CN102274220A - 索拉菲尼在制备逆转肿瘤多药耐药性的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于抗肿瘤药物制备技术的一种索拉菲尼及其盐在制备逆转BCRP蛋白介导的肿瘤多药耐药性的药物中的应用。本发明将索拉菲尼及其盐与抗癌药物合用，恢复多药耐药肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，制备的药物应用于临床化疗耐药的病人联合化疗或预防肿瘤细胞耐药的产生。

Description

索拉菲尼在制备逆转肿瘤多药耐药性的药物中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及一种索拉菲尼及其盐在制备逆转BCRP蛋白介导的肿瘤耐药药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是我国攻关的重点疾病之一。肿瘤治疗过程中的一大缺点是肿瘤细胞对抗癌药产生原发或诱发耐药性，导致临床化疗失败。据统计，90％以上肿瘤患者死因在不同程度上都与耐药有关。肿瘤细胞耐药的主要表型为多药耐药(multidrug resistance，MDR)，即患者接受化疗药物治疗后，对原来药物产生耐药，并且对其它结构和作用机制不同的抗癌药产生交叉耐药，从而出现临床疗效的降低或无效的现象。因此，肿瘤耐药基因的表达和逆转MDR的研究成为肿瘤治疗亟待解决的问题。MDR的发生与多种因素有关，研究最广泛的是ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白，目前已经明确的有49种ABC转运蛋白，都有共同的ATP结合域，水解ATP释放能量将药物泵出膜外，这些膜转运蛋白降低了多药耐药肿瘤细胞内抗肿瘤药物的积累和滞留，使药物浓度低于治疗浓度的阈值，因而限制了肿瘤细胞的杀灭。哺乳类动物中相关转运蛋白分子水平的研究，已能分离和描述多种转运蛋白基因编码，主要的三种转运蛋白包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)。

乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)，又称为ABCG2，是1998年由美国3个不同研究小组相继报道的乳腺癌耐药细胞系中存在的一种新的肿瘤耐药相关蛋白。多个研究小组研究不同来源的肿瘤MDR细胞系，结果发现在乳腺癌MCF-7/Mitox、胃癌EPG85-257RNDV、结肠癌SM1-3.2、纤维肉瘤EPF86-079RNDV和多发性骨髓瘤8226/MR20等耐药细胞有BCRP高表达，与P-gp/MRP表达无关。相对于实体瘤及血液系统肿瘤的细胞株研究，有关BCRP临床资料还较少。目前多个临床小组对病人的肿瘤标本的研究显示BCRP表达与白血病、非小细胞肺癌、乳腺癌的临床化疗敏感性有关，且与Pgp、MRP的表达水平无相关性。尤其BCRP在急性髓细胞白血病中的研究很多，证实了BCRP表达与肿瘤复发明显相关。目前更多的肿瘤类型及其BCRP的表达与临床化疗及预后的关系研究还在进行中。研究显示，BCRP与拓扑替康、依立替康等拓扑异构酶I抑制剂，米托蒽醌等拓扑异构酶II抑制剂的耐药性有着密切的关系，与Pgp具有不同的机制特质。同时，资料表明BCRP还与多种口服抗癌药的生物利用度限制有着密切的关系。总之，越来越多的细胞模型和临床研究证实BCRP的过表达会引起多药耐药。

