JPS637798A - α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬 - Google Patents

α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬

Info

Publication number
JPS637798A
JPS637798A JP62155650A JP15565087A JPS637798A JP S637798 A JPS637798 A JP S637798A JP 62155650 A JP62155650 A JP 62155650A JP 15565087 A JP15565087 A JP 15565087A JP S637798 A JPS637798 A JP S637798A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amylase
substrate
reagent
monoclonal antibody
glucosidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP62155650A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0710238B2 (ja
Inventor
マルチン・ゲルバー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Publication of JPS637798A publication Critical patent/JPS637798A/ja
Publication of JPH0710238B2 publication Critical patent/JPH0710238B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、１橿又は数種の助酵素の存在で基質それ自体
を分解し、分解生成物を測定することによって、α−ア
ミラーゼを測定するための方法と試薬に関する。
従来の技術 α−アミラーゼ及びそのイソ酵素の測定は、それらの結
果が診断目的、特に膵臓病の診断に使用されるので、臨
床化学の特に重要な方法である。従って多数のα−アミ
ラーゼ測定法が開発された。それらは大部分、しばしば
１ａ［以上の助酵素の存在での、基質の分解及び分解生
成物の測定に基づく。特許、例えは米国特許（ｔｙｓ−
ｐｓ）第３８７９２６３号及び同第４００００４２号及
び西ドイツ特許公開（Ｄｏｌｌ！−０８）第２７４１１
９２号明細書に記載されている様に、測定可能な基を生
ずる澱粉及びマルトオリイシドが工業的ＫＲｅである。
前記マルトオリゴシトは、例えば西ドイツ特許公開（Ｄ
Ｉ−Ｏ８）第２７３１４２１号及び第２７５５８０３号
明細書に記載されているように光学的に測定可能な基に
よっても誘導することができるか又はエチリデン保護基
ｔ−有していてもよい（欧州特許第１３５７５８Ａ１号
明細書）。
これらの測定の一般的な難点は全て、基質がα−アミラ
ーゼによる分解に対し種々の攻撃箇所を有し、従って部
分的には極めて複雑な機構により、異なる分解生成物が
生じることである。
これによって活性の正確な計算が著しく困難になり、精
密さが部分的に損われる。例えば基質α−（４−ニトロ
フェニル）−マルトヘプタオースの分解の際には、マル
トオクタオース約６０％が生じるが、これは、例えばα
−グルコシダーゼを用いて行われる次の指示薬反応によ
って劣悪に分解されるにすぎない。同様な難点がその他
のマルトオリゴシト基質及びその誘導体の場合に存在す
る。この難点は、マルトトリオース及びマルトースもし
くはそれらの相応する誘導体のみを生成するように基質
の分解を進行させるようにすることができれば、解決さ
れるであろう。
更に、基質の分解速度を高めることができる際にも期待
される。
従って本発明の課題は、従来使用される基質で前記の難
点を除去し、特に基質の分％！型を改良し及び分購率ｆ
：高めることである。
この課題は本発明により、基質を１種以上の助酵累の存
在で分解し、分解生成物を測定することたよるα−アミ
ラーゼの測定法によって暦法され、この方法は、反応を
α−アミラーゼに対するモノクロナール抗体の存在で実
施することを特徴とする。
基質としては、本発明による方法のためにα−アミラー
ゼの天然の基質及びその誘導体、例えは澱粉銹導体又は
少ａｔ類及び多糖類を使用することができる。場合によ
っては発色団によって置換されていて良くかつ／又は少
なくとも１個のエチリデン保護基を有していて良い、分
子中にグルコース単位２〜１０個を有するＤ−マルトオ
リイシドが特に好適であると判明した。
分子中にグルコース巣位４〜８個を有するようなり一マ
ルトオリゴシドが特に有利である。分解により容易に光
学的に測定しうる好適な発色団ｈ、例、ｔ、ハフェニル
ー、モノニトロフェニル−、ソルビット−又はグルコン
酸基である（西Ｖイツ特許公開公報第２７５５８０３号
明細？）。
同様に置換分として、色素又は色素結合成分、例えば螢
光色素又はその前駆物質（これは容易に本来の色素に公
知方法で変えることができる）が挙げられる。保護基の
測定は当業者に公知であり、本明細書で詳説する必要は
ない。本発明の方法で特に好適な基質の代表例は、マル
トテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオ
ース、マルトヘプタオース及びマルトオクタオーＸ、ソ
レラのモノニトロフェニル−及ヒジニトロフェニル誘導
体、前記マルトオリゴオ−スのエチリデン銹導体及びエ
チリデン保獲基もニトロフェニル−又ハシニ）ｏ７ｚ二
／１４１゜有する相応する化合物である。
例として挙げられる助酵素は、使用される基質の洩類に
左右され、−方では場合によってはα−アミラーゼによ
って生成される分解生成物を更に分解するか又は更に反
応させて測定可能な最終生成物を生成するのに役立つ。
すなわち、有利にはニトロフェニル基で置換されたグル
コース基２〜１０個を有するマルトオリゴシｒを使用す
る場合に、助酵素としては、それがα−化合物がである
場合にはα−グルコシダーゼを皐独で、又はそれがβ−
化合物、例えばβ−（ｐ−ニトロフェニル−）マルトヘ
プタサツカリドである場合にはβ−グルコシダーゼと一
緒に使用する。マルトヘプタオースの場合には、α−ア
ミラーゼによる分解が行われてマルトトリオース及びマ
ルトテトラオースが生成するがこれはα−グルコシダー
ゼによって完全にグルコース単位に分解される１次に得
られるグルコースを常用のグルコース測定法により、例
えば助酵累としてヘキソキナーゼ及びグルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼを用いて測定することが
できる。
同様にマルトオリゴシト、例えばマルトヘプタオース又
はマルトテトラオース金α−アミラーゼにより分解して
マルトースにし、このマルトースをマルトースホスホリ
ラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ及びグルコース−６
−ホスフニートデヒドロデナーゼを用いて同様に公知方
法で測定することができる。前記酵素を本発明の方法で
助′＃素として添加する。α−アミラーゼの分解生成物
に関するこれら及びその他の測定方法は当業者に公知で
あるので、ここでは詳説する必要はない。
モノクロナール抗体としては、本発明では。
有利Ｋ、ハイブリッド細胞クローン４６９Ａ１２＝ＩＯ
ＡＯＯ８６０２０６０１又は４７２Ｇ１２−ＫＯＡＯＣ
！　８６０２０６０２から生成されるようなものを使用
する。しかし本発明は、α−アミラーゼに対応するその
他のモノクロナール抗体を用いて実施することもできる
。これらのモノクロナール抗体はこの為に常用の方法に
よって、り０ち特に好適な試験生体における免疫原とし
てのα−アミラーゼの使用、この免疫原拠対応する抗体
を生成する白血球の取得及び骨髄肺細胞（Ｍｙａｌｏｍ
ｚ　ｅｌｌｅｎ　）又はその他の永続的な培養可能性を
生じる細胞又は細胞フラグメントとの融合及び培養及び
こうして得た細胞クローンを生じた抗体に対する選択に
よって得ることができる。
この完投法用の実験動物として、例えばバルブ（１’！
ａｌｂ　）　／　ｃ−マウスを使用することかでき、こ
の免疫法自体は完全又は不完全な７０インドのアジュバ
ントヲ用いてか又は単に生理的食塩水中で実施すること
ができる。免疫化実施の後湾、実験動物の胛体細胞を骨
髄肺細胞と融合させ、血接培誉皿中でか又は腹水として
生長させ、選別する。
α−アミラーゼに対する抗体が不発明に好適であるか否
かは、若干の予備試験により容易に確認することができ
る。その際、本発明による作用を生じるか否かだけを調
べれば良い。しかし、特に簡単なスクリーニング法は、
本発明で有利な作用を全く生じない様な酵素に対する結
合場所を有する特定のモノクロナール抗体が存在する場
合に、評価すべきモノクロナール抗体がこの酵素に結合
するか否かのみを確認することである。このために、有
利にハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣＣ８４１１１３
０１、Ｎ０ＡＯ（：＋　Ｆ３４１．２２００３、ＮＣ！
ＡｃＣ８５［）２２２０２及びＥＯＡＣＩＣ８６０６０
６０１から生じるモノクロナール抗体を使用する。この
抗体と複合されるα−アミラーゼは、明らかに本発明に
よる作用を生じるような抗体とのみ結合する。
本発明によりα−アミラーゼに対するモノクロナール抗
体を添加することによって、意外にも、酵素活性の部分
的な者しい上昇が達成され、しかも、それはα−アミラ
ーゼの両方のイン酵素に関してである。イソ酵素のこの
上昇は、意外にも、他のイソ酵素がこのイン酵素を特異
的に抑制するモノクロナール抗体を添加することによっ
て除かれる場合でも残留する。下記第１表に、腹水から
の種々のモノクロナール抗体の、種々の基質の場合のヒ
トの唾液−（ｈ−８Ａ）及び膵臓−α−アミラーゼ（ｈ
−ＦＡ）の活性に対する影響を示す。更に本発明の操作
方法によって、モノクロナール抗体の添加なしの場合よ
りも多量の直接測定可能な分解生成物を生成するように
、基質の分解型が変えられる。このことは、２種類の異
なる基質に圓して本発明により使用されるモノクロナー
ル抗体を使用する場合と使用１．ない場合の各々の活性
及び分解生成物の組成を表わした下記第２表に示される
。
第２表の最初の６つの実験で得られた分解型を添付図面
の第１図〜第６図に図解するが、それにより本発明によ
り得られる著しい効果が明らかに認めることができる。
本発明のもう１つの目的けα−アミラーゼの測定用の試
薬であり、この試薬は基質、１種以上の助酵素及び分牌
生成物の測定用の系を含有し、α−アミラーゼに対する
モノクロナール抗体少なくとも１種を含有すること全特
徴とする。
モノクロナール抗体として有利にはハイブリッド細胞ク
ローンＡ６９ＡＩ２−ＫＯＡＣ！０８６０２０６０１又
は／及び４７２　Ｇ　１２−　ＦＸｃｈａｃ　８６０２
０６０２により生成されるモノクロナール抗体を含有す
る。
好適な基質及び助酵素に関しては前記の方法を行う態様
に記載したものが該当する。試薬をα−アミラーゼのイ
ソ酵素の１つを測定するために使用する場合には、この
試薬は付加的に各々その他のα−アミラーゼイソ酵素に
対する１種以上のモノクロナール抗体を含有する。その
際、膵臓−α−アミラーゼの測定用試薬用には、ハイブ
リッド細胞クローンｎｃＡｃｃ　８４１２２００３から
生成される唾液−α−アミラーゼに対するモノクロナー
ル抗体の添加及び場合によっては付加的ｋ、ハイブリッ
ド細胞クローンｙｃｈｃｃ８４１１１３０１Ｖｃより生
成されるモノクロナール抗体の添加が有利である。
本発明によりα−アミラーゼの活性を各々基質により３
０〜１００％高め、同時に分解域を改良することができ
る。これによって、総α−アミラーゼ及びイン＃素、特
に膵臓アミラーゼに対するより鋭敏な試験が可能となる
。
次に実施例につき本発明を詳説する。
例　　１ １：ヒトの唾液−α−アミラーゼを用いるマウスの免役
化 材料 一バルプ／Ｃ−マウス、雌、年令約６〜８週−ヒトの唾
液−α−アミラーゼ〔シグマ（Ｓｉｇ！ｎ＆　）、商品
番号ＡＯ５２１）−７０インドのアジュバント、完全（
シグマ、Ｎｒ、ＩＰ５８８１） 一７ａインドのアジュバント、不完全（シグマ、注文用
商品番号？５５０６） −生理的食塩水（シグマ、Ｎｒ、　Ｐ　８０３３　）試
薬 Ａ：フロイントの完全アジュバント中の唾液−α−アミ
ラーゼ（３００μ９／１１Ｌｌ’）Ｂニア０インドの不
完全アジュバント中の唾液−α−アミラーゼ（１５０μ
ｉ／ｍ１）Ｃ：生理的食塩水中の唾液−α−アミラーゼ
（１５０ａｌｌ／ａｔ　） 実施 パルプ／ＣマウスをＡ３００μｌを用いて免疫化する。
約８週間のリズムで各々Ｂ５００μノで３〜４回再免疫
化する。融合の４日前に、Ｃ！３０ｎμｌを用いて（静
脈内）最後の免疫化を行う。
ＩＩ：肺臓細胞の融合 肺臓細胞と骨髄腫細胞Ａｇ　８．６５３　（ＡＴＣ００
ＲＩ１１５８０）又はＢ　Ｐ　２１０　（ＡＴＣＩＣ（
：！Ｒ工１５８１）の融合を、１．　ｏｆ工ｍｍｕｎ、
　Ｍｏｔｈ、第３９巻２８５〜３０８頁による標準法に
より行う。胛体細胞対骨髄膝細胞の融合比は５：１であ
る。融合生成物を２４−培養皿〔コスタ−（Ｏｏｇｔａ
ｒ　）　］の２０個に接種し、各培養容器当り腹膜の滲
出物細胞５ＸＩＱ４で培養する。
陽性の一次培養（Ｃ参照）を融合後３〜４週間後に螢光
−活性化された細胞ａｌ（Ｚθ１ｌｓｏｒｔθｒ）を用
いてクローニングする。細胞を個々に９６−コスタ−プ
レートに入れ、腹膜−滲出細胞２Ｘ１０’個と共に培養
する。培地として、１０％の牛胎児血清を有する市販の
ＲＰＭニー１６４０−培地（Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、第１９９
巻（１９５７）５１９頁に記載〕を使用する。
■：α−アミラーゼ活性活性化用体用クリーニング系 免疫付与されたマウスの血清又はノ１イブリッド細胞の
培養上澄み液又は腹水中のアミラーゼ活性化抗体のき度
