ES2951919T3

ES2951919T3 - Composición para mejorar la capacidad cognitiva y prevenir o tratar la demencia y el trastorno por déficit de atención con hiperactividad, que comprende extracto de Galla rhois y fraxina como ingredientes activos

Info

Publication number: ES2951919T3
Application number: ES18943563T
Authority: ES
Inventors: Seon Ah Ha
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2023-10-25
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: WO2020130172A1; KR20210022161A; US11253553B1; EP3900732B1; EP3900732C0; GB2596927B; EP3900732A4; CN113194972B; CN114588180B; US11382935B2; KR20200143490A; US20220105139A1; GB202109624D0; CN114588180A; KR102235881B1; KR102246444B1; GB2596927A; JP2022513304A; US20220040240A1; CN113194972A

Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende un extracto de agalla y fraxina como ingredientes activos para mejorar la capacidad cognitiva y para la prevención o el tratamiento de la demencia y el trastorno por déficit de atención con hiperactividad. En la presente invención, se descubrió que una composición de extracto de agalla y fraxina mejora significativamente la capacidad cognitiva y de memoria e inhibe la formación de placa amiloide en modelos de enfermedad de Alzheimer inducida por la administración de Aβ (1-42) y en Alzheimer doble transgénico APPswe/PS1dE9. modelos de enfermedades. Estos resultados sugieren la utilidad de una combinación de extracto de agalla y fraxina como material candidato terapéutico para la enfermedad de Alzheimer. Además, una combinación de extracto de agalla y fraxina se puede utilizar como material candidato terapéutico para el TDAH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para mejorar la capacidad cognitiva y prevenir o tratar la demencia y el trastorno por déficit de atención con hiperactividad, que comprende extracto de Galla rhois y fraxina como ingredientes activos

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición para el uso en la mejora de la capacidad cognitiva y la prevención o el tratamiento de la demencia y el trastorno por déficit de atención con hiperactividad, que comprende un extracto etanólico de Galla rhois y fraxina como ingredientes activos.

Antecedentes

La disminución de la capacidad cognitiva, es decir, la pérdida de memoria, debida a la demencia puede denominarse un "síndrome" en el que el daño temporal o continuo de los nervios craneales, que se produce principalmente por causas médicas o neurológicas, da como resultado una notable dificultad para mantener la vida social y cotidiana.

La enfermedad de Alzheimer representa la mayoría de los pacientes con demencia. La patogenia de la enfermedad de Alzheimer aún no está claramente identificada, pero se sugiere que la toxicidad de una proteína neurotóxica (proteína p-amiloide) depositada en una lesión cerebral es la causa más importante.

La enfermedad de Alzheimer y la demencia cerebrovascular causada por lesiones cerebrales extensas generadas después de un accidente cerebrovascular o debida a la arteriosclerosis cerebral representan aproximadamente el 90% de las enfermedades de demencia.

Los pacientes con demencia exhiben una hipofunción significativa de diversos neurotransmisores principalmente en la corteza cerebral y el sistema límbico y se exhibía en los pacientes una hipofunción del metabolismo energético cerebral y, en particular, en el caso de la enfermedad de Alzheimer (EA), la hipofunción de sistemas de neurotransmisión de acetilcolina (ACh), ácido glutámico, neuropéptidos y monoaminas, suponiendo que la disfunción de estos sistemas de neurotransmisión es la causa principal de la EA.

Además, desde el punto de vista de la acción neurocitotóxica inducida por un péptido p-amiloide, el mecanismo de inicio mediado por el desprendimiento de las células nerviosas del hipocampo a través del depósito extracelular de péptidos p-amiloides en las placas seniles también se supone como una de las principales causas de la EA.

Actualmente, el tratamiento de la demencia tiene como objetivo reducir la progresión mediante el diagnóstico precoz de los síntomas, y no existe ningún fármaco que pueda inhibir o prevenir la progresión de la demencia en la etapa actual. Si bien existen Cogne (Parke-Davis), Aricept (Eisai & Pfizer), Exellon (Novartis) y Ebixa (Lundbeck), que son productos aprobados por la FDA de los EE. UU. de A. y están disponibles en el mercado, estos medicamentos, excepto Ebixa, solo contribuyen al alivio de algunos de los síntomas generados por la EA (aumentar la concentración de un neurotransmisor, es decir, la acetilcolina, y su enzima de degradación, es decir, la acetilcolinesterasa, se inhiben) y a alentar a los pacientes y sus cuidadores.

Estos fármacos inhibidores de la AChE son más efectivos cuando el nervio colinérgico no está funcionalmente dañado y, dado que su eficacia disminuye con la disminución de la función de los nervios colinérgicos, los fármacos solo son efectivos en las primeras etapas de demencia senil leve o moderada. La mayoría de estos fármacos exhiben efectos secundarios colinérgicos de los nervios periféricos y tienen una semivida muy corta y un efecto secundario grave como la hepatotoxicidad. En particular, cuando se administra por vía oral 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina (THA), que es un ingrediente activo de Cognex, muestra una mejora en la capacidad perceptiva, pero se acompaña de efectos secundarios graves, como temblores, mareos y hepatotoxicidad, por lo que no se usa mucho.

