ES2198739T3 - Caspasas y apoptosis. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a los nuevos compuestos de la fórmula (I), sus composiciones farmacéuticas y a la nueva inhibición de carpases para empleo en el tratamiento de la apoptosis y estados de enfermedad producidos por una excesiva o inapropiada muerte celular.
Description
Caspasas y apóptosis
La presente invención se refiere al
descubrimiento de un nuevo procedimiento para bloquear una
apóptosis excesiva o inapropiada en un mamífero.
Se ha reconocido durante un siglo que existen
diferentes formas de muerte celular. Una forma de muerte celular,
la necrosis, es normalmente el resultado de traumatismo severo y es
un proceso que implica pérdida de la integridad de la membrana y
liberación incontrolada de contenido celular, con frecuencia dando
lugar a respuestas inflamatorias. Por el contrario, la apóptosis es
un proceso más fisiológico que se produce de una forma controlada y
por lo general tiene naturaleza no inflamatoria. Por esta razón, la
apóptosis se denomina frecuentemente muerte celular programada. El
propio nombre (apóptosis; Griego "caer", por ejemplo, las
hojas de los árboles) conlleva una muerte celular que es parte de
un proceso fisiológico normal (Kerr, et al., Br. J.
Cancer, 26: 239-257 (1972)).
La apóptosis parece ser una serie cuidadosamente
controlada de sucesos celulares que conducen finalmente a la muerte
de la célula. Este proceso para la eliminación de células
indeseadas es activo y requiere gasto de energía celular. Las
características morfológicas de la apóptosis incluyen contracción
celular y pérdida del contacto célula-célula,
condensación de la cromatina celular seguida de fragmentación, la
aparición de arrugas en la membrana, formación de ampollas en la
membrana y cuerpos apoptóticos. Al finalizar el proceso, las células
vecinas y macrófagos fagocitan los fragmentos de la célula
apoptótica. El proceso puede ser muy rápido, produciéndose en tan
solo unas pocas horas (Bright et al., Biosc. Rep.,
14, 67-82 (1994)).
El suceso bioquímico mejor definido de la
apóptosis implica la destrucción ordenada del DNA nuclear. Las
señales de apóptosis promueven la activación de endonucleasas
específicas dependientes del calcio y del magnesio que escinden el
DNA de doble cadena en regiones engarce entre nucleosomas. Esto
origina la producción de fragmentos de DNA que son múltiples
fragmentos de 180-200 pares de bases (Bergamaschi
et al., Haematologica, 79,
86-93 (1994); Stewart, JNCI, 86:
1286-1296 (1994)). Cuando se examinan por
electroforesis en gel de agarosa, estos fragmentos múltiples forman
un modelo de escalera que es característico para la mayoría de
células que sufren apóptosis.
Existen numerosos estímulos que pueden indicar a
las células que inicien o promuevan la apóptosis celular, y éstos
pueden ser diferentes en diferentes células. Estos estímulos pueden
incluir glucocorticoides, TNFa, limitación del factor de
crecimiento, algunas proteínas virales, radiación y fármacos
anticancerígenos. Algunos de estos estímulos pueden inducir sus
señales a través de una diversidad de receptores de la superficie
celular, tales como la familia de receptores TNF/factor de
crecimiento nervioso, que incluyen CD40 y Fas/Apo-1
(Bright et al, supra). Dada esta diversidad en los estímulos
que causan apóptosis, ha sido difícil trazar las vías de
transducción de señal y los factores moleculares implicados en la
apóptosis. No obstante, existen evidencias de moléculas específicas
que están implicadas en la apóptosis.
La mejor evidencia de moléculas específicas que
son esenciales para la apóptosis llega del estudio del nematodo C.
elegans. En este sistema, los genes que parecen ser
requeridos para la inducción de apóptosis son Ced-3
y Ced- 4. Estos agentes deben funcionar en las células en
destrucción y, si se inactiva cualquier gen por mutación, la muerte
celular no puede producirse (Yuan et al., Devel.
Biol., 138: 33-41 (1990)). En mamíferos,
los genes que se han asociado con la inducción de apóptosis
incluyen el proto-oncogen c-myc y el
gen supresor tumoral p53 (Bright et al., supra; Symonds
et al., Cell, 78: 703-711
(1994)).
En esta determinación crítica de si se sufre o no
apóptosis no resulta sorprendente que existan genes que programan
proteínas que inhiben la apóptosis. Un ejemplo en C. elegans
es Ced-9. Cuando está anormalmente activado, las
células que sobreviven son las que normalmente morirían y, por el
contrario, cuando Ced-9 está inactivado, las células
que mueren son las normalmente vivirían (Stewart, B. W.,
supra). Un homólogo en mamíferos es bcl-2,
que se ha identificado como oncogen causante del cáncer. Este gen
inhibe la apóptosis cuando su producto es sobreexpresado en una
diversidad de células de mamífero, haciéndole menos sensible a la
radiación, fármacos citotóxicos y señales apoptóticas tales como
c-myc (Bright et al, supra). Algunas
proteínas virales aprovechan su capacidad de proteínas específicas
para bloquear la apóptosis produciendo proteínas virales homólogas
con funciones análogas. Un ejemplo de dicha situación es una
proteína producida por el virus de Epstein Barr que es similar a
bcl-2, que previene la muerte celular y potencia de
este modo la producción viral (Wells, et al., J. Reprod.
Fertil., 101: 385-391 (1994)). Por el
contrario, algunas proteínas pueden unirse a, e inhibir la función
de la proteína bcl-2, siendo un ejemplo la
proteína bax (Stewart, B. W., supra). La descripción general
que se ha desarrollado es que la entrada en apóptosis está regulada
por una acción de equilibrio cuidadoso entre productos génicos
específicos que promueven o inhiben la apóptosis (Barinaga,
Science, 263: 754-756 (1994)).
La apóptosis es una parte importante de la
fisiología normal. Los dos ejemplos citados más frecuentemente de
esta son el desarrollo fetal y el desarrollo de células inmunes. En
el desarrollo del sistema nervioso fetal, más de la mitad de las
neuronas que existen en el feto prematuro se pierden por apóptosis
durante el desarrollo para formar el cerebro maduro (Bergamaschi
et al., Haematologica, 79:
86-93 (1994)). En la producción de células T
inmunes competentes (y en menor grado existen evidencias en células
B), se produce un proceso de selección que elimina las células que
reconoce y reacciona contra ellas mismas. Se cree que este proceso
de selección se produce de una forma apoptótica en áreas de
maduración de células inmunes (Williams, G. T., J. Pathol.,
173: 1-4 (1994); Krammer et al.,
Curr. Opin. Immunol., 6: 279-289
(1994)).
La desregulación de la apóptosis puede jugar un
papel clave en estados de enfermedad y las enfermedades pueden
estar causadas por la aparición de apóptosis excesiva o reducida.
