WO2020130172A1 - 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선, 치매 및 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선, 치매 및 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020130172A1
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extract
proxin
amyloid
test
administration
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하선아
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박 제임스 씨.
김상희
김 루이 남조
김 해리 남서
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cognitive improvement, dementia and hyperactivity disorder, which includes the extract of quince and proxin as active ingredients.
  • Dementia cognitive ability, or memory loss can be said to be a "syndrome" in which remarkable difficulties in maintaining social and daily life occur mainly due to temporary or persistent damage to the brain nerve due to medical and neurological causes.
  • Alzheimer's type dementia accounts for the majority of people with dementia.
  • the mechanism of development of Alzheimer's dementia is not yet clear, but the toxicity of the neurotoxic protein ( ⁇ -amyloid protein) deposited in brain lesions has been suggested as the most important cause.
  • Patients with dementia mainly show a marked decrease in function of various neurotransmitter systems in the cerebral cortex and cerebral limbic system and a decrease in the function of cerebral energy metabolism.
  • AD' Alzheimer's Disease
  • acetylcholine acetylcholine, hereinafter abbreviated as'ACh'
  • glutamic acid glutamic acid
  • neuropeptide neuropeptide
  • monoamine systems neurotransmitters function.
  • AD Alzheimer's Disease
  • AD neurocytotoxic effect induced by the ⁇ -amyloid peptide
  • the mechanism of development of AD due to the elimination of hippocampal neurons through the accumulation of germ spots out of the cells of the ⁇ -amyloid peptide is the main of AD It is believed to be one of the causes.
  • AChE-inhibiting drugs are most effective when the cholinergic nerve is not functionally impaired, and the efficacy of these drugs decreases with the decline in cholinergic nerve function, so it is effective only in the early stages of mild or moderate senile dementia, most of which are peripheral It exhibits cholinergic side effects of nerves, half-life is too short, severe side effects such as liver toxicity, and especially 9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine (THA), an active ingredient of Cognex Although it shows signs of improvement in perception when administered orally, it is not widely used because it has serious side effects such as tremor, dizziness, and liver toxicity.
  • TAA 9-amino-1,2,3,4-tetrahydroacridine
  • ADHD attention deficit hyperactivity disorder
  • the present invention solves the above problems and was devised by the necessity of the above, the object of the present invention is to provide a novel composition for preventing or treating dementia (AD).
  • AD dementia
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating attention deficit hyperactivity disorder (ADHD).
  • ADHD attention deficit hyperactivity disorder
  • the present invention provides a composition for preventing or treating dementia, which includes an extract of ginseng and proxin as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating hyperactivity disorder comprising the extract of quince and proxin as active ingredients.
  • the present invention provides a composition for improving cognition, including the extract of quince and proxin as active ingredients.
  • the concentration of the proxin is preferably 0.1 to 0.5mM, but is not limited thereto.
  • compositions according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • Pharmaceutical dosage forms of the compositions of the present invention are in the form of their pharmaceutically acceptable salts. Can also be used, and can also be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable set.
  • the salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, acetic formic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, and the like.
  • hydrochloric acid sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, acetic formic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is an oral dosage form such as a powder, a granule, a tablet, a capsule, a suspension, an emulsion, a syrup, an aerosol, an external preparation such as an ointment, a cream, a suppository and a sterile injection solution, respectively, according to a conventional method. It can be formulated and used in any form suitable for pharmaceutical preparations.
  • the preferred dosage of the extract or compound of the present invention varies depending on the subject's age, sex, weight, symptoms, degree of disease, drug form, administration route and duration, but is appropriately selected by a person skilled in the art. Can be. However, for the desired effect, it is recommended that the composition of the present invention be administered at 0.001 to 500 mg/kg body weight per day. Administration may be administered once a day, or may be divided into several times. In addition, the dosage may be increased or decreased depending on age, gender, weight, disease severity, and route of administration. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • composition according to the present invention can be administered to a mammal such as a rat, mouse, livestock, or human by various routes such as parenteral or oral, and all modes of administration can be expected, for example, oral, rectal or It can be administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dura mater or intracerebroventricular injection.
  • the present invention may be provided as a food additive or a functional food composition of the ginseng extract and the proxin composition of the present invention.
  • the food composition according to the present invention may be, for example, chewing gum, caramel products, candies, ice cream, various foods such as sweets, soft drinks, beverage products such as mineral water, and health functional foods including vitamins and minerals.
  • the amount of the extract or compound in the food can be added at 0.001 to 99.9% by weight of the total food weight, and in a beverage, it can be added at a rate of 0.001 to 0.1 g based on 100 ml.
  • the beverages of the present invention have no particular limitations on other components other than those containing the extracts and compound derivatives as essential components in the indicated proportions, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in conventional beverages.
  • the functional food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid And salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • the ginseng extract and the proxin composition significantly improve cognitive memory and inhibit the production of amyloid plaque in the Alzheimer's dementia model and the APPswe/PS1dE9 double expression Alzheimer's dementia model induced by administration of A ⁇ (1-42). It has been clarified, and the results show the usefulness of the combination of the ginseng extract and the proxin for Alzheimer's disease as a treatment candidate, and it can also be seen that the combination of the ginseng extract and the proxin can be used as a candidate for ADHD treatment.
  • 1 is a graph showing the change in the amount of intracellular ROS by Phytochemical treatment
  • Figure 2 is a figure showing the combined administration effect of pentagonal ethanol extract (Galla rhois) and / or proxine on cognitive memory degradation by ⁇ -amyloid (1-42).
  • Cognitive memory was measured by the alteration behavior of the Y-maze test.
  • Each group was tested with 16 mice, and each value was the mean ⁇ standard error.
  • Figure 3 is a figure showing the combined administration effect of ethanol extract (Galla rhois) and / or proxin of the five-fold on the cognitive memory degradation by ⁇ -amyloid (1-42).
  • Cognitive memory was measured using a novel object recognition test. Each group was tested with 16 mice, and each value was the mean ⁇ standard error. *P ⁇ 0.01 vs. Saline + ⁇ -amyloid (42-1), #P ⁇ 0.05 vs. Saline + ⁇ -amyloid (1-42) (using Fisher's PLSD test as one-way ANOVA and post-test).
  • Figure 4 is a figure showing the combined administration effect of ethanol extract (Galla rhois) and / or proxin of the five-fold on the cognitive memory degradation by ⁇ -amyloid (1-42).
  • Cognitive memory was measured by observing the finding latency of the water finding test. Each group was tested with 16 mice, and each value was the mean ⁇ standard error.
  • Figure 5 is a diagram showing the combined administration effect of ethanol extract (Galla rhois) and / or proxin of the five-fold on the cognitive memory degradation by ⁇ -amyloid (1-42).
