EA026409B1 - Соединение, ингибирующее деубиквитинирующую активность, и использование его в композиции и в способе лечения рака - Google Patents

Abstract

Соединение общей структуры (I), где R, R, R, Rи Rтакие, как описаны в формуле изобретения, способно аннулировать деубиквитинирующую (DUB) активность 19S RP DUB. Соединение можно применять для лечения рака, в частности рака, не восприимчивого к лечению современной химиотерапией. Также раскрыты соответствующие способы лечения и фармацевтическая композиция, содержащая данное соединение.

Description

Изобретение относится к соединению, способному аннулировать деубиквитинирующую активность 198 КР ΌυΒ. Изобретение также касается способа лечения у пациента рака, который оказывается устойчивым к лечению по меньшей мере одним противораковым лекарственным средством, и фармацевтической композиции, содержащей данное соединение.

Предпосылки изобретения

Опухолевые клетки демонстрируют повышенную чувствительность к нарушениям в убиквитинпротеасомной системе (УПС), делая ее привлекательной мишенью для разработки противораковых методов лечения [1]. Убиквитин-меченые субстраты разрушаются 268 протеасомой, мультисубъединичным комплексом, содержащим протеолитическое ядро 208 (208 СР), покрытое регуляторными частицами 198 (198 КР) [2, 3]. 208 СР эволюционировало как важная мишень для разработки противораковых лекарств, следствием чего является одобрение бортезомиба (Уе1сабе®) для лечения миелоидного лейкоза [4].

Известно, что соединение 6-ЛР15 (N80687852) индуцирует р53-независимый и (катепсин-Ό)зависимый апоптоз [5, 6].

Целью изобретения является получение соединения для применения в способе лечения рака у пациента посредством ингибирования деубиквитинирующей активности, в частности рака, не восприимчивого к современной химиотерапии.

В частности, целью изобретения является получение такого соединения для лечения у пациента рака, невосприимчивого к лечению, по меньшей мере, бортезомибом или агентом, участвующим в механизме бортезомиба по ингибированию деубиквитинирующей активности.

Другой целью изобретения является получение соединения упоминаемого выше вида, которое обладает повышенной растворимостью при физиологическом рН относительно функционально эквивалентных соединений, известных в данной области.

Дополнительной целью изобретения является обеспечение соответствующего способа.

Еще одной целью изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей данное соединение.

Дополнительные цели изобретения станут очевидны при изучении следующего краткого содержания изобретения, ряда предпочтительных вариантов, проиллюстрированных на чертежах, и приложенной формулы изобретения.

Краткое содержание изобретения

Согласно настоящему изобретению раскрыто соединение общей структуры 8

способное аннулировать деубиквитинирующую (ΌυΒ) активность 198 КР ΌυΒ.

Считают, что соединение по изобретению относится к новому классу ингибиторов протеасом, типичным представителем которых является известное соединение Б-АР15.

В частности, согласно настоящему изобретению соединение по изобретению ингибирует активность двух 198 КР ΌυΒ, иСНЬ5 и и8Р14, не влияя на непротеасомные ΌυΒ. Более конкретно, соединение по изобретению является эффективным при лечении раковой опухоли, не восприимчивой к современной химиотерапии вследствие чрезмерной экспрессии собственного ингибитора апоптоза Ес1-2.

Более конкретно, согласно настоящему изобретению соединение по изобретению является эффективным при лечении рака, не восприимчивого к лечению бортезомибом или агентом, участвующим в

- 1 026409 механизме бортезомиба по ингибированию деубиквитинирования. В другом предпочтительном варианте соединение является эффективным при лечении рака, не восприимчивого к любому противораковому препарату, известному в данной области.

В этом изобретении выражение не восприимчивый к лечению означает, что лечение рака посредством одной дозы противоракового лекарства не снижает существенно скорость роста рака, наблюдаемую непосредственно до начала лечения, например снижая скорость роста за месяц не более чем на 25, или 10, или даже 5% или менее. В частности, способ по изобретению является эффективным при лечении рака у пациента, который после приема одной или более, в частности двух или трех, стандартных доз бортезомиба, или агента, участвующего в апоптоз-генерирующей активности бортезомиба, или любого другого противоракового препарата, демонстрирует скорость роста рака за месяц, сниженную не более чем на 25, или 10, или даже 5% или менее, например любую положительную скорость роста, по сравнению со скоростью роста рака, наблюдаемой непосредственно до разовой обработки или до последней из двух, трех или большего количества обработок соответственно. Признанной мерой роста опухоли является изменение объема нераспространенного рака.

Примером рака, поддающегося лечению способом по изобретению, является множественная миелома. Другие примеры рака, поддающегося лечению, включают рак легких, рак простаты, рак толстой кишки, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак шеи и головы.

В соединении по изобретению общей структуры 8-1:

К¹, К² при двойной связи Й1 и К³, К⁴ при двойной связи Й2 могут независимо друг от друга иметь конфигурацию, противоположную конфигурации формулы 8-1;

X обозначает СО, С8, СН₂, СНС1_-6алкил, ΝΗ или ХС]_-6алкил;

К¹ и К³ независимо друг от друга обозначают Н или С1_-6алкил;

К² и К⁴ независимо друг от друга обозначают Н; С_1-6алкил; С1_-5алкил-СО; фенил или 6-членный гетероарил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из следующих: С1_-6алкил, С_1-6алкокси, ΟΝ, СОО-С1_-6алкил, СООН, ΝΟ₂, Р, С1, Вг, I, СР₃, ΝΗ₂, ΝΗ-С^алкил, ^С_1-6алкил)₂, СΟNК⁷К⁸, при условии, что один или более Н в алкиле и алкокси могут быть замещены атомом фтора;

К⁵ обозначает Н, С_1-6алкил, С_2-6алкенил, С1_-3алкокси-С_2-6алкил-, С_1-3алкокси-С_2-6алкенил-, арил-С_0-6алкил-, гетероарил-С_0-6алкил-, гетероциклил-С_0-6алкил-, циклоалкил-С_0-6алкил-,

-С1_-6алкил-СОО-С1_-6алкил, -С_2-6алкиларилокси, СОК⁶;

К⁶ выбран из следующих: С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С_1-6алкокси, С1_-3алкокси-С1_-6алкил-, С_1-3алкоксиС1-6алкенил-, арил-С0-6алкил-, гетероарил-С0-6алкил-, гетероциклил-С0-6алкил-, циклоалкил-С0-6алкил-, -С_1-6алкил-СОО-С_1-6алкил, ΝΗ₂, -МН-С_1-6алкил, -И(С_1-6алкил)₂, -С_0-6алкиларилокси;

К⁷, К⁸ независимо друг от друга обозначают Н или С_1-3алкил.

Для обоих радикалов К¹ и К³ предпочтительным значением является С_1-3алкил.

Для обоих радикалов К² и К⁴ предпочтительными значениями являются Н; С_1-6алкил; С_1-5алкил-СО; фенил или 6-членный гетероарил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из следующих: С_1-6алкил, С_1-6алкокси, ΟΝ, СОО-С_1-6алкил, СООН, NΟ₂, Р, С1, Вг, I, СР₃, ΝΗ₂, МН-С_1-6алкил, ^С_1-6алкил)₂, СОМК⁷К⁸, при условии, что один или более Н в алкиле и алкокси могут быть замещены атомом фтора, и где замещение фенила предпочтительно происходит по одному или нескольким из положений 3, 4, 5.

Для обоих радикалов К² и К⁴ особо предпочтительным значением является фенил, замещенный по одному или нескольким из положений 3, 4, 5 1-3 заместителями, предпочтительно 1 или 2 заместителями, выбранными из следующих: С1-6алкил, С1-6алкокси, ΟΝ, -СОО-С1-6алкил, СООИ. NΟ2, Р, С1, Вг, I, СР3, ΝΗ2, NΗ-С1-6алкил, ^С1-6алкил)2, СОМК⁷К⁸, при условии, что один или более Н в алкиле и алкокси могут быть замещены атомом фтора. Наиболее предпочтительными являются электронно-акцепторные заместители, в частности Р, С1, трифторметил, NΟ2, ΟΝ.

Для К⁵ предпочтительны значения, выбранные из группы, включающей Н, метил, ацетил, СООШСШ, 2-ацетоксиэтил.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения Х=СО. Согласно другому предпочтительному аспекту изобретения К¹ и К³, оба, обозначают Н. Согласно третьему предпочтительному аспекту изобретения, К² и К⁴ независимо друг от друга обозначают фенил или 6-членный гетероарил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из следующих: С_1-6алкил, С_1-6алкокси, ΟΝ, -СОО-С_1-6алкил, СООК NΟ₂, Р, С1, Вг, I, СР₃, ΝΗ₂, NΗ-С_1-6алкил, ^С_1-6алкил)₂, СОМК⁷К⁸, предпочтительным является фенил, и предпочтительным замещением в фениле, если таковое имеется, является замещение по одному или нескольким из положений 3, 4, 5.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения К¹, К² при двойной связи Й1 и К³, К⁴ при двойной связи Й2 имеют конфигурацию формулы 8-1; X обозначает СО, С8, СШ ОТ-С^алкил, ΝΗ или ^С1-6алкил; К¹ и К³ независимо друг от друга обозначают Н или С1-6алкил; К² и К⁴ независимо друг от друга обозначают Н; С_1-6алкил; С_1-5алкил-СО; фенил или 6-членный гетероарил, замещенный 1-3 заместителями, выбранными из следующих: ΟΝ, NΟ₂, Р, С1, Вг, I, ΝΗ₂, NΗ-С_1-6алкил, ^С_1-6алкил)₂, СО-С1-6алкил; К⁵ обозначает Н, С1-6алкил, С2-6алкенил, С1-3алкокси-С1-6алкил, С1-3алкокси-С1-6алкенил, арил, гетероарил, гетероциклил, С1-6алкилгетероарил, С1-6алкилгетероциклил, С1-6алкилциклоалкил,

- 2 026409

С_1-6алкиларил, СО-С_1-6алкил, СО-винил, СО-аллил, СО-арил, СО-циклоалкил. Независимо друг от друга, предпочтительным значением для X является СО, для К² и К⁴ - замещенный фенил, для К⁵ - значения, выбранные из СОК⁶, в частности значения, выбранные из СО-С_1-6алкила, СО-циклоалкила, СО-винила, СО-аллила.

Термин арил относится к моноциклическому или бициклическому углеводороду, имеющему от 6 до 10 атомов углерода и содержащему по меньшей мере один ароматический цикл. Термин арилокси относится к арильной группе, связанной с атомом кислорода. Термин гетероарил представляет моноциклическую кольцевую систему, имеющую 5 или 6 кольцевых атомов, среди которых один или более независимо выбраны из атома кислорода, азота, серы. Термин алкил обозначает линейный или разветвленный алкил. Термин алкенил обозначает линейный или разветвленный алкенил. Термин алкокси обозначает линейный или разветвленный алкокси. Термин циклоалкил относится к насыщенному моноциклическому углеводороду, имеющему от 3 до 7 атомов углерода.

