ES2899252T3 - Combinación de ingredientes activos, composiciones que los comprenden y su uso en el tratamiento de la sarcopenia - Google Patents
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Abstract
Una combinación de ingredientes activos que comprende ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un extracto de semilla de uva y un extracto de withania.
Description
DESCRIPCIÓN
Combinación de ingredientes activos, composiciones que los comprenden y su uso en el tratamiento de la sarcopenia
Sumario de la invención
El contenido de la presente invención es una combinación novedosa de ingredientes activos, en particular una combinación de ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un extracto de semilla de uva, un extracto de withania y, opcionalmente, ornitina alfa-cetoglutarato. La combinación de la invención es útil en el tratamiento de la sarcopenia y, en general, en las enfermedades que provocan una pérdida de masa muscular y como agente anabólico. Un objeto adicional de la invención es una composición farmacéutica o nutracéutica que comprende la combinación mencionada anteriormente, junto con excipientes y vehículos convencionales.
Campo técnico
Sarcopenia es el término utilizado para describir la pérdida de masa muscular, con una pérdida consiguiente de fuerza y de rendimiento físico, en un sujeto. Las razones que provocan la sarcopenia pueden ser diversos, siendo la más común el sedentarismo, periodos prolongados de inactividad física, por ejemplo como una consecuencia de accidentes o enfermedades, traumas que implican escayolar partes del cuerpo, daño nervioso local, envejecimiento y una dieta deficiente o equivocada. De forma alternativa, la sarcopenia puede ser inducida por enfermedades tales como caquexia, cáncer, SIDA y sepsis o puede derivar de un tratamiento prolongado con glucocorticoides.
Cuando la sarcopenia no puede ser tratada de forma eficaz únicamente con una dieta correcta, a menudo se introducen en la dieta los suplementos alimentarios, tales como, por ejemplo, calcio, vitamina D y vitamina B12, aminoácidos de cadena ramificada, precursores o metabolitos de los mismos.
Objetos de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva combinación de ingredientes activos, particularmente útiles, pero sin limitación, en el tratamiento y/o la prevención de la sarcopenia y, en general, en el tratamiento de cualquier afección o enfermedad que provoque el deterioro de la masa muscular y/o como esteroide anabólico. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica y/o nutracéutica que comprenda la combinación de la invención.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición para su uso en un procedimiento para el tratamiento y/o la prevención de la sarcopenia y, en general, para el tratamiento de cualquier afección o enfermedad que provoque el deterioro de la masa muscular, que comprenda la administración de la combinación o composición de la invención.
Descripción de la invención
El contenido de la invención, según uno de los aspectos de la misma, es una nueva combinación de ingredientes activos que comprende ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacológica y farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente sal de calcio, un extracto de semilla de uva y un extracto de withania.
Según una realización preferida, la combinación comprende, además, ornitina alfa-cetoglutarato.
El ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico (también denominado ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico, en lo sucesivo también HMB) es un metabolito de aminoácido leucina. Se conoce su papel anabólico y anticatabólico. Según la presente invención, se utiliza preferiblemente, ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico en forma de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de forma ventajosa en forma de su sal de calcio.
Según la presente invención, extracto de semillas de uva (también denominadas pepitas de uva) significa un extracto de leucocianidina obtenido de semillas Vitis vinífera L., por ejemplo, mediante extracción con agua y acetona. Tal extracto está disponible comercialmente y es comercializado, por ejemplo, por Indena® Company. En particular, el extracto comercializado por Indena® Company comprende, además de leucocianidinas, también fosfolípidos de soja.
Según la presente invención, extracto de withania significa, preferiblemente, un extracto de Withania somnífera. Preferiblemente, el extracto es un extracto de las raíces de Withania somnifera, también denominado “extracto seco de Ashwagandha”. Además, este producto está disponible comercialmente y es comercializado, por ejemplo, por Vivatis Pharma Company.
Ornitina alfa-cetoglutarato (en lo sucesivo también OKG, por sus siglas en inglés) es un compuesto conocido, utilizado, en general, en el campo deportivo como un esteroide anabólico.
Según una realización preferida, la combinación de la invención es una combinación fija constituida por ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo/extracto de semilla de uva/extracto de withania/ornitina alfa-cetoglutarato, con una relación recíproca de pesos de 1/0,1-0,30/0,1-0,5/2-5, respectivamente. Según una realización preferida, la combinación de la invención es una combinación fija constituida por 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio/extracto de semilla de uva/extracto de withania/ornitina alfa-cetoglutarato, con una relación recíproca de pesos de 1/0,1-0,30/0,1-0,5/2-5, respectivamente, preferiblemente aproximadamente 1/0,15/0,30/3, ventajosamente aproximadamente 1/0,16/0,16/2,3.
Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la combinación descrita anteriormente es particularmente útil en el tratamiento de la sarcopenia y, en general, en el tratamiento de cualquier afección o enfermedad que provoque el deterioro de la masa muscular y también como un esteroide anabólico. En particular, se ha descubierto que los extractos de semilla de uva y de withania contribuyen a potenciar el efecto anabólico del ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico y de la ornitina alfa-cetoglutarato.
Según la presente invención, el término “sarcopenia” denota en la presente memoria cualquier pérdida de masa muscular, con independencia de su origen e incluye la pérdida de fuerza y de rendimiento físico debido al catabolismo muscular.
La invención es, por ejemplo, útil para aumentar la masa muscular durante el entrenamiento o en personas de edad avanzada y debilitadas y en personas que han perdido musculatura debido a su inactividad o a su postración en cama; en las condiciones de caquexia; para proteger al músculo contra daños producidos por un ejercicio intenso y para combatir la sensación de fatiga y/o para mejorar el rendimiento físico.
El contenido de la invención, según otro de los aspectos de la misma, es una composición farmacéutica o nutracéutica que comprende una combinación de ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente la sal de calcio, un extracto de semilla de uva, un extracto de withania y, opcionalmente, ornitina alfa-cetoglutarato, junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
Según una realización preferida, el contenido de la invención es una composición farmacéutica o nutracéutica que comprende una combinación de ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferiblemente la sal de calcio, un extracto de semilla de uva, un extracto de withania y ornitina alfa-cetoglutarato, junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
Preferiblemente, la composición de la invención es para el uso oral, pero se pueden utilizar, de forma eficaz, otras vías de administración.
Según una realización, el objeto de la invención es una composición que comprende
- 1 a 4 g, preferiblemente 1 a 3 g de ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
- 100 a 500 mg, preferiblemente 200 a 400 mg de extracto de semilla de uva, preferiblemente según se ha definido anteriormente;
- 100 a 1000 mg, preferiblemente 200 a 800 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera; y - 1 a 10 g, preferiblemente 2 a 8 g de ornitina alfa-cetoglutarato,
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
Según una realización preferida, el objeto de la invención es una composición que comprende
- 1 a 4 g, preferiblemente 1 a 3 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 100 a 500 mg, preferiblemente 200 a 400 mg de extracto de semilla de uva, preferiblemente según se ha definido anteriormente;
- 100 a 1000 mg, preferiblemente 200 a 800 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera; y - 1 a 10 g, preferiblemente 2 a 8 g de ornitina alfa-cetoglutarato,
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
Según una realización preferida, el objeto de la invención es una composición que comprende
- aproximadamente 1 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- aproximadamente 150 mg de extracto de semilla de uva, preferiblemente según se ha definido anteriormente;
- aproximadamente 300 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera; y
- aproximadamente 3 g de ornitina alfa-cetoglutarato,
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
Según una realización preferida, el contenido de la invención es una composición que comprende
- aproximadamente 1,5 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- aproximadamente 250 mg de extracto de semilla de uva, preferiblemente según se ha definido anteriormente; - aproximadamente 250 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera; y
- aproximadamente 3,5 g de ornitina alfa-cetoglutarato,
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
Tales composiciones son adecuadas para la administración oral al sujeto que ha de ser tratado, una o más veces al día.
La dosificación de la composición que ha de ser administrada depende de la necesidad —por ejemplo de la edad del sujeto, del tipo de enfermedad, de la condición de salud, etc.—; tales dosificaciones pueden ser determinadas por el médico.