  • Cognitive memory was measured by observing the step-through latency of the passive avoidance test. Each group was tested with 16 mice, and each value was the mean ⁇ standard error.
  • Figure 6 is a figure showing the combined administration effect of ethanol extract (Galla rhois) and / or proxin of the five-fold on the cognitive memory degradation by ⁇ -amyloid (1-42).
  • Cognitive memory was measured using a reference memory test from Morris water maze. Eight mice per group were measured four times daily, each value being the mean ⁇ standard error. *P ⁇ 0.01 vs. Saline + ⁇ -amyloid (42-1), #P ⁇ 0.05 vs. Saline + ⁇ -amyloid (1-42) (using one-way ANOVA for repeat measurements and Fisher's PLSD test as a post-test).
  • Figure 7 is a diagram showing the combined administration effect of ethanol extract (Galla rhois) and or proxin of the five-fold on the cognitive memory degradation by ⁇ -amyloid (1-42).
  • Cognitive memory was measured using the probe test of Morris water maze. Eight mice per group were measured twice, and each value is the mean ⁇ standard error. *P ⁇ 0.01 vs. Saline + ⁇ -amyloid (42-1), #P ⁇ 0.05 vs. Saline + ⁇ -amyloid (1-42) (using Fisher's PLSD test as one-way ANOVA and post-test).
  • Figure 8 is a figure showing the combined administration effect of pentagonal ethanol extract (Galla rhois) and / or proxin on the decrease in cognitive memory by ⁇ -amyloid (1-42).
  • mice per group were measured four times a day for three days, and each value is the mean ⁇ standard error.
  • Figure 9 is a picture showing the combined pharmacological effects of pentagonal ethanol extract (Galla rhois) and / or proxine on cognitive memory (evaluated by Y-maze test) in APPswe/PS1dE9 double-expressing mice. Each figure represents the mean ⁇ standard error of 10 animals. #P ⁇ 0.05 vs. Saline (One-way ANOVA. Fisher's assessment by post-test).
  • Figure 10 is a picture showing the pharmacological effect of co-administration of pentagonal extract (Galla rhois) and/or proxine on cognitive memory (evaluated by Novel object recognition test) of APPswe/PS1dE9 double-expressing mice. Each figure represents the mean ⁇ standard error of 10 animals. #P ⁇ 0.05 vs. Saline (One-way ANOVA. Fisher's assessment by post-test).
  • Figure 11 is a picture showing the combined pharmacological effect of the combined administration of ethanol extract (Galla rhois) and / or proxine on the cognitive memory (evaluated by the finding latency of the water finding test) of APPswe/PS1dE9 double-expressing mice. Each figure represents the mean ⁇ standard error of 10 animals. #P ⁇ 0.05, ##P ⁇ 0.01 vs. Saline (One-way ANOVA. Fisher's assessment by post-test).
  • FIG. 12 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on Aroclor 1254-induced hyperlocomotor activity in rats. Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 rats, *P ⁇ 0.05,**P ⁇ 0.01 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05, ##P ⁇ 0.01 vs. Sal + Aroclor 1254
  • FIG. 13 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on increase in Aroclor 1254-induced rearing number in rats. Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 mice, *P ⁇ 0.05 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254 (one-way ANOVA followed by Fisher's PLSD test)
  • FIG. 14 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on Aroclor 1254-induced changes in the ability to enter and exit from the rat to the central zone.
  • Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 rats, *P ⁇ 0.01 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254 (one-way ANOVA accompanied by Fisher's PLSD test)
  • FIG. 15 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on Aroclor 1254-induced increase in distance traveled from the central zone in mice.
  • Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 rats, *P ⁇ 0.01 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05, ##P ⁇ 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254
  • FIG. 16 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on Aroclor 1254-induced increase in the number of rats entering the central zone. Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 rats, *P ⁇ 0.01 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254
  • FIG. 17 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on Aroclor 1254-induced changes in time spent in the central zone in mice. Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 mice, *P ⁇ 0.05 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254
  • FIG. 18 is a graph confirming the effect of stigma and/or proxin on Aroclor 1254-induced learning and memory impairment in a new subject recognition test in rats.
  • Each value is the mean ⁇ S.E.M. of 12 rats, *P ⁇ 0.01 vs. Sal + Sal, #P ⁇ 0.05, ##P ⁇ 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254 (one-way ANOVA is accompanied by Fisher's PLSD test)
  • gallic acid and Fraxin are the most active through screening for antioxidant activity by receiving various known antioxidant activities.
  • the compounds used in the antioxidant activity screening of the present invention are as follows A1 to A7.
  • A6 and A7 did not show the effect of removing free radicals or regenerating cells.
  • A4 has a good effect on both free radical scavenging and cell regeneration, while A3 has good scavenging activity, but has good cell regeneration, so the antioxidant effect of A3 is thought to be due to a different mechanism than free radical scavenging.
  • SOD Superoxide dismutase
  • catalase assay produced in the cell, or both enzymes has the effect of removing the free radicals coming from the outside are but did not that activity is greatly changed by the aid of H 2 O 2 in H 2 O 2 When A3 was treated before treatment, it was observed that the activity of SOD increased.
  • LPO shows a tendency to increase slightly as cells age. In particular, when the cells were exposed to H 2 O 2 , the result of LPO was found to increase the amount of MDA, and it was confirmed that this increase was significantly reduced by the treatment of A3 and A4, and the remaining A1 to A2 and A5 to A7 This activity could not be observed.
  • ROS reactive oxygen species
  • the present inventors have adopted A3 and A4 as candidates for combination with the five-fold extract from among the A1 to A7 compounds, and since the five-fold extract contains a large amount of the A4 compound, Methyl gallate, the A4 is not additionally added to the five-fold extract, It was decided to further evaluate the effect by further including A3, proxin.
  • the concentration of proxin was performed at 0.5 mM, and these concentrations were performed using the DPPH assay for the free radical scavenging activity experiment of proxin.
  • various concentrations of proxin (0.02, 0.1 and 0.5) were added to the DPPH solution. mM), and the change in absorbance for 10 minutes was monitored at 517 nm, resulting in free radical scavenging activity of about 10%, about 18%, and about 50% at a concentration of 0.02, 0.1, and 0.5 mM of proxin. It came out and was used in the experiment after 0.5mM.
  • the decrease in cognitive memory by A ⁇ was evaluated in 12-week-old mice. ICR mice [Orient Bio Co., Ltd., Gyeonggi, Korea] were purchased and adapted to the experimental animal room for 1 week, and drug administration and cognitive memory evaluation were performed.
  • the toxic A ⁇ (1-42) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA) and the control substance non-toxic A ⁇ (42-1) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA) have 400 pmol as the third ventricle.
  • the cognitive memory evaluation was performed 3 days after the administration of A ⁇ .
  • Ethanol ethanol extract 500 mg/kg, p.o.
