "periodo de tratamiento unico" es el periodo de tiempo que transcurre entre la administracion y el consumo del compuesto de la invencion, es decir, el momento en el cual la concentration del compuesto de la invencion en un sitio de action, tal como en un tumor, se ha reducido en un 90% o 95% o 99% y mas. En una composition farmaceutica, un isomero o una mezcla de isomeros del compuesto de la invencion se estabiliza frente a la isomerization mediante la exclusion cuidadosa de la humedad.

El uso de la invencion comprende administrar al paciente que lo requiera una dosis farmacologicamente eficaz del compuesto de la invencion en un vehiculo farmaceutico adecuado, tal como, por ejemplo, disuelto o suspendido en un vehiculo acuoso o en un vehiculo que comprende dimetil sulfoxido o N,N-dimetilacetamida. La administracion puede ser por cualquier via adecuada, tal como por inyeccion o infusion intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea. Tambien se contemplan otros metodos de administracion, en particular per os, tales como en forma de comprimidos o capsulas de gelatina dura o blanda.

El experto en la materia sabe como determinar una dosis farmacologicamente eficaz. Dicha dosis puede ser de 0,0001 g/kg a 0,1 g/kg de peso corporal, en particular de 0,001 g/kg a 0,01 g/kg de peso corporal, dependiendo de si el agente se administra sistemicamente o localmente.

De acuerdo con la inhibition de DUB, el tratamiento con el compuesto de la invencion provoca la acumulacion de proteinas poliubiquitinadas de mayor peso molecular en comparacion con el tratamiento con bortezomib, y da como resultado una respuesta de proteina no plegada mas fuerte. De acuerdo con la invencion, tambien se ha encontrado que la induction de apoptosis por el compuesto de la invencion difiere de la de bortezomib por ser insensible a la ruptura del supresor de tumores p53 e insensible a la sobreexpresion del inhibidor de la apoptosis Bcl-2.

De acuerdo con la presente invencion, el uso de los compuestos para el tratamiento inhibe la progresion tumoral en modelos in vivo de tumores humanos y de raton de carcinoma de pulmon, colon, cabeza y cuello, e inhibe la infiltration en un modelo de leucemia mieloide aguda (AML). En consecuencia, se divulga que la inhibicion de la actividad de DUB de la RP 19S por el compuesto de la invencion es una option viable para el tratamiento del cancer en seres humanos y animales.

De acuerdo con un aspecto preferido de la invencion, las DUB de RP 19S comprenden UCHL5 y USP14. De acuerdo con otro aspecto preferido de la invencion, la actividad de desubiquitinacion (DUB) de las DUB no proteasomicas no se ve afectada por el compuesto de la invencion. El compuesto de la invencion se puede administrar disuelto o suspendido en un vehiculo liquido por cualquier via adecuada, tal como por administracion intravenosa, intramuscular y subcutanea. De forma alternativa o adicional, el compuesto de la invencion se puede administrar por via oral, tal como en forma de un comprimido o capsula. Una dosis util farmacologicamente eficaz del compuesto de la invencion es de 0,0001 g/kg a 0,1 g/kg de peso corporal, en particular de 0,001 g/kg a 0,01 g/kg de peso corporal, dependiendo de si el compuesto se administra sistemicamente o localmente.

El compuesto de la invencion bloquea la funcion del proteasoma celular, como se confirma mediante el uso de una lmea celular informadora, que expresa ubiquitina marcada con protema fluorescente amarilla (UbG76V-YFP) dirigida de forma constitutiva a la degradacion proteasomal (12). La inmunotransferencia y la citometna de flujo revelaron una acumulacion dependiente de la dosis del informador Ub-YFP (IC50 = 0,8 j M), lo que sugiere un deterioro de la funcion del proteasoma. Dado que la inhibicion de la funcion del proteasoma se caracteriza por defectos en la vida media de la ubiquitina (13), se trataron celulas HCT116 de carcinoma de colon con el compuesto de la invencion y se analizo el nivel de conjugacion de ubiquitina mediante inmunotransferencia. El tratamiento causo la rapida acumulacion dependiente del tiempo de protemas poliubiquitinadas de mayor peso molecular en comparacion con el bortezomib inhibidor del CP 20S, lo que sugiere que el compuesto de la invencion inhibe una rama alternativa del UPS. El aumento de la poliubiquitina se asocia con una fuerte respuesta proteotoxica caracterizada por la induccion de HSPA6 (Hsp70B'), HSPA1B y DNAJB1 (Hsp40).

La vida media de muchas protemas reguladoras del ciclo celular esta controlada por el UPS que incluye inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina p21Cip1, p27Kip1 y el supresor de tumores p53 (4). El tratamiento con el compuesto de la invencion aumenta sus niveles de una manera dependiente de la dosis sin alterar los niveles de ornitina descarboxilasa 1 (ODC1), un sustrato de proteasoma independiente de ubiquitina (8). El aumento en los reguladores del ciclo celular fue concomitante con la detencion del crecimiento en el ftmite de la fase G2/M y un mayor contenido de ADN sub G1. La detencion del ciclo celular observada no se asocia con niveles aumentados de marcadores de dano del ADN tales como p53 fosforilado (en Ser 15) (9) o H²AX (en Ser 139) (10), lo que sugiere que b-AP15 no es un agente genotoxico.

El aumento en el ADN sub G1, la activacion de la caspasa-3 y la escision de la poli-ADP ribosa polimerasa (PARP) y la citoqueratina se asocian con una disminucion general de la viabilidad celular en las concentraciones del farmaco que inducen la acumulacion de poliubiquitina que conecta la inhibicion de la UPS y la apoptosis. La induccion de apoptosis por bortezomib es sensible al estado del supresor de tumores p53 y la sobreexpresion de la oncoprotema Bcl-2 antiapoptotica (11, 12). Mediante el uso de clones isogenicos de celulas de cancer de colon HCT116 se demostro que la apoptosis inducida por b-AP15 es insensible a la sobreexpresion de Bcl-2 y la interrupcion de los reguladores apoptoticos p52, BAX o PUMA. La medicion de la actividad citotoxica muestra que el compuesto de la invencion es mas toxico para la lmea celular de carcinoma de colon HTC-116 que para las celulas epiteliales de pigmento retinal inmortalizadas (hTERT-RPE1) y las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). El compuesto de la invencion exhibe un mayor grado de actividad citotoxica hacia las celulas HTC-116 que hacia los tipos de celulas normales.

La reduccion observada en la actividad del proteasoma celular no se puede explicar por la inhibicion de las actividades proteolfticas de las subunidades p del CP 20S. Los experimentos in vitro que usan sustratos espedficos de actividad no muestran inhibicion en ninguna de las actividades proteolfticas del CP 20S o del proteasoma 26S, disociacion de las RP 19S y CP 20S o inhibicion de la union de poliubiquitina al proteasoma.

El compuesto de la invencion comprende una entidad de dienona a-p con dos carbonos p accesibles estericamente. Se ha descrito anteriormente que un farmacoforo estructuralmente similar esta comprendido por una clase de inhibidores de la isopeptidasa de la ubiquitina (13). Sin embargo, cuando se probo la actividad de DUB celular usando ubiquitina 7-amido-4-metilcumarina (Ub-AMC) en celulas tratadas, tratadas con el compuesto de la invencion, no se observo reduccion en la escision de Ub-AMC. Esto demuestra que el compuesto de la invencion no es un inhibidor general de DUB. Sin querer vincularse a ninguna teona en particular, las similitudes en la estructura del farmacoforo y los datos que muestran que el compuesto de la invencion inhibe la actividad del proteasoma independiente del CP 20S indican que el compuesto de la invencion inhibe el proteasoma al bloquear la actividad de desubiquitinacion de la RP 19S.

Los ensayos in vitro utilizando Ub-AMC y la RP 19S o los proteasomas 26S purificados confirmaron que el compuesto de la invencion inhibe la actividad de desubiquitinacion tanto de la RP 19S o el proteasoma 26S. La ubiquitina-GFP recombinante es un sustrato para la actividad de DUB de RP 19S (15). El tratamiento de RP 19S con b-AP15 inhibio eficazmente la escision de Ub-GFP y HDM2 ubiquitinada. El tipo de enlaces de ubiquitina presentes en la cadena de poliubiquitina determina el destino de un sustrato modificado con ubiquitina.

