SE1200735A1 - Sätt att inhibera deubiqutineringsaktivitet - Google Patents

Abstract

Användning av en förening med den allmänna strukturen A. för behandling av cancer hos en patient som är resistent mot behandling med bortezomib eller ett medel som har samma mekanism för inhibering av deubiquitinerande aktivitet som bortezomib.

Description

15 20 25 UPPFINNINGENS ÄNDAMÃL Ett ändamål för uppfinningen är att ange en förening för användning vid ett förfarande för behandling av cancer hos en patient genom inhibering av deubiquitinerande aktivitet, i synnerhet mot kemoterapi enligt teknikens ståndpunkt resistent cancer.

Ett föremål av uppfinningen är i synnerhet att ange en sådan förening för behandling av cancer hos en patient som är resistent mot behandling med bortezomib eller ett medel som samma mekanism för inhibering av deubiquitinerande aktivitet som bortezomib.

Ett ytterligare föremål för uppfinningen är att ange ett motsvarande förfarande. Ännu ett föremål för uppfinningen är att ange en farmaceutisk beredning som innehåller föreningen.

Ytterligare föremål för uppfinningen kommer att framgå ur en genomgång av den följande sammanfattningen av uppfinningen, ett antal föredragna utföringsformer därav som åskådliggörs i en ritning och de bifogade patentkraven.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN I enlighet med föreliggande uppfinning anges en förening med den allmänna strukturen A A som förmår upphäva den deubiquitinerande (DUB) aktiviteten av 195 RP DUBs. 10 15 20 25 30 Föreningen enligt uppfinningen erkänns tillhöra en ny klass av proteasominhibitorer, som företräds av den kända föreningen b-AP15.

I enlighet med föreliggande uppfinning inhiberar föreningen enligt uppfinningen i synnerhet aktiviteten av två 195 DUBs, UCHL5 och USP14, medan den inte påverkar icke- proteasomala DUBs. Mera specifikt visar föreningen enligt uppfinningen effekt vid behandling av en cancertumör som är resistent mot kemoterapi enligt teknikens ståndpunkt genom förhöjt uttryck av den inneboende celldödinhibitorn Bcl-2.

Mera specifikt och i enlighet med föreliggande uppfinning visar föreningen enligt uppfinningen effekt vid behandling av cancer som är resistent mot behandling med bortezomib eller ett medel som uppvisar samma inhiberande effekt på deubiquitinerande aktivitet som bortezomib. Hos ett annat föredraget utföringsexempel har föreningen effekt vid behandling av cancer som är resistent mot vilket i tekniken känt läkemedel mot cancer som helst.

I denna ansökan avser "resistent mot behandling” att behandlingen av en cancer med en enkel dos av ett läkemedel mot cancer inte väsentligen minskar den omedelbart före behandlingen observerade tillväxthastigheten hos cancern, såsom en minskning av tillväxthastigheten per månad av ej mer än 25 % eller 10 % eller även 5 %. I synnerhet har förfarandet enligt uppfinningen hög effekt vid behandling av cancer hos en patient som, efter att ha tagit emot en eller fler, i synnerhet två eller tre standarddoser bortezomib eller ett medel med samma celldödalstrande aktivitet som bortezomib eller vilket annat läkemedel mot cancer som helst, uppvisar en månatlig tillväxthastighet av cancern på ej mer än 25 % eller 10 % eller även 5 %, såsom ej någon positiv tillväxthastighet alls, i jämförelse med cancerns tillväxthastighet som observerats omedelbart före engångsbehandlingen eller de senaste två eller tre eller fler behandlingarna. Ett accepterat mått på tumörtillväxt är volymändringen hos en icke spridd cancer.

Ett exempel för en cancer som är behandlingsbar med förfarandet enligt uppfinningen är multipelt myelom. Andra exempel på behandlingsbara cancer omfattar lungcancer, 10 15 20 25 30 4 prostatacancer, coloncancer, äggstockscancer, pankreascancer, bröstcancer, cancer i nacke eller huvud.

I föreningen enligt uppfinningen av den allmänna strukturen A väljs R1, Rz, R3, R4 oberoende av varandra från gruppen bestående av H, C1.8-alkyl, OCH;- alkyl, CLg-acyl, aryl eller heteroaryl substituerad med 0-5 oberoende av varandra valda Rg, Cgß-cykloalkyl, CH2-C3.8-cyk|oalkyl, CHZCO-alkyl, C1-4-alky|aryl, C1.4-alky|heteroary|, OH, CN, COOH, vinyl, allyl; med bestämningen att endast en av R1,R2 in (R1,R2) och en av R3,R4 hos (R3,R4) är aryl eller heteroaryl substituerad med 0-5 Rs; X är CO eller CS; RS väljes från gruppen bestående av H, OH, NHZ, Cbg-alkyl, CM-alkenyl, CLg-alkoxy, CH;- alkoxy-CLS-alkyl, C1.3-alkoxy-C1_6-alkenyl, CO-alkyl, aryl, heteroaryl, heterocyklyl, CH-alkyl- heteroaryl, CH-alkyl-heterocyklyl, CLg-alkyl-cykloalkyl, C1-8-a|kyl-ary|, CHZCORQ, CN, COOH, CO-alkyl, CO-aryl, CO-cykloalkyl, CONRQ , COORQ, CO-vinyl, CO-allyl; Rg väljes från gruppen bestående av OH, CN, COOH, N02, F, Cl, Br, I, CF3, CHF2, NHZ, NHRg, N(R9);, NHCORQ, NHCON(R9)2, NHCOORg, NHSOgRg, CHO, CO-alkyl, COOMe, COOEt, OMG; Rg är alkyl, aryl, heteroaryl, heterocyklyl eller cykloalkyl.

Det är föredraget att R; och R4 är H. Det är också föredraget att R1 and R; är samma, i synnerhet substituerad eller icke-substituerad aryl, mest föredraget fenyl. X är företrädesvis CO.

Ifall något av R1,R2 i (R1,R2) och en av R3,R4 i (R3,R4) är fenyl, är den företrädesvis monosubstituerad i4-position, i synnerhet med N02, halogen eller annan elektron- attraherande substituent.