Mientras tanto, como medicamentos a base de hierbas que no exhiben las desventajas de un fármaco inhibidor de AChE de este tipo, productos que incluyen ginseng como ingrediente principal y se preparan mediante la extracción de una mezcla de múltiples medicamentos a base de hierbas se divulgan en la Solicitud de Patente Coreana No Examinada N° 99-85202 y la Patente de EE. UU. de A. N° 6.010.702. Aunque este extracto mixto de medicamentos a base de hierbas exhibe un cierto grado de eficacia sobre la demencia senil, todavía no garantiza efectos definitivos y estables debido a que tiene efectos secundarios.

Mientras tanto, se estima que el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) se produce en de 3 a 5% de los niños en edad escolar. Agentes psicofarmacológicos que se han propuesto hasta el momento para el tratamiento de esta enfermedad incluyen compuestos estimulantes (anfetamina y metilfenidato), antidepresivos tricíclicos (imipramina y amitriptilina) y antipsicóticos (fenotiazina y haloperidol). Se ha demostrado que el metilfenidato es eficaz en el tratamiento de la hiperactividad y el déficit de atención, y ha sido objeto de diversos estudios médicos. Sin embargo, la hipertensión se ha presentado como una reacción secundaria y se ha demostrado que a veces aumenta la impulsividad. En el tratamiento con metilfenidato, se han presentado efectos secundarios frecuentes, como ojeras, pupilas dilatadas, dolor de cabeza y pérdida de apetito.

El documento KR 20130108821A trata de un extracto de Galla rhols para la prevención y el tratamiento de la demencia, que mejora las capacidades cognitivas y que mejora la inmunidad.

Divulgación

Problema técnico

Para resolver los problemas descritos anteriormente, la presente invención está dirigida a proporcionar una composición para el uso en la prevención o el tratamiento de la demencia (EA).

La presente invención también está dirigida a proporcionar una composición para el uso en la prevención o el tratamiento del trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH).

Solución técnica

Para lograr los propósitos descritos anteriormente, la presente invención proporciona una composición para el uso según la reivindicación 1.

En una realización de la presente invención, la concentración de fraxina es preferentemente de 0,1 a 0,5 mM, pero la presente invención no se limita a esto.

La composición para el uso según la presente invención se puede proporcionar como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica para el uso según la presente invención puede comprender además un vehículo, un excipiente y un diluyente, que se usan convencionalmente y son adecuados para preparar una composición farmacéutica. Una forma de administración farmacéutica de la composición para el uso según la presente invención también se puede usar en forma de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, o se puede usar sola, o unida o combinada apropiadamente con otro compuesto farmacéuticamente activo. La sal puede ser cualquier sal farmacéuticamente disponible sin limitación particular y puede incluir, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluenosulfónico y ácido naftalenosulfónico.

La composición farmacéutica para el uso según la presente invención se puede formular en cualquier forma adecuada para una preparación farmacéutica, incluidas las formulaciones orales como un polvo, un gránulo, un comprimido, una cápsula, una suspensión, una emulsión, un jarabe y un aerosol, preparaciones para uso externo tales como un ungüento y una crema, un supositorio y una solución inyectable estéril, según métodos convencionales.

En la composición farmacéutica para el uso según la presente invención, una dosis preferible del extracto o compuesto de la presente invención puede variar según la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto, los síntomas, la gravedad de la enfermedad, la forma de dosificación y la vía y la duración de la administración. Sin embargo, para efectos preferibles, la composición para el uso según la presente invención se administra preferiblemente diariamente en de 0,001 a 500 mg/kg de peso corporal. La dosis diaria se puede administrar una vez o en porciones divididas. Además, la dosis puede aumentarse o disminuirse según la edad, el sexo, el peso corporal, la gravedad de la enfermedad o la vía de administración. Por tanto, la dosis no limita de ningún modo el alcance de la presente invención.

La composición farmacéutica para el uso según la presente invención se puede administrar a mamíferos tales como ratas, ratones, ganado o seres humanos por varias vías, por ejemplo, las vías parenteral u oral, y se pueden esperar todos los tipos de administración, por ejemplo, por vía oral, intrarrectal, inyección intravenosa, muscular, subcutánea, intrauterina o intracerebroventricular.

Además, la composición para el uso según la presente invención se puede proporcionar como un aditivo alimentario o una composición alimenticia funcional. La composición alimenticia para el uso según la presente invención puede incluir, por ejemplo, todo tipo de alimentos como chicles, caramelos, golosinas, helados y dulces, bebidas como refrescos y agua mineral, y alimentos funcionales para la salud como vitaminas y minerales

En este caso, el contenido del extracto o compuesto puede ser del 0,001 al 99,9% en peso del peso total del alimento en los alimentos y del 0,001 a 0,1 g por 100 ml en las bebidas.

