JPS6239996B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6239996B2 JPS6239996B2 JP5097983A JP5097983A JPS6239996B2 JP S6239996 B2 JPS6239996 B2 JP S6239996B2 JP 5097983 A JP5097983 A JP 5097983A JP 5097983 A JP5097983 A JP 5097983A JP S6239996 B2 JPS6239996 B2 JP S6239996B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tgase
- reaction
- antibody
- monoclonal antibody
- immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 10
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 9
- 101710123874 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 102000009366 Alpha-s1 casein Human genes 0.000 description 4
- 108050000244 Alpha-s1 casein Proteins 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- -1 amine compounds Chemical class 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical group CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNLLNTMHVMIMOG-YUMQZZPRSA-N Gamma-glutamyl-Lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O LNLLNTMHVMIMOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 238000006149 azo coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011188 deamidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 1
- CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J dicalcium hydroxide phosphate Chemical compound [OH-].[Ca++].[Ca++].[O-]P([O-])([O-])=O CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000003234 fluorescent labeling method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052622 kaolinite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、モノクローナル抗体を用いて特異的
に固定化されたトランスグルタミナーゼ、及びそ
の利用法に関する。 トランスグルタミナーゼ
（Transglutaminase、Glutaminyl−peptide γ
−glutamyl transferase；EC 2.3.2.13以下
「TGase」と略す）は、Ca2+依存性のアシル転移
酵素である。アシル供与体は特異性が高くペプチ
ド鎖中のグルタミン（Glnと略す）残基のγ−カ
ルボキシルアミド基であり、アシル受容体はペプ
チド鎖中リジン（Lysと略す）残基のε−アミノ
基および種々の一級アミンであり、反応機構は以
下のようである。 この酵素が触媒する反応としては、ペプチド鎖
中Gln残基とペプチド鎖中Lys残基との間でのε
−（γ−グルタミル）リジン架橋結合の形成、ペ
プチド鎖中Gln残基へのアミン化合物の導入、あ
るいはアミン化合物非存在下でのペプチド鎖中
Gln残基の脱アミド反応がある。 TGaseは多くの動物の様々な部位で見つけられ
ているが、この生理機能として知られているもの
はほとんどがタンパク質間架橋形成反応であり、
血液凝固カスケード反応の最終ステツプであるフ
イブリンモノマーの架橋重合による安定化、表皮
組織の角質層における不溶性タンパク質の形成、
毛タンパクの架橋形成、また、げつ歯類の射精後
にみられる腟栓形成などがある。 TGaseを利用すれば、蛋白質の生化学的研究、
新しい酸素反応系の形成や、再利用可能な補酵素
誘導体−カゼイン複合体の形成、さらには必須ア
ミノ酸を導入することによつて食品蛋白質の栄養
価を改善することができ、大量入手する方法の開
発が望まれている。 現在、TGaseを利用するにあたつて良質な酵素
の給源としてモルモツトの肝臓（Guinea Pig
Liver）のTGase（以下GPL−TGaseと略す）が
用いられている。 しかしながら質的には優秀なGPL−TGaseを用
いることについて３つの問題点がある。１つは、
モルモツトが高価であり、したがつてTGaseも高
価なものとなつていること、精製法が複雑で収率
が悪く大量調整には不適当であること、現在は１
回のみ使用するだけであることなどである。 酵素を効率よく利用する方法として酵素を固定
化する方法がある。しかし直接タンパク質固定化
用担体に酸素を固定化すると、酵素活性が著しく
減少する場合がある。 本発明者らはこのような酵素を高収率で簡便に
固定化し、効率よく利用する方法を提供すべく鋭
意検討した結果、タンパク質固定化用担体に、ト
ランスグルタミナーゼの活性部位以外の部位にお
いてトランスグルタミナーゼを捕捉する抗トラン
スグルタミナーゼモノクローナル抗体を結合せし
め、該モノクローナル抗体にトランスグルタミナ
ーゼを捕捉せしめて固定化することによつて、抗
原であるTGaseが特異的に固定化され、酵素反応
を制御できることを発見し、本発明を完成した。 更にモノクローナル抗体に捕捉されたTGaseを
用いて酵素反応を行つた場合、モノクローナル抗
体の種類によつて抗体と酵素との結合部位が異な
ることを利用し、酵素活性中心を認識しないクロ
ーンより産生されるモノクローナル抗体であつて
も、活性部位に対し担体と抗体が立体障害をつく
り基質の接近を妨げる場合と、立体障害をつくら
ない場合とを使い分け、酵素反応をモノクローナ
ル抗体の種類、反応分子の大きさによつてコント
ロールすることもできる。また、アミノ化合物の
導入反応時に副反応としておこる基質タンパク質
のタンパク質間架橋形成を抑制し、導入反応の効
率を向上することができる。 本発明はモノクローナル抗体のこの性質を利用
し、TGaseの酵素活性を有効に発現せしめるもの
である。本発明の固定化法は、TGaseに限らず、
他の高価で微量にしか得られない動植物組織由来
の酵素について適用することができる。 モノクローナル抗体は抗原分子上の１つの抗原
決定基と特異的に結合する抗体であつて、その認
識部位が一定の均一な抗体である。モノクローナ
ル抗体を得るには、抗体産生を行う脾臓のリンパ
球と無限の増殖能を有する悪性の骨髄腫細胞とを
細胞融合することによつて、抗体産生能と増殖能
とを併せ持つハイブリドーマ（融合細胞腫）を
得、これをクローンに分けることによつてモノク
ローナル抗体を産生する細胞を得ることができ
る。 本発明で用いる抗トランスグルタミナーゼモノ
クローナル抗体は次のようにして得られる。まず
TGaseを用いて免疫したマウスの脾細胞とマウス
骨髄腫（ミエローマ）細胞とをポリエチレングリ
コールにより細胞融合させた後、ヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジン培養液（以下
「HAT培地」という）中で細胞を培養すると、互
いの欠損を捕つたハイブリドーマのみが増殖す
る。 このハイブリドーマの抗体産生をテストし陽性
であつたクローンを新しい培地で増殖させてクロ
ーン化を繰り返す。このようにしてクローン化さ
れた細胞について免疫グロブリン変異体の産生が
ないかどうか解析する。クローンが産生する抗体
をスクリーニングする方法は、Solid phase法
（ビオチン−アビジン系蛍光標識法「BASスクリ
ーニング」と略す〔フナコシ薬品(株)総合カタログ
No.４（1983）276頁〜279頁に記載の方法〕）と活
性中和法（二次抗体法）によるスクリーニング法
により、更に抗体産生細胞のクローニングを行う
ことによつて行われる。 活性中和法には間接法と直接法があり、間接法
とはモノクローナル抗体では抗原−抗体複合体は
沈降しないため、ウサギの抗マウスlgG抗体とS.