Las cadenas de poliubiquitina unidas a K48 generalmente se dirigen a protemas unidas para la degradacion (14), mientras que las cadenas unidas a K63 participan en roles no proteolfticos que incluyen la reparacion del ADN (15) y la segregacion de cromosomas mitoticos (16). Las reacciones de desmontaje de la cadena de ubiquitina revelaron que el compuesto de la invencion inhibe el procesamiento de RP 19S de tetrameros de ubiquitina unidos a K48 y K63. La inhibicion del desmontaje de la cadena de ubiquitina observada puede explicar la acumulacion de conjugados de ubiquitina de alto peso molecular en celulas tratadas con el compuesto de la invencion.

La actividad de desubiquitinacion del proteasoma se atribuye a la accion de tres DUB, UCHL5, USP14 y POH1, todos localizados dentro de la RP 19S (17-19). Tanto UCHL5 como USP14 son sensibles a la N-etilmaleimida (NEM), un inhibidor general de las cistema proteasas, mientras que POH1 es insensible a la inhibicion por NEM pero sensible a los quelantes de metales tales como N,N,N,N-tetrakis-(2-piridilmetilo)etilendiamina (TPEN) (20). Los experimentos de inhibicion mostraron que la actividad residual de DUB esta presente incluso despues del tratamiento conjunto de RP 19S con NEM y el compuesto de la invencion. Esta actividad de DUB residual se abolio despues del tratamiento conjunto de RP 19S con el compuesto de la invencion y TPEN, lo que sugiere que el compuesto de la invencion inhibe principalmente uno o ambos DUB de cistema sensibles a NEM. Los carbonos p del compuesto de la invencion pueden servir como fracciones aceptoras de Michael, dando como resultado una union covalente a residuos de cistema en protemas objetivo. Sin embargo, los ensayos in vitro mostraron que el compuesto de la invencion es un inhibidor reversible y que el glutation no excluye la actividad inhibitoria del compuesto.

Para identificar espedficamente que DUB fueron inhibidos por el tratamiento con el compuesto de la invencion, se realizaron experimentos competitivos de marcacion usando ubiquitina vinilsulfonona etiquetada con hemaglutinina (HA-UbVS), una sonda dirigida al sitio activo que reacciona irreversiblemente con DUB de la clase cistema (17). La incubacion de RP 19S o los proteasomas 26S con el compuesto de la invencion abolio la marcacion con Ub-VS de dos DUB de pesos moleculares correspondientes a UCHL5 y USP14. Se obtuvo un resultado similar utilizando UbV en lisados derivados de celulas tratadas con farmaco. El analisis de inmunotransferencia mostro un cambio descendente en el peso molecular tanto de USP14 como de UCHL5 debido a la perdida de actividad y la disminucion del etiquetado de UbV. Esto es consistente con los proteasomas purificados por afinidad del compuesto de la invencion. Las celulas tratadas muestran una actividad de DUB reducidas confinadas al proteasoma y no es evidente en los lisados celulares. Los ensayos adicionales in vitro mostraron una inhibicion minima del compuesto de la invencion en DUB de cistema no proteasomal recombinante, lo que concuerda con la idea de que la inhibicion no se debe a la reactividad general de la cistema.

El compuesto de la invencion disminuye sustancialmente e incluso detiene el crecimiento del tumor in vivo, como se muestra por su administracion a ratones que portan un tumor humano o xenoinjertos de raton. Cuando el compuesto de la invencion se administra diariamente a ratones SCID que tienen xenoinjertos de carcinoma de cabeza y cuello FaDu, se observa una inhibicion significativa del crecimiento del tumor FaDu despues del tratamiento diario con el compuesto de la invencion (volumen de tumor tratado/control, T/C = 0,4, p = < 0,001). La muerte de celulas tumorales se analizo midiendo la citoqueratina derivada de xenoinjerto (CK18) en circulacion. Citoqueratina 18 es un biomarcador para la apoptosis (21,22); se observo un aumento significativo en los niveles plasmaticos de CK18 humana total (p = 0,01). Los niveles de CK18 escindida por caspasa (CK18-Asp396) aumentaron moderadamente en comparacion con los niveles totales, lo que sugiere que el compuesto de la invencion tiene actividad contra las celulas tumorales in vivo. Tambien se demostro que el compuesto de la invencion inhibe el inicio tumoral de xenoinjertos de carcinoma de colon HCT-116Bcl2+ en ratones desnudos, como lo demuestra un retraso significativo en el inicio del tumor en comparacion con los controles tratados con vehmulo. De manera similar, el compuesto de la invencion inhibe el crecimiento de tumores en modelos de ratones sinergicos usando cronogramas de administracion menos frecuentes.

Las hidrolasas C-terminal de ubiquitina (UCH) y las proteasas espedficas de ubiquitina (USP) son subgrupos principales de las aproximadamente cien DUB codificadas por el genoma humano (23). El mecanismo de especificidad del compuesto de la invencion para UCHL5 y USP14 en el RP 19S puede estar relacionado con conformaciones unicas de estas enzimas en el Rp 19S o debido a alteraciones inducidas por farmacos de la estructura de RP 19S. Los presentes hallazgos son consistentes con los informes en la tecnica que indican que la perdida tanto de UCHL5 como de USP14, a diferencia de la perdida de uno solo, conduce a la acumulacion de protemas poliubiquitinadas y la inhibicion de la degradacion de protemas celulares (24).

La observacion de que la inhibicion de DUB esta asociada con complejos de ubiquitina-sustrato de alto peso molecular parece ser de particular relevancia. Se observo una fuerte expresion de genes chaperones en celulas tratadas con el compuesto de la invencion, lo que indica la induccion de una respuesta proteotoxica. Los complejos de ubiquitinasustrato de alto peso molecular que se acumulan como resultado de la inhibicion de DUB por el compuesto de la invencion parecen generar una fuerte citotoxicidad.

A continuacion, se describira la invencion con mayor detalle haciendo referencia a las realizaciones preferidas de la misma, ilustradas por un dibujo que comprende varias figuras.

Descripcion de las figuras

Las Figuras 1a a 1o son diagramas que ilustran la induccion de la citotoxicidad dependiente de la dosis despues de 72 horas de exposicion continua de la lmea celular informadora HCT-116 al compuesto por realizaciones del compuesto de la invencion, de acuerdo con lo medido por FMCA (ensayo de citotoxicidad de microcultivos fluorometricos), asf como la ausencia de dicha induccion por compuestos estructuralmente relacionados no comprendidos en la invencion. Las celulas tratadas se compararon con los controles no tratados (mdice de supervivencia);

Las Figuras 2a a 2e son diagramas que ilustran la solubilidad superior de los compuestos de la invencion en un medio acuoso a pH fisiologico;

Las Figuras 3a a 3f son diagramas que ilustran, por el metodo de las Figs. 1a a 1o, la citotoxicidad superior de los compuestos de azepanona de la invencion en relacion con los compuestos de piperidin-4-ona estructuralmente correspondientes no comprendidos por la invencion.

Descripcion de las realizaciones preferidas

Metodos

Los ensayos de actividad del proteasoma in vitro se realizan en placas negras de microtitulacion de 96 pozos utilizando proteasoma 20S humano (Boston Biochem) en regulador de reaccion (Hepes 25 mM, EDTA 0,5 mM, SDS al 0,03%) con Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC o Boc-LRRAMC usados como sustratos para la actividad del proteasoma. Los ensayos de actividad de desubiquitinasa se realizan con RP 19S humano (Boston Biochem) con ubiquitina-AMC como sustrato. Para los estudios de xenoinjerto de FaDu, se inyecta en forma subcutanea una suspension de 100 pL de celulas que contiene 1 x 106 celulas en el flanco de SCID. Tras la toma del tumor, los ratones se asignan al azar a grupos de control o tratamiento y se les administra 5 mg kg-1 del compuesto de la invencion o el vehmulo. Los niveles in vivo de apoptosis y muerte celular se determinan a partir de la deteccion de la caspasa escindida y los niveles totales de citoqueratina 18 en plasma utilizando los ensayos M30 Apoptosense® y M65 ELlSA® (Peviva). Los metodos se describen a continuacion con mas detalle.