La bebida para el uso según la presente invención no tiene límite de componentes excepto que contiene el extracto y el compuesto como componentes esenciales en una proporción predeterminada y puede contener componentes adicionales tales como diversos sabores o hidrocarburos naturales como las bebidas convencionales.

Además de estos componentes, la composición de los alimentos funcionales para la salud para el uso según la presente invención puede contener una variedad de nutrientes, vitaminas, minerales (electrolitos), agentes saborizantes que incluyen agentes saborizantes sintéticos y naturales, agentes colorantes y rellenos (queso, chocolate, etc.), ácido péctico y una de sus sales, ácido algínico y una de sus sales, un ácido orgánico, agentes espesantes coloidales protectores, modificadores del pH, estabilizadores, conservantes, glicerina, alcoholes o agentes carbonatantes usados en bebidas carbonatadas.

Efectos ventajosos

En la presente invención, se identificó que una composición que incluye un extracto etanólico de Galla rhols y fraxina mejora significativamente la memoria cognitiva en un modelo de enfermedad de Alzheimer inducido por la administración de Ap (1-42) y un modelo de enfermedad de Alzheimer de doble expresión de APPswe/PS1dE9 e inhibe la generación de placas amiloides, y este resultado puede sugerir la utilidad de la combinación del extracto de Galla rhols y la fraxina, como agente terapéutico, para la enfermedad de Alzheimer, y muestran que la composición de extracto de Galla rhols y fraxina se puede usar como agente terapéutico para el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH).

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un gráfico que muestra un cambio en el nivel de ROS intracelulares por tratamiento fitoquímico.

La FIG. 2 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1-42). La memoria cognitiva se midió mediante el comportamiento de alternancia de una prueba de laberinto en Y. El experimento se llevó a cabo con 16 ratones por grupo y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1) y #P ≤ 0,05 frente a solución salina p-amiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 3 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1 -42). La memoria cognitiva se midió usando una prueba de reconocimiento de nuevos objetos. El experimento se llevó a cabo con 16 ratones por grupo y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1), y #P ≤ 0,05 frente a solución salina pamiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 4 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1-42). La memoria cognitiva se midió observando la latencia de búsqueda de una prueba de búsqueda de agua. El experimento se llevó a cabo con 16 ratones por grupo y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1) y #P ≤ 0,05, ##P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 5 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1-42). La memoria cognitiva se midió observando la latencia por etapas de una prueba de evitación pasiva. El experimento se llevó a cabo con 16 ratones por grupo y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1) y #P ≤ 0,05 frente a solución salina p-amiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 6 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1 -42). La memoria cognitiva se midió usando una prueba de memoria de referencia de un laberinto acuático de Morris. Se midieron ocho ratones por grupo cuatro veces al día, y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1), y #P ≤ 0,05 frente a solución salina p-amiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional para mediciones repetidas y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 7 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1 -42). La memoria cognitiva se midió usando una prueba de tanteo de un laberinto acuático de Morris. Se midieron ocho ratones por grupo dos veces y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1), y #P ≤ 0,05 frente a solución salina pamiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior)).

La FIG. 8 muestra el efecto de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols y/o fraxina sobre una disminución de la memoria cognitiva mediada por p-amiloide (1 -42). Se midieron ocho ratones por grupo cuatro veces al día durante tres días, y cada valor se expresa como media ± SEM. *P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (42-1), #P ≤ 0,05 y ##P ≤ 0,01 frente a solución salina p-amiloide (1 -42) (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 9 muestra el efecto farmacológico de la administración conjunta de un extracto etanólico de Galla rhols (Galla rhois) y/o fraxina sobre la memoria cognitiva (evaluada mediante una prueba de laberinto en Y) de ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9. Cada valor se expresa como media ± SEM de 10 ratones. #P ≤ 0,05 frente a solución salina (usando ANOVA unidireccional y una prueba de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 10 muestra el efecto farmacológico de la administración conjunta de un extracto de Galla rhols (Galla rhois) y/o fraxina sobre la memoria cognitiva de ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9 (evaluada mediante una prueba de reconocimiento de nuevos objetos). Cada valor se expresa como media ± SEM de 10 ratones. #P ≤ 0,05 frente a solución salina (usando ANOVA unidireccional y una prueba de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 11 muestra el efecto farmacológico de la administración conjunta de un extracto de Galla rhols y/o fraxina sobre la memoria cognitiva (evaluada mediante la latencia de búsqueda de una prueba de búsqueda de agua) de ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9. Cada valor se expresa como media ± SEM de 10 ratones. #P ≤ 0,05 y ##P ≤ 0,01 frente a solución salina (usando ANOVA unidireccional y una prueba de PLSD de Fisher para una prueba posterior).

