JPH0710238B2 - α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬 - Google Patents

α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬

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JPH0710238B2
JPH0710238B2 JP62155650A JP15565087A JPH0710238B2 JP H0710238 B2 JPH0710238 B2 JP H0710238B2 JP 62155650 A JP62155650 A JP 62155650A JP 15565087 A JP15565087 A JP 15565087A JP H0710238 B2 JPH0710238 B2 JP H0710238B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、１種又は数種の補助の酵素の存在で基質それ
自体を分解し、分解生成物を測定することによつて、α
−アミラーゼを測定するための方法と試薬に関する。
従来の技術 α−アミラーゼ及びそのイソ酵素の測定は、それらの結
果が診断目的、特に膵臓病の診断に使用されるので、臨
床化学の特に重要な方法である。従つて多数のα−アミ
ラーゼ測定法が開発された。それらは大部分、しばしば
１種以上の助酵素の存在での、基質の分解及び分解生成
物の測定に基づく。特に、例えば米国特許（US−PS）第
3879263号及び同第4000042号及び西ドイツ特許公開（DE
−OS）第2741192号明細書に記載されている様に、測定
可能な基を生ずる澱粉及びマルトオリゴシドが工業的に
重要である。前記マルトオリゴシドは、例えば西ドイツ
特許公開（DE−OS）第2731421号及び第2755803号明細書
に記載されているように光学的に測定可能な基によつて
も誘導することができるか又はエチリデン保護基を有し
ていてもよい（欧州特許第135758A1号明細書）。
これらの測定の一般的な難点は全て、基質がα−アミラ
ーゼによる分解に対し種々の攻撃箇所を有し、従つて部
分的には極めて複雑な機構により、異なる分解生成物が
生じることである。これによつて活性の正確な計算が著
しく困難になり、精密さが部分的に損われる。例えば基
質α−（４−ニトロフエニル）−マルトヘプタオースの
分解の際には、マルトテトラオース約60％が生じるが、
これは、例えばα−グルコシダーゼを用いて行われる次
の指示薬反応によつて劣悪に分解されるにすぎない。同
様な難点がその他のマルトオリゴシド基質及びその誘導
体の場合に存在する。この難点は、マルトトリオース及
びマルトースもしくはそれらの相応する誘導体のみを生
成するように基質の分解を進行させるようにすることが
できれば、解決されるであろう。
更に、基質の分解速度を高めることができる際にも期待
される。
発明が解決しようとする問題点 従つて本発明の課題は、従来使用される基質で前記の難
点を除去し、特に基質の分解型を改良し及び分解率を高
めることである。
問題点を解決するための手段 この課題は本発明により、基質を１種以上の補助の酵素
の存在で分解し、分解生成物を測定することによるα−
アミラーゼの測定法の改良によつて解決され、この方法
は、反応をα−アミラーゼに対するモノクロナール抗体
の存在で実施することを特徴とする。
基質としては、本発明による方法のためにα−アミラー
ゼの天然の基質及びその誘導体、例えば澱粉誘導体又は
少糖類及び多糖類を使用することができる。場合によつ
ては発色団によつて置換されていて良くかつ／又は少な
くとも１個のエチリデン保護基を有していて良い、分子
中にグルコース単位２〜10個を有するＤ−マルトオリゴ
シドが特に好適であると判明した。分子中にグルコース
単位４〜８個を有するようなＤ−マルトオリゴシドが特
に有利である。分解により容易に光学的に測定しうる好
適な発色団は、例えばフエニル−、モノニトロフエニル
−、ソルビツト−又はグルコン酸基である（西ドイツ特
許公開公報第2755803号明細書）。同様に置換分とし
て、色素又は色素結合成分、例えば螢光色素又はその前
駆物質（これは容易に本来の色素に公知方法で変えるこ
とができる）が挙げられる。保護基の決定は当業者に公
知であり、本明細書で詳説する必要はない。本発明の方
法で特に好適な基質の代表例は、マルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオース及びマルトオクタオース、それらのモノニトロ
フエニル−及びジニトロフエニル誘導体、前記マルトオ
リゴオースのエチリデン誘導体及びエチリデン保護基も
ニトロフエニル−又はジニトロフエニル基も有する相応
する化合物である。
例として挙げられる補助の酵素は、使用される基質の種
類に左右され、一方では場合によつてはα−アミラーゼ
によつて生成される分解生成物を更に分解するか又は更
