JPH0416745B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物、特に人間の体液中の抗原の存在
を検出する方法及びこれに用いる装置・並びに抗
体の存在を検出する方法及びこれに用いる装置に
関する。 免疫反応による診断試験は体液抗原、ホルモ
ン、病原体及び血清抗体の検出に用いられてい
る。免疫検定法（イムノアツセイ）は一般に大別
して次の２つの方法に分類される。第一の方法に
は、抗体−抗原沈降試験法例えば放射免疫拡散
法、血球凝集反応法及び被覆したラテツクス粒子
の凝集反応法がある。第二の方法には、標識した
試薬試験法例えば放射線免疫検定法（ラジオイム
ノアツセイ）及び酵素結合免疫検定法がある。 沈降型の免疫検定試験法は手作業で実施し得る
という利点を有し、肉眼で読める使い捨て用具と
して商業的に用いられ、格別の器具を要しない。
沈降型免疫検定法からの解読は、供試試料又は競
合抗原の一連の既知希釈法の各々で凝集反応の有
無として通常表わされる。沈降型試験法の欠点
は、該試験では標識した試薬検定法よりも感作性
がずつと低く、時間のかゝる反応操作を必要と
し、且つ沈降反応の肉眼による識別において主観
的な錯誤を受け易いということである。 標識した試薬による免疫検定法（イムノアツセ
イ）は定量的で高度に感作性であるが、それでも
なお或る欠点を有する。放射線免疫検定法では放
射性トレーサーを用いるのでγ線の検出装置を必
要とする。放射性トレーサーは貯蔵寿命が短か
く、技術者に健康障害を生起し、法的規制を受け
ている。酵素結合免疫抗体吸着検定法［（enzyme
−linkedimmunoabsorbant assay（ELISA）］で
は酵素で標識した試薬を用いる。この酵素は、容
易に測定し得る（例えば発色により）生成物を生
ずる基質との反応により検出する。ELISA法で
は放射生物質を必要とせず、貯蔵寿命の長い試薬
を用いる。 ELISA検定法はプラスチツク製液溜めの底部
の如き個相支持体に対照試薬を結合することから
始める。供試流体を酵素で標識した試薬と混合
し、該流体を前記の結合対照試薬と反応させる。
多数の希釈、反応及び洗浄操作（14回程の多数の
操作）を介して、結合試薬及び遊離試薬が分離さ
れ、着色反応を開始する。種々の段階希釈法で形
成させた発色の強さは定量的な尺度を与える。標
準的なELISA法は、実施するのに４〜12時間要
する。 従つて、ELISA法の主たる欠点は、多数の希
釈、反応及び洗浄操作であり、これは時間がかゝ
り錯誤を受け易い。 本発明の装置は、前記した型式の検定法に伴な
う多数の障害を克服するのに用いるものである。
詳しく言えば、本発明の装置を用いることによ
り、希釈操作や洗浄操作を必要とせずしかも反応
操作が１回で短期間に検出し、測定できる
ELISA法が得られる。この本発明による検定は、
供試流体に直接暴露した時に発色反応を形成する
乾燥層状試片の形である。この試片は定量に必要
な希釈操作が自動的に実施され、遊離抗体から結
合抗体が分離される。発色反応は肉眼で読み取る
ことができ、あるいは分光光度計の如き器具を用
いて読み取ることができる。更には、本発明の装
置は細片形に形成でき且つ薬剤又は尿中のホルモ
ンの如き抗原を迅速に検出する浸漬棒
（dipstick）として用い得る。本発明の装置の特
定の応用例は、救急室での薬剤過量を迅速に検出
するものであり、あるいは家庭での妊娠試験とし
て用いるものである。 第１の層と第２の層と第３の層とを有してなる
繊維質積層体からなる生物液中の抗原の存在を検
出する装置であつて、前記積層体中の第１の層
が、試験される前記抗原と免疫学的に反応して保
護酵素結合抗体一抗原・複合体を生成し得る酵素
結合抗体を含有するものであり；前記第２の層
が、該第２の層に結合され固定された抗原であつ
て前記第１の層で反応しなかつた酵素結合抗体と