La FIG. 12 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre la actividad hiperlocomotriz inducida por Aroclor 1254 en ratones. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, *P≤0,05, **P ≤ 0,01 frente a Sal Sal, y #P ≤ 0,05, y ##P ≤ 0,01 frente a Sal Aroclor 1254.

La FIG. 13 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre el aumento del número de erguimientos inducido por Aroclor 1254 en ratones. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, *P ≤ 0,05 frente a Sal Sal, y #P ≤ 0,05 frente a Sal Aroclor 1254 (el ANOVA unidireccional se acompaña de una prueba de PLSD de Fisher).

La FIG. 14 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre un cambio inducido por Aroclor 1254 con respecto a la latencia de entrada en la zona central en ratones. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, **P ≤ 0,01 frente a Sal Sal, y #P ≤ 0,05 frente a Sal Aroclor 1254 (el ANOVA unidireccional se acompaña de una prueba de PLSD de Fisher).

La FIG. 15 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre un aumento inducido por Aroclor 1254 con respecto a una distancia recorrida en la zona central. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, *P ≤ 0,01 frente a Sal Sal, #P ≤ 0,05 y ##P ≤ 0,05 frente a Sal Aroclor 1254.

La FIG. 16 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre un aumento inducido por Aroclor 1254 con respecto al número de entradas en la zona central en ratones. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, *P≤ 0,01 frente a Sal Sal, y #P ≤ 0,05 frente a Sal Aroclor 1254.

La FIG. 17 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre el cambio inducido por Aroclor 1254 con respecto al tiempo de permanencia en la zona central en ratones. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, *P≤ 0,05 frente a Sal Sal, y #P ≤ 0,05 frente a Sal Aroclor 1254.

La FIG. 18 es un gráfico que muestra el efecto de Galla rhols y/o fraxina sobre el daño al aprendizaje y la memoria inducido por Aroclor 1254 en una prueba de reconocimiento de nuevos objetos en ratones. Cada valor se expresa como media ± SEM de 12 ratones, * P ≤ 0,01 frente a Sal Sal, #P ≤ 0,05 y ##P ≤ 0,05 frente a Sal Aroclor 1254 (el ANOVA unidireccional se acompaña de una prueba de PLSD de Fisher).

Modos de la invención

A continuación, la presente invención se describirá con mayor detalle a través de ejemplos no limitativos.

Ejemplo: Preparación de extracto de Galla rhols y procedimiento de selección de fraxina

Se seleccionaron cuidadosamente 5 kg de Galla rhols (K P), se cortaron en tosco según el grado de corte y el grado de polvo de las reglas generales de la farmacopea, y el medicamento a base de hierbas se pesó y se puso en un extractor, y se extrajo con de 8 a 10 veces de etanol al 95% dos veces durante de 5 a 6 horas en un extractor de agitación. El extracto resultante se filtró a través de un microfiltro de 1 μm y a continuación el filtrado se concentró a presión reducida a 50°C o menos y se secó, obteniendo así 2,39 kg de extracto seco (rendimiento: 47,8%).

Se proporcionaron componentes con actividad antioxidante conocida y se determinó que el ácido gálico y la fraxina tienen la actividad más alta a través del cribado de la actividad antioxidante.

Los compuestos utilizados en el cribado de la actividad antioxidante de la presente invención son A1 a A7 a continuación:

A1. Un compuesto flavonoide de quercetin-3-O-p-D-glucuronopiranósido, A2. Un compuesto fenilpropanoide de 1-O-cafeoil-quercetin-3-O-p-D-glucopiranósido, A3. Un compuesto cumarínico de fraxina, A4. Un compuesto tanínico de galato de metilo (galicina), A5. Un compuesto flavonoide de 2"-O-ramnosilvitexina, A6. Un compuesto fenilpropanoide de tipo dépsido de acteósido, y A7. Un compuesto relacionado con alcohol bencílico de citrato de 1,3-bis[4-(p-D-glucopiranosil)bencilo]

Se trataron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con cada uno de los 7 tipos de antioxidantes A1-A7, y a continuación se administró un oxidante, peróxido de hidrógeno, para analizar el grado de daño celular mediante un ensayo de MTT y a continuación se midió la actividad de superóxido dismutasa y catalasa.

Como resultado del experimento, A6 y A7 no mostraban un efecto de eliminación de ROS ni un efecto de regeneración celular. A4 tiene un efecto de eliminación de ROS y un efecto de regeneración celular altos, mientras que A3 tiene un efecto de regeneración celular alto, pero tiene un efecto pobre de eliminación de ROS, se considera que el efecto antioxidante de A3 está provocado por un mecanismo diferente al de la eliminación de ROS.

- Ensayo de superóxido dismutasa (SOD), catalasa: la actividad de ambas enzimas que tienen un efecto de eliminación de ROS generadas en las células o que entran desde el exterior no cambiaba mucho mediante tratamiento con H²O², pero cuando A3 se trataba antes del tratamiento con H²O², se pudo observar un aumento en la actividad de SOD.

