JPH0436343B2 - - Google Patents

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JPH0436343B2
JPH0436343B2 JP59246409A JP24640984A JPH0436343B2 JP H0436343 B2 JPH0436343 B2 JP H0436343B2 JP 59246409 A JP59246409 A JP 59246409A JP 24640984 A JP24640984 A JP 24640984A JP H0436343 B2 JPH0436343 B2 JP H0436343B2
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amylase
saliva
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pancreatic
monoclonal antibody
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Uarutaa Nauyokusu Kuruto
Geruharuto Uirii
Hyuupunaa Paraisutsu Kurisuta
Urufu Kaaru
Yungufuaa Heruberuto
Rentsu Herumuuto
Aruberuto Uinfuriito
Uiruherumu Uaarefueruto Augusuto
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Publication of JPH0436343B2 publication Critical patent/JPH0436343B2/ja
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、だ液のα−アミラーゼと共にすいぞ
うのα−アミラーゼの特異的に測定する試薬に関
する。
従来の技術 α−アミラーゼ（E.C.3.2.1.1.）は、１，４−ｄ
−グルコシド結合のオリゴー及びポリサツカライ
ドを、主として１，４−ｄ−グリコシド結合のマ
ルトース及びマルトーオリゴサツカライドへの加
水分解によつて分解する。酵素は工業的発酵技術
と共に、臨床分析及び診断法で著しい重要性を有
する。即ち多くの発病では、体液、例えば血清、
尿又は十二指腸分泌液中のα−アミラーゼ含量が
変化する。しかしながら、体内では主として２種
のα−アミラーゼ酵素、即ちすいぞうの酵素及び
だ液の酵素が生じる。診断上の重要性はすいぞう
の酵素であるのに過ぎないので、この両方（まれ
であると共に、わずかな量で生じるのに過ぎない
他のイソ酵素）のα−アミラーゼを分析上区別す
る課題が存在する。この場合難点は、両方の多発
形は類似構造を有し、免疫学上同一なことである
〔K.Lorentz、Laboratoriumsblatter 32：118
（1982年）〕。だ液の酵素の活性を除去するために
は、陰イオン交換剤の吸着、小麦の蛋白質による
抑制又は電気泳動又は電気焦点集中を使用するこ
とは公知である。しかしこれらの方法は、その分
離作用が不十分であるか又は日常の診断には費用
がかゝる。前記方法では、単にClin.Chem.28／
７巻、1525〜1527頁（1982年）に記載されている
だ液系酵素の抑制法は、小麦の芽から得られた抑
制剤によつて日常の診断上引受けられる時間を伴
なうが、選択度は不十分である。抑制剤の最適濃
度の場合でも、だ液系の酵素の活性約13％が得ら
れるが、すいぞうの酵素の活性は約81％に減少す
る。
発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこの欠点を除去し、体
液のだ液系のα−アミラーゼと共に、すいぞうの
α−アミラーゼの迅速で簡単なかつ確実な測定が
可能な方法及び試薬を得ることである。
問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば体液、殊に血清、
十二指腸分泌液又は尿のだ液のα−アミラーゼの
存在下にすいぞうのα−アミラーゼを、α−アミ
ラーゼの検出系とだ液のα−アミラーゼの抑制物
質の存在で反応させて特異的に測定する方法によ
つて解決される。この方法は抑制物質の代りに、
すいぞうのα−アミラーゼに対して５％以下の交
叉反応度を有するモノクロン抗体を添加する。
本発明方法は、すいぞうの酵素に対して著しく
わずかな交叉反応度を有するモノクロン抗体の驚
異的発見に基づく。このことは予期することがで
きなかつた。それというのもだ液とすいぞうとの
酵素は免疫学上同一であることは公知だつたから
である（Gerhad Pfleiderer，Lab.Med，７巻、
189〜193頁；K.Lorentz loc.cit.）。このようにし
て、モルトン・シユバルツ（Morton K.