を確認するために、スクリーニング評価としてアミラー
ゼ−活性試駿ヲ用いる。その為に９６−エリず（ＩＬＩ
ＳＡ　）プレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に、ａ−衝
剤（トリス−ＨＣｌ５０ミリモル／ｌ、１％牛の血清ア
ルブミン、Ｎａ＋Ｊ　Ｑ、１モル／１ｐ８７．５）中の
膵臓−又は唾液−α−アミラーゼ５０μ！（約４００　
Ｕ／７　）を前取って装入し、被検溶液〔例えば培養上
澄み液、（生理的食塩溶液で）１々に希釈した血清、（
生理的食塩溶液で）ａｌ々に希釈した腹水〕５０μｊと
一緒に２０分間室温で予め恒温保持する。
その後アミラーゼ基質〔α−グリコシダーゼｔｉする４
−ニトロフェニル−マルトへブタオシド；ベーリンガー
マンハイム社（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
　ＧｍｂＨ）　、商品番号５６８５８９）”］５０μｌ
ｌ’ｆｔ用いて酵素反応を開始させる。室温で２０〜６
０分後に吸光を４０５　ｎｍで光度計〔エリデーリーダ
ー（ＩＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒ　）、コン）　：ｙ　（
Ｋｏｎｔｏｎ　）、スイス〕で測定する（値■）。
次の対照を一緒に測定する：新鮮な培地（値…）。活性
は値…に対する％で記載する：この試験系を用いて下記
の結果が得られる。
−次培養の約２％から活性化されたモノクロナール抗体
を見出すことができる。
■：腹水の製造 ハイブリッド維胞（細胞系統（Ｚｅｌｌ−Ｌｉｎｉｅ　
）８６０２０６０１又Ｆｉ８６０２０６０２）１−２Ｘ
１０６を、各々「プリスタン・オイル（Ｐｒ１ｓｔａｎ
　Ｏｌｌ　）　Ｊ　　（シグマ、ミュンヘン、部品番号
Ｔ　７６４０　）　１０．５蝉で１〜２回前処理したバ
ルブ／Ｃマウス（約生後６週間）の腹腔内に注射する。
約１５〜２０日後にマウス１匹当り、−Ｇ約１０〜／　
ｍｌを有する腹水６〜５１１Ｌｌが取出される。
例　　２ ヒトの唾液−α−アミラーゼ及びヒトの膵臓−α−アミ
ラーゼの活性に対する、活性化ＭＡＫｘｃＡｃｃ　８６
０２０６０２及びＥＣＡＯＣ：８６０２０６０１（ＭＡ
Ｋ　Ｎ０ＡＣＣ！　８４１２２００３及びＮＣＡＣＣ８
４１１１３０１との組合せも含めて）の作用物質ニ ーα−アミラーゼに対するエンズアミルに一チーテスト
（ＥｎｚＡｍｙｌ−に−Ｔｅｓｔ　）　ＣＩ’デッヶ（
Ｇｏｅｄｅｃｋｅ　）　、ベルリン；商品番号８、！！
７９０３：］　；基質−アルトチトラ万一ス（Ａｌｔｏ
ｔｅｔｒａｏｓ　）、 −α−アミラーゼ９に対するフェデバスーテスト（Ｐｈ
ａｄｅｂａｓ−Ｔｅｓｔ　）　（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　）、フライデルク；簡品番号５１−５２
２１−００／１　）；基質＝青色に一リンガー　マンハ
イム社、ｍ８８号 −４−二トロフェニルーα−Ｄ−マルトヘンタオシド、
ａ５−ｐＮｐ（イーリンガー　マンハイム社、商品番号
７２０４９６） −４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘキサオシド、
　Ｇ６−ｐＮＰ　（イーリンガー　マンハイム社、商品
番号７２０４８８） ブ ー４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘヘタオシド、
Ｇ、−ｐＮＰ（イーリンガー　マンハイム社、商品番号
７２０．！１７０） −４，６−エチｌＪ　テン−４−ニトロフェニル−（！
　−ｆ）　−−ｒ　ｋトヘプタオシ）’、　ｅｔｈ　Ｇ
７−ｐＮＰ（西「イツ特許出１＠ＤＩ−Ａ第３３２８６
１６号明細書により）造） 一細胞系統”ＣＡＣｊＣ８６０２０６０２、ＥＣＡＣＣ
　８（５０２０６０１、Ｎｃｈｃａ　８４１２２００３
、ＮＣＡＣＣ８４１１１３０１のマウスからの腹水（例
１、ＩＶと同様にして製造） −ヒトの多液−α−アミラーゼ（シグマ、ミュンヘン、
商品番号ＡＯ５２１”） −ヒトの膵臓−α−アミラーゼ［：　Ｄ、Ｊ、ステイー
フェル＜　５ｔｉｅｆｒｌ　）及びＰ、、Ｔ、ケラ−（
Ｋｅｌｌｅｒ　）著（１９７３年）バイオケミ力・工Ｏ
ビオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ａｔＢ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）により製造〕−牛血
撹アルプミン（Ｒ８Ａ　）　（ベーリンガーマンハイム
社、商品番号２３８０３１　）−α−クルコシターセ（
イーリンガー　マンハイム社、商品番号７５０５９０） 試薬： Ａ　：　ＰＢＳ　：燐酸緩衝剤１００ミリモル、Ｎａ０
１１　５　０　　ミ　　リ　モ　ル　、　　ｐ）Ｉ−７
，１Ｂ　、：　ＰＢＳ／Ｒ８Ａ：牛血清アルブミン６％
を有するＰＢＳ Ｃ！：ｈ−８Ａ−溶液：　ＰＢＳ　／　Ｒ８Ａ中のヒト
の唾液−α−アミラーセ′、５０口［Ｊ／Ｉｃ市販の試
薬α−アミラーゼｐｔ＋ｐ自動包装（Ａｕｔｏｍａｔｅ
ｎｐａｃｋｉｎｇ　）　、ペーリンガー社、商品番号５
６８５８９を用いて２５°Ｃで測定〕 Ｄ　：　ｈ−ｐＡ−浴液：　ＰＢＳ　／　ＢＳＡ甲のヒ
トの膵臓−α−アミラーセ゛５００　Ｕ／　ｌ　（ｈ−
ｓＡ−溶液と同様に測定） Ｅ：アミラーゼ−試薬（各々ｐＮＰ基質を用いて）：ペ ヘーメス（Ｈｅｐｅｓ　）　−ｔｊ、衝剤（ｐ！（７，
１）１００ミリモル／１ ＮａＣｊ？　　　　　５　０　　ミ　リ　モル／　１ｐ
ＮＰ基質（基質各１ａ類）５ミリモル／ｌα−グルコシ
ダーゼ　　３０Ｕ／Ｊ Ｆ：腹水希釈物二種々の腹水をＰＢＳ　／　Ｒ８Ａを用
いて各々１＋５０に希釈する。
実施 １、　腹水からのＭＡＫ　ｉ有するアミラーゼの調製−
アミラーゼ（ｈ−８Ａ又はｈ−ＦＡ）１００μｌを種々
の腹水希釈物（１ａ［又は数ｍ）１０μノと混合し、Ｐ
ＢＳ　／　ＲＥＩＡで２００μｌにする。
対照として、ＰＢＳ　／　Ｒ８Ａで増分しただけのアミ
ラーゼを用いる。
一混合物を５分間室温で恒温保持する。
２、基質Ｇ４ヲ用いるアミラーゼ活性の測定−アミラー
ゼ’　／　ＭＡＫ混合物もしくは相応する対照のアミラ
ーゼ活性の測定は、デデツケ・エンズアミルに一テスト
ヲ用いて２５℃でその指示に正確に従って行う。
３、高分子基質を用いるアミラーゼ活性の測定−アミラ
ーゼ／　ＭＡＫ混合物又は相応する対照のアミラーゼ活
性測定は、ファルマシア社のファデバスーテストを用い
その指示に正確に従って行う。
４、　　ＰＮＰ−基質を用いるアミラーゼ活性の測定−
アミラーゼ試薬Ｅ１−を半微量キュベツト（Ｈａｌｂｍ
ｉｋｒｏｋ’ｕｖｅｔｔｅｎ　）中で２５°Ｃの温度に
する。
−アミラーゼ／　ＭＡＫ混合物もしくは対照各５０μｌ
をこれに加えて、良く混合する。
分 一吸光度変化ΔＥ／令の測定をアミラーゼ−ＭＡＫ−添
加後６〜７隘間の間にＡ　Ｑ　５　ｎｍで行う。
計算 １、Ｇ４−基質及び高分子基質 −１７当りの本位（Ｕ／ｌ）として得られるアミラーゼ
゛／　ＭＡＫ混合物のアミラーゼ活性を同じ基質の対照
（ＭＡＫなし）の相応するアミラーゼ活性に関連させて