Предпочтительные соединения по изобретению общей структуры §-1 раскрыты в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Предпочтительные соединения по изобретению Х=СО, К¹=К³=Н, К⁵=Н или алкил

№	К2	к4	в?	НСА116 КМСА 1С50 (мкМ)	МеСГи5о-иВ 1псиСуЬе наименьш. эффект. КОНЦ . (мкМ)
1516	фенил	фенил	н		1,2
1517	4-метоксифенил	4-метоксифенил	н
1518	4-нлорфенил	4-хлорфенил	н		1,6
1533	3-ацетилфенил	3-ацетилфенил	н
1535	3-нитрофенил	3-нитрофенил	н	5,9
1536	2-нитрофенил	2-нитрофенил	н	6, 9
1537	4-нитрофенил	4-нитрофенил	н	4,1
1560	4-нитрофенил*	Н**	н	1,0
1561	4-фторфенил	4-фторфенил	н	1,0	1

- 3 026409

1562	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	Н	0,5	0,25
1563	4-нитрофенил	4-нитрофенил	метил	1,5	0,5
1564	4-фторфенил	4-фторфенил	метил	0, 9	16
1565	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	метил	1,5	0,5
1566	3-нитрофенил	3-нитрофенил	метил	2,3	0,5
1574	4-фторфенил	4-фторфенил	пропи л	2,8	0,5
1575	4- нитрофенил	4- метоксифенил	н	2,1	1
1576	4-фторфенил	4-метоксифенил	н	1,6	8
1577	4-фторфенил	4-метоксифенил	метил	4,9	8
1582	4-фторфенил	4-хлорфенил	Н	1,7	2
1583	4- хлорфенил	4-нитрофенил	метил	3,3	2
1584	4-хлорфенил	4-нитрофенил	н	1,8	2
1585	4-фторфенил	4-нитрофенил	н	1,5	2
1586	4-хлорфенил	4-фторфенил	н	1,1	0,5
1587	4-фторфенил	4-нитрофенил	метил	3,0	1
1588	4-нитрофенил	4-метоксифенил	метил	3,1	1
1589	4-хлорфенил	4-фторфенил	метил	2,5	1
1590	4-хлорфенил	4-метоксифенил	метил	2,0	1
1591	4-нитрофенил	4-хлорфенил	н	0, 9	0,5
1592	4-хлорфенил	4-нитрофенил	н	12	4
1593	4-нитрофенил	4-фторфенил	метил	2,9	1
1594	4-нитрофенил	4-хлорфенил	метил	2,6	1
1595	4-фторфенил	4-хлорфенил	метил	2,3	1
1596	4-нитрофенил	4-фторфенил	Н	2,6	2
1608	З-хлоро-4- фторфенил	З-хлоро-4- фторфенил	метил	1,8	1
1609	4-фтор-3-трифтор- метилфенил	4-фтор-З- трифтор- метилфенил	метил	1,4	1
1610	3,4 дифторфенил	3,4- дифторфенил	метил	1,7	1
1611	З-фтор-5- трифторметил фенил	З-фтор-5- трифторметил фенил	н	1,1	0,5

- 4 026409

1612	З-фтор-5- трифторметил фенил	З-фтор-5- трифторметил фенил	метил	0,7	0,25
1613	4-нитрофенил	4-нитрофенил	Н	25	32
1614	4-нитрофенил	4-нитрофенил	метил	7,4	3
1615	4-нлоро-З- трифторметилфенил	4-нлоро-З- трифтор- метилфенил	метил	0,9	0,5
1616	3,4,5- трифтсрметилфенил	3,4,5-трифторметилфенил	метил	1,4	0,5
1617	4- трифторметил фенил	4-трифтор- метилфенил	метил	1,6	1
1618	З-циано-4- фторфенил	З-циано-4- фторфенил	метил	1,5	0,5
1619	3- карбониламинофенил	3-карбонил- аминофенил	н	30	32
1620	3-нитрофенил	3-нитрофенил	метил	>32	нет эффекта
1621	4-цианофенил	4-цианофенил	метил	4,5	2
1622	4-фтор-З-трифтор- метилфенил	4-фтор-З- трифтор- метилфенил	Н	0,8	0,5
1623	3-циано-4-фтор фенил	З-циано-4- фторфенил	н	1,0	0,5
1624	З-фтор-4-трифтор- метилфенил	З-фтор-4- трифтор- метилфенил	метил	1,8	1
1625	4-цианофенил	4-цианофенил	н	0,9	0,5
1626	З-фтор-4-трифтор- метилфенил	З-фтор-4- трифтор- метилфенил	н	0,8	8

или Η, или смесь Н и 4-нитрофенил ** или 4-нитрофенил или смесь Н и 4-нитрофенил Вследствие протонирования аминогруппы растворимость в водной среде азепаноновых соединений по изобретению, в которых К⁵ не является ацилом, а также соответственно замещенных пиперидин-4онов повышается с уменьшением рН. Однако согласно важному аспекту азепаноновые соединения по изобретению, в которых К⁵ не является ацилом (т.е. не является -СОК⁶), обладают превосходной растворимостью в водной среде при физиологическом рН по сравнению с соответственно замещенными пиперидин-4-онами. Хотя растворимость этих азепанонов и пиперидин-4-онов увеличивается при переходе от высоких рН к низким рН, для азепанонов увеличение начинается при более высоких значениях рН, чем для соответствующих пиперидин-4-онов. В этом изобретении физиологические рН соответствуют значениям рН от 6 до примерно 8, в частности от 7,0 до 7,5.

- 5 026409

Предпочтительные соединения по изобретению Х=СО, К¹=К³=Н, К⁵=СОК^б

Таблица 2

№	В2	В4	вй	ИСАИ 6 ГМСА 1С50 (мкМ)	МеСГиЗо-иВ 1псиСуГе наименыи. эффект. КОНЦ . (мкМ)
1505	4-нитрофенил	4-нитрофенил	2- пирролидинил	5,2	16
1507	4-нитрофенил	4-нитрофенил	2-(1- карбоксиэтил- зтил 1	4,4	8
1520	фенил	фенил	винил
1521	фенил	фенил	циклобутил
1525	4- метоксифенил	4- метоксифенил	циклобутил
1526	4- метоксифенил	4- метоксифенил	циклопропил
1527	4-хлорфенил	4-хлорфенил	циклобутил		2
1546	4-нитрофенил	4-нитрофенил	винил	1,2	2
1567	4-нитрофенил	4-нитрофенил	метил	0, 6	0, 5
1568	4-фторфенил	4-фторфенил	винил	1,5	2
1569	4-фторфенил	4-фторфенил	винил	2,0	4
1570	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	винил	0, 5	0,25

1571	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	метил	0,9	0,25
1572	3-нитрофенил	3-нитрофенил	винил	2,5	0,5
1578	4-фторфенил	4- метоксифенил	метил	7,0	8
1579	4-фторфенил	4- метоксифенил	метил	5,9	8
1580	4-нитрофенил	4- метоксифенил	винил	1,5	8
1581	4-нитрофенил	4- метоксифенил	метил	7,2	8
1597	4-нитрофенил	4-хлорфенил	метил	1,3	1
1627	4- трифторметилф енил	4- трифторметил фенил	метил	0,7	1
1623	3, 4- дифторфенил	3,4- дифторфенил	метил	2,3	1
1629	3,4,5- трифторфенил	з, 4,5- трифторфенил	метил	0,6	1
1630	4-хлоро-3- фторфенил	4-хлоро-З- фторфенил	метил	0,9	0,5
1631	3-хлоро-4- фторфенил	З-хлоро-4- фторфенил	метил	1,0	32
1633	4-хлорфенил	4-хлорфенил	2- ацетоксиэтил	2,2	4
1635	4-хлорфенил	4-хлорфенил	бензил	1,4	2
1636	4-хлорфенил	4-хлорфенил	1-(З-фенил-2- пропенил)	2,0	1
1637	4-хлорфенил	4-хлорфенил	3-пиридил	2,1	2
1638	4-хлорфенил	4-хлорфенил	2-тиофенил	2,0	2
1639	4-хлорфенил	4-хл орфе нил	4-гидрокси-3- этоксибензил	1,2	1
1640	4-хлорфенил	4-хл орфе нил	метил-(2- метокси карбоксил) фенил	1,9	1

- 7 026409

1641	4- трифторметил фенил	4- трифторметил фенил	метил-3- пиридил	2,7	2
1642	4- трифторметил фенил	4- трифторметил фенил	2-оксо- ацетоксиэтил	1,2	1
1643	4- трифторметил фенил	4- трифторметил фенил	3-(3- оксопропаноил оксиметил)	0,9	1
1644	4- трифторметил фенил	4- трифторметил фенил	1-ОКСО-2-(2- пиридил) этил	1,4	1
1645	4-хлоро-3- фторфенил	4-хлоро-З- фторфенил	2-оксо- ацетоксиэтил	2,5	2
1646	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	2-оксо- ацетокси- метил	1,1	1
1647	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	3- (3-оксо- пропаноил- оксиметил	0,7	0, 25
1648	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	1-оксо-2-(2- пиридил)этил	0,3	0, 5
1649	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	метил-(2- метокси) карбоксил фенил	0,9	0, 5
1650	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	метил-3- пиридил	1,9	1
1651	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	2-оксоацеток- сиэтил	0,8	0, 5
1652	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	3-13- оксопропаноил -окси)метил	0,6	0, 5
1653	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	1-оксо-2-(2- пиридил) этил	0, 71	1
1654	4-хлор-З- фторметил- фенил	4-хлор-З- фторметил- фенил	метил-(2- метоксикарбоксил)	1,2	1

- 8 026409

			фенил
1655	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	метил-3- пиридил	1,0	1
1656	4-хлор-3- трифтор метил-фенил	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	2- оксоацетокси- этил	0,7	0, 5
1657	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	ацетил	0,6	0, 5
1658	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	4-хлор-З- трифтор метил-фенил	1-оксо-2-(2- пиридил)этил	0,8	0, 5
1659	4- трифторметил- фенил	4- трифторметил фенил	2- ацетоксиэтил	2,4	2
1660	4-хлор-З- трифтор-фенил	4-хлор-З- трифтор- фенил	2- ацетоксиэтил	2,4	2
1661	4-хлор-З- фторфенил	4-хлор-З- фторфенил	Метил- карбоксил	24	32
1662	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	2- ацетоксиэтил	2,1	1
1663	4-фтор-З- нитрофенил	4-фтор-З- нитрофенил	метил- карбоксил	3,1	4
1664	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	2- ацетоксиэтил	2,8	4
1665	3,4,5- трифторфенил	3,4,5- трифторфенил	метил- карбоксил	5,0	3
1666	4-хлоро-З- трифторметилфенил	4-хлоро-З- трифтор- метилфенил	2- ацетоксиэтил	1,3	1

Растворимость в водной среде соединений по изобретению, в которых К⁵ обозначает ацил (т.е. -СОК⁶), существенно зависит от рН.

Особо предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения № 1561, 1562, 1567, 1570, 1571, 1586, 1591, 1600, 1612, 1618, 1622, 1625, 1643, 1644, 1647, 1648, 1649, 1652, 1653, 1656, 1657, 1658, 1662. Наиболее предпочтительными соединениями по изобретению являются соединения № 1570, 1571, 1625, 1662.

Поскольку соединение по изобретению содержит фрагмент 1,5-дизамещенный 1,4-пентен-3-он, то оно может существовать в виде четырех цис/трансизомеров ЕЕ, ΖΕ, Εδ, ΖΖ. Выше при определении соединения по изобретению эту изомерию определяют следующим образом: К¹, К² при двойной связи 61 и К³, К⁴ при двойной связи 62 могут независимо друг от друга иметь конфигурацию, противоположную конфигурации формулы δ1. Соединение по изобретению включает любой такой изомер и любую смесь таких изомеров.

При синтезе получают соединение по изобретению в виде смеси изомеров, но иногда также в виде изомера с самой низкой растворимостью в конкретном растворителе, из которого он осаждается или кристаллизуется. Притом что в контролируемых условиях можно таким образом получить чистые изомеры, фармакологический эффект демонстрируют все изомеры соединения. Причиной этого является их равновесие в присутствии воды или другого гидроксил- или сульфгидрилсодержащего растворителя или агента, достижение которого ускоряется посредством кислотного или основного катализа.

Таким образом, используемое здесь выражение соединение по изобретению включает чистый изомер вышеупомянутого вида, а также смесь двух или более таких изомеров. Скорость уравновешива- 9 026409 ния соединения по изобретению в водной жидкости организма достаточна для обеспечения, по существу, состояния равновесия в течение периода одной обработки.

Соединение по изобретению содержит азепановый фрагмент, предпочтительно фрагмент азепан-4он. Согласно важному аспекту изобретения соединение по изобретению демонстрирует цитотоксическую активность, превосходящую активность структурно соответствующего соединения, содержащего пиперидиновый фрагмент, например фрагмент 4-пиперидинон.

Согласно другому важному аспекту изобретения соединение по изобретению, содержащее азепановый фрагмент, в частности фрагмент азепан-4-он, демонстрирует растворимость в жидком носителе, подходящем для введения пациенту, например диметилсульфоксиде, превосходящую растворимость структурно соответствующего соединения, содержащего пиперидиновый фрагмент, например фрагмент 4-пиперидинон.

Выражение период разовой обработки обозначает период времени, протекающего между введением соединения по изобретению и его потреблением, т.е. моментом времени, в который концентрация соединения по изобретению на месте действия, например в опухоли, снижена на 90, или 95, или 99% и более. В фармацевтической композиции изомер или смесь изомеров соединения по изобретению стабилизируют от изомеризации посредством тщательного исключения влаги.

Способ по изобретению включает введение нуждающемуся пациенту фармакологически эффективной дозы соединения по изобретению в подходящем фармацевтическом носителе, например, растворенном или суспендированном в водном носителе или в носителе, содержащем диметилсульфоксид или Ν,Ν-диметилацетамид. Введение можно производить любым подходящим способом, таким как внутривенная, внутримышечная, внутрибрюшинная или подкожная инъекция или инфузия. Также предполагаются другие способы введения, в частности пероральный, для препаратов в виде таблеток или жестких или мягких желатиновых капсул.

Специалист в данной области знает, как определить фармакологически эффективную дозу. Такая доза может составлять от 0,0001 до 0,1 г/кг массы тела, в частности от 0,001 до 0,01 г/кг массы тела, с учетом способа введения агента, системно или локально.