Reactivos. Los reactivos se obtuvieron de las siguientes fuentes: proteasoma 20S (E-360), proteasoma 26S (E-365), proteasoma 19S (E-366), Suc-LLVY-AMC (S-280), Z-LLE-AMC (S-230),, Boc-LRR-AMC (S-300), Ubiquitina-AMC (U-550), Tetra-ubiquitina K63 (UC-310), Tetra-ubiquitina K48 (UC-210), conjunto de enzimas desconjugantes (KE10), vinil sulfona de HA-ubiquitina (U-212) (Boston Biochem); anti-p-actina (AC-15), ODC-1 (HPA001536) (Sigma Aldrich); anti-LC-3 (2775), anti-GAPDH (2118), MAPK anti-p44/42 (4695), MAPK anti-Fosfo-p44/42 (9101) (Cell Signaling); N-etilmaleimida (34115) (Em D Chemicals); anti-ubiquitina K48 (Apu2), anti-ubiquitina (MAB1510) (Millipore); anti-p53 (DO1), anti-UCHL5 (H-110), Hdm2 (SMP14) (Santa Cruz); anti-PARP (C2-10), anti-p27 (G173-524), anti-Caspasa 3 activa (C92-605) (Bd Biosciences); anti-USP14 (A300-919A) (Bethyl Laboratories); anti-HA (12CA5) (Roche). Bortezomib se obtuvo del Departamento de Oncolog^a del Hospital Karolinska, Suecia.

Cultivo celular. Las celulas de CMF7 se mantienen en MEM/suero de ternera fetal al 10%. Las celulas HCT-116 p53 /+, p53 -/-, Bcl-2 /+, PUMA -/- y BAX -/- se mantienen en medio modificado 5A de McCoy/suero de ternera fetal al 10%. Las HCT-116 p53 /+, p53 -/-, PUMA -/- y BAX -/- se generan como se describio (25). La lmea celular HCT-116 Bcl-2 /+ se genero transfectando celulas HCT-116 p53 /+ parentales con pCEP4 Bcl-2 (plasmido 16461 de Addgene) (26) y aislando clones de alta expresion. Las celulas FaDu y LLC3 se mantienen en medio DMEM alto en glucosa complementado con suero de ternera fetal al 10%, piruvato de Na, Hepes y aminoacidos no esenciales. Las celulas de carcinoma 4T1.12B se mantienen en medio RPMl suplementado con un 10% de suero de ternera fetal. La lmea celular informadora de proteasoma MelJuSo Ub-YFP se genero como se describe (12). Todas las celulas se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco/suero de ternera fetal al 10%. La lmea celular epitelial de la retina se genero como se describe (12). Todas las celulas se mantienen en medio Eagle modificado por Dulbecco/suero de ternera fetal al 10%. La lmea celular epitelial de la retina se genero como se describe (28). Todas las celulas se mantienen a 37°C en CO² al 5%.

Ensayos de proteasoma y de inhibicion de DUB. Los ensayos in vitro de actividad de proteasoma usando CP 20S (2 nM) (Boston Biochem) se realizan a 37°C en 100 pL de regulador de reaccion (Hepes 25 mM, EDTA 0,5 mM, SDS al 0,03%). Las muestras se incuban durante 10 minutos con el compuesto indicado seguido de la adicion de Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC o Boc-LRR-AMC 10 pM para la deteccion de actividad similar a la quimotripsina, similar a la caspasa y similar a la tripsina respectivamente. Para los ensayos de inhibicion de DUB se incuban RP 19S (5 nM), 26S (5 nM), UCH-L1 (5 nM), UCH-L3 (0,3 nM), USP2CD (5 nM), USP7CD (5 nM), USP8CD (5 nM) y BAP1 (5 nM) con el compuesto de la invencion seguido de la adicion de ubiquitina-AMC (1000 nM). La fluorescencia se monitorea utilizando el contador Wallac Multilabel o Tecan Infinite M1000 equipado con filtros de excitacion de 360 nm y de emision de 460 nm.

Ensayos de superposicion de sustrato. La electroforesis en gel nativo se realiza como se describe (29). En resumen, 4 pg de proteasoma 26S purificado (Boston Biochem) se mezclan con 10 o 50 pM del compuesto de la invencion y se incuban a 37°C durante 10 min. Las muestras se resuelven en PAGE no desnaturalizante al 4%. Los geles se sumergen en regulador de ensayo (Tris-HCL 20 mM, MgCb 5 mM, ATP 1 mM, Suc-LLVY-AMC 1 mM) y los proteasomas se visualizan bajo iluminacion UV.

Ensayo de escision de ubiquitina. El plasmido recombinante Ub-GFP pet19b Ub-M-GFP se genera como se describe (30). En resumen, Ub-GFP recombinante se purifica a partir de celulas de E. coli BL21 mediante purificacion por afinidad. Para ensayos de escision, se incuba RP 19S (25 nM) con NEM 10 mM, TPEN 250 pM o 50 pM del compuesto de la invencion durante 10 minutos, seguido de la adicion de Ub-GFP recombinante (200 nM). Las reacciones de desmontaje de la cadena de ubiquitina se realizan esencialmente como anteriormente, excepto que los tetrameros de ubiquitina unidos a K48 o K63 (50 ng) se sustituyen por Ub-GFP. El nivel de escision de Ub-GFP o el desensamblaje de ubiquitina se determina mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-ubiquitina. El sustrato Hdm2 ubiquitinado se genera de acuerdo con el protocolo Boston Biochem (K-200). Para el ensayo de escision, se incuba RP 19S (25 nM) con 50 pM del compuesto de la invencion o DMSO durante 10 minutos, seguido de la adicion de sustrato Hdm2 ubiquitinado (100 nM). La escision del sustrato Hdm2 ubiquitinado y Hdm2 ubiquitinado se determina mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-Hdm2.

Aislamiento del proteasoma: las celulas HCT-116 se tratan con bortezomib (100 nM) o el compuesto de la invencion (1 pM) durante 3 horas. Despues de la estimulacion, las celulas se lisan en HEPES 50 mM, pH 7,4, sacarosa 250 mM, MgCl² 10 mM, ATP 2 mM, DTT 1 mM y digitonina al 0,025%. Las muestras se sonican brevemente y se incuban durante 15 minutos en hielo. Los proteasomas de estas muestras se afslan de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Marcacion con UbVS de las DUB. Para el etiquetado de las DUB en lisados celulares, las celulas subconfluentes se recolectan mediante tripsinizacion, se lavan tres veces con PBS y se centrifugan a 1500 RPM durante 5 min. Los sedimentos celulares se lisan con regulador (HEPES 50 mM, pH 7,4, sacarosa 250 mM, MgCh 10 mM, ATP 2 mM, DTT 1 mM) en hielo durante 15 min. Los residuos se eliminan por centrifugacion y se marcan 25 pg de protema con HA-UbVS 1 pM durante 30 minutos a 37°C. Las muestras se resuelven mediante SDS-PAGE y se analizan mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.