Exempel på synnerligen föredragna utföringsexempel av uppfinningen är: 10 15 20 25 o o N \o N o” H H A a O ÛAÜÛÜ N X O C O O \ *fl mm . .o o' . .._o ii N / i» *ii N i' F * o' O 0% o O cl; o L N F*\O Û\/ F r M o I denna ansökan avser ”aryl” ett monocykliskt eller bicykliskt kolväte med från 6 till 10 O: kolatomer och som innefattar minst en aromatisk ring; exempel därav innefattar fenyl, pentalenyl, indenyl, indanyl, isoindolinyl, chromanyl, naftyl, fluorenyl, antryl, fenantryl and pyrenyl. "Aryloxy" avser en till en syreatom bunden arylgrupp. ”Heteroaryl” representerar ett mono-, bi- eller tricycliskt ringsystem, som innefattar minst en aromatisk ring, varvid systemet har från 5 till 14, företrädesvis från 5 till 10 ringatomer, av vilka ett eller fler väljes oberoende av varandra från syre, kväve, svavel. ”Heteroaryloxy” avser en till en syreatom bunden heteroarylgrupp. Exempel för heteroarylringar är pyrrol, imidazol, thiofen, furan, tiazol, isotiazol, tiadiazol, oxazol, isoxazol, oxadiazol, pyridin, pyrazin, pyrimidin, pyridazin, pyrazol, triazol, tetrazol, chroman, isochroman, kinolin, kinoxalin, isokinolin, ftalazin, cinnolin, kinazolin, indol, isoindol, indolin (d v s 2,3-dihydroindol), isoindolin (d v s 1,3- dihydroisoindol), bensotiofen, bensofuran, isobensofuran, bensoxazol, 2,1,3-bensoxadiazol, bensopyrazol; bensotiazol, bensimidazol, indazol, bensodioxan, indan, 1,2,3,4-tetrahydro- kinolin, 3,4-dihydro-2H-1,4-bensoxazin, 1,5-naftyridin, 1,8-nafthyridin, pyrido[3,2-b]tiofen, tetralin, metylendioxyindol, 2,3-dihydrobensofuran, 2,3-dihydrobensotiofen, 1,3-bens- oxatiole, acridin, fenazin och xanthen. Heteroaryl kan vara valfritt substituerad med 1 till 5 substituenter valda från gruppen bestående av OH, CN, COOH, N02, F, CI, Br, I, NHZ, NH(C1- 3), N(C1-3)2, NC1-3alkylC1-3alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-cykloalkyl, C00-alkyl, COO-aryl, 10 15 20 25 30 6 COO-cykloalkyl, COO-heterocykel, cykloalkyl, aryl, heterocykel, heteroaryl. ”CLG-alkyl” och "C1.8-alkyl" betecknar en rak eller förgrenad grupp med från 1 till 6 eller 1 till 8 kolatomer; exempel därav inkluderar metyl, etyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, sek-butyl, t- butyl samt pentyl och hexyl med rak eller förgrenad kedja. ”CLS -alkoxy” and “C1_8-alkoxy” betecknar raka eller förgrenade alkoxigrupper med från 1 till 6 eller 1 till 8 kolatomer; exempel därav inkluderar metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, iso-butoxi, sek- butoxi, t-butoxi och pentoxi och hexoxi med rak eller förgrenad kedja. "Halogen" är vilket som helst av fluor, klor, brom, jod. ”CLG-alkyltio” avser C1-6-alkyl-S-, vari alkyldelen är såsom definierad i det föregående; exempel därav inkluderar metyltio, etyltio, n-propyltio, isopropyltio, n-butyltio, isobutyltio, sek-butyltio, t-butyltio pentyltio and hexyltio med rak eller förgrenad kolkedja. ”CM-alkoxy-CH-alkyl" anger en CH-alkoxigrupp, såsom ovan angiven, fäst vid en CM-alkylgrupp, såsom ovan angiven; exempel därav inkluderar 2- metoxietyl, 2-etoxietyl och 2-isopropoxietyl. ”C2.4-alkenyloxi-CLS-alkyl” avser en CM- aIkenyl-O-CLG-alkylgrupp vari C2-6-a|kyl och CM-alkenyl är såsom ovan angivna. Exempel för CM-alkenyloxi-CLB-alkylgrupper inkluderar 2-(vinyloxi)ety| och 2-(2-propenyloxi)etyl.

”Heterocyklyl” avser ett icke-aromatisk mättat eller omättat, i synnerhet ett helt mättat, monocykliskt ringsystem med från 4 till 7 kolatomer, av vilka en eller fler kan bytas ut mot en heteroatom vald från O, N, S. Exempel för heterocyklyl inkluderar piperidinyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrofuranyl, azepinyl, azetidinyl, pyrrolidinyl, morfolinyl, imidazolinyl, tiomorfolinyl, pyranyl, 1,3-dioxolanyl, 1,4-dioxanyl, piperazinyl. Svavelatomen kan föreligga i oxiderat tillständ, såsom i SO eller S02. Ett exempel för en heterocyklisk grupp innehållande svavel i ett oxiderat tillstånd är tiomorfolin-1,1-dioxid.

Förfarandet enligt uppfinningen innefattar administrering till den behövande patienten av en farmakologisk verksam dos av föreningen enligt uppfinningen i en lämplig farmaceutisk bärare, såsom exempelvis i en vattenhaltig bärare eller i en bärare, som innefattar dimetyl sulfoxid eller N,N-dimetylacetamid. Administreringen kan ske på vilken lämplig väg som helst, såsom genom intravenös eller intramuskulär injektion eller infusion. Andra administreringsförfaranden, i synnerhet per os, har också tagits i beaktande, såsom i form av tabletter eller hårda eller mjuka gelatinkapslar. 10 15 20 25 30 Fackmannen vet hur man bestämmer en farmakologisk verksam dos. En sådan dos kan vara från 0,01 g/kg kroppsvikt till 0,1 g eller 1,0 g eller mer/kg kroppsvikt, varvid hänsyn tages till huruvida medlet administreras systemiskt eller lokalt.

I överensstämmelse med DUB-inhiberingen förorsakar behandling med föreningen enligt uppfinningen ackumulering av polyubiquitinerade proteiner av högre molekylvikt i jämförelse med behandlingen med bortezomib och resulterar i ett kraftigare proteinsvar. I enlighet med uppfinningen har man också funnit, att induceringen av celldöd genom föreningen enligt uppfinningen skiljer sig från induceringen genom bortezomib genom att vara okänslig mot störning av p53 tumörsuppressorn och okänslig mot förhöjt uttryck av celldödinhibitorerna Bcl-2, BAX och PUMA.

I enlighet med föreliggande uppfinning inhiberar behandling med föreningen enligt uppfinningen tumörtillväxt hos humana och murina in vivo tumörmodeller för bröst-, lung-, kolon-, huvud- och nackkarcinom samt inhiberar infiltreringen hos en modell för akut myeloid leukemi (AML). Följaktligen anges inhiberingen av DUB-aktiviteten hos 19S RP genom föreningen enligt uppfinningen vara en realistisk valmöjlighet vid behandling av cancer hos människa och djur.

Mera specifikt anges således ett förfarande för behandling av cancertumör hos en person, som är resistent mot kemoterapi enligt teknikens ståndpunkt och som innefattar administrering av en farmakologiskt verksam dos av föreningen enligt uppfinningen i en farmaceutiskt godtagbar bärare. Förfarandet enligt uppfinningen är synnerligen av nytta vid behandling av en patient som har en tumör vars celler är resistenta mot behandling på grund av ett förhöjt uttryck av den inneboende apoptosinhibitorn Bcl-2.