В соответствии с ингибированием ΌυΒ лечение соединением по изобретению вызывает накопление полиубиквитинированных белков более высокой молекулярной массы по сравнению с лечением бортезомибом и дает более сильную реакцию на несложенные белки. Согласно изобретению также обнаружено, что индукция апоптоза соединением по изобретению отличается от действия бортезомиба, будучи не чувствительной к разрушению супрессора опухолей р53 и не чувствительной к чрезмерной экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2.

Согласно настоящему изобретению лечение соединением по изобретению ингибирует развитие опухоли на ίη νίνο моделях человеческой и мышиной карциномы молочной железы, легких, толстой кишки, головы и шеи и ингибирует инфильтрацию на модели острого миелоидного лейкоза (ЛМЬ). Впоследствии было раскрыто, что ингибирование активности ΌυΒ 198 КР соединением по изобретению является жизнеспособным вариантом лечения рака у людей и животных. Таким образом, более конкретно, раскрыт способ лечения у человека раковой опухоли, не восприимчивой к современной химиотерапии, включающий введение фармакологически эффективной дозы соединения по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. Способ по изобретению является особенно полезным для лечения пациента, имеющего опухоль, клетки которой не восприимчивы к лечению вследствие чрезмерной экспрессии собственного ингибитора апоптоза Вс1-2.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения 198 КР ΌυΒ включают иСНЬ5 и и8Р14. Согласно другому предпочтительному аспекту изобретения соединение по изобретению не влияет на деубиквитинирующую (ΌυΒ) активность непротеасомных ΌυΒ. Соединение по изобретению можно вводить в виде раствора или суспензии в жидком носителе любым подходящим способом, например посредством внутривенного, внутримышечного и подкожного введения. По-другому или дополнительно к этому, соединение по изобретению можно вводить перорально, например в виде таблетки или капсулы. Подходящая фармакологически эффективная доза соединения по изобретению составляет от 0,0001 до 0,1 г/кг массы тела, в частности от 0,001 до 0,01 г/кг массы тела, с учетом способа введения агента, системно или локально. Способ может включать выбор пациента, предполагаемого к лечению, посредством определения скорости роста рака до и после введения бортезомиба, или указанного действующего начала, участвующего в механизме бортезомиба по ингибированию деубиквитинирующей активности, или указанного другого противоракового лекарства, положительная скорость роста, в частности скорость роста более 5, или более 10, или более 25% в месяц, представляет собой маркер отбора.

Соединение по изобретению блокирует протеасомную функцию клеток, что подтверждается использованием репортерной клеточной линии, которая экспрессирует убиквитин, подвешенный к желтому флуоресцентному белку (СЬС76У-УРР). конститутивно предназначенному для протеасомной деградации [12]. Иммуноблоттинг и проточная цитометрия показывают зависимое от дозы накопление репортера ЕЬ-УЕР (1С₅₀=0,8 мкМ), предполагающее нарушение протеасомной функции. Так как ингибирование протеасомной функции характеризуется дефектами в убиквитиновом обороте [13], клетки НСТ11 карциномы толстой кишки обрабатывают соединением по изобретению и анализируют методом имму- 10 026409 ноблоттинга уровень сопряжения убиквитина. Обработка вызывает быстрое зависимое от времени накопление полиубиквитинированных белков более высокой молекулярной массы по сравнению с 208 СР ингибитором бортезомибом, предполагая, что соединение по изобретению ингибирует альтернативную ветвь УПС. Увеличение полиубиквитина связано с сильной протеотоксической реакцией, характеризуемой индукцией Н8РА6 (Ηδρ70Β'), Н8РА1В и ΌΝΑΙΒ1 (Ηδρ40).

Оборот многих регуляторных белков клеточного цикла регулируется УПС, включающей ингибиторы циклинзависимой киназы ρ21°^ιρ1, ρ27^Κιρ1 и опухолевый супрессор р53 [4]. Обработка соединением по изобретению повышает их уровни зависимым от дозы образом, не изменяя уровни орнитиндекарбоксилазы 1 (ОЭС1). убиквитиннезависимого протеасомного субстрата [8]. Увеличение регуляторов клеточного цикла сопровождается задержкой роста границы фаз О2/М и увеличением содержания 8иЬ-О1 ДНК. Наблюдаемая задержка клеточного цикла не связана с повышенными уровнями маркеров повреждения ДНК, таких как фосфорилированный р53 (в положении 8ег 15) [9] или Н2АХ (в положении 8ег 139) [10], предполагая, что Ь-АР15 не является генотоксичным агентом.

Увеличение 8иЬ-О1 ДНК, активация каспазы-3 и расщепление поли(АДФ-рибоза)полимеразы (РАКР) и цитокератина связаны с общим снижением жизнеспособности клеток при концентрациях лекарства, которые индуцируют накопление полиубиквитина, связывающего ингибирование УПС и апоптоз. Индукция апоптоза бортезомибом чувствительна к статусу супрессора опухоли р53 и чрезмерной экспрессии антиапоптического онкопротеина Вс1-2 [11, 12]. При использовании изогенных клонов раковых клеток толстой кишки НСТ116 продемонстрировано, что Ь-АР15-индуцированный апоптоз нечувствителен к чрезмерной экспрессии Вс1-2 и разрушению регуляторов апоптоза р52, ВАХ или РИМА. Измерение цитотоксической активности показывает, что соединение по изобретению является более токсичным для клеточной линии карциномы толстой кишки НТС-116, чем для иммортализованных клеток пигментного эпителия сетчатки (ЙТЕКТ-КРЕ1) и мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Соединение по изобретению демонстрирует более высокую степень цитотоксической активности по отношению к клеткам НТС-116, чем к нормальным типам клеток.

Наблюдаемое снижение активности клеточных протеасом нельзя объяснить ингибированием протеолитических активностей β субъединиц 208 СР. Ιη νίίτο эксперименты с использованием активностьспецифических субстратов не показывают ингибирования ни в одной из протеолитических активностей 208 СР или 268 протеасомы, диссоциации 198 КР и 208 СР или ингибирования связывания полиубиквитина с протеасомой.

Соединение по изобретению содержит элемент α-β диенон с двумя стерически доступными β атомами углерода. Ранее описан структурно аналогичный фармакофор, включенный в класс ингибиторов убиквитинизопептидаз [13]. Однако, когда тестируют клеточную ИИВ активность, используя убиквитин 7-амидо-4-метилкумарин (ЦЬ-АМС) на клетках, обработанных соединением по изобретению, не наблюдают снижения расщепления ЦЬ-АМС. Это демонстрирует, что соединение по изобретению не является общим ИиВ-ингибитором. Без ограничения теорией, сходства в структуре фармакофора и данные, показывающие, что соединение по изобретению ингибирует активность протеасом независимо от 208 СР, указывают, что соединение по изобретению ингибирует протеасомы, блокируя деубиквитинирующую активность 198 КР.

Ιη νίίτο исследования с использованием ЦЬ-АМС и очищенных протеасом 198 КР или 268 подтверждают, что соединение по изобретению ингибирует деубиквитинирующую активность обеих протеасом 198 КР и 268. Рекомбинантный убиквитин-ОРР является субстратом для активности 198 КР ИИВ [15]. Обработка 198 КР посредством Ь-АР15 эффективно ингибирует расщепление ИЬ-ОРР и убиквитинированного НИМ2. Тип убиквитиновых связей, присутствующих в полиубиквитиновой цепи определяет судьбу убиквитин-модифицированного субстрата.

К48-связанные полиубиквитиновые цепи обычно нацелены на присоединенные белки для деградации [14], тогда как К63-связанные цепи вовлечены в непротеолитические роли, включая репарацию ДНК [15] и сегрегацию митотических хромосом [16]. Реакции демонтажа убиквитиновой цепи выявили, что соединение по изобретению ингибирует 198 КР обработку обоих К48 и К63 связанных убиквитиновых тетрамеров. Наблюдаемое ингибирование разборки убиквитиновой цепи может стать причиной для накопления высокомолекулярных конъюгатов убиквитина в клетках, обрабатываемых соединением по изобретению.

Деубиквитинирующую активность протеасомы приписывают действию трех ИИВ (иСНЬ5, И8Р14 и РОН1), все они локализованы в 198 КР [17-19]. Оба иСНЬ5 и И8Р14 чувствительны к Ν-этилмалеимиду (NΕМ), общему ингибитору цистеинпротеаз, тогда как РОН1 не чувствителен к ингибированию посредством NΕМ, но чувствителен к метал-хелатирующим агентам, таким как НННИт-етракис-(2-пиридилметил)этилендиамин (ΊΤΕΝ) [20]. Эксперименты по ингибированию показывают, что остаточная активность ИИВ присутствует даже после совместной обработки 198 КР посредством и соединения по изобретению. Эта остаточная активность ИИВ аннулируется после совместной обработки 198 КР соединением по изобретению и ТРЕН предполагая, что соединение по изобретению сначала ингибирует один или оба NΕМ-чувствительных цистеиновых ИИВ. β-углероды соединения

- 11 026409 по изобретению могут служить в качестве фрагментов акцептора Михаэля, что приводит к ковалентному связыванию с цистеиновыми остатками в целевых белках. Однако ίη νίΐτο исследования показывают, что соединение по изобретению является обратимым ингибитором и что глутатион не препятствует ингибиторной активности соединения.

Для идентификации, какие конкретно ΌυΒ ингибируются при обработке соединением по изобретению, проводили эксперименты с конкурентным мечением, используя гемагглютинин-меченый убиквитинвинилсульфонон (НА-ЦЬУ8), активный сайт-направленный зонд, который необратимо взаимодействует с ΌυΒ цистеинового класса [17]. Инкубация протеасом 198 КР или 268 с соединением по изобретению уничтожает иЬ-У8 маркировку двух ΌυΒ с молекулярной массой, соответствующей иСНЬ5 и и8Р14. Аналогичный результат получают с использованием иЬУк на лизатах, получаемых из обработанных лекарством клеток. Иммуноблот анализ показывает сдвиг в сторону уменьшения молекулярной массы и8Р14 и иСНЬ5 вследствие потери активности и снижения иЬУ8 мечения. Это согласуется с аффинно очищенными протеасомами из клеток, обработанных соединением по изобретению, демонстрирующими пониженную ΌυΒ активность, ограниченную протеасомами и неочевидную в лизатах клеток. Дополнительные анализы ίη νίΐτο показывают минимальное ингибирование соединения по изобретению на рекомбинантных непротеасомных цистеиновых ΌυΒ, согласно с мнением, что ингибирование происходит не вследствие общей цистеиновой реактивности.

Соединение по изобретению действительно существенно уменьшает и даже останавливает рост опухоли ίη νίνο, как показано посредством его введения мышам, несущим ксенотрасплантаты человеческой или мышиной опухоли. Если соединение по изобретению вводят ежедневно мышам 8СГО, несущим ксенотрасплантаты РаОи карциномы головы и шеи, то наблюдают значительное ингибирование роста опухоли РаОи после ежедневной обработки соединением по изобретению (объем опухоли обработка/контроль, Т/С=0,4, р=<0,001). Некроз опухолевых клеток анализируют, измеряя производимый ксенотрансплантатом цитокератин (СК18) в циркуляции. Цитокератин-18 представляет собой биомаркер апоптоза [21, 22]; наблюдают значительное повышение уровней общего человеческого СК18 в плазме (р=0,01). Уровни расщепляемого каспазой СК18 (СК18-А§р396) повышаются умеренно по сравнению с общими уровнями, предполагая, что соединение по изобретению обладает активностью против опухолевых клеток ίη νίνο. Также показано, что соединение по изобретению ингибирует появление опухоли НСТ-116^Бс12+ ксенотрасплантатов карциномы толстой кишки у голых мышей, как демонстрирует значительная задержка появления опухоли по сравнению с контролями, обработанными носителем. Аналогично соединение по изобретению ингибирует рост опухоли на моделях сингенных мышей с применением режима менее частого введения.

Убиквитин С-терминальные гидролазы ШСН) и убиквитин-специфические протеазы (υ8Ρ) представляют собой основные подгруппы примерно из 100 ΌυΒ, кодируемых геномом человека [23]. Механизм специфичности соединения по изобретению для υ0ΗΌ5 и υ8Ρ14 в 198 КР может быть связан с уникальными конформациями этих ферментов в 198 КР или индуцированными лекарствами изменениями структуры 198 КР. Настоящие выводы согласуются с отчетами в данной области, указывающими, что потеря ЕСН1.5 и ^Р14, в отличие от потери только одного, ведет к накоплению полиубиквитинированных белков и ингибированию деградации клеточных белков [24].