aureus菌体を結合させることにより抗原−抗体
複合体を沈降させ、上清液中の残存TGaseを測定
することにより抗体量を知るものである。 直接法とは、TGase溶液をモノクローナル抗体
の濃縮培養上清に加えて反応させた後、残存
TGaseを測定することにより抗体量を知るもので
ある。 得られた抗TGase抗体（lgG）産生ハイブリド
ーマを、限界希釈法により0.5cell／wellとなるよ
うに希釈してプレートにまき生育させクローニン
グする。 このようなスクリーニング法により抗TGase抗
体産生ハイブリドーマとして、TGaseの活性部位
を捕捉するモノクローナル抗体を産生するクロー
ンと、TGaseの活性部位以外の部分を捕捉し
TGaseの活性に影響を及ぼさないモノクローナル
抗体を産生するクローンと、TGaseの活性部位以
外の部分を捕捉しTGaseの活性を抑えるモノクロ
ーナル抗体を産生するクローンの３種類の抗
TGase抗体産生ハイブリドーマが得られる。 このようにしてクローン化したハイブリドーマ
を、生体外又は生体内で培養して培養上清から抗
体を集めることにより大量に抗体を調製すること
ができる。特に組織的に許容される動物（マウス
など）に注射して生体内で培養する方法が大量調
製に適している。例えば、ハイブリドーマを注入
された動物の腹水を遠心分離し、得られた上清液
に硫酸アンモニウム飽和溶液を加えて沈殿させ、
沈殿した画分を緩衝液に混合して溶解した後、よ
く透析した溶液をモノクローナル抗体含有液とし
て用いることができる。クローン化したハイブリ
ドーマとして特にTGase活性部位以外の部分を捕
捉するモノクローナル抗体を用いた場合に、酵素
活性が高い、固定化されたTGaseが得られ、更に
担体と抗体が立体障害をつくり、基質の接触を妨
げるような抗体を用いた場合には、特異的な反応
をする固定化されたTGaseが得られる。 このようなモノクローナル抗体中のタンパク質
のNH基に、タンパク質固定化用担体を結合せし
め、結合したモノクローナル抗体にTGase捕捉し
固定化したTGaseが得られる。タンパク質固定化
用担体としては多糖類（セルロース、デキストラ
ン、アガロースなど）、イオン交換樹脂、多孔性
ガラスなどの水不溶性担体があり、これにタンパ
ク質を物理的吸着、イオン結合、あるいは共有結
合させることによつて固定化する。固定化酵素の
多くは粒状であるが、利用目的によつて膜状、板
状、管状あるいは繊維状にすることもできる。物
理的吸着法は活性炭、カオリナイト、ハイドロキ
シルアパタイトなどを担体として用いる方法であ
る。イオン結合法は、DEAE−セルロース、
TEAE−セルロース、DEAE−セフアデツクス、
CM−セルロースあるいはイオン交換樹脂などを
用いる方法である。共有結合法は結合様式によつ
て、ジアゾ法（アミノ基を有する水不溶性の担体
（Ｒ−NH2）をジアゾニウム化合物とし、これを酵
素とジアゾカツプリングさせる）、ペプチド法
（カルボキシル基を含む担体をアジド化するか、
多糖類をBrCNで活性化したものと酵素蛋白質中
の遊離のアミノ基とでペプチド結合させる）、お
よびアルキル化法（ハロゲンのような官能基を有
する不溶性担体を用いる）に分離され、これらの
方法より本発明のモノクローナル抗体を結合する
のに適したものを選ぶことができる。 タンパク質固定化用担体としてアフイニテイー
クロマトグラフイー用担体が好ましく、「Affi−
Gel 10」「Affi−Gel 15」（BiO−Rad
Laboratrois製）などを用いることができる。
「Affi−Gel 10」については下記のような反応で
結合する。 モノクローナル抗体と「Affi−Gel 10」との反
応は下記の条件が好ましい。 PH 6.5〜8.5 温 度 １℃〜10℃ 時 間 ３時間〜５時間 モノクローナル抗体と「Affi−Gel 10」との量
比は、ゲル１mlに対してモノクローナル抗体10〜
20mgを含む溶液に換算して１ml程度加えれば充分
である。 次の工程として担体に結合したモノクローナル
抗体とTGaseとの固定化反応は両者をよく撹拌し
た後１℃ないし４℃にて２時間ないし５時間放置
することによつて行われる。これを1000回転程度
での遠心分離し沈殿物をTGase緩衝液〔例えば、
２ｍＭのEDTAを含有する20ｍＭトリス塩酸塩緩
衝液（PH7.5）〕で洗浄する。この遠心分離と洗浄
を２ないし４回繰り返した後、同体積の緩衝液に
分散して、固定化されたTGase分散液を得る。 8Dクローン抗体（後述）を介してTGaseを固
定化する方法は、モノクローナル抗体でのTGase
の特異的吸着により酵素の精製をおこない、同時
に固定化TGaseを得ることを可能にする。モノク
ローナル抗体は比較的容易に大量調製が可能であ
りTGaseも固定化により再利用可能であるため、
精製の簡易化と酵素の固定化しての反復使用とい
つた２つの利点を一挙に獲得することになり、
TGaseをモノクローナル抗体により固定化するこ
とはモルモツト肝臓から得られたTGaseの有効利
用方法である。 実施例 −材料および方法− トランスグルタミナーゼの調製 トランスグルタミナーゼは、J.Connellanらの
方法〔J.Biol.Chem.、246、1093（1971）〕により
新鮮なモルモツトの肝臓より調製されたものを用
いた。モルモツトの肝臓800ｇに冷0.25Mシヨ糖
溶液21を加えてホモゲナイズし、遠心分離を行な
い上清液を得た。これをTGase緩衝液〔２ｍＭ
EDTA含有５ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（PH7.5）〕
で平衡化してあるDEAEセルロースカラムに添加
吸着させ、酵素活性の高い画分を得た。 これを撹拌しながら１％硫酸プロミタンを添加
し、遠心分離して沈殿を集めた。この沈殿より
0.05M硫安を含む緩衝液を添加し、ホモゲナイズ
することによつてTGaseを抽出した。この抽出液
よりカルボキシメチル・セルロースカラムにてプ