I enlighet med en föredragen aspekt av uppfinningen innefattar 19S RP DUBs UCHL5 och USP14. I enlighet med en annan föredragen aspekt av uppfinningen påverkas den deubiquiniterande (DOB) aktiviteten av icke-proteasomala DUBs av föreningen enligt uppfinningen. Föreningen enligt uppfinningen kan administreras löst eller suspenderad i en vätskeformad bärare på vilken lämplig väg som helst, såsom genom intravenös, 10 15 20 25 30 intramuskulär och subkutan administrering. Alternativt eller dessutom kan föreningen enligt uppfinningen administreras peroralt, såsom i form av en tablett eller kapsel. En användbar farmakologisk verksam dos av föreningen enligt uppfinningen är från 0,01g/kg kroppsvikt till 0,1 g eller 1,0 g eller mer/kg kroppsvikt, varvid hänsyn tages till huruvida föreningen administreras systemiskt eller lokalt. Förfarandet kan innefatta att välja ut en person för behandling genom att bestämma cancerns tillväxthastighet före eller efter administrering av bortezomib eller av en aktiv princip, som har samma inhiberingsmekanism av deubiquiniterande aktivitet som bortezomib eller förutnämnda andra läkemedel mot cancer, varvid en positiv tillväxthastighet, i synnerhet en tillväxthastighet av mer än 5 % eller mer än 10 % eller mer än 25 % per månad konstituerar en urvalsmarkör.

Föreningen enligt uppfinningen blockerar den cellulära proteasomfunktionen, såsom bekräftat genom användning av en rapportörcelllinje, som uttrycker ubiquitin taggat till ett gult fluorescerande protein (UbG76V-YFP), som är ett konstitutivt mål for proteasomal nedbrytning (12). lmmunoblotting and flödescytometri visade en dosberoende ökning av Ub-YFP reportern (|C50=0.8 pM), vilket indikerar en försämrad proteasomfunktion. På grund av att en inhibering av proteasomfunktionen kännetecknas av defekter i ubiquitinomsättningen (13) behandlades colonkarcinom HCT116 celler med föreningen enligt uppfinningen och nivån av ubuquitinkonjugeringen analyserades genom lmmunoblotting. Behandlingen orsakade en snabb tidsberoende ackumulering av polyubiquitinerade proteiner med högre molekylvikt ijämförelse med ZOS CP inhibitorn bortezomib, vilket tyder på att föreningen enligt uppfinningen inhiberar en alternativ gren hos UPS. Polyubiquitinökningen sammanhänger med ett starkt proteotoxiskt svar som kännetecknas genom inducering av HSPA6 (Hsp70B'), HSPA1B och DNAJB1(Hsp40).

Omsättningen av många cellregulatoriska proteiner styrs av UPS, inklusive inhibitorerna av det cyclinberoende kinaset p2lcipl, p27Kíp1 och tumörsuppresorn p53 (4). Behandlingen med föreningen enligt uppfinningen ökar deras nivåer på ett dosberoende sätt utan att ändra nivåerna av ornitindekarboxylas 1 (0DC1), ett ubiquitinoberoende proteasomsubstrat (8). Ökningen av regulatorer av cellcykeln gick hand i hand med 10 15 20 25 30 9 tillväxtstoppet vid G2/M gränsen och ökade halten sub G1 DNA. Det observerade stoppet av cellcykeln hänger inte samman med ökade nivåer av markörer för DNA-skada, såsom fosforylerat p53 (vid Ser 14) eller H2AX (vid Ser 139) (10), vilket tyder på att b-AP15 inte är ett gentoxiskt ämne. Ökningen av sub G1 DNA , aktivering av caspas-3 och spjälkningen av poly-ADP ribospolymeras (PARP) och cytokeratin hör samman med en generell minskning av cellviabiliteten vid läkemedelskoncentrationer som inducerar en ackumulering av polyubiquitin, vilket visar på ett samband mellan UPS-inhibering och celldöd. lnduceringen av celldöd genom bortezomib är känslig mot 53 tumörsuppressorns status och förhöjt uttryck av det anti-apoptopiska oncoproteinet Bc|-2 (11, 12). Genom användning av isogena kloner av HCT116 coloncancerceller visades att genom b-AP15 inducerad celldöd är okänslig mot förhöjt uttryck av Bc|-2 och fragmentering av de apoptopiska regulatorerna p52, BAX or PUMA. Mätningen av den cytotoxiska aktiviteten visar, att föreningen enligt uppfinningen är mer toxisk mot colonkarcinom-celllinjen HTC-116 än mot odödligt gjorda retinapigmentepitelceller (hTERT-RPE1) och perifera mononukleära blodceller (PBMC).

Föreningen enligt uppfinningen visar en högre grad av cytotoxisk aktivitet mot HTC-116 celler än mot normala typer av celler.

Den observerade minskningen av cellulär proteasomaktivitet kan inte förklaras med inhibering av proteolytiska aktiviteter hos ß-subenheter av 205 CP. ln vitro experiment under användning av aktivitetsspecifika substrat visar inte en inhibering av någon av 205 CP eller 265 proteasomernas protolytiska aktiviteter, en dissociation av 19S RP och 205 CP eller en inhibering av till proteasomen bindande polyubiquitin.

Föreningen enligt uppfinningen innefattar en oz-ß dienonenhet med två steriskt tillgängliga ß-kolatomer. En strukturellt liknande farmakofor har tidigare beskrivits höra till en klass av inhibitorer av ubiquitinisopeptidas (13). När den cellulära DUB-aktiviteten testades under användning av ubiquitin 7-amido-4-metylkumarin (Ub-AMC) på celler, som behandlats med föreningen enligt uppfinningen, observerades emellertid ingen minskning av Ub-AMC spjälkning. Detta visar att föreningen enligt uppfinningen inte är en generell DUB-inhibitor. 10 15 20 25 30 10 Utan att önska vara bunden av teoretiska överväganden indikerar likheterna i farmakoforstruktur och data, som visar att föreningen enligt uppfinningen inhiberar proteasomaktiviteten oberoende av 205 CP, att föreningen enligt uppfinningen inhiberar proteasomen genom blockering av den deubiquiniterande aktiviteten hos 195 RP. ln vitro analyser under användning av Ub-AMC och renade 195 RP eller 265 proteasomer konfirmerade att föreningen enligt uppfinningen inhiberar den deubiquitinerande aktiviteten av både 195 RP och 265 proteasomen. Rekombinant ubiquitin-GFP är ett substrat för 19S RP DUB aktivitet (15). Behandling av 195 RP med b-AP15 inhiberar verksamt spjälkningen av Ub-GFP och ubiquitinerad HDM2. Typen av ubiquitinbindningar i polyubiquitinkedjan bestämmer av som händer med ett ubiquitinmodifierat substrat.

K48-länkade polyubiquitinkedjor har generellt kopplade proteiner som mål för nedbrytning (14), medan K63-länkade kedjor är involverade i icke-proteolytiska roller inklusive DNA- reparation (15) och mitotisk kromosomsegregering (16). Fragmenteringsreaktioner av ubiquitinkedjor avslöjade, att föreningen enligt uppfinningen inhiberar bearbetningen av både K48- och K63-länkade ubiquitintetramerer. Den observerade inhiberingen av ubiquitinkedjans fragmentering kan förklara ackumuleringen av ubiquitinkonjugat med hög molekylvikt i med föreningen enligt uppfinningen behandlade celler.