Особо важным представляется наблюдение, что ΌυΒ ингибирование связано с комплексами убиквитин-субстрат высокой молекулярной массы. В клетках, обработанных соединением по изобретению, наблюдают сильную экспрессию генов шаперонов, означающую индукцию протеотоксической реакции. Аккумулирование комплексов убиквитин-субстрат высокой молекулярной массы в результате ингибирования ΌυΒ соединением по изобретению, по-видимому, генерирует сильную цитотоксичность.

Далее изобретение описано более подробно со ссылкой на его предпочтительные варианты, иллюстрированные чертежами, включающими ряд фигур.

Описание чертежей

На фиг. 1а-1о представлены диаграммы, иллюстрирующие дозозависимую индукцию цитотоксичности через 72 ч непрерывного воздействия на репортерную линию клеток НСТ-116 вариантами соединения по изобретению по измерениям РМСА (флуориметрический анализ цитотоксичности в микрокультурах), а также отсутствие такой индукции при использовании структурно родственных соединений, не входящих в изобретение. Обработанные клетки сравнивают с необработанными контролями (коэффициент выживания).

На фиг. 2а-2е представлены диаграммы, иллюстрирующие превосходную растворимость соединений по изобретению в водной среде при физиологическом рН.

На фиг. 3а-3£ представлены диаграммы, иллюстрирующие по методу фиг. 1а-1о превосходную цитотоксичность азепаноновых соединений по изобретению относительно структурно соответствующих пиперидин-4-оновых соединений, не входящих в изобретение.

- 12 026409

Описание предпочтительных вариантов

Методы.

Ιη νίίτο анализ активности протеасом выполняют на черном микротитровальном 96-ячеечном планшете, используя человеческие 208 протеасомы (Βοκίοη ВюсНст) в реакционном буфере (25 мМ Нерек, 0,5 мм ΕΌΤΆ, 0,03% 8Ό8) с применением Зис-ЕЬУУ-АМС, Ζ-ЕЬЕ-ЛМС или Вос-ЬККАМС в качестве субстратов для активности протеасом. Анализы деубиквитиназной активности выполняют, используя человеческий 198 КР (Βοκίοη Вюсйет) с убиквитином АМС в качестве субстрата. Для исследований ксенотрансплантата РаЭи 100-мкл-клеточную суспензию, содержащую 1х 10⁶ клеток, вводят подкожно в бок мышам 8СГО. После внесения опухоли мышей рандомизуют на контрольную или обрабатываемую группы и вводят 5 мг/кг соединения по изобретению или наполнителя. Определяют ίη νίνο уровни апоптоза и некроза клеток посредством детектирования расщепляемых каспазой и общих уровней цитокератина-18 в плазме, применяя исследования М30 Αρορίο^η^® и М65 ЕЬ18А® (Резауа). Методы описаны ниже более подробно.

Реагенты.

Реагенты получают из следующих источников:

протеасомы 208 (Е-360), протеасомы 268 (Е-365), протеасомы 198 (Е-366), 8ис-ЕЕУУ-АМС (8-280), Ζ-ЬЬЕ-АМС (8-230), Βοс-^КК-ΑМС (8-300), убиквитин-АМС (И-550), тетраубиквитин К63 (ИС-310), тетраубиквитин 48 (ИС-210), набор деконъюгирующих ферментов (КЕ10), НА-убиквитинвинилсульфон (И-212) (Βοκίοη Вюсйет);

анти-в-актин (АС-15), ОИС-1 (НРА001536) (8щта А1бпсй);

анти-ЖХ-3 (2775), анти-ОАРИН (2118), анти р44/42 МАРК (4695), анти фосфо-р44/42 МАРК (9101) ((Се11 8ίβηα1ίη8));

Ν-этилмалеимид (34115) (ЕМИ Сйетюа1к);

анти-убиквитин К48 (Ари2), анти-убиквитин (МАВ1510) ^Π^οκ); анти-р53 (ΌΟ1), анти-иСНЬ5 (Н-110), Нбт2 (8МР14) (8аФа Сги/);

анти-РАКР (С2-10), анти-р27 (0173-524), анти-активная каспаза-3 (С92-605) (ΒΌ Вюкаемсек); анти-и8Р14 (А300-919А) (Βеίйу1 ^аЬο^аίο^^еκ); анти-НА (12СА5) (Κο^).

Бортезомиб получают от ОерагИпет ο£ Ο^οίο^, КагоЮкка Βοκρίΐαΐ. 8\уебеш

Клеточные культуры.

Клетки МСР7 содержат в минимальной питательной среде МЕМ/с 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки НСТ-116 р53+/+, р53-/-, Βο1-2+/+, РИМА-/- и ВАХ-/- содержат в модифицированной среде Маккоя/с 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки НСТ-116 р53+/+, р53-/-, РИМА-/- и ВАХ-/генерируют, как описано в [25]. НСТ-116 ΒΟ-2+/+ клеточную линию генерируют, трансфицируя исходные клетки НСТ-116 р53+/+ посредством рСЕР4 ΒΟ-2 (Аббдеме плазмида 16461) [26] и выделяя клоны с высокой экспрессией. Клетки РаЭи и ЬЬС3 содержат в среде ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, №-пируватом, Нерек и несущественными аминокислотами. Клетки карциномы 4Т1,12Ь содержат в среде КРМ1, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Протеасомные репортерные линии клеток МеШ^ ИЬ-УРР генерируют, как описано в [12]). Клетки содержат в среде Игла, модифицированной Дульбекко с 10% фетальной телячьей сывороткой. Клеточную линию эпителия сетчатки генерируют, как описано в [12]). Все клетки содержат в среде Игла, модифицированной Дульбекко с 10% фетальной телячьей сывороткой. Линии сетчатки эпителиальных клеток генерируют, как описано в [28]. Все клетки содержат при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Исследования ингибирования протеасом и ΌΌΒ.

Ιη νίίτο исследования активности протеасом с использованием 208 СР (2 нМ) (Βο^οη ΒίοΟκιη) проводят при 37°С в 100 мкл реакционного буфера (25 мМ Нерек, 0,5 мМ ЕИТА, 0,03% 8Ό8). Образцы инкубируют в течение 10 мин с указанным соединением, а затем добавляют 10 мкМ 8ис-ЕЕУУ-АМС, Ζ-ЕЕЕ-АМС или Βοс-^ΚΚ-ЛМС для детектирования химотрипсин-подобной, каспаза-подобной и трипсин-подобной активности соответственно. Для исследований ингибирования ΌΌΒ инкубируют 198 КР (5 нМ), 268 (5 нМ) ИСН-Ы (5 нМ), иСН-Ь3 (0,3 нМ), И8Р2СИ (5 нМ), И8Р7СИ (5 нМ), И8Р8СИ (5 нМ) и ВАР1 (5 нМ) с соединением по изобретению, а затем добавляют убиквитин-АМС (1000 нМ). Флуоресценцию контролируют, используя счетчики \Уа11ас Ми1й1аЬе1 или Τесаη IηΠη^ίе М1000, оснащенные возбуждающими 360 нм и эмиссионными 460 нм фильтрами.

Исследования с наложением субстрата.

Нативный гель-электрофорез выполняют, как описано в [29]. Кратко говоря, 4 мкг очищенных протеасом 268 (Βο^οη Β^οсйет) смешивают с 10 или 50 мкМ соединения по изобретению и инкубируют при 37°С в течение 10 мин. Образцы разделяют в 4% неденатурирующем РАОЕ. Гели погружают в исследовательский буфер (20 мМ трис-НС1, 5 мМ МдС1₂, 1 мМ АТФ, 0,1 мМ 8ис-ЕЕУУ-АМС) и визуализируют протеасомы при УФ-освещении.

- 13 026409

Исследование расщепления убиквитином.

Рекомбинантную ИЬ-ОРР плазмиду реИ9Ь ИЬ-М-ОРР генерируют, как описано в [30]. Кратко говоря, рекомбинантную ИЬ-ОРР очищают от клеток ВЬ21 Е.соН посредством Ηίδ-аффинного очищения. Для исследований расщепления 198 КР (25 нМ) инкубируют с 10 мМ ΝΕΜ, 250 мкМ ΤΡΕΝ или 50 мкМ соединения по изобретению в течение 10 мин с последующим добавлением рекомбинантных ИЬ-ОРР (200 нМ). Реакции разборки убиквитиновой цепи выполняют, по существу, как описано выше, за исключением того, что ИЬ-ОРР заменяют К48- или К63-связанными убиквитиновыми тетрамерами (50 нг). Уровень ИЬ-ОРР расщепления или убиквитиновой разборки определяют методом иммуноблоттинга с антиубиквитиновыми антителами.

Убиквитинированный Нйт2 субстрат генерируют согласно протоколу ВоЧоп ВюсНет (К-200). Для исследования расщепления 198 КР (25 нМ) инкубируют с 50 мкМ соединения по изобретению или ДМСО в течение 10 мин с последующим добавлением убиквитинированного Нйт2 субстрата (100 нМ). Расщепление убиквитинированного Нйт2 субстрата и убиквитинированного Нйт2 определяют методом иммуноблоттинга с анти-Нйт2 антителами.

Выделение протеасом: клетки НСТ-116 обрабатывают бортезомибом (100 нМ) или соединением по изобретению (1 мкМ) в течение 3 ч. После стимуляции клетки лизируют в 50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 250 мМ сахароза, 10 мМ МдС1₂, 2 мМ АТФ, 1 мМ БТТ и 0,025% дигитонин. На образцы кратко воздействуют ультразвуком и инкубируют в течение 15 мин на льду. Протеасомы из этих образцов выделяют согласно протоколу производителя.

ИЬУ8-мечение БИВ.

Для мечения БИВ в лизатах клеток собирают субконфлюэнтные клетки трипсинизацией, промывают три раза РВ8 и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Гранулы клеток лизируют буфером (50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 250 мМ сахароза, 10 мМ МдС1₂, 2 мМ АТФ, 1 мм БТТ) на льду в течение 15 мин. Остатки удаляют центрифугированием и 25 мкг белка метят посредством 1 мкМ НА-ИЬУ8 в течение 30 мин при 37°С. Образцы разделяют методом 8Б8-РАОЕ и анализируют методом иммуноблоттинга с указанными антителами.

Определение апоптоза и жизнеспособности клеток.

Для определения апоптоза исходные клетки НСТ-116 р53+/+ обрабатывают возрастающими дозами соединения по изобретению в течение 24 ч. Применяемые для обработки дозы основаны на концентрации лекарства, которая дает максимальный апоптоз через 24 ч. Клетки НСТ-116 высевают на 96-ячеечные микротитровальные планшеты при плотности 10000 клеток/ячейку и инкубируют в течение ночи. Клетки обрабатывают указанным лекарственным препаратом в течение 24 ч. В конце инкубационного периода добавляют к среде для культивирования ткани №40 до 0,1% и исследуют 25 мкл содержимого из каждой ячейки, применяя М30-Арор!о8еи5е® ЕЬ18А, как описано ранее [31]. Жизнеспособность клеток определяют, измеряя кислотную фосфатазную активность или применяя метод РМСА [32]. Для определения кислотной фосфатазной активности клетки высевают на 96-ячеечные планшеты для культивирования с плотностью 5000 клеток/ячейку и инкубируют в течение 12 ч при 37°С. К клеткам в питательной среде добавляют соединения и инкубируют в течение 72 ч при 37°С. Клетки промывают 200 мкл теплого РВ8. Добавляют 100 мкл паранитрофенилфосфата (р№Р, 2 мг/мл) в Να-ацетатном буфере с рН 5 (№Ас 0,1 М, 0,1% Ттйоп-Х-100) на ячейку. Клетки инкубируют в течение 2 ч, после чего реакцию останавливают, добавляя 1н. №ЮН. Измеряют поглощение при 405 нм. На фиг. 1а-1о показана дозозависимая цитотоксичность для ряда вариантов соединения по изобретению.

Для РМСА исследования клетки высевают на 384-ячеечные планшеты, подготовленные с использованием, применяя дозировочный робот Ргесыоп 2000 (Вю-Тек НШгшпепй 1пс., ХУтоойо. УТ). Планшеты инкубируют в течение 72 ч и затем переносят на комплексную систему НТ8 8АIОАN Соге 8у8!ет, включающую робот ОКСА (Весктап СоиНет) с СО₂-инкубатором (Су1ота1 2С, Кепйго, 8о11еп!ипа, 8^ейеп), диспенсерный модуль (МиШйтор 384, Тйейек, НиШэтШе, АЬ), промывочный модуль (ЕЬх 405, Вю-Тек НШгитепЦ 1пс), станцию для извлечения, места для размещения планшетов, считыватель штрихкодов (Весктап СоиНет), устройство подачи жидкостей (Вютек 2000, Весктап СоиНег) и многоцелевой ридер (РИИО81ат Орйта, ВМО ИаЫесН ОтЬН, ОйепЬигд, Оегтапу) для автоматизированного анализа РМСА. Коэффициент выживания (81) определяют как флуоресценцию тестируемых ячеек в процентах от контролей при вычете контрольных значений.