  • proxin 0.5 mM
  • APPswe/PS1dE9 double-expressing mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MA, USA
  • a cognitive memory evaluation was performed after oral administration of pentagonal ethanol extract (500 mg/kg, p.o.) and/or proxin (0.5 mM) once a day for 3 months to APPswe/PS1dE9 double-expressing mice.
  • drugs were administered after the behavioral and cognitive function evaluations were completed to prevent drugs from directly affecting behavior.
  • animals were sacrificed to evaluate the degree of A ⁇ accumulation.
  • the Y-maze consists of a Y-shaped arm, a black plastic box 25 cm long and 14 cm high and 5 cm wide.
  • the mouse was placed at the end of one arm, and the arm was allowed to move freely for 8 minutes.
  • the number of times the mouse entered each arm was shot with a video camera.
  • the evaluation index of alternating behavior was compared with the control group by acquiring 1 point for all 3 arms.
  • the alternation score of the mouse was converted to 100% by dividing the score obtained by the actual mouse by the possible alternation score.
  • mice On the first day, the mice were acclimatized by placing them in a 40 cm X 40 cm X 30 cm box and allowing them to move freely for 10 minutes.
  • two objects On the second day, two objects were placed in a box and the reaction time for each object was recorded. After 24 hours, one of the two objects was replaced with a new object (novel object), and the reaction time for the novel object was recorded.
  • Water finding test is a method of evaluating latent learning and attentional spatial memory. On the first day, let the mouse recognize the nozzle position of the water bottle in the apparatus, and then place it in the apparatus again after 24 hours of water saving to find the nozzle of the water bottle. Then, the time was measured (Finding latency). On the second day, the position of the water bottle and the length of the nozzle were slightly changed, and based on the information acquired on the first day, attention was paid to find a new location.
  • the passive avoidance test device consists of two rooms, and is divided into guillotine doors between the two rooms.
  • a shock generator is installed on the floor of the room.
  • rats were placed in one of the two rooms, acclimatized for 15 seconds, and then the guillotine door was opened at the same time as the room with the mouse was turned on.
  • the guillotine door was closed and an electric shock (0.5mA, 5s) was applied to the bottom of the dark room.
  • mice were placed in the same device and the time to move from light to dark was measured (step-through latency).
  • a cylindrical water tank with a diameter of 97 cm and a height of 60 cm was used.
  • 23 ⁇ 2°C water diluted with milk powder was used.
  • a transparent platform was installed 2 cm below the surface of the water tank, and four signs were placed outside the water tank.
  • the motion trajectory of the mouse was analyzed through a video tracking system (EthoVision, Noldus, The Netherlands).
  • mice were placed in a water tank toward the side of the platform where they did not see the platform at five randomly selected starting points.
  • the latency of finding the platform after the mouse is placed in the tank is recorded, and when the mouse finds the platform, it remains on the platform for 10 seconds and then moved to the home cage. If the mouse does not find the platform within 60 seconds, the escape latency is recorded as 60 seconds.
  • Each trial was conducted four times a day, three days after the administration of ⁇ -amyloid for four days (3-6 days).
  • Probe test was conducted 7 days after ⁇ -amyloid administration. After the platform was removed, the number of times the platform had been recorded was recorded by letting the rat swim in the tank for 60 seconds.
  • Working memory test was conducted from 8 to 10 days after ⁇ -amyloid administration. Similar to the reference memory test, escape latency was measured by changing the platform location every day. Five trials were conducted per day, and the escape latency of the second to fifth trials was used.
  • the animal effect test results are as follows.
  • ⁇ -amyloid (1-42) significantly reduced alteration behavior in Y-maze.
  • Ojaja extract significantly inhibited the decrease in alteration behavior by ⁇ -amyloid (1-42) (FIG. 2 ).
  • the alteration behavior was significantly increased in the case of the combination administration of the extract and the proxin compared to the administration of the embryo alone.
  • ⁇ -amyloid (1-42) significantly reduced exploration for novel objects in novel object recognition tests.
  • the five-fold extract significantly inhibited the decrease in exploration of novel objects by ⁇ -amyloid (1-42) (FIG. 3 ).
  • the reduction of exploration for novel objects by ⁇ -amyloid (1-42) was significantly suppressed by about 6.78% more significantly than when administered with the ginseng alone (FIG. 3 ).
  • ⁇ -amyloid (1-42) significantly increased finding latency in a water finding test evaluating latent learning.
  • the quince extract significantly suppressed the increase in finding latency caused by ⁇ -amyloid (1-42) (FIG. 4 ).
  • the increase in finding latency due to ⁇ -amyloid (1-42) was significantly suppressed by about 11.43% more significantly than when administered with the ginseng alone (FIG. 4 ).
  • ⁇ -amyloid (1-42) significantly reduced step-through latency in fear avoidance and passive avoidance tests evaluating memory.
  • the five-fold extract significantly suppressed the reduction of step-through latency by ⁇ -amyloid (1-42) (FIG. 5 ).
  • the reduction of the step-through latency by ⁇ -amyloid (1-42) was significantly suppressed by about 10.34% more significantly than when administered with the ginseng alone (FIG. 5).
  • mice to which ⁇ -amyloid (1-42) was administered had a significantly reduced time to find a safe platform in the tank, and probes to subtract and measure the platform compared to those to which ⁇ -amyloid (42-1) was administered. Even in the test, the time spent in the quadrant where the platform was located was also significantly reduced. Ethanol extracts from five germ significantly suppressed the increase in escape latency by ⁇ -amyloid (1-42) and the decrease in residence time in the quadrant where the platform was located (FIGS. 6 and 7 ).
  • ⁇ -amyloid (1-42) induced significantly lower spatial working memory in Morris water maze's working memory test.
  • Ojaja extract significantly suppressed the increase in escape latency caused by ⁇ -amyloid (1-42) (FIG. 8 ).
  • the increase in escape latency due to ⁇ -amyloid (1-42) was significantly suppressed by about 9.43% more significantly than when administered with the embryonic alone (FIG. 8).
  • the five-fold extract significantly increased exploration for novel objects (FIG. 10).
  • the exploration was significantly increased by about 9.76% more significantly when administered with the combination of the five-fold extract and proxin than when administered with the five-fold alone (FIG. 10).
  • DHD is a disease mainly occurring in children
  • immature mice should be used for experiments, and ICR mice [Orient Bio Co., Gyeonggi, Korea] were purchased and adapted to the experimental animal room and mated.
  • Aroclor 1254 (18 mg/kg) was orally administered once a day to the mother.
  • Gallic acid 100 mg/kg, po
  • methyl gallate 100 mg/kg, po
  • pentagonal extract from postnatal day 21 to postnatal day 21 until the end of the behavioral experiment
  • 500 mg/kg, po) and/or proxine (0.5 mM) were administered once a day.