ロタミンを除去し、更に難溶物を除いた。これを
10％アガロース（Bio Gel Ａ−0.5M）でゲル濾
過を行ない、活性の高い画分を集め、更に限外濾
過して濃縮しTGase溶液とした。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は
Laemmliの不連続緩衝液系を用いる方法
〔Nature、227、680（1970）〕により、TGase純
度は80％であつた。 免 疫 TGaseを含むPBS（0.15M塩化ナトリウムを含
む10ｍＭリン酸緩衝液PH7.4）と、等量のFreund
’ｓ complete adjuvantを混合し乳化処理し、
0.1ml中に32μｇのTGaseを含有する乳化液を得
た。この乳化液0.3〜0.4mlを８週令のBALB／ｃ
マウスの腹腔内に注射した（１匹あたり
TGase100〜120μｇ）。２週間後、PBSに溶けた
58μｇのTGaseを注射し追加免疫した。追加免疫
を２回繰り返して、完全に免疫した。 ハイブリドーマの作製 ハイブリドーマの作製にはまず免疫したマウス
の脾臓を摘出しこれより脾細胞をときほぐし、別
に培養した８−アザグアニン耐性マウスミエロー
マ細胞（NS−１）とを約２：１の割合で混合
し、遠心後ペレツトに50％ポリエチレングリコー
ル（PEG）を加えて細胞融合し、これらを96穴
マイクロプレート（MCP）に106cell／well程度
に分注した。これらをHAT培地（RPMI1640（日
水製薬(株)）100ml溶液に50倍のHAT2mlを溶解さ
せたもの）で生育させハイブリドーマ生育wellを
選択した。 lgG産生ハイブリドーマのクローン化 91のハイブリドーマ生育wellについてBAS−ス
クリーニングをおこなつたところ、16wellが陽性
と出、lgG産生ハイブリドーマが検索された。 16のlgG産生ハイブリドーマから間接法による
活性中和スクリーニングで、３つの抗TGase抗体
産性ハイブリドーマが得られた。これらについて
クローニングとBASスクリーニングおよび活性
中和法によるスクリーニングをおこなつて最終的
に８つの抗GPL TGase抗体産生ハイブリドーマ
クローンを得た。 サブクラスの決定 マイクロオクタローニ法で試料lgG溶液とウサ
ギの抗マウスlgG1、lgG2a、IgG2bおよびIgG3抗体
溶液との沈降線によりサブクラスを決定した。モノクローナル抗体lgGのサブクラス サブクラス クローン lgG1 2F、4B、7C、8B、8D、8E、11C lgG2a 9F 8D、および9Fクローン培養上清のTGase活性に
与える影響 間接法による活性中和で特に高い値を示した
8Dクローンおよび9Fクローンの産生する抗体が
直接法でTGaseに影響を与えるかどうかを検討し
たところ、8Dクローンは影響を与えず活性中心
を認識していない抗体を産生し、9Fクローンは
活性を抑制し活性中心を認識している抗体を産生
するものであつた。 大量培養および培養上清の濃縮 最終的に得られたクローンについては、Ｔフラ
スコで培養し大量の培養上清を得た。 この培養上清に当容の飽和硫安溶液を加えて、
50％飽和和状態にした後、遠心分離して沈澱を緩
衝液にとかして透析し、最終的に11〜13倍濃縮
（体積換算）されたものが得られた。 腹水からのモノクローナル抗体の調製 マウスBALB／Ｃの腹腔内に１匹当り0.5mlの
プリスタン（Aldrich Chemical社製）を注射
し、更に１週間後同様に再投与した。３日後に、
前記のTGaseに対する抗体産生ハイブリドーマを
クローン化した懸濁液をマウスの腹腔内に５×
106〜107cell／mouse程度になるように注射し抗
体を産生させた後、その腹水２〜３ml／mouseを
採取した。これを遠心分離し沈殿物を除去した
後、抗体を含む上清液に硫酸アンモニウム飽和溶
液を等量加えて抗体を沈殿として得た。これを遠
心分離して得られる沈殿画分を緩衝液〔0.15M塩
化ナトリウムを含有する0.1M炭酸水素ナトリウ
ム溶液（PH８）〕に溶解し、これをよく透析して
用いた。腹水より得たモノクローナル抗体（生体
内培養したもの）は、フラスコで培養して得たモ
ノクローナル抗体（生体外培養したもの）の約
100倍の濃度であつた。 アフイニテイクロマトグラフイー用担体と抗体の
結合反応 アフイニテイクロマトグラフイー用担体
〔（Affi−Gel 10」（Bio−Rad Laboratories製）〕
１mlをガラスフイルター上で氷冷したイソプロパ
ノールで３回洗浄した後、更に氷水で３回洗浄し
た。これを1000rpmで遠心分離して得られた沈殿
１mlにモノクローナル抗体15mgを含むタンパク溶
液１mlを加え、４℃にて５時間撹拌してモノクロ
ーナル抗体を担体に結合させた。 反応後これを1000rpmで遠心分離して得られた
沈殿を、0.1M炭酸水素ナトリウムと0.15M塩化ナ
トリウム混合液で２回洗浄した後、等量の0.1M
エタノールアミン塩酸塩（PH8.0）を混合し、室
温で１時間撹拌した。これを遠心分離して得られ
た沈殿を、TGase緩衝液〔２ｍＭ EDTAを含有
する20ｍＭトリス塩酸（PH7.5）〕で洗浄した後、
等量の緩衝液に懸濁させ、10mgタンパク／mlgel
を含有するゲル懸濁液を得た。 抗体を介して結合した固定化TGaseの作製 8Dモノクローナル抗体あるいは6Fモノクロナ
ール抗体を結合させた「Affi−Gel 10」200μ
にTGase（精製品の場合100μｇ、粗製品の場合
（700μｇ）を含む溶液100〜300μを加えて４℃
で３時間撹拌し、遠心分離して沈殿物を得た。こ
の沈殿物をTGase緩衝液で６回洗浄した。 次に洗浄した沈殿物を等量のTGase緩衝液に懸
濁して固定化したTGase懸濁液を得た。 8D−TGaseおよび9F−TGaseの作製 8Dモノクロナール抗体および9Fモノクロナー
ル抗体を結合させた「Affi−Gel 10」200μ
に、TGase100μ（107μｇ）を加え４℃で３時