Proteasomens deubiquitinerande aktivitet tillskrivs en inverkan av tre DUBs, UCHL5, USP14 och POH1, samtliga belägna inom 195 RP (17-19). Både UCHL5 och USP14 är känsliga mot N-etylmaleimid (NEM), en generell inhibitor av cysteinproteaser, medan POH1 är okänslig mot inhibering genom NEM men känslig mot metalkomplexbindare såsom N,N,N,N- tetrakis-(2-pyridy|metyl)etylendiamin (TPEN) (20). lnhiberingsexperiment visade att den återstående DUB-aktiviteten finns kvar även efter behandling av 195 RP med kombinationen NEM och föreningen enligt uppfinningen. Denna kvarvarande DUB-aktivitet försvann vid behandling av 195 RP med kombinationen föreningen enligt uppfinningen/TPEN, vilket tyder på att föreningen enligt uppfinningen i först hand inhiberar en eller båda NEM-känsliga cystenin-DUBs. Föreningen enligt uppfinningens ß-kolatomer skulle kunna tjäna som Michael-acceptorenheter, vilket resulterar i kovalent bindning till 10 15 20 25 30 11 cysteinrester hos målproteiner. Analyser in vitro visade emellertid, att föreningen enligt uppfinningen är en reversibel inhibitor och att glutation inte hindrar föreningens inhibitoriska aktivitet.

För att specifikt identifiera vilka DUBs som inhiberades genom behandling med föreningen enligt uppfinningen utfördes kompetitiva inmärkningsförsök under användning av med hemagglutinin taggad ubiquitinvinylsulfonon (HA-UbVS), en mot ett aktivt center riktad prob som irreversibelt reagerar med DUBs hörande till cysteinklassen (17). lnkubering av 195 RP- eller 6S-proteasomer med föreningen enligt uppfinningen gjorde att Ub-VS märkningen av två DUBs med molekylvikter motsvarande UCHL5 och USP14 försvann. Ett liknande resultat erhölls vid användning av UbVs på lysat härrörande från celler som behandlats med läkemedel. lmmunoblotanalys visade en förskjutning av molekylvikten för både USP14 ochUCHL5 nedåt på grund av aktivitetsförlust och minskad UbVs-märkning.

Detta är i överensstämmelse med affinitetsupprenade proteasomer från med föreningen enligt uppfinningen behandlade celler, som visar minskad DUB-aktivitet begränsad till proteasomen och som inte är evident i celllysat. Ytterligare analyser in vitro visade minimal inhibering genom föreningen enligt uppfinningen av rekombinanta icke-proteosomala cystein-DUBs , vilket överensstämmer med uppfattningen, att inhiberingen inte beror på en generell cysteinreaktivitet.

Föreningen enligt uppfinningen minskar väsentligt tumörtillväxt in vivo och även stoppar den, såsom visas genom dess administrering till möss som antingen bär på en human tumör eller på musxenograft. Då föreningen enligt uppfinningen administreras dagligen till SCID- möss med FaDu huvud- och halskarcinomxenograft, observeras en signifikant inhibering av FaDu-tumörens tillväxt (behandlad/kontroll tumörvolym T/C=0.4, p<0.001).

Tumörcelldöden analyserades genom att mäta från xenograften härrörande cytokeratin (CK18) i cirkulationen. Cytokeratin-18 är en biomarkör för celldöd (21, 22); en signifikant ökning l plasmanivåerna av totalt human CK18 o (p=0.01). Nivåerna av caspasspjälkat CK18 (CK18-Asp396) ökade måttligt ijämförelse med de sammanlagda nivåerna, vilket tyder på att föreningen enligt uppfinningen har aktivitet mot tumörceller in vivo. Föreningen enligt uppfinningen visades också inhibera etableringen av HCT-llößdz* colonkarcinom xenograft 10 15 20 25 30 12 i nakna möss, såsom visad genom en signifikant försening av tumöretableringen jämfört med kontroller som behandlats med bärare. På liknande sätt inhiberar föreningen enligt uppfinningen tumörtillväxt i syngena musmodeller vid användning av mindre frekventa administeringsscheman.

Ubiquitin C-terminala hydrolaser (UCH) och ubiquitinspecifika proteaser (USP) är stora subgrupper hos de omkring etthundra DUBs som kodas av det humana genomet (23).

Mekanismen för specificiteten av föreningen enligt uppfinningen för UCHL5 och USP14 i 19S RP kan höra samman med unika konformationer hos dessa enzymer i 19S RP eller bero på läkemedelsinducerade förändringari 19S RP strukturen. Dessa fynd är konsistenta med rapporter i tekniken som indikerar att en förlust av både UCHL5 och USP14, till skillnad mot förlusten av endast en av dem, leder till ackumulering av polyubiquitinerade proteiner och inhibering av cellulär proteinnedbrytning (24).

Observationen att DUB-inhiberingen hör samman med ubiquitin-substrat komplex med hög molekylvikt verkar vara av särskild stor relevans. Ett starkt uttryck av chaperongener observerades i celler som behandlats med föreningen enligt uppfinningen, vilket indikerar induktionen av ett proteotoxiskt svar. Ubiquitinsubstratkomplex med hög molekylvikt som ackumuleras till följd av DUB-inhiberingen genom föreningen enligt uppfinningen synes generera hög cytotoxicitet.

I det följande kommer uppfinningen att beskrivas i större detalj under hänvisning till föredragna utföringsformer därav som illustreras i en ett antal figurer omfattande ritning.

BESKRIVNING AV FIGURERNA Figurerna la o s v är diagram som åskådliggör induktionen av dosberoende cytotoxicitet efter 72 timmars kontinuerlig exponering av föreningar mot reportercelllinjen |\/IelJuSo-ub YFP genom utföringsformer av föreningen enligt uppfinningen, såsom uppmätt genom FMCA-metoden, såväl som frånvaro av sådan induktion genom strukturellt besläktade 13 föreningar som inte omfattas av uppfinningen. Behandlade cellerjämfördes med obehandlade kontroller (överlevnadsindex).

Figurerna 2a o s v är diagram som åskådliggör proteasominhiberingen som funktion av 5 tiden för samma föreningar. fig la, 2a b-AP15; fig lb, 2b l-akryloyl -(3E, 5E)-3,5-bis[(4-nitrofeny|)metyliden]-4-oxo-piperidin-2- 10 ka rboxylsyra fig lc, 2c förening L enligt uppfinningen; 15 fig ld, 2d förening M enligt uppfinningen; fig le, 2e (3E, 5E)-3,5-bis(4-nitrofenylmetyliden)-4-oxo-piperidin-2-karboxylsyra 10 15 20 25 30 14 fig lf, 2f förening A enligt uppfinningen; fig lg, 2g förening C enligt uppfinningen.