  • mice were placed in a 40 x 40 x 30 cm black acrylic box, and the behavior was measured for 30 minutes using a videotracking system, and the open field was divided into 9 equal parts to set the middle area as the central zone.
  • the index of hyperactivity in ADHD was voluntary momentum (distance moved in cm), and the index of impulsive behavior was standing, the time in the central zone, the number of times in the central zone, and the first in the central zone. Time was measured as an indicator. In the open field evaluation, the time spent in the central zone is long and frequent, and the shorter the first time, the more impulsive, and in the opposite case, it is known that there is anxiety. The behavior was measured between 9 am and 6 pm.
  • Example 3 The results of Example 3 are as follows.
  • Aroclor 1254 significantly induced locomotor activity and increased rearing behavior.
  • the administration of quince extract and/or proxin significantly inhibited the increase in hyperlocomotor activity and rearing behavior by Aroclor 1254. ( Figures 12 and 13).
  • Aroclor 1254 significantly increased the time spent in the central zone of the open field and the number of times it entered the central zone, and the time of entering the central zone for the first time was significantly shortened, impulsive action was induced.
  • Aroclor 1254 significantly reduced the time of interest in novel objects in the novel object recognition test, leading to attention deficit disorder and decreased learning memory.

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Abstract

본 발명은 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선, 치매 및 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 오배자 추출물 및 프락신 조성물은 Aβ (1-42)의 투여로 유도된 알츠하이머 치매 모델 및 APPswe/PS1dE9 이중발현 알츠하이머 치매 모델에서 유의하게 인지기억능을 향상시키고 아밀로이드 플라크의 생성을 억제함을 규명하였고,그러한 결과는 알츠하이머병에 대한 오배자 추출물 및 프락신 조합의 치료 후보물질로서의 유용성을 제시하고, 또한 오배자 추출물 및 프락신의 조합은 ADHD 치료 후보물질로서 이용될 수 있다는 것을 알 수 있다.

Description

오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선, 치매 및 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선, 치매 및 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치매에 의한 인지력 즉 기억력 저하는 주로 내과적, 신경과적 원인으로 인하여 뇌신경의 일시적 혹은 지속적인 손상이 발생함으로써 사회생활과 일상생활 유지에 현저한 곤란이 발생하는 "증후군"이라 할 수 있다.
알쯔하이머형 치매는 치매 환자의 과반수를 차지하고 있다. 알쯔하이머형 치매의 발병기전은 아직까지 명확히 밝혀져 있지 않으나 뇌병변에 침착하는 신경독성단백질(β-amyloid protein)의 독성이 가장 중요한 원인으로 제시되고 있다.
알츠하이머형 치매증 및 뇌졸중 후나 혹은 뇌동맥경화에 의한 광범위한 뇌병변이 발생함으로써 유발되는 뇌혈관성 치매증이 치매질환의 약 90%를 차지한다.
치매 환자는 주로 대뇌 피질 및 대뇌 변연계에서 다양한 신경전달물질계의 현저한 기능 저하 및 대뇌 에너지 물질 대사의 기능저하를 나타내며 특히 알츠하이머형 치매증 (Alzheimer's Disease, 이하 'AD'로 약칭함)에 있어서는, 환자의 아세틸콜린 (acetylcholine, 이하 'ACh'로 약칭함)계, 글루타민 산 (glutamic acid)계, 신경펩티드 (neuropeptides)계 및 모노아민 (monoamine)계에서의 신경전달의 기능저하가 나타나, 이들 신경전달계의 기능 장해가 AD의 주된 원인인 것으로 추정되고 있다.
또한, β-아밀로이드 펩티드 (β-amyloid peptide)에 의해 유발된 신경세포 독성작용의 관점으로부터 β-아밀로이드 펩티드의 세포 밖으로의 노인 반점의 집적을 통한 해마 신경세포의 탈락에 의한 발증 기전도 AD의 주요 원인 중 하나로 추정되고 있다.
현재 치매의 치료는 증상을 조기에 발견해 치료함으로써 진행을 늦추는 데 목표를 두고 있으며, 현단계에서 치매의 진행을 억제하거나 예방할 수 있는 약물은 없다. 미국 FDA의 허가를 받고 시장에 발매된 제품은 Cogne(Parke-Davis), Aricept(Eisai & Pfizer), Exellon(Novartis) 및 Ebixa(Lundbeck)이 있지만, Ebixa를 제외한 약물들은 단지 알쯔하이머에 의해 나타나는 증상의 일부를 완화(신경전달 물질인 Acetylcholine 농도를 높이기 위해 이의 분해효소인 Acetylcholine exterase를 억제)시키고, 환자 및 보호자를 안심시키는데 기여하고 있을 뿐이다.
이러한 AChE 억제 약물들은 콜린성 신경이 기능적으로 손상되지 않았을 때 가장 효과적이고 이들 약물의 효능은 콜린성 신경 기능의 감퇴와 함께 감소되기 때문에, 경증이나 중등도의 노인성 치매의 초기 단계에만 효과가 있으며, 대부분이 말초신경의 콜린성 부작용을 나타내며, 반감기가 너무 짧고, 간 독성 등의 심각한 부작용이 있고 특히 코그넥스 (Cognex)의 유효성분인 9-아미노-1,2,3,4-테트라히드로아크리딘 (THA)은 경구 투여시, 지각능력 향상의 소견을 보이기는 하지만 떨림증, 어지럼증, 간 독성 등의 심각한 부작용을 수반하고 있어 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다.
한편, 이러한 AChE 억제 약물의 단점을 발현하지 아니하는 생약으로서 인삼을 주성분으로 하여 수종의 생약을 혼합 추출한 제품이 한국특허공개 제99-85202호와 미국특허 제6,010,702호에 개시되어 있으나 이러한 생약 혼합 추출물의 경우 노인성 치매에 어느 정도의 약효를 보이고 있기는 하지만, 부작용 등 아직도 확실하고 안정적인 효과를 보장하지 못하고 있다.
한편, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD)는 학동기 어린이 중 3-5%에서 발생하는 것으로 추산되었다. 이제까지 이 질병의 치료를 위해 제안된 심리약리제는 자극적인 화합물(암페타민과 메틸페니데이트), 트리싸이클릭 항우울제(이미프라민, 아미트립틸린) 및 항심리제(페노티아진, 할로페리돌)이다. 메틸페니데이트는 과잉 행동과 주의력 결핍에서 좋은 효과가 입증되어 여러 의학 연구의 목적이 되어 왔다. 그러나, 반작용으로 고혈압이 보고되었고, 가끔 충동성이 증가됨을 보여주었다. 메틸페니데이트로 치료하는 중에 눈주위의 검은원, 동공 확대, 두통, 식욕감퇴와 같은 빈번한 부작용이 보고되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 치매 (AD) 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD) 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프락신의 농도는 0.1 내지 0.5mM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산,나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 내지 500 mg/kg 체중으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 오배자 추출물 및 프락신 조성물은 식품 첨가제 또는 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류,과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터 등의 음료제품, 비타민이나 미네랄등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.