新近的研究发现，部分肿瘤组织中存在少部分特殊细胞，被称为旁群细胞或SP细胞(side population cells)，这些细胞具有干细胞的很多特性，在肿瘤耐药和复发机制中可能起着关键作用。有证据表明，肿瘤SP细胞代表着一族肿瘤干细胞，这些细胞对化疗药有内在的高抵抗性，纵使大部分肿瘤细胞被常规化疗方案杀死，只要残存SP细胞，都可能成为肿瘤复发的根源，因此，治愈肿瘤，首先应清除SP细胞。Zhou S等首次在BCRP基因敲除小鼠的研究中发现骨髓细胞SP表型完全丢失，由此证明在骨髓细胞中BCRP是参与其SP表型形成的因素(Zhou S，Schuetz JD，Bunting KD，et al.The ABC transporter Bcrp1/ABCG2isexpressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of theside-population phenotype.Nat Med，2001，7(9)：1028-34.)。Hirshmann-Jax等也指出只有部分具有SP表型细胞表达BCRP，而non-SP细胞对常用的抗癌药物敏感性要大于SP细胞，这是细胞的SP表型导致其对药物敏感性的下降的直接证据(Hirshmann-Jax C，Foster AE，Wulf GG，et al.A distinct″side population″ofcells with high drug efflux capacity in human tumor cells.PNAS，2004，101(39)：14228-33)。由BCRP表达与SP表型的直接相关性可知，细胞对药物敏感性的下降是BCRP的表达造成的。所以我们推测恶性肿瘤难以根除的原因之一是肿瘤干细胞或肿瘤中的SP细胞表达BCRP而形成多药抗性，造成治疗效果不理想。由此可见SP细胞的耐药机制和表达BCRP蛋白有关。我们有理由相信靶向BCRP转运蛋白的MDR逆转剂也可能成为肿瘤干细胞的靶向抑制剂。乳腺癌耐药蛋白从1998年发现至今才10多年，但是它已经成为了近年一种新的治疗靶点(Xu J，Peng H，Zhang JT.Human Multidrug Transporter ABCG2，a Target for SensitizingDrug Resistance in Cancer Chemotherapy.Curr Med Chem.2007；14：689-701)。因此，以BCRP蛋白为生物学靶标，设计合成能与靶点相互作用的小分子化学物质就可特异性干扰关键的病理环节，终止或减缓癌症的发生和发展，这也是抗癌药物研究新方向。

传统的MDR逆转剂如维拉帕米和三苯氧胺(TAM)等对BCRP介导的MDR无逆转作用。随着BCRP研究的深入，如何逆转由BCRP引起的MDR也成为人们研究的热点。目前所有针对BCRP外排功能的拮抗剂都处于实验室的研究阶段，近几年新发现的BCRP小分子逆转剂，其大致分为三类(Ahmed-Belkacem A，et al.Inhibitors of cancer cell multidrug resistance mediatedby breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2).Anti-Cancer Drug 2006；17：239-243)：①MDR广谱的逆转剂，如最具代表性的第二代逆转剂GF120918即是P-gp又是BCRP的抑制剂，而类黄酮对P-gp、MRP1和BCRP介导的MDR都有逆转作用。②其它靶标的抑制剂，如BCR-ABL酪氨酸激酶的选择性抑制剂伊马替尼(STI571)和表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib，这些逆转剂基本上都是老药新用，均有针对性很强的治疗功能，当作逆转剂应用时，其原有治疗功能必然带来严重的毒副作用。因而，在临床研究中实际用药剂量很低，患者血药浓度远远低于体外研究应用的最佳活性的浓度。③BCRP特异性抑制剂，目前文献报道甚少，如霉菌毒素C(FTC)及衍生物、6-prenylchrysin和杨芽黄素。FTC是最早发现，也是迄今为止高效BCRP特异性抑制剂，能够逆转由BCRP介导的对阿霉素、米托蒽醌和拓扑特肯的耐药，而对P-gp和MRP介导的耐药却无逆转作用，但其神经毒性限制了临床使用，现在新的高效、低毒的FTC类似物Ko系列正在紧锣密鼓的研制中。因此，继续研究开发对BCRP介导的耐药肿瘤安全有效的、高度特异性的逆转剂是十分必要的，其有助于克服化疗过程中出现的BCRP导致的原发性和获得性耐药同时提高抗癌药的利用度，其开发和研究具有良好的前景和重要的意义。

一方面，目前以克服肿瘤耐药为目的主要进行大量的Pgp抑制剂的开发，针对BCRP的抑制剂则相对较少(如前所述)。另一方面，现有的BCRP抑制剂主要是从功能方面阻断BCRP对底物的外排属于短效机制，少有通过影响BCRP蛋白表达这类长效机制解决耐药的抑制剂见诸报道。