に反応させて測定可能な最終生成物を生成するのに役立
つ。すなわち、有利にはニトロフエニル基で置換された
グルコース基２〜10個を有するマルトオリゴシドを使用
する場合に、補助の酵素としては、それがα−化合物で
ある場合にはα−グルコシダーゼを単独で、又はそれが
β−化合物、例えばβ−（ｐ−ニトロフエニル−）マル
トヘプタサツカリドである場合にはβ−グルコシダーゼ
と一緒に使用する。マルトヘプタオースの場合には、α
−アミラーゼによる分解が行われてマルトトリオース及
びマルトテトラオースが生成するがこれはα−グルコシ
ダーゼによつて完全にグルコース単位に分解される。次
に得られるグルコースを常用のグルコース測定法によ
り、例えば補助の酵素としてヘキソキナーゼ及びグルコ
ース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼを用いて測定
することができる。
同様にマルトオリゴシド、例えばマルトヘプタオース又
はマルトテトラオースをα−アミラーゼにより分解して
マルトースにし、このマルトースをマルトースホスホリ
ラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ及びグルコース−６
−ホスフエートデヒドロゲナーゼを用いて同様に公知方
法で測定することができる。前記酵素を本発明の方法で
補助の酵素として添加する。α−アミラーゼの分解生成
物に関するこれら及びその他の測定方法は当業者に公知
であるので、ここでは詳説する必要はない。
モノクロナール抗体としては、本発明では、有利に、ハ
イブリツド細胞クローン469A12＝ECACC86020601又は472
G12＝ECACC86020602から生成されるようなものを使用す
る。しかし本発明は、α−アミラーゼに対応するその他
のモノクロナール抗体を用いて実施することもできる。
これらのモノクロナール抗体はこの為に常用の方法によ
つて、即ち特に好適な試験生体における免疫原としての
α−アミラーゼの使用、この免疫原に対応する抗体を生
成する白血球の取得及び骨髄腫細胞（Myelomz ellen）
又はその他の永続的な培養可能性を生じる細胞又は細胞
フラグメントとの融合及び培養及びこうして得た細胞ク
ローンを生じた抗体に対する選択によつて得ることがで
きる。
この免疫法用の実験動物として、例えばバルブ（Balb）
/c−マウスを使用することができ、この免疫法自体は完
全又は不完全なフロイントのアジユバントを用いてか又
は単に生理的食塩水中で実施することができる。免疫化
実施の後に、実験動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合さ
せ、直接培養皿中でか又は腹水として生長させ、選別す
る。
α−アミラーゼに対する抗体が本発明に好適であるか否
かは、若干の予備試験により容易に確認することができ
る。その際、本発明による作用を生じるか否かだけを調
べれば良い。しかし、特に簡単なスクリーニング法は、
本発明で有利な作用を全く生じない様な酵素に対する結
合場所を有する特定のモノクロナール抗体が存在する場
合に、評価すべきモノクロナール抗体がこの酵素に結合
するか否かのみを確認することである。このために、有
利にハイブリツド細胞クローンNCACC84111301、NCACC84
122003、NCACC85022203及びECACC86060601から生じるモ
ノクロナール抗体を使用する。この抗体と複合されるα
−アミラーゼは、明らかに本発明による作用を生じるよ
うな抗体とのみ結合する。
本発明によりα−アミラーゼに対するモノクロナール抗
体を添加することによつて、意外にも、酵素活性の部分
的な著しい上昇が達成され、しかも、それはα−アミラ
ーゼの両方のイソ酵素に関してである。イソ酵素のこの
上昇は、意外にも、他のイソ酵素がこのイソ酵素を特異
的に抑制するモノクロナール抗体を添加することによつ
て除かれる場合でも残留する。以下第１表に、腹水から
の種々のモノクロナール抗体の、種々の基質の場合のヒ
トの唾液−（ｈ−SA）及び膵臓−α−アミラーゼ（ｈ−
PA）の活性に対する影響を示す。更に本発明の操作方法
によつて、モノクロナール抗体の添加なしの場合よりも
多量の直接測定可能な分解生成物を生成するように、基
質の分解型が変えられる。このことは、２種類の異なる
基質に関して本発明により使用されるモノクロナール抗
体を使用する場合と使用しない場合の各々の活性及び分
解生成物の組成を表わした下記第２表に示される。
第２表の最初の３つの実験で得られた分解型を添付図面
の第１図〜第３図に図解するが、それにより本発明によ
り得られる著しい効果が明らかに認めることができる。
本明細書中で「MAK」は「モノクローナル抗体」を意味
する。
本発明のもう１つの目的はα−アミラーゼの測定用の試
薬であり、この試薬は基質、１種以上の補助の酵素及び
分解生成物の測定用の系を含有し、α−アミラーゼに対
するモノクロナール抗体少なくとも１種を含有すること
を特徴とする。モノクロナール抗体として有利にはハイ