Un ejemplo de enfermedades asociadas con baja apóptosis serían
ciertos tipos de cánceres. Existe un linfoma de células B
foliculares asociado con expresión aberrante de
bcl-2 funcional y una inhibición de apóptosis en
dichas células (Bergamaschi et al. supra). Existen numerosos
informes que asocian la eliminación o mutación de p53 con la
inhibición de apóptosis y la producción de células cancerosas (Kerr
et al., Cancer, 73: 2013-2026
(1994); Ashwell et al., Immunol Today, 15:
147-151 (1994)). Por el contrario, un ejemplo de
apóptosis excesiva o inapropiada es la pérdida de células
neuronales que se produce en la enfermedad de Alzheimer, inducida
posiblemente por péptidos \beta-amiloides (Barr
et al., BioTechnology, 12:
487-493 (1994)). Otros ejemplos incluyen apóptosis
excesiva de células T CD4^{+} que se produce en infección por VIH,
de miocitos cardíacos durante infarto /reperfusión y de células
neuronales durante isquemia (Bergamaschi et al., supra);
Barr et al., supra.
Algunos agentes farmacológicos intentan
contrarrestar la falta de apóptosis que se observa en cánceres.
Ejemplos incluyen inhibidores de topoisomerasa II, tales como
epipodofilotoxinas y antimetabolitos, tales como
ara-c, que se ha descrito que potencia la apóptosis
en células cancerosas (Ashwell et al, supra). En muchos
casos con estos fármacos anticancerosos, el mecanismo exacto de la
inducción de la apóptosis sigue sin desentrañarse.
En los últimos años, las evidencias han
demostrado que ICE y proteínas similares a ICE (Caspasas)
desempeñan un papel importante en la apóptosis. Esta área de
investigación se ha visto estimulada por la observación de
homología entre la proteína codificada por Ced-3, un
gen conocido por ser crítico para la apóptosis por C.
Elegans, e ICE (Caspasa 1). Estas dos proteínas comparten el
29% de la identidad de aminoácidos y la identidad completa en la
porción de 5 aminoácidos que se cree que es responsable de
actividad de proteasa (QACRG) (Yuan et al, Cell,
75: 641-652 (1993)). Se observan otras
homologías entre ICE y el producto del gen nedd-2 en
ratones, un gen del que se sospecha está implicado en la apóptosis
en el cerebro en desarrollo (Kumar et al., Genes
Dev., 8: 1613-1626 (1994)) e Ich- 1
(Caspasa 2) y CPP32 (Caspasa 3), homólogos humanos de
nedd-2 aislado de genotecas de cDNA de cerebro
humano (Wang et al., Cell, 78:
739-750 (1994)); Fernandes-Alnemiri
et al, J. Biol. Chem., 269:
30761-30764 (1994)).
Otra prueba de la función de estas proteínas en
la apóptosis llega de estudios de transfección. La sobreexpresión
de ICE murina causada por fibroblastos para que sufran la muerte
celular programada en un ensayo de transfección transitoria (Miura
et al, Cell, 75: 653-660
(1993)). La muerte celular podría prevenirse por mutaciones
puntuales en el gen transfectado en la región de mayor homología
entre ICE y Ced-3. Puesto que es un apoyo muy
fuerte para la función de ICE en la apóptosis, los autores
demostraron que la apóptosis inducida por transfección de ICE
podría antagonizarse por sobreexpresión de bcl-2,
el oncogen de mamífero que puede prevenir la muerte celular
programada (Miura et al., supra). Se llevaron a cabo otros
experimentos usando el gen crmA. Este gen del virus de la viruela
codifica una proteína serpina, una familia de proteínas que son
inhibidoras de proteasas (Ray et al., Cell 69:
597-604 (1992)). De forma específica, la proteína de
crmA ha demostrado inhibir el procesamiento de
pro-interleuquina-1b por ICE.
(Gagliardini et al, Science, 263:
826-828 (1994)) demostró que la microinyección del
gen crmA en neuronas del ganglio de la raíz dorsal evitaba la
muerte celular inducida por la falta de factor de crecimiento
nervioso. Este resultado demuestra que ICE está implicada en la
apóptosis de células neuronales. Una demostración más directa de la
implicación de ICE llega de experimentos en los que se asocia la
transfección de ICE con la coexpresión de crmA, demostrando una
supresión inducida por crmA de la respuesta apoptótica inducida por
ICE (Miura et al, supra: Wang et al., supra).
Además de ICE, los investigadores han examinado
la capacidad de Caspasas para promover apóptosis. (Kumar et al.,
supra) demostraron que la sobreexpresión de
nedd-2 en fibroblastos y células de neuroblastoma
producía la muerte celular por apóptosis y que esta apóptosis
también se podría suprimir por expresión del gen
bcl-2. Más recientemente, Wang et al., (Wang
et al., supra) examinaron la sobreexpresión de
Ich-1 en una serie de células de mamífero. La
expresión tenía como resultado la apóptosis celular, que se podía
antagonizar por la expresión conjunta de bcl-2. La
mutación de un residuo cisteína, contenido en el motivo QACRG y que
se supone es crítica para la función de proteasas, a serina evitó
la actividad apoptótica.
Otras evidencias de la función de una cisteína
proteasa en la apóptosis llega de un reciente informe de Lazebnik
et al., (Nature, 371: 346- 347 (1994)). Estos
autores han usado un sistema exento de células para emular y
estudiar la apóptosis. En su sistema, existe una actividad de
proteasa que escinde la enzima
poli(ADP-ribosa)polimerasa en un sitio
idéntico a un sitio de escisión en
pre-interleuquina-1b. No obstante,
todavía existe proteasa aislada e ICE parece ser diferente y actuar
en diferentes proteínas substrato. El bloqueo de la actividad de
proteasa en el sistema, usando inhibidores de cisteína proteasa no
selectivos produjo la inhibición de la apóptosis.
Tomadas conjuntamente, las evidencias anteriores
proporcionan una implicación determinante de Caspasas en la
inducción de apóptosis en células de mamíferos. La
interleuquina-1 cerebral se ha descrito por ser
elevada en la enfermedad de Alzheimer y en el síndrome de Down
(Griffin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 86: 7611-7615 (1989)). También
existen informes de que la interleuquina-1 puede
aumentar el mRNA y la producción de proteína
\beta-amiloide, un componente mayoritario de las
placas seniles en la enfermedad de Alzheimer así como en cerebros
de personas con síndrome de Down y con envejecimiento (Forloni
et al., Mol. Brain Res., 16:
128-134 (1992); Busbaum et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 10075- 10078 (1992));
Goldgaber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
86: 7606-7610 (1989)). Estos informes pueden
considerarse como evidencias adicionales para la implicación de ICE
en estas enfermedades y la necesidad de usar un nuevo agente
terapéutico y terapia para el mismo.
Hasta la fecha, ninguna de las estrategias
terapéuticas útiles han bloqueado la apóptosis excesiva o
inapropiada. En una solicitud de patente, EPO 0 533 226 se describe
una nueva estructura peptídica que se dice es útil para determinar
la actividad de ICE y, por tanto, en el diagnóstico y control de
enfermedades mediadas por IL-1. Por tanto, existe
una necesidad de descubrir mejores agentes terapéuticos que tengan
perfiles farmacológicos y toxicológicos no tóxicos para usar en
mamíferos. Estos compuestos bloquearán la apóptosis excesiva o
inapropiada en células y, por ello, proporcionarán un tratamiento
para enfermedades y estados patológicos en los que se produzca este
estado.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos de Formula (I), a sus composiciones farmacéuticas y a la
nueva inhibición de Caspasas para usar en el tratamiento de
apóptosis y estados de enfermedad causados por muerte celular
excesiva o inapropiada. Los compuestos de Fórmula (I) con más
eficaces para inhibir las Caspasas tres y siete.