間放置して8D−TGaseと9F−TGaseを作製し
た。Bio−Rad Laboratoriesの「PROTEIN
ASSAY KIT」を用いてマイクロアツセイ法によ
りタンパク定量をおこない、 3H−プトレシンの
アセチル化カゼインへのとりこみによりTGaseア
ツセイ〔Anal.Biochem.、44．207（1971）及び
50、623（1972）の方法〕をおこなつて結合の収
支について計算した。結果を表１に示す。
に固定化されたトランスグルタミナーゼ、及びそ
の利用法に関する。 トランスグルタミナーゼ
（Transglutaminase、Glutaminyl−peptide γ
−glutamyl transferase；EC 2.3.2.13以下
「TGase」と略す）は、Ca2+依存性のアシル転移
酵素である。アシル供与体は特異性が高くペプチ
ド鎖中のグルタミン（Glnと略す）残基のγ−カ
ルボキシルアミド基であり、アシル受容体はペプ
チド鎖中リジン（Lysと略す）残基のε−アミノ
基および種々の一級アミンであり、反応機構は以
下のようである。 この酵素が触媒する反応としては、ペプチド鎖
中Gln残基とペプチド鎖中Lys残基との間でのε
−（γ−グルタミル）リジン架橋結合の形成、ペ
プチド鎖中Gln残基へのアミン化合物の導入、あ
るいはアミン化合物非存在下でのペプチド鎖中
Gln残基の脱アミド反応がある。 TGaseは多くの動物の様々な部位で見つけられ
ているが、この生理機能として知られているもの
はほとんどがタンパク質間架橋形成反応であり、
血液凝固カスケード反応の最終ステツプであるフ
イブリンモノマーの架橋重合による安定化、表皮
組織の角質層における不溶性タンパク質の形成、
毛タンパクの架橋形成、また、げつ歯類の射精後
にみられる腟栓形成などがある。 TGaseを利用すれば、蛋白質の生化学的研究、
新しい酸素反応系の形成や、再利用可能な補酵素
誘導体−カゼイン複合体の形成、さらには必須ア
ミノ酸を導入することによつて食品蛋白質の栄養
価を改善することができ、大量入手する方法の開
発が望まれている。 現在、TGaseを利用するにあたつて良質な酵素
の給源としてモルモツトの肝臓（Guinea Pig
Liver）のTGase（以下GPL−TGaseと略す）が
用いられている。 しかしながら質的には優秀なGPL−TGaseを用
いることについて３つの問題点がある。１つは、
モルモツトが高価であり、したがつてTGaseも高
価なものとなつていること、精製法が複雑で収率
が悪く大量調整には不適当であること、現在は１
回のみ使用するだけであることなどである。 酵素を効率よく利用する方法として酵素を固定
化する方法がある。しかし直接タンパク質固定化
用担体に酸素を固定化すると、酵素活性が著しく
減少する場合がある。 本発明者らはこのような酵素を高収率で簡便に
固定化し、効率よく利用する方法を提供すべく鋭
意検討した結果、タンパク質固定化用担体に、ト
ランスグルタミナーゼの活性部位以外の部位にお
いてトランスグルタミナーゼを捕捉する抗トラン
スグルタミナーゼモノクローナル抗体を結合せし
め、該モノクローナル抗体にトランスグルタミナ
ーゼを捕捉せしめて固定化することによつて、抗
原であるTGaseが特異的に固定化され、酵素反応
を制御できることを発見し、本発明を完成した。 更にモノクローナル抗体に捕捉されたTGaseを
用いて酵素反応を行つた場合、モノクローナル抗
体の種類によつて抗体と酵素との結合部位が異な
ることを利用し、酵素活性中心を認識しないクロ
ーンより産生されるモノクローナル抗体であつて
も、活性部位に対し担体と抗体が立体障害をつく
り基質の接近を妨げる場合と、立体障害をつくら
ない場合とを使い分け、酵素反応をモノクローナ
ル抗体の種類、反応分子の大きさによつてコント
ロールすることもできる。また、アミノ化合物の
導入反応時に副反応としておこる基質タンパク質
のタンパク質間架橋形成を抑制し、導入反応の効
率を向上することができる。 本発明はモノクローナル抗体のこの性質を利用
し、TGaseの酵素活性を有効に発現せしめるもの
である。本発明の固定化法は、TGaseに限らず、
他の高価で微量にしか得られない動植物組織由来
の酵素について適用することができる。 モノクローナル抗体は抗原分子上の１つの抗原
決定基と特異的に結合する抗体であつて、その認
識部位が一定の均一な抗体である。モノクローナ
ル抗体を得るには、抗体産生を行う脾臓のリンパ
球と無限の増殖能を有する悪性の骨髄腫細胞とを
細胞融合することによつて、抗体産生能と増殖能
とを併せ持つハイブリドーマ（融合細胞腫）を
得、これをクローンに分けることによつてモノク
ローナル抗体を産生する細胞を得ることができ
る。 本発明で用いる抗トランスグルタミナーゼモノ
クローナル抗体は次のようにして得られる。まず
TGaseを用いて免疫したマウスの脾細胞とマウス
骨髄腫（ミエローマ）細胞とをポリエチレングリ
コールにより細胞融合させた後、ヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジン培養液（以下
「HAT培地」という）中で細胞を培養すると、互
いの欠損を捕つたハイブリドーマのみが増殖す
る。 このハイブリドーマの抗体産生をテストし陽性
であつたクローンを新しい培地で増殖させてクロ
ーン化を繰り返す。このようにしてクローン化さ
れた細胞について免疫グロブリン変異体の産生が
ないかどうか解析する。クローンが産生する抗体
をスクリーニングする方法は、Solid phase法
（ビオチン−アビジン系蛍光標識法「BASスクリ
ーニング」と略す〔フナコシ薬品(株)総合カタログ
No.４（1983）276頁〜279頁に記載の方法〕）と活
性中和法（二次抗体法）によるスクリーニング法
により、更に抗体産生細胞のクローニングを行う
ことによつて行われる。 活性中和法には間接法と直接法があり、間接法
とはモノクローナル抗体では抗原−抗体複合体は
沈降しないため、ウサギの抗マウスlgG抗体とS.