Determinacion de la apoptosis y viabilidad celular. Para la determinacion de la apoptosis, se tratan las celulas HCT-116 p53 /+ parentales con las dosis crecientes del compuesto de la invencion durante 24 h. Las dosis de tratamiento se basan en la concentracion del farmaco que dio lugar a la apoptosis maxima durante un penodo de 24 h. Las celulas HCT-116 se siembran en placas de microtitulacion de 96 pozos a razon de 10.000 celulas por pozo y se incuban durante la noche. Las celulas se tratan con el farmaco indicado durante 24 h. Al final del penodo de incubacion, se agrega NP40 al medio de cultivo tisular al 0,1% y se analizan 25 pL del contenido de cada pozo utilizando el ELISA M30-Apoptosense® como se describio anteriormente (31). La viabilidad celular se determina midiendo la actividad de la fosfatasa acida o utilizando el metodo FMCA (32). Para la actividad de la fosfatasa acida, las celulas se siembran a razon de 5.000 celulas por pozo en placas de cultivo de 96 pozos y se incuban durante 12 horas a 37°C. Los compuestos se agregan a las celulas en medios de cultivo y se incuban durante 72 horas a 37°C. Las celulas se lavan con 200 pL de PBS caliente. Se anaden 100 pL de fosfato de para-nitrofenilo (pNPP, 2 mg/mL) en regulador de acetato de Na pH 5 (NaAc 0,1 M, Triton-X-100 al 0,1%) por pozo. Las celulas se incuban durante 2 h, despues de lo cual se detiene la reaccion mediante la adicion de NaOH 1 N. La absorbancia se mide a 405 nm. La citotoxicidad dependiente de la dosis de varias realizaciones del compuesto de la invencion se ilustra en las Figs. 1a-1o.

Para el ensayo de FMCA, las celulas se siembran en las placas de 384 pozos preparadas con el farmaco utilizando el robot de pipeteo Precision 2000 (Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT). Las placas se incuban durante 72 horas y luego se transfieren a un Sistema HTS SAIGAN Core integrado que consiste en un robot ORCA (Beckman Coulter) con una incubadora de CO² (Cytomat 2C, Kendro, Sollentuna, Suecia), modulo dispensador (Multidrop 384, Titertek, Huntsville, AL), modulo de lavado (ELx 405, Bio-Tek Instruments Inc), estacion de destapado, alojamiento de placas, lector de codigo de barras (Beckman Coulter), manipulador de lfquidos (Biomek 2000, Beckman Coulter) y lector multiusos (FLUOstar Optima, BMG Labtech GmbH, Offenburg, Alemania) para FMCA automatizada. El mdice de supervivencia (SI) se define como la fluorescencia de los pozos de prueba en porcentaje de controles con valores restados del blanco.

Analisis del ciclo celular. Para la determinacion del ciclo celular, las celulas HCT-116 se tratan con el compuesto de la invencion o las celulas DMSO se recogen mediante tripsinizacion, se lavan y se fijan en EtOH al 70% enfriado en hielo durante 12 h. Las celulas se resuspenden en una solucion de tincion que contiene yoduro de propidio (50 pg/mL) y RNasa A (0,5 pg/mL) en PBS. Las muestras se procesan en BD FACScalibur. El porcentaje de celulas en cada fase del ciclo celular se determina utilizando el software ModFit.

Ejemplo 1. Ejemplos de smtesis de realizaciones preferidas del compuesto de la invencion

Informacion general. Todos los disolventes utilizados fueron de grado HPLC o mejor. Cuando se requirieron condiciones anhidras, se agrego un exceso de tamices moleculares de 3 A al disolvente por lo menos 24 h antes de su uso para asegurar la sequedad. La resonancia magnetica nuclear (RMN) de 1H se registro en un espectrometro Bruker Advance DPX 400 a 400,1 MHz. Los espectros de masas de ionizacion por electroaspersion de baja resolucion se obtuvieron utilizando un espectrometro de masas Agilent en modo de ionizacion positiva. La cromatograffa ultrarrapida se realizo en gel de sflice 60 de Merck (malla 230-400). Los datos analfticos de LCMS se obtuvieron con un espectrometro de masas Agilent; Sistema Agilent 1100; A: columna C8 ACE (50 x 3,0 mm, 5 pM); gradiente: 10­ 97% de acetonitrilo en agua/TFA al 0,1%, en 3 minutos a razon de 1,0 mL/min, o B: columna C18 xBridge (3,5 pM, 50 x 3,0 mm), gradiente de 10% a 97% de acetonitrilo en 10 mM NH4HCO3 ( pH 10) en 3 min, 1 mL/min). Los nombres de las estructuras qmmicas se determinaron utilizando Marvin Scech 5.2.6, ChemAxon.

(3E, 5E)-3,5-Bis(fenilmetiliden)azepan-4-ona (# 1516) y (3E, 5E)-3,5-bis(4-metoxifenilmetiliden)-azepan-4-ona (# 1517)

Se disolvio hexahidro-4H-azepin-4-ona (0,45 g, 3,0 mmol), junto con cualquiera de benzaldehfdo (0,70 g, 7,0 mmol), 4-metoxibenzaldehndo (0,90 g, 7,0 mmol) o 4-clorobenzaldehHdo (0,92 g, 7,0 mmol) en acido acetico (10 mL). Luego se agrego gota a gota acido sulfurico (1 mL, concentrado) y las reacciones se agitaron durante 24 horas a temperatura ambiente. Se agrego agua (30 mL) y se filtro el precipitado y se seco al vacfo durante la noche. No se realizo ninguna purificacion adicional. El compuesto # 1516 se obtuvo con una pureza del 99% determinada por LCMS (Sistema A) MS ESI+ m/z 290 [M H]+. El compuesto # 1517 tambien se obtuvo con una pureza del 99% determinada por LCMS (Sistema A), MS ESI+ m/z 350 [M H]+. El compuesto # 1518 se obtuvo con una pureza del 91%; LCMS (Sistema A). MS ESI+ m/z 358 [M]+, 360 [M 2]+.

(3E, 5E)-3,5-bis(fenilmetiliden)-1-(prop-2-enoil)-azepan-4-ona (# 1520)

Se disolvieron (3E, 5E)-3,5-Bis(fenilmetiliden)azepan-4-ona (# 1516) (50,0 mg, 0,182 mmol) y acido acnlico (14,4 mg, 0,20 mmol), h Bt U (58,4 mg, 0,182 mmol), trietilamina (36,7 mg, 0,364 mmol) en DMF (2 mL) y se agito durante una noche. Se agregaron acetato de etilo y salmuera y se extrajeron los productos. Las capas organicas combinadas se secaron y se evaporaron. El producto crudo se diluyo con metanol y se purifico por HPLC preparativa. El compuesto # 1520 se obtuvo con una pureza del 96%, MS-ESI+ m/z 344 [M H]+.

Trifluoroacetato de (2R)-[(3E, 5E)-3,5-Bis(4-nitrofenilmetiliden)-4-oxo-1-(pirrolidin-2-il-carbonil)-azepan (# 1505)

Se disolvieron N-Boc-azepanona (100 mg, 0,47 mmol) y 4-nitrobenzaldehndo (156 mg, 1,03 mmol) en acido acetico (10 mL). Luego se agrego gota a gota acido sulfurico (1 mL concentrado) y las reacciones se agitaron a temperatura ambiente durante tres dfas. Luego se agregaron mas aldehndo y acido sulfurico y la reaccion se agito otras 24 horas, se agrego mas acido dos veces con 24 horas de diferencia. La reaccion se detuvo mediante la adicion de agua y los compuestos intermedios crudos precipitados se separaron por filtracion y se lavaron con agua. Despues de secar el producto al vado durante la noche, se pesaron 2 x 35 mg (0,09 mmol) del compuesto intermedio crudo en dos matraces y se disolvieron junto con succinato de monoetilo (14,8 mg, 0,10 mmol) en DCM/DMF (2 mL, 4:1). Se agrego trietilamina (19,3 |^j L, 0,14 mmol) y la mezcla se agito durante 5 minutos antes de la adicion de HATU (38,6 mg, 0,10 mmol). Despues de continuar la agitacion durante 12 horas, se agrego mas trietilamina y HATU y se continuo la agitacion durante 4 horas. Los disolventes se evaporaron y el residuo se purifico por HPLC preparativa. El residuo se disolvio en diclorometano/acido trifluoroacetico (5 mL, 4:1), se agito durante 40 minutos y se concentro nuevamente. El compuesto # 1505 se obtuvo con una pureza del 93% mediante LCMS (Sistema A). MS ESI+ m/z 477 [M H]+.