Otro aspecto de la presente invención es una
composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula (I),
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un compuesto de Fórmula (I), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento
para usar en el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados
con la actividad excesiva de convertasa de
IL-1b.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un compuesto de Fórmula (I), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento
para usar en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos en los que
un factor es bloquear la apóptosis excesiva o inapropiada.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un compuesto de Fórmula (I), o una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento
para usar en el tratamiento de, y el tratamiento y/o profilaxis de
trastornos en los que es un factor el bloqueo o reducción de la
producción de IL-1\beta y/o TNF.
Los compuestos de Fórmula (I) se representan por
la estructura
en la
que
R_{1} es hidrógeno o alquilo
(C_{1}-C_{4});
R_{2} es alquilo
(C_{1}-C_{10}), aril(alquilo
(C_{1}-C_{4})) opcionalmente sustituido una a
tres veces independientemente con hidroxi, halógeno, alquilo o
alcoxi, heteroaril-alquilo
(C_{1}-C_{4}), cicloalquilo
(C_{3}-C_{7}), o R_{1} y R_{2} junto con el
nitrógeno al que están unidos forman un anillo de 3 a 10 miembros
que opcionalmente contiene un heteroátomo adicional seleccionado de
oxígeno, nitrógeno o azufre;
R_{3} y R_{4} son alquilo
(C_{1}-C_{6}), hidrógeno, nitro o halógeno,
y
R_{5} es alquilo
(C_{1}-C_{6}), hidrógeno, arilalquilo o
heteroarilalquilo;
siendo el heteroarilo de dicho
heteroaril-alquilo (C_{1}-C_{4})
y dicho heteroarilalquilo un sistema de anillo aromático de 5 a 10
miembros en el que uno o más anillos contienen uno o más
heteroátomos seleccionados del grupo formado por N, O o S; y
siendo el arilo de dicho
aril-alquilo (C_{1}-C_{4}) y
dicho arilalquilo un anillo fenilo o naftilo.
Con preferencia, R_{1} y R_{2} están unidos
formando un anillo que contiene nitrógeno de cinco miembros. Se
sabe que el grupo alquilo del resto arilalquilo o heteroalquilo
puede ser ramificado o lineal, tal como metileno o un grupo
metileno sustituido, es decir,
-CH(CH_{3})-arilo.
R_{5} es preferiblemente bencilo.
Compuestos ejemplificados por la Fórmula (I)
incluyen, aunque no quedan limitados a:
5-clorosulfonil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-bencilaminosulfonil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(1-metil-3-fenilpropilamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-bencil-2-cianoetilamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-(3-piridil)etilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-furfurilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-isopropoxietilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-metoxietilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-tetrahidrofurfurilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(-)-5-[N-(cis-mirtanilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[(1-bencilpiperidinil-4-amino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-indanamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(ciclopropilmetilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(1,5-dimetilhexilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metilbencilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[N-(3-(N-acetil-N-metilamino)pirrolidinil)sulfonil]-3,3-dicloro-2-
oxoindol
5-[2-(1,2,3,4-tetrahidroisoquinolino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(decahidroisoquinolino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metil-2-cianoetilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metilcianometilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(pirrolidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metilfenetilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(azaciclooctano)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(3-azabiciclo[3.2.2]nonano)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(2-etoxicarbonilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(morfolino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(S)-(+)-5-[1-(2-metoximetilpirrolidinil)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metil-2-(4-piridinil)etilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metil-2-hidroxietilamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(S)-(+)-5-[N-(2-hidroximetilpirrolidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(3-hidroxipirrolidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(3-aminocarbonilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(2-metilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(4-metilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-hidroxipiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(2-(2-hidroxietil)piperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(3-hidroximetilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-fenilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-bencilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-(1-piperidinil)piperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-bencilaminosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-clorosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-bencilaminosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
N-metil-5-(1-piperidinilsulfonil)-3,3-dicloro-2-oxoindol
El término "actividad IL-1b
convertasa excesiva" se usa en la presente memoria para indicar
una expresión excesiva de proteína, o activación de la enzima.
El término "alquilo
(C_{1}-C_{6})" o "alquilo" se usa en la
presente memoria para indicar radicales tanto de cadena lineal como
ramificada de 1 a 6 átomos de carbono, a no ser que se indique otra
longitud de cadena, incluyendo, aunque sin quedar limitados a los
mismos, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo,
n-butilo, sec-butilo, iso-butilo,
terc-butilo y similares.
El término "heteroarilo" (o el mismo en
cualquier combinación tal como "heteroariloxi" o
"heteroarilalquilo"), se usa en la presente memoria para
indicar un sistema de anillo aromático de 5 a 10 miembros en el que
uno o más anillos contienen uno o más heteroátomos seleccionados
del grupo formado por N, O o S, tal como, pero sin estar limitado
a, pirrol, pirazol, furano, tiofeno, quinolina, isoquinolina,
quinazolinilo, piridina, pirimidina, oxazol, oxadiazol, tetrazol,
tiazol, tiadiazol, triazol, imidazol, bencimizadol, benzotiofeno,
benzopirrol o benzofurano.
El término "arilo" (o el mismo en cualquier
combinación tal como "ariloxi" o "arilalquilo") se usa en
la presente memoria para indicar un anillo fenilo o naftilo.
El término "cicloalquilo" se usa en la
presente memoria para indicar radicales cíclicos, preferiblemente
de 3 a 7 carbonos, incluyendo aunque sin estar limitados a los
mismos, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares.
El término "halo" o "halógenos" se usa
en la presente memoria para que incluya, a no ser que se indique
de otro modo, cloro, fluoro, bromo y yodo.
La presente invención contiene la inhibición de
Caspasas por compuestos de Fórmula (I). Lo que se entiende por el
término "Caspasas" son fragmentos, homólogos, análogos y
derivados de los polipéptidos enzima conversora de
interleuquina-1 b (o convertasa). Estos análogos
están estructuralmente relacionados con la familia de Caspasas. Por
lo general codifican una proteína o proteínas que presentan alta
homología con ICE humana en toda la secuencia. Preferiblemente, se
conserva el pentapéptido QACRG. Las Caspasas, que pueden incluir
muchas variantes alélicas naturales (tales como sustituciones,
eliminaciones o adiciones de nucleótidos) no alteran sustancialmente
la función del polipéptido codificado. Es decir, retienen
esencialmente la misma función o actividad biológica que la
proteasa ICE, aunque se sabe que la función biológica puede
potenciarse o reducirse en actividad. La actividad adecuada no es
actividad IL-1b convertasa, sino la capacidad para
inducir apóptosis o implicarse en la muerte celular programada de
alguna forma. Las Caspasas adecuadas incluidas en esta invención
son las descritas en los documentos PCT US94/07127, presentado el
23 de junio de 1994, número de expediente del agente:
325800-184; y en USSN 08/334.251, presentado el 1 de
noviembre de 1994, número de expediente del agente:
325800-249, cuyas descripciones se incorporan en la
presente memoria como referencia en su totalidad.