ブリツド細胞クローン469A12＝ECACC86020601又は／及
び472G12＝ECACC86020602により生成されるモノクロナ
ール抗体を含有する。
好適な基質及び補助の酵素に関しては前記の方法を行う
態様に記載したものが該当する。試薬をα−アミラーゼ
のイソ酵素の１つを測定するために使用する場合には、
この試薬は付加的に各々その他のα−アミラーゼイソ酵
素に対する１種以上のモノクロナール抗体を含有する。
その際、膵臓−α−アミラーゼの測定用試薬用には、ハ
イブリツド細胞クローンNCACC84122003から生成される
唾液−α−アミラーゼに対するモノクロナール抗体の添
加及び場合によつては付加的に、ハイブリツド細胞クロ
ーンNCACC84111301により生成されるモノクロナール抗
体の添加が有利である。
本発明によりα−アミラーゼの活性を各々基質により30
〜100％高め、同時に分解型を改良することができる。
これによつて、総α−アミラーゼ及びイソ酵素、特に膵
臓アミラーゼに対するより鋭敏な試薬が可能となる。
次に実施例につき本発明を詳説する。
例 １ I:ヒトの唾液−α−アミラーゼを用いるマウスの免疫化 材料 −バルブ/c−マウス、雌、年令約６〜８週 −ヒトの唾液−α−アミラーゼ〔シグマ（Sigma）、商
品番号A0521〕 −フロイントのアジユバント、完全（シグマ、Nr.F588
1） −フロイントのアジユバント、不完全（シグマ、注文用
商品番号F5506） −生理的食塩水（シグマ、Nr.P8033） 試薬 A:フロイントの完全アジユバント中の唾液−α−アミラ
ーゼ（300μg/ml） B:フロイントの不完全アジユバント中の唾液−α−アミ
ラーゼ（150μg/ml） C:生理的食塩水中の唾液−α−アミラーゼ（150μg/m
l） 実施 バルブ/cマウスをA300μを用いて免疫化する。約８週
間のリズムで各々B300μで３〜４回再免疫化する。融
合の４日前に、C300μを用いて（静脈内）最後の免疫
化を行う。
II:脾臓細胞の融合 脾臓細胞と骨髄腫細胞Ag8.653（ATCC CRL1580）又はSP2
10（ATCC CRI1581）の融合を、J.of Immun.Meth.第39巻
285〜308頁による標準法により行う。脾臓細胞対骨髄腫
細胞の融合比は5:1である。融合生成物を24−培養皿
〔コスター（Costar）〕の20個に接種し、各培養容器当
り腹膜の滲出物細胞５×104で培養する。陽性の一次培
養（Ｃ参照）を融合後３〜４週間後に螢光−活性化され
たセルソーター（Zellsorter）を用いてクローニングす
る。細胞を個々に96−コスタープレートに入れ、腹膜−
滲出細胞２×104個と共に培養する。培地として、10％
の牛胎児血清を有する市販のRPMI−1640−培地〔J.A.M.
A.第199巻（1957）519頁に記載〕を使用する。
III:α−アミラーゼ活性化抗体用のスクリーニング系 免疫付与されたマウスの血清又はハイブリツド細胞の培
養上澄み液又は腹水中のアミラーゼ活性化抗体の濃度を
確認するために、スクリーニング評価としてアミラーゼ
−活性試験を用いる。その為に96−エリザ（ELISA）プ
レート（Nunc、デンマーク）に、緩衝剤（トリス−HCI5
0ミリモル／、１％牛の血清アルブミン、NaCl0.1モル
／、pH7.5）中の膵臓−又は唾液−α−アミラーゼ50
μ（約400U/）を前以つて装入し、被検溶液〔例え
ば培養上澄み液、（生理的食塩溶液で）種々に希釈した
血清、（生理的食塩溶液で）種々に希釈した腹水〕50μ
と一緒に20分間室温で予め恒温保持する。
その後アミラーゼ基質〔α−グリコシダーゼを有する４
−ニトロフエニル−マルトヘプタオシド；ベーリンガー
マンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）、商品番号
568589）〕50μを用いて酵素反応を開始させる。室温
で20〜60分後に吸光を405nmで光度計〔エリザ−リーダ
ー（ELISA−Reader）、コントン（Konton）、スイス〕
で測定する（値Ｉ）。
次の対照を一緒に測定する：新鮮な培地（値II）。活性
は値IIに対する％で記載する： この試験系を用いて下記の結果が得られる。
一次培養の約２％から活性化されたモノクロナール抗体
を見出すことができる。
IV:腹水の製造 ハイブリツド細胞（細胞系統（Zell−Linie）86020601
又は86020602）１−２×106を、各々「プリスタン・オ
イル（Pristan Oil）」〔シグマ、ミユンヘン、商品番
号T7640）〕0.5mlで１〜２回前処理したバルブ/cマウス
（約生後３週間）の腹腔内に注射する。約15〜20日後に
マウス１匹当り、IgG約10mg/mlを有する腹水３〜5mlが
取出される。
例 ２ ヒトの唾液−α−アミラーゼ及びヒトの膵臓−α−アミ
ラーゼの活性に対する、活性化MAK ECACC86020602及びE
CACC86020601（MAK NCACC84122003及びNCACC84111301と
の組合せも含めて）の作用 物質： −α−アミラーゼに対するエンズアミルＫ−テ−テスト