Según una realización preferida, las composiciones son administradas dos veces al día, para una dosificación diaria total de
- aproximadamente 2-3 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- aproximadamente 300-500 mg de extracto de semilla de uva, preferiblemente según se ha definido anteriormente;
- aproximadamente 500-600 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera; y
- aproximadamente 6-7 g de ornitina alfa-cetoglutarato.
Sin embargo, se pueden administrar otras dosificaciones según la necesidad, según se ha mencionado.
El sujeto que ha de ser tratado con la composición de la invención es, preferiblemente, un mamífero; en particular el ser humano.
La composición de la invención es, preferiblemente, una composición farmacéutica formulada para el uso oral, por ejemplo en forma de composiciones farmacéuticas o nutracéuticas tales como comprimidos, revestidos opcionalmente, gránulos, gránulos finos, polvos, cápsulas duras, cápsulas blandas, jarabes, emulsiones, suspensiones y soluciones adecuados para la administración oral. Sin embargo, se pueden utilizar otras formas farmacéuticas.
Según una realización preferida, la composición de la invención tiene forma oral sólida o semisólida, seleccionada, de forma ventajosa, entre comprimidos, polvos, gránulos y gel. Tal composición puede ser tomada sola o con agua, o mezclada con otros alimentos, por ejemplo con yogur o similar.
De forma alternativa, la composición de la invención puede tener una forma bebible lista para su uso, tal como, por ejemplo, en forma de bolsitas para beber, del tipo “bolsa tubular”, preferiblemente en forma de gel.
Los tipos de aditivos farmacéuticos utilizados para la preparación de la composición de la invención, las relaciones de las cantidades de los aditivos con respecto al ingrediente activo y los procedimientos para preparar la composición farmacéutica pueden ser seleccionados, de forma adecuada, por un experto en la técnica. Se pueden utilizar sustancias orgánicas o inorgánicas, o sustancias sólidas o líquidas, como excipientes y vehículos, siempre que sean comestibles y farmacéuticamente aceptables.
Ejemplos de los excipientes utilizados para la preparación de las composiciones farmacéuticas sólidas incluyen, por ejemplo, maltodextrinas, derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, sacarosa, ésteres de sacarosa, ácido cítrico, dióxido de silicio, amidas, talco, celulosa, dextrinas, caolín, carbonato de calcio, ácido esteárico o estearato de magnesio, lactosa, polietilenglicol, manitol, sorbitol, agentes quelantes, agentes antiaglutinantes, sustitutos de azúcar, agentes conservantes y aromas.
Para la preparación de composiciones líquidas para la administración oral, se puede utilizar un diluyente inerte convencional tal como agua o un aceite, por ejemplo un aceite vegetal. La composición líquida puede incluir
adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes de suspensión, edulcorantes, aromas, colorantes y conservantes además del diluyente inerte. La composición líquida puede incluirse en cápsulas de un material absorbible, tal como gelatina.
Los sustitutos de azúcar pueden ser uno o más azúcares naturales, reducidos opcionalmente, tales como, por ejemplo, sacarosa, sucralosa, dextrosa, xilitol, manitol o sorbitol, o un producto sintético tal como, por ejemplo, sacarina de sodio, aspartamo, acesulfamo K o sucralosa. También pueden añadirse agentes acidificantes.
Los agentes aromatizantes son aromas y sabores farmacéuticamente aceptables procedentes de aceites sintéticos o aceites naturales, extraídos estos de plantas, flores, frutas y combinaciones de los mismos, tales como, por ejemplo, canela, menta, anís y hojas de cítricos, almendras amargas, cítricos, en particular aceites de naranja y/o de limón, lima, vainilla, chocolate y pomelo. De forma ventajosa, se pueden utilizar aromas de chocolate, vainilla o eucalipto y esencias de fruta, en particular manzana, pera, melocotón, fresa, albaricoque, naranja, limón y uva.
La composición de la invención puede comprender, además, otros ingredientes activos o extractos vegetales útiles en el tratamiento y/o la prevención de la sarcopenia.
A modo de ejemplo, las composiciones de la invención pueden comprender aminoácidos, por ejemplo uno o más aminoácidos seleccionados entre L-leucina, L-valina, L-isoleucina, L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-cistina, L-cisteína, L-fenilalanina, L-tirosina, L-treonina, L-glutamina, L-arginina y L-triptófano y/o una o más vitaminas, por ejemplo vitamina B6 y vitamina D3.
Las dosificaciones de los aminoácidos y las vitaminas pueden ser identificadas por las cantidades diarias recomendadas o pueden ser seleccionadas por el médico o el dietista en función de las necesidades del sujeto que ha de ser tratado. Se proporcionan ejemplos en la Sección experimental de la presente invención.
A modo de ejemplo, se pueden añadir a la composición aproximadamente 5-20 g, por ejemplo 8-12 g, de forma ventajosa 10 g de una mezcla de aminoácidos y/o aproximadamente 1-3 mg de vitaminas del grupo B, preferiblemente vitamina B6 y/o aproximadamente 10-30 microgramos de vitaminas del grupo D, preferiblemente vitamina D3.
Se pueden añadir, adicionalmente, otros componentes a la composición de la invención, tal como, por ejemplo, creatina, por ejemplo en una cantidad de 0,5-3 gramos.
Además del tratamiento de la sarcopenia, según se ha definido anteriormente, se puede utilizar convenientemente como agente anabólico la combinación y la composición de la invención, preferiblemente la composición que comprende aminoácidos y/o vitaminas, en particular por deportistas o en cualquier caso por sujetos que buscan aumentar su masa muscular.
Los componentes adicionales preferidos se indican en los ejemplos ilustrativos de las composiciones de la invención descritas en la Sección experimental.
La composición de la invención puede ser envasada en envases de dosis unitarias o multidosis, según procedimientos convencionales bien conocidos por el experto en la técnica.
Según una realización preferida, las composiciones de la invención son envasadas en dosis unitarias orales, por ejemplo bolsitas, cápsulas o comprimidos.
El contenido de la invención, según otro de los aspectos de la misma, es el uso de la combinación y composición farmacéutica y nutracéutica según la invención para el tratamiento y/o la prevención de la sarcopenia.
Por lo tanto, la combinación y las composiciones de la invención son particularmente útiles para aumentar la masa muscular (aumentando la síntesis de proteínas y reduciendo el deterioro muscular) durante el entrenamiento o en personas de edad avanzada y debilitadas y en personas que han perdido musculatura debido a su inactividad o a su postración en cama; para proteger el músculo contra los daños inducidos por un ejercicio intenso; y para combatir la sensación de fatiga y/o para mejorar el rendimiento físico.
La combinación y la composición según la invención para su uso en el tratamiento de la sarcopenia y para los usos definidos anteriormente son un aspecto adicional de la invención.
El contenido de la invención, según otro de los aspectos de la misma, es un procedimiento para el tratamiento y/o la prevención de la sarcopenia, que comprende la administración de una dosificación eficaz de la combinación y/o de la composición según la invención a un sujeto necesitado de las mismas.
La combinación de la invención ha sido objeto de ensayo en diversos experimentos in vivo, in vitro y ex vivo.
Experimento 1
Prueba en rata tras un tratamiento crónico en un modelo in vivo de sarcopenia
Se ha reproducido un modelo de daño muscular mediante una administración intraperitoneal a la rata de una dosis diaria de 600 microgramos/kg de dexametasona durante 15 días hasta una pérdida evidente de peso corporal con respecto al grupo de control tratado con el vehículo.
La combinación de las sustancias que están siendo examinadas ha sido administrada oralmente cada día durante toda la duración del tratamiento. Se ha evaluado la eficacia de la combinación compuesta así:
• 250 microgramos/kg de extracto de semilla de uva
• 250 microgramos/kg de extracto de withania
• 300 microgramos/kg de HMB
• 500 microgramos/kg de OKG.
Comenzando el día 1, los distintos grupos de animales han sido tratados, respectivamente, con:
- únicamente dexametasona,
- dexametasona y la combinación definida anteriormente,
- los respectivos vehículos (controles).
El peso corporal ha sido monitorizado diariamente según se documenta en la Figura 1. El tratamiento con dexametasona induce una pérdida repentina de peso que continúa progresivamente hasta el final de la observación el día 15. Los animales que reciben el tratamiento con la combinación tienen un peso que es siempre mayor que el de los tratados únicamente con dexametasona. Comenzando el día 7, tal aumento es significativo y el peso permanece constante hasta el día 15. El aumento del peso corporal se correlaciona con una mejora de las capacidades funcionales evaluadas por medio de la prueba de agarre que permite la determinación de la fuerza aplicada por el animal para mantener el agarre y contrarrestar la tracción. Según se muestra en la Figura 2, el efecto de reducción de la fuerza inducida por la dexametasona es reducido significativamente por el tratamiento con la combinación.
