ES2330495B1 - Inhibidores de la enzima o6-alquilguanina-adn-metil-transferasa para el tratamiento del cancer. - Google Patents
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Abstract
Inhibidores de la enzima
O^{6}-alquilguanina-ADN-metil-
transferasa para el tratamiento del cáncer.
transferasa para el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere al uso de
compuesto derivados de
piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona
como inhibidores de la acción reparadora de la ADN realizada por la
enzima
O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa
y con composiciones farmacéuticas que los contienen, para la
preparación de medicamentos coadyuvantes de la terapia antitumoral
basada en agentes alquilantes.
Description
Inhibidores de la enzima
O^{6}-alquilguanina-ADN-metil-transferasa
para el tratamiento del cáncer.
La presente invención se enmarca en el campo de
la química médica, y más concretamente en el de compuestos
inhibidores de enzimas para uso terapéutico aplicables en
particular como adyuvantes del tratamiento del cáncer por
quimioterapia, al disminuir los efectos negativos de dicha
terapia.
El tratamiento de la mayor parte de los tumores
se basa en una aproximación múltiple que incluye la resección
quirúrgica y la radioterapia, dirigidas al tumor principal, y la
quimioterapia, que actúa en todo el organismo para prevenir y
combatir la aparición de tumores en otras localizaciones
(metástasis). Los principales compuestos usados en quimioterapia
son los agentes alquilantes (ciclofosfamida, mecloretamina),
antimetabolitos (6-mercaptopurina,
5-fluoruracilo), alcaloides derivados de plantas
(vinblastina, vincristina), y diversas moléculas biológicas
(antibióticos antitumorales, enzimas, hormonas, etc.).
Las nitrosoureas y los compuestos relacionados
(procarbazina, estreptozina, temozolomida) son similares a los
agentes alquilantes y su efectividad terapéutica se atribuye, en
buena parte, al potencial citotóxico de las lesiones que inducen en
el ADN [1]. Los tejidos tumorales, dada la mayor tasa de
proliferación de sus células, sintetizan más ADN, por lo que son
los más afectados por estas lesiones. En particular dichos
compuestos provocan metilaciones del oxigeno en posición 6 de las
moléculas de guanina del ADN, originando
O^{6}-metilguanina (O^{6}-mG).
La metilación de la guanina en esta posición provoca que se aparee
con una timina (T) en vez de con una citosina (C), y también puede
provocar entrecruzamientos G-C por lo que la
replicación de la cadena con O^{6}-mG origina
alteraciones en la nueva cadena de ADN que finalmente producen la
inhibición tanto de la replicación como de la transcripción del
ADN, conduciendo en ambos casos a muerte celular por apoptosis
[1].
Sin embargo las células presentan mecanismos
para reparar las lesiones de su ADN producidas en condiciones
fisiológicas normales, ya sea por factores medioambientales o por
metabolitos generados internamente. En particular la resistencia a
los compuestos alquilantes de O^{6} está mediada por la enzima
O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa
(la enzima en humanos es conocida como hAGT, del inglés "human
O^{6}-alkylguanine-DNA
alkyltransferase"), que transfiere el grupo metilo de la
O^{6}-mG a un aminoácido de su centro activo (un
cisteína en posición 145), restaurando así la guanina original [1,
2]. La síntesis de la hAGT se encuentra aumentada en la mayoría de
las células tumorales, por lo que a menudo los tumores son
resistentes a la quimioterapia con agentes alquilantes [3, 4]. Así
por ejemplo, la acción de la hAGT es la causa principal de la
resistencia a quimioterapia en el glioblastoma, un tipo de tumor
maligno que constituye aproximadamente el 50% de los tumores
cerebrales.
Se ha estudiado por tanto el uso de inhibidores
de la hAGT como coadyuvantes para los tratamientos de
quimioterapia, ya que al potenciarse el efecto de los agentes
alquilantes podría reducirse su dosis terapéutica, lo que a su vez
supondría una disminución de sus efectos secundarios. La
O^{6}-benzilguanina (O^{6}-bG) y
sus análogos inactivan hAGT in vitro e in vivo [2],
pero aunque se ha demostrado en ensayos clínicos que la
O^{6}-BG mejora la eficacia de agentes
quimio-terapéuticos [5], existen limitaciones
considerables para su uso terapéutico: su toxicidad sobre la
mielina de las células nerviosas, su escasa solubilidad en agua y
su rápida degradación en el plasma celular [6]. Además, la hAGT
tiene más afinidad por la O^{6}-mG que por la
O^{6}-bG, por lo que se une preferentemente al
ADN que presente O^{6}-mG, de modo que su
actividad reparadora está más favorecida que la inhibición por
O^{6}-bG.
Algunos estudios recientes han mostrado que los
oligodesoxirribonucleótidos que contienen O^{6}-bG
inactivan más eficazmente a la hAGT [7]. En concreto, se ha
demostrado el potencial inhibidor in vitro de moléculas de
11 desoxirribonucleótidos que contienen O^{6}-bG
modificadas con enlaces metilfosfonato terminales para protegerlas
de la degradación por nucleasas. Sin embargo, en modelos celulares
el potencial inhibidor de la hAGT por estas cadenas de
desoxirribonucleótidos se redujo en una escala de unas 1000 veces
en comparación a lo observado in vitro, sugiriendo que la
incorporación de estas moléculas por las células es un factor
limitante de su acción terapéutica.