El término "bloqueo o inhibición, o reducción
de la producción de IL-1b y/o TNF" tal y como se
usa en la presente memoria se refiere a:
a) una reducción de niveles excesivos, o una
regulación a niveles menores, de la citoquina en un ser humano
hasta niveles normales o inferiores a los normales inhibiendo la
liberación in vivo de citoquina; o
b) una regulación a niveles inferiores, al nivel
genómico, de niveles excesivos in vivo de la citoquina
(IL-1 o TNF) en un ser humano hasta niveles
normales o inferiores a los normales; o
c) una regulación a niveles inferiores, mediante
la inhibición de la síntesis directa de la citoquina
(IL-1 o TNF) como suceso postraducción; o
d) una regulación a niveles inferiores, al nivel
de traducción, de niveles excesivos in vivo de la citoquina
(IL-1 o TNF) en un ser humano hasta niveles
normales o inferiores a los normales.
El bloqueo o inhibición, o reducción de la
producción de IL-1 y/o TNF es un descubrimiento de
que los compuestos de Fórmula (I) son inhibidores de las
citoquinas. IL-1 y TNF se basan en los efectos de
los compuestos de Fórmula (I) sobre la producción de
IL-1 y TNF en ensayos in vitro e in
vivo que son bien conocidos y reconocidos en la técnica,
algunos de los cuales se describen en la presente memoria.
El compuesto de la presente invención se puede
sintetizar conforme a los esquemas ilustrados a continuación.
Se trata la isatina o su derivado
N-alquilo con ácido clorosulfónico a temperaturas
que varían de 0 a 10ºC con el fin de obtener
5-clorosulfonil-3,3-
dicloro-2-oxoindol, el precursor
directo de los compuestos de esta invención. El tratamiento del
derivado clorosulfonilo con una amina primaria o secundaria en
disolventes orgánicos tales como tetrahidrofurano, cloruro de
metileno o dimetilformamida con o sin la adición de una base de
amina terciaria tal como trietilamina, proporciona el
5-alquilaminosulfonil-3,3-dicloro-2-oxoindol.
Se calentó una solución de isatina (1,6 g, 10
mmol) en ácido clorosulfónico (6,6 ml) hasta 70ºC durante 3 horas.
Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se vertió la
solución en hielo y se extrajo con cloruro de metileno. La solución
orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se eliminó
el disolvente a presión reducida proporcionando el compuesto del
epígrafe como un sólido naranja con rendimiento cuantitativo. RMN
de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) d 7,25 (d, J= 10,5 Hz, 1 H), 8,12
(d, J= 10,5 Hz, 1 H), 8,29 (s, 1 H), 8,74 (s ancho, 1 H ).
Se añadió bencilamina (135 \mul, 1,2 mmol) gota
a gota a una solución de
5-clorosulfonil-3,3-dicloro-2-oxoindol
(100 mg, 400 \mumol) en cloruro de metileno (3 ml). Después de
agitar durante 4 horas, se añadió ácido clorhídrico 3N junto con un
volumen adicional de cloruro de metileno (20 ml). Se secó la fase
orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtró y se sometió a
cromatografía sobre gel de sílice (25% a 35% de acetato de etilo /
hexanos) proporcionando el compuesto del epígrafe. ES (-) MS m/e =
369 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
3-fenilpropilamina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como una espuma amarilla con un 32% de rendimiento. ES (+)
MS m/e = 413 (M + H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-(2-cianoetil)-bencilamina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido blanco con
un 19% de rendimiento. ES (+) MS m/e = 424 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-(3-piridil)-etilamina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un aceite amarillo
con un 4% de rendimiento. ES (+) MS m/e = 386 (M + H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-furfurilamina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como un sólido amarillo con un 17% de rendimiento. ES (-)
MS m/e = 359 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-isopropoxietilamina, proporcionando el compuesto
del epígrafe como una espuma amarilla con un 33% de rendimiento. ES
(-) MS m/e = 365 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-metoxietilamina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como una espuma amarilla con un 27% de rendimiento. ES (-)
MS m/e = 337 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-tetrahidrofurfurilamina, proporcionando el
compuesto del epígrafe como una espuma amarilla clara con un 30% de
rendimiento. ES (-) MS m/e = 363 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
(-)-cis-mirtanilamina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
clara con un 8% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 415 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
4-amino-1-bencilpiperidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un aceite amarillo
con un 5% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 452 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-indanamina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como una espuma marrón con un 50% de rendimiento. ES (-) MS
m/e = 395 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
ciclopropilmetilamina, proporcionando el compuesto del epígrafe
como una espuma amarilla con un 21% de rendimiento. ES (-) MS m/e =
333 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
1,5-dimetilhexilamina, proporcionando el compuesto
del epígrafe como una espuma amarilla con un 12% de rendimiento. ES
(-) MS m/e = 391 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-metilbencilamina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como un sólido amarillo con un 38% de rendimiento. ES (-)
MS m/e = 384 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
3-(N-acetil-N-metilamino)pirrolidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
con un 39% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 404 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, proporcionando el
compuesto del epígrafe como un sólido amarillo con un 47% de
rendimiento. ES (-) MS m/e = 395 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
decahidroisoquinolina, proporcionando el compuesto del epígrafe
como una espuma amarilla con un 27% de rendimiento. ES (-) MS m/e =
401 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-metil-beta-alaninanitrilo,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido amarillo
claro con un 28% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 346 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-metilaminoacetonitrilo, proporcionando el
compuesto del epígrafe como un sólido amarillo con un 7% de
rendimiento. ES (-) MS m/e = 332 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por pirrolidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido amarillo
claro con un 21% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 333 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-metilfenetilamina, proporcionando el compuesto
del epígrafe como una espuma amarilla clara con un 45% de
rendimiento. ES (-) MS m/e = 397 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por azaciclooctano,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
con un 49% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 375 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
3-azabiciclo[3.2.2]nonano,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
con un 60% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 387 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
piperidina-2-carboxilato de etilo,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
clara con un 69% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 419 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por morfolina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido amarillo
claro con un 56% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 349 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
(S)-(+)-2-(metoximetil)pirrolidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
clara con un 38% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 377 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-metil-2-(4-piridina)etilamina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido marrón con
un 38% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 398 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
N-(metil)aminoetanol, proporcionando el compuesto del
epígrafe como una espuma amarilla clara con un 27% de rendimiento.