Анализ клеточного цикла.

Для определения клеточного цикла клетки НСТ-116 обрабатывают соединением по изобретению или ДМСО, собирают клетки трипсинизацией, промывают и фиксируют в охлажденном на льду 70% ЕЮН в течение 12 ч. Клетки повторно суспендируют в окрашивающем растворе, содержащем пропидий йодид (50 мкг/мл) и РНКазу (0,5 мкг/мл) в РВ8. Образцы исследуют на ВБ РАС8саНЬиг. Определяют процент клеток на каждой фазе клеточного цикла, используя программное обеспечение Мой ΕίΙ.

- 14 026409

Пример 1. Типичный синтез предпочтительных вариантов соединения по изобретению.

Общая информация.

Все используемые растворители имеют ВЭЖХ-класс чистоты или выше. Когда требуются безводные условия, для обеспечения сухости добавляют в растворитель избыток 3 А молекулярных сит по меньшей мере за 24 ч до использования. Спектры ядерного магнитного резонанса (¹Н ЯМР) регистрируют на спектрометре Бгикег Абуапсе ЭРХ 400 при 400,1 МГц. Масс-спектры низкого разрешения при ионизации электрораспылением получают, используя масс-спектрометр Лдбеи! в режиме положительной ионизации. Флэш-хроматографию выполняют на Мегск силикагеле 60 (230-400 меш). Аналитические ЖХ-МС данные получают на масс-спектрометре Адбеи!; система Лдбеи! 1100; А: колонка АСЕ С8 (50x3,0 мм, 5 мкМ), градиент: 10-97% ацетонитрил в смеси вода/0,1% ТФУ, за 3 мин 1,0 мл/мин или В: колонка хБпбде С18 (50x3,0 мм, 3,5 мкМ), градиент ацетонитрил от 10 до 97% в 10 мМ ΝΗ·Ηί.Ό₃, (рН 10) за 3 мин, 1 мл/мин). Названия химических структур определяют, используя Магуш 8еесЬ 5.2.6, СЬетАхоп.

(3Е,5Е)-3,5-бис-(Фенилметилиден)азепан-4-он (№ 1516) и (3Е,5Е)-3,5-бис-(4-метоксифенилметилиден)азепан-4-он (№ 1517).

Гексагидро-4Н-азепин-4-он (0,45 г, 3,0 ммоль) вместе с бензальдегидом (0,70 г, 7,0 ммоль), 4-метоксибензальдегидом (0,90 г, 7,0 ммоль) или 4-хлорбензальдегидом (0,92 г, 7,0 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (10 мл). Затем добавляют по капле серную кислоту (конц. 1 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при к.т. Добавляют воду (30 мл) и осадок отфильтровывают и сушат в вакууме в течение ночи. Дополнительную очистку не проводят. Соединение № 1516 получают с 99% степенью чистоты, определяемой методом ЖХ-МС (система А).

М8 Ε8Ι+ т/ζ 290 [М+Н].

Соединение № 1517 также получают с 99% степенью чистоты, методом ЖХ-МС (система А), М8 Ε8Τ т/ζ 350 [М+Н]+.

Соединение № 1518 получают с 91% степенью чистоты; ЖХ-МС (система А), М8 Ε8Τ т/ζ 358 [М]+, 360 [М+2]⁺.

(3Е,5Е)-3,5-бис-(Фенилметилиден)-1-(проп-2-еноил)азепан-4-он (№ 1520).

(3Е,5Е)-3,5-бис-(Фенилметилиден)азепан-4-он (№ 1516) (50,0 мг, 0,182 ммоль) и акриловую кислоту (14,4 мг, 0,20 ммоль), ΗΒΤυ (58,4 мг, 0,182 ммоль), триэтиламин (36,7 мг, 0,364 ммоль) растворяют в ДМФА (2 мл) и перемешивают в течение ночи. Добавляют этилацетат и насыщенный раствор соли и продукты экстрагируют. Объединенные органические слои сушат и выпаривают. Сырой продукт разводят метанолом и очищают методом препаративной ВЭЖХ. Соединение № 1520 получают с 96% степенью чистоты.

М8-Е81+ т/ζ 344 [М+Н]+.

(2К)-[(3Е,5Е)-3,5-бис-(4-Нитрофенилметилиден)-4-оксо-1-(пирролидин-2-илкарбонил)азепан трифторацетат (№ 1505).

Ν-Бос-азепанон (100 мг, 0,47 ммоль) и 4-нитробензальдегид (156 мг, 1,03 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (10 мл). Затем добавляют по капле серную кислоту (конц. 1 мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение трех дней. Далее добавляют еще альдегид и серную кислоту и реакционную смесь перемешивают еще 24 ч, еще дважды добавляют кислоту с интервалом 24 ч. Реакционную смесь гасят, добавляя воду и выпавшие в осадок сырые промежуточные продукты отфильтровывают и промывают водой. После сушки продукта в вакууме в течение ночи отвешивают 2x35 мг (0,09 ммоль) сырого промежуточного продукта в две колбы и растворяют вместе с моноэтилсукцинатом (14,8 мг, 0,10 ммоль) в смеси ДХМ/ДМФА (2 мл, 4:1). Добавляют триэтиламин (19,3 мкл, 0,14 ммоль) и смесь перемешивают 5 мин. перед введением ΗΑΤυ (38,6 мг, 0,10 ммоль). После перемешивания в течение 12 ч добавляют еще триэтиламин и ΗΑΤυ и продолжают перемешивание в течение 4 ч. Растворители выпаривают и остаток очищают методом препаративной ВЭЖХ. Растворяют остаток в смеси дихлорметан/трифторуксусная кислота (5 мл, 4:1), перемешивают 40 мин и снова концентрируют. Соединение № 1505 получают с 93% степенью чистоты по данным ЖХ-МС (система А).

М8 Ε8Ι+ т/ζ 477 [М+Н]+.

Пример 2. Дополнительные типичные примеры синтеза предпочтительных вариантов соединения по изобретению.

(2К)-2-{(3Е,5Е)-3,5-бис-[(4-Нитрофенил)метилиден]-4-оксоазепан-1-карбонил}пирролидиний трифторацетат (соединение № 1505).

N-Βос-азепан-4-он (0,10 г, 0,47 ммоль) и 4-нитробензальдегид (156 мг, 1,0 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (10 мл), добавляют по капле конц. Н₂8О₄ (1 мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение выходных. Добавляют еще альдегид (156 мг) и Н₂8О₄ (1 мл) и продолжают перемешивание при к.т. в течение ночи. Добавляют еще конц. Н₂8О₄ и реакционную смесь снова перемешивают в течение ночи. Добавляют еще конц. Н₂8О₄ и реакционную смесь перемешивают до завершения взаимодействия (две недели). После добавления воды образуется коричневый осадок, его отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме, получая 339,5 мг коричневого твердого промежуточного продукта 1, ко- 15 026409 торый используют без дополнительной очистки. Промежуточный продукт 1 (35 мг, 0,09 ммоль) и Ν-Ьос-пролин (22 мг, 0,10 ммоль) растворяют в смеси ДХМ/ДМФА (4:1, 2 мл). Добавляют ТЭА (19 мкл, 0,14 ммоль) и смесь перемешивают в течение 5 мин, затем добавляют НАТИ (38,6 мг, 0,10 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют еще ТЭА (19 мкл, 0,14 ммоль) и НАТи (38,6 мг, 0,10 ммоль) и реакционную смесь перемешивают еще 4 ч. Реакционную смесь концентрируют и затем очищают методом препаративной ЖХ (40-70% АСN в 0,1% ТФУ), получая продукт в виде желтого твердого вещества. Твердое вещество растворяют в смеси ДХМ/ТФУ (4:1, 5 мл) и раствор перемешивают при к.т. 40 мин для удаления защитной группы Ьос. ТФУ-соль продукта выделяют в виде желтого твердого вещества 93% степени чистоты.

ЖХ-МС А: К1 1,94/1,99, т/ζ [М+Н]+ 477,1; В: К1 2,28.

(3Е,5Е)-1-(4-Этокси-4-оксобутаноил)-3,5-бис-[(4-нитрофенил)метилиден]-4-оксоазепан-1-ий трифторацетат (соединение № 1507).

Промежуточный продукт 1 (35 мг, 0,09 ммоль) и Ν-Ьос-пролин (22 мг, 0,10 ммоль) растворяют в смеси ДХМ/ДМФА (4:1, 2 мл). Добавляют ТЭА (19 мкл, 0,14 ммоль) и смесь перемешивают в течение 5 мин, затем добавляют НАТИ (38,6 мг, 0,10 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют еще ТЭА (19 мкл, 0,14 ммоль) и НАТИ (38,6 мг, 0,10 ммоль) и реакционную смесь перемешивают еще 4 ч. Реакционную смесь концентрируют и затем очищают методом препаративной ЖХ (40-70% АСN в 0,1% ТФУ), получая ТФУ-соль продукта в виде желтого твердого вещества с 95% степенью чистоты.

ЖХ-МС А: К1 2,48/2,50, т/ζ [М+Н]+ 508,1; В: К1 2,48/2,52.

(3Е,5Е)-3,5-бис-[(4-Хлорофенил)метилиден]азепан-4-он (соединение № 1518).

Азепан-4-он гидрохлорид (0,45 г, 3,0 ммоль) и 4-хлорбензальдегид (0,92 г, 6,6 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (10 мл), добавляют по капле конц. Н₂§О₄ (1 мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение 24 ч. После добавления воды (30 мл) образуется осадок, его отфильтровывают и сушат в вакууме, получая продукт с 91% степенью чистоты в виде желтого твердого вещества.

ЖХ-МС А: К1 2,04, т/ζ [М]+ 358,1.

(3Е,5Е)-3,5-бис-(Фенилметилиден)-1-(проп-2-еноил)азепан-4-он (соединение № 1520).

Азепан-4-он гидрохлорид (50 мг, 0,182 ммоль), акриловую кислоту (14 мкл, 0,20 ммоль), ТВТи (58 мг, 0,182 ммоль) и ТЭА (37 мг, 0,364 ммоль) растворяют в ДМФА (2 мл) и перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют насыщенный раствор соли и этилацетат и фазы разделяют. Сушат органическую фазу и растворители выпаривают после фильтрования. Сырой продукт растворяют в уксусной кислоте (2 мл) и Н₂§О₄ (0,2 мл). Добавляют бензальдегид (50 мкл) и реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч. Добавляют метанол и воду к смеси, которую очищают методом препаративной ЖХ. Указанное в заголовке соединение выделяют в виде желтого твердого вещества с 96% степенью чистоты.

ЖХ-МС А: К1 2,68, т/ζ [М+Н]+ 344,1.

(3Е,5Е)-3,5-бис-(Фенилметилиден)-1-циклобутанкарбонилазепан-4-он (соединение № 1521).

Азепан-4-он гидрохлорид (50 мг, 0,182 ммоль), цикломасляную кислоту (14 мкл, 0,20 ммоль), ТВТИ (58 мг, 0,182 ммоль) и ТЭА (37 мг, 0,364 ммоль) растворяют в ДМФА (2 мл) и перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют насыщенный раствор соли и этилацетат и фазы разделяют. Сушат органическую фазу и растворители выпаривают после фильтрования. Сырой продукт растворяют в уксусной кислоте (2 мл) и Н₂§О₄ (0,2 мл). Добавляют бензальдегид (50 мкл) и реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч. Добавляют метанол и воду к смеси, которую очищают методом препаративной ЖХ. Указанное в заголовке соединение выделяют в виде желтого твердого вещества с 96% степенью чистоты.

ЖХ-МС А: К1 2,68, т/ζ [М+Н]+ 372,1.

(3Е,5Е)-1-(2-Циклопропилацетил)-3,5-бис-[(4-метоксифенил)метилиден]азепан-4-он (соединение № 1526)

Азепан-4-он гидрохлорид (0,45 г, 3,0 ммоль) и 4-метоксибензальдегид (0,90 г, 6,6 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (10 мл), добавляют по капле конц. Н₂§О₄ (1 мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение 24 ч. Добавляют воду (30 мл). Осадок отфильтровывают и сушат в вакууме в течение ночи. Сырой материал (30 мг, 0,107 ммоль), циклопропилуксусную кислоту (12 мг, 0,12 ммоль), ТЭА (26 мг, 0,2 6 ммоль) и ТВТИ (41 мг, 0,13 ммоль) растворяют в ДМФА (2 мл) и перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют метанол (1,5 мл) и воду (0,5 мл) и очищают продукт методом препаративной ЖХ, получая твердый продукт с 95% степенью чистоты.