Schwarz）〔“Immunoassay of Enzymes−an
Overview”（1983年）、４〜９頁〕によつて、人
間のだ液のα−アミラーゼに対する抗体はだ液系
の酵素を78％、すいぞうの酵素を75％抑制するこ
とが記載されている。それ故、実際に免疫学的基
礎での両酵素の定量的区別が可能になる方法を解
明することは予期されなかつた。
本発明方法に使用した新規モノクロン抗体は、
NCACC〔National Collection of Animal Cell
Cultires，ポートン・ダウン（Porton Down）、
英国〕に寄託された： クロン 79 ＝NCACC 84111305、 クロン 1A813E10 ＝NCACC 84111304、 クロン 1A814A ７ ＝NCACC 84111303、 クロン 32C516E3 ＝NCACC 84111302、 クロン 32C518F11 ＝NCACC 84111301 本発明によれば、これは実験動物を自然又は変
性されただ液のα−アミラーゼで免疫し、このよ
うにして得られた免疫動物のＢ−リンパ球を形質
転換因子と融合し、クローニングし、このように
して形成したモノクロン抗体を生じる混合細胞を
培養し、モノクロン抗体を単離して得ることがで
きる。だ液のα−アミラーゼ抗体を製造するため
の特に適当な動物は、ねずみ及びはつかねずみで
ある。免疫は、人間の自然のだ液のα−アミラー
ゼか又は変性されただ液のα−アミラーゼで行な
う。自然の酵素を使用する場合には、市場で得ら
れる電気泳動による均一な調剤が適当である。化
学的に変性されただ液のα−アミラーゼは、同じ
ようにして、例えばドイツ特許公開公報第
2543994号に記載されている酵素変性の公知方法
によつて得ることができる。適当な変性剤は、例
えば蛋白質のトリプトフアン基の酸化〔BBA、
143巻（1967年）、462〜472頁〕、主としてヒスチ
ジンに作用する酢酸ヨード（IAA）でのカルボ
キシメチル化又はテトラニトロメタンでのニトロ
化〔J.Biol.Chem.238巻（1963年）3307頁〕、ジア
ゾ化スルフアニル酸でのジアゾ化〔Meth.
Enzymol.25巻（1972年）、515〜531頁〕並びにジ
ニトロフルオルベンゾール（DNFB）と反応〔J.
Biol.Chem.243巻（1968年）、5344〜253頁〕させ
たＮ−ブロムサクシンイミド（NBS）である。
この場合自然の酵素は別として、DNFBで変性
した酵素が最も適当であることが判明した。
免疫は、自然又は変性された酵素の、好ましく
はアジユバントと組合せた常用の投与によつて行
なう。好ましくはアジユバントとしては、水酸化
アルミニウムをボルダテラ・ペルトウシイス
（Bordatella Pertussis）と一緒に使用する。
免疫に自然のだ液のα−アミラーゼを使用する
場合には、免疫は好ましくは少くとも９ヶ月にわ
たつて少くとも７回の免疫（注入I.P.）で行な
う。変性されただ液のα−アミラーゼを使用する
場合には、免疫の１部分を試験管内で行なうのが
有利であることが判明した。しかしながら試験管
内の免疫を行なう前に、生体内の免疫を少くとも
２回行なわなければならない。試験管内の免疫の
場合には、免疫動物のＢ−リンパ球を胸腺細胞で
調整した培地で培養し、培地に抗原を添加する。
免疫後に、免疫動物のＢ−リンパ球を、常法で
形質転換因子と融合させる。本発明範囲内で使用
することのできる形質転換因子の例は、骨髄腫細
胞、形質転換ウイルス、例えばＥ−Ｂウイルス又
はドイツ公開特許第3245665号明細書に記載され
ている因子である。融合は、ケーラー
（Koehler）及びミルシユタイン（Milstein）の
公知方法〔Nature 256巻（1975年）、495〜997
頁〕によつて行なう。この場合形成した混合細胞