索拉非尼是由拜尔和Onyx Pharmaceuticals公司开发的双芳基脲类化合物，2005年被FDA批准用于晚期肾癌的治疗。索拉非尼是第1个可靶向于RAF的口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，它可通过靶向RAF信号通路阻断肿瘤细胞的增殖。靶向于VEGFR产生抗血管生成作用。在体外研究中发现索拉非尼还可以作用于PDGFR-p、FGFR、C-KIT、FLT-3和RET以及细胞内ERK1/2激酶，抑制下游Ras/Raf/MEK和PI-3K/Akt两条细胞信号转导通路，从而抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡。在晚期肾癌患者中进行的III期临床试验中，与安慰剂组相比，索拉非尼显著地延长了患者的疾病无进展生存时间，且生活质量显著改善。其他临床研究表明索拉非尼对晚期肝细胞癌、黑素瘤和非小细胞肺癌等实体瘤均具有潜在的抗肿瘤效应。有报道称，索拉菲尼在耐药肝癌细胞株BEL-7402/FU中，可以抑制mdrl基因蛋白产物P-gp的表达，增加细胞内化疗药物的浓度，从而逆转了肝癌细胞的多药耐药性(魏莉，苏宁，曹梦苒，郑大勇，李爱民，严晓，吕成伟，罗荣城索拉非尼对耐药肝癌细胞株BEL-7402/FU逆转作用的研究，细胞与分子免疫学杂志2009：25(4)：344-47.)。但是对BCRP介导的多药耐药是否具有抑制作用还未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种索拉菲尼及其盐在制备逆转BCRP介导的肿瘤耐药药物中的应用。

索拉菲尼及其盐在制备逆转乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药性的药物中的应用，将索拉菲尼及其盐与抗癌药物合用，用于临床化疗耐药的病人联合化疗或预防肿瘤细胞耐药的产生。

其特征在于，所述抗癌药物为蒽环类、紫杉醇类、长春新碱类、喜树碱类、鬼臼毒素类、烷化剂类、抗代谢类药物中的一种或多种的混合物。

所述蒽环类药物为米托蒽醌或阿霉素；紫杉醇类药物为紫杉醇或多西他赛；长春新碱类药物为硫酸长春地辛、硫酸长春新碱或长春新碱；喜树碱类药物为拓扑替康；鬼臼毒素类药物为依托泊苷或替尼泊苷；烷化剂类药物为环磷酰胺、顺铂或替莫唑胺；抗代谢类药物为氟尿嘧啶、甲氨喋呤或阿糖胞苷。

本发明通过耐药细胞株进行体外实验，从功能、细胞、蛋白、基因等多个水平进行实验，证明索拉菲尼能够特异性的有效逆转BCRP介导的肿瘤多药耐药。

将索拉菲尼与底物类抗癌药共同作用于ABCB1/Pgp、ABCG2/BCRP、ABCC1/MRP1高表达的耐药细胞株及其亲本细胞株上，从功能、细胞、蛋白、基因等多个层次评价索拉菲尼逆转肿瘤MDR的效果。应用流式细胞术分别以罗丹明123、米托蒽醌、阿霉素为底物检测索拉菲尼对于Pgp、BCRP、MRP1作为药物外排泵的功能活性的影响；应用MTS法及SRB法检测索拉菲尼对耐药细胞和敏感细胞的细胞毒性，并选取IC₁₀以内的用量与底物类抗癌药共同作用，检测其恢复MDR肿瘤细胞对抗癌药敏感性的效果；应用Western Blot检测索拉菲尼对耐药细胞中P-gp、BCRP、MRP1蛋白表达水平的影响。结果表明索拉菲尼能够显著增加BCRP高表达细胞HEK293T/BCRP中底物米托蒽醌的积累，而对Pgp及MRP高表达的耐药细胞则无此效果。索拉菲尼在2.5μM的无毒剂量下能够显著恢复HEK293T/BCRP细胞对于多种BCRP底物的敏感性，包括米托蒽醌、拓扑替康及阿霉素，而对Pgp高表达耐药细胞则无此类效果。索拉菲尼对HEK293T/BCRP细胞中的BCRP蛋白有显著的降解作用，并呈明显的时间和剂量依赖性。

本发明含有索拉菲尼所形成的药物组合物，它包含索拉菲尼、抗癌药物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明用于肿瘤耐药逆转的索拉菲尼能以其本身安全的口服或非口服给药，或者以和药学上可接受的载体赋形剂及其他添加剂形成的化合物(如片剂、缓释制剂、胶囊剂、注射剂、溶液剂)安全的口服或非口服给药。当口服给药时，组合物可配制成片剂、糖衣剂或胶囊。为制备口服组合物可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为蹦解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗黏合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份蹦解添加剂组成混合物，该混合物与黏合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其他的蹦解剂，润滑剂和抗黏剂将此混合物压片。