ЖХ-МС А: К1 2,51, т/ζ [М+Н]+ 432,2.

(3Е,5Е)-5-[(3-Нитрофенил)метилиден]-3-(фенилметилиден)азепан-4-он (соединение № 1560).

ЮВос-азепан-4-он (0,10 г, 0,47 ммоль) и 3-нитробензальдегид (156 мг, 1,0 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (5 мл), добавляют по капле концентрированную Н₂§О₄ (0,5 мл) и перемешивают реакционную смесь при к.т. в течение 4 дней. Затем добавляют еще концентрированную Н₂§О₄ (0,5 мл) и альдегид (156 мг, 1,0 ммоль) и продолжают перемешивание при к.т. в течение трех недель. Получают смесь продуктов моно- и диконденсации. Смесь очищают методом колоночной хроматографии (ДХМ/метанол), получая промежуточный амин, промежуточный продукт 2, в виде коричневого масла (19 мг). Промежуточный продукт 2 растворяют в уксусной кислоте (1,5 мл) вместе с бензальдегидом.

- 16 026409

Добавляют конц. Н₂§0₄ (0,05 мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение ночи. Затем добавляют еще Н₂§0₄ и продолжают перемешивание в течение недели. Добавляют еще альдегид (156 мг, 1,0 ммоль) и Н₂§0₄ и продолжают перемешивание еще 4 дня. Реакционную смесь концентрируют и очищают методом препаративной ЖХ, получая ТФУ-соль продукта в виде желтого твердого вещества с 98% степенью чистоты.

ЖХ-МС система Α: Κί 1,78, т/ζ [М+Н]+ 335,1; система В: Κί 2,43/2,28.

(3Е,5Е)-1-Метил-3,5-бис-[(4-нитрофенил)метилиден]азепан-4-он (соединение № 1563).

Ы-Метилазепан-4-он-НС1 (50 мг, 0,30 ммоль) и 4-нитробензальдегид растворяют в уксусной кислоте (5 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§0₄ (50 мкл) и смесь перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют еще концентрированную Н₂§0₄ (100 мкл) и продолжают перемешивание при к.т. в течение 6 ч. Добавляют еще 500 мкл концентрированной Н₂§0₄ и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Добавляют еще 350 мкл конц. Н₂§0₄ и продолжают перемешивание еще 5 ч, в течение которых добавляют еще Н₂§0₄ двумя порциями (500 мкл и 250 мкл). Затем добавляют воду (3 реакционных объема) и смесь перемешивают до достижения комнатной температуры. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом (3 реакционных объема). Фазы разделяют и органическую фазу концентрируют, получая темно-желтое вязкое масло. Сырой продукт очищают методом препаративной ВЭЖХ (колонка ΧΒπύβο; элюенты 50 мМ аммоний-карбонатный буфер с рН 10 и метанол), получая указанный в заголовке продукт в виде желтого твердого вещества (26,3 мг).

ЖХ-МС система А: Κί 1,87, т/ζ [М+Н]+ 394,1; система В: Κί 2,57.

(3Е,5Е)-3,5-бис-[(4-Фторфенил)метилиден]-1-пропилазепан-4-он (соединение № 1574).

Азепан-4-он гидрохлорид (0,25 г, 1,68 ммоль) и 4-фторбензальдегид (0,416 г, 3,36 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (20 мл) и раствор перемешивают в течение 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§0₄ (200 мкл) и раствор перемешивают при к.т. в течение ночи. Добавляют еще конц. Н₂§0₄ (1 мл) и перемешивание продолжают при к.т. Через 6 ч добавляют еще конц. Н₂§0₄ и реакционную смесь снова перемешивают в течение ночи. На следующий день добавляют еще 800 мкл конц. Н₂§0₄ и продолжают перемешивание пять дней, в течение которых добавляют к реакционной смеси две порции Н₂§0₄ (1 и 0,5 мл). Затем добавляют воду (3 реакционных объема) и смесь перемешивают до достижения комнатной температуры. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом (10 реакционных объемов).

Органическую фазу концентрируют выпариванием. Добавляют к остатку воду. Образуется осадок, его отфильтровывают. Твердое вещество промывают водой и сушат в вакууме, получая промежуточный продукт 3 в виде желтого твердого вещества. Часть его (15 мг, 0,05 ммоль) растворяют в ДХЭ, добавляют пропанал (4 мкл, 0,06 ммоль) и смесь перемешивают в течение 15 мин при к.т. Затем добавляют NаΒН(0Αс)з (15,7 мг, 0,07 ммоль) и уксусную кислоту (2,6 мкл, 0,05 ммоль) и перемешивают реакционную смесь при к.т. в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют и очищают сырой продукт методом препаративной ЖХ, получая продукт (7,2 мг) с 90% степенью чистоты.

ЖХ-МС система Α: Κί 2,02, т/ζ [М+Н]+ 368,1, система В: Κί 3,21.

(3Е,5Е)-3-[(4-Метоксифенил)метилиден]-5-[(4-нитрофенил)метилиден]азепан-4-он (соединение № 1575).

Азепан-4-он гидрохлорид (0,25 г, 1,68 ммоль) и 4-нитробензальдегид (253 мг, 1,68 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (20 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§0₄ (1 мл) и смесь перемешивают при к.т. в течение 8 дней. В дни 1-3 добавляют одну порцию конц. Н₂§0₄ в день (0,5 мл, 0,75 мл и 0,5 мл). Добавляют воду (2 реакционных объема) и смесь экстрагируют этилацетатом (2 реакционных объема). Органическую фазу концентрируют выпариванием и сушат, получая сырой промежуточный продукт 4. Часть промежуточного продукта 4 (100 мг, 0,41 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (6 мл) и перемешивают 10 мин, а затем медленно добавляют концентрированную Н₂§0₄ (0,6 мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение 6 дней. После добавления воды продукт осаждается в виде желтого твердого вещества. Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме, получая указанное в заголовке соединение в виде желтого твердого вещества с 98% степенью чистоты.

ЖХ-МС система Α: Κί 1,82, т/ζ [М+Н]+ 365,1; система В: Κί 2,41.

Ή-ЯМР (400 МГц, С1)С1_;) [м.д.] = 2,97-2,99 (м, 2Н), 3,41-3,44 (м, 2Н), 3,83 (ш.с, 3Н), 4,28 (с, 2Н), 7,06-7,08 (д, 2Н), 7,47 (с, 1Н), 7,59-7,62 (д, 2Н), 7,76 (с, 1Н), 7,78-7,80 (д, 2Н), 8,27-8,29 (д, 2Н).

(3Е,5Е)-5-[(4-Фторфенил)метилиден] -3-[(4-метоксифенил)метилиден] -1 -метилазепан-4-он (соединение № 1577).

Ы-Метилазепан-4-он гидрохлорид (75 мг, 0,46 ммоль) и 4-фторбензальдегид растворяют в уксусной кислоте (7 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§0₄ (350 мкл) и смесь перемешивают при к.т. в течение 8 дней. В течение дней 2-4 добавляют еще конц. Н₂§0₄ (0,175, 0,35, 0,25 мл соответственно). Добавляют воду и раствор экстрагируют этилацетатом (двойной объем реакционной смеси). Органическую фазу концентрируют, получая промежуточный продукт 5. Часть этого промежуточного продукта (35 мг, 0,15 ммоль) и 4-метоксибензальдегид (17 мкл, 0,15 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (2,5 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§0₄ (0,20 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение пяти дней. Добавляют воду (2 реакционных объема) и реакци- 17 026409 онную смесь экстрагируют этилацетатом (2 реакционных объема). Органический слой концентрируют и добавляют воду. Образуется осадок, его отфильтровывают, получая указанный в заголовке продукт (11,2 мг) в виде желтого твердого вещества с 91% степенью чистоты.

ЖХ-МС система Α: Κΐ 1,8б, т/ζ [М+Н]+ 352,1; система В: Κΐ 2,79.

(3Е,5Е)-1-Ацетил-5-[(4-фторфенил)метилиден]-3-[(4-этоксифенил)метилиден]азепан-4-он (соединение № 1579).

Азепан-4-он гидрохлорид (0,25 г, 1,б8 ммоль) и 4-фторбензальдегид (179 мкл, 1,б8 ммоль) растворяют в уксусной кислоте (20 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§О₄ (1 мл) и смесь перемешивают при к.т. в течение 8 дней с добавлением конц. Н₂§О₄ в течение первых трех дней (0,5, 0,75 и 0,5 мл соответственно). Добавляют воду (2 реакционных объема) и смесь экстрагируют этилацетатом (2 объема смеси). Органическую фазу концентрируют и сушат, получая сырой промежуточный продукт б. Часть этого промежуточного продукта (100 мг, 0,4б ммоль) растворяют в уксусной кислоте (б мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют концентрированную Н₂§О₄ (0,б мл) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение 7 дней. Добавляют воду (1 объем) и смесь нейтрализуют насыщенным водным раствором ЫаНСО₃. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме, получая промежуточный продукт 7 (31,5 мг) в виде желтого твердого вещества с 91% степенью чистоты.

ЖХ-МС система Α: Κΐ 1,85, т/ζ [М+Н]+ 338.

Промежуточный продукт 7 (10 мг) растворяют в ДХМ (1 мл) и добавляют ТЭА (5,0 мкл, 0,04 ммоль). Смесь перемешивают 10 мин, а затем добавляют ацетилхлорид (2,3 мкл, 0,03 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при к.т. в течение 30 мин. Реакционную смесь промывают водой, насыщенным водным ЫаНСО₃ и насыщенным раствором соли. Органическую фазу концентрируют, получая указанное в заголовке соединение (б,4 мг) в виде желтого твердого вещества с 90% степенью чистоты.

ЖХ-МС система А: 2,35 Κΐ, т/ζ [М+Н]+ 380,1; система В: Κΐ 2,37.

Ή-ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): [м.д.] = 1,70, 1,90, 1,98 и 1,99 (4хс, 3Н, СН₃СО-, сигналы от двух региоизомеров и ротамеров их ацетата), 2,89-3,01 (м, 2Н), 3,б8-3,77 (м, 2Н), 3,79, 3,79, 3,79, 3,08 (4хс, 3Н, -ОМе, сигналы от двух региоизомеров и ротамеров их ацетата), 4,б5-4,б8 (м, 2Н), 7,0-7,04 и 7,098-7,103 (2хм, 2Н), 7,22-7,30 (м, 3Н), 7,48-7,б2 (м, 5Н).

(3Е,5Е)-5-[(4-Хлорофенил)метилиден]-3-[(4-нитрофенил)метилиден]азепан-4-он (соединение № 1583).

Ы-Метилазепан-4-он гидрохлорид (75 мг, 0,4б ммоль) и 4-хлорбензальдегид (б4 мг, 0,4б ммоль) растворяют в уксусной кислоте (7 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§О₄ (350 мкл) и смесь перемешивают при к.т. в течение 8 дней. Добавляют еще конц. Н₂§О₄ в течение дней 2-4 (0,175, 0,35, 0,25 мл соответственно). Добавляют воду (2 реакционных объема) и раствор экстрагируют этилацетатом (2 реакционных объема). Органическую фазу концентрируют, получая промежуточный продукт 8. Часть этого промежуточного продукта (35 мг, 0,14 ммоль) и 4-нитробензальдегид (б9,5 мг, 0,4б ммоль) растворяют в уксусной кислоте (2,5 мл) и перемешивают 10 мин, затем медленно добавляют конц. Н₂§О₄ (200 мкл) и смесь перемешивают при к.т. в течение 5 дней. Добавляют еще конц. Н₂§О₄ (0,2 мл) и продолжают перемешивание еще 5 дней. Добавляют воду (2 реакционных объема) и раствор экстрагируют этилацетатом (2 реакционных объема). Органическую фазу концентрируют и остаток очищают методом препаративной ЖХ, получая указанное в заголовке соединение (1,8 мг) в виде желтого твердого вещества с 94% степенью чистоты.

ЖХ-МС система Α: Κΐ 1,98/2,04, т/ζ [М+Н]+ 383,1, система В: Κΐ 2,82/2,98.

Сокращения:

Вос - трет-бутилоксикарбонил;

АСЫ - ацетонитрил;

ДХМ - дихлорметан;

ТФУ - трифторуксусная кислота;

ДМФА - диметилформамид;

ТЭА - триэтиламин;

Κΐ - время удерживания;

ТВТи - О-(бензотриазол-1-ил)-Ы.Ы.Ы'.Ы'-тетраметилуроний тетрафторборат; к.т. - комнатная температура;

ЖХ - жидкостная хроматография;

ЭДК - 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид;

НАТИ - 2-(1Н-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметил-гексафторфосфат;

ДХЭ - 1,2-дихлорэтан.

Пример 3. Фармацевтическая композиция (водная суспензия).