は公知方法で、例えば市場で得られるセルソルタ
ー（Zellsorter）を使用してクローニングし、所
望のモノクロン抗体を形成するクロンも培養す
る。混合細胞の癌腫状の成長に基づいて、これは
不定時間で培養し、所望のモノクロン抗体を任意
の量で生じることができる。このようにして得ら
れたモノクロン抗体で体液からのだ液のα−アミ
ラーゼを大量に吸着することができるので、残留
するアミラーゼの活性はすいぞうのα−アミラー
ゼに関係ずけることができる。
本発明による測定法には、モノクロン抗体を、
そのまゝか又は相応する免疫学的性質を有するフ
ラグメント（Fcフラグメント）として使用するこ
とができる。それ故この場合“モノクロン抗体”
とは、フラグメントでもある。完全な抗体並びに
そのフラグメントは固定形で使用することができ
る。
意外なことにも本発明によつて使用したモノク
ロン抗体は、すいぞうのα−アミラーゼに対して
５％以下の交叉反応度を有し、多くの場合にはな
お１％に過ぎない交叉反応度に達する。それ故、
この抗体は小麦の芽から得られた公知抑制物質の
代りに、体液中のすいぞうのα−アミラーゼの特
異的測定に適当である。
α−アミラーゼそのものの測定は、公知方法に
よつて行なう。本発明によるモノクロン抗体は選
択的にだ液系のα−アミラーゼを結合し、これを
このようにして酵素活性の測定から取上げるの
で、α−アミラーゼの測定の際モノクロン抗体の
存在で得られた値は、単にすいぞうの酵素に該当
する活性に相応する。
好ましくは本発明方法は、分子にグルコース基
４〜７個を有するマルトポリオース、マルトース
ホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グ
ルコース−６−ホスフアトデヒドロゲナーゼ及び
NADを含有するα−アミラーゼ検出系で実施す
る。
本発明範囲内で好ましく使用したα−アミラー
ゼの他の検出系は、分子にグルコース基４〜７個
を有するニトロフエニルマルトポリオース及びα
−グルコシダーゼからなる。
α−アミラーゼのもう１つの好ましい検出系
は、一定の基で変性されている澱粉からなる。変
性されている澱粉とは、例えば一定の基で変性さ
れている澱粉、例えば、“フアデバス
（Phadebas）”として市場で得られる生成物〔ス
エーデンのフアルマジア（Pharmazia）社製〕
並びにドイツ公開特許第2812154号明細書に記載
されている生成物並びに分解挙動が変えられてい
る澱粉、例えばカルボキシメチル澱粉及び終極デ
キストリンである。これらのすべての系は公知で
あり、それ故詳説は不必要である。
本発明方法を実施するためには、試料の液体に
本発明による抗体を、好ましくは懸濁液の形で添
加し、次いで不溶物を好ましくは短時間の遠心分
離によつて分離する。透明な上澄みを、常用のα
−アミラーゼ試験で使用する。
本発明による試薬の範囲内では、モノクロン抗
体は完全な形並びにフラグメントの形で固体担
体、例えば免疫吸着性紙又はプラスチツクの小管
又はホースの表面に存在していてもよい。この方
法では、だ液系のα−アミラーゼは担体、即ち固
相に結合し、それ故液相では他に分離しないです
いぞうの酵素に基づく残りの活性の測定を行なう
ことができる。
本発明範囲内で特に良好な結果は、数種の異な
るクロンによつて得られるモノクロン抗体から混
合しているモノクロン抗体調剤を使用する場合に
得られる。
モノクロン抗体を固定形で使用しない場合に
は、モノクロン抗体及びその抗原、だ液のα−ア
ミラーゼから形成した錯体は可溶であるので、そ
の分離のための他の方法は、付加的にモノクロン
抗体又は免疫の際に実験動物から形成した抗体の
沈降因子を添加することである。この場合には不
溶錯体が形成し、これはだ液のα−アミラーゼ、
モノクロン抗体及び沈降因子を含有する。