本发明的索拉菲尼不易溶于水，为增加溶解性可将杂环类衍生物游离后制成药学上可接受的有机酸，较好地为甲磺酸，富马酸等以有利于以注射剂形式给药，虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，但当对肿瘤耐药的成人非口服给药时通常为每剂量约0.1mg/kg～1000mg/kg体重，优选的约0.1mg/kg～800mg/kg体重，更优选的0.5mg/kg～500mg/kg体重，并且每日一次或几次给药是有益的。当非肠道给药时，本发明的组合物被制成注射溶液，制备此类注射液时，将活性成分溶于蒸馏水中或各种有机溶剂中，也可加入助溶剂如山梨糖醇单月桂酸酯、单硬脂酸酯或单油酸酯等等，注射液还可含有各种常用的添加剂、防腐剂等。在灌装安瓶前，需将含本发明组合物的注射液过滤，灌装后进行灭菌。

本发明的有益效果：索拉菲尼能够显著增加BCRP高表达细胞HEK293T/BCRP中底物米托蒽醌的积累，在2.5μM的无毒剂量下能够显著恢复HEK293T/BCRP细胞对于多种BCRP底物的敏感性，包括米托蒽醌、拓扑替康及阿霉素等多种抗癌药物，对HEK293T/BCRP细胞中的BCRP蛋白有显著的降解作用，并呈明显的时间和剂量依赖性。

附图说明

图1为索拉菲尼对HEK293/BCRP及VEC细胞中米托蒽醌蓄积的影响；

图中DMSO：1‰DMSO；SOR：2.5μM索拉菲尼；KO143为5μM的阳性对照药。

图2为索拉菲尼对HEK293/BCRP及VEC细胞中米托蒽醌蓄积影响的剂量依赖性，其中A为索拉菲尼增加米托蒽醌在HEK293/BCRP细胞中蓄积的剂量依赖性，B为索拉菲尼对HEK293/VEC细胞对米托蒽醌蓄积的影响；图中DMSO为溶剂阴性对照组，所标剂量浓度为索拉菲尼用药浓度。

图3为索拉菲尼对HEK293/BCRP细胞中BCRP蛋白表达水平的影响，A为2.5μM浓度下的时间依赖性，B为72h时间内的剂量依赖性，C为1‰DMSO的阴性对照的时间依赖性。

图4为索拉菲尼在HEK293/BCRP细胞中对米托蒽醌(MX)细胞增敏作用，其中A代表其在HEK293/BCRP耐药细胞中的效果；B代表其在敏感细胞HEK293/VEC中的效果；

图中，Ko143：阳性对照；sorafenib：索拉菲尼实验组；DMSO：2.5‰DMSO；MX：100nM米托蒽醌；CH：2.5μM索拉菲尼；CL+MX：0.625μM索拉菲尼+100nM米托蒽醌；CM+MX：1.25μM索拉菲尼+100nM米托蒽醌；CH+MX：2.5μM索拉菲尼+100nM米托蒽醌。

图5为索拉菲尼在HEK293/BCRP细胞中对阿霉素(ADR)细胞增敏作用，其中，A为索拉菲尼在HEK293/BCRP耐药细胞中的效果；B为索拉菲尼在敏感细胞HEK293/VEC中的效果；

图中，Ko143：阳性对照；sorafenib：索拉菲尼实验组；DMSO：2.5‰DMSO；MX：200ng/mL阿霉素；CH：2.5μM索拉菲尼；CL+ADR：0.625μM索拉菲尼+200ng/mL阿霉素；CM+ADR：1.25μM索拉菲尼+200ng/mL阿霉素；CH+ADR：2.5μM索拉菲尼+200ng/mL阿霉素。

图6为索拉菲尼在HEK293/BCRP细胞中对拓扑替康(TOPT)细胞增敏作用，其中，A为索拉菲尼在HEK293/BCRP耐药细胞中的效果；B为索拉菲尼在敏感细胞HEK293/VEC中的效果；

图中，Ko143：阳性对照；sorafenib：索拉菲尼实验组；DMSO：2.5‰DMSO；TOPT：80nM拓扑替康；CH：2.5μM索拉菲尼；CL+TOPT：0.625μM索拉菲尼+80nM拓扑替康；CM+TOPT：1.25μM索拉菲尼+80nM拓扑替康；CH+TOPT：2.5μM索拉菲尼+80nM拓扑替康。