（EnzAmyl-K-Test）〔ゲデツケ（Goedecke）、ベルリ
ン；商品番号847903〕；基質＝アルトテトラオース（Al
totetraos）、 −α−アミラーゼに対するフエデバス−テスト（Phadeb
as−Test）〔フアルマシア（Pharmacia）、フライブル
ク；商品番号51−5221−00/1〕；基質＝青色に着色した
高分子澱粉 −４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトテトラオシド、
G4−pNP（ベーリンガー マンハイム社、商品番号72051
8） −４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトペンタオシド、
G5−pNP（ベーリンガー マンハイム社、商品番号72049
6） −４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘキサオシド、
G6−pNP（ベーリンガー マンハイム社、商品番号72048
8） −４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、
G7−pNP（ベーリンガー マンハイム社、商品番号72047
0） −4,6−エチリデン−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マ
ルトヘプタオシド、eth G7−pNP（西ドイツ特許出願DE
−Ａ第3328616号明細書により製造） −細胞系統ECACC86020602、ECACC86020601、NCACC84122
003、NCACC84111301のマウスからの腹水（例１、IVと同
様にして製造） −ヒトの唾液−α−アミラーゼ（シグマ、ミユンヘン、
商品番号A0521） −ヒトの膵臓−α−アミラーゼ〔D.J.ステイーフエル
（Stiefel）及びP.J.ケラー（Keller）著（1973年）バ
イオケミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Biochemica e
t Biophysica Acta）により製造〕 −牛血清アルブミン（RSA）（ベーリンガーマンハイム
社、商品番号238031） −α−グルコシダーゼ（ベーリンガー マンハイム社、
商品番号750590） 試薬： A:PBS:燐酸緩衝剤100ミリモル、NaCl150ミリモル、pH＝
7.1 B:PBS/RSA:牛血清アルブミン６％を有するPBS C:h−SA−溶液:PBS/RSA中のヒトの唾液−α−アミラー
ゼ、500U/〔市販の試薬α−アミラーゼPNP自動包装
（Automatenpacking）、ベーリンガー社、商品番号5685
89を用いて25℃で測定〕 D:h−PA−溶液:PBS/BSA中のヒトの膵臓−α−アミラー
ゼ500U/（ｈ−SA−溶液と同様に測定） E:アミラーゼ−試薬（各々pNP基質を用いて）：ヘーペ
ス（Hepes）−緩衝剤（pH7.1） 100ミリモル／ NaCl 50ミリモル／ pNP基質（基質各１種類）５ミリモル／ α−グルコシダーゼ 30U/ F:腹水希釈物：種々の腹水をPBS/RSAを用いて各々１＋5
0に希釈する。
実施 1. 腹水からのMAKを有するアミラーゼの調整 −アミラーゼ（ｈ−SA又はｈ−PA）100μを種々の腹
水希釈物（１種又は数種）10μと混合し、PBS/RSAで2
00μにする。対照として、PBS/RSAで増分しただけの
アミラーゼを用いる。
−混合物を５分間室温で恒温保持する。
2. 基質G4を用いるアミラーゼ活性の測定 −アミラーゼ/MAK混合物もしくは相応する対照のアミラ
ーゼ活性の測定は、ゲデツケ・エンズアミルＫ−テスト
を用いて25℃でその指示に正確に従つて行う。
3. 高分子基質を用いるアミラーゼ活性の測定 −アミラーゼ/MAK混合物又は相応する対照のアミラーゼ
活性測定は、フアルマシア社のフアデバス−テストを用
いその指示に正確に従つて行う。
4. PNP−基質を用いるアミラーゼ活性の測定 −アミラーゼ試薬E1mlを半微量キユベツト（Halbmikrok
vetten）中で25℃の温度にする。
−アミラーゼ/MAK混合物もしくは対照各50μをこれに
加えて、良く混合する。
−吸光度変化ΔE/分の測定をアミラーゼ−MAK−添加後
３〜７分間の間に405nmで行う。
計算 1. G4−基質及び高分子基質 −１当りの単位（U/）として得られるアミラーゼ/M
AK混合物のアミラーゼ活性を同じ基質の対照（MAKな
し）の相応するアミラーゼ活性に関連させて、％値とし
て記載する。
2. pNP−基質 −ΔE/分として得られるアミラーゼ/MAK混合物のアミラ
ーゼ活性を、同じpNP基質の対照（MAKなし）の相応する
アミラーゼ活性に関連させて、％値として記載する。
結果 唾液−及び膵臓アミラーゼの活性に対するモノクロナー
ル抗体の影響を種々の基質におけるMAKなしの活性に対
する活性（％値）として第１表に総括する。
例 ３ モノクロナール抗体ECACC86020601及びECACC86020602含
