JP7066922B2 - 五倍子抽出物およびフラキシンを有効成分として含む認知機能の改善、認知症および注意欠陥多動性障害の予防または治療用組成物 - Google Patents
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Description
五倍子(KP)5kgを精選して薬典通則の切度および粉末度によって粗切にした後、生薬を秤量して抽出器に入れ、8~10倍の95%エタノールを入れて撹拌抽出器で5~6時間2回抽出して、抽出液を1μm大きさのマイクロフィルターを利用して濾過し、濾液を50℃以下で減圧濃縮した後、乾燥して、乾燥エキス2.39kgを得た(収得率47.8%)。
1)Aβによる認知記憶能力の低下は、12週齢のマウスで評価された。ICRマウス[(株)オリエントバイオ、京畿道、韓国]を購入して、実験動物室に1週間適応させ、薬物投与および認知記憶能力の評価を実施した。毒性のAβ(1-42)(American Peptide Company,Sunnyvale,CA,USA)と対照物質である無毒性のAβ(42-1)(American Peptide Company,Sunnyvale,CA,USA)は、400pmolを第3脳室に投与した。Aβの投与3日後から認知記憶能力の評価を実行した。五倍子抽出物(500mg/kg、p.o.)および/またはフラキシン(0.5mM)は、Aβ投与2日前から認知記憶能力の評価が終るまで1日に1回ずつ経口投与した。認知記憶能力の評価が行われる期間には、行動に薬物が直接的な影響を及ぼすことを防ぐために、行動および認知機能評価が終わった後、薬物を投与した。
本実験には、6ヶ月齢のAPPswe/PS1dE9二重発現マウス(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,MA,USA)を使用した。APPswe/PS1dE9二重発現マウスに五倍子抽出物(500mg/kg、p.o.)および/またはフラキシン(0.5mM)を1日に1回ずつ3ヶ月間経口投与した後、認知記憶能力の評価を実行した。認知記憶能力の評価が行われる期間には、行動に薬物が直接的な影響を及ぼすことを防ぐために、行動および認知機能の評価が終わった後、薬物を投与した。認知記憶能力の評価が終わって、1日後、動物を犠牲にさせて、Aβの蓄積程度を評価した。
(1)Y字迷路テスト(Y-maze test)
Y字迷路の構成は、Y字状のarmからなり、長さ25cm、高さ14cm、広さ5cmの黒色プラスチック箱からなっている。マウスを片方のarmの先端に配置し、8分間自由にarmを往来するようにした。マウスがそれぞれのarmに入る回数をビデオカメラで撮った。 交替反応行動(空間交替行動)の評価指標は、3個のarmを全部入る場合に1点を獲得することにして、対照群と比較した。マウスの交替反応点数(score)は、実際にマウスが獲得した点数を可能な交替反応点数で割って、100%に換算した。
初日には、マウスを40cm×40cm×30cmの箱に入れ、10分間自由に移動するようにして適応させた。2日目には、箱に2つの物体を配置し、それぞれの物体に対する反応時間を記録した。これから24時間後に2つのうち1つの物体を新規物体に変えた後、新規物体に対する反応時間を記録した。
水探索テストは、潜在学習(latent learning)および注意を必要とする空間記憶(attentional spatial memory)を評価する方法であって、1日にマウスにとって装置内で水差しのノズル位置を認知するようにした後、24時間の断水後に再び装置内に位置させて、水差しのノズルを探すようにしてその時間を測定した(Finding latency)。ただし、2日には、水差しの位置およびノズルの長さを若干変化させて、1日に習得した情報に基づいて、注意力を傾けて新しい位置を探すようにした。
受動的回避テスト装置は、2つの部屋からなっており、2つの部屋の間には、ギロチンドア(guillotine door)で分かれている。部屋の底には、ショック発生器が設置されている。1日には、獲得試行(acquisition trial)としてマウスを2つの部屋のうち1つの部屋に入れ、15秒間適応させた後に、マウスのある部屋の明かりをつけると同時に、ギロチンドアを開く。マウスが明るい部屋から暗い部屋に移動すると同時に、ギロチンドアが閉じ、暗い部屋の底に電気ショック(electric shock)(0.5mA、5s)を加えた。2日には、同じ装置にマウスを入れ、明るい部屋から暗い部屋に移動する時間を測定した(step-through latency)。
水迷路テスト評価のための水槽は、直径が97cmであり、高さが60cmである円筒形水槽を使用した。テスト期間中に粉ミルクを希釈した23±2℃の水を満たして使用した。水槽の中には、水面から2cm下に透明なプラットフォームを設置し、水槽の外側に4個の標識を設置した。マウスの運動軌跡は、ビデオトラッキングシステム(EthoVision,Noldus,The Netherlands)を用いて分析された。