、％値として記載する。
物のアミラーゼ活性を、同じｐＮＰ基質の対照（ＭＡＫ
なし）の相応するアミラーゼ活性に関連させて、力値と
して記載する。
結果 唾液−及び膵臓アミラーゼの活性に対するモノクロナー
ル抗体の影響を種々の基質におけるＭＡＮなしの活性に
対する活性（％値）として第１表に総括する。
例　　３ モノクロナール抗体ＥｃＡｃｃ　８６０２０６０１及び
ｋＯＡＯｃ　８６０２０６０２含有及び不含のヒトの膵
臓−α−アミラーゼによるＧ、−ｐＮＰ及びｅｔｈ　Ｇ
７−ｐＮＰの分解壓及び反応速度の測定物質 −４，６−エチリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｉ）
　−フルトヘプタオシド、ｅｔｈＧ、ｙ−ｐＮＰ（西Ｙ
　イツ荷”Ｆ　出Ｍｉ　Ｄ’Ｅ−Ａ第３３２８６１６号
明細書により製造） −４−二トロフェニルーα−Ｄ−マルトヘフタオシド、
ａ−１−ｐＮＰ（イーリンガー　マンハイムＧｍｂＨ１
注文用商品番号７２０４７０）−細胞系統ｘｃｈａａ　
８６０２０６０１の腹水−細胞系統Ｅ（３ＡＣＣ！　８
６０２０６０２の腹水−ヒトの膵臓−α−アミラーゼ（
Ｄ、Ｊ、ステーフェル及びＰ、Ｊ、ケラー著（１９７５
年）ビオケミ力　エト　ビオフイジカ　アクタ第６０２
巻、３４５〜６６１貞により装造〕−十血清アルデミン
（Ｒ８Ａ　）　（イーリンガーマンハイムＧｍｂＨ１商
品番号２３８０３１　）試薬 Ａ　：　Ｈｅｐｅａ緩衝剤１５０ミリモル、Ｎａ０Ａ！
　５０ミ　リ　モル　、　　ＮａＮ３１　　ｍｙ　／　
ｒｎｌ　、　　ｐＨ７，１Ｂ：＊＆塩緩衝剤１００ミリ
モル、Ｎａｃ１１５０ミリモル、６％Ｒ８Ａ　、　ＰＨ
７，１Ｃ：緩衝剤Ｂ中のヒトの膵臓−α−アミラーゼ７
５６Ｕ／Ｊ（市販の試薬−α−アミラーゼｐＮＰ自動包
装、イーリンガー　マンノ−イム社、商品番号５６８５
８９を用い２５°Ｃで測定）、 Ｄ＝モノクロナール抗体ＰｅＡｃｅ８６０２０６０１：
腹水１　＋５０　（Ｂで希釈） Ｅ：モノクロナール抗体ＫＣＡＣＩＣ！　８６０２０６
０２　：腹水１＋５０（Ｂで希釈） Ｆニア七トニトリル２０部、１モル／　ｌ　Ｈ３Ｐ０゜
３部と混合 Ｇ：２５ミリモル／　ｌ　ｘ２ａｐｏ、　１部、ｐ）Ｉ
糟７．１、アセトニトリル１部と混合 Ｈ：Ａ中の５ミリモルのａｔｈ　Ｇ−ｔ　ｐＮＰ工：Ａ
中の５ミリモルの０７−ｐＮＰ 実施 １、　アミラーゼとＭＡＫの混合 −ＭＡＫ溶液り又はＥ又は緩衝剤Ｂ２０μｌ′ｔ−膵臓
アミラーゼＣ２００μｌと混合し、５分間室温で恒温保
持する。
２、　アミラー（？　／　ＭＡＫと基質の反応−基質溶
液（Ｈ又は工）２１Ｒ１を前取って装入し、２５℃の温
度にする。
−ｉ度調整した基質溶液を種々のアミラーゼ／ＭＡＫ（
緩衝剤）混合物（１から）２００μノで反応開始させる
。
一正罹に１．３．５．７，１０．２０．３０分後に、開
始させた基質溶液公告２００μｊｉｔ−取出し、停止試
薬Ｆ’１３０μｊに添加する。
−停止させた基質溶液分を溶液１紅で希釈し、−２０℃
で保存する。
３、基質及びＨＰＬＣ！による基質の分解分（Ｂｒｕｃ
ｈｓｔＭｃｋ　）の測定 −２，からの停止させ、希釈した基質溶液分を溶解させ
る。
−ＧツーｐＮＰもしくはａｔｈｇ７−ｐＮＰの金貸、そ
の際ｐＮＰ及びＧ１−ｐＮＰ　Ａ−０６−ｐＮＰの含量
（個々の基質溶液分の）をＨＰＬＯによってＥ、−０，
ヘーデレ（Ｈ’ａｇｅｌＪ　）その他！（１９８２年）
　（’ｍｉｎ。
Ｃｈｅｍ、　２８／１１巻、２２０１〜２２０５頁に記
載されている様にして測定する。
結果 ・　アミラーゼと基質との反応が進むにつれて、基質の
含量が減少する。第２表にＭＡＫ不含の並びにＭＡＫ　
ｎａｈｃａ　８６０２０６０１及びＫＯＡＯＯ８６０２
０６０２含有の両方の基質に関するミリモル／（１分）
を表わす。更に、ＭＡＫ含有膵臓アミラーゼの活性値を
、ＭＡＫ不含活性値に対して規格化して表わす。この反
応で遊離ｐＮＰ、Ｇ１−ｐＮＰ、並びに０５−ｐＮＩ’
及びＧ６−ｐＮＰは生じない。その他の分解分の％数も
第１表にまとめる。
第１図〜第６図は、ＭＡＫを含有及び不含の基質として
の０７−ｐＮＰに関する膵臓アミラーゼ反応における基
質の減少速度及び生成物の増加を示している。
例　　４ 基質マルトヘプタオースのｆｌｕのＭＡＷ　ＥＯＡＣＯ
８６０２０６０１及び１１！０ＡＯＯ８６０２０６０２
によるヒトα−アミラーゼの活性化 物質ニ ーモノテスト（Ｍｏｎｏｔｅｓｔ　）　ａ−アミラーゼ
ＵＶ（イーリンガー　マンハイム社、マンハイム、商品
番号２４０００１　） 一細胞系統ｗｃｈｃｃ　８６０２０６０２又はｍｃＡｃ
ｃ８６０２０６０１のマクスからの腹水（例１による） 一ヒトの唾液−α−アミラーゼ（シグマ、ミュンヘン、
商品番号ＡＯ５２１’） −ヒトの膵臓−α−アミラーゼ（Ｄ、Ｊ、ステー７エル
及びＰ、Ｊ、ケラー著（１９７３年）ビオケミ力・工・
ビオフイジカゆアクタ第３０２巻、３４５〜３６１頁に
より鞄造） −牛血清アルブミン、　ＲＳＡ（イーリンガー　マンハ
イム社、商品番号２３８０３１　’）試薬 Ａ　：　ＰＢＳ　／ＲＢＡ　：燐酸塩緩衝剤１００ミリ
モル／ｌ、Ｎａ（’ｌ　　　１５０　　　ミ　　リ　％
　　ｋ　　／　　ｌ　　、　　　ＲＳＡ　　６　％　　
、−７，１ Ｂ：ｈ−８Ａ−溶液：　ＰＢＳ　／　ＲＳＡ中のヒトの
唾液−α−アミラーゼ５０００／Ｊ（’２５℃で市販の
１ｉｉｔ［−α−アミラーゼＰＮＰ自動包装、イーリン
ガーマンハイム社、カタログ番号５６８５８９を用いて
測定） ａ：ｈ−ＰＡ−溶液：　ＰＢＢ　／　ＲＳＡ中のヒトの
膵臓−α−アミラーゼ、５００Ｕ／Ｊ（ｈ−８Ａ−溶液
と同様に測定） Ｄ　：　ＭＡＩＣＩ！１ＣＡｃｅ　８６０２０６０１の
腹水希釈物：腹水１　＋　５０（ＰＢ８／Ｒ８Ａで希釈
）ｘ　：　ＭＡＫ　ｚｃｈｃａ　８６０２０６０２の腹
水希釈物：腹水１　＋５０　（ｐＢｓ７ｘｓｈで希釈）
実施 一α−アミラーゼ及びＭＡＫもしくは緩衝剤を下記要領
により混合する： 試料Ｉ〜■を１０分間室温で恒温保持する。
−試料■〜■の活性を２５°Ｃでモノテスト−α−アミ
ラーゼＵＶを用いて正確にその指示に従って測定する。
計算 ＭＡＷ　／アミラーゼ混合物（試料■〜■）の測定活性
をアミラーゼ／Ｍ衝剤混合物（試料Ｉ及び試料ＩＩ）の
相応する活性ｋｌＮ達させて、％値として表わす（試料
■及び■は試料Ｉに関係づけ、試料■及び■け試料■に
関係づける）。
結果 ヒトの唾液−及び膵臓−α−アミラーゼに対するモノク
ロナール抗体及び緩衝剤の影響？下記表に表わす： 例　　５ 融合物の培養上澄み液又はマウスの腹水又は血清〔ヒト
のα−アミラーゼＮｒ、ｌ、■、■及びＶの工ｔ　）　
−ｆ　（Ｋｐｉｔｏｐ　）を検出しない〕からのモノク
ロナール抗体のスクリーニング系アミラーゼ−活性化Ｍ
ＡＫのスクリーニング用の次の実施例は、検査用にＭＡ
Ｋの活性化特性を利用する。アミラーゼは少なくとも５
種類のエピトープを有するものと考えられる。これらの
全てのエピトープにＭＡＮは同時に結合することができ
、エピトープ■は活性作用及び分解型変形作用を有する
ＭＡＫと結合するエピトープである。
物質ニ ー年からのマウスＦｃ　−７−７ラグメントに対するポ