La mayor fuerza se corresponde con una mejor coordinación motora estimulada en la “prueba de varilla giratoria” por el requerimiento de mantener el equilibrio sobre una varilla giratoria. Los animales tratados frecuentemente con la combinación muestran una reducción del número de caídas y un mayor periodo de tiempo de mantenimiento en equilibrio sobre la varilla semigiratoria (Figura 3). Para extender tal investigación, los animales fueron sometidos a una evaluación de sus capacidades autónoma, neurológica y motora observando una serie de parámetros documentados en la Tabla 1 (Figura 10). Tales evaluaciones, resumidas como prueba de Irwin, permitieron resaltar las capacidades de protección de la combinación contra las alteraciones inducidas por la dexametasona y, no menos importante, permitieron excluir daños del perfil neurológico inducidos por la combinación, confirmando, por lo tanto, un excelente perfil de seguridad. Durante la prueba, se ha llevado a cabo la evaluación de las capacidades motora y neurológica por medio de una prueba de Irwin llevada a cabo el día 15. Se han evaluado los signos de una forma semicuantitativa según una escala predeterminada (0 a 4, -4 a 0, 0-4 a 4). Los datos hacen referencia a una evaluación de 10 ratas por grupo divididas en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,01 vs. vehículo vehículo; 11 P<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Al final de las observaciones del comportamiento (día 15), se han sacrificado los animales y se han explantado y analizado algunos músculos específicos de la pata trasera.
La Figura 4 muestra la reducción drástica de peso de los músculos gastrocnemius, tibialis y extensor digitorum inducida por la dexametasona. Se debería hacer notar que la reducción de peso corporal de los animales es de aproximadamente un 20% tras un tratamiento con dexametasona mientras que el peso muscular se reduce un 40%, lo que indica un mayor daño de las estructuras musculares con respecto a otros tejidos. Los mismos músculos recogidos de los animales tratados con la combinación tienen un peso significativamente mayor. La capacidad de la combinación para evitar casi completamente tal alteración sugiere que las propiedades tónicas de la combinación probada están casi completamente dirigidas hacia el tejido muscular. Sin embargo, se documenta que hay una mejora apreciable del índice de sarcopenia (Figura 5) solo para el músculo gastrocnemius. Se obtiene tal valor dividiendo el peso muscular por el peso corporal total, dado que los efectos de la combinación tienen como resultado un aumento general del peso corporal (claramente correlacionado con un mayor bienestar del animal), las diferencias de tal relación resultan estar equilibradas por el aumento simultáneo del numerador y del denominador. Para investigar un posible mecanismo para la eficacia mostrada por la combinación, se ha evaluado el estado de oxidación del músculo midiendo la oxidación de los lípidos y de las proteínas. El músculo gastrocnemius ha sido procesado y hecho reaccionar con ácido tiobarbitúrico para permitir la detección de las sustancias reactivas al ácido (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico-TBARS; Figura 5). La dexametasona fomenta un aumento doble de peroxidación lipídica con respecto a los controles tratados con el vehículo. Aún más sorprendente es el efecto de
oxidación de las proteínas evaluadas como la presencia de proteínas carboniladas que aumentan en aproximadamente 5 veces (Figura 7). En ambos casos el tratamiento con la combinación evita significativamente el estrés oxidativo tanto de los lípidos como de las proteínas.
Experimento 2
Prueba en rata tras un tratamiento crónico en un modelo in vitro de sarcopenia
El estudio de la acción trófica del músculo de los compuestos investigados ha sido llevado a cabo en una línea de mioblastos murinos C2C12. Las alteraciones han sido producidas por medio de incubaciones durante tiempos crecientes con 1 pM de dexametasona (Lu y otros, Int jour Biol Mol 2013, 61: 7-16), que puede inducir una atrofia muscular; el receptor de glucocorticoides así activado aumenta la transcripción de sus genes diana que fomenta la expresión de las proteínas que pertenecen a la familia FoxO y de E3 ubiquitina ligasas (Shimizu y otros, Cell Metab, 13: 170-182, 2011) que actúan en el ámbito celular muscular reduciendo el trofismo y una nueva formación. La acción de la combinación que está siendo examinada ha sido resaltada tras la incubación con concentraciones escalares de los compuestos individuales o en mezcla, en particular se han probado extractos vegetales de withania, semillas de uva tinta y sal de calcio de hidroximetilbutirato.
El tratamiento de mioblastos con 1 microM de dexametasona durante 48 h reduce de forma significativa la viabilidad celular evaluada por el ensayo MTT (véase la Sección experimental) en aproximadamente un 70%.
Las Figuras 8 y 9 muestran con claridad cómo aumenta significativamente la adición de extractos de semilla de uva y de withania la actividad del HMB sobre la protección celular, tras el daño celular producido por la dexametasona. Experimento 3
Prueba en rata tras un tratamiento crónico en un modelo ex vivo de sarcopenia
Se ha evaluado el efecto de la administración oral diaria en un modelo de daño muscular inducido por la dexametasona (administrada intraperitonealmente a la rata a la dosis diaria de 600 pg/kg durante 15 días; Yamamoto y otros, Muscle and Nerve, 41: 819-827, 2010).
Durante el tratamiento se han monitorizado el peso corporal y la fuerza aplicada por medio de la prueba de agarre, la coordinación motora y la resistencia al movimiento por medio de la prueba de varilla giratoria, el cuadro neurológico por medio de la prueba EON. Se han confirmado las mejoras funcionales inducidas por la mezcla que está siendo examinada, como se resalta en el anterior informe.
Al final del tratamiento, se han llevado a cabo mediciones morfométricas y moleculares sobre los músculos individuales; en particular se han evaluado los músculos gastrocnemius y extensor digitorum.
El análisis histológico, llevado a cabo por medio de hematoxilina-eosina (Figura 11) y el etiquetado con faloidina de miosina (Figura 12), mostró una alteración significativa de la estructura en el músculo extensor digitorum tras el tratamiento con dexametasona. El tratamiento con la mezcla (“complejo” en las figuras) indujo una mejora que es cuantificable por el análisis morfométrico. En particular, el complejo puede reactivar el área de las fibras (Figura 13), el número de fibras por sección (Figura 14), el perímetro de las fibras (Figura 15) y, finalmente, el mínimo diámetro de Feret considerado la medida más correcta para la evaluación del estado morfológico del músculo. El diámetro de Feret se define como la distancia mínima entre dos tangentes de fibra paralelas entre sí; permite evaluar la medida real de fibras que son no homogéneas por su naturaleza y preparación (Figura 16). En la Tabla 1, se documenta el nivel de lipofuscina medido en el tejido muscular como un marcador de estrés de los procesos de autofagosomalisosoma. El tratamiento con el complejo que está siendo examinado reduce significativamente la cantidad de lipofuscina. Centrándose en los estados de los miotubos, la Figura 17 muestra la normalización del diámetro en los músculos explantados de animales tratados reiteradamente con el complejo. No se han descubierto alteraciones relativas al número de núcleos por cada miotubo. El análisis del músculo gastrocnemius mostró resultados análogos. Experimento 4
Prueba en rata tras un tratamiento crónico en un modelo in vivo de sarcopenia
Se ha evaluado en un modelo de daño muscular inducido por un tratamiento de quimioterapia con el agente antitumoral oxaliplatino.
En particular, se ha reproducido el modelo de daño muscular administrando intraperitonealmente a la rata oxaliplatino a la dosis diaria de 2,4 mg kg_1 durante 15 días (Cavaletti y otros, Eur J Cancer 2001; Di Cesare Mannelli y otros, Exp Neurol 2014) hasta una pérdida manifiesta de peso corporal con respecto al grupo de control tratado con el vehículo.