有及び不含のヒトの膵臓−α−アミラーゼによるG7−pN
P及びeth G7−pNPの分解型及び反応速度の測定 物質 −4,6−エチリデン−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マ
ルトヘプタオシド、ethG7−pNP（西ドイツ特許出願DE−
Ａ第3328616号明細書により製造） −４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、
G7−pNP（ベーリンガー マンハイムGmbH、注文用商品
番号720470） −細胞系統ECACC86020601の腹水 −細胞系統ECACC86020602の腹水 −ヒトの膵臓−α−アミラーゼ〔D.J.ステーフエル及び
P.J.ケラー著（1975年）ビオケミカ エト ビオフイジ
カ アクタ第302巻、345〜361頁により製造〕 −牛血清アルブミン（RSA）（ベーリンガーマンハイムG
mbH、商品番号238031） 試薬 A:Hepes緩衝剤150ミリモル、NaCl50ミリモル、NaN31mg/
ml、pH7.1 B:燐酸塩緩衝剤100ミリモル、NaCl150ミリモル、６％RS
A、pH7.1 C:緩衝剤Ｂ中のヒトの膵臓−α−アミラーゼ756U/
（市販の試薬−α−アミラーゼpNP自動包装、ベーリン
ガー マンハイム社、商品番号568589を用いて25℃で測
定）、 D:モノクロナール抗体ECACC86020601:腹水１＋50（Ｂで
希釈） E:モノクロナール抗体ECACC86020602:腹水１＋50（Ｂで
希釈） F:アセトニトリル20部、１モル／ H3PO43部と混合 G:25ミリモル／ K2HPO41部、pH＝7.1、アセトニトリ
ル１部と混合 H:A中の５ミリモルのeth G7−pNP I:A中の５ミリモルのG7−pNP 実施 1. アミラーゼとMAKの混合 −MAK溶液Ｄ又はＥ又は緩衝剤B20μを膵臓アミラーゼ
C200μと混合し、５分間室温で恒温保持する。
2. アミラーゼ/MAKと基質の反応 −基質溶液（Ｈ又はＩ）2mlを前以つて装入し、25℃の
温度にする。
−温度調整した基質溶液を種々のアミラーゼ/MAK（緩衝
剤）混合物（１から）200μで反応開始させる。
−正確に１、３、５、７、10、20、30分後に、開始させ
た基質溶液分各200μを取出し、停止試薬F130μに
添加する。
−停止させた基質溶液分を溶液1mlで希釈し、−20℃で
保存する。
3. 基質及びHPLCによる基質の分解分（Bruchstck）
の測定 −2.からの停止させ、希釈した基質溶液分を溶解させ
る。
−G7−pNPもしくはethg7−pNPの含量、その際pNP及びG1
−pNP〜G6−pNPの含量（個々の基質溶液分の）をHPLCに
よつてE.−O.ヘーゲレ（Ｈgele）その他著（1982年）
Clin.Chem.28/11巻、2201〜2205頁に記載されている様
にして測定する。
結果 アミラーゼと基質との反応が進むにつれて、基質の含量
が減少する。第２表にMAK不含の並びにMAK ECACC860206
01及びECACC86020602含有の両方の基質に関するミリモ
ル／（１分）を表わす。更に、MAK含有膵臓アミラーゼ
の活性値を、MAK不含活性値に対して規格化して表わ
す。この反応で遊離pNP、G1−pNP、並びにG5−pNP及びG
6−pNPは生じない。その他の分解分の％数も第１表にま
とめる。
第１図〜第３図は、MAKを含有及び不含の基質としてのG
7−pNPに関する膵臓アミラーゼ反応における基質の減少
速度及び生成物の増加を示している。
例 ４ 基質マルトヘプタオースの場合のMAK ECACC86020601及
びECACC86020602によるヒトα−アミラーゼの活性化 物質： −モノテスト（Monotest）α−アミラーゼUV（ベーリン
ガー マンハイム社、マンハイム、商品番号240001） −細胞系統ECACC86020602又はECACC86020601のマウスか
らの腹水（例１による） −ヒトの唾液−α−アミラーゼ（シグマ、ミユンヘン、
商品番号A0521） −ヒトの膵臓−α−アミラーゼ（D.J.ステーフエル及び
P.J.ケラー著（1973年）ビオケミカ・エ・ビオフイジカ
・アクタ第302巻、345〜361頁により製造） −牛血清アルブミン、RSA（ベーリンガー マンハイム
社、商品番号238031） 試薬 A:PBS/RSA:燐酸塩緩衝剤100ミリモル／、NaCl150ミリ
モル／、RSA6％、pH7.1 B:h−SA−溶液:PBS/RSA中のヒトの唾液−α−アミラー
ゼ500U/（25℃で市販の試薬α−アミラーゼPNP自動包
装、ベーリンガーマンハイム社、カタログ番号568589を
用いて測定） C:h−PA−溶液:PBS/RSA中のヒトの膵臓−α−アミラー
ゼ、500U/（ｈ−SA−溶液と同様に測定） D:MAK ECACC86020601の腹水希釈物：腹水１＋50（PBS/R
SAで希釈） E:MAK ECACC86020602の腹水希釈物：腹水１＋50（PBS/R