リクロナール抗血清 一牛血消アルデミン（Ｒ８Ａ　）　（イーリンガーマン
ハイム社、マンハイムＨ品番号２３８０３１　）−ヒト
の唾液−α−アミラーゼ−オランダガラシーペルオキシ
ダーゼ−複合体（ｈ−８Ａ翼ＰＯＤ）　；Ｍ、Ｂ、ウイ
ルン７　（Ｗｉｌｓｏｎ　）及びＰ、に、ナカ　　。
ム（Ｎａｋａｍ　）　Ｃイムノフルオレッセンス・アン
ド・リレイテツド・ステイニング・テクニークス（工ｍ
ｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎａａ　ａｎｄ　Ｒｅｌａ
ｔｅｄＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）　
Ｗ、クナツプ（ｌ１ａｐｐ　）　　　−他、Ｅｄ８０、
エルセピア／−ノースーホランダΦバイオメゾカル・プ
レス（Ｅ：Ｌｓｅマｉｅｒ　／−Ｎｏｒｔｈ　−Ｈｏ１
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　。
Ａｍｇｔｅｒ改ａｍ　−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）、１９７
８．２１５〜２２４頁中〕によりヒトの唾液−α−アミ
ラーゼ（シグマ、ミュンヘン、商品番号ＡＯ５２１）及
びオランダガラシーペルオキシダーゼ（イーリンガーマ
ンハイム社、マンハイム、商品番号２３８０３１　’） −ハイブリッド細胞クローンＮ０ＡＣ！０８４１１１３
０１の培地上澄み液 一ハイフリツｙ細胞ｐ　ロー　ンＮａＡｃｃ８４１１１
３０１から製造したモノクロナール抗体のＦａ’に？−
フラグメント（アミラーゼエピトープＩに対するＭＡＫ
　） 一ハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣＣＢ、ａｉ　２２
００３により履造したモノクロナール抗体のＦａｂ’　
−７ラグメント（アミラーゼエピトープＩＩｋ対するＭ
ＡＫ） 一／Ｓイフ＋）ツＩ−”細胞クロー　ンＮＧＡＯＣ８５
０２２２０３によって製造したモノクロナール抗体のＦ
ａｂ’−フラグメント（アミラーゼエピトープ■に対す
るＭＡＫ　） 一ハイブリッド細胞りローンｖｃＡｃｃ８６０６０６０
１（１１５０９）によって製造したモノクロナール抗体
のＦａｄ−７ラグメント（アミラーゼエｆ）−ｆＶに対
するＭＡＫ　） −ＫＬ工Ｓ、Ａ−プレート〔ヌンク（Ｎｕｎｃ　）、ロ
スキルデ（Ｒｏｓｋｉ’ｌｄｅ　）　、デンマーク〕−
ＡＢＴＳ■：２，２−アジノージ−〔６−エチルベンズ
チアゾリンスルホネート（６）　）　（べ一すンガーマ
ンハイム社、商品番号１０２９４６　”）−メルク（Ｍ
ｅｒｃｋ　）　、　タルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ　）又はイーリンガー　マンハイム社の高純度の薬
品 −ＥＬＩＳＡプレート用の保護シート：フレートφシー
ラーズ（Ｐｌａｔｅ　５ｅａｒｅｒｓ　）商品番号Ｍ３
０〔ダイナチック・ドイチュランド社（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ　Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ　ＧｍｂＨ）　、デンケン
ドルフ（Ｄｅｎｋｅｑｄｏｒｆ　）　〕種々のモノクロ
ナール抗体のＦａｂ’−フラグメントの製造は次のよう
にして行った： 先ず種々のハイブリッド細胞クローンの腹水を（例１／
ＩＶと同様）製造した。腹水から、分別した硫酸アンモ
ニウム沈澱及びジエチルアミノエチルセルロース−カラ
ム〔Ａ、ジョンスト−７（Ｊｏｂｎｅｔｏｎｅ　）及び
Ｒ，ソーペ（Ｔｈｏｒｐｅ　）による：イムノケミスト
リーΦイン・プラクテイス（工ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　）、ブラックウェル
・サイアンティフィック・バブリケーションズ（Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ　）、オツクスフオー（＊　　ｏ　ｙトノ々　
ラ ンーエジンズ※爽−ボストンーメルボルン１．（，５！ １９８２．４３〜４７頁〕を用いてモノクロナミール抗
体ｔａ製した。抗体ｔ　Ｆ’ａｂ’−フラグメントに分
解することは、Ａ、二ノノフ（Ｎ１ａｏｎｏｆｆ　）〔
メソツズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　）　Ｍｅｄ−Ｒｅｓ、　１
　Ｑ巻、１６４頁以降（１９６４年）〕により行った。
試薬： Ａ：炭酸ナトリウム緩衝剤、５０ミリモル。
ｐ）１９．３、マウスＦｃ−γ−７ラグメントに対する
ヒツジのポリクロナール抗体 １０μｌ／ＩＩＬｌｋ含有する〔ポリクロナール抗血清
から硫酸アンモニウム沈澱及びジエチルアミンエチルセ
ルロースクロマトグラフィーを用いて精製（Ａ、ジョン
ストーン及ヒＲ，ソーづ：イムノケミストリーーイン・
°−“　　　　プラクテイス、ブラックウェル・サイア
ンティフィック・パブリケーションズ、オツノ々　ラ クスフオードーロンドンーエジン％Ｆ　％　Ｋ　−ｔボ
ストンーメルボルン、１９８２．４３〜４７貞）〕 Ｂ　：　ＰＢＳ／Ｒ８Ａ　：　燐酸塩１００ミリモル、
Ｎａ０Ｊ１５０ミリモル、−一７．１、ウシ血清アルブ
ミン（Ｒ８Ａ　）　１％を含有 ０：ｈ−ＥＩＡ−ＰＯＤ　　２００工Ｕ／ｌ　（ペルオ
キシダーゼ単位）及び〔ハイブリッド細胞クローンＮ０
ＡＣ○８４１１１３０１．８４１２２００３．８５０２
２２０３及びｒ＝ｃＡｃｃ　８６０６０６０１（７６０
Ｂ＞の）　ｄ　Ｆａｂ’−７ラグメント各１００μｇｌ
Ｉｌｌを有する試薬Ｂ；ｉｇ、は使用する１時間前にｖ
！４表する。
Ｄ：ペルオキシダーゼ−基質溶液：燐酸塩−クエン酸塩
−緩衝剤１００ミリモル、ｐＨ−、ｉ、４、過鈴縁ナト
リウム６．２ミリモル及びＡＢＴ、■１．９ミリモル。
Ｅ　：　ＰＢＳ：燐酸塩緩衝剤１００ミリモル、Ｎａ（
Ｊｌ　５０ミリモル、…＝７６１ 実施： １、　　ＫＬ工ＳＡ−プレートの各斑点に試薬Ａ各１０
０μｌをピペットで滴加する。プレートを保仰シートで
密封し、１８時間４°Ｃで恒温保持する。
２、プレートの各斑点を試薬Ｅ少なくとも２５０μｌで
３回洗浄する（室温、各々約５分間）。
３、　プレートの各斑点を試薬Ｂ２５０μ！と一緒に恒
温保持する（保護シート；室温、１時間）。
４、　プレートの各斑点を２に記載したようにして洗浄
する。
５．　　＊々のハイブリッド細胞クローンの上澄み又は
免疫処理したマウスの腹水又は血清を、希釈せずに、か
つ／又Ｆｉａ々の希釈度で（試薬Ｂで希釈）プレートの
種々の斑点中にピペットで入れる（各々１００μｌ）。
プレートを゛ど封し、２時間３７°Ｃ−で恒温保持す石
。盲検値として試薬Ｂと一緒にのみ恒温保持した斑点を
用いる。堪性の対照としてハイブリッド細胞クローンＮ
ｃｈａｃ　８３１１１３０１の培養土ザみを用いる。
６、　　ｆレートの各斑点を２に記載したようにして洗
浄する。
Ｚ　プレートの各斑点を試薬Ｃ（アミラーゼ−ＰＯＤ−
複合体＋Ｆａｂ’−フラグメント）１００．ｃｌと一緒