- Ensayo de peroxidación lipídica (LPO): la LPO tiende a aumentar ligeramente a medida que las células envejecen. Particularmente, cuando las células se exponían a H²O², se podía ver que el resultado de LPO aumenta la cantidad de MDA, y se confirmaba que dicho aumento se reduce en gran medida mediante tratamiento con A3 y A4, y esta actividad no se observaba con A1, A2 y A5 a A7.

- Producción de especies oxigenadas reactivas (ROS): para medir las ROS generadas en las células, se usó la fluorescencia de DCF. Se observó que un nivel de ROS en HUVEC tratadas con H²O²aumenta en un 55% en comparación con las no tratadas con H²O², y se vio que este aumento se reduce en un 39% y un 24% cuando se añadían A3 y A4 (FIG. 1).

Por lo tanto, los inventores seleccionaron A3 y A4 de entre los compuestos A1 a A7 como candidatos para combinarse con un extracto de Galla rhols y, puesto que el extracto de Galla rhols contiene una gran cantidad de galato de metilo, que es el compuesto A4, iba a evaluarse un efecto del extracto de Galla rhols al que se añade A3, fraxina, no A4.

En la presente invención, el experimento se llevó a cabo con fraxina que tenía una concentración de 0,5 mM, y esta concentración es el resultado de realizar un experimento de la actividad de eliminación de radicales libres de la fraxina usando un ensayo de DPPH. Se trató una solución de DPPH con diversas concentraciones de fraxina (0,02, 0,1 y 0,5 mM) y se comprobó el cambio de absorbancia a 517 nm durante 10 minutos. La actividad de eliminación de radicales libres era aproximadamente del 10%, 18% o 50% a la concentración de fraxina de 0,02, 0,1 o 0,5 mM, respectivamente, y se seleccionó 0,5 mM para el experimento posterior.

Ejemplo Experimental 1: Evaluación de la eficacia farmacológica de extracto de Galla rhols y/o fraxina en un modelo de enfermedad de Alzheimer

1) Se evaluó una disminución de la memoria cognitiva mediada por Ap en ratones de 12 semanas de edad. Se adquirieron ratones ICR [Orient Bio Inc., Gyeonggi, Corea] y se aclimataron en una jaula para animales de laboratorio durante 1 semana, seguido de la administración del fármaco y la evaluación de la memoria cognitiva. Se administraron al tercer ventrículo 400 pmol de Ap (1-42) tóxico (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, EE. UU. de A.) o Ap (42-1) atóxico (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, EE. UU. de A.) como un control. La evaluación de la memoria cognitiva se realizó a partir de los 3 días posteriores a la administración de Ap. Se administraron oralmente un extracto etanólico de Galla rhols (500 mg/kg, p.o.) y/o fraxina (0,5 mM) una vez al día desde dos días antes de la administración de Ap hasta el final de la evaluación de la memoria cognitiva. Durante la evaluación de la memoria cognitiva, para prevenir los efectos directos de los fármacos sobre el comportamiento, los fármacos se administraron después de que se completaran las evaluaciones de la función conductual y cognitiva.

2) Administración de fármacos a ratones de doble expresión de proteína precursora de amiloide/presenilina-1 (APPswe/PS1dE9), que son modelos de la enfermedad de Alzheimer

En este experimento, se usaron ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9 de 6 meses de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, MA, EE. UU. de A.). Se administraron oralmente un extracto etanólico de Galla rhols (500 mg/kg, p.o.) y/o fraxina (0,5 mM) a los ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9 una vez al día durante 3 meses, seguido de una evaluación de la memoria cognitiva. Durante la evaluación de la memoria cognitiva, para prevenir los efectos directos de los fármacos sobre el comportamiento, los fármacos se administraron después de que se completaran las evaluaciones de la función conductual y cognitiva. Un día después de completar la evaluación de la memoria cognitiva, los animales se sacrificaron para evaluar el grado de acumulación de Ap.

Métodos de evaluación de la memoria cognitiva

(1) Prueba de laberinto en Y

El laberinto en Y tiene tres brazos configurados en forma de Y, en la que cada brazo está formado por una caja de plástico negro con un tamaño de 25 cm (largo) x 14 cm (alto) x 5 cm (ancho). Un ratón fue colocado al final de un brazo y se le permitió moverse libremente en el brazo durante 8 minutos. El número de entradas del ratón en cada brazo se registró con una cámara de video. Se determinó que el índice de evaluación para el comportamiento de alternancia obtenía 1 punto cuando el ratón entra en los tres brazos y se comparó con un control. La puntuación de alternancia del ratón se expresó dividiendo las puntuaciones reales obtenidas por el ratón entre las posibles puntuaciones de alternancia y convirtiendo el valor del resultado al 100%.