aureus菌体を結合させることにより抗原−抗体
複合体を沈降させ、上清液中の残存TGaseを測定
することにより抗体量を知るものである。 直接法とは、TGase溶液をモノクローナル抗体
の濃縮培養上清に加えて反応させた後、残存
TGaseを測定することにより抗体量を知るもので
ある。 得られた抗TGase抗体（lgG）産生ハイブリド
ーマを、限界希釈法により0.5cell／wellとなるよ
うに希釈してプレートにまき生育させクローニン
グする。 このようなスクリーニング法により抗TGase抗
体産生ハイブリドーマとして、TGaseの活性部位
を捕捉するモノクローナル抗体を産生するクロー
ンと、TGaseの活性部位以外の部分を捕捉し
TGaseの活性に影響を及ぼさないモノクローナル
抗体を産生するクローンと、TGaseの活性部位以
外の部分を捕捉しTGaseの活性を抑えるモノクロ
ーナル抗体を産生するクローンの３種類の抗
TGase抗体産生ハイブリドーマが得られる。 このようにしてクローン化したハイブリドーマ
を、生体外又は生体内で培養して培養上清から抗
体を集めることにより大量に抗体を調製すること
ができる。特に組織的に許容される動物（マウス
など）に注射して生体内で培養する方法が大量調
製に適している。例えば、ハイブリドーマを注入
された動物の腹水を遠心分離し、得られた上清液
に硫酸アンモニウム飽和溶液を加えて沈殿させ、
沈殿した画分を緩衝液に混合して溶解した後、よ
く透析した溶液をモノクローナル抗体含有液とし
て用いることができる。クローン化したハイブリ
ドーマとして特にTGase活性部位以外の部分を捕
捉するモノクローナル抗体を用いた場合に、酵素
活性が高い、固定化されたTGaseが得られ、更に
担体と抗体が立体障害をつくり、基質の接触を妨
げるような抗体を用いた場合には、特異的な反応
をする固定化されたTGaseが得られる。 このようなモノクローナル抗体中のタンパク質
のNH基に、タンパク質固定化用担体を結合せし
め、結合したモノクローナル抗体にTGase捕捉し
固定化したTGaseが得られる。タンパク質固定化
用担体としては多糖類（セルロース、デキストラ
ン、アガロースなど）、イオン交換樹脂、多孔性
ガラスなどの水不溶性担体があり、これにタンパ
ク質を物理的吸着、イオン結合、あるいは共有結
合させることによつて固定化する。固定化酵素の
多くは粒状であるが、利用目的によつて膜状、板
状、管状あるいは繊維状にすることもできる。物
理的吸着法は活性炭、カオリナイト、ハイドロキ
シルアパタイトなどを担体として用いる方法であ
る。イオン結合法は、DEAE−セルロース、
TEAE−セルロース、DEAE−セフアデツクス、
CM−セルロースあるいはイオン交換樹脂などを
用いる方法である。共有結合法は結合様式によつ
て、ジアゾ法（アミノ基を有する水不溶性の担体
（Ｒ−NH2）をジアゾニウム化合物とし、これを酵
素とジアゾカツプリングさせる）、ペプチド法
（カルボキシル基を含む担体をアジド化するか、
多糖類をBrCNで活性化したものと酵素蛋白質中
の遊離のアミノ基とでペプチド結合させる）、お
よびアルキル化法（ハロゲンのような官能基を有
する不溶性担体を用いる）に分離され、これらの
方法より本発明のモノクローナル抗体を結合する
のに適したものを選ぶことができる。 タンパク質固定化用担体としてアフイニテイー
クロマトグラフイー用担体が好ましく、「Affi−
Gel 10」「Affi−Gel 15」（BiO−Rad
Laboratrois製）などを用いることができる。
「Affi−Gel 10」については下記のような反応で
結合する。 モノクローナル抗体と「Affi−Gel 10」との反
応は下記の条件が好ましい。 PH 6.5〜8.5 温 度 １℃〜10℃ 時 間 ３時間〜５時間 モノクローナル抗体と「Affi−Gel 10」との量
比は、ゲル１mlに対してモノクローナル抗体10〜
20mgを含む溶液に換算して１ml程度加えれば充分
である。 次の工程として担体に結合したモノクローナル
抗体とTGaseとの固定化反応は両者をよく撹拌し
た後１℃ないし４℃にて２時間ないし５時間放置
することによつて行われる。これを1000回転程度
での遠心分離し沈殿物をTGase緩衝液〔例えば、
２ｍＭのEDTAを含有する20ｍＭトリス塩酸塩緩
衝液（PH7.5）〕で洗浄する。この遠心分離と洗浄
を２ないし４回繰り返した後、同体積の緩衝液に
分散して、固定化されたTGase分散液を得る。 8Dクローン抗体（後述）を介してTGaseを固
定化する方法は、モノクローナル抗体でのTGase
の特異的吸着により酵素の精製をおこない、同時
に固定化TGaseを得ることを可能にする。モノク
ローナル抗体は比較的容易に大量調製が可能であ
りTGaseも固定化により再利用可能であるため、
精製の簡易化と酵素の固定化しての反復使用とい
つた２つの利点を一挙に獲得することになり、
TGaseをモノクローナル抗体により固定化するこ
とはモルモツト肝臓から得られたTGaseの有効利
用方法である。 実施例 −材料および方法− トランスグルタミナーゼの調製 トランスグルタミナーゼは、J.Connellanらの
方法〔J.Biol.Chem.、246、1093（1971）〕により
新鮮なモルモツトの肝臓より調製されたものを用
いた。モルモツトの肝臓800ｇに冷0.25Mシヨ糖
溶液21を加えてホモゲナイズし、遠心分離を行な
い上清液を得た。これをTGase緩衝液〔２ｍＭ
EDTA含有５ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（PH7.5）〕
で平衡化してあるDEAEセルロースカラムに添加
吸着させ、酵素活性の高い画分を得た。 これを撹拌しながら１％硫酸プロミタンを添加
し、遠心分離して沈殿を集めた。この沈殿より
0.05M硫安を含む緩衝液を添加し、ホモゲナイズ
することによつてTGaseを抽出した。この抽出液
よりカルボキシメチル・セルロースカラムにてプ
ロタミンを除去し、更に難溶物を除いた。これを
10％アガロース（Bio Gel Ａ−0.5M）でゲル濾
過を行ない、活性の高い画分を集め、更に限外濾
過して濃縮しTGase溶液とした。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は
Laemmliの不連続緩衝液系を用いる方法
〔Nature、227、680（1970）〕により、TGase純
度は80％であつた。 免 疫 TGaseを含むPBS（0.15M塩化ナトリウムを含
む10ｍＭリン酸緩衝液PH7.4）と、等量のFreund
’ｓ complete adjuvantを混合し乳化処理し、
0.1ml中に32μｇのTGaseを含有する乳化液を得
た。この乳化液0.3〜0.4mlを８週令のBALB／ｃ
マウスの腹腔内に注射した（１匹あたり
TGase100〜120μｇ）。２週間後、PBSに溶けた
58μｇのTGaseを注射し追加免疫した。追加免疫
を２回繰り返して、完全に免疫した。 ハイブリドーマの作製 ハイブリドーマの作製にはまず免疫したマウス
の脾臓を摘出しこれより脾細胞をときほぐし、別
に培養した８−アザグアニン耐性マウスミエロー
マ細胞（NS−１）とを約２：１の割合で混合
し、遠心後ペレツトに50％ポリエチレングリコー
ル（PEG）を加えて細胞融合し、これらを96穴
マイクロプレート（MCP）に106cell／well程度
に分注した。これらをHAT培地（RPMI1640（日
水製薬(株)）100ml溶液に50倍のHAT2mlを溶解さ
せたもの）で生育させハイブリドーマ生育wellを
選択した。 lgG産生ハイブリドーマのクローン化 91のハイブリドーマ生育wellについてBAS−ス
クリーニングをおこなつたところ、16wellが陽性