免疫学的に反応し得る抗原を含有するものであ
り；且つ前記第３の層が、前記の酵素結合抗体−
抗原・複合体に結合されている酵素と反応して前
記体液中の抗原の存在を示す発色反応を生じうる
物質を含有するものであることを特徴とする生物
体液中の抗原の存在を検出する装置が提供され
る。 本発明の別の要旨によると、生物体液中の抗原
の存在を検出する方法において、第１の層と第２
の層と第３の層とを有してなる繊維質積層体から
なる装置であつて、前記第１の層が、試験される
前記抗原と免疫学的に反応して保護酵素結合抗体
−抗原・複合体を生成し得る酵素結合抗体を含有
するものであり、前記第２の層が、該第２の層に
結合され固定された抗原であつて前記第１の層で
反応しなかつた酵素結合抗体と免疫学的に反応し
得る抗原を含有するものであり且つ前記第３の層
が、前記の酵素結合抗体−抗原・複合体に結合さ
れている酵素と反応して前記体液中の抗原の存在
を示す発色反応を生じうる物質を含有するもので
ある装置を用いて、この装置の前記第１の層に抗
原の存在を試験すべき体液を接触させ；前記の体
液を前記繊維質装置に浸透させ；次いで前記第３
の層における発色変化の有無を観察しそれによつ
て前記体液中の抗原の有無を検出することからな
ることを特徴とする、体液中の抗原の存在を検出
する方法が提供される。 また、本発明のさらに別の要旨によると、第１
の層と第２の層と第３の層とを有してなる繊維質
積層体からなる生物体液中の抗体の存在を検出す
る装置であつて、前記の積層体中の第１の層が、
試験される前記抗体と免疫学的に反応して保護酵
素結合抗原−抗体・複合体を生成し得る酵素結合
抗原を含有するものであり；前記第２の層が、該
第２の層に結合され固定された抗体であつて前記
第１の層で反応しなかつた酵素結合抗原と免疫学
的に反応し得る抗体を含有するものであり；且つ
前記第３の層が、前記の酵素結合抗原−抗体・複
合体に結合されている酵素と反応して前記体液中
の抗体の存在を示す発色反応を生じ得る物質を含
有するものであることを特徴とする生物体液中の
抗体の存在を検出する装置が提供される。 また、本発明のさらにまた別の要旨によると、
生物体液中の抗体の存在を検出する方法におい
て、第１の層と第２の層と第３の層とを有してな
る繊維質積層体からなる装置であつて、前記積層
体中の第１の層が、試験される前記抗体と免疫学
的に反応して保護酵素結合抗原−抗体・複合体を
生成し得る酵素結合抗原を含有するものであり、
前記第２の層が、該第２の層に結合され固定され
た抗体であつて前記第１の層で反応しなかつた酵
素結合抗原と免疫学的に反応し得る抗体を含有す
るものであり且つ前記第３の層が、前記の酵素結
合抗原−抗体・複合体に結合されている酵素と反
応して前記試料液中の抗体の存在を示す発色反応
を生じ得る物質を含有するものである装置を用い
て、この装置の前記第１の層に抗体の存在を試験
すべき体液を接触させ；前記の体液を前記繊維質
装置に浸透させ；次いで前記第３の層における発
色変化の有無を観察しそれによつて前記体液中の
抗体の有無を検出することからなることを特徴と
する、生物体液中の抗体の存在を検出する方法が
提供される。 本発明を図面を参照して説明する。 第１図は本発明の生物体液中の抗原の存在を検
出する装置の図解図であり、該装置１０は３つの
相異なる層すなわち第１の層１２、第２の層１４
及び第３の層１６により構成される。該装置１０
は図示の如く支持部材２２上に配置してある。第
１の層１２は多孔質材料から形成され、その中に
体液試料中に可溶性であつて試料体液中の抗原と
免疫学的に反応し得る酵素結合抗体２４が分散さ
れている。第２の層１４もまた多孔質材料から形
成され、該材料には酵素結合抗体２４と免疫学的
に反応し得る抗原２６が結合され固定されてい
る。第３の層１６も同様に多孔質材料から形成さ
れ、しかも結合した着色試薬17即ち酵素と反応す