(2) Prueba de nuevos objetos

El primer día, se colocó un ratón en una caja de 40 cm x 40 cm x 30 cm y se aclimató dejándolo moverse libremente durante 10 minutos. El segundo día, se colocaron dos objetos en la caja y a continuación se registró el tiempo de reacción para cada objeto. Después de 24 horas, uno de los dos objetos se reemplazó por un nuevo objeto y se registró el tiempo de reacción para el nuevo objeto.

(3) Prueba de búsqueda de agua

La prueba de búsqueda de agua es un método de evaluación del aprendizaje latente y la memoria espacial atencional, en el que, el primer día, se permitía que un ratón reconociera la posición de una boquilla de una botella de agua en el aparato, y después de 24 horas de ser privado de agua, el ratón fue colocado de nuevo en el aparato para encontrar la boquilla de la botella de agua, seguido de la medición del tiempo (latencia de búsqueda). Sin embargo, el segundo día, la posición de la botella de agua y la longitud de la boquilla se modificaron ligeramente para que el ratón encontrara una nueva posición con atención en función de la información aprendida el primer día.

(4) Prueba de evitación pasiva

Un aparato para la prueba de evitación pasiva consiste en dos cámaras y había una puerta de guillotina entre las dos cámaras. Se dispuso un generador de choque sobre el suelo de cada cámara. El primer día, en un experimento de adquisición, el ratón fue colocado en una de las dos cámaras y se aclimató durante 15 segundos, se encendió una luz en la cámara en la que estaba el ratón y se abrió la puerta de guillotina. Cuando el ratón se movía de la cámara iluminada a la cámara oscura, la puerta de la guillotina se cerraba y se aplicaba una descarga eléctrica (0,5 mA, 5 s) al suelo de la cámara oscura. El segundo día, el ratón fue colocado en el mismo aparato y se midió el tiempo para moverse de la cámara iluminada a la cámara oscura (latencia por etapas).

(5) Prueba del laberinto acuático de Morris

Un baño de agua para evaluar un laberinto acuático es un baño de agua cilíndrico con un tamaño de 97 cm (diámetro) x 60 cm (altura). Durante la prueba, el baño de agua se llenó con leche en polvo diluida con agua a 23 ± 2°C. Se instaló una plataforma transparente 2 cm por debajo de la superficie del agua en el baño de agua y se colocaron cuatro señales en el exterior del baño de agua. La trayectoria de movimiento de un ratón se analizó a través de un sistema de seguimiento de video (EthoVision, Noldus, Países Bajos).

(5-1) Prueba de memoria de referencia

Durante cada examen, un ratón fue colocado en un baño de agua sin estar frente a una plataforma en una posición en la que se seleccionaban aleatoriamente cinco puntos de partida. En cada examen, el ratón fue colocado en el baño de agua, se registró el tiempo para encontrar la plataforma (latencia de escape), cuando el ratón encontraba la plataforma, se le permitió permanecer sobre la plataforma durante 10 segundos y a continuación se trasladó a una jaula de alojamiento. Cuando el ratón no encontraba la plataforma en 60 segundos, la latencia de escape se registró como 60 segundos. Cada experimento se llevó a cabo cuatro veces al día durante 4 días (día 3 a día 6) desde tres días después de la administración de p-amiloide.

(5-2) Prueba de tanteo

Siete días después de la administración de p-amiloide, se realizó una prueba de tanteo. Después de retirar la plataforma, se permitió que un ratón nadara en un baño de agua durante 60 segundos, y se registró cuántas veces pasaban los ratones por la posición en la que había estado colocada la plataforma mientras nadaban.

(5-3) prueba de memoria de trabajo

Se llevó a cabo una prueba de memoria de trabajo del día 8 al día 10 después de la administración de p-amiloide. Esta prueba es similar a la prueba de memoria de referencia, pero la latencia de escape se midió cambiando la posición de la plataforma todos los días. Se realizaron cinco exámenes al día, y se usaron las latencias de escape de los experimentos 2° a 5°.

Los resultados de dicha prueba de efecto en los animales son los siguientes.

Efecto de mejora de la memoria cognitiva de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la disminución de la memoria espacial a corto plazo inducida por la administración de p-amiloide (1 -42)

La administración de p-amiloide (1-42) reducía significativamente el comportamiento de alternancia en el laberinto en Y. El extracto de Galla rhols inhibía significativamente una disminución en el comportamiento de alternancia debida al p-amiloide (1-42) (FIG. 2). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, se mostraba un aumento significativo de aproximadamente 6,66% en el comportamiento de alternancia.

Efecto de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la disminución de la memoria de reconocimiento visual inducida por la administración de p-amiloide (1-42)

La administración de p-amiloide (1-42) disminuía significativamente la exploración de un nuevo objeto en una prueba de reconocimiento de nuevos objetos. El extracto de Galla rhols inhibía significativamente una disminución en la exploración de un nuevo objeto por p-amiloide (1-42) (FIG. 3). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, la disminución de la exploración de un nuevo objeto provocada por el p-amiloide (1 -42) se inhibía de forma más significativa, en aproximadamente un 6,78% (FIG. 3).