と出、lgG産生ハイブリドーマが検索された。 16のlgG産生ハイブリドーマから間接法による
活性中和スクリーニングで、３つの抗TGase抗体
産性ハイブリドーマが得られた。これらについて
クローニングとBASスクリーニングおよび活性
中和法によるスクリーニングをおこなつて最終的
に８つの抗GPL TGase抗体産生ハイブリドーマ
クローンを得た。 サブクラスの決定 マイクロオクタローニ法で試料lgG溶液とウサ
ギの抗マウスlgG1、lgG2a、IgG2bおよびIgG3抗体
溶液との沈降線によりサブクラスを決定した。モノクローナル抗体lgGのサブクラス サブクラス クローン lgG1 2F、4B、7C、8B、8D、8E、11C lgG2a 9F 8D、および9Fクローン培養上清のTGase活性に
与える影響 間接法による活性中和で特に高い値を示した
8Dクローンおよび9Fクローンの産生する抗体が
直接法でTGaseに影響を与えるかどうかを検討し
たところ、8Dクローンは影響を与えず活性中心
を認識していない抗体を産生し、9Fクローンは
活性を抑制し活性中心を認識している抗体を産生
するものであつた。 大量培養および培養上清の濃縮 最終的に得られたクローンについては、Ｔフラ
スコで培養し大量の培養上清を得た。 この培養上清に当容の飽和硫安溶液を加えて、
50％飽和和状態にした後、遠心分離して沈澱を緩
衝液にとかして透析し、最終的に11〜13倍濃縮
（体積換算）されたものが得られた。 腹水からのモノクローナル抗体の調製 マウスBALB／Ｃの腹腔内に１匹当り0.5mlの
プリスタン（Aldrich Chemical社製）を注射
し、更に１週間後同様に再投与した。３日後に、
前記のTGaseに対する抗体産生ハイブリドーマを
クローン化した懸濁液をマウスの腹腔内に５×
106〜107cell／mouse程度になるように注射し抗
体を産生させた後、その腹水２〜３ml／mouseを
採取した。これを遠心分離し沈殿物を除去した
後、抗体を含む上清液に硫酸アンモニウム飽和溶
液を等量加えて抗体を沈殿として得た。これを遠
心分離して得られる沈殿画分を緩衝液〔0.15M塩
化ナトリウムを含有する0.1M炭酸水素ナトリウ
ム溶液（PH８）〕に溶解し、これをよく透析して
用いた。腹水より得たモノクローナル抗体（生体
内培養したもの）は、フラスコで培養して得たモ
ノクローナル抗体（生体外培養したもの）の約
100倍の濃度であつた。 アフイニテイクロマトグラフイー用担体と抗体の
結合反応 アフイニテイクロマトグラフイー用担体
〔（Affi−Gel 10」（Bio−Rad Laboratories製）〕
１mlをガラスフイルター上で氷冷したイソプロパ
ノールで３回洗浄した後、更に氷水で３回洗浄し
た。これを1000rpmで遠心分離して得られた沈殿
１mlにモノクローナル抗体15mgを含むタンパク溶
液１mlを加え、４℃にて５時間撹拌してモノクロ
ーナル抗体を担体に結合させた。 反応後これを1000rpmで遠心分離して得られた
沈殿を、0.1M炭酸水素ナトリウムと0.15M塩化ナ
トリウム混合液で２回洗浄した後、等量の0.1M
エタノールアミン塩酸塩（PH8.0）を混合し、室
温で１時間撹拌した。これを遠心分離して得られ
た沈殿を、TGase緩衝液〔２ｍＭ EDTAを含有
する20ｍＭトリス塩酸（PH7.5）〕で洗浄した後、
等量の緩衝液に懸濁させ、10mgタンパク／mlgel
を含有するゲル懸濁液を得た。 抗体を介して結合した固定化TGaseの作製 8Dモノクローナル抗体あるいは6Fモノクロナ
ール抗体を結合させた「Affi−Gel 10」200μ
にTGase（精製品の場合100μｇ、粗製品の場合
（700μｇ）を含む溶液100〜300μを加えて４℃
で３時間撹拌し、遠心分離して沈殿物を得た。こ
の沈殿物をTGase緩衝液で６回洗浄した。 次に洗浄した沈殿物を等量のTGase緩衝液に懸
濁して固定化したTGase懸濁液を得た。 8D−TGaseおよび9F−TGaseの作製 8Dモノクロナール抗体および9Fモノクロナー
ル抗体を結合させた「Affi−Gel 10」200μ
に、TGase100μ（107μｇ）を加え４℃で３時
間放置して8D−TGaseと9F−TGaseを作製し
た。Bio−Rad Laboratoriesの「PROTEIN
ASSAY KIT」を用いてマイクロアツセイ法によ
りタンパク定量をおこない、 3H−プトレシンの
アセチル化カゼインへのとりこみによりTGaseア
ツセイ〔Anal.Biochem.、44．207（1971）及び
50、623（1972）の方法〕をおこなつて結合の収
支について計算した。結果を表１に示す。
【表】
8D−TGaseおよび9F−TGase作製の収支か
ら、8D−TGaseは、計算上結合しているTGase
量の約1/3の活性を発現しているのに比べて9F−
TGaseの場合はほとんど活性を示さなかつた。こ
れは、9F−クローンの産生するモノクローナル
抗体が活性中心を認識しているため、活性中心で
結合するTGaseが使用不能となり活性を発現しえ
ないためと考えられる。 8D−TGaseおよび9F−TGaseの作製において
ともに用いたタンパクの約60％が結合し、活性の
ほとんどが結合したことになつており、用いた
TGaseが純度60％であることから考えるとこのモ
ノクローナル抗体が結合した「Affi−Gel10」と
の結合の際にモノクローナル抗体の特異的結合に
よりTGase選択的に結合されたことを示す。 固定化TGaseの37℃長時間反応における安定性 固定化TGaseと固定化していないTGaseの安定
性の差をみるため、8D−TGase（8D−モノクロ
ナール抗体を介して固定化したもの）と固定化し
ていないTGaseを用いて 3H−プトレシンのアセ
チル化カゼインへのとりこみを37℃で反応させて
測定した。反応系の組成を下記に、そして結果を
第１図に示す。
ら、8D−TGaseは、計算上結合しているTGase
量の約1/3の活性を発現しているのに比べて9F−
TGaseの場合はほとんど活性を示さなかつた。こ
れは、9F−クローンの産生するモノクローナル
抗体が活性中心を認識しているため、活性中心で
結合するTGaseが使用不能となり活性を発現しえ
ないためと考えられる。 8D−TGaseおよび9F−TGaseの作製において
ともに用いたタンパクの約60％が結合し、活性の
ほとんどが結合したことになつており、用いた
TGaseが純度60％であることから考えるとこのモ
ノクローナル抗体が結合した「Affi−Gel10」と
の結合の際にモノクローナル抗体の特異的結合に
よりTGase選択的に結合されたことを示す。 固定化TGaseの37℃長時間反応における安定性 固定化TGaseと固定化していないTGaseの安定
性の差をみるため、8D−TGase（8D−モノクロ
ナール抗体を介して固定化したもの）と固定化し
ていないTGaseを用いて 3H−プトレシンのアセ
チル化カゼインへのとりこみを37℃で反応させて
測定した。反応系の組成を下記に、そして結果を
第１図に示す。
【表】
【表】
未洗浄試料のスポツトを０分と180分にとり長
時間反応における蒸発分を換算した。 固定化TGaseの熱安定性 25、30および37℃で放置した固定化していない
TGaseおよび8D−TGaseの37℃反応での初速度
をもとめることにより、各温度での安定性のちが
いについて検討した。なお放置時のタンク濃度に
よる失活の差を補正するため最終的に10mg／mlと
なるように水35μ、TGase20μに対し牛血清
アルブミン20μを加えた。結果を第２図ないし
第４図に示す。 第２図の結果から8D−TGaseは25℃では4hrs
たつても活性の低下がなかつた。この点から考え
ると8D−TGaseは25℃で使用すれば再利用可能
と考えられる。 固定化TGase（8D−TGase）と固定化していな