BESKRIVNING AV FÖREDRAGNA UTFÖRINGSEXEMPEL Förfaranden Bestämningar av proteasomaktivitet in vítro utförs i svarta 96brunns mikrotiterplattor under användning av human ZOS proteasom (Boston Biochem) i reaktionsbuffert (25 mM Hepes, 0.5 mM EDTA, 0.03 % SDS) med Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC eller Boc-LRRAMC som substrat för proteasomaktivitet. De-ubiquitinas aktivitetsbestämningar utfördes med humant 19S RP (Boston Biochem) med ubiquitin-AMC som substrat. För FaDu xenograftstudier injicerades en 100-111 cellsuspension innehållande 1x106 celler subkutant i veka livet av SCID. Då tumören etablerats randomiserades mössen i kontroll- och behandlingsgrupper samt administrerades 5 mg kgl förening enligt uppfinningen eller bärare. ln vivo-nivåer av apoptos and celldöd bestämdes ur påvisningen av caspasspjälkning och totala nivåer av cytokeratin-18 i plasma under användning av analysförfarandena M30 Apoptosense® och M65 ELlSA®s (Peviva). Förfarandena beskrivs nedan mera detaljerat.

Reagens. Reagens erhölls från följande källor: ZOS proteasom (E-360), 26S proteasom (E- 365), 19S proteasom (E-366), Suc-LLVY-AMC (S-280), Z-LLE-AMC (S-230), Boc-LRR-AMC (S- 300), Ubiquitin-AMC (U-550), Tetra-ubiquitin K63 (UC-310), Tetra-ubiquitin K48 (UC-210), dekonjugerande enzymset(KE10), HA-ubiquitinvinylsulfon (U-212) (Boston Biochem); anti- ß-actin (AC-15), ODC-l (HPAOO1536) (Sigma Aldrich); anti-LC-3 (2775), anti-GAPDH (2118), anti-p44/42 MAPK (4695), anti-Phospho-p44/42 MAPK (9101)(Cell Signaling); N-etyl- maleimid (34115) (EMD Chemica|s); anti-ubiquitin K48 (Apu2), anti-ubiquitin (MAB1510) (Mil|ipore); anti-p53 (D01), anti-UCHL5 (H-110), Hdm2 (SMP14) (Santa Cruz); anti-PARP (C2- 10), anti-p27 (G173-524), anti-aktiv Caspase 3 (C92-605) (BD Biosciences); anti-USP14 (A300-919A) (Bethyl Laboratories); anti-HA (12CA5) (Roche). Bortezomib erhölls från onkologiska kliniken, Karolinska sjukhuset, Sverige. 10 15 20 25 30 15 Cel/od/ing. MCF7 celler hölls levande i MEM/10% fetalt kalverum. HCT-116 p53 +/+, p53 -/-, Bc|-2 +/+, PUMA -/- och BAX -/- celler hölls vid liv i McCoy's 5A modified medium/10% fetalt kalvserum. HCT-116 p53 +/+, p53 -/-, PUMA -/- och BAX -/- genererades såsom beskrivet (25). Celllinjen HCT-116 Bc|-2 +/+ genererades genom transfektion av parentala HCT-116 p53 +/+ celler med pCEP4 Bc|-2 (Addgene plasmid 16461) (26) och isolering av kloner med högt uttryck. FaDu- och LLC3-celler hölls vid liv I DMEM medium med hög glukoshalt kompletterat med 10% fetalt kalvserum, Na-pyruvat, Hepes och icke-essentiella aminosyror. 4T1.12B karcinomceller hölls vid liv i RPMI medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum. Proteasom reportercelllinjen MelJuSo Ub-YFP genererades såsom beskrivet (12). Cellerna hölls vid livi Dulbecco's Modified Eag|e's Medium/10 % fetalt kalvserum. Den retinala epitelcelllinjen genererades såsom beskrivet (12). Alla celler hölls vid liv i Dulbecco's Modified Eagle Medium/10 % fetalt kalvserum. Den retinala epitelcelllinjen genererades såsom beskrivet (28). Alla celler hölls vid liv vid 37 °C in 5 % C02.

Förfaranden för bestämning av proteasom- och DUB-inhibering. ln vitro förfarandet för bestämning av proteasomaktivitet under användning av 205 CP (2nM) (Boston Biochem) utfördes vid 37 °C i 100-ul reaktionsbuffert (25 mM Hepes, 0.5 mM EDTA, 0.03 % SDS). Prov inkuberades i 10 min med den angivna föreningen följd av tillsats av 10 (LM Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC eller Boc-LRR-AMC för påvisning av chymotrypsin-liknande, caspas-Iiknande och trypsin-liknande aktivitet. För bestämningen av DUB-inhibering inkuberades 195 RP (5 nM), 265 (5 nM) UCH-Ll (5 nM), UCH-L3 (O.3 nM), USPZCD (5 nM) USP7CD (5 nM) USPSCD (5 nM) och BAP1 (5 nM) med föreningen enligt uppfinningen följd av tillsats av ubiquitin-AMC (1000 nM). Fluorescensen övervakades under användning av en Wallac Multilabel räknare eller en Tecan Infinite M1000 utrustad med 360 nm exciterings- och 460 nm emissions- filter.

Förfaranden för bestämning av substratoverlay. Nativ gelelektrofores utfördes såsom beskrivet (29). I korthet blandades 4 pg renad 265 proteasom (Boston Biochem) med 10 eller 50 uM b-AP15 och inkuberades vid 37 °C i 10 min. Proven upplöstes på 4% icke- 10 15 20 25 30 16 denaturerande PAGE. Geler doppades in assaybuffert (20 mM Tris-HCL, 5 mM MgClz, 1 mM ATP, 0.1 mM Suc-LLVY-AMC) and proteasomerna synliggjordes under UV-belysning.

Bestämningsmetoder för ubiquitinspjäikning. Den rekombinanta Ub-GFP plasmiden petl9b Ub-IVI-GFP genererades såsom beskrivet (30). I korthet renades rekombinant Ub-GFP ifrån BL21 E. coli celler genom His affinitetsrening. För bestämning av spjälkningen inkuberades 195 RP (25 nM) med 10 mM NEM, 250 ulvl TPEN eller 50 uM av föreningen enligt uppfinningen i 10 min följd av tillsats av rekombinant Ub-GFP (200 nM).

Fragmenteringsreaktioner på ubiquitinkedjor utfördes väsentligen såsom ovan beskrivet, med undantag av att K48- or K63-länkade ubiquitintetramerer (50 ng) ersatte Ub-GFP.

Nivån av Ub-GFP spjälkningen eller ubiquitinfragmenteringen bestämdes genom immunoblotting med anti-ubiquitinantikroppar. Det ubiquitinerade Hdm2-substratet genererades enligt Biochem-protokollet (K-200). För bestämning av spjälkningen inkuberades 195 RP (25 nM) med 50 uIVl av föreningen enligt uppfinningen eller DMSO i 10 min följd av en tillsats av ubiquitinerat Hdm2-substrat (100 nM). Spjälkningen av ubiquitinerat Hdm2-substrat och ubiquitinerat Hdm2 bestämdes genom immunoblotting med anti-Hdm2-antikroppar.