Соединение по изобретению (25 мг) растворяют в 1 мл диметилсульфоксида. Данный раствор добавляют по капле к 10 мл энергично перемешиваемого физиологического раствора. Полученную суспензию, которую можно стабилизировать посредством добавления 1 мас.% ΡΥΡ, можно применять для

- 18 026409 внутримышечного, внутривенного или подкожного введения.

Пример 4. Фармацевтическая композиция В (таблетки).

Таблетки для перорального приема получают, смешивая 2,0 г соединения по изобретению (порошок, <10 мкм, 90%) с микрокристаллической целлюлозой (1,30 г), кукурузным крахмалом (0,50 г), диоксидом кремния (0,20 г), стеаратом Мд (0,12 мг). Смесь прессуют сухим способом, получая 400 мг таблетки, которые покрывают сахаром.

Пример 5. Фармацевтическая композиция С (раствор).

Соединение по изобретению (10 мг) растворяют в 0,5 мл кремофора ЕЬ (ΒΑ8Ρ С'огр.) и добавляют абсолютный этанол до 1,0 мл. Прозрачным раствором заполняют стеклянные ампулы для инъекций.

Пример 6. Фармацевтическая композиция Ό (раствор).

Для внутрибрюшинного введения при исследованиях на животных готовят водную композицию исходный раствор, растворяя соединение по изобретению до концентрации 2 мг/мл в смеси кремафор ЕЬ/полиэтиленгликоль 400 = 1:1. (об./об.) при к.т. или при нагревании до температуры примерно 80°С и вспомогательном воздействии ультразвуком. Аликвоту исходного раствора разбавляют 1:10 0,9% физиологическим раствором и сразу же используют для внутрибрюшинной инъекции.

Пример 7. Фармацевтическая композиция Е (раствор).

Для внутрибрюшинного введения готовят 25 мас.% исходный раствор Ι<ο11ίρ1ιοΓ Н815 посредством плавления целого контейнера ^1^^ Н815 (8ьдта 42966) при нагревании до 60°С и разбавления деионизированной водой до 25% мас./мас. К соединению № 1570 (18,0 мг) в 10 мл пробирке для образца добавляют 10,0 мл исходного раствора, пробирку встряхивают, обрабатывают ультразвуком при температуре около 50°С в течение примерно 2 ч и время от времени нагревают до 83 °С. Полученный прозрачный раствор перед инъекцией подвергают стерилизующему фильтрованию, используя 0,2 мкм целлюлозный шприцевой фильтр. По аналогичной методике готовят растворы соединений № 1546 и 1571; однако эти соединения растворяются не полностью. Нерастворенный остаток взвешивают и данную массу вычитают из начальной массы соединения (18 мг). Обнаружено, что приготовленные растворы (10 мл) содержат 8,5 и 11,0 мг соединений № 1546 и 1571 соответственно.

Пример 8. Фармацевтическая композиция Р (раствор).

Для внутрибрюшинного введения готовят исходный раствор 2-гидроксипропил-в-циклодекстрина (АИпсН 332593), растворяя циклодекстрин в деионизированной воде до концентрации 30% мас./мас. К соединению № 1649 (15,0 мг) в 10 мл пробирке для образца добавляют 10,0 мл исходного раствора. Пробирку встряхивают, обрабатывают ультразвуком при температуре около 50°С в течение примерно 2 ч и время от времени нагревают до 83 °С. Полученный раствор перед инъекцией подвергают стерилизующему фильтрованию, используя 0,2 мкм целлюлозный шприцевой фильтр. Определяют массу оставшегося нерастворенного соединения № 1659 и используют ее для коррекции концентрации фильтрованного раствора до 82,5% от получаемой концентрации. По той же методике готовят раствор соединения № 1546.

Пример 9. Соединение по изобретению индуцирует ингибирование протеасом.

Для оценки соединения используют репортерную клеточную линию ΜοΠιι8ο ПЬ-УРР, которая спроектирована для аккумулирования желтого флуоресцентного белка (УРР) после ингибирования протеасом (12). Аккумуляцию УРР измеряют в течение 48 ч на системе 1псиСу1с-РЕК (Εδδβη Бюхасисс. Е55СИ. ПК), которая представляет собой автоматический флуоресцентный микроскоп. В качестве меры ингибирования протеасом используют количество положительных клеток на поле.

Пример 10. Определение растворимости соединений по изобретению в водной среде.

На диаграммах фиг. 2а-2е растворимость выражают как Εο§ 8 (ммоль/мл; программное обеспечение АСО/ЬаЬк 1пс.). Растворимость определяют в водном буфере при различных значениях рН и прогнозируют для чистой воды при 25°С. Алгоритм использует набор >6800 соединений в качестве эталона. Диаграммы показывают, что азепаноны по изобретению могут обладать существенно повышенной растворимостью, например в 2 раза или более, в водной среде при физиологических рН, таких как рН от 6 до 8, в частности от 7,0 до 7,5, по сравнению с соответственно замещенными пиперидин-4-онами.

Пример 11. Азепаны/азепаноны по изобретению демонстрируют более высокую цитотоксичность, чем структурно соответствующие пиперидины/пиперидин-4-оны.

На фиг. 3Ь, 3Д, 3£ представлены диаграммы, иллюстрирующие цитотоксичность соединений по изобретению № 1546, 1547 и 1570 с 7-членным циклическим фрагментом по сравнению со структурно соответствующими соединениями, не включенными в изобретение, с 6-членным циклическим фрагментом. Их индукцию дозозависимой цитотоксичности определяют после 72 ч непрерывного воздействия соединением на репортерную клеточную линию НСТ-116. Обработанные клетки сравнивают с необработанными контролями. Цитотоксичность визуализируют как коэффициент выживания (81) в диапазоне примерно от 90% 81 до примерно 0% 81 в зависимости от концентрации соединения. Из фигур ясно, что соединения по изобретению являются более цитотоксичными, чем контрольные соединения, так как они производят такой же уровень цитотоксичности при меньшей концентрации.

- 19 026409

Ссылки

1. МаабеЬогз, Р е1 ак, 1псгеазеб зепзкпкуо/СП-бетеб 1утрЬосу{ез Ιο αρορίοίϊο беогЛ ααίναϋοη Ьу (йе рго{еазоте-зреа/к тЫЬКог 1ас{асуз(т. Вг ί Наета1о1105, 752-757, бог.Ь)Ь1388 [рн] (1999).

2. ОеМагбпо, 6 N е( а1., РА700, ап АТР-берепбеп{ ααίίναίΟΓ о/{Ье 20 5 рпкеазоте, 1$ ап АТРазе согЛаттд ти1бр1е тетЬегз о/а пискокбе Ыпбтд ρΓοίεΐη /атИу. Σ Βίο) СЬет 69, 20878-20884, Ьир://7тлпы.псЫ.п1т.гнЬ.§о\//еп1гег/риегу.к81?ст£|=Ке1пеуе&0Ь=РиЬМее1 &бор1=Скайоп&Н51_и|б5=8063704 (1994) (1994).

3. ВесЬ5(е1пег, М е1 а1., ТЬе ти1(ка{а1уИс апб 26 5 рго{еазез. ί ΒίοΙ СЬет 268,6065-6068, Ь«р://7/*лм.псЫ.п1т,п'|Ь.§оу/еп1гег/чиегу,1с81?стс1=8е1г1еуейс1Ь=РиЬМеДйс1ор1:= С|1аЬоп&Нз1_и|Дз=8454582 (1993).

4. Абат$, ,1 & КаиКтап, М, Оеие/ортепГ о/№е рго{еазоте тЫЬког \/е1сас1е (ВоПегогтЬ). Сапсег 1тге$122,304-311, Ьпр://тлпм.псЫп1т.п|Ь.80у/епСге2/циегу.(с§1? стб=Ве1пече &6Ь =РиЬМеб&бор1=С|1а11Оп&||й_и|б5=15199612 (2004).

5. Егба1, Н е1 аI., /пЗисИоп о/1узозота! тетЬгапе регтеаЬШгабоп Ьу сотроипбз {Ьа( ас(ка{е р534пберепбеп{ арор{озк. Ргос ИаМ Асаб 5α и 5 А 102,192-197,

6ΟΪ :0408592102 [рн]10.1073/рпаз.0408592102 (2005).

6. ΒβΓηάΙϊίοη, М е1 ак, 1пбис{юп о/(Ье 1узозота1 арор{оз1з ра(Ьшау Ьу тЫЬНогз о/{Ье иЫдиШп-рго1еазоте зуЯет. Ιηΐ ί Сапсег 124,1463-1469, боЫ0.1002/цс.24004 (2009).

7.1_атЬ, 1 θί ак, ТЬе Соппес1М1у Мар: изтд депе-ехргеззюп з/дпаГигез (о соппесг зто/1 то!еси1ез, депез, апбб/зеазе. 5аепсе 313,1929-1935,

6οί :313/5795/1929 [рн]10.1126/5С1епсе.1132939 (2006).

8. Абатв, ί е1 ак, Ро(еп( апб зе!ес1ме тЫЬИогз о/1Ье ргоГеазоте: б1рерИбу1 Ьогопк аабз. ΒΪΟΟΓ8 Меб СЬет 1еП8, 333-338 333-338, 6οί:50960894Χ98000298 [ρϋ] (1998).

9.5ЫЬаХа, Т βΐ а1„ Ап епбодепоиз е!ес{горЫ1е {Ьа( тобиккез {Ье геди!а(огу тесЬатзт ο/ρπΛεΐη {игпоуег: юЫЬкогу е{$ес1з о} 15-беоху-ОеЯа 12,14-ргоз{ад1апбт 12 оп рго(еазоте. ВюсЬет«1гу 42,13960-13968, бо1:10.1021/Ы035215а (2003).

10. Уапе, Н е1 ак, Се1азГго1, а (гкегрепе ехГгасгеб/гот {Ье СЫпезе ТЬипбег оУСоб Мпе, (5 а ро{еп( рго!еазоте тЫЬког апб зирргеззез Ьитап ргоз{а(е сапсег дгош(Ь ίη пибе тке. Сапсег Ке5 66, 4758-4765 4758-4765, 6οί:66/9/4758 [рн]10.1158/0008-5472.СА1Ч054529 (2006).

11. Уап§, Н ег ак, ТЬе {итог ргогеазоте /з а рптагу {агде(/ог {Ье па{ига! апИсапсег сотроипб ШНЬа/епп А 1зо1а{еб/гот Ίη6ίαη ιν/ηίβΓ сЬеггу. ΜοΙ РЬагтасо! 71,426-437, бокто1.106.030015 [рп]10.1124/то1.10б.030015 (2007).

12. Мепепбег-ВепНо, V е! ак, Епбор1азтк ге(ки!ит з{гезз сотргот/зе5 {Ье иЫдиЫпрго(еазотезуз(ет. Нит ΜοΙ Йепе114, 2787-2799, 6οί:66ί312 [рн]10.1093/Ьт8/бб|312 (2005).

13. Ми11э11у, 1 Е & ЕИграШск, Е А, РЬагтасорЬоге тобе!/ог поие! тЫЬИогз о/иЫдикт /зорерЬбазез {Ьа(тбисер53-тберепбеп{ сеН беа{Ь. ΜοΙ РЬагтасо! 62, Ьир://«плд«.псЫ.п1т.п|Ь.80у/еп1гег/чиегу./с81?стб=Ке1г!е7е&бЬ=РиЬМеб& бор1=СИабоп&1|51_и!б5=12130688 (2002).

- 20 026409

14. Ойегтап, А & бНсктап, Μ Н, Сотр1етеп(агу го1ез/ог Чрп11 апд иЬрб ίπ с/еиЫдиМпааоп апс/ рго(ео1уз15 Ьу (Ле рго(еазоте. 1 ΒίοΙ Скет 27Э, 17291738, йо1:10.1074/)Ьс.М307050200 [рп] (2004).

15. НоЛтапп, К М & РюкагС, С М е( ак, Νοηοαηοηκαί ММ52-епсо4ес/ иЫдиШп согуидоИпд епгуте /ипсаоп; ίη аззетЫу о/ попе/ ро1уиЫдиШп сЬатз {ог ΟΝΑ герсиг. Се1196, 645-653, άοί:50092-8674(00)80575-9 [ρϋ] (1999).

16. νοπβ, О Р е( а1„ СЬготозоте аИдптеп( апс/ зедгедайоп гедиЫес/ Ьу иЫдиШпаНоп о{ зип/Мпд сеНз. Заепсе 310,1499-1504, РокЗТО/5753/1499 [ρϋ] 10.1126/5аепсе.1120160 (2005).