Así pues, los inhibidores de la función
reparadora de ADN de la hAGT descritos hasta ahora no son
suficientemente efectivos. Los autores de la presente invención
aplicaron por tanto la metodología del diseño de fármacos basado en
la estructura tridimensional de las dianas terapéuticas para
solventar este problema técnico. Para ello analizaron la estructura
de la hAGT [8] y se fundamentaron en la hipótesis de que la unión
del ADN no comporta un cambio conformacional significativo en esta
enzima, al igual que se ha encontrado para la proteína Ada (que
también repara alquilaciones del ADN). Esta hipótesis encaja
asimismo con el mecanismo de inversión de la base alquilada que se
plantea para este tipo de enzimas [9].
La aplicación de esta metodología, en el punto
de confluencia entre la Química, la Biología y la Bioinformática
ha permitido identificar dos familias de compuestos con gran
afinidad por el centro activo de la proteína hAGT y que poseen la
capacidad de inhibir su actividad biológica de forma relevante.
La presente invención se relaciona con el uso de
derivados de
piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona
como inhibidores de la acción reparadora del ADN realizada por la
enzima
O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa
y con composiciones farmacéuticas que los contienen, para la
preparación de medicamentos coadyuvantes de la terapia antitumoral
basada en agentes alquilantes.
El procedimiento para identificar familias de
dichos compuestos se inició con el cribado virtual de la base de
datos de compuestos químicos (quimioteca) ZINC [10], que
contiene más de dos millones de compuestos. En dicho cribado se
buscaron candidatos a interaccionar con el centro activo de la
hAGT, particularmente compuestos que encajaran en el surco
hidrofóbico que presenta la superficie de dicho centro activo y que
está definido por los aminoácidos Metionina 134, Prolina 140 y el
"lazo" del centro activo (comprendido entre los aminoácidos
Valina 155 y Glicina 160, inclusive). La interacción o encaje
molecular ("docking") de los compuestos de la quimioteca en
dicho surco se analizó virtualmente según el proceso esquematizado
en la Figura 1.
La estructura inicial de la hAGT se obtuvo de la
base de datos PDB (RCSB Protein Data Bank, disponible en
www.rcsb.org/pdb/ [11]). De dicha base se tomó un modelo de la
proteína, del que se descartaron las moléculas de agua y ADN que
aparecían interaccionando con la misma. A este modelo se le
añadieron los átomos de hidrógeno con el programa protonate del
paquete AMBER [12], y se le asignaron cargas y radios
atómicos a todos los átomos de la proteína utilizando el mismo
paquete. A continuación, se caracterizó energéticamente el centro
activo mediante la combinación de tres programas propios
desarrollados por los inventores:
\sqbulletCGRID [13], genera una malla
tridimensional sobre el centro activo de la proteína y permite
calcular tanto las interacciones electrostáticas como las de tipo
van der Waals entre cada uno de los átomos de centro activo
de la proteína con cada uno de los átomos principales (carbono,
nitrógeno, oxígeno, azufre, hidrógeno, fósforo, flúor, cloro,
bromo, yodo) de las moléculas de la quimioteca utilizada. Los bordes
de la malla tridimensional para la hAGT se situaron a un mínimo de
distancia de 5 \ring{A} de cualquier átomo del nucleótido
metilado (tal como la O^{6}-mG) sobre el que
actuará el centro activo de la enzima, y el espaciado entre cada
punto de la malla fue de 0.5 \ring{A}.
\sqbulletCDOCK [13], un programa de
análisis del encaje molecular o docking cuya función de
asignación de valores se basa en las mallas calculadas con
CGRID. Se utilizaron 3 sondas (moléculas prototipo): benceno
para detectar zonas hidrofóbicas, y agua y metanol para detectar
zonas susceptibles de formar puentes de hidrógeno.
\sqbulletGAGA [14], que comprime la
información obtenida por CDOCK para una sonda en una serie
de funciones gaussianas que actúan como puntos farmacofóricos.
La "preparación" de los compuestos de la
quimioteca ZINC para su cribado basado en el posible encaje
molecular con el centro activo de hAGT se inició con el cálculo de
las coordenadas tridimensionales de todos los compuestos de esta
quimioteca mediante el programa CORINA [Corina Molecular
Networks, Erlangen, Alemania]. Este programa permite además generar
todas las combinaciones tridimensionales de un determinado
compuesto de la quimioteca a través de las diferentes
conformaciones de sus anillos y estereoisómeros. Con las
coordenadas tridimensionales se realizó un análisis conformacional
de todos estas combinaciones mediante el programa ALFA,
desarrollado por los autores de la presente invención. El análisis
permitió obtener las conformaciones más estables energéticamente de
cada compuesto, asignándoles a su vez radios tipo AMBER a
todos sus átomos [12]. Por último, se calcularon las cargas
parciales de cada átomo mediante el paquete MOPAC [15]. Este
cálculo se realizó para cada una de las estructuras
tridimensionales obtenidas con el programa CORINA. Toda la
información que se fue generando (estructuras tridimensionales de
las conformaciones con sus radios y cargas) se almacenó en una base
de datos relacional en MySQL [disponible en www.mysql.com].