La combinación de las sustancias que están siendo examinadas ha sido administrada oralmente cada día durante toda la duración del tratamiento de quimioterapia. Se ha determinado la eficacia de la combinación compuesta así:
• 250 mg kg-1 de extracto de semilla de uva (Vitis vinifera)
• 250 mg kg-1 de extracto de withania (Withania somnífera)
• 300 mg kg-1 de HMB
• 500 mg kg-1 de OKG
Comenzando el día 1, se han tratado los distintos grupos de animales, respectivamente, con
- oxaliplatino,
- oxaliplatino y la combinación,
- los respectivos vehículos.
Se ha monitorizado diariamente el peso corporal según se documenta en la Figura 19. El tratamiento con oxaliplatino evita la ganancia de peso fisiológico durante un tiempo. Comenzado el día 9, los animales que reciben el tratamiento con la mezcla muestran un peso que es significativamente mayor que el de los tratados con oxaliplatino por sí solo. El aumento de peso corporal se correlaciona con una mejora de las capacidades funcionales evaluadas por medio de la prueba de agarre que permite la determinación de la fuerza aplicada por el animal para mantener el agarre y contrarrestar la tracción. Según se muestra en la Figura 20, se evita significativamente el efecto de una reducción de la fuerza inducida por el oxaliplatino por medio del tratamiento con el complejo.
La mayor fuerza se corresponde con una mejor coordinación motora estimulada en la prueba de varilla giratoria por el requisito de mantener el equilibrio sobre una varilla giratoria. Los animales tratados reiteradamente con el complejo molecular constituido por extractos de uva tinta y de withania, HMB y OKG tienen una reducción del número de caídas y un mayor tiempo de permanencia en equilibrio durante el movimiento sobre la varilla semigiratoria, lo que sugiere, por lo tanto, una mayor resistencia a la actividad física (Figura 21). Para extender tal investigación, los animales fueron sometidos a una evaluación de sus capacidades autónoma, neurológica y motora observando una serie de parámetros documentados en la Tabla de la Figura 22. Tales evaluaciones, resumidas como prueba de Irwin, permitieron resaltar las capacidades de protección del complejo contra las alteraciones inducidas por el agente quimioterapéutico y, no menos importante, permitieron excluir daños del perfil neurológico inducidos por la mezcla, confirmando, por lo tanto, un buen perfil de seguridad.
Al final de las observaciones del comportamiento (día 15), los animales han sido sacrificados y algunos músculos de la pata trasera han sido explantados y analizados. La Figura 23 muestra la reducción drástica de peso de los músculos gastrocnemius, tibialis y extensor digitorum inducida por el oxaliplatino. Se debería hacer notar que la reducción del peso corporal de los animales es de aproximadamente un 15% tras un tratamiento con dexametasona mientras que el peso muscular se reduce un 50% indicando un mayor daño de las estructuras musculares con respecto a otros tejidos. Los mismos músculos recogidos de los animales tratados con el complejo tienen un peso significativamente mayor. Se documenta que para los músculos gastrocnemius y tibialis hay una mejora apreciable del índice de sarcopenia (Figura 24). Además, los músculos extensor digitorum y gastrocnemius fueron sometidos a un estudio morfométrico y molecular. El análisis histológico llevado a cabo por medio de hematoxilina-eosina (Figura 25) y el etiquetado con faloidina de miosina (Figura 26) mostró una alteración significativa de la estructura en el músculo extensor digitorum tras el tratamiento con oxaliplatino. El tratamiento con la mezcla (“complejo” en las figuras) indujo una mejora que es cuantificable por el análisis morfométrico. En particular, el complejo puede reactivar el área de las fibras (Figura 27), el número de fibras por sección (Figura 28), el perímetro de las fibras (Figura 29) y, finalmente, el mínimo diámetro de Feret (Figura 30) considerado la medida más correcta para la evaluación del estado morfológico del músculo. El diámetro de Feret se define como la distancia mínima entre dos tangentes de fibra paralelas entre sí; permite evaluar la medida real de fibras que son no homogéneas por su naturaleza y preparación. Centrándose en los estados de los miotubos, la Figura 31 muestra la normalización del diámetro en los músculos explantados de animales tratados reiteradamente con el complejo. No se han descubierto alteraciones relativas al número de núcleos por cada miotubo (Figura 32). El análisis del músculo gastrocnemius mostró resultados análogos.
Para investigar un posible mecanismo para la eficacia mostrada por el complejo, se ha evaluado el estado de oxidación del músculo midiendo la oxidación de los lípidos y de las proteínas. El músculo extensor digitalis ha sido procesado y hecho reaccionar con ácido tiobarbitúrico para permitir la detección de las sustancias reactivas al ácido (TBARS; Figura 33). En los animales tratados con oxaliplatino por sí solo se ha observado un aumento doble de peroxidación lipídica con respecto a los controles tratados con el vehículo. Aún más sorprendente es el efecto de oxidación de las proteínas evaluadas como la presencia de proteínas carboniladas que aumentan aproximadamente 4 veces (Figura 34). En ambos casos, el tratamiento con el complejo evita significativamente el estrés oxidativo tanto de lípidos como de proteínas. La desregulación redox inducida por el oxaliplatino también ha sido verificada midiendo la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en el músculo (Figura 35). La reducción de la actividad enzimática inducida por el oxaliplatino se evita significativamente mediante el tratamiento con el complejo. El cuadro
de protección antioxidante se encuentra de acuerdo con el perfil farmacodinámico del extracto de semilla de uva. Además, se ha evaluado la recuperación del tejido muscular midiendo los niveles plasmáticos de creatina quinasa (Figura 36), una enzima muscular liberada al torrente sanguíneo tras un daño muscular. El aumento drástico (aproximadamente 7 veces) inducido por el oxaliplatino es reducido un 50% mediante el tratamiento con la mezcla. Tal efecto puede relacionarse con las propiedades del extracto de withania. De forma análoga, el aumento plasmático de testosterona inducido por el complejo está de acuerdo con lo indicado en la bibliografía relativa a los efectos de la withania. Por otra parte, el aumento de glutamina, que favorece la síntesis de proteínas e inhibe la degradación muscular, es atribuible a la OKG, un precursor de aminoácido. Finalmente, la Figura 37 muestra el aumento, dependiente del oxaliplatino, de la expresión de NF-kB (factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de células B activadas) en el músculo, un complejo proteínico con actividad catabólica. El tratamiento reiterado con el complejo evita el aumento de tal mediador inflamatorio.
Conclusiones
Los resultados experimentales demuestran claramente que la combinación de la invención evita de forma eficaz el daño muscular inducido por la dexametasona. Un aumento general del peso corporal está soportado por una pronunciada acción de fomento de la masa muscular. Tales efectos pueden mejorar la fuerza y las capacidades de motoras de los animales. La protección muscular está asociada con una restauración del equilibrio redox de la estructura muscular. Además, los resultados muestran que los componentes de la combinación presentan un efecto sinérgico, dado que la administración simultánea de HMB, extractos de semillas de uva y de withania produce un efecto, con respecto a los daños inducidos por la dexametasona, que es mucho mayor que el que podría lograrse con la administración de HMB por sí solo.
La combinación puede contrarrestar, además, el daño muscular inducido por el oxaliplatino. Un aumento general del peso corporal está soportado por una pronunciada acción de fomento de la masa muscular. Tales efectos pueden mejorar la fuerza y las capacidades motoras de los animales. La protección muscular se combina con una restauración del equilibrio redox de la estructura muscular junto con un aumento de las actividades anabólicas y una reducción de las señales catabólicas.