이 때, 상기 식품 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 내지 99.9 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중에는 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 0.1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 음료는 지시된 비율로 필수성분으로서 상기 추출물 및 화합물 유도체를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민,광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈,초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서는 오배자 추출물 및 프락신 조성물은 Aβ (1-42)의 투여로 유도된 알츠하이머 치매 모델 및 APPswe/PS1dE9 이중발현 알츠하이머 치매 모델에서 유의하게 인지기억능을 향상시키고 amyloid plaque의 생성을 억제함을 규명하였고,그러한 결과는 알츠하이머병에 대한 오배자 추출물 및 프락신 조합의 치료 후보물질로서의 유용성을 제시하고, 또한 오배자 추출물 및 프락신의 조합은 ADHD치료 후보물질로서 이용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 1은 Phytochemical 처리에 의한 세포내 ROS 의 양의 변화를 나타낸 그래프,
도 2는 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여효과를 나타낸 그림. 인지기억능은 Y-maze test의 alteration behavior로 측정하였음. 각 군당 16 마리의 생쥐로 실험하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05vs. Saline + β-amyloid (1-42) (one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 3은 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 효과를 나타낸 그림. 인지기억능은 novel object recognition test를 이용하여 측정하였음. 각 군당 16 마리의 생쥐로 실험하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05vs. Saline + β-amyloid (1-42)(one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 4는 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 효과를 나타낸 그림. 인지기억능은 water finding test의 finding latency를 관찰하여 측정하였음. 각 군당 16 마리의 생쥐로 실험하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05, ##P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (1-42) (one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 5는 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 효과를 나타낸 그림. 인지기억능은 passive avoidance test의 step-through latency를 관찰하여 측정하였음. 각 군당 16 마리의 생쥐로 실험하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05 vs. Saline + β-amyloid (1-42) (one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 6은 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 효과를 나타낸 그림. 인지기억능은 Morris water maze의 reference memory test를 이용하여 측정하였음. 각 군당 8마리의 생쥐를 매일 4번씩 측정하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05 vs. Saline + β-amyloid (1-42) (반복측정에 대한 one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 7은 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및 또는 프락신의 병용투여 효과를 나타낸 그림. 인지기억능은 Morris water maze의 probe test를 이용하여 측정하였음. 각 군당 8마리의 생쥐를 2회 측정하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05 vs. Saline + β-amyloid (1-42) (one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 8은 β-amyloid (1-42)에 의한 인지기억능 저하에 대한 오배자에탄올 추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 효과를 나타낸 그림. 각 군당 8마리의 생쥐를 하루 4회씩 3일간 측정하였으며, 각 수치는 평균 ± 표준오차임. *P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (42-1), #P < 0.05, ##P < 0.01 vs. Saline + β-amyloid (1-42) (one-way ANOVA 및 사후검정으로서 Fisher's PLSD test를 사용).
도 9는 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 인지기억능 (Y-maze test로 평가)에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 약리효과를 나타낸 그림. 각 수치는 10마리의 평균 ± 표준오차를 의미함. #P < 0.05 vs. Saline (One-way ANOVA. 사후검정으로 Fisher's 평가).
도 10은 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 인지기억능 (Novel object recognition test로 평가)에 대한 오배자 추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 약리효과를 나타낸 그림. 각 수치는 10마리의 평균 ± 표준오차를 의미함. #P < 0.05 vs. Saline (One-way ANOVA. 사후검정으로 Fisher's 평가).
도 11은 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 인지기억능 (water finding test의 finding latency로 평가)에 대한 오배자 에탄올추출물 (Galla rhois) 및/또는 프락신의 병용투여 약리효과를 나타낸 그림. 각 수치는 10마리의 평균 ± 표준오차를 의미함. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs. Saline (One-way ANOVA. 사후검정으로 Fisher's 평가).
도 12는 쥐에서 Aroclor 1254-유도된 hyperlocomotor 활성에 대한 오배자 및/또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고, *P < 0.05,**P < 0.01 vs. Sal + Sal, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs. Sal + Aroclor 1254
도 13은 쥐에서 Aroclor 1254-유도된 rearing number의 증가에 대한 오배자 및/또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고, *P < 0.05 vs. Sal + Sal, #P < 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254 (원-웨이 ANOVA는 Fisher's PLSD 테스트에 의해서 수반됨)
도 14는 쥐에서 중앙 존으로 출입 능력에서 Aroclor 1254-유도된 변화에 대한 오배자 및/또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고,*P < 0.01 vs. Sal + Sal, #P < 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254(원-웨이 ANOVA는 Fisher's PLSD 테스트에 의해서 수반됨)
도 15는 쥐에서 중앙 존에서 이동한 거리에서 Aroclor 1254-유도된 증가에 대한 오배자 및 또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고,*P < 0.01 vs. Sal + Sal, #P < 0.05, ##P < 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254
도 16은 쥐에서 중앙 존으로 들어간 수에서 Aroclor 1254-유도된 증가에 대한 오배자 및/또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고,*P< 0.01 vs. Sal + Sal, #P < 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254
도 17은 쥐에서 중앙 존에서 머문 시간에서 Aroclor 1254-유도된 변화에 대한 오배자 및/또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고,*P< 0.05 vs. Sal + Sal, #P < 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254
도 18은 쥐에서 새로운 대상 인식 테스트로 Aroclor 1254-유도된 학습 및 기억 손상에 대한 오배자 및/또는 프락신의 효과를 확인한 그래프이다. 각 값은 12마리 쥐의 평균 ± S.E.M.이고,*P < 0.01 vs. Sal + Sal, #P < 0.05, ##P < 0.05 vs. Sal + Aroclor 1254(원-웨이 ANOVA는 Fisher's PLSD 테스트에 의해 수반됨)
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 :오배자 추출물의 제조 및 프락신 선택 과정
오배자 (K P) 5kg을 정선하여 약전통칙 절도 및 분말도에 따라 조절로 한 다음 생약을 달아 추출기에 넣고 8-10배의 95% 에탄올을 넣어 교반추출기에서 5~6시간 2회 추출하여 추출액을 1㎛ 크기의 마이크로필터를 이용하여 여과하고 여액을 50℃이하에서 감압농축한 후 건조하여 건조엑스 2.39kg을 얻었다.(수득율 47.8%)
본 발명자들은 여러 항산화 활성이 알려진 성분들을 제공받아 항산화 활성 스크리닝을 통하여 gallic acid와 Fraxin이 가장 활성이 큰 것으로 판명되었다.
본 발명의 항산화 활성 스크리닝에 이용된 화합물은 아래 A1 내지 A7과 같다.