ると発色する物質が含有されている。 第２図は抗原を含有している体液試料に対して
第１図の装置を用いて本発明の方法を実施した際
の図解図である。詳しく言えば、No.28で一般に確
認される体液試料液（抗原３２を含有する）を層
１２の表面３０に施用する。試料液がこのマトリ
ツクス（matrix）を通つて拡散するにつれて、
遊離抗原３２は第１の層１２中において酵素結合
抗体２４と接触して免疫学的に反応して保護酵素
結合抗体−抗原・複合体を生成する。短時間の反
応（incubation）後に、遊離抗原３２によつて認
識部位が飽和された酵素結合抗体すなわち保護酵
素結合抗体−抗原・複合体は、試料液に可溶化し
た状態で第１の層１２から第２の層１４に拡散し
て移行するが、認識部位が飽和されているために
第２の層１４に結合され固定されている抗原２６
とは反応し得ない。従つて、該複合体は試料液と
共に第２の層１４を通つて自由に拡散して第３の
層１６に移行し、そこで該複合体中の酵素と着色
用試薬とが反応して特色のある発色を生じ、施用
した体液試料中に抗原が存在することを示す。 第３図は抗原を含有していない試料液に対して
第１図の装置を用いて本発明の方法を実施した際
の図解図であり、試料液中に抗原が存在しない場
合には何が起こるかを示す図解図である。詳しく
言えば、一般に３４で示した試料液を第１の層１
２の表面３０に施用する。試料液がこのマトリツ
クスの層１２を通つて拡散するにつれて、第１の
層１２中の酵素結合抗体２４が試料液に可溶化し
て第２の層１４に移動し、そこで該抗体２４は第
２の層１４に結合され固定されている抗原２６と
免疫学的に反応して酵素結合抗体−抗原・複合体
を形成して該抗原２６に結合し固定される。従つ
て、酵素結合抗体２４は第３の層１６に拡散移行
し得ないので層１６中の発色試薬１７に到達せ
ず、発色変化は観察されない。勿論これは抗原が
試料液３４中に存在しないことを示している。 第３図は第１図の装置を用いて本発明の方法を
実施した際の図解図であり、供試流体中に抗原が
ない場合には何が起こるかを示す図解図である。
詳しく言えば、一般に３４で示した流体を層１２
の表面３０に施用する。流体がこのマトリツクス
の層１２を通つて拡散するにつれて、酵素結合抗
体２４は可溶化して層１４に移動し、そこで該抗
体２４は結合抗原２６と係合しこれに結合され
る。従つて酵素結合抗体は層１６（第２の帯域２
０）中の発色試薬１７に到達せず、発色変化は観
察されない。勿論これは抗原が流体３４中に存在
しないことを示している。本発明はELISA型の
試薬を実施するための改良した方法である。免疫
検定の試薬を３つの相異なる試片に含浸させる。
試験すべき液体試料を試片に受動的に拡散させ
る。酵素基質を収容する第３の層に最終的に到達
する酵素結合抗体の量は試料中の試験される抗原
の濃度に応じて決まる。試片中の酵素基質は酵素
と反応して発色反応を生ずる。 定量化を与えるには、試片の中の第２の層を多
数の別個の領域で構成し、各々が種々の量の固定
された対照抗原を収容するように構成する。それ
故、試片上の発色変化の位置は、供試試料中の抗
原の濃度に応じて決まる。 本発明の好ましい実施法では、免疫検定装置は
多孔質基材層の３層からなるサンドイツチ積層体
（第１図参照）である。第１の多孔質層には、酵
素と結合した特異抗体を含浸させる。第２の多孔
質質層は、後記のように該多孔質基材との直接結
合、共有結合、架橋結合等により結合し固定した
（結合）対照抗原を含有する。前記の対照抗原は
第１の多孔質層中の抗体により特異的に認識され
る型式の抗原である。第３の層は、抗体に結合し
た酵素と反応する発色基質を含有する。免疫検定
装置の操作は次の如くである（第２図及び第３図
参照）。 試験すべき抗原を含有する流体試料は第１の層
と接触させておく。供試試料中の遊離抗原は第２
の層中に拡散し、次いで第３の層中に拡散する。