Proteasomisolering HCT-116 celler behandlades I 3 timmar med bortezomib (100 nM) eller föreningen enligt uppfinningen (1 pM). Efter stimuleringen lyserades cellerna i 50 mM HEPES pH 7.4, 250 mM sukros, 10 mM MgClz, 2 mM ATP, 1 mM DTT och 0.025 % digitonin.

Provet behandlades kort med ultraljud och inkuberades I 15 min på is. Proteasomerna från dessa prov isolerades enligt tillverkarens protokoll.

UbVS inmärkning av DUBs. För inmärkning av DUBs i celllysat skördades sub-konfluenta celler genom trypsinering, tvättades 3 ggr med PBS och centrifugerades vid 1500 RPM i 5 min. Cellpellets lyserades med buffert (50 mM HEPES pH 7.4, 250 mM sukros, 10 mM MgClz, 2 mM ATP, 1 mM DTT) på is i 15 min. Avfall avlägsnades genom centrifugering och 25 pg protein märktes med 1 uM HA-UbVS i 30 min vid 37 °C. Proven separerades genom SDS-PAGE och analyserades genom immunoblotting med angivna antikroppar. 10 15 20 25 30 17 Bestämning av ce//apoptos och -viabilitet. För bestämningen av apoptos behandlades parentala HCT-116 p53 +/+ celler i 24 h med ökande doser bortezomib eller föreningen enligt uppfinningen. Doserna för behandlingen baserades på läkemedelskoncentrationen som gav maximal apoptos över ett dygn. HCT-116 cellerna såddes i 96-brunns mikrotiterplattor vid 10,000 celler per brunn och inkuberades över natten. Cellerna behandlades I 24 timmar med det angivna läkemedlet. Vid slutet av inkubationsperioden tillsattes NP40 till vävnadsodlingsmediet till en halt av 0.1 % och 25 ul av innehållet av varje brunn analyserades under användning av M30-Apoptosense® ELISA såsom tidigare beskrivet (31). Cellviabiliteten bestämdes genom att mäta aktiviteten av surt fosfatas eller genom FMCA-metoden (32). För aktiviteten av surt fosfatas såddes cellerna med 5000 celler per brunn i 96-brunns odlingsplattor och inkuberades i 12 h vid 37 °C. Föreningarna tillsattes till cellerna i tillväxtmedier och inkuberades i 72 h vid 37 °C. Cellerna tvättades med 200 ul varmt PBS. 100 ul para-nitrofenylfosfat (pNPP, 2mg/ml) i natriumacetatbuffert pH 5 (NaAc 0.1 M, 0.1% Triton-X-100) tillsattes per brunn. Cellerna inkuberades I 2 h varefter reaktionen stoppades genom tillsats av 1N NaOH. Absorbansen uppmättes vid 405 HIT).

För FMCA-bestämningen såddes cellerna i med läkemedel preparerade 384-brunns plattor under användning av pipetteringsroboten Precision 2000 (Bio-Tek lnstruments Inc., Winooski, VT). Plattorna inkuberades I 72 h och överfördes sedan till ett integrerat HTS SAIGAN Core System bestående av en ORCA robot (Beckman Coulter) med COz-inkubator (Cytomat 2C, Kendro, Sollentuna, Sweden), dispenseringsmodul (Multidrop 384, Titertek, Huntsville, AL), tvättmodul (ELx 405, Bio-Tek lnstruments Inc), lockborttagningsstation, plattlagringsstation, streckkodläsare (Beckman Coulter), vätskehanterare (Biomek 2000, Beckman Coulter) och en flerändamålsläsare (FLUOstar Optima, BMG Labtech GmbH, Offenburg, Tyskland) för automatiserad FMCA. Överlevnadsindex (SI) definieras som fluorescensen hos testbrunnar i procent av kontroller med fråndragna nollvärden.

Cellcykelanalys. För bestämning av cellcykeln behandlades HCT-116 celler med föreningen enligt uppfinningen eller DMSO. Cellerna skördades genom trypsinisering, tvättades och fixerades i 70% iskall EtOH i 12 h. Cellerna resuspenderades i en infärgningslösning 15 20 30 18 innehållande propidiumjodid (50 pg/ml) och RNAs A (0,5 ug/ml) i PBS. Proven mättes på en BD FACScalibur. Procentandelen celler i varje fas av cellcykeln bestämdes under användning av ModFit mjukvara.

EXEMPEL 1. Syntesexempel av föredragna utföringsformer av föreningen enligt uppfinningen (3E,5E)-3,5-BisUenylmety/idempiperidin-4-on (A) och (3E,5E)-3,5-bis(4-metoxy- fenylmetyIiden)-piperidín-4-on (B). o o \ / ll ° ü ° A B Piperidon tillsammans med bensaldehyd eller 4-metoxybensaldehyd löstes i ättiksyra (10 mL) och svavelsyra (konc, 1 mL) tillsattes droppvis. Blandningarna omrördes vid rumstemperatur. Vatten tillsattes och den utfällda produkten filterades, tvättades med vatten och torkades. Produkt A erhölls med en renhet av 99% bestämd genom LCMS (xBridge C18, 3,5 um, 50 x 3.0 mm, 10% to 90% acetonitril i 3 min, 1 mL/min. 215-395, 254 och 214 nm. A= 10mM NH4HCO3 (pH 10) - B= acetonitril), MS ESI* m/z 276 [M+H]*. Produkt B erhölls också i en renhet av 99%, MS ESI* m/z 336 [M+H]+. (3E, 5E)-3,S-Bisfieny/mety/ídenßl-(2-cyklopropy/acety/)-piperídin-4-on (C) o o ©^Ü^© N Cl __N Cl O oå~<> C D Amin F (30 mg) löstes i DMF (2 mL) tillsammans med cyklopropylättiksyra (med F, 1,1 ekvival) och reaktionen omrördes vid rumstemperatur över natten. Reaktonen späddes 15 20 25 30 19 med metanol och renades genom preparativ HPLC, varvid produkt C erhölls i en renhet av 96% bestämd genom LCMS (ACE 3 C8, 50 x 3,0 mm, 10% till 97% acetonitril i 3 min, 1 mL/min. A= 0,1% TFA (pH2 - B= acetonitril), I\/IS ESl+ m/z 358 [M+H]+. (3E, 5E)-3,5-Bis(4-nitrofeny/metyliden)-1-[(2R)-pyrrolidin-2-yl-karbony/I-piperidin-4-on (L) och etyl 4-{[(3E, 5E)-3,5-bis(4-nitrofenylmetyliden)]-4-oxo-piperidin-1-y/}-4-oxo- butanoat trifluoracetat (M) o o N / är o olw. N D ä? o' o CI) O o 5% °\/ F M o N-Boc piperidon (300 mg, 1,51 mmol) och 4-nitrobensaldehyd (156 mg, 1,03 mmol) löstes i '\ 0:. ll O F O L N i ättiksyra (10 mL). Sedan tillsattes svavelsyra (konc, 1mL) droppvis och reaktionen omrördes vid återlopp i sju timmar. Reaktionsblandningen kyldes till rumstemperatur och den utfällda mellanprodukten filtrerades av och tvättades med vatten. Den råa mellanprodukten fick torka på filtret. Mellanprodukten erhölls i en renhet av 85% och användes som sådan; MS ESI* m/z 366 [M+H]+. Sedan vägdes 2 x 25 mg, 0.07 mmol av den råa mellanprodukten i tvâ kolvar och löstes tillsammans med N-Boc-prolin (16.2 mg, 0.08 mmol) respektive monoetylsuccinat (11,0 mg, 0.08 mmol) i DCM/DMF (5 mL, 4:1). Sedan tillsattes trietylamin (14,3 uL, 0.10 mmol) vid 0° C och blandningarna omrördes i 5 min före tillsatsen av HATU (28.6 mg, 0.08 mmol) till varje kolv. Reaktionerna omrördes vid rumstemperatur i två timmar och koncentrerades sedan. Ãterstoden renades genom preparativ HPLC varvid fortfarande Boc-skyddat material erhölls. Ãterstoden löstes upp igen i diklormetan/trifluorättiksyra (5 mL, 4:1) och omrördes vid rumstemperatur i 40 min och koncentrerades igen. Produkt L erhölls I en renhet av >99 % uppmätt genom LCMS (ACE 3 C8, 50 x 3,0 mm, 10% till 97% acetonitril in 3 min, 1 mL/min. A= 0,1% TFA (pH2 - B= acetonitril), MS ESl+ m/z 463 [M+H]* och produkt M i 94% renhet, MS ESI* m/z 494 [M+H]+.