ES (-) MS m/e = 337 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
(S)-(+)-2-(hidroximetil)pirrolidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como una espuma amarilla
clara con un 31% de rendimiento. ES (-) MS m/e = 363 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
3-hidroxipirrolidina, proporcionando el compuesto
del epígrafe como un sólido blanco con un 9% de rendimiento. ES (-)
MS m/e = 351 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
3-carboxamidapiperidina, proporcionando el
compuesto del epígrafe como un sólido blanco con un 53% de
rendimiento. ES (-) MS m/e = 390 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
2-metilpiperidina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como una espuma blanca con un 10% de rendimiento. ES (-) MS
m/e = 361 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
4-metilpiperidina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como un sólido blanquecino con un 32% de rendimiento. ES
(-) MS m/e = 361 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
4-hidroxipiperidina, proporcionando el compuesto
del epígrafe como un sólido blanquecino. ES (+) MS m/e = 365 (M +
H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
(+/-)-2-(2-hidroxietil)piperidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido
blanquecino. ES (-) MS m/e = 391 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
(+/-)-3-hidroximetilpiperidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido
blanquecino. ES (-) MS m/e = 377 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
(+/-)-3-hidroximetilpiperidina,
proporcionando el compuesto del epígrafe como un sólido
blanquecino. ES (-) MS m/e = 423 (M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
4-bencilpiperidina, proporcionando el compuesto del
epígrafe como un sólido blanquecino. ES (-) MS m/e = 437 (M -
H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
1b) salvo porque se sustituyó la bencilamina por
4-(1-piperidinil)piperidina, proporcionando
el compuesto del epígrafe como un sólido blanquecino. ES (-) MS m/e
= 430 (M - H).
Se preparó el compuesto del epígrafe conforme al
ejemplo 1a) salvo porque se sustituyó la isatina por
N-metilisatina. El producto se obtuvo como un
sólido naranja con rendimiento cuantitativo. RMN de ^{1}H (400
MHz, CDCl_{3}) d 3,37 (s, 3 H), 7,09 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 8,16
(d, J = 10,5 Hz, 1 H), 8,28 (s, 1 H).
Se añadió bencilamina (50 \mul, 458 \mumol)
gota a gota a una solución de
5-clorosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
(120 mg, 382 \mumol) en cloruro de metileno (5 ml). Después de
agitar durante toda la noche, se añadió ácido clorhídrico 3N junto
con un volumen adicional de cloruro de metileno (20 ml). La fase
orgánica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtró y se sometió
a cromatografía sobre gel de sílice (35% a 55% de acetato de etilo /
hexanos) proporcionando el compuesto del epígrafe. ES (-) MS m/e =
383 ( M - H).
Se preparó conforme al procedimiento del ejemplo
41 b, salvo porque se sustituyó la bencilamina por piperidina. RMN
de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) d 1,45 (m, 2 H), 1,67 (m, 4 H),
3,00 (m, 4 H), 3,36 (s, 3 H), 7,01 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 7,84 (d,J
= 10,5 Hz, 1 H), 7,99 (s, 1 H).
Se expresó Caspasa 3 de longitud completa
intracelularmente en E. coli con el marcador hexa His en
N-terminal. Las células de E. coli se lisaron
en 10 ml/g de células de tampón de lisis (fosfato sódico 50 mM, pH
7,2, NaCl 0,1 M, Tween 20 al 0,1% y
\beta-mercaptoetanol 10 mM) usando un
homogeneizador Microfluidics M110Y a 69 x 10^{6} Pa. Después de
centrifugar, se detectó la actividad de Caspasa 3 en el
sobrenadante del lisado. Se sometió a intercambio de tampón el
sobrenadante en una columna Sephadex G25 equilibrada con Tris HCl
20 mM, sacarosa al 10%, CHAPS al 0,1%, DTT 2 mM, pH 7,8 (TSDC). Las
fracciones que contenían actividad Caspasa 3 se aplicaron a DEAE
Toyopearl 650 M (Supelco Inc.) equilibrada con tampón TSCD. La
columna eluyó con un gradiente lineal de 20 mM a 120 mM de Tris HCl
pH 7,8 en TSCD. La Caspasa 3 eluyó al principio del gradiente antes
de eluir la mayoría de impurezas. Esta Caspasa 3 parcialmente
purificada se usó para el rastreo del inhibidor. Todas las
operaciones se llevaron a cabo a 4ºC y se midió la actividad Caspasa
3 usando substrato, DEVD-AMC y lector de placas
Dynatach Fluolite 1000.
Se ensayó la Caspasa 3 a 30ºC en placas de 96
pocillos usando sustrato tetrapéptido fluorógeno
N-acetil-L-aspartil-L-glutanil-L-valil-L-
aspartil-7-amido-4-metilcumarina
(Av-DEVD-AMC). Los ensayos se
llevaron a cabo a pH 7,5 en un sistema tamponado que contenía Hepes
25 mM, sacarosa al 10%, CHAPS al 0,1% y DTT 1-50
\muM. La concentración de sustrato se fijó a 10 \muM. Se
controló de forma continua la fluorescencia de la
7-amino-4-metilcumarina
liberada a 460 nm después de excitación a 360 nm.
Los compuestos se ensayaron en una única dosis de
50 a 100 \muM. La actividad se controló como se ha descrito antes
durante un período de 30 a 60 minutos después de la adición
simultánea de sustrato e inhibidor a la enzima para iniciar la
reacción. Las curvas de progreso así generadas se ajustaron por
ordenador a una ecuación de primer orden para valorar la potencia
y/o dependencia del tiempo.
Los compuestos representativos de fórmula (I) han
demostrado actividad inhibidora positiva en el ensayo indicado
antes.
Los compuestos se prepararon en forma de solución
madre (5 - 100 mM) en dimetilsulfóxido (DMSO) y se diluyeron en
DMSO proporcionando las concentraciones finales, con
concentraciones en DMSO que variaban de 0,1 a 1%.
Se obtuvieron células Jurkat de American Type
Culture Collection y se desarrollaron en medio
RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%
a 37ºC, CO_{2} al 5%. Las células se sembraron en matraces en T a
0,03 a 0,08 x 10^{6} células /ml y se usaron para experimentos a
0,5 a 1,0 x 10^{6} células/ml. Se pueden usar otras células
proliferativas con apóptosis inducida por anti-fas,
cantotecina, cerimida o TNF.
Un procedimiento para medir la apóptosis es
cuantificar la cantidad de fragmentos de DNA rotos usando un
procedimiento de marcado del extremo fluorescente, un sistema usado
en el kit ApopTag de Oncor (Gaithersburg, MD). En resumen, la enzima
desoxinucleotidil transferasa terminal extiende fragmentos de DNA
con nucleótidos que contienen digoxigenina, que se detectan entonces
con un anticuerpo antidigoxigenina que lleva fluoresceína
permitiendo la detección por fluorescencia (494 nm en excitación y
523 nm en emisión). Se usa yoduro de propidio como colorante
complementario para medir el contenido de DNA total. Se realizó
análisis citométrico de flujo en un aparato
Becton-Dickinson (Rutherford, NJ) FACScan usando el
programa CelQuest.
Para uso terapéutico, los compuestos de la
presente invención se administrarán por lo general en una
composición farmacéutica convencional obtenida mezclando con un
vehículo o diluyente farmacéutico seleccionado con respecto a la
vía deseada de administración y a la práctica farmacéutica
convencional. Por ejemplo, se pueden administrar oralmente en forma
de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o
lactosa, o en cápsulas, óvulos o pastillas solos o mezclados con
excipientes, o en forma de elixires o suspensiones que contienen
aromatizantes o colorantes. Se pueden inyectar parenteralmente, por
ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para
administración parenteral, se usan mejor en forma de una solución
acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo,
sales o glucosa suficientes para hacer la solución isotónica con la
sangre. La elección de la forma de administración, así como las
dosis eficaces variarán dependiendo, entre otros, del trastorno que
se vaya a tratar. La elección del modo de administración y
dosificación está dentro de la práctica de los técnicos.