En total se obtuvo información de 2.288.455 compuestos en formato
bidimensional (SMILES, Daylight Chemical Information
Systems, Inc.), que fue procesada e incluida en la base de datos
relacional.
Las posiciones más probables de estos compuestos
en su encaje con el centro activo se obtuvieron después de la
utilización de dos programas de filtros. El programa DOCK
[16] se utilizó para asignar a cada geometría centro activo -
compuesto un valor (ZScore) en función de los contactos
entre ambas moléculas. Se seleccionaron aquellos compuestos que
presentaban geometrías con valores de ZScore iguales o superiores a
5 para ser analizados exhaustivamente con el programa CDOCK
[17]. De los 976 millones de conformaciones de los compuestos de
ZINC se seleccionaron 4.787 para su cribado exhaustivo con
CDOCK. Todos los resultados obtenidos, tanto del filtrado
inicial como del filtrado exhaustivo se almacenaron en la base de
datos relacional.
Para la identificación final de compuestos con
potencial inhibidor de la hAGT se llevó a cabo una actualización de
los valores energéticos de los resultados obtenidos con
CDOCK incorporando una componente coulómbica más refinada y
los términos necesarios para la desolvatación del centro activo y
del compuesto (puesto que ambas moléculas inicialmente se
encuentran en solución en la célula, deben dejar de reaccionar con
el solvente en las regiones en las que interaccionan entre sí). La
actualización se llevó a cabo mediante la resolución de la ecuación
de Poisson implementada en el paquete DelPhi
(http://wiki.c2b2.columbia.edu/honiglab_public/index.php/Software).
También se añadió la componente no polar, calculada como un valor
proporcional al área de superficie accesible al solvente
(SASA) [18]. Así pues, fue posible realizar una
reclasificación de los resultados en función de la suma de las
energías de van der Waals, coulómbica, desolvatación del
centro activo y del compuesto potencialmente inhibidor y componente
no polar. A partir de esta nueva clasificación se inspeccionaron
visualmente los resultados de los compuestos que presentaban los
100 mejores resultados y se seleccionaron 21 compuestos dentro de
dicho grupo que mostraban la mayor afinidad frente al centro activo
de la hAGT.
Dichos compuestos demostraron capacidad
inhibidora de la hAGT in vitro e in vivo, resultando
en el último caso en una mayor eficacia de los agentes alquilantes
para controlar la proliferación celular (Ejemplo 2). Los
compuestos identificados pueden agruparse según su estructura
química: compuestos con la fórmula I (derivados de
piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona),
en adelante "compuestos de la invención".
Así, un primer aspecto de la presente invención
se refiere al uso de un compuesto capaz de inhibir la acción de la
O^{6}-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa
caracterizado porque es un derivado de
piperadinil-metil-tetrazol-quinolona
con la fórmula general (en adelante fórmula I):
en la
que:
- X es un átomo de carbono (C) o nitrógeno (N),
indistintamente;
- R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son
iguales o diferentes y están independientemente seleccionados del
grupo constituido por: hidrógeno, alquilo lineal, alquilo
ramificado, cicloalquilmetil, cicloalquiletil, aminocarbonilalquil,
alquiloxi lineal, alquiloxi ramificado, furilmetil,
imidazolilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, R^{7},
metil-R^{7}, etil-R^{7},
propil-R^{7}, metoxi-R^{7},
etoxi-R^{7}, propoxi-R^{7},
donde R^{7} es un arilo en el que cada una de sus cinco
posiciones restantes está sustituida por un grupo
independientemente seleccionado entre hidrógeno, fluor, cloro,
bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi (alquilóxido de 1 a 4
átomos de C), alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino.
En una realización particular de la presente
invención X es nitrógeno, R^{1} es
2,5-dimetilfenil, R^{2} es hidrógeno, R^{3} es
metoxi y R^{4} es fenil-metil, originando la
3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1H)-quinolinona
(en adelante, compuesto Ia o Pibetina, según denominación dada por
los inventores), con la fórmula:
En otra realización particular de la presente
invención, X es carbono, R^{1} es fenil-metil,
R^{2} es metil, R^{3} es hidrógeno y R^{4} es
fenil-metil, originando la
3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolino-
na (en adelante compuesto Ib), con la fórmula:
na (en adelante compuesto Ib), con la fórmula:
Los modelos tridimensionales de unión entre los
compuestos de la invención descritos en las realizaciones
particulares (compuestos Ia - o Pibetina- y Ib) con el centro
activo de la hAGT se muestran en la Figura 4. El análisis de los
efectos de dichos compuestos sobre la hAGT demostró que los mismos
son capaces de inhibir competitivamente la actividad reparadora de
esta enzima en presencia de su sustrato natural, la cadena de ADN
metilada.