各trial期間中に、マウスは、5箇所の開始点を無作為で選択した地点でプラットフォームを見ることができない側に向かって水槽中に入れられた。各trialでは、マウスが水槽に入れられた後、プラットフォームを探す時間(escape latency)を記録することになり、マウスがプラットフォームを探せば、10秒間プラットフォームの上で留まるようにした後、ホームケージに移されることになる。マウスが60秒内にプラットフォームを探さない場合、探す時間は、60秒で記録した。各trialは、β-amyloidを投与した3日後から4日間(3日~6日)、1日に4回ずつ実行された。
β-amyloid投与7日後にプローブテストを進めた。プラットフォームを取り外した後、60秒間マウスにとって水槽内を水泳するようにしつつ、プラットフォームがあった位置を何回も通り過ぎるかを記録した。
作業記憶テストは、β-amyloidの投与後に8日~10日に進めた。参照記憶テストと類似しているが、プラットフォームの位置を毎日変えながら、逃避時間(escape latency)を測定した。1日に5回のトライアルを進め、2回目~5回目のtrialの逃避時間を使用した。
β-amyloid(1-42)の投与は、Y字迷路で交替反応行動を有意に減少させた。五倍子抽出物は、β-amyloid(1-42)による 交替反応行動の減少を有意に抑制させた(図2)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約6.66%さらに有意に交替反応行動の増加を示した。
β-amyloid(1-42)の投与は、新規物体認識行動テストで新規物体 に対する探索を有意に減少させた。五倍子抽出物は、β-amyloid(1-42)による新規物体に対する 探索の減少を有意に抑制させた(図3)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約6.78%さらに有意にβ-amyloid(1-42)による新規物体に対する探索の減少を有意に抑制させた(図3)。
β-amyloid(1-42)の投与は、潜在学習を評価する水探索テストで探索潜時(finding latency)を有意に増加させた。五倍子抽出物は、β-amyloid(1-42)による探索潜時 の増加を有意に抑制した(図4)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約11.43%さらに有意にβ-amyloid(1-42)による探索潜時の増加を有意に抑制した(図4)。
β-amyloid(1-42)の投与は、恐怖学習(fear learning)および記憶を評価する受動的回避テスト(passive avoidance test)でステップスルー潜伏期を有意に減少させた。五倍子抽出物は、β-amyloid(1-42)によるステップスルー潜伏期の減少を有意に抑制した(図5)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約10.34%さらに有意にβ-amyloid(1-42)によるステップスルー潜伏期の減少を有意に抑制した(図5)。
β-amyloid(1-42)の投与は、Morris水迷路の隠されたプラットフォームおよびプローブテスト(water mazeのhidden platform testおよびprobe test)を通じて評価した結果、有意に空間参照記憶の低下を誘導した。すなわち、β-amyloid(1-42)を投与したマウスは、β-amyloid(42-1)を投与したマウスに比べて水槽内の安全なプラットフォームを探す時間が有意に減少しただけでなく、プラットフォームを取り外して測定するプローブテストでも、プラットフォームがあった象限(quadrant)に留まる時間も有意に減少した。五倍子抽出物は、β-amyloid(1-42)による逃避時間(escape latency)の増加およびプラットフォームがあった象限での滞留時間の減少を有意に抑制した(図6と7)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約12.00%さらに有意にβ-amyloid(1-42)による逃避時間の増加およびプラットフォームがあった象限での滞留時間の減少を有意に抑制した(図6と7)。
β-amyloid(1-42)の投与は、Morris 水迷路-作業記憶テスト(water mazeのworking memory test)で有意に空間作業記憶の低下を誘導した。五倍子抽出物は、β-amyloid(1-42)による逃避時間の増加を有意に抑制した(図8)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約9.43%さらに有意にβ-amyloid(1-42)による逃避時間の増加を有意に抑制した(図8)。