酵素結合抗体が遊離抗原と結合し酵素結合抗体−
抗原・複合体を形成した場合には、該抗体は認識
部位が飽和されているので第２の層に固定された
抗原と反応し得ず、第３の層に自由に拡散し発色
反応を生じる。流体試料が抗原を含有しない場合
には、全ての酵素結合抗体は自由な結合個所を有
し、第２層中の固定した抗原と結合するものであ
る。第２層中の固定された抗原と結合する酵素結
合抗体はこの場合第３の層中に拡散せず、着色反
応は生じない。分解した発色基質の量の差異（及
び生じた発色の強さ）は供試試料中の抗原の量に
比例する。第１の層中の酵素標識抗体の所与量に
対して、本発明の装置の感度は第２の層中に存在
する対照抗原の量によつて決定される。例えば、
試験装置は一連のサンドイツチ複合体を含有し、
各々の複合体が種々の量の対照抗原を有する。一
連の対照抗原濃度を前もつて決定して、測定され
る供試溶液に適当な或る範囲の感度を計測する。
ELISA試片では陽性の発色反応は、試験される
抗原の存在を示していることを強調すべきであ
る。 本発明の装置を形成するのに用いる材料は当業
者には周知である。しかしながら、実際にはニト
ロセルロース又はジアゾベンジルオキシメチル
（DBM）紙の如き編成繊維から好ましい装置の
帯域又は層を形成するのが望ましいことが見出さ
れた。ニトロセルロース紙は蛋白質に直接結合
し、抗原を固定するのに有用であることが示され
た。DBM基材（マトリツクス）は共有結合によ
りジアゾニウム基にDNA，RNA及び蛋白質を結
合させる。更にはポリアクリルアミド、アガロー
ス又はコラーゲンの如き多孔質ゲルも利用し得
る。抗原は上記ゲルの細孔内に捕捉され得るか又
は抗原は配位子のアミノ基及び基材上のカルボキ
シル基を介して多孔質ゲルに架橋結合し得る。ま
た、セルロース又はプラスチツク繊維基材内に捕
捉された結合配位子を含有する粒子又はビーズを
も用い得る。満足な例は直径５〜10ミクロンのポ
リアクリルアミドビーズであり、ペプチド結合を
介してビーズの表面に抗原を結合させたものであ
る。該ビーズは１〜２ミクロンの孔径を有するセ
ルロース フイルター基材内に捕捉される。 適当な基質即ち発色試薬は当業者には周知であ
る。この点に関して、多数の種々の型式の精製酵
素がELISAの如き免疫検定法に用いる普通の標
識酵素である。これらの酵素には西洋ワサビのペ
ルオキシダーゼ、アルカリ性ホスフアターゼ及び
β−ガラクトシダーゼがある。しかしながら、本
発明は抗体又は抗原を標識するのにこれらの酵素
の使用には限定されない。抗体を標識するのに用
いた酵素は、発色剤と直接又は間接的に作用する
ことにより試験装置の第３の帯域内で発色し得
る。例えばジアミノベンジジン又はｐ−ニトロフ
エニルホスフエートの如き当業者に周知の基質は
過酸化水素の存在下に西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼと反応して褐色又は黒色を生ずる。本発明の
１形式では、本発明装置の使用中に過酸化水素を
外部から加える。別法として、凍結乾燥した発色
用帯域は結合グルコースオキシダーゼを含有で
き、第１の層はグルコースを含有できる。本発明
の装置を用いる際には、第１の層中のグルコース
は第２の層を通過して第３の層に拡散し、グルコ
ースオキシダーゼと反応することにより過酸化水
素を発生する。 抗体に結合した酵素は、第３の帯域中で、該帯
域の透過性を生ずる如き間接的な手段により発色
し得る、本発明に適当と見出されたこの方法の１
例は抗体に結合した酵素として高度に精製された
コラゲナーゼ（collagenase）を用いることであ
る。この酵素はコラーゲン（collagen）を小さな
ペプチドに分解する。コラゲナーゼ標識を検出す
るには、結合して発色する２つの試薬をコラーゲ
ン基質バリヤーにより分離する。コラゲナーゼで
標識した抗体の存在が検出される。その理由はコ