いTGaseによるαs1−カゼインの架橋重合反応 3H−プレトシンのアセチル化カゼインへの導
入反応では、ほぼ同じ活性を示す酸素量を用いて
αS1−カゼインを架橋重合させ、8D−TGaseと
固定化していないTGaseとの間の反応性のちがい
をみた。 反応系の組成を下記に示す。
時間反応における蒸発分を換算した。 固定化TGaseの熱安定性 25、30および37℃で放置した固定化していない
TGaseおよび8D−TGaseの37℃反応での初速度
をもとめることにより、各温度での安定性のちが
いについて検討した。なお放置時のタンク濃度に
よる失活の差を補正するため最終的に10mg／mlと
なるように水35μ、TGase20μに対し牛血清
アルブミン20μを加えた。結果を第２図ないし
第４図に示す。 第２図の結果から8D−TGaseは25℃では4hrs
たつても活性の低下がなかつた。この点から考え
ると8D−TGaseは25℃で使用すれば再利用可能
と考えられる。 固定化TGase（8D−TGase）と固定化していな
いTGaseによるαs1−カゼインの架橋重合反応 3H−プレトシンのアセチル化カゼインへの導
入反応では、ほぼ同じ活性を示す酸素量を用いて
αS1−カゼインを架橋重合させ、8D−TGaseと
固定化していないTGaseとの間の反応性のちがい
をみた。 反応系の組成を下記に示す。
【表】
【表】
37℃にて反応させ、０分、15分、30分、60分、
120分後に反応系から60μとり、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）用試
料処理液60μに加えることにより反応を終了さ
せた。この液を95℃にて３分間熱処理した後、
Lammliの不連続緩衝液系を用いる方法に従つ
て、試料20μ（タンパク20μｇ）を各レーンに
用いた。 8D−TGaseおよび固定化していないTGaseを
用いてαs1−セゼインの架橋重合をおこなわせる
と固定化していないTGaseでは15分ですでに高重
合度のものを形成し、60分でもうほとんどもとの
αｓのバンドが消失した。一方8D−TGaseによ
る反応の場合は、120分たつてもとのαs1のバン
ドがはつきりとのこつていた。この結果から考え
られることは、TGaseはグルタミン反応部位と２
つの基質反応部位があるが、特にアミン反応部位
での立体障害がひどく低分子基質であるプトレシ
ンは容易に反応部位に近づくことができるが、よ
り大きなαs1−カゼインは近づくことがより困難
になるのではないかと考えられる。 この性質を利用すれば、アミン化合物導入反応
時に副反応としておこる基質タンパク質の架橋重
合が抑制され、導入反応の効率を向上させうる。 モノクローナル抗体を介して結合させたTGaseと
直接結合させたTGaseの反応性 TGaseの粗製品〔DEAEセルロースカラムに添
加吸着させた後の酵素活性の高い画分〕を、8D
モノクローナル抗体が結合されている「Affi−
Gel 10」または「Affi−Gel 10」にそれぞれ４℃
にて３時間かけて固定化しTGaseの収支を測定し
た。 結果を表２に示す。
120分後に反応系から60μとり、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）用試
料処理液60μに加えることにより反応を終了さ
せた。この液を95℃にて３分間熱処理した後、
Lammliの不連続緩衝液系を用いる方法に従つ
て、試料20μ（タンパク20μｇ）を各レーンに
用いた。 8D−TGaseおよび固定化していないTGaseを
用いてαs1−セゼインの架橋重合をおこなわせる
と固定化していないTGaseでは15分ですでに高重
合度のものを形成し、60分でもうほとんどもとの
αｓのバンドが消失した。一方8D−TGaseによ
る反応の場合は、120分たつてもとのαs1のバン
ドがはつきりとのこつていた。この結果から考え
られることは、TGaseはグルタミン反応部位と２
つの基質反応部位があるが、特にアミン反応部位
での立体障害がひどく低分子基質であるプトレシ
ンは容易に反応部位に近づくことができるが、よ
り大きなαs1−カゼインは近づくことがより困難
になるのではないかと考えられる。 この性質を利用すれば、アミン化合物導入反応
時に副反応としておこる基質タンパク質の架橋重
合が抑制され、導入反応の効率を向上させうる。 モノクローナル抗体を介して結合させたTGaseと
直接結合させたTGaseの反応性 TGaseの粗製品〔DEAEセルロースカラムに添
加吸着させた後の酵素活性の高い画分〕を、8D
モノクローナル抗体が結合されている「Affi−
Gel 10」または「Affi−Gel 10」にそれぞれ４℃
にて３時間かけて固定化しTGaseの収支を測定し
た。 結果を表２に示す。
【表】
直接結合する方法は、酵素の様々な部位で結合
する可能性があり、多くの酵素が結合により使用
不能な状態になるものと考えられる。このことよ
り直接法ではTGaseの利用効率が悪く、有効利用
の方法としては不適当であり、モノクローナル抗
体を介してTGaseを固定化する方法がすぐれてい
る。 利用例 固定化TGase（8D−TGase）によるαS1−カ
ゼインへのリジン導入 固定化TGaseの利用例として、牛乳タンパク質
の主成分であるαs1−カゼインへの必須アミノ酸
リジンの導入を行つた。反応系の組成を下記に示
す。 ４％αs1−カゼイン 200μ 0.5MTris−HCl（PH7.5） 160μ 0.4Mジオスレイトール 80μ 0.8MCal2 80M 0.1ML−リジン 400μ H2O 180μ8D−TGase susp 500μ 1600μ 25℃にて、反応液をゆるく撹拌しつつ反応さ
せ、一定時間後に反応液を遠心分離して固定化
TGaseを反応系により沈降物として分離した。上
清を10ｍＭリン酸カリウム緩衝液（PH7.6）にた
いして透析した後、アミノ酸分析を行い、リジン
導入量を測定した。結果を第５図に示した。 同一反応系を例として、固定化TGaseの反復使
用における効率の変化をみた。反応時間は２時間
として、反応終了時に反応液を遠心分離して固定
化TGaseを回収し、0.15M塩化ナトリウムと0.2ｍ
Ｍジオスチレイトールを含むTGase緩衝液で３回
洗浄した後に再使用に供した。 結果を表３に示した。
する可能性があり、多くの酵素が結合により使用
不能な状態になるものと考えられる。このことよ
り直接法ではTGaseの利用効率が悪く、有効利用
の方法としては不適当であり、モノクローナル抗
体を介してTGaseを固定化する方法がすぐれてい
る。 利用例 固定化TGase（8D−TGase）によるαS1−カ
ゼインへのリジン導入 固定化TGaseの利用例として、牛乳タンパク質
の主成分であるαs1−カゼインへの必須アミノ酸
リジンの導入を行つた。反応系の組成を下記に示
す。 ４％αs1−カゼイン 200μ 0.5MTris−HCl（PH7.5） 160μ 0.4Mジオスレイトール 80μ 0.8MCal2 80M 0.1ML−リジン 400μ H2O 180μ8D−TGase susp 500μ 1600μ 25℃にて、反応液をゆるく撹拌しつつ反応さ
せ、一定時間後に反応液を遠心分離して固定化
TGaseを反応系により沈降物として分離した。上
清を10ｍＭリン酸カリウム緩衝液（PH7.6）にた
いして透析した後、アミノ酸分析を行い、リジン
導入量を測定した。結果を第５図に示した。 同一反応系を例として、固定化TGaseの反復使
用における効率の変化をみた。反応時間は２時間
として、反応終了時に反応液を遠心分離して固定
化TGaseを回収し、0.15M塩化ナトリウムと0.2ｍ
Ｍジオスチレイトールを含むTGase緩衝液で３回
洗浄した後に再使用に供した。 結果を表３に示した。