に恒温保持する（保護シート；６７℃、２時間）。
８、プレートの各斑点を試薬Ｅで６回洗浄する（少なく
とも２５０μ！、室温、各々約２分間）。斑点を揚水ポ
ンプ及び微細なガラスカニユーレにより吸引乾燥する。
９　その後直ちにプレートの各斑点に試薬Ｄ１００μｌ
’ｊｒ：加える。プレートを保護／−トで密封し、３７
°Ｃで恒温保持する（約１５〜６０分、検査すべきＭＡ
Ｋの濃度による）。
評価： ＥＬ工ＳＡ−プレートの１面々の斑点の吸光度を保護シ
ートを取除いた後にＥＬ工ＳＡ　−ＩＪ−ダー（コント
ロン、スイス）で測定する。盲検値（試薬Ｂのみ）の吸
光度をＭＡＫを有するその他の斑点の吸光から引く。
アミラーゼのエピトープ■に対する抗体で被覆した斑点
け、ハイグリッド細胞クローンＮ０ＡＣＩＣ！　８．ｉ
　１１１３０１の培養上澄みで被覆した斑点よりも著し
く高い吸光度を示す。吸光度の相違は少なくとも２００
　ｍＫである。
この様にしてアミラーゼのエピトープｌＶｔ−検出する
全てのＭＡＫが確実に見出される。このＭＡＫは意外に
もアミラーゼを活性化しくすなわち分解速度を促進し）
、場合により基質の分触型を変える特性を有する。
【図面の簡単な説明】
添付図面第１図は第２表におけるＭＡＩＩｍ不含の場合
の基５！ｉ　Ｇ、−ｐＮＰに関する膵臓アミラーゼ反応
における基質の減少速度及び生成物の増加を表わすグラ
フ図であり、第２図はＭＡＫ　ＢＯＡＯＯ／％８６０２
０６２を含有する場合の図、第３図はＭＡＸ　ｗｃＡａ
ｃ　／１６８６０２０６１を含有する場合の図である。 ＦＩＧ、１ １＋、、ｊ’Ｉｌｌ採持！丁、ｌ＋４４．こつｒ］ＦＩ
Ｇ、２ ＦＩＧ、３

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、基質を１種又は数種の助酵素の存在で分解し、分解
    生成物を測定することによつてα−アミラーゼを測定す
    る方法において、反応をα−アミラーゼに対するモノク
    ロナール抗体の存在で行うことを特徴とする、α−アミ
    ラーゼの測定法。 ２、基質として、場合によつて発色団により置換されて
    おりかつ／または少なくとも１個のエチリデン保設基を
    有するグルコース単位２〜１０個を有するＤ−マルトオ
    リゴシドを使用する、特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。 ３、グルコース単位４〜８個を有するＤ−マルトオリゴ
    シドを使用する、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、発色団としてニトロフェニル基を有するＤ−マルト
    オリゴシドを使用する、特許請求の範囲第２項又は第３
    項のいずれか１項に記載の方法。 ５、助酵素としてα−グルコシダーゼを添加する、特許
    請求の範囲第２項から第４項までのいずれか１項に記載
    の方法。 ６、基質としてマルトヘプタオースを、かつ付加的な助
    酵素としてα−グルコシダーゼの他になおヘキソキナー
    ゼ及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
    を使用する、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、その他の助酵素としてα−グルコーシダーゼと並ん
    でなおβ−グルコシダーゼを使用する、特許請求の範囲
    第４項及び第５項のいずれか１項に記載の方法。 ８、基質としてマルトテトラオースを、かつ助酵素とし
    てマルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムター
    ゼ及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
    を使用する、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ９、ハイブリッド細胞クローンＥＣＡＣＣ ８６０２０６０１又はＥＣＡＣＣ８６０２０６０２から
    生成されるモノクロナール抗体を使用する、特許請求の
    範囲第１項から第８項までのいずれか１項に記載の方法
    。 １０、両方のα−アミラーゼイソ酵素の１つを測定する
    ために、付加的に、各々その他のα−アミラーゼイソ酵
    素を特異的に抑制するモノクローナル抗体を使用する、
    特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれか１項に
    記載の方法。 １１、唾液−α−アミラーゼを特異的に抑制するモノク
    ローナル抗体としてハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣ
    Ｃ８４１２２００６により生成された抗体を単独で又は
    ハイブリッド細胞核ＮＣＡＣＣ８４１１１６０１により
    生成された抗体と一緒に使用し、膵臓−α−アミラーゼ
    を測定する、特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、ハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣＣ８４１１１
    ３０１、ＲＣＡＣＣ８４１２２００３、ＮＣＡＣＣ８５
    ０２２２０２及びＥＣＡＣＣ８６０６０６０１から生成
    されるモノクローナル抗体の存在で、α−アミラーゼと
    結合するモノクローナル抗体を使用する、特許請求の範
    囲第１項から第１１項までのいずれか１項に記載の方法
    。 １３、基質、１種以上の助酵素及び分解生成物を測定す
    るための系を含有するα−アミラーゼ測定用試薬におい
    て、α−アミラーゼに対するモノクロナール抗体少なく
    とも１種類を含有することを特徴とする、α−アミラー
    ゼ測定用試薬。 １４、ハイブリッド細胞クローンＥＣＡＣＣ８６０２０
    ６０１又は／及びＥＣＡＣＣ８６０２０６０２によつて
    生成されるモノクロナール抗体を含有する、特許請求の
    範囲第１３項に記載の試薬。 １５、基質として、場合により発色団によつて置換され
    ておりかつ／又は少なくとも１個のエチリデン保護基を
    有する、グルコース単位２〜１０個を有するＤ−マルト
    オリゴシドを含有する、特許請求の範囲第１６項又は第
    １４項のいずれか１項に記載の試薬。 １６、基質がグルコース単位４〜８個を含有する、特許
    請求の範囲第１５項に記載の試薬。 １７、マルトオリゴシドが発色団としてニトロフェニル
    基を含有する、特許請求の範囲第１５項又は第１６項に
    記載の試薬。 １８、助酵素としてα−グルコシダーゼを含有する、特
    許請求の範囲第１５項から第１７項に記載の試薬。 １９、基質としてマルトヘプタオースを、かつ助酵素と
    してα−グルコシダーゼ、ヘキソキナーゼ及びグルコー