SAで希釈） 実施 −α−アミラーゼ及びMAKもしくは緩衝剤を下記要領に
より混合する： 試料Ｉ〜VIを10分間室温で恒温保持する。
−試薬Ｉ〜VIの活性を25℃でモノテスト−α−アミラー
ゼUVを用いて正確にその指示に従つて測定する。
計算 MAK/アミラーゼ混合物（試料III〜VI）の測定活性をア
ミラーゼ／緩衝剤混合物（試料Ｉ及び試料II）の相応す
る活性に関連させて、％値として表わす（試料III及びI
Vは試料Ｉに関係づけ、試料Ｖ及びVIは試料IIに関係づ
ける）。
結果 ヒトの唾液−及び膵臓−α−アミラーゼに対するモノク
ロナール抗体及び緩衝剤の影響を下記表に表わす： 例 ５ 融合物の培養上澄み液又はマウスの腹水又は血清〔ヒト
のα−アミラーゼNr.I、II、III及びＶのエピトープ（E
pitop）を検出しない〕からのモノクロナール抗体のス
クリーニング系 アミラーゼ−活性化MAKのスクリーニング用の次の実施
例は、検査用にMAKの活性化特性を利用する。アミラー
ゼは少なくとも５種類のエピトープを有するものと考え
られる。これらの全てのエピトープにMAKは同時に結合
することができ、エピトープIVは活性作用及び分解型変
形作用を有するMAKと結合するエピトープである。
物質： −羊からのマウスFc−γ−フラグメントに対するポリク
ロナール抗血清 −牛血清アルブミン（RSA）（ベーリンガーマンハイム
社、マンハイム商品番号238031） −ヒトの唾液−α−アミラーゼ−オランダガラシ−ペル
オキシダーゼ−複合体（ｈ−SA＝POD）;M.B.ウイルソン
（Wilson）及びP.K.ナカム（Nakam）〔イムノフルオレ
ツセンス・アンド・リレイテツド・ステイニング・テク
ニークス（Immunofluorescence and Related Staining
Techniques）W.クナツプ（Knapp）他、Eds.、エルセビ
ア／−ノース−ホランダ・バイオメデカル・プレス（El
sevier/−North−Holland Biomedical Press、Amsterda
m−New York）、1978、215〜224頁中〕によりヒトの唾
液−α−アミラーゼ（シグマ、ミユンヘン、商品番号A0
521）及びオランダガラシ−ペルオキシダーゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社、マンハイム、商品番号238031） −ハイブリツド細胞クローンNCACC84111301の培地上澄
み液 −ハイブリツド細胞クローンNCACC84111301から製造し
たモノクロナール抗体のFab′−フラグメント（アミラ
ーゼエピトープＩに対するMAK） −ハイブリッド細胞クローンNCACC84122003により製造
したモノクロナール抗体のFab′−フラグメント（アミ
ラーゼエピトープIIに対するMAK） −ハイブリツド細胞クローンNCACC85022203によつて製
造したモノクロナール抗体のFab′−フラグメント（ア
ミラーゼエピトープIIIに対するMAK） −ハイブリツド細胞クローンNCACC86060601（115C9）に
よつて製造したモノクロナール抗体のFab′−フラグメ
ント（アミラーゼエピトープＶに対するMAK） −ELISA−プレート〔ヌンク（Nunc）、ロスキルデ（Ros
kilde）、デンマーク〕 −ABTS :2,2−アシノ−ジ−〔３−エチルベンズチアゾ
リンスルホネート（６）〕（ベーリンガーマンハイム
社、商品番号102946） −メルク（Merck）、ダルムシユタツト（Darmstadt）又
はベーリンガー マンハイム社の高純度の薬品 −ELISAプレート用の保護シート：プレート・シーラー
ズ（Plate Sealers）商品番号M30〔ダイナテツク・ドイ
チユランド社（Dynatech Deutschland GmbH）、デンケ
ンドルフ（Denkendorf）〕 種々のモノクロナール抗体のFab′−フラグメントの製
造は次のようにして行つた： 先ず種々のハイブリツド細胞クローンの腹水を（例1/IV
と同様）製造した。腹水から、分別した硫酸アンモニウ
ム沈澱及びジエチルアミノエチルセルロース−カラム
〔A.ジヨンストーン（Johnstone）及びR.ソーペ（Thorp
e）による；イムノケミストリー・イン・プラクテイス
（Immunochemistry in Practice）、ブラツクウエル・
サイアンテイフイツク・パブリケーシヨンズ（Blackwel
l Scientific Publications）、オツクスフオード−ロ
ンドン−エジンバラ−ボストン−メルボルン、1982、43
〜47頁〕を用いてモノクロナール抗体を精製した。抗体
をFab′−フラグメントに分解することは、A.ニソノフ
（Nisonoff）〔メソツズ（Methods）Med−Res.10巻、13
4頁以降（1964年）〕により行つた。
試薬： A:炭酸ナトリウム緩衝剤、50ミリモル、pH9.3、マウスF
c−γ−フラグメントに対するヒツジのポリクロナール
抗体10μg/mlを含有する〔ポリクロナール抗血清から硫