En la siguiente Sección experimental se documentan los materiales y los procedimientos utilizados.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Evaluación del peso corporal como una función del tiempo. Los datos se documentan como media ± S.E.M. (error estándar de la media, por sus siglas en inglés) de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Figura 2. Evaluación de la fuerza de agarre. Prueba de medición de la fuerza de agarre llevada a cabo el día 15. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de 10 ratas para cada grupo divididas en dos sesiones experimentales distintas, *p<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Figura 3. Evaluación de la coordinación motora. Prueba de varilla giratoria llevada a cabo el día 15; se han calculado el número de caídas y el tiempo pasado en equilibrio sobre la varilla giratoria a los 600 s. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *p<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Figura 4. Evaluación ex vivo del peso muscular. El día 15 se han explantado y pesado algunos músculos de la pata trasera. En particular, se documentan los pesos de los músculos gastrocnemius, tibialis y extensor digitorum. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los músculos individuales obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *p<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Figura 5. Evaluación del índice de sarcopenia referido al peso de la pata trasera. El día 15 se han explantado y pesado algunos músculos de la pata trasera. En particular, se documentan los pesos de los músculos gastrocnemius, tibialis y extensor digitorum. Se ha obtenido el índice de sarcopenia dividiendo el peso de cada músculo por el peso total del animal. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *p<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Figura 6. Evaluación de la peroxidación lipídica muscular. El día 15 se ha explantado el músculo gastrocnemius. La medición del estado de oxidación de los lípidos ha sido llevada a cabo por medio de la reacción con ácido tiobarbitúrico y los resultados se expresan como una cantidad TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico). Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *p<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo. Figura 7. Evaluación de carbonilación de proteínas musculares. El día 15 se ha explantado el músculo gastrocnemius. La medición del estado de oxidación de las proteínas ha sido llevada a cabo por medio de
inmunoelectrotransferencia después de hacer reaccionar el homogenado proteínico con DNPH (2-4-dinitrofenilhidrazina). Para cada muestra se ha llevado a cabo la normalización con respecto a la expresión de la proteína de referencia beta-actina. En el gráfico se muestra la medición de la densidad integrada y en el inserto una imagen representativa de la inmunoelectrotransferencia con los pesos moleculares respectivos, el control se denota como C, el tratado con dexametasona como D, el tratado con la combinación D C. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *p<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. dexametasona vehículo.
Figura 8: Evaluación de la viabilidad celular en C2C12 (miocitos) tratados con 1 pM de dexametasona con y sin HMB. Tratamientos de 48 horas. Prueba MMT (con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. **p<0,01 vs. dexametasona; AAp<0,01 vs. 1 dexametasona.
Figura 9: Evaluación de la viabilidad celular en C2C12 (miocitos) tratados con 1 pM de dexametasona con y sin una mezcla de extractos de semilla de uva, de withania y HMB. Tratamientos de 48 horas. Prueba MMT (con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. **p<0,01 vs. dexametasona; AAp<0,01 vs. 1 dexametasona.
La Figura 10 muestra los resultados de la prueba de Irwin, obtenidos con la combinación definida en el Experimento 1.
La Figura 11 muestra la histología del músculo mediante tinción con hematoxilina-eosina en el Experimento 3. La Figura 12 muestra la inmunohistoquímica de F-actina por la faloidina del Experimento 3.
La Figura 13 muestra el área de las fibras del Experimento 3.
La Figura 14 muestra el número de las fibras del Experimento 3.
La Figura 15 muestra el perímetro de las fibras del Experimento 3.
La Figura 16 muestra el mínimo diámetro de Feret del Experimento 3.
La Figura 17 muestra el diámetro de miotubos del Experimento 3.
La Figura 19 muestra la evaluación del peso corporal como una función del tiempo. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 20 muestra la evaluación de la fuerza perdida. La prueba de medición de la fuerza de agarre se llevó a cabo el día 15. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 21 muestra la evaluación de la coordinación motora y de la resistencia al ejercicio. La prueba de varilla giratoria se llevó a cabo el día 15; se han evaluado el número de caídas y el tiempo pasado en equilibrio sobre la varilla giratoria a los 600 s. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 22 muestra la evaluación de las capacidades motora y neurológica mediante la prueba de Irwin llevada a cabo el día 15. Se han evaluado los signos de una forma semicuantitativa según una escala predeterminada (0 a 4, -4 a 0, o -4 a 4). Los datos hacen referencia a una evaluación de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas.
La Figura 23 muestra la evaluación ex vivo del peso muscular. El día 15 se han explantado y pesado algunos músculos de la pata trasera. En particular, se documentan los pesos de los músculos gastrocnemius, tibialis y extensor digitorum. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los músculos individuales obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 24 muestra la evaluación del índice de sarcopenia referido al peso de los músculos de la pata trasera. El día 15 se han explantado y pesado algunos músculos de la pata trasera. En particular, se documentan los pesos de los músculos gastrocnemius, tibialis y extensor digitorum. Se ha obtenido el índice de sarcopenia dividiendo el peso década músculo por el peso total del animal. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 25 muestra una muestra histológica.
La Figura 26 muestra la morfometría y los miotubos.
La Figura 27 muestra el área de las fibras. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 28 muestra el número de las fibras. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 29 muestra el perímetro de las fibras. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 30 documenta el mínimo diámetro de Feret. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, ** P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 31 muestra el diámetro de los miotubos. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, *P<0,05 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 32 muestra el número de núcleos por miotubo. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas.
La Figura 33 muestra la evaluación de la peroxidación lipídica muscular. El día 15 se ha explantado el músculo gastrocnemius. La medición del estado de oxidación de los lípidos se ha llevado a cabo por medio de la reacción con ácido tiobarbitúrico y los resultados se expresan como cantidad de TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico). Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, ** P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 34 muestra la evaluación de la carbonilación de las proteínas musculares. El día 15 se ha explantado el músculo gastrocnemius. La medición del estado de oxidación de las proteínas ha sido llevada a cabo por medio de inmunoelectrotransferencia después de hacer reaccionar el homogenado proteínico con DNPH (2-4-dinitrofenilhidrazina). Para cada muestra se ha llevado la normalización con respecto a la expresión de la proteína de referencia beta-actina. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, ** P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,01 vs. oxaliplatino vehículo.
La Figura 35 muestra la evaluación de la actividad enzimática de la superóxido dismutasa.
La Figura 36 muestra la evaluación de la actividad enzimática de la superóxido dismutasa.
La Figura 37 muestra la evaluación de los niveles musculares de NF-kB. El día 15 se ha explantado el músculo gastrocnemius. La medición del estado de oxidación de las proteínas ha sido llevada a cabo por medio de inmunoelectrotransferencia. Para cada muestra se ha llevado a cabo la normalización con respecto a la expresión de la proteína de referencia beta-actina. Los datos se documentan como media ± S.E.M. de los valores obtenidos de 10 ratas por grupo, que se dividen en dos sesiones experimentales distintas, ** P<0,01 vs. vehículo vehículo; Ap<0,05 vs. oxaliplatino vehículo.
Sección experimental
Ejemplo 1
Materiales y procedimientos
Experimento 1
Animales
Se han utilizado ratas macho Sprague-Dawley de aproximadamente 200 g proporcionadas por Harlan Company, Italia. Los animales han sido enjaulados en grupos de cuatro, en jaulas de dimensiones de 26*41 cm en el Centro per la Stabulazione Animali da Laboratorio (Ce.S.A.L.) de la Universita di Firenze con un ciclo circadiano de 12 h con agua y alimento “ad libitum”. Las ratas han sido alimentadas con una dieta estándar y enjauladas a una temperatura de 23±1°C. El procedimiento experimental ha sido aprobado por el comité local para el control de la experimentación sobre animales de laboratorio. Todos los experimentos son llevados a cabo según legislaciones del Consejo
Europeo del 24 de noviembre de 1986 (DL 116/92; 86/609/EEC) relativas a la manipulación de animales de investigación y de acuerdo con el “National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”, reconociendo las pautas del “ International Association for the Study of Pain”. Se han tomado todas las medidas necesarias para reducir al mínimo tanto el número de los animales como su malestar.
Modelo de daño muscular inducido por la dexametasona
Se ha administrado intraperitonealmente dexametasona a la rata a la dosis diaria de 600 microgramos/kg durante 15 días, hasta una pérdida evidente del peso corporal con respecto al grupo de control tratado con el vehículo.
Evaluación de la función muscular y de las capacidades motoras
Se ha medido la fuerza de agarre por medio de la prueba de fuerza de agarre. Se ha analizado adicionalmente la integridad de la capacidad de coordinación motora del animal con la ayuda del instrumento de varilla giratoria utilizado a la velocidad de 10 revoluciones por minuto. Se colocó el animal sobre una varilla giratoria durante 10 minutos, se han medido el número de caídas y el tiempo total pasado en equilibrio. Tras un máximo de 6 caídas del animal se ha considerado completada la sesión.
Prueba de Irwin
Se ha llevado a cabo la prueba según el trabajo de Irwin para evaluar algunos parámetros del comportamiento tales como: comportamiento (actividad espontánea, pasividad, curiosidad, etc.), excitación del S.N.C. (temblores, convulsiones, etc.), movimientos (ataxia, estereotipia, etc.), tono muscular (fuerza física, etc.), reflejos, signos involuntarios (piloerección, exoftalmía, salivación, etc.), toxicidad (muerte instantánea o retardada). Se han evaluado todos los parámetros en un intervalo con límites de 0-4/4-0 (excepto la medición de la temperatura corporal que es de -4/+4 dependiendo de si es hipertermia o hipotermia).