A1. Quercetin-3-O-β-D-glucuronopyranoside의 flavonoid 화합물, A2.1-O-caffeoyl-Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside의 phenylpropanoid 화합물, A3. Fraxin의 coumarin 화합물, A4. Methyl gallate (gallicin)의 tannin 화합물, A5.2''-O-rhamnosylvitexin의 flavonoid 화합물, A6. Acteoside의 depside형태의 phenylpropanoid 화합물 및 A7.1,3-bis[4-(β-D-glucopyranosyl)benzyl]citrate의 benzyl acohol 관련화합물
인간제대 정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)에 항산화제인 7종의 A1-A7들을 각각 처치 후 산화제인 과산화수소를 투여하여 세포 손상 정도를 MTT assay 로 분석하고 각각의 superoxide dismutase와 catalase 활성을 측정하였다.
실험 결과, A6, A7는 활성산소제거효과나 세포재생효과도 보여주지 않았다. A4는 활성산소제거 효과와 세포재생효과 모두가 좋은 반면 A3는 활성산소제거효과는 좋지 않은 반면 세포재생효과는 좋아 A3의 항산화효과는 활성산소제거와는 다른 기전에 의한 것으로 생각된다.
- Superoxide dismutase (SOD), catalase assay: 세포 안에서 생성되거나 외부에서 유입된 활성산소를 제거하는 효과를 가진 두 효소들은 하지만 H 2O 2의 처치에 의해 그 활성이 크게 변화지 않았으나 H 2O 2의 처치 전 A3를 처치한 경우 SOD의 활성이 증가한 것을 관측할 수 있었다.
- Lipid peroxidation (LPO) assay: LPO는 세포가 나이를 먹어감에 따라 약간씩 증가한 경향을 보여 준다. 특히 세포가 H 2O 2에 노출 되었을 때 LPO의 결과물이 MDA의 양이 증가함을 알수 있었고 이러한 증가량이 A3와 A4의 처치에 의해 크게 줄어듦을 확인할 수 있었고, 나머지 A1 내지 A2 및 A5 내지 A7에서는 이러한 활성이 관찰할 수 없었다.
- Production of reactive oxygen species (ROS): 세포안에 발생하는 활성산소를 측정하기 위하여 DCF fluorescence를 사용하여 측정하였음. H2O2를 처리한 HUVEC 세포내의 활성산소의 양은 H2O2를 처치하지 않은 경우에 비해 55% 증가함을 관측할 수 있었고 이러한 증가량은 A3, A4를 첨가했을 경우 39%와 24%로 그 양이 감소함을 알 수 있었다(도 1).
본 발명자들은 이에 따라서 A1 내지 A7 화합물 중에서 A3와 A4를 오배자 추출물과 조합할 후보물질로 채택하였으며, 오배자 추출물에 A4 화합물인 Methyl gallate가 다량 포함하고 있으므로, 오배자 추출물에 A4를 추가로 첨가하지 않고, A3인 프락신을 추가로 포함하여 효과를 평가하기로 하였다.
본 발명에서는 프락신의 농도를 0.5mM로 정하여 수행하였는데, 이러한 농도는 프락신의 자유 라디컬 소거 활성 실험을 DPPH 어세이를 사용하여 수행한 결과, DPPH 용액에 여러 농도의 프락신 (0.02, 0.1 및 0.5 mM)을 처리하고, 10분 동안 흡광도의 변화를 517 nm에서 모니터한 결과, 0.02, 0.1 및 0.5 mM의 프락신 농도에서 자유 라디컬 소거 활성이 각각 약 10%, 약 18% 및 약 50%로 나와서 0.5mM 이후 실험에서 채택하여 사용하였다.
실험예 1:알츠하이머병 모델에서 오배자 추출물 및/또는 프락신의 약리효능평가
Aβ에 의한 인지기억능의 저하는 12주령의 생쥐에서 평가되었다. ICR 생쥐 [(주)오리엔트바이오, 경기, 한국]를 구입하여 실험동물실에 1주일간 적응시키고, 약물투여 및 인지기억능 평가를 실시하였다. 독성의 Aβ(1-42) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA)와 대조물질인 무독성의 Aβ (42-1) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA)은 400 pmol을 제 3뇌실로 투여하였다.Aβ의 투여 3일 후부터 인지기억능 평가를 실행하였다. 오배자 에탄올추출물 (500 mg/kg, p.o.) 및/또는 프락신(0.5 mM)은 Aβ 투여 2일 전부터 인지기억능 평가가 끝날 때까지 1일 1회씩 경구투여 하였다. 인지기억능 평가가 이루어지는 기간에는 행동에 약물들이 직접적인 영향을 미치는 것을 막기 위하여, 행동 및 인지기능 평가가 끝난 후 약물을 투여하였다.
2) 알츠하이머병 모델인 amyloid precursor protein/presenilin-1 (APPswe/PS1dE9) 이중발현 생쥐에 대한 약물투여
본 실험에는 6월령의 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MA, USA)를 사용하였다. APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에 오배자 에탄올추출물 (500 mg/kg, p.o.) 및/또는 프락신(0.5 mM)을 1일 1회씩 3개월간 경구투여한 후 인지기억능 평가를 실행하였다. 인지기억능 평가가 이루어지는 기간에는 행동에 약물들이 직접적인 영향을 미치는 것을 막기 위하여, 행동 및 인지기능 평가가 끝난 후 약물을 투여하였다. 인지기억능 평가가 끝나고 1일 후 동물을 희생시켜 Aβ의 축적 정도를 평가하였다.
인지기억능 평가법
(1) Y-maze test
Y-maze 의 구성은 Y-자 형태의 arm 으로 되어 있고 길이 25 cm 와 높이 14 cm 넓이 5 cm 의 검은 plastic 상자로 되어 있다. 마우스를 한쪽 arm의 끝에 놓고 8분 동안 자유롭게 arm을 왕래하도록 하였다. 마우스가 각각의 arm에 들어가는 횟수를 video camera로 찍었다. Alternation behavior (공간 교체행동)의 평가지표는 3개의 arm을 모두 들어가는 경우에 1점을 획득하는 것으로 하여 대조군과 비교하였다. 마우스의 alternation score는 실제 마우스가 획득한 score를 가능한 alternation score 로 나누어 100%로 환산하였다.
(2) Novel object test
첫 날에는 생쥐를 40 cm X 40 cm X 30 cm 의 상자에 넣고 10 분간 자유롭게 이동하도록 하여 적응시켰다. 2일째에는 상자에 두 개의 물체를 놓고 각각의 물체에 대한 반응시간을 기록하였다. 이로부터 24시간 후 두 개 중 한 개의 물체를 새로운 물체 (novel object)로 바꾼 후 novel object에 대한 반응시간을 기록하였다.