第１図は、固定化TGaseと固定化していない
TGaseを37℃に長時間反応させたときの、TGase
の安定性を示す。横軸は時間（分）、縦軸はアセ
チル化カゼインにとり込まれたプトレシン
（nmole）である。破線は固定化TGase、実線は
固定化していないTGaseの値である。第２図ない
し第４図は、それぞれ25℃、30℃、37℃における
TGaseの熱安定性を示す。横軸は時間（時間）、
横軸は活性（％）である。破線は固定化TGase、
実線は固定化していないTGaseの値である。第５
図は、固定化TGaseによるαs1−カゼインへのリ
ジン導入を示す。横軸は時間（時間）、縦軸はαs
１−カゼインにとり込まれたリジン量（リジン／
αs1−カゼイン、mole／mole）である。
TGaseを37℃に長時間反応させたときの、TGase
の安定性を示す。横軸は時間（分）、縦軸はアセ
チル化カゼインにとり込まれたプトレシン
（nmole）である。破線は固定化TGase、実線は
固定化していないTGaseの値である。第２図ない
し第４図は、それぞれ25℃、30℃、37℃における
TGaseの熱安定性を示す。横軸は時間（時間）、
横軸は活性（％）である。破線は固定化TGase、
実線は固定化していないTGaseの値である。第５
図は、固定化TGaseによるαs1−カゼインへのリ
ジン導入を示す。横軸は時間（時間）、縦軸はαs
１−カゼインにとり込まれたリジン量（リジン／
αs1−カゼイン、mole／mole）である。
Claims (1)
- １ タンパク質固定化用担体に、トランスグルタ
ミナーゼの活性部位以外の部位においてトランス
グルタミナーゼを捕捉する抗トランスグルタミナ
ーゼモノクローナル抗体を結合せしめ、該モノク
ローナル抗体にトランスグルタミナーゼを捕捉せ
しめて固定化されたトランスグルタミナーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5097983A JPS59175884A (ja) | 1983-03-26 | 1983-03-26 | 固定化されたトランスグルタミナ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5097983A JPS59175884A (ja) | 1983-03-26 | 1983-03-26 | 固定化されたトランスグルタミナ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175884A JPS59175884A (ja) | 1984-10-04 |
| JPS6239996B2 true JPS6239996B2 (ja) | 1987-08-26 |
Family
ID=12873921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5097983A Granted JPS59175884A (ja) | 1983-03-26 | 1983-03-26 | 固定化されたトランスグルタミナ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175884A (ja) |
-
1983
- 1983-03-26 JP JP5097983A patent/JPS59175884A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59175884A (ja) | 1984-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1162848A (en) | Method for enzyme immunoassay and peptide-enzyme conjugate and antibody therefor | |
| JPS60180584A (ja) | アルカリホスフアタ−ゼおよびその精製法 | |
| EP0081583A1 (en) | Method for affinity purification of hybridoma antibodies | |
| JPH0588116B2 (ja) | ||
| US4876191A (en) | Immobilization of biologically active substances with carrier bond antibody | |
| JPS6291197A (ja) | 抗ヒトインタ−ロイキン１抗体，その製法及びその使用法 | |
| FI83669C (fi) | Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas. | |
| Ikura et al. | Specific immobilization of an enzyme by monoclonal antibody: immobilization of guinea pig liver transglutaminase | |
| JPS6239996B2 (ja) | ||
| CA2076557C (en) | Process for the purification of factor xiii, monoclonal antibodies against factor xiiia, the preparation and use thereof | |
| Bureau et al. | Desorption following immunoaffinity chromatography; generalization of a gentle procedure for desorbing antigen | |
| JPH02221300A (ja) | イムノアフィニティーマトリックス | |
| Wilchek | Affinity chromatography; a tool in protein chemistry. | |
| Potts et al. | A simple method for immunoaffinity purification of nondenatured avian sarcoma and leukemia virus gag-containing proteins | |
| JPH0794475B2 (ja) | 純粋なエリスロポエチンの製造法 | |
| EP0084344A2 (en) | Anti-urokinase monoclonal antibodies and process for preparing the same | |
| JPS59226864A (ja) | トランスホ−ミンググロスファクタ−の酵素免疫測定法 | |
| JPH07121876B2 (ja) | 静注用免疫グロブリンの製法 | |
| JPH04139200A (ja) | タンパク質の固定方法 | |
| JPH03127997A (ja) | ヒト１ｇＥ結合因子に特異的なモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびその用途 | |
| JPS63117253A (ja) | 免疫センサ− | |
| JP2548562B2 (ja) | 抗血液凝固物質の製造法 | |
| JPH02126157A (ja) | ヒトトランスフォーミンググロースファクターβの免疫学的測定方法 | |
| JPH04131092A (ja) | モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法 | |
| Spitznagel | Structure, activity, and stability of immobilized monoclonal antibodies |