WO2013032087A1 - C3g 또는 이를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
C3g 또는 이를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- composition for the prevention or treatment of diabetic erectile dysfunction comprising C3G or an auditory extract containing the same
- the present invention relates to the use of C3G (Cyan i d i n-3-0- ⁇ -d-g 1 ucopyr anos i de) for improving diabetic foot donation.
- C3G Cyan i d i n-3-0- ⁇ -d-g 1 ucopyr anos i de
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic erectile dysfunction and a health functional food composition containing C3G.
- a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic erectile dysfunction and a health functional food composition comprising an Audi extract containing C3G.
- penile erectile dysfunction is classified as a representative urological disease.
- the causes of erectile dysfunction can be largely divided into psychogenic (mental cause) and temperament (physical cause).
- Base causes include abnormalities of the nervous system, vasculature, or endocrine system, and typical diseases causing erectile dysfunction include spinal nerve disease (spinal cord injury, multiple sclerosis), peripheral nerve disease (diabetes, pelvic surgery). And high blood pressure and kidney disease.
- the incidence of erectile dysfunction in diabetic patients is three times higher than that of the general population, and it is reported to be about 35% to 75%, although it varies depending on the reporter (Fedele, D. et al. Epidemiol. 2000, 29, 524-531; Johannes, CB et al., J. Urol. 2000, 163, 460-463).
- Diabetes impairs the function of cavernous nerves and endothelial cells, which are important factors for erectile function, and reduces the production of nitric oxide. Because of this, the body's oxide is increased, blood vessels are hardened, and the lesions of the corpus cavernosum are caused, and neuropathy occurs due to disorders in the blood flow of the nematode. In addition, more than 75% of the penis in diabetic patients undergoing penile complex Doppler ultrasound after intracavernous drug injection
- non-surgical treatment includes medication, injection of erectile prosthesis into the cavernous body, and vacuum penis inhaler. Intravenous ligation, penile artery reconstruction, and prosthesis implants.
- Viagra ⁇ Intravenous ligation, penile artery reconstruction, and prosthesis implants.
- the world's most effective erectile dysfunction treatment agent is Viagra ⁇ , and research into developing an alternative drug is ongoing.
- most of them are chemically synthesized drugs, there are problems with side effects of cardiovascular system and vision disorder.
- the development of drugs that are effective in diabetic erectile dysfunction patients has not been made.
- mulberry is a mature fruit of the mulberry tree Uforus aH) a L) and related genera belonging to the genus Moraceae, and is called as heartache, loss, nausea and cold in Chinese medicine. Audi has traditionally been used as a medicinal herb for treating or preventing diabetes, and the root bark of the mulberry tree has been used as an medicinal herb for anti-inflammatory, diuretic, antitussive and antipyretic drugs.
- the natural pigment in mulberry mulberry is C3G, a form of anthocyanin
- Korean Patent No. 0601320 describes the use of C3G extracted from the tail of rice
- Korean Patent No. 0880876 describes the use of C3G extracted from the assay for the treatment of ischemia-reperfusion injury.
- Korean Patent Publication No. 2011-00144 issues bokbunja extract containing C3G It describes a therapeutic use of gastritis and gastric ulcer as an active ingredient. As such, various pharmacological activities of C3G have been reported, but the effect of improving erectile dysfunction is not known yet.
- the inventors of the present invention while searching for herbal medicines to develop a drug that is harmless to the human body and has a prophylactic or therapeutic effect on diabetic erectile dysfunction, found that C3G contained in a large amount of Audi has an excellent effect on improving erectile function in a diabetic rat model.
- the present invention was completed by confirming.
- One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic erectile dysfunction, including C3G (Cyan i d i n-3-0- ⁇ -d-g 1 ucopyr anos i de). .
- Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic erectile dysfunction, which comprises an extract of Audi containing C3G. It is another object of the present invention to provide a method for treating diabetic erectile dysfunction comprising administering to a subject an effective amount of a composition comprising C3G.
- Another object of the present invention to provide a health functional food for improving the erectile function of diabetic erectile dysfunction containing C3G.
- Figure 1 shows Masson's trichrome staining results of collagen (blue) and smooth muscle (red) in the cavernous tissue of the control group (A), diabetes (B) and C3G treated diabetic group (C). Magnification: 200x.