HATU= 0-(7-AzabensotriazoI-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluronium hexafluorfosfat 10 15 20 25 30 20 EXEMPEL 2. Farmaceutisk beredning A (vattenhaltig suspension). Föreningen enligt uppfinningen (25 mg) löstes i 1 ml dimetylsulfoxid. Lösningen tillsattes droppvis till 10 ml koksaltlösning under kraftig omrörning. Den bildade suspensionen, som kan stabiliseras genom tillsats av 1 vikt- % PVP, kan användas för intramuskulär, intravenös eller subkutan administrering.

EXEMPEL 3. Farmaceutisk beredning B (tablett). Tabletter för oral administrering framställs genom att blanda 2.0 g av föreningen enligt uppfinningen (pulver, <1O mp, 90 %) med mikrokristallin cellulosa (1,30 g), majsstärkelse (O,50) g, kiseloxid (0,20) g, magnesiumstearat (O,12 mg). Blandningen komprimeras till 400 mg tabletter, som beläggs med socker.

EXEMPEL 4. Farmaceutisk beredning C (lösning). Föreningen enligt uppfinningen(10 mg) löses i 0,5 ml Cremophor EL (BASF Corp.) och absolut etanol tillsattes upp till en volum av 1,0 ml. Den klara lösningen fylldes i provrör av glas för injicering.

EXEMPEL 5. Föreningen enligt uppfinningen inducerar proteasominhibering (Fig. la, 1c, 1d, lf, lg). Reporter celllinjen MelJuSo Ub-YFP, som manipulerats för att ackumulera gult fluorescerande protein (YFP) vid proteasominhibering (12), användes för utvärdering av föreningarna. Ackumuleringen av YFP uppmättes under 48 timmar i ett lncuCyte-FLR system (Essen Bioscience, Essen, UK), som är ett automatiserat fluorescensmikroskop.

EXEMPEL 6. Proteasominhibering som funktion av tiden. Proteasominhiberingen över tiden uppmättes under användning av reportercelllinjen MelJuSo-ub YFP. Antalet positiva celler per fält användes som ett mått på proteasominhibering.

Litteraturhän visningar 1. Masdehors, P et al., increased sensitivity of CLL-derived lymphocytes to apoptotic death activation by the proteasome-specific inhibitor lactacystin. Br J Haematol 105, 752-757, doi:bjh1388 [pii] (1999). 10 15 20 25 30 21 2. DeMartino, G N et al., PA 700, an ATP-dependent activator of the 20 S proteasome, is an ATPase containing multiple members of a nuc/eotide bindíng protein family. J Biol Chem 69, 20878-20884, http://www.ncbi.nIm.nih.gov/entrez/querv.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed &dopt=Citation&list_uíds=8063704 (1994) (1994). 3. Rechsteiner, M et al., The multicatalytic and 26 S proteases. J Biol Chem 268, 6065-6068, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt= Citation&list_uids=8454582 (1993). 4. Adams, J & Kauffman, M, Development of the proteasome inhibitor Velcade (Bortezomib).