酸アンモニウム沈澱及びジエチルアミノエチルセルロー
スクロマトグラフイーを用いて精製（A.ジヨンストーン
及びR.ソーペ；イムノケミストリー・イン・プラクテイ
ス、ブラツクウエル・サイアンテイフイツク・パブリケ
ーシヨンズ、オツクスフオード−ロンドン−エジンバラ
−ボストン−メルボルン、1982、43〜47頁）〕 B:PBS/RSA:燐酸塩100ミリモル、NaCl150ミリモル、pH＝
7.1、ウシ血清アルブミン（RSA）１％を含有 C:h−SA＝POD200IU/（ペルオキシダーゼ単位）及び
〔ハイブリツド細胞クローンNCACC84111301、8412200
3、85022203及びECACC86060601（76C8）の〕4Fab′−フ
ラグメント各100μg/mlを有する試薬B;溶液は使用する
１時間前に調製する。
D:ペルオキシダーゼ−基質溶液：燐酸塩−クエン酸塩−
緩衝剤100ミリモル、pH＝4.4、過硼酸ナトリウム3.2ミ
リモル及びABTS 1.9ミリモル。
E:PBS:燐酸塩緩衝剤100ミリモル、NaCl150ミリモル、pH
＝7.1 実施： 1. ELISA−プレートの各斑点に試薬Ａ各100μをピペ
ツトで滴加する。プレートを保護シートで密封し、18時
間４℃で恒温保持する。
2. プレートの各斑点を試薬Ｅ少なくとも250μで３
回洗浄する（室温、各々約５分間）。
3. プレートの各斑点を試薬B250μと一緒に恒温保持
する（保護シート；室温、１時間）。
4. プレートの各斑点を２に記載したようにして洗浄す
る。
5. 種々のハイブリツド細胞クローンの上澄み又は免疫
処理したマウスの腹水又は血清を、希釈せずに、かつ／
又は種々の希釈度で（試薬Ｂで希釈）プレートの種々の
斑点中にピペツトで入れる（各々100μ）。プレート
を密閉し、２時間37℃で恒温保持する。盲検値として試
薬Ｂと一緒にのみ恒温保持した斑点を用いる。陰性の対
照としてハイブリツド細胞クローンNCACC83111301の培
養上澄みを用いる。
6. プレートの各斑点を２に記載したようにして洗浄す
る。
7. プレートの各斑点を試薬Ｃ（アミラーゼ−POD−複
合体＋Fab′−フラグメント）100μと一緒に恒温保持
する（保護シート;37℃、２時間）。
8. プレートの各斑点を試薬Ｅで６回洗浄する（少なく
とも250μ、室温、各々約２分間）。斑点を揚水ポン
プ及び微細なガラスカニユーレにより吸引乾燥する。
9. その後直ちにプレートの各斑点に試薬D100μを加
える。プレートを保護シートで密封し、37℃で恒温保持
する（約15〜60分、検査すべきMAKの濃度による）。
評価： ELISA−プレートの個々の斑点の吸光度を保護シートを
取除いた後にELISA−リーダー（コントロン、スイス）
で測定する。盲検値（試薬Ｂのみ）の吸光度をMAKを有
するその他の斑点の吸光から引く。
アミラーゼのエピトープIVに対する抗体で被覆した斑点
は、ハイブリツド細胞クローンNCACC84111301の培養上
澄みで被覆した斑点よりも著しく高い吸光度を示す。吸
光度の相違は少なくとも200mEである。
この様にしてアミラーゼのエピトープIVを検出する全て
のMAKが確実に見出される。このMAKは意外にもアミラー
ゼを活性化し（すなわち分解速度を促進し）、場合によ
り基質の分解型を変える特性を有する。
【図面の簡単な説明】
添付図面第１図は第２表におけるMAK不含の場合の基質G
7−pNPに関する膵臓アミラーゼ反応における基質の減少
速度及び生成物の増加を表わすグラフ図であり、第２図
はMAK ECACC No.8602062を含有する場合の図、第３図は
MAK ECACC No.8602061を含有する場合の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/32 6807−4Ｂ 1/34 6807−4Ｂ 1/48 Ｚ 6807−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】基質を１種又は数種の補助の酵素の存在で
    分解し、分解生成物を測定することによってα−アミラ
    ーゼを測定する方法において、反応をα−アミラーゼに
    対するモノクローナル抗体の存在で実施し、その際、ハ
    イブリッド細胞クローンNCACC84111301、NCACC8412200
    3、NCACC85022203及びECACC86060601から生成されるモ
    ノクローナル抗体の存在で、α−アミラーゼを結合する
    ことのできるモノクローナル抗体少なくとも１個を使用
    することを特徴とする、α−アミラーゼの測定法。
  2. 【請求項２】基質として、場合によって１個の発色団に
    より置換されておりかつ／または少なくとも１個のエチ
    リデン保護基を有するグルコース単位２〜10個を有する
    Ｄ−マルトオリゴシドを使用する、特許請求の範囲第１
    項に記載の方法。
  3. 【請求項３】グルコース単位４〜８個を有するＤ−マル