Los compuestos de la presente invención, en
particular los indicados en la presente memoria o sus sales
farmacéuticamente aceptables que son activos cuando se administran
por vía oral, se pueden formular como líquidos, por ejemplo,
jarabes, suspensiones o emulsiones, comprimidos, cápsulas o
pastillas.
Una formulación líquida comprenderá normalmente
una solución o suspensión del compuesto o sal farmacéuticamente
aceptable en un vehículo(s) acuoso(s), por ejemplo,
etanol, glicerina, disolvente no acuoso, por ejemplo,
polietilenglicol, aceites o agua con un agente de suspensión,
conservante, aromatizante o colorante.
Se puede preparar una composición en forma de un
comprimido usando cualquiera de los vehículos farmacéuticamente
adecuados usados de forma habitual para preparar formulaciones
sólidas. Ejemplos de tales vehículos incluyen estearato de
magnesio, almidón, sacarosa y celulosa.
Se puede preparar una composición en forma de una
cápsula usando procedimientos de encapsulación habituales. Por
ejemplo, se pueden preparar péllets que contienen ingrediente
activo usando vehículos convencionales y luego rellenarse en una
cápsula de gelatina dura; como alternativa, se puede preparar una
dispersión o suspensión usando cualquiera de los vehículos
farmacéuticos convencionales, por ejemplo, gomas acuosas,
celulosas, silicatos o aceites y la dispersión o suspensión se
rellena entonces en una cápsula de gelatina blanda. Con preferencia,
la composición está en forma de unidad de dosis tal como una
cápsula o comprimido.
Composiciones parenterales típicas comprenden una
solución o suspensión de compuesto o sal farmacéuticamente
aceptable en un vehículo acuoso estéril o aceite parenteralmente
aceptable, por ejemplo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona,
lecitina, aceite de cacahuete o aceite de sésamo. Como alternativa,
la solución se puede liofilizar y luego reconstituirse con un
disolvente adecuado antes de la administración.
Una formulación de supositorio típica comprende
un compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que es
activo cuando se administra de este modo, con un agente ligante y/o
lubricante tal como glicoles poliméricos, gelatina o manteca de
cacao u otras ceras o grasas vegetales o sintéticas de bajo punto
de fusión.
Los compuestos farmacéuticamente aceptables de la
invención se administrarán normalmente a un sujeto en una pauta de
administración diaria. Para un paciente, esta puede ser por ejemplo,
de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg,
preferiblemente de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 mg/kg
de peso corporal del animal. Una dosis diaria, para un mamífero
mayor varía preferiblemente de aproximadamente 1 mg a
aproximadamente 1000 mg, preferiblemente de 1 mg a 500 mg o una de
sus sales farmacéuticamente aceptables, calculada como la base
libre, administrándose el compuesto de 1 a 4 veces al día. Las
formas de unidad de dosis pueden contener de aproximadamente 25
\mug a aproximadamente 500 mg del compuesto.
Existen muchas enfermedades y estados patológicos
en los que la desregulación de la apóptosis desempeña una
importante función. Todos estos estados patológicos implican
pérdida no deseada, perjudicial de células específicas con las
consecuencias patológicas resultantes.
La remodelación ósea implica la resorción inicial
por osteoclastos, seguida por la formación de hueso por los
osteoclastos. Recientemente, ha habido una serie de informes de
sucesos apoptóticos que se producen durante este proceso. Los
sucesos apoptóticos se han observado tanto en las células de
formación de hueso como de la resorción de hueso in vitro y,
de hecho, en los sitios de estas unidades de remodelación in
vivo.
La apóptosis ha sido sugerida como uno de los
mecanismos posibles de la desaparición de osteoclastos de sitios
inversos entre la resorción y formación. El
TGF-\beta1 induce la apóptosis (aproximadamente
30%) en osteoclastos de cultivos de médula ósea de murino
desarrollados durante 6 días in vitro. (Hughes, et
al. J. Bone Min. Res., 9, S138 (1994)). Los
bisfosfonatos antiresorción (cidronato, pamidronato o residronato)
promueven la apóptosis en osteoclastos de ratones in vitro
e in vivo. (Hughes et al, supra, en S347).
M-CSF que se ha encontrado con anterioridad que es
esencial para la formación de osteoclastos puede suprimir la
apóptosis, sugiriendo no solo que se mantiene la población de
osteoclastos, sino también que la formación de estas células
multinucleares puede determinarse por sucesos de apóptosis. (Fuller
et al, J. Bone Min. Res, 8, S384 (1993);
Perkin et al, J. Bone Min. Res, 8, S390
(1993)). Las inyecciones locales de IL-1 en la
bóveda del cráneo de ratones una vez al día durante 3 días inducen
una intensa y agresiva remodelación. (Wright, et al, J.
Bone Min. Res,9,S174 (1994)). En estos estudios, el 1% de
osteoclastos eran apoptóticos 1 día después del tratamiento, que
aumentó 3 días después al 10%. Un alto porcentaje (95%) de estos
osteoclastos apoptóticos estaban en el sitio inverso. Estos datos
sugieren que Caspasas son funcionalmente muy importantes en la
apóptosis de osteoclastos.
Por tanto, un aspecto de la presente invención es
promover la apóptosis en osteoclastos como una nueva terapia para
inhibir la resorción en enfermedades de excesiva pérdida ósea,
tales como osteoporosis, usando compuestos de Fórmula (I) como los
definidos en la presente memoria.
La apóptosis puede inducirse por bajos niveles
séricos en células del tipo osteoblastos de rata altamente
diferenciados (Ros 17/2.8) (Ihbe, et al., (1994), J. Bone
Min. Res, 9, S167)). Esto estaba asociado con una
pérdida temporal de fenotipo de osteoblastos, sugiriendo que el
mantenimiento de la expresión y apóptosis de genes de linajes
específicos están fisiológicamente asociadas. Osteoblastos
derivados de bóveda de cráneo de rata fetal desarrollados in
vitro sufrieron apóptosis y esta se localizó en áreas de
formación de nódulos como se indica por el marcado in vivo de
extremos de DNA fragmentado. (Lynch et al,(1994) J. Bone
Min. Res, 9, S352). Se ha demostrado que los genes
inmediatamente anteriores c-fos y
c-jun se expresan antes de la apóptosis:
d-fos y c-jun-Lac Z
en ratones transgénicos muestran la expresión constitutiva de estos
factores de transcripción en muy pocos tejidos, uno de los cuales
es el óseo (Smeyne et al., (1992) Neuron, 8,
13- 23; y Morgan J,. (1993), Apoptotic Cell Death: Functions and
Mechanisms. Colg Spring Harbor 13-15 de octubre).