Ejemplo 2. Otros ejemplos de smtesis de realizaciones preferidas del compuesto de la invencion

Trifluoroacetato de (2R)-2-[(3E, 5E)-3,5-bis[(4-nitrofenil)metiliden]-4-oxoazepan-1-carbonil pirrolidinio (compuesto # 1505). Se disolvieron N-Boc azepan-4-ona (0,10 g, 0,47 mmol) y 4-nitrobenzaldel'ndo (156 mg, 1,0 mmol) en acido acetico (10 mL), se agrego gota a gota H²SO⁴ concentrado (1 mL) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante el fin de semana. Se agregaron mas aldehndo (156 mg) y H²SO⁴ (1 mL) y se continuo la agitacion a temperatura ambiente durante la noche. Se agrego otro mL de H²SO⁴ concentrado y la reaccion se agito durante la noche nuevamente. Se agrego H²SO⁴ concentrado una vez mas y la reaccion se agito hasta completar (durante dos semanas). Tras la adicion de agua, se formo un precipitado marron, se separo por filtracion, se lavo con agua y se seco al vacfo para obtener 339,5 mg de un compuesto intermedio 1 solido marron, que se uso sin purificacion adicional. El compuesto intermedio 1 (35 mg, 0,09 mmol) y N-Boc prolina (22 mg, 0,10 mmol) se disolvieron en DCM/DMF (4:1, 2 mL). Se agrego TEA (19 j L, 0,14 mmol) y la mezcla se agito durante 5 minutos, luego se agrego HATU (38,6 mg, 0,10 mmol) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se agrego mas TEA (19 j L, 0,14 mmol) y HATU (38,6 mg, 0,10 mmol), y la reaccion se agito durante otras 4 h. La mezcla de reaccion se concentro y luego se purifico por LC preparativa (40-70% de ACN en TFA al 0,1%) para obtener el producto como un solido amarillo. El solido se disolvio en DCM/TFA (4:1, 5 mL) y la solucion se agito a temperatura ambiente durante 40 minutos para eliminar el grupo protector BOC. La sal de TFA del producto se recupero como un solido amarillo de 93% de pureza. LCMS A: Rt 1,94/1,99, m/z [M H]+ 477,1, B: Rt 2,28.

Trifluoroacetato de (3E, 5E)-1-(4-etoxi-4-oxobutanoil)-3,5-bis[(4-nitrofenil)metiliden]-4-oxoazepon-1-io (compuesto # 1507). El compuesto intermedio 1 (35 mg, 0,09 mmol) y N-Boc prolina (22 mg, 0,10 mmol) se disolvieron en DCM/DMF (4:1, 2 mL). Se agrego TEA (19 j L, 0,14 mmol) y la mezcla se agito durante 5 minutos, luego se agrego HATU (38,6 mg, 0,10 mmol) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron mas TEA (19 j L, 0,14 mmol) y HATU (38,6 mg, 0,10 mmol) y la reaccion se agito durante otras 4 h. La mezcla de reaccion se concentro y luego se purifico por LC preparativa (40-70% de ACN en TFA al 0,1%) para obtener la sal de TFA del producto como un solido amarillo de 95% de pureza. LCMS A: Rt 2,48/2,50 m/z [M H]+ 508,1. B: Rt 2,48/2,52.

[3E, 5E)-3,5-bis[(4-clorofenil)metiliden]azepan-4-ona (compuesto # 1518). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (0,45 g, 3,0 mmol) y 4-clorobenzaldehndo (0,92 g, 6,6 mmol) en acido acetico (10 mL), se agrego gota a gota H²SO⁴ concentrado (1 mL) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 h. Despues de la adicion de agua (30 mL), se formo un precipitado, se separo por filtracion y se seco al vacfo para obtener el producto con una pureza del 91% como un solido amarillo. LCm S A: Rt 2,04 m/z [M]+ 358,1.

(3E, 5E)-3,5-bis(fenilmetiliden)-1-(prop-2-enoil)azepan-4-ona (compuesto # 1520). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (50 mg, 0,182 mmol), acido acnlico (14 j L, 0,20 mmol), TBTU (58 mg, 0,182 mmol) y TEA (37 mg, 0,364 mmol) en DMF (2 mL) y se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron salmuera y acetato de etilo y se separaron las fases. La fase organica se seco y los disolventes se evaporaron despues de la filtracion. El producto crudo se disolvio en acido acetico (2 mL) y H²SO⁴ (0,2 mL). Se agrego benzaldehfdo (50 j L) y la reaccion se agito durante 24 horas. Se agregaron metanol y agua a la mezcla, que se purifico mediante LC preparativa. El compuesto del tttulo se aislo con una pureza del 96% como un solido amarillo. lCm S A: Rt 2,68 m/z [M H]+ 344,1.

(3E, 5E)-3,5-bis(fenilmetiliden)-1-ciclobutancarbonilazepan-4-ona (compuesto # 1521). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (50 mg, 0,182 mmol), acido ciclobutmco ( l4 pL, 0,20 mmol), TBTU (58 mg, 0,182 mmol) y TEA (37 mg, 0,364 mmol) en DMF (2 mL) y se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron salmuera y acetato de etilo y se separaron las fases. La fase organica se seco y los disolventes se evaporaron despues de la filtracion. El producto crudo se disolvio en acido acetico (2 mL) y H²SO⁴ (0,2 mL). Se agrego benzaldehndo (50 pL) y la reaccion se agito durante 24 h. Se agregaron metanol y agua a la mezcla, que se purifico mediante LC preparativa. El compuesto del tttulo se aislo con una pureza del 96% como un solido amarillo. LCMS A: Rt 2,68 m/z [M H]+ 372,1.

[3E, 5E)-1-(2-ciclopropilacetil)-3,5-bis[(4-metoxifenil)metilidenolazepon-4-ona (compuesto # 1526). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (0,45 g, 3,0 mmol) y el 4-metoxibenzaldehHdo (0,90 g, 6,6 mmol) en acido acetico (10 mL), se agrego gota a gota H²SO⁴ concentrado (1 mL) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 h. Se agrego agua (30 mL). El precipitado se separo por filtracion y se seco al vado durante una noche. El material crudo (30 mg, 0,107 mmol), acido ciclopropilacetico (12 mg, 0,12 mmol), TBTU (41 mg, 0,13 mmol) y TEA (26 mg, 0,26 mmol) se disolvieron en DMF (2 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron metanol (1,5 mL) y agua (0,5 mL) y el producto se purifico por LC preparativa para obtener el producto solido con una pureza del 95%. LCMS A: Rt 2,51 m/z [M H]+ 432,2.

(3E, 5E)-5-[(3-nitrofenil)metiliden]-3-(fenilmetiliden)azepan-4-ona (compuesto # 1560). Se disolvieron N-Boc-azepan-4-ona (0,10 g, 0,47 mmol) y 3-nitrobenzaldel'ndo (156 mg, 1,0 mmol) en acido acetico (5 mL), se agrego H²SO⁴ concentrado (0,5 mL) gota a gota y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 dfas. Luego se agregaron mas H²SO⁴ concentrado (0,5 mL) y aldehfdo (156 mg, 1,0 mmol) y se continuo agitando a temperatura ambiente durante tres semanas. Se obtuvo una mezcla de los productos de mono y di-condensacion. La mezcla se purifico por cromatograffa en columna (DCM/metanol) para obtener el compuesto intermedio de amina, el compuesto intermedio 2 como un aceite marron (19 mg). El compuesto intermedio 2 se disolvio en acido acetico (1,5 mL) junto con benzaldehfdo. Se agrego H²SO⁴ concentrado (0,05 mL) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. Luego se agrego mas H²SO⁴ y se continuo la agitacion durante una semana. Se agrego mas aldehfdo (156 mg, 1,0 mmol) y H²SO⁴ y se continuo la agitacion durante 4 dfas adicionales. La mezcla de reaccion se concentro y se purifico por LC preparativa para obtener la sal de TFA del producto como un solido amarillo con una pureza del 98%. LCMS Sistema A: Rt 1,78 m/z [M H]+ 335,1, Sistema B: Rt 2,43/2,28.