Biopsias tisulares
Al final de los tratamientos los animales han sido sacrificados y se han extirpado los músculos gastrocnemius, tibialis anterior y extensor digitorum. Se extirparon los tendones y el tejido conectivo de los músculos y se analizaron estos. Lipoperioxidación (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, TBARS)
Se ha añadido al lisado tisular 4 ml de ácido tiobarbitúrico 36 mM (Sigma-Alemania) (en una solución de ácido acético al 10% (Merck-Alemania) llevada hasta un pH de 4,0 con NaOH (Merck-Alemania). Las muestras han sido hervidas durante 1 hora. La reacción ha sido apagada colocando los viales en hielo, la solución ha sido centrifugada durante 10 minutos a 1.600 * g a 4°C. La fluorescencia resultante de la reacción entre el dialdehído malonílico y el ácido tiobarbitúrico ha sido leída a una longitud de onda de excitación de 530 nm y a una longitud de onda de emisión de 550 nm (Cayman Chemical Company-EE. UU.) en un lector de fluorescencia Perkin-Elmer.
Oxidación de proteínas, evaluación del nivel de carbonilación de las proteínas
El lisado tisular ha sido lisado en un tampón compuesto de 50 mM de Tris-HCl con un pH de 8,0, 150 nM de NaCl, 1 mM de EDTA, Triton X-100 al 0,5%, inhibidor de proteasa cOmplete (Roche-Alemania) y experimentó un ciclo de congelación/descongelación para completar la lisis de las membranas. La suspensión ha sido centrifugada a 5000 * g a 4°C, la solución sobrenadante ha sido almacenada y se ha llevado a cabo la dosificación proteínica en la misma por medio del ensayo de ácido bicinconínico (Sigma-Alemania).
Se han desnaturalizado 10 g de proteínas añadiendo SDS (Sigma-Alemania) para obtener una concentración final de SDS al 6%. Entonces, se han derivatizado las muestras añadiendo 10 mM de DNPH (Sigma-Alemania) (2-4-dinitrofenilhidrazina) e incubándolas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las proteínas de cada muestra han sido esclarecidas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% (Bio-Rad-CA) y transferidas sobre una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad-CA). Tras bloquear los sitios no específicos en una solución de albúmina al 1% (Sigma-Alemania) en tampón fosfato al que se ha añadido Tween 20 al 0,1% (Sigma-Alemania), se ha incubado la membrana con un anticuerpo anti-DNPH (1:5000; Chemicon International) durante la noche a 4°C. La incubación siguió con un anticuerpo secundario anticonejo conjugado con una peroxidasa (1:5000, Cell signaling-EE. UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se ha evaluado la expresión proteínica mediante la técnica de quimioluminiscencia (ECL; Pierce-EE. UU.); se ha llevado a cabo el análisis densitométrico utilizando el soporte lógico para el análisis de imágenes “Scion Image”. Para cada muestra se ha llevado a cabo la normalización con respecto a la expresión de la proteína de referencia beta-actina.
Ejemplo 2
Experimento 2
Cultivos celulares
Se han obtenido cultivos de mioblastos murinos (C2C12) de la American Type Culture Collection (Manassas, EE. UU.). Las células han sido cultivadas en DMEM rico en glucosa que contenía suero fetal bovino (SFB) al 10%, 2mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Las células han sido almacenadas en una incubadora humidificada a 37°C y con CO2 al 5% (v/v). Se ha inducido la diferenciación de los mioblastos en miotubos tras alcanzar el 80% de confluencia celular, sustituyendo el SFB por suero equino al 2%. Tras 7 días de incubación el cultivo mostró la formación característica de miotubos.
Tratamientos farmacológicos
Los cultivos de mioblastos han sido tratados con dexametasona (Sigma - Italia), Loganina (Apharm, Italia), Paeoniflorina (Apharm, Italia), extracto de withania (Apharm, Italia), extracto de semilla de uva (Farmalabor, Italia) e hidroximetilbutirato de calcio (HMB) (Barentz - Italia) a diversas concentraciones dependiendo de los distintos requisitos experimentales.
Ensayo de viabilidad celular (MTT)
Se han puesto en placa mioblastos murinos (C2C12) a 3000 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contenía un volumen de 200 microlitros de medio de cultivo. Tras 48 horas, las células han sido tratadas dependiendo de los distintos requisitos experimentales, utilizando DMEM blanco como vehículo. En cuanto al modelo de daño celular inducido por la dexametasona, las células han sido incubadas con distintas concentraciones de corticosteroide con o sin las sustancias que están siendo examinadas. Estas han sido sometidas a prueba tanto en combinación como por sí solas sin el corticosteroide.
Al final de los distintos tratamientos farmacológicos las células han sido lavadas con PBS y se ha añadido a cada pocillo una solución de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, Sigma-Alemania) a una concentración de 1 mg/ml en DMEM blanco, las células han sido incubadas durante 1 hora a 37°C en tal solución. Al final de la incubación se ha extraído la solución de MTT y se han añadido 100 microlitros de DMSO (Sigma -Alemania) a cada pocillo para solubilizar los cristales de formazán formados en las mitocondrias de las células vitales. Se ha medido la absorbancia de las soluciones violetas así obtenidas a la longitud de onda de 550 nm. Ejemplo 3
Experimento 3
Animales
Ratas macho Sprague-Dawley de aproximadamente 200 g proporcionadas por Harlan Company, Italia. Los animales han sido enjaulados en grupos de cuatro, en jaulas de dimensiones de 26*41 cm en el Centro per la Stabulazione Animali da Laboratorio (Ce.S.A.L.) de la Universita di Firenze con un ciclo circadiano de 12 h con agua y alimento “ad libitum”. Las ratas han sido alimentadas con una dieta estándar y enjauladas a una temperatura de 23±1°C. El procedimiento experimental ha sido aprobado por el comité local para el control de la experimentación sobre animales de laboratorio. Todos los experimentos han sido llevados a cabo según legislaciones del Consejo Europeo del 24 de noviembre de 1986 (DL 116/92; 86/609/EEC) relativas a la manipulación de animales de investigación y de acuerdo con el “National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”, reconociendo las pautas del “ International Association for the Study of Pain”. Se han tomado todas las medidas necesarias para reducir al mínimo tanto el número de los animales como su malestar.
Modelo de daño muscular inducido por la dexametasona
Se ha administrado intraperitonealmente dexametasona a la rata a la dosis diaria de 600 pg/kg durante 15 días (Yamamoto y otros, Muscle and Nerve, 41: 819-827, 2010).
Evaluaciones del comportamiento
Se han evaluado las capacidades motoras de los animales como actividad espontánea, capacidad de estiramiento de las patas y de escalada según el procedimiento descrito por García y otros, (García JH, Wagner S, Liu KF, Hu JX. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke 1995b; 26: 627-34). La fuerza de agarre ha sido medida por medio de la prueba de fuerza de agarre (Ugo Basile, Italia). La integridad de la capacidad de coordinación motora del animal ha sido analizada adicionalmente con la ayuda del instrumento de varilla giratoria (Ugo Basile, Varese, Italia) utilizado a la velocidad de 10 rotaciones por minuto. Se colocó el animal sobre una varilla giratoria durante 10 minutos, se han medido el número de caídas y el tiempo total pasado en equilibrio. Tras un máximo de 6 caídas el animal completó la sesión (Vaught y otros, Neuropharmacology, 4: 211-216, 1985).
Biopsias tisulares
Al final de los tratamientos los animales han sido sacrificados y se han extirpado los músculos gastrocnemius y extensor digitorum. Se extirparon los tendones y el tejido conectivo de los músculos y se analizaron estos entonces.
Análisis histológico
Los tejidos han sido fijados en paraformaldehído al 4%, luego deshidratados e incluidos en parafina. Se han obtenido secciones de 10 |jm y han sido tincionadas con una mezcla de hematoxilina/eosina. Se ha medido toda la sección transversal del músculo. Se han llevado a cabo los análisis morfométrico e histológico sobre imágenes digitalizadas obtenidas con un microscopio de 40*. Se llevarán a cabo las mediciones en tres áreas distintas de la misma sección (50-75% de la superficie total de la sección).