Asimismo, según se muestra en el Ejemplo 2, el
tratamiento de cultivos de células derivadas de carcinomas con
dichos compuestos potenció la acción terapeútica de la carmustina
(1,3-Bis(2-cloroetil)1-nitrosourea),
un agente alquilante empleado frecuentemente para combatir el
mieloma múltiple, tumores del cerebro, enfermedad de Hodgkin's, y
linfomas no Hodgkin's, mostrando el potencial terapéutico del uso
de los compuestos de la invención como
co-adyuvantes de agentes
quimio-terapéuticos en el tratamiento de
tumores.
Un segundo aspecto de la presente invención
incluye el uso de isómeros o mezclas de isómeros de los compuestos
de la invención, incluyendo los isómeros de los compuestos Ia y Ib
descritos en la presente invención, como coadyuvantes de agentes
quimio-terapéuticos. Dichos isómeros
comprenden:
- isómeros en disposición Z o E
definidos por la posición de los sustituyentes respecto a los
enlaces múltiples que presentan los compuestos,
- isómeros ópticos o enantiómeros, originados
por la presencia de centros quirales (átomos unidos a cuatro
sustituyentes diferentes) que provocan la diferenciación entre
enantiómeros respecto a su actividad óptica (rotación de la luz
polarizada al pasar a través de una solución del enantiómero),
- diastereoisómeros, isómeros con al menos dos
centros quirales, estando los sustituyentes de uno de dichos
centros dispuestos igual en ambos diastereoisómeros y los
sustituyentes de al menos otro de los centros dispuestos de forma
distinta entre ambos.
Un tercer aspecto de la presente invención se
refiere al uso de profármacos de los compuestos de la invención
como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. El
término "profármaco", tal como aquí se utiliza comprende
cualquier compuesto derivado de fórmula I tal y como se definen en
la presente invención (por ejemplo, ésteres, carbamatos, amidas
etc.), que, cuando se administra a un individuo, es capaz de
proporcionarle, directa o indirectamente, uno o varios de los
compuestos de la invención.
En una realización preferente de la presente
invención, dicho profármaco es un compuesto que, en comparación con
los compuestos de la invención aumenta su biodisponibilidad cuando
se administra a un individuo, o que potencia la liberación de los
compuestos de la invención en un compartimiento biológico (por
ejemplo, en el cerebro o el tejido particular afectado por el tumor
o la metástasis). La preparación de dicho profármaco puede
llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los
expertos en la materia, que pueden encontrarse por ejemplo en
"Textbook of Drug Design and Discovery"
(Krogsgaard-Larsen P, Liljefors T y Madsen U;
editorial Taylor and Francis, 2002, 3ª Edición).
Un cuarto aspecto de la presente invención se
refiere al uso de las formas cristalinas de los compuestos de la
invención en estado libre o como solvatos, como coadyuvantes de
agentes quimio-terapéuticos. El término
"solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos
que puedan ser utilizados en la composición de un medicamento, como
solvatos útiles en la preparación de dicho medicamento. Los
solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación
bien conocidos por los técnicos en la materia.
Un quinto aspecto de la presente invención se
refiere al uso de sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos de la invención como coadyuvantes de agentes
quimio-terapéuticos. Las sales de los compuestos de
la invención que no sean farmacéuticamente aceptables pueden ser
útiles asimismo en la preparación de fármacos, por lo que todas las
sales de los compuestos de la invención, sean o no
farmacéuticamente aceptables están incluidas en el ámbito de la
presente invención.
Un sexto aspecto de la presente invención se
refiere al uso como coadyuvantes de agentes
quimio-terapéuticos, de compuestos de la invención
que contengan uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por
ejemplo, compuestos con una de fórmula I en las que uno o varios
átomos de hidrógeno han sido sustituidos por átomos de deuterio o
de tritio, uno o varios átomos de de carbono han sido sustituidos
por átomos de ^{13}C o ^{14}C o uno o varios átomos de
nitrógeno han sido sustituidos por ^{15}N.
En un séptimo aspecto, la presente invención se
relaciona con composiciones farmacéuticas con una cantidad
terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos de la invención,
sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, tanto presentes en
forma esencialmente pura como en mezcla con agentes auxiliares,
aditivos o portadores farmacéuticamente aceptables y,
eventualmente, otros agentes terapéuticos. Los agentes auxiliares,
aditivos o portadores deben ser compatibles con los demás
componentes de la composición y no causar perjuicios a sus
receptores. Las composiciones farmacéuticas incluyen aquéllas que
son adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica
(incluidas la bucal, sublingual y epicutánea), o parenteral
(incluidas la subcutánea, intramuscular, intravenosa e
intradérmica). Los métodos para la preparación de dichas
composiciones así como los agentes auxiliares, aditivos o
portadores (diluyentes, solventes, disgregantes, emulgentes,
absorbentes, antioxidantes, lubricantes, colorantes, edulcorantes,
humectantes, etc) son bien conocidos en la técnica de la farmacia,
y ejemplos de ambos pueden encontrarse en "Textbook of Drug
Design and Discovery" (Krogsgaard-Larsen P,
Liljefors T y Madsen U; editorial Taylor and Francis, 2002, 3ª
Edición).