(3E, 5E)-1-metil-3,5-bis[(4-nitrofenil)metiliden]azepon-4-ona (compuesto # 1563). Se disolvieron N-metilazepan-4-ona ■ HCl (50 mg, 0,30 mmol) y 4-nitrobenzaldelddo en acido acetico (5 mL) y se agito durante 10 minutos, luego se agrego H²SO⁴ concentrado (50 pL) lentamente y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se agrego mas H²SO⁴ concentrado (100 pL) y se continuo la agitacion a temperatura ambiente durante 6 h. Se agregaron 500 pL adicionales de H²SO⁴ concentrado y la reaccion se agito durante la noche. Se agregaron otros 350 pL de H²SO⁴ concentrado y se continuo la agitacion durante 5 h adicionales, penodo durante el cual se agrego H²SO⁴ adicional en dos porciones (500 pL y 250 pL). Luego se agrego agua (3 x volumen de reaccion) y la mezcla se agito hasta que se alcanzo la temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se extrajo con acetato de etilo (3 x volumen de reaccion). Las fases se separaron y la fase organica se concentro para obtener un aceite viscoso amarillo oscuro. El producto crudo se purifico por HPLc preparativa, (columna XBridge; eluyentes, regulador de carbonato de amonio 50 mM a pH 10 y metanol) obteniendose el producto del tftulo como un solido amarillo (26,3 mg). LCMS Sistema A: Rt 1,87 m/z [M H]+ 394,1, Sistema B: Rt 2,57.

(3E, 5E)-3,5-bis[(4-fluorofenil)metilidenel-1-propilazepan-4-ona (compuesto # 1574). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (0,25 g, 1,68 mmol) y 4-fluorobenzaldehndo (0,416 g, 3,36 mmol) en acido acetico (20 mL) y la solucion se agito durante 10 min, luego se agrego lentamente H2SO4 concentrado (200 pL) y la solucion se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se agrego mas H²SO⁴ concentrado (1 mL) y se continuo la agitacion a temperatura ambiente. Se agrego otro mL de H²SO⁴ concentrado despues de 6 h, y la reaccion se agito nuevamente durante la noche. Al dfa siguiente se agregaron 800 pL adicionales de H²SO⁴ concentrado y se continuo agitando durante un penodo de cinco dfas, durante los cuales se agregaron dos porciones de H²SO⁴ (1 mL y 0,5 mL) a la mezcla de reaccion. Luego se agrego agua (3 x volumen de reaccion) y la mezcla se agito hasta alcanzar la temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se extrajo con acetato de etilo (10 x volumen de reaccion). La fase organica se concentro por evaporacion. Se agrego agua al residuo. Se formo un precipitado y se separo por filtracion. El solido se lavo con agua y se seco al vacfo para obtener el compuesto intermedio 3 como un solido amarillo. Una porcion (15 mg, 0,05 mmol) del mismo se disolvio en DCE-Propanal (4 pL, 0,06 mmol), se agrego y la mezcla se agito durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, se agregaron NaBH(OAc)3 (15,7 mg, 0,07 mmol) y acido acetico (2,6 pL, 0,05 mmol) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. La reaccion se concentro y el producto crudo se purifico por LC preparativa obteniendo el producto (7,2 mg) con una pureza del 90%. LCMS Sistema A: Rt 2,02 m/z [M H]+ 368,1, Sistema B: Rt 3,21.

[3E, 5E)-3-[(4-metoxifenil)metiliden]-5-[(4-nitrofenil)metiliden]azepan-4-ona (compuesto # 1575). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (0,25 g, 1,68 mmol) y 4-nitrobenzaldehndo (253 mg, 1,68 mmol) en acido acetico (20 mL) y se agitaron durante 10 minutos, luego se concentraron. Se agrego lentamente H²SO⁴ concentrado (1 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 8 dfas. En los dfas 1-3 se agrego una porcion de H²SO⁴ concentrado por dfa (0,5 mL, 0,75 mL y 0,5 mL). Se agrego agua (2 x volumen de reaccion) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x volumen de reaccion). La fase organica se concentro por evaporacion y se seco para producir el compuesto intermedio 4 crudo. Una porcion del compuesto intermedio 4 (100 mg, 0,41 mmol) se disolvio en acido acetico (6 mL) y se agito durante 10 minutos, luego se agrego H²SO⁴ concentrado (0,6 mL) lentamente y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 6 dfas. Tras la adicion de agua, el producto precipito como un solido amarillo. El precipitado se separo por filtracion, se lavo con agua y se seco al vado para obtener el compuesto del tftulo en forma de un solido amarillo con una pureza del 98%. LCMS Sistema A: Rt 1,82 m/z [M H]+ 365,1, Sistema B: Rt 2,41. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) [ppm] = 2,97-2,99 (m, 2H), 3,41-3,44 (m, 2H), 3,83 (bs, 3H), 4,28 (s, 2H), 7,06-7,08 (d, 2H), 7,47 (s, 1H), 7,59-7,62 (d, 2H), 7,76 (s, 1H), 7,78-7,80 (d, 2H), 8,27-8,29 (d, 2H).

(3E, 5E)-5-[(4-fluorofenil)metiliden]-3-[(4-metoxifenil)metiliden]-1-metilazepan-4-ona (compuesto # 1577). Se disolvieron clorhidrato de N-metilazepan-4-ona (75 mg, 0,46 mmol) y 4-fluorobenzaldelddo en acido acetico (7 mL) y se agitaron durante 10 minutos, luego se agrego H²SO⁴ concentrado (350 j L) lentamente y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 8 dfas. Se agrego mas H²SO⁴ concentrado durante los dfas 2-4 (0,175 mL, 0,35 mL, 0,25 mL respectivamente). Se agrego agua y la solucion se extrajo con acetato de etilo (dos veces el volumen de la mezcla de reaccion). La fase organica se concentro para obtener el compuesto intermedio 5. Una porcion de este compuesto intermedio (35 mg, 0,15 mmol) y 4-metoxibenzaldehndo (17 j L, 0,15 mmol) se disolvieron en acido acetico (2,5 mL) y se agito durante 10 minutos, luego se agrego H²SO⁴ concentrado (0,20 mL) lentamente y la reaccion se agito durante cinco dfas. Se agrego agua (2 x volumen de reaccion) y la mezcla de reaccion se extrajo con acetato de etilo (2 x volumen de reaccion). La capa organica se concentro y se agrego agua. Se formo un precipitado y se filtro para obtener el producto del tftulo (11,2 mg) con una pureza del 91% como un solido amarillo. LCMS Sistema A: Rt 1,86 m/z [M H]+ 352,1, Sistema B: Rt 2,79.

(3E, 5E)-1-acetil-5-[(4-fluorofenil)metiliden]-3-[(4-etoxifenil)metiliden]azepon-4-ona (compuesto # 1579). Se disolvieron clorhidrato de azepan-4-ona (0,25 g, 1,68 mmol) y 4-fluorobenzaldelddo (179 j L, 1,68 mmol) en acido acetico (20 mL) y se agitaron durante 10 minutos, luego se agrego lentamente H²SO⁴ concentrado (1 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 8 dfas con la adicion de H²SO⁴ concentrado durante los primeros tres dfas (0,5 mL, 0,75 mL y 0,5 mL respectivamente). Se agrego agua (2 x volumen de reaccion) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x volumen de mezcla). La fase organica se concentro y se seco para obtener el compuesto intermedio 6 crudo. Una porcion de este compuesto intermedio (100 mg, 0,46 mmol) se disolvio en acido acetico (6 mL) y se agito durante 10 minutos, luego se agrego lentamente H²SO⁴ concentrado (0,6 mL) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 7 dfas. Se agrego agua (1 x volumen) y la mezcla se neutralizo con NaHCO3 acuoso saturado. El precipitado formado se separo por filtracion, se lavo con agua y se seco al vacfo para producir el compuesto intermedio 7 (31,5 mg) en forma de un solido amarillo con una pureza del 91%. LCMS Sistema A: Rt 1,85 m/z [M H]+ 338. El compuesto intermedio 7 (10 mg) se disolvio en DCM (1 mL) y se agrego TEA (5,0 j L, 0,04 mmol). La mezcla se agito durante 10 minutos, luego se agrego cloruro de acetilo (2,3 j L, 0,03 mmol) y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reaccion se lavo con agua, NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase organica se concentro para obtener el compuesto del tftulo (6,4 mg) en forma de un solido amarillo con una pureza del 90%. LCMS Sistema A: Rt 2,35 m/z [M H]+ 380,1, Sistema B: Rt 2,37. RMN de 1H (400 MHz, CDCla): [ppm] = 1,70, 1,90, 1,98 y 1,99 ( 4 x s, 3H, CH³CO-, senales de los dos regioisomeros y sus rotameros de acetato), 2,89-3,01 (m, 2H), 3,68-3,77 (m, 2H), 3,79, 3,79, 3,79, 3,08 (4 x s, 3H, -OMe, senales de los dos regioisomeros y sus rotameros de acetato), 4,65-4,68 (m, 2H), 7,0-7,04 y 7,098-7,103 (2 x m, 2H), 7,22-7,30 (m, 3H), 7,48-7,62 (m, 5H).