ラゲナーゼがコラーゲンバリヤーを分解させ次い
で分離された２つの試薬を混合させしかも発色さ
せるからである。適当なコラゲナーゼは当業者に
周知の手段により精製したヒストリチクス菌から
得られるコラゲナーゼである。適当なコラーゲン
基質は三重螺旋の（天然の）形又は特質を失なつ
た（ゼラチン）形での牛型Ｉコラーゲンにより形
成されたコラーゲン基質である。 次の実施例により本発明の実施を更に説明す
る。 実施例 １ 試験：妊娠の検知用の本発明の３層からなる装置 用いた物質は次の如くである。 (a) 抗原：人間の絨毛性ゴナドトロピン（hCG） (b) 抗体：人間のhCGに対するラビツトの抗血清 (c) 抗体に結合した酵素：西洋ワサビのペルオキ
シダーゼ (d) 発色用酵素基質：ジアミノベンジジン (e) 多孔質層を形成する検査紙材料：ニトロセル
ロース 操作方法 操作１ 発色試薬を含有する層（第３の層）の調製： 厚さ0.2mmのニトロセルロース基材のシートを
幅２cm、長さ10cmの試片に切断した。該シート
を、蒸留水に溶かした0.1mg／mlのジアミノベン
ジジンの溶液に30分間浸漬した。次いで該シート
をドライアイスのペレツトで被覆することにより
前記シートを凍結した。凍結したシートを慣用の
凍結乾燥機中で凍結乾燥した。 操作２ 抗原含有層（第２の層）の調製： 抗原を5.0.I.U.／mlの濃度で燐酸塩緩衝塩水中
に可溶化させ且つ一連の段階希釈率すなわち１：
１，１：２，１：４，１：８，１：16，１：32，
１：64及び１：100の希釈液を調製した。 ８群のニトロセルロースシートを各々、種々の
希釈率の抗原溶液中に４℃で30分間浸漬した。次
いで全てのシートを、燐酸塩緩衝塩水に溶かした
牛型血清アルブミンの１％溶液中に浸漬してニト
ロセルロース上の全ての遊離蛋白質結合部位を飽
和させた（Tobinら「Proc.Natl.Acad.of Sci.」
76，4350〜4354，1979）。 次いで該シートを前記の如く凍結乾燥した。 操作３ 酵素結合抗体含有層（第１の層）の調製： Wilson及びNakaneの標準的なペリオデート法
（「Immunot Iuorescence ＆ Related
Techniques」Elsevier社発行、P.215〜225，
1978年）によりペルオキシダーゼ酵素を抗体に結
合させた。標準法により該結合体を精製した後
に、PBS中で１mg／mlの濃度に調製した。前記
の層に含浸すべき酵素結合抗体の濃度は、１：32
の希釈率での固定抗原を含有するニトロセルロー
スシートの表面に施用した20μの液滴が固定抗
原に対する全ての抗体の完全な結合を示すまで酵
素結合抗体溶液を希釈することにより測定した
（標準希釈曲線の製造）。この濃度の酵素結合抗体
をセルロース吸取紙よりなる材料の試片に浸漬さ
せ、前記の操作１の如く凍結乾燥した。 操作４ ３層サンドイツチ積層体の製造： １cm四方の各々凍結乾燥させた層を、前記細片
から切断した。固体支持体は10cm×１cm×0.1mm
（厚さ）の透明なポリカーボネートプラスチツク
の細片である。発色基質を含有するニトロセルロ
ースの８枚の四角形シートをラテツクス基剤セメ
ントでプラスチツク支持体に接合した。これらの
四角形シートの頂部に抗原含有シートをその周囲
でラテツクスセメントを用いて接合した。８種類
の相異なる抗原濃度を用いた。最後に、抗原含有
層の頂部に、酵素結合抗体含有層を接合した。 操作５ 免疫検定を実施するには、50μの供試溶液を
頂部層の表面に施用する。供試溶液は0.1％過酸
化水素と共に燐酸塩緩衝塩水（PH7.4）中の標識
抗原よりなる。免疫検定の感度は0.3IUのhCGで
あり、これは１：32希釈率の固定抗原で発色反応
を示した。 結 果 前記の如く形成したELISA試片を標準的な血
球凝集反応法に対する感度について比較する。供
試試料は妊娠していると前もつて決定された６人