图7为索拉菲尼对abcg2基因表达的影响；

图中DMSO为溶剂对照组，Sorafenib为索拉菲尼加药组。

图8为索拉菲尼对BCRP构象的影响；

图中，Vi-矾酸钠；sorafenib-索拉菲尼；DMSO-溶剂对照，H-38为已知能引起构象变化的化合物。

图9显示索拉菲尼对BCRP的ATPase活性的影响；

图中，NT为阴性对照组；DMSO为1‰DMSO溶剂组；Na₃VO₄为抑制剂对照，TOP为拓扑替康底物对照；sorafenib为索拉菲尼实验组。

具体实施方式：

实施例1索拉菲尼对BCRP底物米托蒽醌在BCRP高表达耐药细胞中的积累影响实验

分别收获BCRP高表达的耐药株HEK293/BCRP及亲本HEK293/VEC，在有或无索拉菲尼(索拉菲尼浓度为2.5μM)的存在情况下加入BCRP底物荧光染料MX，37℃孵育一个小时，应用FACS检测细胞内荧光强度的变化。逆转倍数＝处理组GMean/DMSO组的GMean。

结果表明索拉菲尼可以显著的增加HEK293/BCRP中米托蒽醌的积累，并呈剂量依赖性，而对亲本细胞无此作用(图1-2)。而采取类似的方法，在Pgp高表达的K562/A02细胞中索拉菲尼则没有类似的效果。这表明索拉菲尼能够特异性地阻断BCRP对其底物的外排。

实施例2索拉菲尼对BCRP高表达耐药细胞中BCRP的表达水平的影响

将索拉菲尼以0.625μM、1.25μM、2.5μM刺激72h或2.5μM刺激24h、48h、72h两种方式作用于HEK293/BCRP细胞，应用Weston Blot技术检测其中BCRP表达情况。

结果表明索拉菲尼能显著的、剂量及时间依赖性的降低BCRP的蛋白表达水平(图3)。采取类似的方法发现索拉菲尼不能够引起Pgp的降解。同时通过检测表明所选的逆转浓度对AKT和ERK的磷酸化水平没有影响。

实施例3索拉菲尼在体外特异性地逆转BCRP介导的多药耐药性实验

将BCRP高表达的HEK293/BCRP细胞悬浮于10％FBS/DMEM接种于96孔微孔板(40000cells/160μl/well)，在5％CO2、37℃条件下培养24h。加入索拉菲尼溶液20μl至终浓度分别为0.625μM、1.25μM、2.5μM(IC₁₀以内无毒剂量)，5％CO2、37℃孵育2h，加入米托蒽醌溶液20μl至终浓度为100nM(IC₁₀以内的无毒剂量)，培养72小时后以MTS法测定细胞生存率。

结果表明，无毒剂量的索拉菲尼与米托蒽醌共同作用后耐药细胞的生存率明显下降，相同的实验作用于敏感细胞HEK293/VEC无此效应，表明索拉菲尼能够特异性逆转HEK293/BCRP对米托蒽醌的耐药性(图4)。采用类似的方法还发现索拉菲尼可以逆转HEK293/BCRP对BCRP底物阿霉素(图5)、拓扑替康(图6)对HEK293/BCRP的耐药性。而在Pgp高表达的K562/A02细胞中索拉菲尼则没有类似的效果。表明索拉菲尼能够特异性地逆转BCRP介导的多药耐药。

实施例4索拉菲尼对HEK293/BCRP中abcg2基因表达的影响

以2.5μM的索拉菲尼对HEK293/BCRP细胞分别刺激24h、48h、72h后收获细胞提取总RNA。反转录后应用荧光定量PCR技术检测abcg2表达水平变化，DMSO(2.5‰)为实验对照组。

图7结果表明索拉菲尼对abcg2基因表达无显著影响。

实施例5索拉菲尼对BCRP构象变化的影响

5D3是BCRP构象敏感的抗体，优先识别抑制剂诱导的构象改变的BCRP，使峰右移。收获BCRP高表达的耐药株HEK293/BCRP，以无血清DMEM培养基重悬，分别加入Na₃VO₄至终浓度1mM，阳性对照H-38至终浓度10μM，索拉菲尼至终浓度10μM，调整DMSO至1‰，37℃孵育10分钟。离心甩去培养基用FACS洗液洗一次，加入5D3抗体稀释液100μl冰上孵育30分钟，洗三次上机检测。应用PE直标的5D3抗体(eBioscienceCAT：12-8888-73)通过FACS检测与其BCRP结合的强弱可以反映化合物对BCRP构象变化的影响。