Cancer Invest 22, 304-311, fip://www.ncbi.nlm.nihgov/entrez/quervfcgl? cmd=Retrieve &db =PubMed&dopt=Citation&Iist_uids=15199612 (2004). 5. Erdal, H et al., lnduction of /ysosoma/ membrane permeabi/ization by compounds that activate p53-independent apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 192-197, doi:0408592102 [pii]10.1073/pnas.0408592102 (2005). 6. Berndtsson, M et al., /nduction of the /ysosoma/ apoptosis pathway by inhibitors of the ubiquitin-proteasome system. IntJ Cancer 124, 1463-1469, dol:10.1002/ljc.24004 (2009). 7. Lamb, J et al., The Connectivity Map: using gene-expression signatures to connect small molecu/es, genes, and disease. Science 313, 1929-1935, doi:313/5795/1929 [pii]10.1126/science.1132939 (2006). 8. Adams, .I et al., Potent and selective inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. Bioorg Med Chem Lett 8, 333-338 333-338, doi:S0960894X98000298 [pii] (1998). 9. Shibata, T et al., An endogenous e/ectrophi/e that modulates the regulatory mechanism of protein turnover: inhibitory effects of IS-deoxy-De/ta 12,14-prostaglandin 12 on proteasome. Biochemistry 42, 13960-13968, doi:10.1021/bi035215a (2003). 10. Yang, H et al., Celastrol, a triterpene extractedfrom the Chinese ”Thunder of God Vine, " is a patent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice. Cancer Res 66, 4758-4765 4758-4765, doi:66/9/4758 [pii]10.1158/0008-5472.CAN05- 4529 (2006). 11. Yang, H et al., The tumor proteasome is a primary target for the natural anticancer compound Withaferin A isolated from "lndian winter cherry”. Mol Pharmacol 71, 426-437, d0i:m0l.106.030015 [pii]10.1124/m0|.106.030015 (2007). 10 15 20 25 30 22 12. Menendez-Benito, V et al., Endoplasmic reticulum stress compromises the ubiquitin- proteasome system. Hum Mol Genet 14, 2787-2799, doi:ddi312 [pii]10.1093/hmg/ddi312 (2005). 13. Mullally, J E & Fitzpatrick, F A, Pharmacophore model for novel inhibitors of ubiquitin isopeptidases that induce p53-independent cell death. Mol Pharmacol 62, http://www.ncbi.n|m.nihgov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopt=Citation&|ist_uids=12130688 (2002). 14. Guterman, A & Glickman, M H, Complementary roles for Rpnll and Ubp6 in deubiquitination and proteo/ysís by the proteasome. J Biol Chem 279, 17291738, doi:10.1074/jbc.M3070502OO [pii] (2004). 15. Hofmann, R M & Pickart, C M et al., Noncanonical MMSZ-encoded ubiquitin conjugating enzyme functions in assembly of novel po/yubiquitin chaíns for DNA repair. Cell 96, 645-653, doi:S0092-8674(00)80575-9 [pil] (1999). 16. Vong, Q P et al., Chromosome a/ignment and segregation regulated by ubiquitinatíon of surviving cells. Science 310, 1499-1504, doi:310/5753/l499 [pii]10.1126/science.112016O (2005). 17. Borodovsky, A et al., A novel active site-directed probe specific for deubiquitylating enzymes reveals proteasome association of USP14. EM BO J 20, 5187-5196, doi:10.1093/emboj/20.18.5187 (2001). 18. Lam, Y A et al., Specificity of the ubiquitin isopeptidase in the PA700 regulatory complex of 26 S proteasomes. J Biol Chem 272, 28438-28446, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=9353303 (1997). 19. Verma, R et al., Role of Rpnll metalloprotease in deubiquitination and degradation by the 265 proteasome. Science 298, 611-615, doi:10.1126/science.10758981075898 [pii] (2002). 20. Yao, T & Cohen, R E, A cryptic protease couples deubiquitination and degradation by the proteasome. Nature 419, 403-407, doi:10.1038/natureO1071nature01071 [pii] (2002). 21. Kramer, G et al., Differentiation between cell death modes using measurements of different soluble forms of extracel/ular cytokeratin 18. Cancer Res 64, 1751-1756 (2004) http://www.ncbi.nIm.nih.gov/entrez/queryfcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& dopwcirarionstlisguids=14996736 (2004). 10 15 20 25 23 22. Olofsson, MH et al., Specific demonstration of drug-induced tumour cell apoptosis in human xenograft models using a plasma biomarker. Cancer Biomarkers 5, 117-125, http://www.ncbi.n|m.nih.gov/pubmed/19407366 (2009). 23. Reyes-Turcu, F E et al., Regulation and cellular roles of ubiquitin-speciflc deubiquitinating enzymes. Annu Rev Biochem 78, 363-397, htto://www.ncbi.n|m.nih.gov/ entrez/queryfcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=19489724 (2009). 24. Koulich, E et al., Relative structural and functional roles of multiple deubiquitylating proteins associated with mammalian 265 proteasome. Mol Biol Cell 19, 1072-1082, doi:E07- 10-1040 [pii]10.1091/mbc.E07-10-1040 (2008). 25. Bunz, F. et al., Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.

Science 282, 1497-1501 (1998). 26. Pietenpoi, J A et al., Paradoxical inhibition of solid tumor cell growth by bc/2. Cancer Res 54, 3714-3717 (1994). 27. Bodnar, A G et al., Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279, 349-352 (1998). 28. Lamb, J et al., The Connectivity Map: using gene-expression signatures to connect small mo/ecules, genes, and disease. Science 313, 1929-1935, doi:313/5795/ 1929 [pii] 10.1126/science.1132939 (2006). 29. Elsasser, S et al., Characterization of the proteasome using native gel electrophoresis.

Methods Enzymol 398, 353-363, doi:S0076-6879(05)98029-4 [pii]10.1016/S0076- 6879(05)98029-4 (2005). 30. Guterman, A & Giickman, M H, Complementary rolesfor Rpnll and Ubp6 in deubiquitination and proteolysis by the proteasome. J Biol Chem 279, 1729-1738, doi:10.1074/jbc.M307050200M307050200 [pii] (2004). 31. Hagg, M et al., A novel high-through-put assay for screening of pro-apoptotic drugs.

Invest New Drugs 20, 253-259 (2002). 32. Lindhagen, E et al., The fluorometric microculture cytotoxicity assay. Nat Protoc 3, 1364- 1369, d0i:npr0t.2008.114 [pii]10.1038/npr0t.2008.114 (2008).

Claims (2)

10 15 20 25 24 Patentkrav

1. Användning av en förening med den allmänna strukturen A A för behandling av cancer hos en patient som är resistent mot behandling med bortezomib eller ett medel som har samma mekanism för inhibering av deubiquitinerande aktivitet som bortezomib.

2. Användning enligt krav 1, varvid - R1, Rz, R3, R4 väljs oberoende av varandra från gruppen bestående av H, CH;- alkyl, OC1_8-alky|, CLg-acyl, aryl eller heteroaryl substituerad med 0-5 oberoende av varandra valda Rs, Cgß-cykloalkyl, CHz-Cgß-cykloalkyl, CHzCO-alkyl, CM- alkylaryl, C1-4-a|ky|heteroaryl, OH, CN, COOH, vinyl, allyl; med bestämningen att endast en av R1,R2 in (R1,R2) och en av R3,R4 hos (R3,R4) är aryl eller heteroaryl substituerad med 0-5 RS; - X är CO eller CS; - RS väljs från gruppen bestående av H, OH, NHZ, C1_8-a|kyl, Cm-alkenyl, C14;- alkoxy, Cm-alkoxy-CLS-alkyl, C1.8-alkoxy-CLG-alkenyl, CO-alkyl, aryl, heteroaryl, heterocyklyl, Cw-alkyl-heteroaryl, Cw-alkyl-heterocyklyl, C1_8-alkyl-cykloalkyl, Cl- g-alkyl-aryl, CHZCORQ, CN, COOH, CO-alkyl, CO-aryl, CO-cykloalkyl, CONRQ , COORg, CO-vinyl, CO-allyl; - Rs väljs från gruppen bestående av OH, CN, COOH, N02, F, CI, Br, I, CF3, CHF2, NHz, NHRg, N(R9)2, NHCORQ, NHCON(R9)2, NHCOORQ, NHSOZRQ, CHO, CO-alkyl, COOMe, COOEt, OMe; - R9 är alkyl, aryl, heteroaryl, heterocyklyl eller cykloalkyl. 10 25 Användning enligt krav 1 eller 2, varvid cancern väljes från multipelt myelom, prostatacancer, koloncancer, äggstockscancer, pankreascancer, bröstcancer, cancer i nacke eller huvud. Användning enligt något av kraven 1 till 3, varvid en farmakologisk verksam dos av föreningen med den allmänna strukturen A i en lämplig farmaceutisk bärare används. Användning enligt krav 4, varvid bäraren är en vattenhaltig bärare eller en bärare, som innefattar dimetylsulfoxid eller N,N-dimetylacetamid. Användning enigt krav 4 eller 5, varvid föreningen administreras genom intravenös eller intramuskulär injektion eller infusion. Användning enligt krav 4, varvid föreningen med den allmänna strukturen administreras i form av tabletter eller hårda eller mjuka gelatinkapslar.