Efecto de mejora de la memoria cognitiva de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la disminución del aprendizaje latente inducida por la administración de p-amiloide (1 -42)

La administración de p-amiloide (1-42) aumentaba significativamente la latencia de búsqueda en una prueba de búsqueda de agua que evalúa el aprendizaje latente. El extracto de Galla rhols inhibía significativamente un aumento en la latencia de búsqueda por p-amiloide (1 -42) (FIG. 4). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, el aumento de la latencia de búsqueda provocado por el p-amiloide (1 -42) se inhibía de forma más significativa, en aproximadamente un 11,43% (FIG. 4).

Efecto de mejora de la memoria cognitiva de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la disminución del aprendizaje y la memoria del miedo inducida por la administración de p-amiloide (1-42)

La administración de p-amiloide (1 -42) disminuía significativamente la latencia por etapas en una prueba de evitación pasiva que evalúa el aprendizaje y la memoria del miedo. El extracto de Galla rhols inhibía significativamente la disminución de la latencia por etapas provocada por el p-amiloide (1-42) (FIG. 5). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, la disminución de la latencia por etapas provocada por el p-amiloide (1-42) se inhibía más significativamente, en aproximadamente un 10,34% (FIG. 5).

Efecto de mejora de la memoria cognitiva de extracto de Galla rhois y fraxina sobre la disminución de la memoria de referencia espacial inducida por la administración de p-amiloide (1 -42)

Como resultado de la evaluación a través de una prueba de plataforma oculta y una prueba de tanteo con el laberinto acuático de Morris, la administración de p-amiloide (1-42) inducía significativamente una disminución en la memoria de referencia espacial. Es decir, en los ratones a los que se les administraba p-amiloide (1-42), en comparación con los ratones a los que se les administraba p-amiloide (42-1), el tiempo para encontrar una plataforma segura en un baño de agua no solo aumentaba significativamente, sino también el tiempo pasado en el cuadrante en el que estaba colocada la plataforma se reducía significativamente en la prueba de tanteo que realiza la medición sin la plataforma. El extracto de Galla rhols inhibía significativamente un aumento de la latencia de escape y una disminución del tiempo pasado en el cuadrante en el que hay una plataforma por p-amiloide (1 -42) (FIG. 6 y 7). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, el aumento de la latencia de escape y la disminución del tiempo de permanencia en el cuadrante en el que hay una plataforma provocados por el p-amiloide (1-42) se inhibían de forma más significativa, en aproximadamente un 12,00% (FIG. 6 y 7).

Efecto de mejora de la memoria cognitiva de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la disminución de la memoria de trabajo espacial inducida por la administración de p-amiloide (1-42)

La administración de p-amiloide (1-42) inducía significativamente una disminución en la memoria de trabajo espacial en una prueba de memoria de trabajo con el laberinto acuático de Morris. El extracto de Galla rhols inhibía significativamente un aumento de la latencia de escape provocado por p-amiloide (1-42) (FIG. 8). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, el aumento de la latencia de escape provocado por el p-amiloide (1-42) era inhibido más significativamente en aproximadamente un 9,43% (FIG. 8).

Efecto de mejora de la memoria cognitiva de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la memoria espacial a corto plazo en ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9

Como resultado de una prueba de laberinto en Y que evalúa la memoria espacial a corto plazo en ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9, el extracto de Galla rhols aumentaba significativamente el comportamiento de alternancia (FIG. 9). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, el comportamiento de alternancia se aumentaba más significativamente en aproximadamente un 10,53% (FIG. 9).

Mejora del efecto de extracto de Galla rhols y fraxina sobre la memoria de reconocimiento visual en ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9

Como resultado de la realización de una prueba de reconocimiento de nuevos objetos que evalúa la memoria de reconocimiento visual en ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9, el extracto de Galla rhols aumentaba significativamente la exploración de un nuevo objeto (FIG. 10). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, la exploración se aumentaba más significativamente en aproximadamente un 9,76% (FIG. 10).

Mejora del efecto de extracto de Galla rhols y fraxina sobre el aprendizaje latente en ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9

Como resultado de la realización de una prueba de búsqueda de agua que evalúa el aprendizaje latente en ratones de doble expresión APPswe/PS1dE9, el extracto de Galla rhols disminuía significativamente la latencia de búsqueda (FIG. 11). Además, en la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, en comparación con la administración única de Galla rhols, la latencia de búsqueda se redujo más significativamente en aproximadamente un 10,48% (FIG. 11).

Ejemplo Experimental 2: Eficacia farmacológica de extracto de Galla rhols y/o fraxina en modelos de TDAH

1) Animales de laboratorio y tratamiento farmacológico.