    ス−６−燐酸脱水素酵素を含有する、特許請求の範囲第
    １８項に記載の試薬。 ２０、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼを含
    有する、特許請求の範囲第１７項又は第１８項のいずれ
    か１項に記載の試薬。 ２１、基質としてマルトテトラオースを、かつ助酵素と
    してマルトースホスホリラーゼ、β−ホスホグルコムタ
    ーゼ及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
    ゼを使用する、特許請求の範囲第１５項に記載の試薬。 ２２、α−アミラーゼイソ酵素に対するモノクローナル
    抗体を含有する、特許請求の範囲 第１６項から第２１項までのいずれか１項に記載の試薬
    。 ２３、ハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣＣ８４１２２
    ００６によつて生成される唾液−α−アミラーゼに対す
    るモノクロナール抗体を含有する、特許請求の範囲第２
    ２項に記載の試薬。 ２４、付加的に、ハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣＣ
    ８４１１１３０１によつて生成される、唾液−α−アミ
    ラーゼに対するモノクロナール抗体を含有する、特許請
    求の範囲第２６項に記載の試薬。 ２５、付加的にハイブリッド細胞クローンＮＣＡＣＣ８
    ５０２２２０３又は／及び ＥＣＡＣＣ８６０６０６０１によつて生成される唾液−
    α−アミラーゼに対するモノクロナール抗体を含有する
    、特許請求の範囲第２３項又は第２４項のいずれか１項
    に記載の試薬。
JP62155650A 1986-06-25 1987-06-24 α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬 Expired - Lifetime JPH0710238B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3621271.7 1986-06-25
DE19863621271 DE3621271A1 (de) 1986-06-25 1986-06-25 Verfahren und reagenz zur bestimmung von alpha-amylase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS637798A true JPS637798A (ja) 1988-01-13
JPH0710238B2 JPH0710238B2 (ja) 1995-02-08

Family

ID=6303661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62155650A Expired - Lifetime JPH0710238B2 (ja) 1986-06-25 1987-06-24 α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4945043A (ja)
EP (1) EP0251195B1 (ja)
JP (1) JPH0710238B2 (ja)
AT (1) ATE85363T1 (ja)
DE (2) DE3621271A1 (ja)
ES (1) ES2053472T3 (ja)
GR (1) GR3007698T3 (ja)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3500526A1 (de) * 1985-01-09 1986-07-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Spezifisch hemmender s-amylase-mak
US5043436A (en) * 1986-11-20 1991-08-27 Kurita Water Ind., Ltd. Substrate for measurement of alpha-amylase activity
DE3903114A1 (de) * 1989-02-02 1990-08-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung
DE3929355A1 (de) * 1989-09-04 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase
JP2576910B2 (ja) * 1990-04-13 1997-01-29 富士写真フイルム株式会社 免疫分析要素および免疫分析方法
US20050209121A1 (en) * 1990-12-05 2005-09-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US6967080B1 (en) * 1990-12-05 2005-11-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
JP2770891B2 (ja) * 1991-06-26 1998-07-02 キッコーマン株式会社 マルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法
US5334502A (en) * 1991-11-27 1994-08-02 Osborn Laboratories, Inc. Method of collecting, identifying, and quantifying saliva
CA2121361C (en) * 1991-11-27 1997-03-04 Jangbir S. Sangha Apparatus and method of saliva collection and verification for dried saliva spot drug and hiv antibody testing
US5914241A (en) * 1993-01-19 1999-06-22 Biosite Diagnostics, Inc. Assays and kits for detecting analytes in the presence of cross-reacting substances
JP3124435B2 (ja) * 1993-10-20 2001-01-15 キッコーマン株式会社 α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法
JPH11299498A (ja) * 1998-02-19 1999-11-02 Toyobo Co Ltd アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬
CN110951824B (zh) * 2019-11-15 2023-08-11 中山市创艺生化工程有限公司 一种复合缓冲体系在制备α-淀粉酶测定试剂盒中的应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT362526B (de) * 1977-09-13 1981-05-25 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha- -amylase
US4304854A (en) * 1978-06-06 1981-12-08 Worthington Biochemical Corporation Alpha-amylase assay and substrates for use therein
US4493890A (en) * 1981-03-23 1985-01-15 Miles Laboratories, Inc. Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays
US4446233A (en) * 1982-05-05 1984-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Homogeneous immunoassay using covalent hybrid antibodies
DE3328616A1 (de) * 1983-08-08 1985-02-28 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Oligoglucosidderivate
US4649108A (en) * 1984-07-26 1987-03-10 Genzyme Corporation Alpha amylase assay
DE3500526A1 (de) * 1985-01-09 1986-07-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Spezifisch hemmender s-amylase-mak
DE3508384A1 (de) * 1985-03-08 1986-11-06 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper
DE3525926A1 (de) * 1985-07-19 1987-01-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase
FR2721019B1 (fr) * 1994-06-14 1996-09-06 Rhone Poulenc Chimie Procédé de séparation de diacides aliphatiques à partir de leurs mélanges avec l'acide adipique.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0251195A2 (de) 1988-01-07
EP0251195A3 (en) 1990-12-05
ATE85363T1 (de) 1993-02-15
DE3621271A1 (de) 1988-01-07
JPH0710238B2 (ja) 1995-02-08
DE3783957D1 (de) 1993-03-18
EP0251195B1 (de) 1993-02-03
GR3007698T3 (ja) 1993-08-31
US4945043A (en) 1990-07-31
ES2053472T3 (es) 1994-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS637798A (ja) α−アミラ−ゼの測定法及び測定用試薬
JPH0350222B2 (ja)
JPH0417640B2 (ja)
Meites et al. Amylase isoenzymes
US5071744A (en) Process and monoclonal antibody for the specific determination of pancreatic α-amylase in the presence of salivary α-amylase
US4939082A (en) Process and monoclonal antibody for the specific determination of pancreas alpha-amylase in the presence of saliva alpha-amylase
KR910008637B1 (ko) 심근 미오신 중사슬에 대한 단일클론항체
US4237044A (en) Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof
FI86441C (fi) Foerfarande och reagens foer specifik bestaemning av bukspottkoertelns alfa-amylas.
JP4828752B2 (ja) サイクリン／ｃｄｋ複合体のリン酸化酵素活性測定方法
Heacock et al. Reduction of adrenochrome with ascorbic acid
Dalal et al. Laboratory evaluation of a chromogenic amylase method
JPH06315399A (ja) α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法
JPS58183098A (ja) アイソザイム分別定量法
JPH0515392A (ja) 前立腺由来酸性ホスフアターゼに対するモノクローナル抗体、それを用いた測定法及び測定用キツト
JPH09328500A (ja) 膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定法
Moss Electrophoresis of human alkaline and acid phosphatases
JPH058678B2 (ja)
JPH0235098A (ja) モノクローナル抗体及び該抗体を用いるヒトアルカリホスフアターゼアイソザイムの免疫活性測定法
JPS61286753A (ja) モノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定方法およびそのためのキツト
JPH0346116B2 (ja)
JPH0643167A (ja) 癌マーカーであるテネイシン及びその定量法
Marshall Hypoxia and angiogenesis in colorectal liver metastases
JPH085919B2 (ja) 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法
JPH0195799A (ja) モノクローナル抗体および免疫化学的測定方法