Los compuestos de la invención, sus isómeros,
profármacos, solvatos o sales, así como las composiciones
farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con
otros fármacos para proporcionar terapia de combinación, ya sea
formando parte de la misma composición farmacéutica o como
composiciones separadas, administradas simultánea o no
simultáneamente.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de uno o más compuestos de la invención, sus isómeros,
profármacos, solvatos o sales, capaz de desarrollar en el receptor
el efecto terapéutico mediado por la inhibición de la actividad
reparadora de ADN de la hAGT. Dicha cantidad o dosis vendrá
determinada, entre otras causas, por las características propias de
los compuestos y sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, así
como por la composición farmacéutica que los contengan, la vía y
frecuencia de administración, y la edad y condición del sujeto
individual al que se le administra.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto de la invención de
fórmula I, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, o sus
mezclas, en la elaboración de un medicamento o composición
farmacéutica para el tratamiento del cáncer, incluyendo, pero no
limitado, al tratamiento de carcinomas incluyendo los de próstata,
mama, pulmón, páncreas, colorrectal, gástrico, esofágico, laríngeo,
tiroideo, hepático, de vejiga urinaria, renal, uterino, y de
cérvix, cualquier tipo de sarcomas incluyendo osteosarcomas,
sarcomas de partes blandas y angiosarcomas, cualquier tipo de tumor
hematopoyético incluyendo leucemias y linfomas, cualquier tipo de
tumor del sistema nervioso incluyendo neuroblastomas, glioblastomas
y astrocitomas, cualquier cáncer dermatológico incluyendo
melanomas, carcinomas de células basales y carcinomas de células
escamosas. En una realización preferente de la presente invención,
dicho uso se lleva a cabo en combinación con otros tratamientos
antitumorales, sean éstos mediante la administración de
medicamentos, sustancias radiactivas, radioterapia, quimioterapia,
cirugía o cualquier procedimiento médico.
Figura 1. Metodologías para la identificación
de pequeñas moléculas inhibidoras de la actividad de la enzima
O^{6}-alquilguanina-ADN-metil-transferasa.
El proceso se inició por dos vías paralelas, consistentes en el
análisis virtual, mediante medios informáticos, de la estructura
tridimensional, conformaciones más estables energéticamente y
distribución de cargas, radios y cargas de los átomos que se
encuentran en la superficie de las moléculas de una quimioteca de
compuestos (ZINC) y del centro activo de la enzima. Los datos
resultantes de dicho análisis para los más de tres millones de
compuestos de la quimioteca se almacenaron en una base de datos
(BBDD) relacional en entorno MySQL. Las posiciones más
probables de los compuestos en su encaje con el centro activo de la
enzima se obtuvieron asignando a cada par geométrico centro activo
- compuesto un valor (ZScore) en función de los contactos entre
ambas moléculas, calculado mediante un programa informático
(DOCK). Las parejas geométricas con valores de ZScore
superiores a 5 se re-analizaron con el programa
CDOCK, diseñado específicamente por los autores de la
invención. Posteriormente se llevo a cabo una reclasificación de
los resultados en función de la suma de las energías de van der
Waals, componente coulómbica, desolvataciones del centro activo
y del compuesto potencialmente inhibidor (pérdida de interacción
con moléculas del disolvente para que puedan interaccionar entre
sí) y componente no polar. A partir de esta nueva clasificación se
inspeccionaron visualmente los resultados y se seleccionaron 21
compuestos que mostraban la mayor probabilidad de interacción
estable con el centro activo de la hAGT.
Figura 2. Fórmulas generales de los
compuestos de la invención. Se muestran las fórmulas generales
de los compuestos de la invención (fórmula I).
Figura 3. Fórmulas de realizaciones
específicas de compuestos de la invención. Se muestran las
fórmulas químicas de cuatro compuestos que constituyen
realizaciones específicas de la invención: dos compuestos que tienen
la fórmula general I. Compuesto Ia,
3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1H)-quinolinona
(denominado Pibetina por los inventores); compuesto Ib,
3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolinona.
Figura 4. Modelos estructurales del encaje
molecular entre compuestos de la invención y el centro activo de la
enzima hAGT. Las ilustraciones muestran representaciones de la
superficie de hAGT, junto a modelos de varillas de compuestos Ia y
Ib de la invención, ilustrando el encaje óptimo entre el centro
activo de la hAGT y dichos compuestos según resultados obtenidos
mediante el programa CDOCK.
Figura 5. Inhibición por los compuestos Ia,
Ib de la actividad reparadora de ADN de la enzima hAGT in
vitro . La actividad remanente de la hAGT tras
pre-incubarse con distintas concentraciones en el
intervalo de 0 a 100 \muM de los compuestos de la invención se
representa como el porcentaje de dicha actividad durante la
posterior incubación de la mezcla utilizando
[^{3}H]-metil-ADN como sustrato,
respecto a la actividad medida en el control positivo. Como control
negativo de la reacción se utilizó proteína hAGT mutante (C145S,
representado por un círculo, \bigcirc), y como control positivo
se sustituyeron los compuestos por la misma concentración del
disolvente utilizado para su disolución, el DMSO (representado por
un cuadrado negro, \ding{110}).