(3E, 5E)-5-[(4-clorofenil)metiliden]-3-[(4-nitrofenil)metiliden]azepan-4-ona (compuesto # 1583). Se disolvieron clorhidrato de N-metilazepan-4-ona (75 mg, 0,46 mmol) y 4-clorobenzaldehndo (64 mg, 0,46 mmol) en acido acetico (7 mL) y se agitaron durante 10 min, luego se agrego H²SO⁴ concentrado (350 j L) lentamente y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 8 dfas. Se agrego mas H²SO⁴ concentrado durante los dfas 2-4 (0,175 mL, 0,35 mL, 0,25 mL respectivamente). Se agrego agua (2 x volumen de reaccion) y la solucion se extrajo con acetato de etilo (2 x volumen de reaccion). La fase organica se concentro para obtener el compuesto intermedio 8. Una porcion del compuesto intermedio (35 mg, 0,14 mmol) y 4-nitrobenzaldel'ftdo (69,5 mg, 0,46 mmol) se disolvieron en acido acetico (2,5 mL) y se agito durante 10 minutos, luego se agrego H²SO⁴ concentrado (200 j L) lentamente y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 5 dfas. Se agrego mas H²SO⁴ concentrado (0,2 mL) y la agitacion continuo durante 5 dfas mas. Se agrego agua (2 x volumen de reaccion) y la solucion se extrajo con acetato de etilo (2 x volumen de reaccion). La fase organica se concentro y el residuo se purifico por LC preparativa para obtener el compuesto del tftulo (1,8 mg) en forma de un solido amarillo de 94% de pureza. Lc MS Sistema A: Rt 1,98/2,04 m/z [M H]+ 383,1, Sistema B: Rt 2,82/2,98.

Abreviaturas

Boc terc-butiloxicarbonilo

ACN acetonitrilo

DCM diclorometano

AGT acido trifluoroacetico

DMF dimetilformamida

TEA trietilamina

Rt tiempo de retencion

TBTU tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

rt temperatura ambiente

LC cromatograffa Kquida

EDC 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida

HATU hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio;

DCE 1,2-dicloroetano

Ejemplo 3. Composicion farmaceutica A (suspension acuosa). El compuesto de la invencion (25 mg) se disuelve en 1 mL de dimetilsulfoxido. La solucion se agrega gota a gota a 10 mL de solucion salina agitada vigorosamente. La suspension formada, que se puede estabilizar agregando 1% en peso de PVP, se puede usar para administracion intramuscular, intravenosa o subcutanea.

Ejemplo 4. Composicion farmaceutica B (comprimido). Los comprimidos para administracion oral se producen mezclando 2,0 g del compuesto de la invencion (polvo, < 10 m j, 90%) con celulosa microcristalina (1,30 g), almidon de mafz (0,50 g), sflice (0,20 g), estearato de Mg (0,12 mg). La mezcla se comprime en seco en comprimidos de 400 mg, que estan recubiertos con azucar.

Ejemplo 5. Composicion farmaceutica C (solucion). El compuesto de la invencion (10 mg) se disuelve en 0,5 mL de Cremophor EL (BASF Corp.) y se agrega etanol absoluto hasta 1,0 mL. La solucion transparente se llena en viales de vidrio para inyeccion.

Ejemplo 6. Composicion farmaceutica D (solucion). Para la administracion intraperitoneal en estudios con animales, se preparo una solucion madre disolviendo el compuesto de la invencion hasta una concentracion de 2 mg/mL en Cremophor EL/polietilenglicol 400 en proporcion 1:1 (v/v) a temperatura ambiente o calentando hasta aproximadamente 80°C asistida por ultrasonido. Una parte alfcuota de la solucion madre se diluyo 1:10 con solucion salina al 0,9% y se uso inmediatamente para inyeccion IP.

Ejemplo 7. Composicion farmaceutica E (solucion). Para administracion intraperitoneal, se preparo una solucion madre de Kolliphor HS15 al 25% en peso al fundir todo un recipiente de Kolliphor HS15 (Sigma 42966) calentando a 60°C y diluyendo con agua desionizada hasta 25% p/p. Al compuesto # 1570 (18,0 mg) en un tubo de muestra de 10 mL, se le agregaron 10,0 mL de la solucion madre y el tubo se agito con agitacion tipo vortice, se trato con ultrasonido a aproximadamente 50°C durante aproximadamente 2 h, y ocasionalmente se calento a aproximadamente 83°C. La solucion transparente obtenida se filtro de forma esteril a traves de un filtro de jeringa de celulosa de 0,2 jm antes de la inyeccion. Por el mismo procedimiento se prepararon soluciones de los compuestos # 1546 y # 1571; sin embargo, estos compuestos no estaban completamente disueltos. Se peso el residuo no disuelto y se dedujo el peso del peso inicial del compuesto (18 mg). Se encontro que las soluciones preparadas (10 mL) conteman 8,5 mg y 11,0 mg, respectivamente, de los compuestos # 1546 y # 1571.

Ejemplo 8. Composicion farmaceutica F (solucion). Para administracion intraperitoneal, se preparo una solucion madre de 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina (Aldrich 332593) disolviendo la ciclodextrina en agua desionizada hasta una concentracion de 30% p/p. Al compuesto # 1649 (15,0 mg) en un tubo de muestra de 10 mL, se le agregaron 10 mL de la solucion madre. El tubo se agito con agitacion tipo vortice, se trato con ultrasonidos a aproximadamente 50°C durante aproximadamente 2 h, y ocasionalmente se calento a aproximadamente 83°C. La solucion obtenida se filtro de forma esteril a traves de un filtro de jeringa de celulosa de 0,2 jm antes de la inyeccion. Se determino el peso del compuesto # 1659 residual no disuelto y se uso para corregir la concentracion de la solucion filtrada hasta el 82,5% de la concentracion pretendida. Por el mismo procedimiento, se preparo una solucion del compuesto # 1546.

Ejemplo 9. El compuesto de la invencion induce la inhibicion del proteasoma. La lmea celular informadora MelJuSo Ub-YFP, que esta modificada para acumular protema fluorescente amarilla (YFP) tras la inhibicion del proteasoma (12), se uso para la evaluacion del compuesto. La acumulacion de YFP se midio durante 48 horas en un sistema IncuCyte-FLR (Essen Bioscience, Essen, Reino Unido), que es un microscopio de fluorescencia automatizado. Se uso el numero de celulas positivas por campo como medida de la inhibicion del proteasoma.

Ejemplo 10. Determinacion de la solubilidad de los compuestos de la invencion en medios acuosos. En los diagramas de las Figs.2a-2e, la solubilidad se expresa como Log S (mmol/mL; software ACD/Labs Inc.) La solubilidad se determina en regulador acuoso a diversos valores de pH y predicho para agua pura a 25°C. El algoritmo utiliza un conjunto de > 6.800 compuestos como referencia. Los diagramas muestran que las azepanonas de la invencion pueden tener una solubilidad sustancialmente mayor, tal como por un factor 2 o mas, en medios acuosos a pH fisiologico, tal como a un pH de 6 a 8, en particular de 7,0 a 7,5, en comparacion con las piperidin-4-onas correspondientemente sustituidas.