Dado que el TDAH es una enfermedad que se produce principalmente en niños, se deben usar ratones inmaduros en el experimento y, por lo tanto, se adquirieron ratones ICR [Orient Bio, Inc., Gyeonggi, Corea] y se aclimataron en una jaula para animales de laboratorio, seguido de apareamiento. Se administró oralmente Aroclor 1254 (18 mg/kg) a las madres una vez al día desde el día 6 de gestación hasta el día 21 después del nacimiento. El día 21 después del nacimiento, se destetaron únicamente las crías masculinas, y a continuación, a partir del día 21 después del nacimiento hasta el final de la prueba conductual, se administraron ácido gálico (100 mg/kg, p.o.), galato de metilo (100 mg/kg, p.o.) o el extracto de Galla rhols (500 mg/kg, p.o.) y/o fraxina (0,5 mM) a las crías destetadas una vez al día.

El día 35 después del nacimiento, se evaluaron el impulso espontáneo y las tendencias impulsivas usando una prueba de campo abierto y, en los días 36 y 37, se evaluaron la atención y la memoria cognitiva usando una prueba de reconocimiento de nuevos objetos. Como fármaco de referencia se uso metilfenidato. Los detalles experimentales se muestran en la FIG. 12

2) Evaluación del comportamiento

(1) Prueba de campo abierto

Un ratón fue colocado en una caja de material acrílico de bloques con un tamaño de 40 x 40 x 30 cm, y se midió su comportamiento durante 30 minutos usando un sistema de seguimiento por video. Un campo abierto se dividió en 9 secciones, y la superficie central se estableció como una zona central. El índice de hiperactividad del TDAH usaba el impulso espontáneo (distancia recorrida en cm), y los indicadores del comportamiento impulsivo fueron el comportamiento de erguimiento, el tiempo pasado en la zona central, el número de entradas en la zona central y el tiempo para entrar por primera vez en la zona central. En la evaluación en campo abierto, se sabe que el tiempo de permanencia en la zona central es largo y frecuente, y como el tiempo para entrar por primera vez es más corto, hay impulsividad, y en caso contrario, el ratón tiene un síntoma de ansiedad. La medición conductual se realizó entre las 9 a. m. y las 6 p. m.

(2) Prueba de reconocimiento de nuevos objetos

Veinticuatro horas después de la prueba de campo abierto, se fijaron dos objetos en una caja acrílica que era la misma que la usada en la prueba de campo abierto. Después de colocar un ratón, se midió el tiempo para acercarse a cada objeto durante 10 minutos usando un sistema de seguimiento de video. Después de 24 horas, uno de los dos objetos se reemplazaba por un nuevo objeto, a continuación el ratón era colocado en la caja, se midió el tiempo para acercarse a cada objeto durante 10 minutos usando un sistema de seguimiento de video y el tiempo para acercarse al nuevo objeto en el tiempo para acercarse a los dos objetos se calculó y se expresó como un porcentaje.

El resultado del Ejemplo 3 se muestra a continuación.

Efecto farmacológico de extracto de Galla rhols y/o fraxina sobre la hiperactividad inducida por Aroclor 1254

La administración de Aroclor 1254 inducía significativamente la actividad locomotora y aumentaba el comportamiento de erguimiento. En la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, los aumentos en la actividad hiperlocomotora y el comportamiento de erguimiento inducidos por Aroclor 1254 se inhibían notablemente (FIG. 12 y 13).

Efecto farmacológico de extracto de Galla rhols y/o fraxina sobre el comportamiento impulsivo inducido por Aroclor 1254

La administración de Aroclor 1254 aumentaba significativamente el tiempo de permanencia en la zona central de un campo abierto y el número de entradas a la zona central, y el tiempo para entrar por primera vez a la zona central se reducía significativamente, lo que indica un comportamiento impulsivo. En la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, el comportamiento impulsivo inducido por Aroclor 1254 se inhibía notablemente (FIG. 14 a 17).

Efecto farmacológico de extracto de Galla rhols y/o fraxina sobre el trastorno de atención/la disminución de la memoria de aprendizaje inducidos por Aroclor 1254

La administración de Aroclor 1254 reducía significativamente el tiempo dedicado a mostrar interés en un nuevo objeto en una prueba de reconocimiento de nuevos objetos, lo que indica un déficit de atención y una disminución en la memoria de aprendizaje. En la administración conjunta del extracto de Galla rhols y la fraxina, el trastorno de atención/la disminución de la memoria de aprendizaje inducidos por Aroclor 1254 se inhibían notablemente (FIG. 18).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para el uso en la prevención o el tratamiento de la demencia o el trastorno por déficit de atención con hiperactividad, o para el uso en la mejora de la capacidad cognitiva, que comprende un extracto etanólico de Galla rhols y fraxina como ingredientes activos.

2. La composición para el uso según la reivindicación 1, en la que la concentración de fraxina es de 0,1 a 0,5 mM.