    トオリゴシドを使用する、特許請求の範囲第２項に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】発色団としてニトロフェニル基を有するＤ
    −マルトオリゴシドを使用する、特許請求の範囲第２項
    又は第３項のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】補助の酵素としてα−グルコシダーゼを添
    加する、特許請求の範囲第２項から第４項までのいずれ
    か１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】基質としてマルトヘプタオースを、かつ付
    加的な補助の酵素としてα−グルコシダーゼの他になお
    ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−ホスフェートデヒ
    ドロゲナーゼを使用する、特許請求の範囲第５項記載の
    方法。
  7. 【請求項７】その他の補助の酵素としてα−グルコシダ
    ーゼトと並んでなおβ−グルコシダーゼを使用する、特
    許請求の範囲第４項及び第５項のいずれか１項に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】基質としてマルトテトラオースを、かつ補
    助の酵素としてマルトースホスホリラーゼ、β−ホスホ
    グルコムターゼ及びグルコース−６−ホスフェートデヒ
    ドロゲナーゼを使用する、特許請求の範囲第３項記載の
    方法。
  9. 【請求項９】ハイブリッド細胞クローンECACC86020601
    又はECACC86020602から生成されるモノクローナル抗体
    を使用する、特許請求の範囲第１項から第８項までのい
    ずれか１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】両方のα−アミラーゼイソ酵素の１つを
    測定するために、付加的に、各々他のα−アミラーゼイ
    ソ酵素を特異的に抑制するモノクローナル抗体を使用す
    る、特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれか１
    項記載の方法。
  11. 【請求項１１】基質、１種以上の補助の酵素及び分解生
    成物を測定するための系を含有するα−アミラーゼ測定
    用試薬において、α−アミラーゼに対するモノクローナ
    ル抗体少なくとも１種類を含有し、かつ、その際ハイブ
    リッド細胞クローンNCACC84111301、NCACC84122003、NC
    ACC85022203及びECACC86060601から生成されるモノクロ
    ーナル抗体の存在で、α−アミラーゼを結合することの
    できるモノクローナル抗体１個を含有することを特徴と
    する、α−アミラーゼ測定用試薬。
  12. 【請求項１２】ハイブリッド細胞クローンECACC8602060
    1又は／及びECACC86020602によって生成されるモノクロ
    ーナル抗体を含有する、特許請求の範囲第11項に記載の
    試薬。
  13. 【請求項１３】基質として、場合により発色団によって
    置換されておりかつ／又は少なくとも１個のエチリデン
    保護基を有する、グルコース単位２〜10個を有するＤ−
    マルトオリゴシドを含有する、特許請求の範囲第11項又
    は第12項のいずれかに記載の試薬。
  14. 【請求項１４】基質がグルコース単位４〜８個を含有す
    る、特許請求の範囲第13項に記載の試薬。
  15. 【請求項１５】マルトオリゴシドが発色団としてニトロ
    フェニル基を有する、特許請求の範囲第13項又は第14項
    に記載の試薬。
  16. 【請求項１６】補助の酵素としてα−グルコシダーゼを
    含有する、特許請求の範囲第13項から第15項までのいず
    れか１項記載の試薬。
  17. 【請求項１７】基質としてマルトヘプタオースを、かつ
    補助の酵素としてα−グルコシダーゼ、ヘキソキナーゼ
    及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを
    含有する、特許請求の範囲第16項に記載の試薬。
  18. 【請求項１８】α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダ
    ーゼを含有する、特許請求の範囲第15項又は第16項のい
    ずれかに記載の試薬。
  19. 【請求項１９】基質としてマルトテトラオースを、かつ
    補助の酵素としてマルトースホスホリラーゼ、β−ホス
    ホグルコムターゼ及びグルコース−６−ホスフェートデ
    ヒドロゲナーゼを使用する特許請求の範囲第13項に記載
    の試薬。
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