(3) Water finding test
Water finding test는 latent learning 및 attentional spatial memory를 평가하는 방법으로, 1일에 생쥐로 하여금 apparatus 안에서 물병의 노즐 위치를 인지하게끔 한 다음, 24시간의 절수 후에 다시 apparatus 안에 위치시켜 물병의 노즐을 찾도록 하여 그 시간을 측정하였다(Finding latency). 단 2일에는 물병의 위치 및 노즐의 길이를 약간 변화시켜, 1일에 습득한 정보를 바탕으로 하여, 주의력을 기울여서 새로운 위치를 찾게끔 하였다.
(4) Passive avoidance test
Passive avoidance test 장치는 두 개의 방으로 이루어져 있으며, 두 방의 사이에는 guillotine door로 나뉘어져 있다. 방의 바닥에는 쇼크 발생기가 장치되어져 있다. 1일에는 acquisition trial로서 쥐를 두 개의 방 중 한 개의 방에 넣고 15초간 적응시킨 후에 쥐가 있는 방의 불을 켬과 동시에 guillotine door를 열어 줌. 쥐가 밝은 방으로부터 어두운 방으로 이동함과 동시에 guillotine door가 닫히고 어두운 방의 바닥에 electric shock (0.5mA, 5s)을 주었다. 2일에는 같은 장치에 쥐를 넣고 밝은 방에서 어두운 방으로 이동하는 시간을 측정하였다(step-through latency).
(5) Morris water maze test
Water maze 평가를 위한 수조는 지름이 97cm이고 높이가 60cm인 원통형 수조를 사용하였다. 테스트 기간동안 분유를 희석한 23±2°C의 물을 채워 사용하였다. 수조 안에는 수면에서 2cm 아래에 투명한 플랫폼을 장치하였으며, 수조 바깥쪽에 네 개의 표지를 장치하였다. 마우스의 운동궤적은 비디오트래킹 시스템 (EthoVision, Noldus, The Netherlands)을 통하여 분석되었다.
(5-1) Reference memory test
각 trial 기간 동안 마우스는 다섯 군데의 시작점을 무작위로 선택한 지점에서 플랫폼을 보지 못하는 쪽을 향하여 수조 안으로 넣어졌다. 각 trial에서는 마우스가 수조로 넣어진 후 플랫폼을 찾는 시간 (escape latency) 을 기록하게 되며, 마우스가 플랫폼을 찾으면 10초간 플랫폼 위에서 머무르게 한 후 home cage로 옮겨지게 된다. 마우스가 60초 내로 플랫폼을 찾지 못할 경우 escape latency는 60초로 기록하였다. 각 trial은 β-amyloid를 투여한 3일 후부터 4일간 (3일~6일), 하루 네 번씩 실행되었다.
(5-2) Probe test
β-amyloid 투여 7일 후에 probe test를 진행하였다. 플랫폼을 제거한 후, 60초간 쥐로 하여금 수조안을 수영하게 하면서 플랫폼이 있던 위치를 몇 번이나 지나는지 기록하였다.
(5-3) Working memory test
Working memory test는 β-amyloid 투여 후 8일~10일에 진행하였다. Reference memory test와 비슷하지만, 플랫폼의 위치를 매일 바꾸어 주면서 escape latency를 측정하였다. 하루에 5번의 trial을 진행하며, 2번째~5번째 trial의 escape latency를 사용하였다.
상기 동물효과 시험 결과는 하기와 같다.
β- amyloid (1- 42)의 투여로 유도된 spatial short-term memory의 저하에 대한 오배자 에탄올 추출물 과 프락신의 인지기억능 개선효과
β-amyloid (1-42)의 투여는 Y-maze에서 alteration behavior를 유의하게 감소시켰다. 오배자 추출물은 β-amyloid (1-42)에 의한 alteration behavior의 감소를 유의하게 억제시켰다(도 2). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 6.66% 더 유의하게 alteration behavior의 증가를 보여주었다.
β- amyloid (1- 42)의 투여로 유도된 visual recognition memory의 저하에 대한 오배자 에탄올추출물과 프락신의 효과
β-amyloid (1-42)의 투여는 novel object recognition test에서 novel object에 대한 exploration을 유의하게 감소시켰다. 오배자 추출물은 β-amyloid (1-42)에 의한 novel object에 대한 exploration의 감소를 유의하게 억제시켰다 (도 3). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 6.78% 더 유의하게 β-amyloid (1-42)에 의한 novel object에 대한 exploration의 감소를 유의하게 억제시켰다 (도 3).
β- amyloid (1- 42)의 투여로 유도된 latent learning의 저하에 대한 오배자 에탄올추출물과 프락신의 인지기억능 개선효과
β-amyloid (1-42)의 투여는 latent learning을 평가하는 water finding test에서 finding latency를 유의하게 증가시켰다. 오배자 추출물은 β-amyloid (1-42)에 의한 finding latency의 증가를 유의하게 억제하였다(도 4). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 11.43% 더 유의하게 β-amyloid (1-42)에 의한 finding latency의 증가를 유의하게 억제하였다(도 4).
β- amyloid (1- 42)의 투여로 유도된 fear learning 및 memory의 저하에 대한 오배자 에탄올추출물과 프락신의 인지기억능 개선효과
β-amyloid (1-42)의 투여는 fear learning 및 memory를 평가하는 passive avoidance test에서 step-through latency를 유의하게 감소시켰다. 오배자 추출물은 β-amyloid (1-42)에 의한 step-through latency의 감소를 유의하게 억제하였다 (도 5). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 10.34% 더 유의하게 β-amyloid (1-42)에 의한 step-through latency의 감소를 유의하게 억제하였다 (도 5).
β- amyloid (1- 42)의 투여로 유도된 spatial reference memory의 저하에 대한 오배자 에탄올추출물과 프락신의 인지기억능 개선효과
β-amyloid (1-42)의 투여는 Morris water maze의 hidden platform test 및 probe test를 통하여 평가한 결과, 유의하게 spatial reference memory의 저하를 유도하였다. 즉, β-amyloid (1-42)를 투여한 생쥐는 β-amyloid (42-1)을 투여한 생쥐에 비하여 수조 안의 안전한 platform을 찾는 시간이 유의하게 감소되었을 뿐 아니라, platform을 빼고 측정하는 probe test에서도 platform이 있던 quadrant에 머무는 시간도 유의하게 감소되었다. 오배자 에탄올추출물은 β-amyloid (1-42)에 의한 escape latency의 증가 및 platform이 있던 quadrant에서의 체류시간 감소를 유의하게 억제하였다(도 6과 7). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 12.00% 더 유의하게 β-amyloid (1-42)에 의한 escape latency의 증가 및 platform이 있던 quadrant에서의 체류시간 감소를 유의하게 억제하였다(도 6과 7).