La apóptosis se observó en estos animales en la placa de
crecimiento epifíseal y en zonas condrogénicas como calficicaciones
de ligamentos petulares. La apóptosis condrogénica también se ha
observado en ratones con menos PTHRP y estos transgénicos presentan
una formación de hueso endocondral anómala (Lee et al,
(1994) J. Bone Min. Res, 9, S159). Un artículo muy
reciente examinó una línea de células de osteosarcoma humano que
sufría apóptosis espontánea. Usando esta línea de células,
LAP-4, pero no ICE, se podía detectar y se podía
bloquear la apóptosis in vitro mediante la inhibición o
agotamiento de LAP-4 (Nicholson, et al,
(1995) Nature, 376, 37-43). Así, la
apóptosis pede desempeñar un papel en la pérdida de osteoblastos y
condrocitos y en la inhibición de la apóptosis podría proporcionar
un mecanismo para mejorar la formación de hueso.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
es la inhibición de la apóptosis como nueva terapia para mejorar la
formación de hueso usando compuestos de Fórmula (I) como los
definidos en la presente memoria.
La osteoartritis (OA) es una enfermedad
degenerativa caracterizada por erosión progresiva del cartílago
articular. Los condrocitos son los únicos tipos de células
encontrados en el cartílago articular y las perturbaciones en el
metabolismo de estas células puede implicarse en la patogénesis de
OA. Las lesiones al cartílago inician una respuesta reparadora
específica que implica un aumento en la producción de proteoglucano
y colágeno en un intento por reestablecer la homeostasis normal de
la matriz. Sin embargo, con el progreso de la enfermedad, la red
tridimensional de colágeno se rompe y se produce muerte celular de
condrocitos en lesiones de OA (Malemud, et al: Regulation
of chondrocytes in osteoarthritis. In: Adolphe, M. ed.
Biological Regulation of Chondrocytes. Boca Raton: CRC Press, 1992,
295-319). Se ha demostrado que en la OA, los
condrocitos adyacentes a defectos del cartílago expresan altos
niveles de bcl-2 (Erlacher, et al, (1995),
J. of Rheumatology, 926-931). Esto
representa un intento por proteger los condrocitos de la apóptosis
inducida por el proceso de la enfermedad.
La protección de condrocitos durante los primeros
cambios degenerativos en el cartílago mediante inhibición de
apóptosis puede proporcionar una nueva técnica terapéutica a esta
enfermedad común. Por tanto, otro aspecto de la presente invención
es la inhibición de la apóptosis como una nueva terapia para tratar
osteoartritis, usando compuestos de Fórmula (I) como los definidos
en la presente memoria.
Recientes evidencias demuestran que los estados
degenerativos crónicos del hígado están asociados a apóptosis
hepatocelular. Estos estados patológicos incluyen degeneración
hepatocelular inducida por infecciones, compuestos químicos y
respuestas inmunes/inflamatorias. La apóptosis de células hepáticas
se ha observado en estados degenerativos del hígado inducidos por
una serie de agentes químicos, incluyendo paracetamol (Ray, et
al, 1993), FASEB . J., 7,
453-463), cocaína (Cascales et al, (1994),
Hepatology, 20, 992-1001) y etanol
(Baroni et al, (1994), J. Hepatol., 20,
508-513). Los agentes infecciosos y sus componentes
químicos que han demostrado inducir apóptosis incluyen hepatitis
(Hiramatsu, et al, (1994), Hepatology, 19,
1354-1359; Mita et al, (1994) Biochem.
Biophys. Res. Commun., 204, 468-474)),
factor de necrosis tumoral y endotoxina (Leist, et al,
(1995), J. Immunol., 154, 1307-1316; y
Decker, K., (1993) Gastroenterology, 28(S4}),
20-25). La estimulación de las respuestas inmunes /
inflamatorias por mecanismos tales como el transplante de
haloinjertos y la hipoxia seguida por reperfusión han demostrado
inducir apóptosis de hepatocitos (Krams, et al, (1995)
Transplant. Proc., 27, 466-467).
Juntas, estas evidencias apoyan que la apóptosis hepatocelular es
vital en enfermedades hepáticas degenerativas.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
es la inhibición de la apóptosis como nueva terapia para tratar
enfermedades hepáticas degenerativas, usando compuestos de Fórmula
(I) como los definidos en la presente memoria.
La apóptosis se reconoce como un proceso
fundamental en el sistema inmune en el que la muerte celular
configura el sistema inmune y efectúa funciones inmunes. La
apóptosis también está implicada en enfermedades virales (por
ejemplo, SIDA). Informes recientes indican que la infección por VIH
puede producir un exceso de apóptosis, contribuyendo a la pérdida
de células T CD4^{+}. Es de interés especial la observación de
que APO-1/Fas comparte homología de secuencia con
gp120 de VIH-1.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
es la inhibición de apóptosis como una nueva terapia para tratar
enfermedades virales, usando compuestos de Fórmula (I) como los
definidos en la presente memoria.
Instrucciones terapéuticas adicionales y otras
indicaciones en las que la inhibición de cisteína proteasas
apoptóticas sea de utilidad terapéutica, junto con citas relevantes
que apoyan la implicación de la apóptosis en cada indicación se
presentan a continuación en la Tabla 1.
| Indicación | Citas |
| Isquemia / reperfusión | Barr et al, (1994) Biotechnology, 12, |
| 487-493; Thompson, C. B. (1995) Science, 267, 1456-1462 | |
| Ictus | Barr et al, supra; y Thompson, C. supra |
| Enfermedad renal poliquística | Barr et al, supra; y Mondain et al |
| (1995) ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 57, 28-32 | |
| Glomerulonefritis | Barr et al, supra |
| Osteoporosis | Lynch et al(1994) J. Bon. Min. Res. 9, S352; |
| ;Nicholson et al, (1995) Nature, 376, 37-43 | |
| Eritopoyesis / anemia aplásica | Thompson, C. supra; Koury et al |
| (1990) Science, 248, 378-381 | |
| Degeneración hepática crónica | Thompson, C, supra; Mountz et al, |
| (1994), Arthritis Rheum., 37, 1415-1420; Goldin et al, 1993) | |
| Am.J. Phatol., 171, 73-76 | |
| Muerte de células T | Thompson, C. supra; Ameison et al, (1995) |
| Trends Cell Biol. 5, 27-32 | |
| Osteoartritis –condrocitos | Ishizaki et al, (1994), J. Cell Biol., |
| 126 1069-1077; Blanco et al, (1995), Am. J. Pathol., 146, 75-85 | |
| Calvicie de patrón masculino | Mondain et al, supra; Seiberg et al., |
| (1995) J. Invest Dermatol. 104, 78-82; Tamada et al., (1994) | |
| Br. J. dermatol., 131, 521-524 | |
| Enfermedad de Alzheimer | Savill, J., (1994) Eur. J. Clin. Invest, |
| 24 715-723; Su et al, (1994), Neuroreport, 5, 2529-2533; | |
| Johnson, E., (1994) Neurobiol. Aging, 15 suple 2, S187-S189 | |
| Enfermedad de Parkinson | Savill, J. supra; Thompson, C. supra |
| Diabetes tipo I | Barr et al., supra |
Los efectos inhibidores de IL-1 y
TNF de los compuestos de la presente invención se determinan por el
siguiente ensayo in vitro:
Se aíslan monocitos humanos de sangre periférica
y purifican de preparaciones de sangre nueva de donantes
voluntarios, o de linfa cuajada de bancos de sangre, conforme al
procedimiento de Colotta et al., J.