の患者から採取した人間の尿である。 【表】 ELISA試片法の感度は、慣用の血球凝集反応
法よりも大きい。 実施例 ２ 試 験 (a) ３層構造体の第１の層に含浸させた酵素結合
抗体の濃度を種々に変えた際の発色時間を測定
する試験。 (b) 人間の肝炎Ｂ抗原（HBA）を検出する実用
性を測定する試験。 操作方法： 試片を実施例１と同一の方法により構成した。
第１の層は、次の希釈率すなわち1/2，1/5，1/5
０，1/225，1/625及び1/3125のペルオキシダーゼ
結合・抗一HBAを含浸させた凍結乾燥セルロー
ス基質を含有する。実験(a)では、第２の層は抗原
を含有しない。実験(b)では第２の層は500ナノグ
ラム／cm²の濃度で結合HBAを含有する。 第３の層はhCGを検出するのに実施例１の如く
製造したDAB基質を含有する。 結 果 実験(a) 供試試料は0.1％の過酸化水素を含有する燐酸
塩緩衝塩水で1/10に希釈した通常の人間の血清よ
りなる。 【表】 結 論 第２の層が１cm²当り500ナノグラムのHBAを含
有する場合には、酵素結合抗体の最適濃度は1/62
５である。HBAを検出する実用性は1/625の希釈
率で結合対照抗原に対して遊離抗原が競合して存
在することにより証明された。 実験(b)１ 第１層中の酵素結合抗体これは供試試料が抗原
を含有していない場合には、第２の層中の対照抗
原に完全に結合している最適な最大濃度の測定。 第１層中の酵素結合抗−HBAの希釈率 発色反応（１分経過時） １／５ BN １／50 淡，BN １／225 ごく淡い、BN １／625 発色せず （対照抗原による完全な結合） １／3215 発色せず 実験(b)２ 100ナノグラフ／mlでのHBAを検出するのに1/
６２５希釈率（前記表(b)１から）の結合対を選択し
た。 供試試料 発色反応 30秒 １分 HBA存在 淡，BN BN HBA不在 発色せず 発色せず 本発明の技術は、抗体並びに抗原との両方の検
出に同等に応用し得る。抗原及び抗体の役割は単
純に逆になる。 すなわち、抗体を検出するには、抗原を酵素で
標識して第１の層中に分散させることにより配置
し、対照抗体を第２の層に前記の抗原を結合させ
る場合のようにして結合させ固定させる。酵素で
標識された抗原は、試料液中に抗体が存在しない
場合には試料液に可溶化して第１の層から第２の
層に拡散移行し、第２の層に固定された対照抗体
と免疫学的に反応して酵素結合抗原−対照抗体・
複合体を形成して対照抗体に結合して固定される
ものであり、第３の層中に拡散し得ないので発色
できない。抗体が試料液中に存在する場合には、
該抗体は第１の層中で酵素で標識された抗原と免
疫学的に反応して酵素結合抗原−抗体・複合体を
形成し、次いで第２の層に拡散移行する。該酵素
結合抗原−抗体・複合体は認識部位が飽和されて
いるので、第２の層に結合され固定された対照抗
体と反応し得ないので第２の層を拡散通過して第
３の層に移行し、そこで発色試薬と反応する。こ
の場合には、陽性発色反応は、供試試料中に抗体
が存在することを示す。 本発明の好ましい具体例が現在記載されている
けれども、本発明から逸脱することなく種々の変
更及び改良をこゝで成し得ることは当業者には明
らかであり、それ故本発明の範囲内に全てのかゝ
る変化及び改良を包含することは明白である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置１０の図解図であり、第
２図及び第３図は第１図の装置を用いて本発明の
方法を実施した際の図解図であり、第４図は本発
明の別の装置１１の図解図であり、第５図及び第
６図は第４図の装置を用いて本発明の方法を実施
した際の図解図である。図中１２は第17層、１４
は第２の層、１６は第３の層、２４は酵素結合抗
体、２６は抗原、１７は発色試薬、３２は遊離抗