β- amyloid (1- 42)의 투여로 유도된 spatial working memory의 저하에 대한 오배자 에탄올추출물과 프락신의 인지기억능 개선효과
β-amyloid (1-42)의 투여는 Morris water maze의 working memory test에서 유의하게 spatial working memory의 저하를 유도하였다. 오배자 추출물은 β-amyloid (1-42)에 의한 escape latency의 증가를 유의하게 억제하였다(도 8). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 9.43% 더 유의하게 β-amyloid (1-42)에 의한 escape latency의 증가를 유의하게 억제하였다(도 8).
APPswe / PS1dE9 이중발현 생쥐에서 spatial short-term memory에 대한 오배자 추출물과 프락신의 인지기억능 개선효과
APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 단기공간기억력 (short-term spatial)을 평가하는 Y-maze test를 수행한 결과, 오배자 추출물은 alteration behavior를 유의하게 증가시켰다(도 9). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 10.53% 더 유의하게 alteration behavior를 유의하게 증가시켰다(도 9).
APPswe / PS1dE9 이중발현 생쥐에서 visual recognition memory에 대한 오배자 에탄올추출물과 프락신의 개선효과
APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 시각재인지기억 (visual recognition memory)을 평가하는 novel object recognition test를 실시한 결과, 오배자 추출물은 novel object에 대한 exploration을 유의하게 증가시켰다(도 10). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 9.76% 더 유의하게 exploration을 유의하게 증가시켰다(도 10).
APPswe / PS1dE9 이중발현 생쥐에서 latent learning에 대한 오배자 추출물과 프락신 의 개선효과
APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 잠재학습 (latent learning)을 평가하는 water finding test를 실시한 결과, 오배자 에탄올추출물은 finding latency를 유의하게 감소시켰다(도 11). 또한, 오배자추출물과 프락신의 병용투여시에는 오배자단독으로 투여시보다 약 10.48% 더 유의하게 finding latency를 유의하게 감소시켰다(도 11).
실험예 2:ADHD 모델에서 오배자 추출물 및/또는 프락신의 약리효능평가
1) 실험동물 및 약물 처리
DHD가 주로 소아에서 나타나는 질환이기 때문에 미성숙 생쥐를 실험에 이용하여야 하며, ICR 생쥐 [(주)오리엔트바이오, 경기, 한국)]를 구입하여 실험 동물실에 적응시킨 후, mating하였다. Gestational day 6에서부터 postnatal day 21까지 모체에 Aroclor 1254(18 mg/kg)를 1일 1회 경구투여하였다. Postnatal day 21에 male offspring만을 이유한 후, postnatal day 21부터 행동실험이 끝나는 날까지 이유한 offspring에 gallic acid (100 mg/kg, p.o.), methyl gallate (100 mg/kg, p.o.) 혹은 오배자 extract (500 mg/kg, p.o.) 및/또는 프락신 (0.5mM)을 1일 1회 투여하였다.
Postnatal day 35일에 open field test로 자발운동량 및 충동적 경향을, 36일과 37일에는 novel object recognition test를 이용하여 주의력 및 인지기억능을 평가하였다. Reference drug으로 methylphenidate를 사용하였다. 실험 과정은 도 1과 같다.
2) 행동평가
(1) Open field test
생쥐를 40 x 40 x 30 cm의 검은 색 아크릴 박스에 넣고 videotracking system을 이용하여 30분간 행동을 측정하였으며, Open field를 9등분하여 가운데 영역을 central zone으로 설정하였다. ADHD의 과행동 지표는 자발운동량 (distance moved in cm)을 이용하였으며, 충동적 행위의 지표로는 서는 행위 (rearing), central zone에 머문 시간, central zone에 진입한 횟수, 처음 central zone에 진입한 시간을 지표로 측정하였다. Open field 평가에서 central zone에 머문 시간이 길고 자주 진입하며, 최초로 진입한 시간이 짧을 수록 충동적 경향이 있으며, 반대의 경우 불안증세가 있는 것으로 알려져 있다. 행동의 측정은 오전 9시부터 오후 6시 사이에 실시되었다.
(2) Novel object recognition test
Open field test를 마친 24시간 후에, open field test시와 같은 아크릴 박스에 두 개의 물체 (object)를 고정시켰다. 생쥐를 넣고 10분 동안 각각의 물체에 접근하는 시간을 videotracking system을 이용하여 측정하였다. 다시 24시간 후에, 두 개의 물체 중 한 개를 새로운 물체 (novel object)로 바꾼 후, 생쥐를 넣고 10분 동안 각각의 물체에 접근하는 시간을 videotracking system을 이용하여 측정한 후, 두 물체에 접근한 시간 중 새로운 물체 (novel object)에 접근한 시간을 계산하여 퍼센트로 나타내었다.
상기 실시예 3의 결과는 다음과 같다.
Aroclor 1254에 의해 유도된 과잉행동에 대한 오배자 추출물 및 또는 프락신의 약리효과
Aroclor 1254의 투여는 유의하게 locomotor activity를 유도하였으며, rearing behavior를 증가시켰다. 오배자 추출물 및/또는 프락신의 투여는 Aroclor 1254에 의한 hyperlocomotor activity와 rearing behavior의 증가를 유의하게 억제하였다. (도 12 및 도 13).
Aroclor 1254에 의해 유도된 충동 행위에 대한 오배자 추출물 및/또는 프락신의 약리효과
Aroclor 1254의 투여는 유의하게 open field의 central zone에 머문 시간과 central zone에 들어간 횟수를 증가시켰으며, 처음으로 central zone에 들어간 시간은 유의하게 단축되어, 충동적 행위가 유도되었다. 오배자 추출물 및/또는 프락신의 투여는 Aroclor 1254에 의한 충동적 행위를 유의하게 억제하였으며, gallic acid 역시 부분적으로 유의한 약리효능을 나타내었다(도 14 ~ 17).
Aroclor 1254에 의해 유도된 주의력 집중장애/ 학습기억능 저하에 대한 오배자 추출물 및 또는 프락신의 약리효과
Aroclor 1254의 투여는 novel object recognition test에서 유의하게 novel object에 관심을 보인 시간을 감소시켜 주의력 집중장애 및 학습기억능 저하를 유도하였다. 오배자 추출물 및 또는 프락신의 투여는 Aroclor 1254에 의한 주의력 집중장애/ 학습기억능 저하를 유의하게 억제하였으며, gallic acid 역시 유의한 약리효능을 나타내었다(도 18).

Claims (6)

  1. 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프락신의 농도는 0.1 내지 0.5mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 과잉행동장애 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프락신의 농도는 0.1 내지 0.5mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 오배자 추출물 및 프락신을 유효성분으로 포함하는 인지력 개선용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프락신의 농도는 0.1 내지 0.5mM인 것을 특징으로 하는 조성물.
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