Immunol.,132, 936 (1984). Estos monocitos (1 x 10^{6}
se siembran en placas de 24 pocillos en una concentración de 1 - 2
millones/ml por pocillo. Las células se dejan adherirse durante 2
horas, tiempo después del cual se separan las células no adherentes
por lavado suave. Los compuestos de ensayo se añaden entonces a las
células durante aproximadamente 1 hora antes de la adición de
lipopolisacárido (50 ng/ml) y se incuban los cultivos a 37ºC
durante otras 24 horas. Al finalizar este período, se separan los
sobrenadantes de los cultivos y se aclaran de células y otros
restos. Los sobrenadantes de los cultivos se ensayan entonces
inmediatamente para determinar la actividad biológica de
IL-1, bien por el procedimiento de Simon et
al, J. Immunol. Methods, 84, (1985) (en base a la
capacidad de IL-1 para estimular una línea de
células que produzca IL-2 (EL-4)
para secretar IL-2, en concierto con ionóforo
A23187) o el procedimiento de Lee et al., J.
ImmunoTherapy, 6(1), 1-12 (1990)
(ensayo ELISA).
Se aíslan monocitos de sangre periférica humana y
purificados de linfa cuajada de bancos de sangre o de residuos de
feresis de plaquetas, conforme al procedimiento de Colotta, R.,
et al., J. Immunol., 132(2), 936
(1984). Los monocitos se cultivan a una densidad de 1 x 10^{6}
células/ml de medio por pocillo en discos de 24 pocillos. Las
células se dejan adherirse durante 1 hora después de que el
sobrenadante se haya aspirado y añadido medio limpio (1 ml,
RPMI-1640, Whitaker Biomedical Products, Whitaker,
CA), que contenía suero de ternero fetal al 1% y penicilina y
estreptomicina (10 unidades/ml). Las células se incuban durante 45
minutos en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo en dosis
que varían de 1 nM-10 mM (los compuestos se
solubilizan en dimetil sulfóxido / etanol, tal que la concentración
final de disolvente en el medio de cultivo sea 0,5% de dimetil
sulfóxido /0,5% de etanol). Se añade entonces lipopolisacárido
bacteriano (E. coli, 055:B5 [LPS] de Sigma Chemicals Co.)
(100 ng/ml en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato) y se
incuban los cultivos durante 16-18 horas a 37ºC en
un incubador de CO_{2} al 5%. Al finalizar el período de
incubación, se separan los sobrenadantes del cultivo de las
células, se centrifugan a 3.000 rpm para separar los restos
celulares. Se ensaya entonces el sobrenadante para determinar la
actividad TNF usando radioinmunoensayo o un ensayo ELISA, como se
describe en el documento WO 92/10190 y por Becker et al.,
J. Immunol. 1991, 147, 4307.
La descripción anterior desvela totalmente la
invención incluyendo realizaciones preferidas de la misma. Dentro
del alcance de las siguientes reivindicaciones se pueden realizar
modificaciones y mejoras de las realizaciones desveladas de forma
específica en la presente memoria. Sin más elaboración, se cree que
un experto en la técnica puede, usando la descripción anterior,
utilizar la presente invención en toda su amplitud. Por tanto, los
ejemplos presentes se considerarán meramente ilustrativos y no
limitantes del alcance de la presente invención en modo alguno. Las
realizaciones de la invención en las que se reivindica una
propiedad o privilegio exclusivo se definen a continuación.
Claims (11)
1. Un compuesto de fórmula (I) o una sale
farmacéuticamente aceptable del mismo
en la
que
R_{1} es hidrógeno o alquilo
(C_{1}-C_{4});
R_{2} es alquilo
(C_{1}-C_{10}), aril-alquilo
(C_{1}-C_{4}) opcionalmente sustituido una a
tres veces independientemente con hidroxi, halógeno, alquilo o
alcoxi, heteroaril-alquilo
(C_{1}-C_{4}), cicloalquilo
(C_{3}-C_{7}), o R_{1} y R_{2} junto con el
nitrógeno al que están unidos forman un anillo de 3 a 10 miembros
que opcionalmente contiene un heteroátomo adicional seleccionado de
oxígeno, nitrógeno o azufre;
R_{3} y R_{4} son alquilo
(C_{1}-C_{6}), hidrógeno, nitro o halógeno,
y
R_{5} es alquilo
(C_{1}-C_{6}), hidrógeno, arilalquilo o
heteroarilalquilo;
siendo el heteroarilo de dicho
heteroaril-alquilo (C_{1}-C_{4})
y dicho heteroarilalquilo un sistema de anillo aromático de 5 a 10
miembros en el que uno o más anillos contienen uno o más
heteroátomos seleccionados del grupo constituido por N, O o S;
y
siendo el arilo de dicho
aril-alquilo (C_{1}-C_{4}) y
dicho arilalquilo un anillo fenilo o naftilo.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{5} es bencilo sustituido.
3. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1} es hidrógeno o metilo.
4. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que R_{1} y R_{2} están unidos formando un anillo de cinco
miembros que contiene nitrógeno.
5. El compuesto según la reivindicación 1, que
es
5-clorosulfonil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-bencilaminosulfonil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(1-metil-3-fenilpropilamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-bencil-2-cianoetilamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-(3-piridil)etilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-furfurilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-isopropoxietilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-metoxietilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-tetrahidrofurfurilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(-)-5-[N-(cis-mirtanilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[(1-bencilpiperidinil-4-amino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(2-indanamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(ciclopropilmetilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(1,5-dimetilhexilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metilbencilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[N-(3-(N-acetil-N-metilamino)pirrolidinil)sulfonil]-3,3-dicloro-2-
oxoindol
5-[2-(1,2,3,4-tetrahidroisoquinolino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(decahidroisoquinolino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metil-2-cianoetilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metilcianometilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(pirrolidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metilfenetilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(azaciclooctano)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(3-azabiciclo[3.2.2]nonano)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(2-etoxicarbonilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(morfolino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(S)-(+)-5-[1-(2-metoximetilpirrolidinil)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metil-2-(4-piridinil)etilamino)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[N-(N-metil-2-hidroxietilamino)sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(S)-(+)-5-[N-(2-hidroximetilpirrolidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(3-hidroxipirrolidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(3-aminocarbonilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(2-metilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(4-metilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-hidroxipiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(2-(2-hidroxietil)piperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
(+/-)-5-[1-(3-hidroximetilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-fenilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-bencilpiperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-[1-(4-(1-piperidinil)piperidinil)
sulfonil]-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-bencilaminosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-clorosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
5-bencilaminosulfonil-N-metil-3,3-dicloro-2-oxoindol
N-metil-5-(1-piperidinilsulfonil)-3,3-dicloro-2-oxoindol
6. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para su uso en terapia.
7. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto según la reivindicación 1, y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
8. El uso de un compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para su uso
en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos en los que es un
factor el bloqueo de apóptosis excesiva o inapropiada.
9. El uso de un compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para su uso
en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con una
excesiva actividad IL-1\beta convertasa.
10. El uso de un compuesto de fórmula (I) según
la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para su
uso en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos en los que es un
factor el bloqueo o reducción de la producción de
IL-1\beta y/o TNF.
11. El uso de un compuesto de fórmula (I) según
la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para su
uso en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos en los que es un
factor la inhibición de la producción de caspasa 3 y 7.
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