图8中横坐标为PE荧光强度，峰的位置反映5D3抗体结合的强弱，越向右表明5D3抗体结合越强，反之越弱。与对照DMSO组相比1mM矾酸钠可引起5D3抗体结合减弱，峰左移；而10μM的阳性对照H-38则引起5D3抗体结合增强，峰右移。10μM的索拉菲尼可引起峰的右移，表明索拉菲尼可引起BCRP的构象变化，引起5D3抗体的结合效率上升，应与H-38作用机制类似。

实施例6索拉菲尼对BCRP的ATPase活性影响

BCRP的转运依赖于ATP的水解驱动。逆转剂与BCRP相互作用会影响ATPase活性。通过超速离心分离BCPP膜蛋白，并应用Pgp-Glo AssaySysetem(Promega CAT：V3601)提供的ATP依赖的萤火虫荧光素酶发光效应进行检测。BCRP首先与化合物共孵育，再添加入一定量的ATP，随后终止BCRP ATPase的反应，剩余未被水解酶代谢的ATP通过荧光素酶反应体系被检测出来。与无化合物处理组相比，荧光信号的减弱标志被BCRP消耗的ATP量，因此信号降低的越多，BCRP活性越高，使用的化合物为BCRP的底物即激动剂。反之，信号的增强表明，ATPase活性被抑制，化合物为BCRP的抑制剂。在本实验中，试剂盒提供的Na₃VO₄，为抑制剂对照，拓扑替康(TOP)为底物对照。(1)用Assay Buffer分别稀释索拉菲尼、Na₃VO₄、TOP、DMSO，DMSO终浓度均调整至1％，化合物终浓度为0.2mM，同时将提取的BCRP膜蛋白浓度稀释至1.6mg/ml，均放于冰上待用；(2)取0.5ml EP管，标号加入相应化合物，置于冰上，各组有三个副孔。NT及DMSO组，加入20ul 1％DMSO的Assay Buffer；Na₃VO₄、TOP、索拉菲尼各组加入相应0.2mM化合物20μL(在50μL体系中，最终工作浓度为40μM)；(3)除NT组加入20ul 1％DMSO的Assay Buffer，其余每管加入20μL BCRP蛋白(1.6mg/ml)，37℃孵育5min；(4)EP管取出，置于冰上，每管加10μl Mg ATP(25mM)，37℃孵育40min；(5)取出EP管，按标记号加入不透光96孔白板孔内，每孔另加50μL ATP Detection Reagent，室温反应20min后用多功能酶标仪测Luminescence。

图9结果表明索拉菲尼可激活BCRP的ATPase，是BCRP的底物。

实施例7逆转乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药性的药物制备

将索拉菲尼，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于50-60℃干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片，制成制剂1。

制剂1

将索拉菲尼，甘露醇，PEG3000与蒸馏水混合，过滤，调节pH7.0-7.5，使PH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3毫克/毫升，按每安瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射液(制剂2)。

制剂2

将索拉菲尼，聚氧乙烯脱水山梨，糖醇单油酸酯混合制成胶囊(制剂3)，每囊含100mg索拉菲尼，其成分含量如下所示：

制剂3

Claims (3)

1.索拉菲尼及其盐在制备逆转乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药性的药物中的应用，其特征在于，将索拉菲尼及其盐与抗癌药物合用，用于临床化疗耐药的病人联合化疗或预防肿瘤细胞耐药的产生。

2.根据权利要求1所述索拉菲尼及其盐在制备逆转乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药性的药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物为蒽环类、紫杉醇类、长春新碱类、喜树碱类、鬼臼毒素类、烷化剂类、抗代谢类药物中的一种或多种的混合物。

3.根据权利要求2所述索拉菲尼及其盐在制备逆转乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药性的药物中的应用，其特征在于，所述蒽环类药物为米托蒽醌或阿霉素；紫杉醇类药物为紫杉醇或多西他赛；长春新碱类药物为硫酸长春地辛、硫酸长春新碱或长春新碱；喜树碱类药物为拓扑替康；鬼臼毒素类药物为依托泊苷或替尼泊苷；烷化剂类药物为环磷酰胺、顺铂或替莫唑胺；抗代谢类药物为氟尿嘧啶、甲氨喋呤或阿糖胞苷。

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