原、をそれぞれ表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第１の層と第２の層と第３の層とを有してな
   る繊維質積層体からなる生物体液中の抗原の存在
   を検出する装置であつて、前記積層体中の第１の
   層が、試験される前記抗原と免疫学的に反応して
   保護酵素結合抗体−抗原・複合体を生成し得る酵
   素結合抗体を含有するものであり；前記第２の層
   が、該第２の層に結合され固定された抗原であつ
   て前記第１の層で反応しなかつた酵素結合抗体と
   免疫学的に反応し得る抗原を含有するものであ
   り；且つ前記第３の層が、前記の酵素結合抗体−
   抗原・複合体に結合されている酵素と反応して前
   記体液中の抗原の存在を示す発色反応を生じうる
   物質を含有するものであることを特徴とする生物
   体液中の抗原の存在を検出する装置。 ２ 生物体液中の抗原の存在を検出する方法にお
   いて、第１の層と第２の層と第３の層とを有して
   なる繊維質積層体からなる装置であつて、前記第
   １の層が、試験される前記抗原と免疫学的に反応
   して保護酵素結合抗体−抗原・複合体を生成し得
   る酵素結合抗体を含有するものであり、前記第２
   の層が、該第２の層に結合され固定された抗原で
   あつて前記第１の層で反応しなかつた酵素結合抗
   体と免疫学的に反応し得る抗原を含有するもので
   あり且つ前記第３の層が、前記の酵素結合抗体−
   抗原・複合体に結合されている酵素と反応して前
   記体液中の抗原の存在を示す発色反応を生じうる
   物質を含有するものである装置を用いて、この装
   置の前記第１の層に抗原の存在を試験すべき体液
   を接触させ；前記の体液を前記繊維質装置に浸透
   させ；次いで前記第３の層における発色変化の有
   無を観察しそれによつて前記体液中の抗原の有無
   を検出することからなることを特徴とする、体液
   中の抗原の存在を検出する方法。 ３ 第１の層と第２の層と第３の層とを有してな
   る繊維質積層体からなる生物体液中の抗体の存在
   を検出する装置であつて、前記の積層体中の第１
   の層が、試験される前記抗体と免疫学的に反応し
   て保護酵素結合抗原−抗体・複合体を生成し得る
   酵素結合抗原を含有するものであり；前記第２の
   層が、該第２の層に結合され固定された抗体であ
   つて前記第１の層で反応しなかつた酵素結合抗原
   と免疫学的に反応し得る抗体を含有するものであ
   り；且つ前記第３の層が、前記の酵素結合抗原−
   抗体・複合体に結合されている酵素と反応して前
   記体液中の抗体の存在を示す発色反応を生じ得る
   物質を含有するものであることを特徴とする生物
   体液中の抗体の存在を検出する装置。 ４ 生物体液中の抗体の存在を検出する方法にお
   いて、第１の層と第２の層と第３の層とを有して
   なる繊維質積層体からなる装置であつて、前記積
   層体中の第１の層が、試験される前記抗体と免疫
   学的に反応して保護酵素結合抗原−抗体・複合体
   を生成し得る酵素結合抗原を含有するものであ
   り、前記第２の層が、該第２の層に結合され固定
   された抗体であつて前記第１の層で反応しなかつ
   た酵素結合抗原と免疫学的に反応し得る抗体を含
   有するものであり且つ前記第３の層が、前記の酵
   素結合抗原−抗体・複合体に結合されている酵素
   と反応して前記試料液中の抗体の存在を示す発色
   反応を生じ得る物質を含有するものである装置を
   用いて、この装置の前記第１の層に抗体の存在を
   試験すべき体液を接触させ；前記の体液を前記繊
   維質装置に浸透させ；次いで前記第３の層におけ
   る発色変化の有無を観察しそれによつて前記体液
   中の抗体の有無を検出することからなることを特
   徴とする、生物体液中の抗体の存在を検出する方
   法。