La figura superior muestra la actividad
remanente de la hAGT frente a las distintas concentraciones del
compuesto Ia (rombo negro, \ding{117}) y Ib (rombo gris,
4 ).
Figura 6. Inhibición por el compuesto Ia de
la actividad reparadora de ADN de la enzima hAGT in
vivo . Se muestra el efecto de distintos compuestos de la
invención en concentraciones en el intervalo de 0 a 100 \muM
sobre la formación de colonias de células tumorales de
adenocarcinoma colorectal humano sin tratar con el agente
quimioterapeútico carmustina (columnas en negro) o tratadas con una
concentración de 40 \muM de dicho agente (columnas en gris). El
número de colonias se representa como porcentaje de las mismas
respecto al número observado en el control negativo: células
incubadas con el medio utilizado para disolver los distintos
compuestos de la invención (concentración = 0 \muM) y no tratadas
con carmustina (columnas en negro en el extremo izquierdo de todas
las gráficas).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El análisis computacional descrito en la
presente invención permitió identificar dos compuestos
particulares para la fórmula general I (compuestos la y Ib) que
encajaban con buena afinidad en el centro activo de la enzima hAGT
(veáse la Figura 4) y por tanto podían interferir competitivamente
con la interacción entre dicha enzima y su sustrato, el ADN
metilado. Para demostrarlo experimentalmente, se analizó la
capacidad de dichos compuestos de inhibir la actividad reparadora
de ADN de la enzima hAGT mediante un ensayo in vitro
utilizando hAGT sintetizada en cultivos de E. coli
recombinantes. Como control negativo en dicho ensayos se utilizó
hAGT de un mutante, el
hAGT-\DeltaC177-C145S (en
adelante, hAGT-C145S) donde la cisteína 145
responsable de la actividad reparadora de esta enzima es sustituida
por una serina, provocando la pérdida de su actividad.
Síntesis y purificación de hAGT y
hAGT-C145S. Se transformaron células de E.
coli con vectores derivados de los plásmidos pet2l y pet28,
incluyendo en el primer caso una secuencia de la hAGT (plásmido
pet21-hAGT) y en el segundo la secuencia mutante
(originando el vector
pet28-hAGT-\DeltaC177-C145S).
Se seleccionaron las bacterias transformadas mediante crecimiento
en medio LB-agar con ampicilina (100 \mug/ml)
para seleccionar las colonias bacterianas conteniendo el vector
pet21-hAGT o con kanamicina (50 \mug/ml) para
seleccionar aquellas conteniendo el vector
pet28-hAGT-T-\DeltaC177-C145S.
Se transfirieron colonias individuales a 0,6 litros de medio LB,
conteniendo el antibiótico correspondiente a las mismas
concentraciones antes indicadas y se incubaron en agitación a 37ºC
durante 16 h. A continuación se realizaron diluciones de 150 mL de
dicho cultivo en 1,5 litros de LB conteniendo el antibiótico
correspondiente, pero a una concentración dos veces menor que la
inicial. Estas diluciones de los cultivos se incubaron de nuevo en
agitación a 37ºC hasta que alcanzaron la fase de crecimiento
exponencial (D.O._{600 \ nm} \sim 0,6), momento en que la
temperatura se redujo a 30ºC. Cuando se estabilizó esta temperatura
para todo el cultivo se le añadió 1 mM de isopropil
\alpha-D-tiogalactopiranósido
(Calbiochem A) para inducir la expresión de la hATG. Tras 4 horas
de incubación se centrifugaron los cultivos durante 15 min,
resuspendiendo los sedimentos en una solución tampón de 50 mM Tris
pH=8,0 y 20% sacarosa. Estas resuspensiones se congelaron por
inmersión en nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC hasta la
purificación de la hAGT.
Para dicha purificación se descongelaron las
resuspensiones celulares y se les añadió solución tampón para la
lisis celular: 350 mM cloruro de sodio; 20 mM Imidazol; 0,2%
IGEPAL; 1 \mul \beta-mercaptoetanol, 20%
sacarosa, y 50 mM Tris pH=8,0. La rotura celular se llevó a cabo en
un sonicador Fisher Bioblock Scientific 75042, tras lo que las
disoluciones se centrifugaron a 185844 g durante 45 min. El
sobrenadante se filtró a través de filtros de acetato de celulosa
con poros de 45 \muM de diámetro (Sarstedt) y se aplicó el
filtrado a una columna HiTrap^{TM} FF (Amersham Biosciences). La
proteína unida específicamente a dicha columna a través de la cola
de histidinas fue eluída mediante el flujo de una solución tampón
de Imidazol en gradiente de 10 mM a 500 mM, y 350 mM NaCl, 20 mM
Tris pH=8,0 y 1 mM \beta-mercaptoetanol. Las
fracciones proteicas obtenidas se concentraron mediante
centrifugación con dispositivos Amicon Ultra-15
(Millipore) y se purificaron mediante cromatografía de tamiz
molecular en una columna Superdex 75 16/60 (Amersham Biosciences),
utilizando como solución tampón 150 mM NaCl, 10 mM ditiotreitol
(DTT) y 0,1 mM
etilen-diamino-tetra-acetato
(EDTA). Las fracciones correspondientes a la proteína eluída de
esta columna se volvieron a concentrar mediante dispositivos Amicon
Ultra-15 y se llevaron a una concentración de 2
mg/ml en el mismo tampón en presencia de 40% de glicerol, para su
conservación a -20ºC hasta su posterior utilización.