沈降因子としては、好ましくはモノクロン抗体
に対するか又は実験動物から免疫の際に形成した
抗体の抗体（つまり抗−抗体）を使用する。他の
可能性は、蛋白質Ａの好ましくは固定形での添加
である。
本発明方法のこの実施形式を行なう好ましい方
法は、先づモノクロン抗体と抗抗体とからなる錯
体を形成し、次いでこれをα−アミラーゼを含有
する被験液に添加することである。しかしながら
選択的に、先づモノクロン抗体だけを添加し、培
養後に、だ液のα−アミラーゼとの抗原−抗体−
錯体を形成するために、抗−抗体を添加して不溶
性錯体を形成してもよい。
抗−抗体を使用する本発明方法の実施形式に
は、原則としてモノクロン抗体又は実験動物から
形成した抗体に対して調整されたすべての抗−抗
体が適当である。好ましくははつかねずみ又はね
ずみを使用する場合、抗−だ液−α−アミラーゼ
血清を作るためには羊から形成した抗−抗体を使
用する。
本発明の課題は、α−アミラーゼの検出系及び
だ液のα−アミラーゼの抑制物質を含有する、体
液、殊に血清、十二指腸分泌液、血漿又は尿のだ
液のα−アミラーゼと共にすいぞうのα−アミラ
ーゼを特別に測定する試薬であり、この試薬は抑
制物質の代りに、すいぞうのα−アミラーゼに対
して５％以下の交叉反応度を有するだ液のα−ア
ミラーゼに対するモノクロン抗体を含有する。
本発明による試薬中に含有されたα−アミラー
ゼの検出系及びその他の条件に関しては、方法に
関する前記詳述があてはまる。
本発明によつて、大きい特異性を有する体液の
だ液系のα−アミラーゼと共にすいぞうのα−ア
ミラーゼの簡単で迅速な測定が得られ、これによ
つて臨床診断法が改良される。
実施例 例 １ (A) バルブ（Balb）／ｃ−はつかねずみを、人
間のだ液のアミラーゼ100μｇでボルデテラ・
ペルトウシス（BORDETELLA
PERTUSSIS）を有する水酸化アルミニウムで
免疫する。約８時間のリズムで、人間のだ液の
アミラーゼそれぞれ50μｇで同じアジユバンド
で３〜４回更に免疫する。融合前の４日間に最
後の免疫を、生理学的食塩水にとかしただ液の
アミラーゼ50μｇで静脈内で行なう。
(B) 脾ぞう細胞とAg8.654（ATCC CRL 1580）
又はSP2/0（ATCC CRL 1581）骨髄腫細胞と
の融合を、J.ofImm.Meth.、39巻、285〜308頁
による標準法によつて行なう。脾ぞう細胞と骨
髄腫細胞との融合割合は５：１である。融合生
成物をNo.24の培養シヤーレ〔コスタール
（Costar）社製〕10個に入れ、培養シヤーレ１
個当りペリトネアル・エクシユダト
（peritoneal−exsudat）細胞５×104を与える。
ポジチブの１次培養物（例３参照）を、融合後
３〜４週間に螢光活性のセルソルター
（Zellsorter）を用いてクローニングする。細
胞を個別にNo.96のコスタール（Costar）のプ
レートに入れ、ペリトネアル・エクシユダト
（peritoneal−exsudat）細胞２×104を与える。
例 ２ ジニトロフルオルベンゾールのα−アミラーゼ
の変性。
だ液のアミラーゼ20μモル／及びジニトロフ
ルオルベンゾール20mモル／（わずかなエタノ
ールに溶解）を混合し、室温で10分間恒温に保
つ。次いで溶液を、燐酸塩緩衝液（50mモル／
、PH6.8）に対して20時間透析させる（冷室）。
透析液は、差異スペクトルで波長360nmで吸光の
増大値0.070を示す。溶液を、免疫まで冷凍する。
透析液中の蛋白質の濃度は15μモル／である。
このようにして得られた変性α−アミラーゼ
で、はつかねずみを例１のようにして免疫した。
変性アミラーゼで免疫したはつかねずみは、第２
の免疫後にすべて死ぬ。それ故このはつかねずみ
の腱ぞう細胞を第１のブースト（Boost）後に培
養し、ルベン（Luben）の方法〔Molec.