APPswe/PS1dE9二重発現マウスで短期空間記憶力(short-term spatial)を評価するY字迷路テストを行った結果、五倍子抽出物は、交替反応行動を有意に増加させた(図9)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約10.53%さらに有意に交替反応行動を有意に増加させた(図9)。
APPswe/PS1dE9二重発現マウスで視覚再認知記憶(visual recognition memory)を評価する新規物体認識行動テスト を実施した結果、五倍子抽出物は、新規物体に対する探索を有意に増加させた(図10)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約9.76%さらに有意に探索を有意に増加させた(図10)。
APPswe/PS1dE9二重発現マウスで潜在学習(latent learning)を評価する水探索テストを実施した結果、五倍子抽出物は、探索潜時 を有意に減少させた(図11)。また、五倍子抽出物とフラキシンの併用投与時に、五倍子単独で投与時より約10.48%さらに有意に探索潜時を有意に減少させた(図11)。
1)実験動物および薬物処理
ADHDが主に小児に現れる疾患であるから、未成熟のマウスを実験に利用しなければならないし、ICRマウス[(株)オリエントバイオ、京畿道、韓国)]を購入して実験動物室に適応させた後、交尾させた。妊娠6日目から生後21日目まで母体にAroclor 1254(18mg/kg)を1日1回経口投与した。生後21日目にmale offspringだけを離乳した後、生後21日目から行動実験が終わる日まで離乳した子孫(offspring)にgallic acid(100mg/kg、p.o.)、methyl gallate(100mg/kg、p.o.)あるいは五倍子抽出物(500mg/kg、p.o.)および/またはフラキシン(0.5mM)を1日に1回投与した。
(1)オープンフィールドテスト
マウスを40×40×30cmの黒色アクリルボックスに入れ、ビデオトラッキングシステム(video tracking system)を利用して30分間行動を測定し、オープンフィールドを9等分して中間領域を中央ゾーンに設定した。ADHDの多動性指標は、自発運動量(distance moved in cm)を利用し、衝動的行為の指標としては、立ち上がり行動(rearing)、中央ゾーンで留まった時間、中央ゾーンに進入した回数、初めて中央ゾーンに進入した時間を指標として測定した。オープンフィールド評価で中央ゾーンで留まった時間が長く、頻繁に進入し、最初に進入した時間が短いほど衝動的傾向があり、反対の場合、不安病症があることが知られている。行動の測定は、午前9時から午後6時間に実施された。
オープンフィールドテストを終えた24時間後に、オープンフィールドテストの場合と同じアクリルボックスに2つの物体(object)を固定させた。マウスを入れ、10分間それぞれの物体に接近する時間をビデオトラッキングシステムを利用して測定した。さらに24時間後に、2つの物体のうち1つを新規物体に変えた後、マウスを入れ、10分間それぞれの物体に接近する時間をビデオトラッキングシステムを利用して測定した後、2つの物体に接近した時間のうち新規物体に接近した時間を計算してパーセントで示した。
Aroclor 1254の投与は、有意に歩行活動(locomotor activity)を誘導し、立ち上がり行動(rearing)を増加させた。五倍子抽出物およびフラキシンの併用投与時に、Aroclor 1254による過度かどだ歩行活動 (hyperlocomotor activity)と立ち上がり行動の増加が顕著に抑制された(図12および図13)。
Aroclor 1254の投与は、有意にオープンフィールドの中央ゾーン で留まった時間と中央ゾーンに進入した回数を増加させ、初めて中央ゾーンに進入した時間は有意に短縮されて、衝動的行為が誘導された。五倍子抽出物およびフラキシンの併用投与時に、Aroclor 1254による衝動的行為が顕著に抑制された(図14~図17)。
Aroclor 1254の投与は、新規物体認識行動テストで有意に新規物体に関心を示した時間を減少させて、注意力集中障害および学習記憶能力低下を誘導した。五倍子抽出物およびフラキシンの併用投与時に、Aroclor 1254による注意力集中障害/学習記憶能力低下が顕著に抑制された(図18)。
Claims (3)
- 五倍子抽出物およびフラキシンを有効成分として含む認知症の予防または治療用組成物であって、前記フラキシンの濃度は、0.5mMであることを特徴とする組成物。
- 五倍子抽出物およびフラキシンを有効成分として含む注意欠陥多動性障害の予防または治療用組成物であって、前記フラキシンの濃度は、0.5mMであることを特徴とする組成物。
- 五倍子抽出物およびフラキシンを有効成分として含む認知機能の改善用組成物であって、前記フラキシンの濃度は、0.5mMであることを特徴とする組成物。
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