Preparación del ADN metilado. Se metiló
ADN de timo de ternera (Sigma) con
[^{3}H]-metilnitrosourea (Amersham Biosciences)
siguiendo el protocolo descrito en [19]. Se resuspendió 1 mg de ADN
en 1 ml de solución tampón de 10 mM cacodilato sódico pH=7,0
durante 24 horas a 4ºC y a continuación se le añadieron 7 \mul de
[3H]-metilnitrosourea, incubándose la mezcla a 37ºC
durante 2 h. Finalizada la reacción de metilación, el ADN metilado
se precipitó con acetato sódico y etanol. El precipitado obtenido,
conteniendo el [^{3}H]-metil-ADN
se lavó de forma exhaustiva con etanol y se resuspendió finalmente
en solución tampón 50 mM Tris pH=7,8, 1 mM DTT y 5 mM EDTA,
conservándose a -20ºC hasta su uso en los ensayos de actividad.
Ensayo de la actividad de la hAGT in
vitro . La actividad reparadora del ADN de la hAGT y su
inhibición por los compuestos de la invención se determinó
siguiendo básicamente el método descrito en [20]. Brevemente, la
enzima hAGT se preincubó durante 30 min a 37ºC con diferentes
concentraciones de los compuestos Ia, Ib (Asinex) (0, 25, 50, 75 o
100 \muM) disueltos en dimetilsufóxido (DMSO), usando como medio
de reacción una solución tampón 50 mM Tris pH=7,8, 1 mM DTT y 5 mM
EDTA. Tras esta pre-incubación se inició la
reacción mediante la adición del substrato,
[^{3}H]-metil-ADN, y se incubó a
37ºC durante 90 minutos. El volumen final de las reacciones fue de
200 \mul, siendo las concentraciones finales de la hAGT y del
[^{3}H]-metil-ADN 0.5 \muM y 50
\muM, respectivamente. Todas las reacciones se detuvieron por la
adición de 400 \mul de una solución acuosa de ácido
tricloroacético (TCA, Sigma) al 13%. El
[^{3}H]-metil-ADN restante, no
reparado por la acción de la hAGT se hidrolizó calentando la mezcla
de reacción hasta alcanzar 90ºC durante 30 min. La hAGT se
precipitó por centrifugación a 16100 g durante 10 minutos y se
lavaron los precipitados resultantes con una solución acuosa de
TCA al 5%. Tras dichos lavados se resuspendieron en 200 \mul de
solución tampón 0.2 M de Tris pH=8,0. La radioactividad
correspondiente al grupo ^{3}H-metil incorporado
a la hAGT durante la reacción enzimática de reparación del ADN se
midió con un contador de centelleo líquido (Wallac 1414),
utilizando el cóctel de centelleo Optiphase HiSafe 3 (Perkin
Elmer). Esta actividad remanente de la hAGT tras la preincubación
con los compuestos de la invención se calculó en relación a los
controles positivos, en los que la enzima se preincubó sólo con el
disolvente DMSO (con ningún compuesto inhibidor). Como control
negativo se usaron ensayos con la enzima
hAGT-C145S, mutante sin actividad. Todos los
ensayos se efectuaron por duplicado, y en cada uno de ellos las
diferentes concentraciones de los compuestos se realizaron por
cuadriplicado. Los resultados se expresan mediante el porcentaje de
actividad remanente de hAGT en relación a la determinada para los
controles positivos (en los que no hay inhibición de la actividad
reparadora de dicha enzima).
Los resultados de este ensayo se ilustran en la
Figura 5, donde se puede observar que los compuestos Ia y Ib,
inhiben la actividad reparadora del ADN metilado catalizada por la
hAGT, siendo mayor la eficacia inhibidora del compuesto Ib que la
del Ia (compárense las IC_{50}, concentración de compuesto
necesaria para reducir al 50% la actividad reparadora de ADN de la
hAGT).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Dado que la acción de la hAGT es la base de uno
de los mecanismos de supervivencia de las células frente a la
lesión en su ADN provocada por su metilación, puede concluirse que
la inhibición de dicha enzima debe provocar una mayor sensibilidad
por parte de las células a compuestos que, como los agentes
alquilantes usados en quimioterapia, inducen dichas lesiones. Este
es un efecto positivo desde el punto de vista terapéutico puesto
que optimiza la acción antitumoral de dichos agentes. Los autores
de la presente invención demostraron este efecto en cultivos de
células tumorales proveniente de adenocarcinoma colorectal humano
(código ATCC: HTB 38) tratadas con carmustina. En particular se
empleó el ensayo de formación de colonias, previamente utilizado en
el estudio de agentes adyuvantes de quimioterapia en células
tumorales [21].