Ejemplo 11. Los azepanes/azepanonas de la invencion exhiben una mayor citotoxicidad que las piperidinas/piperidin-4-onas estructuralmente correspondientes.

Las Figuras 3b, 3d, 3f son diagramas que ilustran la citotoxicidad de los compuestos de la invencion nos. 1546, 1547 y 1570 con una fraccion de anillo de 7 miembros en comparacion con los compuestos estructuralmente correspondientes no comprendidos en la invencion con una fraccion de anillo de 6 miembros. Su induccion de citotoxicidad dependiente de la dosis se determino despues de 72 horas de exposicion continua del compuesto a la lmea celular informadora HCT-116. Las celulas tratadas se compararon con los controles no tratados. La citotoxicidad se visualiza como un mdice de supervivencia (SI) en el intervalo de aproximadamente 90% de SI hasta aproximadamente 0% de SI en funcion de la concentracion del compuesto. De las Figuras se desprende que los compuestos de la invencion son mas citotoxicos que los compuestos de referencia, ya que producen el mismo nivel de citotoxicidad a una concentracion mas baja.

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23. Reyes-Turcu, F E et al., Regulation and cellular roles of ubiquitin-specific deubiquitinating enzymes. Annu Rev Biochem 78, 363-397, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation &list_uids=19489724 (2009).

24. Koulich, E et al., Relative structural and functional roles of multiple deubiquitylating proteins associated with mammalian 26S proteasome. Mol Biol Cell 19, 1072-1082, doi:E07-10-1040 [pii]10.1091/mbc.E07-10-1040 (2008).

25. Bunz, F. et al., Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 282, 1497-1501 (1998).

26. Pietenpol, J A et al., Paradoxical inhibition of solid tumor cell growth by bcl2. Cancer Res 54, 3714-3717 (1994).

27. Bodnar, A G et al., Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279, 349­ 352 (1998).

28. Lamb, J et al., The Connectivity Map: using gene-expression signatures to connect small molecules, genes, and disease. Science 313, 1929-1935, doi:313/5795/1929 [pii] 10.1126/science.1132939 (2006).

29. Elsasser, S et al., Characterization of the proteasome using native gel electrophoresis. Methods Enzymol 398, 353­ 363, doi:S0076-6879(05)98029-4 [pii]10.1016/S0076-6879(05)98029-4 (2005).

30. Guterman, A & Glickman, M H, Complementary roles for Rpnll and Ubp6 in deubiquitination and proteolysis by the proteasome. J Biol Chem 279, 1729-1738, doi:10.1074/jbc.M307050200M307050200 [pii] (2004).

31. Hagg, M et al., A novel high-through-put assay for screening of pro-apoptotic drugs. Invest New Drugs 20, 253-259 (2002).

32. Lindhagen, E et al., The fluorometric microculture cytotoxicity assay. Nat Protoc 3, 1364-1369, doi:nprot.2008.114 [pii]10.1038/nprot.2008.114 (2008).

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la estructura general S-1

en el que,

R1, R2 en el doble enlace d1 y R3, R4 en el doble enlace d2 pueden, independientemente entre sf, tener una configuracion opuesta a la de la formula S-1,

X es CO o CS;

R1 y R3 son H;

R2 y R4 son, independientemente entre sf, H; alquilo C¹-⁶ ; alquil C¹-⁵-CO; fenilo o heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido con 1-3 de: alquilo C¹-⁶ , alcoxi C¹-⁶ , CN, -CoO-alquilo C¹-⁶ , COOH, NO² , F, Cl, CF³ , NH² , NH-alquilo C¹-⁶ , N(alquilo C¹-⁶)² , CONR7R8, con la condicion de que uno o mas de H en alquilo y alcoxi pueden estar sustituidos con fluor;

R5 es cualquiera de H; alquilo C¹-⁶ ; alquenilo C²-⁶ ; alcoxi C1-3-alquil C²-⁶-; alcoxi C1-3-alquenil C²-⁶-; aril-C⁰-⁶-alquil-; heteroaril-alquil C⁰-⁶-; heterociclilo-alquil C⁰-⁶-; cicloalquil-alquil C⁰-⁶-;

-alquil C¹-⁶-COO-alquilo C¹-⁶ ; -alquil C²-⁶-ariloxi; COR6;

R6 se selecciona de: alquilo C¹-⁶ ; alquenilo C²-⁶ ; alcoxi C¹-⁶ ; alcoxi C1-3-alquilo C¹-⁶-;

alcoxi C1-3-alquenilo C¹-⁶-; aril-alquilo C⁰-⁶-; heteroaril-alquil C⁰-⁶-; heterociclilo-alquil C⁰-⁶-; cicloalquil-alquil C⁰-⁶-; -alquil C¹-⁶-COO-alquilo C¹-⁶ ; NH² ; -NH-alquilo C¹-⁶ ; -N(alquilo C¹-⁶)² ; -alquil C⁰-⁶-ariloxi;

R7, R8 son, independientemente entre s^ H o alquilo C¹-³.

2. El compuesto de la reivindicacion 1, en el que X = CO.

3. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que R2 y R4 son fenilo sustituido en una o mas de las posiciones 3, 4, 5.

4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R5 es COR6 y R6 es alquilo C^1-6 o alquenilo C²-6.

5. El compuesto de la reivindicacion 4, en el que R6 es alquenilo C²-⁶.

6. El compuesto de la reivindicacion 4, en el que R6 es alquilo C¹-⁶.

7. El compuesto de la reivindicacion 1, en el que R1, R2 en el enlace doble d1 y R3, R4 en el enlace doble d2 tienen la configuracion de la estructura S-1,

X es CO o CS;

R1 y R3 son, independientemente entre sf, H;

R2 y R4 son, independientemente entre sf, H; alquilo C¹-⁶ ; alquilo C¹-⁵-CO; fenilo o heteroarilo de 6 miembros sustituido con 1-3 de: CN, NO² , F, Cl, NH² , NH-alquilo C¹-⁶ , N(alquilo C¹-⁶)² ; CO-alquilo C¹-⁶ ;

R5 es H, alquilo C¹-⁶ , alquenilo C²-⁶ , alcoxi C1-3-alquilo C¹-⁶ , alcoxi C1-3-alquenilo C¹-⁶ , arilo, heteroarilo, heterociclilo, alquil C¹-⁶-heteroarilo, alquil C¹-⁶-heterociclilo, alquil C¹-⁶-cicloalquilo, alquilarilo C¹-⁶ , CO-alquilo C¹-⁶ , CO-vinilo, CO-alilo, CO-arilo, CO-cicloalquilo.

8. El compuesto de la reivindicacion 7, en el que X es CO.

9. El compuesto de la reivindicacion 7 u 8, en el que R2 y R4 son fenilo sustituido.

10. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que R5 se selecciona entre CO-alquilo C¹-⁶ , CO-cicloalquilo, CO-vinilo, CO-alilo.

11. El compuesto de la reivindicacion 10, en el que R5 es CO-vinilo.

12. El compuesto de la reivindicacion 10, en el que R5 es CO-alquilo C¹-⁶.

13. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vetnculo farmaceuticamente aceptable.

14. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 13, en forma de un comprimido o capsula u otra preparacion de dosis unica para administracion oral.

15. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 13, en forma de una solucion o suspension en un vetnculo lfquido farmaceuticamente aceptable para inyeccion o infusion.

16. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 15, para infusion o inyeccion intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea.

17. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o la composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, para uso como un medicamento.

18. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o la composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, para uso en el tratamiento del cancer.

19. El compuesto o la composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que el cancer se selecciona de mieloma multiple, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de pancreas.

20. El compuesto o composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 19, en el que la dosis farmacologicamente eficaz es de 0,0001 g/kg a 0,1 g/kg de peso corporal, en particular de 0,001 g/kg a 0,01 g/kg de peso corporal, teniendo en cuenta si el agente se administra sistemicamente o localmente.