17. ВогойоУ5ку, А е( ак, Α ηονεί асНие 31(е-сНгес(ес/ ргоЬе зреа/сс/ог с/еиЫди)(у1а(тд еюутез геуеак рго(еазоте аззо&ааоп О/1/5Р14. ЕМВО 120,5187-5196, ао1:10.1093/етЬоУ20.18.5187 (2001).

18.1ат, Υ А е( ак, 5реа/ю(у о{(Ье иЫдиШп !$орерИдазе ίη (Ле РА700 геди!асогу сотр!ех о/26 5 рго(еа5отез. / ΒίοΙ Скет 272, 28438-28446, к(1р://ипп™/,псЬкп1т.П|к.еоу/еп(гег/ Чиегу.Гсб1?стс1=Ке(1^е&с1Ь=РиЬМес1&с1ор1=С|(а0оп&Н5(_и1с15=9353303 (1997).

19. Уегта, Н е( а к, Яо/е о/Ррп11 те(а11орго(еазе ίη с/еиЫди/апа(юп апс/ дедгас/аИоп Ьу (Ье 265 рго(еазоте. Заепсе 298,611-615, йо1:10.1126/5аепсе.10758981075898 [ρϋ] (2002).

20. Уао, Т & Сокеп, К Е, А сгур(к ргсЯеазе соир!ез с/еиЫдиШпааоп апс/ с/едгас/аИоп Ьу (Ье рго(еазоте. №1иге419, 403-407, Ро1:10.1038/па(иге01071па1иге01071 [ρϋ] (2002).

21. Кгатег, 6 е( ак, £7#/егел(/о(юл ЬеЬл/ееп сеН с/еа(Ь тос/ез изтд теазигетеп(з о/ с/$егеп( зо!иЫе }огтз о/ех(гасе!1и1аг су/окегабп 18. Сапсег Ке5 64,1751-1756 (2004) кПр://1Лплгж.псЬ|.п1т.п1к.бОу/еп(гег/чиегу.ксе1?стс1=Ке(пеуе&с!Ь=РиЬМес1& 0ор(=О1а11оп&Н$1_и1р5=14996736 (2004).

22. ΟΙοΕϊοη, МН е( ак, 5рес1/к </етопз1га(!оп о}с/гид-тдисес/ (итоигсеНарор(оз!з ίη Ьитап хеподга/1 тос/ек изтд а р!азта Ыотагкег. Сапсег Вютагкеге 5,117-125,

КП ρ :/ДЛЛдл/. псЫ.п! т. ηί к.§оу/риЬтес1/19407366 (2009).

23. Кеуе$-Тигси, Ρ Е е( ак, 8еди1а(юп апс/ сеИи!аг го1ез о/ иЫдиШп-зрес1/1с с/еиЫдЫапаИпд епгутез. Аппи Кеу Вюскет 78, 363-397, кПр://«ли/.псЬ|.п|т.П1к.боу/ еп1гег/риегу.к81?ст0=Ке1пеуе&с1Ь=РиЬМей&йор1=С11а(1оп&115(_и1с15=19489724 (2009).

24. КоиНск, Е е( ак, Яе/ак/уе з(гис(ига1 апс//ипс(юпа1 го!ез о/ти1Ир!е с/еиЫди1(у1аЬпд рго(етз аззоаа(ес1 шПЬ таттаНап 265рго(еазоте. ΜοΙ Βίο! СеН19,1072-1082, άοί:Ε0710-1040 [рп]10.1091/тЬс.Е07-10-1040 (2008).

25. Випг, Р, е( ак, 8едикетеп({огр53 αηάр21 (о зиз/ат 62 аггез( арег 0ΝΑ с/ата^е. Заепсе 282, 1497-1501 (1998).

26. ΡίθΙβηροΙ, 1 А е( ак, Рагадох/са! ЫЫЫаоп о/зоНЬ (итогсе/Ι дтлсТЬ Ьу Ьс12. Сапсег Вез 54,3714-3717 (1994).

27. Водпаг, А 6 е( ак, Ех(епзюп о/Н/е-5рап Ьу ίηίΓοάυαίοη о/(е!отега$е ίη(ο погта! Ьитап сеИз. Заепсе 279,349-352 (1998).

28. катЬ, 1 е( ак, ТЬе Соппес№(у Мар: их/пд депе-ехргеззюп з/дпасигез (о соппеазтаН то!еси1ез, депез, апс/ сНзесхе. 5аепее 313,1929-1935, άοί:313/5795/1929 [ρϋ] 10.1126/5С1епсе.1132939 (2006).

29. ЕЬагаег, 3 е( ак, СЬагас(епга(1оп о/(Ье рго(еазоте изтд ησίίνβ де! е!ес(горЬогезк. Ме1косЬ Епгуто! 398, 353-363, άοί:50076-6879(05)98029-4 [ρϋ]10.1016/500766879(05)98029-4 (2005).

30. 6и(егтап, А & СНсктап, Μ Н, Сотр/етеп(агу го!ез/ог 8рп11 апс/ иЬрб ίη ύβυ6ίςυί(ίηα(ίοη апс/ рго(ео!узк Ьу (Ье рго(еазоте. 1 ΒίοΙ Скет 279,1729-1738, άοί:10.1074/ϊΙχ.Μ307050200Μ307050200 [ρϋ] (2004).

31. На§8, М е1 ак, Α ηονεί ЫдЬ-(ЬгоидЬ-ри/оззау/огзсгееЫпд о{рго-арор(о(кс с/гидз. ΙηνβίΙ Νενν Огиег 20, 253-259 (2002).

32. ипйкаееп, Е е( а!., ТЬеЦиоготе/г'к т/сгосикиге суго(охс’а(у аззау. Иа( РгоЮс 3,13641369,0οί:ηρΓΟ(.2008.114 [ри]10.1038/прго1.2008.114 (2008).

Claims (25)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение общей структуры 8-1, способное аннулировать деубиквитинирующую (ОИВ) активность 198 КР ЭЫВ:

   где К¹, К² при двойной связи ά1 и К³, К⁴ при двойной связи ά2 могут независимо друг от друга иметь конфигурацию, противоположную конфигурации формулы 81;

   X обозначает СО, С8 или ΝΗ;

   К¹ и К³ независимо друг от друга обозначают Н или С_!-6алкил;

   К² и К⁴ независимо друг от друга обозначают Н; С1_-6алкил; С^алкил-СО; фенил или 6-членный гетероарил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из следующих: С1_-6алкил, С₁₆алкокси, ΟΝ, -СОО-С_1-6алкил, СООИ, ΝΟ₂, Р, С1, Вг, I, СР₃, ΝΗ₂, ХИ-С^алкил, Х(С_1-6алкил)2, СОИК⁷К⁸ при условии, что один или более из Н в алкиле и алкокси могут быть замещены атомом фтора;

   К⁵ обозначает любую группу из следующих: Н, С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С1_-3алкокси-С_2-6алкил-, С'Х ₃алкокси-С_2-6алкенил-, арил-С_0-6алкил-, гетероарил-С_0-6алкил-, циклоалкил-С_0-6алкил-, -С_1-6алкил-СООС1-6алкил, -С2-6алкиларилокси, СОК⁶;

   К⁶ обозначает любую группу из следующих: С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С_1-6алкокси, С_1-3алкокси-С₁6алкил-, С1-3алкокси-С1-6алкенил-, арил-С0-6алкил-, гетероарил-С0-6алкил-, пирролидинил-С0-6алкил-, циклоалкил-С_0-6алкил-, -С1_-6алкил-СОО-С1_-6алкил; ΝΗ₂; -NΗ-С1_-6алкил, -Х(С1_-6алкил)₂, -С_0-6алкиларилокси;

   К⁷, К⁸ независимо друг от друга обозначают Н или С_1-3алкил, где гетероарил представляет собой моноциклическую кольцевую систему, имеющую 5 или 6 кольцевых атомов, среди которых один или более независимо выбраны из атома кислорода, азота, серы;

   арил представляет собой моноциклический или бициклический углеводород, имеющий от 6 до 10 атомов углерода и содержащий по меньшей мере один ароматический цикл;

   циклоалкил представляет собой насыщенный моноциклический углеводород, имеющий от 3 до 7 атомов углерода.
2. 2. Соединение по п.1, где Х=СО.
3. 3. Соединение по п.1 или 2, где К¹ и К³, оба, обозначают Н.
4. 4. Соединение по пп.1-3, где имеет место замещение фенила по одному или нескольким положениям из 3, 4, 5.
5. 5. Соединение по п.1, где Х=СО, К¹ и К³, оба, обозначают Н; К² и К⁴, оба, означают 4-фтор-3нитрофенил; К⁵ обозначает СОК⁶ и К⁶ означает винил.
6. 6. Соединение по п.1, где Х=СО; К¹ и К³, оба, обозначают Н; К² и К⁴, оба, означают 4-фтор-3нитрофенил; К⁵ обозначает СОК⁶ и К⁶ означает метил.
7. 7. Соединение по п.1, где

   К¹, К² при двойной связи ά1 и К³, К⁴ при двойной связи ά2 имеют конфигурацию формулы 8-1;

   X обозначает СО, С8 или ΝΗ;

   К¹ и К³ независимо друг от друга обозначают Н или С1_-6алкил;

   К² и К⁴ независимо друг от друга обозначают Н, С_1-6алкил, С1_-5алкил-СО, фенил или 6-членный гетероарил, замещенный 1-3 заместителями, выбранными из следующих: ΟΝ, NΟ₂, Р, С1, Вг, I, ΝΗ₂, ΝΗ-Οι_ ₆алкил, ^С1_-6алкил)₂, СО-С_1-6алкил;

   К⁵ обозначает Н, С1_-6алкил, С_2-6алкенил, С1_-3алкокси-С1_-6алкил, С_1-3алкокси-С_1-6алкенил, арил, гетероарил, С1_-6алкилгетероарил, С1_-6алкилциклоалкил, С1_-6алкиларил, СО-С1_-6алкил, СО-винил, СО-аллил, СО-арил, СО-циклоалкил, где гетероарил представляет собой моноциклическую кольцевую систему, имеющую 5 или 6 кольцевых атомов, среди которых один или более независимо выбраны из атома кислорода, азота, серы;

   арил представляет собой моноциклический или бициклический углеводород, имеющий от 6 до 10 атомов углерода и содержащий по меньшей мере один ароматический цикл;

   циклоалкил представляет собой насыщенный моноциклический углеводород, имеющий от 3 до 7 атомов углерода.
8. 8. Соединение по п.7, где X обозначает СО.
9. 9. Соединение по п.7 или 8, где К² и К⁴ обозначают замещенный фенил.
10. 10. Соединение по любому из пп.7-9, где К⁵ выбран из следующих: СО-С1_-6алкил, СО-циклоалкил, СО-винил, СО-аллил.
11. 11. Способ лечения раковой опухоли человека, включающий введение фармакологически эффек- 22 026409 тивной дозы соединения по любому из пп.1-10 в фармацевтически приемлемом носителе.
12. 12. Способ лечения раковой опухоли человека, не восприимчивой к лечению бортезомибом или агентом, вовлеченным в активность бортезомиба по генерированию апоптоза, включающий введение фармакологически эффективной дозы соединения по любому из пп.1-10 в фармацевтически приемлемом носителе.
13. 13. Способ по п.11 или 12, где отсутствует влияние на деубиквитинирующую (ΌυΒ) активность непротеасомных ΌϋΒ.
14. 14. Способ по любому из пп.11-13, где соединение растворяют или суспендируют в жидком носителе.
15. 15. Способ по пп.11-14, где введение осуществляют посредством внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции или инфузии.
16. 16. Способ по п.11 или 12, где введение является пероральным.
17. 17. Способ по п.11 или 12, где носитель представляет собой таблетку или капсулу.
18. 18. Способ по любому из пп.11-17, где фармакологически эффективная доза составляет от 0,0001 до 0,1 г/кг массы тела, в частности от 0,001 до 0,01 г/кг массы тела, при этом даны рекомендации, как вводится агент, системно или локально.
19. 19. Способ по любому из пп.11-18, где рак выбран из множественной миеломы, рака молочной железы, рака яичников, рака легких, рака толстой кишки, рака простаты, рака поджелудочной железы.
20. 20. Фармацевтическая композиция для лечения у человека рака, не восприимчивого к химиотерапии, содержащая соединение по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель.
21. 21. Композиция по п.20 в виде таблетки, или капсулы, или другого препарата с разовой дозой для перорального приема.
22. 22. Композиция по п.20 в виде раствора или суспензии в фармацевтически приемлемом жидком носителе для инъекции или инфузии.
23. 23. Композиция по п.20 для внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной или подкожной инфузии или инъекции.
24. 24. Применение соединения по любому из пп.1-10 для лечения у пациента рака, не восприимчивого к химиотерапии.
25. 25. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.20-23 для лечения у пациента рака, не восприимчивого к химиотерапии.