Ensayo de formación de colonias. Se
sembraron 15000 células en cada uno de los 6 pocillos de placas de
cultivo (Falcon) utilizando como medio el RPMI 1640 (Genycell)
suplementado con 10% de suero fetal bovino (Biowhittaker). Tras una
incubación durante 48 horas a 37ºC se reemplazó el medio y se
añadió al nuevo medio diferentes concentraciones del compuesto Ia
(0, 5, 10, 50 y 100 \muM). Tras una
pre-incubación durante 6 horas con los compuestos
de la invención, se añadió a los cultivos carmustina
(1,3-Bis(2-cloroetil)1-nitrosourea,
también conocido como BCNU, Sigma) disuelta en una solución 1:1 de
tampón fosfato salino pH=7,6 y etanol para llegar a una
concentración final de 40 \muM en el medio de cultivo. Asimismo
se efectuaron controles positivos para cada uno de los cultivos con
las diferentes concentraciones de compuestos de la invención en los
que se añadía únicamente la solución 1:1 de tampón fosfato salino
pH=7,6 y etanol sin contener carmustina. Se incubaron todos los
cultivos 2 horas y se reemplazó el medio de cultivo por medio RPMI
suplementado con suero fetal bovino y que contenía las respectivas
concentraciones de los compuestos de la invención. Tras un periodo
de incubación de 16 horas se lavaron las células y se resembraron
2000 células por pocillo en nuevas placas de cultivo, creciéndose
los cultivos durante 12 días a 37ºC.
La eficacia de la hAGT para inhibir el
crecimiento celular se determinó mediante el recuento de las
colonias formadas usando tinción con violeta de cresilo (cristal
violeta, Merck). Tras una incubación en la solución de tinción
durante 30 minutos a temperatura ambiente se lavaron las colonias
varias veces con agua destilada y desionizada (MilliQ) y se dejaron
secar a temperatura ambiente. Finalmente, se resuspendieron con una
solución acuosa de ácido acético al 10% y se midió la absorbancia
de las resuspensiones a 590 nm. El número de colonias se representó
como porcentaje de las mismas respecto al valor observado en el
control negativo: células pre-incubadas e incubadas
sólo con el medio utilizado para disolver los distintos compuestos
de la invención (concentración = 0 \muM) y no tratadas con
carmustina (columnas en negro en el extremo izquierdo de todas las
gráficas).
Los resultados de este ensayo se ilustran en la
Figura 6. Se observó que los compuestos ensayados potenciaban el
efecto inhibidor de la proliferación celular o formación de
colonias mediado por la carmustina. El compuesto la reforzó el
efecto de la carmustina a concentraciones iguales o superiores a 10
\muM de dicho compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (6)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Uso de un compuesto derivado de piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona, de fórmula I5 en la que:- X es un átomo de carbono (C) o nitrógeno (N), indistintamente;- R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son iguales o diferentes y están independientemente seleccionados del grupo constituido por: hidrógeno, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquilmetil, cicloalquiletil, aminocarbonilalquil, alquiloxi lineal, alquiloxi ramificado, furilmetil, imidazolilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, R^{7}, metil-R^{7}, etil-R^{7}, propil-R^{7}, metoxi-R^{7}, etoxi-R^{7}, propoxi-R^{7}, donde R^{7} es un arilo en el que cada una de sus cinco posiciones restantes está sustituida por un grupo independientemente seleccionado entre hidrógeno, fluor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi (alquilóxido de 1 a 4 átomos de C), alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino;o bien un isómero, profármaco, solvato o sal farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto, en la elaboración de una composición farmacéutica o medicamento destinado al tratamiento del cáncer. - 2. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 donde- X es nitrógeno,- R^{1} es 2,5-dimetilfenil,- R^{2} es hidrógeno,- R^{3} es metoxi,- R^{4} es fenil-metil,compuesto denominado 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2
(1H)-quinolinona. - 3. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 donde- X es carbono,- R^{1} es fenil-metil,- R^{2} es metil,- R^{3} es hidrógeno,- R^{4} es fenil-metil,compuesto denominado 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolinona.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 4. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la composición farmacéutica o medicamento está destinado al tratamiento de un cáncer seleccionado del grupo que comprende: carcinoma de próstata, mama, pulmón, páncreas, esófago, laringe, tiroides, hígado, vejiga urinaria, riñón, útero, cerviz, carcinoma cólorrectal, gástrico, osteosarcoma, sarcoma de partes blandas y angiosarcoma; tumor hematopoyético (incluyendo leucemias y linfomas), neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, melanoma, carcinoma dérmico de células basales y carcinoma dérmico de células escamosas.
- 5. Composiciones farmacéuticas y medicamentos útiles para el tratamiento del cáncer por sí solos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas o medicamentos, caracterizados porque comprenden al menos:- un compuesto de fórmula I, o- un isómero, profármaco, solvato o sal farmacéuticamente aceptables de uno de dichos compuestos.
- 6. Composiciones farmacéuticas y medicamentos según la reivindicación 8 en la que el compuesto de fórmula I es:\bullet 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1-piperazinil][1-(fenilmetil)-1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1H)-quinolinona, o\bullet 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1H)quinolinona.
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Legal Events
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EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20091210 Kind code of ref document: A1 |
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Ref document number: 2330495B1 Country of ref document: ES |
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FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20110222 |