Immunology、17巻（1980年）、635〜639頁〕に
よつて、培地30mlにとかした抗原10μｇの存在で
“試験管内”でなお４日間免疫する。４日間後に、
細胞を、例１によつて得られた脾ぞう細胞のよう
にして融合させ、処理する。
例 ３ 免疫はつかねずみの血清中又は混合細胞の培養
の上澄み中又は腹水中のアミラーゼ結合性抗体の
濃度及び特異性を検出するために、エリサ
（ELISA）を試験原理としてして使用する。この
ためにNo.96のエリサ（ELISA）（NUNC社製）に
羊−抗−はつかねずみ−Fc−抗体を被覆する。非
特異結合を減少するために、牛の血清−アルブミ
ン（生理学的食塩水にとかした２％）を後被覆す
る。次いで抗体を含有する試料とか又はその異な
る希釈液と培養する。
これに続く培養を、だ液のアミラーゼペルオキ
シダーゼ（POD）−結合物又はすいぞうのアミラ
ーゼ−POD−結合物で行なう。結合したPODの
活性を、ABTS（２，2′−アジノジ−／３−エチ
ルベンズチアゾリンスルホネート（６）／）（PH
4.4）で測定し、吸光を、結合したはつかねずみ
の抗体の尺度として直接に採用する。交叉反応を
測定するために、それぞれの試料に対してだ液−
POD及びすいぞうのアミラーゼ−PODの結合と
別々に測定し、だ液のアミラーゼ−PODで得ら
れた吸光を結合100％とする。同時に得られたす
いぞうのアミラーゼ−PODでの吸光によつて、
だ液のアミラーゼ−PODの吸光の％で試料の交
叉反応が判明する。
一般にすいぞうのα−アミラーゼPODの結合
が行なわれなかつたクロン４個及び交叉反応1.5
〜５％を有するクロン５個が判明した。スクリー
ニング後得られたクロンを拡大する。
RPMI−培地は、J.A.M.A.199巻（1957年）519
頁に記載されており、市場で得られる。
例 ４ 羊−抗−はつかねずみ−AKによるモノクロン
抗体（MAK）の固定及び続くだ液のアミラーゼ
の結合。
はつかねずみからの腹水 羊−抗−はつかねずみ−AK（IgGFcp）：19
ｇ／燐酸塩緩衝液、PH7.0；0.05モル／牛
の血清アルブミン２％を有する燐酸塩緩衝液、
PH＝7.0；0.05モル／ 人間のだ液のアミラーゼ：100U／（基質変
換量μモル／ml／分（37℃）、基質としての４
−ニトロフエニルマルトペタオシドを有する） 人間のすいぞうのアミラーゼ：1000U／ 酢酸：0.5モル／ 硫酸水素二カリウム溶液：２モル／ 腹水からのMAKを、羊−抗−はつかねずみの
抗体と１：100の割合で混合する。この混合物を
燐酸塩緩衝液で１：２で希釈し、37℃で15分間振
盪する。得られた沈澱物を緩衝液で２回洗浄し、
次いで酢酸（出発容量の約1/5）に溶解する。５
分間振盪後にK2HPO4溶液を１：２の割合で添加
する。再び沈澱物が生じる。これをRSA（牛の血
清アルブミン）を有する燐酸塩緩衝液で２回、次
いで緩衝液だけで２回洗浄する。続いて沈澱物
を、出発容量の1/5に緩衝液で懸濁させる。沈澱
物50μをだ液又はすいぞうのアミラーゼ50μ
に添加し、室温で15分間恒温に保つ。次いで沈澱
物を遠心分離して除き、上澄みを例７によつて処
理する。対照物としては、沈澱物の代りに緩衝液
50μで処理したアミラーゼ試料が役立つ。
例 ５ だ液のアミラーゼに対するMAKの結合及び続
く羊−抗−はつかねずみの抗体での沈澱。
モノクロン抗体を有する腹水を、緩衝液で１：
50の割合で希釈する。この溶液50μを、だ液又
はすいぞうのアミラーゼ50μと室温で15分間振
盪する。対照物としては、１方では緩衝液での腹
水希釈液からなる混合物（腹水の空試験）、他方
ではアミラーゼと緩衝液とからなる混合物（アミ
ラーゼ活性の対照物）が役立つ。続いて沈澱性抗
−抗体50μを添加する。室温で10分間後に、沈
澱物を遠心分離して除き、上澄みを例７によつて
処理する。
例 ６ 羊−抗−はつかねずみ−抗体によるMAKの固
定及び続くだ液及びすいぞうのアミラーゼの混合
物からの人間のだ液のアミラーゼの結合。
例５に相応して、人間のすいぞう及びだ液のア
ミラーゼ（それぞれ1000U／）からなる混合物
を、予処理した沈澱物と培養する。遠心分離後
に、上澄みを例７に相応して処理する。
例 ７ 残留するすいぞうのアミラーゼの測定。
例４〜６による上澄み50μを市場で得られる
試薬１mlに、α−アミラーゼを、基質としての４
−ニトロフエニルマルトヘプタオシド（ベーリン
ガー社製、No.568589）で測定するために添加す
る。上澄みの活性度を、導入後に37℃で測定す
る。残留活性度が、それぞれ同拌する対照物に対
する活性度（％）として測定される。例４での残
留活性度は、だ液のアミラーゼでは０〜５％であ
り、すいぞうのアミラーゼでは70〜95％である。
例５による試験によつて、だ液のアミラーゼの残
留活性度０〜５％及びすいぞうのアミラーゼでの
残留活性度80〜95％が得られる。両酵素の同時の
存在（例６）によつて、だ液のアミラーゼの選択
的低下が得られ、すいぞうのアミラーゼは活性で
あり、80〜95％測定することができる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ α−アミラーゼの検出系及びだ液α−アミラ
    ーゼの抑制物質を含有する、体液中のだ液α−ア
    ミラーゼの存在下にすいぞうα−アミラーゼを特
    異的に測定する試薬において、抑制物質の代りに
    すいぞうα−アミラーゼに対して５％以下の交叉
    反応度を有するだ液α−アミラーゼに対するモノ