Inmunofluorescencia
Para resaltar las fibras de actina, se ha utilizado TRITC etiquetada con faloidina (1:40, Life Technologies, Italia), diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:2000; Sigma- Aldrich, Milán, Italia) para detectar los núcleos. Los portaobjetos de microscopio han sido montados con ProLong (Life Technologies, Milán, Italia) y observados con un microscopio Leica DM6000B (Leica, Mannheim, Alemania). El análisis cuantitativo ha sido llevado a cabo utilizando el siguiente soporte lógico: extensión de “recuento de células” de ImageJ; FIJI software (ImageJ, NIH, Bethesda, Maryland, EE. UU.); algoritmo “Moments”.
Mediciones morfométricas
Tras la tinción con hematoxilina-eosina o un etiquetado fluorescente con faloidina, se han llevado a cabo las mediciones morfométricas utilizando secciones transversales completas (soporte lógico ImageJ). Se han analizado hasta 3000 fibras por músculo por sección. Se han determinado el área de la fibra, el número para el campo óptico, el perímetro, el mínimo diámetro de Feret (Briguet y otros, Neuromuscular Dis, 2004, 14: 675-682).
Niveles de lipofuscina
Se homogeneizarán secciones de tejido muscular de 200 mg en una solución de cloroformo/metanol (2:1, v/v) que contiene butihidroxitoluol al 0,005% (p/v). Tras una centrifugación a 1000 x g durante 0 minutos se leerá la fluorescencia emitida utilizando una longitud de onda de emisión de 450 nm y una longitud de onda de excitación de 350 nm. (Faist V, Koenig J, Hoeger H, Elmadfa I. Mitochondrial oxygen consumption, lipid peroxidation and antioxidant enzyme systems in skeletal muscle of senile dystrophic mice. Pflugers Arch. Dic 1998; 437(1): 168-71; Jung T, Hohn A, Grune T. Lipofuscin: detection and quantification by microscopic techniques. Methods Mol Biol.
2010; 594: 173-93).
Ejemplo 4
Experimento 4
Animales
Se han utilizado ratas macho Sprague-Dawley de aproximadamente 200 g proporcionadas por Harlan Company, Italia. Los animales han sido enjaulados en grupos de cuatro, en jaulas de dimensiones de 26*41 cm en el Centro per la Stabulazione Animali da Laboratorio (Ce.S.A.L.) de la Universita di Firenze con un ciclo circadiano de 12 h con agua y alimento “ad libitum”. Las ratas han sido alimentadas con una dieta estándar y enjauladas a una temperatura de 23±1°C. El procedimiento experimental ha sido aprobado por el comité local para el control de la experimentación sobre animales de laboratorio. Todos los experimentos son llevados a cabo según legislaciones del Consejo Europeo del 24 de noviembre de 1986 (DL 116/92; 86/609/EEC) relativas a la manipulación de animales de investigación y de acuerdo con el “National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”, reconociendo las pautas del “ International Association for the Study of Pain”. Se han tomado todas las medidas necesarias para reducir al mínimo tanto el número de los animales como su malestar.
Modelo de daño muscular inducido por el oxaliplatino
Se ha administrado intraperitonealmente oxaliplatino a la rata a la dosis diaria de 2,4 mg/kg durante 15 días (Cavaletti y otros, Eur J Cancer, 2001; Di Cesare Mannelli y otros, Exp Neurol, 2014).
Evaluación de la función muscular y de las capacidades motoras
Se ha medido la fuerza de agarre por medio de la prueba de la fuerza de agarre (Ugo Basile, Italia). Se ha analizado adicionalmente la integridad de la capacidad de coordinación motora del animal con la ayuda del instrumento de varilla giratoria (Ugo Basile, Varese, Italia) utilizado a la velocidad de 10 revoluciones por minuto. Se colocó el animal sobre una varilla giratoria durante 10 minutos, se han medido el número de caídas y el tiempo total pasado en equilibrio. Tras un máximo de 6 caídas del animal se ha considerado completada la sesión (Vaught y otros, Neuropharmacology, 4: 211-216, 1985).
Prueba de Irwin
Se ha llevado a cabo la prueba según el trabajo de Irwin (Psychopharmacologia 13: 222-257; 1968) para evaluar algunos parámetros del comportamiento tales como: comportamiento (actividad espontánea, pasividad, curiosidad,
etc.), excitación del S.N.C.. (temblores, convulsiones, etc.), movimientos (ataxia, estereotipia, etc.), tono muscular (fuerza física, etc.), reflejos, signos involuntarios (piloerección, exoftalmía, salivación, etc.), toxicidad (muerte instantánea o retardada). Se han evaluado todos los parámetros en un intervalo con límites de 0-4/4-0 (excepto la medición de la temperatura corporal que es de -4/+4 dependiendo de si es hipertermia o hipotermia).
Biopsias tisulares
Al final de los tratamientos los animales han sido sacrificados y se han extirpado los músculos gastrocnemius, tibialis anterior y extensor digitorum. Se extirparon los tendones y el tejido conectivo de los músculos y se analizaron estos entonces.
Análisis histológico
Los tejidos han sido fijados en paraformaldehído al 4%, luego deshidratados e incluidos en parafina. Se han obtenido secciones de 1o pm y han sido tincionadas con una mezcla de hematoxilina/eosina. Se ha medido toda la sección transversal del músculo. Se han llevado a cabo los análisis morfométrico e histológico sobre imágenes digitalizadas obtenidas con un microscopio de 40*. Se llevarán a cabo las mediciones en tres áreas distintas de la misma sección (50-75% de la superficie total de la sección).
Inmunofluorescencia
Para resaltar las fibras de actina, se ha utilizado TRITC etiquetada con faloidina (1:40, Life Technologies, Italia), diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:2000; Sigma-Aldrich, Milán, Italia) para revelar los núcleos. Los portaobjetos de microscopio han sido montados con ProLong (Life Technologies, Milán, Italia) y observados con un microscopio Leica DM6000B (Leica, Mannheim, Alemania). El análisis cuantitativo ha sido llevado a cabo utilizando el siguiente soporte lógico: extensión de “recuento de células” de ImageJ; FIJI software (ImageJ, NIH, Bethesda, Maryland, EE. UU.); algoritmo “Moments”.
Mediciones morfométricas
Tras la tinción con hematoxilina-eosina o un etiquetado fluorescente con faloidina se han llevado a cabo las mediciones morfométricas utilizando secciones transversales completas (soporte lógico ImageJ). Se han analizado hasta 3000 fibras por músculo por sección. Se han determinado el área de la fibra, el número para el campo óptico, el perímetro, el mínimo diámetro de Feret (Briguet y otros, Neuromuscular Dis, 2004, 14: 675-682).
Lipoperioxidación (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, TBARS)
Se ha añadido al lisado tisular 4 ml de ácido tiobarbitúrico 36 mM (Sigma-Alemania) en una solución de ácido acético al 10% (Merck-Alemania) llevada hasta un pH de 4,0 con NaOH (Merck- Alemania). Las muestras han sido hervidas durante 1 hora. La reacción ha sido apagada colocando los viales en hielo, la solución ha sido centrifugada durante 10 minutos a 1.600 * g a 4°C. La fluorescencia resultante de la reacción entre el dialdehído malonílico y el ácido tiobarbitúrico ha sido leída a una longitud de onda de excitación de 530 nm y a una longitud de onda de emisión de 550 nm (Cayman Chemical Company-EE. UU.) en un lector de fluorescencia Perkin-Elmer.