    クロン抗体を含有する試薬。 ２ α−アミラーゼの検出系として、グルコース
    基４〜７個を有するマルトポリオース、マルトー
    スホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、
    グルコース−６−ホスフアトデヒドロゲナーゼ及
    びNADを含有する、特許請求の範囲第１項記載
    の試薬。 ３ α−アミラーゼの検出系として、グルコース
    単位４〜７個を有するニトロフエニルマルトポリ
    オース及びα−グルコシダーゼを含有する、特許
    請求の範囲第１項記載の試薬。 ４ α−アミラーゼの検出系として、一定の基で
    変性されている澱粉を含有する、特許請求の範囲
    第１項記載の試薬。
JP59246409A 1983-11-25 1984-11-22 体液中のだ液α―アミラーゼの存在下にすいぞうα―アミラーゼを特異的に測定するための試薬 Granted JPS60155134A (ja)

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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757001A (en) * 1984-02-16 1988-07-12 Fujirebio Kabushiki Kaisha Method of measuring biological ligand by utilizing amylase
DE3500526A1 (de) * 1985-01-09 1986-07-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Spezifisch hemmender s-amylase-mak
DE3508384A1 (de) * 1985-03-08 1986-11-06 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper
DE3525926A1 (de) 1985-07-19 1987-01-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase
WO1987000526A1 (en) * 1985-07-26 1987-01-29 The University Of Virginia Alumni Patents Foundati Immunochemical assays for human amylase isoenzymes and related monoclonal antibodies, hybridoma cell lines and production thereof
DE3903114A1 (de) * 1989-02-02 1990-08-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung
DE3929355A1 (de) * 1989-09-04 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase
JPH085919B2 (ja) * 1989-11-10 1996-01-24 日本商事株式会社 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法
GB9024970D0 (en) * 1990-11-16 1991-01-02 Genzyme Uk Ltd Assay
KR20030079382A (ko) * 2002-04-04 2003-10-10 최태부 소화 효소-지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및이의 이용

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58183098A (ja) * 1982-04-20 1983-10-26 Wako Pure Chem Ind Ltd アイソザイム分別定量法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2258822A1 (de) * 1972-12-01 1974-06-06 Merck Patent Gmbh Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern
DE3245665A1 (de) * 1982-05-04 1983-11-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung
US4474892A (en) * 1983-02-16 1984-10-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same
DE3508384A1 (de) * 1985-03-08 1986-11-06 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58183098A (ja) * 1982-04-20 1983-10-26 Wako Pure Chem Ind Ltd アイソザイム分別定量法

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