Oxidación de proteínas, evaluación del nivel de carbonilación de las proteínas
El lisado tisular ha sido lisado en un tampón compuesto de 50 mM de Tris-HCl con un pH de 8,0, 150 nM de NaCl, 1 mM de EDTA, Triton X-100 al 0,5%, inhibidor de proteasa cOmplete (Roche- Alemania) y experimentó un ciclo de congelación/descongelación para completar la lisis de las membranas. La suspensión ha sido centrifugada a 5000 * g a 4°C, la solución sobrenadante ha sido almacenada y se ha llevado a cabo la dosificación proteínica en la misma por medio del ensayo de ácido bicinconínico (Sigma-Alemania). Se han desnaturalizado 10 pg de proteínas añadiendo SDS (Sigma-Alemania) para obtener una concentración final de SDS al 6%. Entonces, se han derivatizado las muestras añadiendo 10 mM de DNPH (Sigma - Alemania) (2-4-dinitrofenilhidrazina) e incubándolas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las proteínas de cada muestra han sido esclarecidas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% (Bio-Rad-CA) y transferidas sobre una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad-CA). Tras bloquear los sitios no específicos en una solución de albúmina al 1% (Sigma-Alemania) en tampón fosfato al que se había añadido Tween 20 al 0,1% (Sigma-Alemania), se ha incubado la membrana con un anticuerpo anti-DNPH (1:5000; Chemicon International) durante la noche a 4°C. La incubación siguió un anticuerpo secundario anticonejo conjugado con una peroxidasa (1:5000, Cell signaling-EE. UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se ha evaluado la expresión proteínica mediante la técnica de quimioluminiscencia (ECL; Pierce-EE. UU.); se ha llevado a cabo el análisis densitométrico utilizando el soporte lógico para el análisis de imágenes “Scion Image”. Para cada muestra se ha llevado a cabo la normalización con respecto a la expresión de la proteína de referencia p actina.
Actividad enzimática y niveles de aminoácidos
Se ha determinado la actividad de la superóxido dismutasa por medio de la reacción xantina oxidasa (Ding y otros, Mol Nutr Food Res. Feb 2013; 57(2): 365-9). Se han dosificado los niveles de creatina quinasa por medio del análisis
enzimático que hace un seguimiento de nicotinamida adenina difosfopiridina - NADPH). Se ha determinado la testosterona mediante el procedimiento ELISA. Se han determinado los niveles de glutamina en plasma y en músculo por medio de una reacción enzimática basada en la hidrólisis de glutamina a glutamato.
Inmunoelectrotransferencia
Se ha homogeneizado el tejido en un tampón de lisis compuesto por 50 mM de Tris-HCl con un pH de 8,0, 150 nM de NaCl, 1 mM de EDTA, Triton X-100 al 0,5%, inhibidor de proteasa cOmplete (Roche). Se ha incubado el homogenado durante 30 minutos en hielo, luego sonicado con 3 impulsos durante 10 segundos y centrifugado durante 15 min. a 13000 * g a 4°C. Se han determinado las proteínas presentes en el sobrenadante por medio del ensayo de ácido bicinconínico. Se han separado 30 |jg de tales proteínas por cada muestra mediante electroforesis en un gradiente de poliacrilamida del 4 al 12% y transferidas sobre una membrana de nitrocelulosa. Tras bloquear los sitios de unión no específicos, se ha incubado la membrana con un anticuerpo policlonal específico a NFkB durante 16 h a 4°C; después de esa incubación siguió durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario conjugado con una peroxidasa. La expresión proteínica ha sido detectada mediante la técnica de quimioluminiscencia. El análisis densitométrico ha sido llevado a cabo utilizando el soporte lógico para el análisis de imágenes “Scion Image”. Para cada muestra se ha llevado a cabo la normalización mediante beta-actina.
Ejemplo 5
Composición según la invención
Se prepara una composición en forma de gránulos, que comprende
- 1 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 150 mg de extracto de semilla de uva;
- 300 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera;
- 3 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con excipientes y vehículos convencionales.
Ejemplo 6
Composición según la invención
Se prepara una composición en forma de polvo, que comprende
- 1 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 150 mg de extracto de semilla de uva;
- 300 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Wíthanía somnífera;
- 3 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con excipientes y vehículos convencionales.
Ejemplo 7
- 1 g de ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico;
- 150 mg de extracto de semilla de uva;
- 300 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Wíthanía somnífera;
- 3 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con excipientes y vehículos convencionales.
Ejemplo 8
Composición según la invención
Se prepara una composición en forma de polvo, que comprende
- 1 g de la sal 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 150 mg de extracto de semilla de uva;
- 300 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera;
- 3 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con excipientes y vehículos convencionales.
Ejemplo 9
Composición según la invención
Se prepara una composición en forma de polvo, que comprende
- 1,5 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 250 mg de extracto de semilla de uva;
- 250 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Wíthanía somnífera;
- 3,5 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con excipientes y vehículos convencionales.
Ejemplo 10
Composición según la invención
Se prepara una composición en forma de polvo, que comprende
- 1,5 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 250 mg de extracto de semilla de uva;
- 250 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Wíthanía somnífera;
- 3,5 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
- 10,3 g de una mezcla de L-leucina, L-valina, L-isoleucina, L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-cistina o L-cisteína, L-fenilalanina, L-tirosina, L-treonina, L-glutamina, L-arginina y L-triptófano;
- Vitamina B6;
- Vitamina D3;
- Creatina;
junto con excipientes y aditivos entre los que figuran maltodextrinas, hidroxipropilmetilcelulosa, ésteres de sacarosa, ácido cítrico, aromas de sucralosa y dióxido de silicio.
Ejemplo 11
Composición según la invención
Se prepara una composición en forma de polvo, que comprende
- 1,5 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 250 mg de extracto de semilla de uva;
- 250 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera;
- 3,5 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
- 10,3 g de una mezcla de L-leucina, L-valina, L-isoleucina, L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-cistina o L-cisteína, L-fenilalanina, L-tirosina, L-treonina, L-glutamina, L-arginina y L-triptófano;
- 1,5 mg de vitamina B6;
- 20 microgramos de vitamina D3;
- 1500 mg de creatina;
maltodextrinas, hidroxipropilmetilcelulosa, ésteres de sacarosa, ácido cítrico, aromas, sustitutos del azúcar y agentes antiaglutinantes.
Claims (15)
1. Una combinación de ingredientes activos que comprende ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un extracto de semilla de uva y un extracto de withania.
2. La combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha sal farmacéuticamente aceptable del ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico es la sal de calcio.
3. La combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende, además, ornitina alfa-cetoglutarato.
4. La combinación según la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque es una combinación fija de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio/extracto de semilla de uva/extracto de withania/ornitina alfa-cetoglutarato a una relación recíproca de pesos de 1/0,1-0,30/0,1-0,5/2-5, respectivamente.
5. La combinación según la reivindicación 4, caracterizada porque es una combinación fija de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio/extracto de semilla de uva/extracto de withania/ornitina alfa-cetoglutarato a una relación recíproca de pesos de 1/0,15/0,30/3, respectivamente, o de 1/0,16/0,16/2,3, respectivamente.
6. Una composición farmacéutica o nutracéutica que comprende la combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
7. La composición según la reivindicación 6, en forma de unidad de dosis, que comprende
- 1 a 4 g de ácido 3-hidroxi-3-metilbutanoico;
- 100 a 500 mg de extracto de semilla de uva;
- 100 a 1000 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnífera; y
- 1 a 10 g de ornitina alfa-cetoglutarato,
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
8. La composición según la reivindicación 7, que comprende
- 1 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 150 mg de extracto de semilla de uva;
- 300 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnifera; y
- 3 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
9. La composición según la reivindicación 7, que comprende
- 1,5 g de 3-hidroxi-3-metilbutanoato de calcio;
- 250 mg de extracto de semilla de uva;
- 250 mg de extracto de withania, de forma ventajosa Withania somnifera; y
- 3,5 g de ornitina alfa-cetoglutarato;
junto con vehículos y/o excipientes convencionales.
10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque es una composición oral sólida, preferiblemente en forma de gránulos de polvo o de gel, o un gel.
11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizada porque comprende, además, aminoácidos y/o vitaminas, preferiblemente vitamina B6 y/o vitamina D3.
12. La composición según la reivindicación 11, caracterizada porque comprende uno o más aminoácidos seleccionados entre L-leucina, L-valina, L-isoleucina, L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-cistina, L-cisteína, L-fenilalanina, L-tirosina, L-treonina, L-glutamina, L-arginina y L-triptófano.
13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizada porque comprende, además, creatina.
14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la sarcopenia y/o como esteroide anabólico.
15. La composición para el uso según la reivindicación 14, para aumentar la masa muscular durante el entrenamiento o en personas de edad avanzada y debilitadas y en personas que han perdido musculatura debido a su inactividad o a su postración en cama; en los estados de caquexia; para proteger al músculo contra los daños inducidos por un ejercicio intenso y para combatir la sensación de fatiga y/o mejorar el rendimiento físico.
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