- Figure 2 shows the results of the drilling TUNEL detection of immunohistochemistry for apoptosis in the cavernous tissue of the control group (A) ⁇ diabetes (B) and C3G treated diabetic group (C). Cells in which apoptosis occurred are shown black or dark brown in TUNEL analysis, and live cells appear as bright spots. Magnification: 400x.
- Figure 3 shows the expression level of eNOS, nNOS and SOD.
- A shows the Western blot results of eNOS, nNOS and SOD in the cavernous tissue
- B shows the results of shading analysis relative to beta actin. The data are expressed as mean square SD. * Indicates significant difference between control and DM group, and ** indicates significant difference between DM group and C3G-treated DM group.
- the present invention provides C3G
- compositions for the prevention or treatment of diabetic erectile dysfunction comprising (Cyan i d i n-3-0- ⁇ -d-g 1 ucopy r anos i de).
- the present invention relates to a method for treating diabetic erectile dysfunction comprising administering to a subject an effective amount of a composition comprising C3G.
- C3G is an anthocyanin-based pigment component, cyanidin This form is combined with glucose.
- C3G according to the present invention can be separated and purified from nature or can be used commercially.
- C3G of the present invention may be extracted and separated from the Audi.
- Audi is a mature fruit of mulberry iorus alba L) belonging to the genus Moraceae, and its C3G content is 23 times that of grapes and 2.3 times that of colored rice. Not only is this simple, it contains pigments in the whole fruit, so its content is high and its separation yield is high.
- C3G of the present invention because it is contained in a large amount into the audio extract, prevention or treatment of mulberry extract is also diabetic impotence containing C3G and "may be used for the purpose.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetic erectile dysfunction comprising an Audi extract containing Cyanidin-3— O- ⁇ -d-glucopyranoside (C3G).
- the present invention relates to a method for treating diabetic erectile dysfunction comprising administering to a subject an effective amount of a C3G-containing Audi extract.
- the Audi extract is included in the scope of the present invention regardless of the extraction method and the extraction solvent as long as it contains C3G.
- the mulberry extract of the present invention is an extract obtained by extracting the mulberry with a solvent selected from the group consisting of water, ketones of C3 to C5, and straight or branched alcohols of C1 to C4 and their mixed solvents,
- the extract is understood to include an extract fractionated by at least one selected from the group consisting of water, C5 to C7 alkanes, C1 to C4 straight or branched alcohols, methylene chloride, and ethyl acetate.
- Preferred extractants are water or ethanol, more preferably 0.1% citric acid and 70% ethanol.
- Audi extract of the present invention may be prepared according to a conventional method for producing a plant extract, preferably may be by hot water extraction, pressure extraction, reflux extraction, hot needle extraction, ultrasonic extraction, but is not limited thereto.
- the extract prepared as described above is then carried out under reduced pressure filtration or addition Concentration and / or lyophilization may be used to concentrate or remove the solvent. Therefore, the Audi extract in the present invention is used as a meaning including a dried liquid dried in a conventional manner and the concentrated liquid extract or solid extract from which the extraction solvent is removed.
- diabetic erectile dysfunction means a state in which it does not exert sufficient function in acquiring or maintaining an erection due to neuropathy and angiopathy of penile cavernous tissues exhibited under diabetes.
- the compositions of the present invention can be used in subjects with diabetes mellitus, in particular type 1 and type 2 diabetes.
- C3G extracted from the audio pigment significantly improves the reduced intracranial pressure (ICP) in diabetic rats (see Table 1 of the Examples).
- ICP intracranial pressure
- ICP / MAP cavernosal pressure / average arterial pressure is increased in diabetic rats when electrical stimulation of the cavernous nerve in experimental models to mimic the erection process observed in men.
- C3G can improve penile tissue function by restoring smooth muscle function of the corpus cavernosum (FIG. 1).
- FOG. 1 smooth muscle function of the corpus cavernosum
- C3G improves erectile function by minimizing cavernous cell death in diabetic erectile dysfunction rat model (FIG. 2).
- FIG. 2 shows that when the C3G was administered to diabetic rats, the number of positively stained cells was significantly lower than that of the diabetic rats.
- Nitric oxide (NO) is an important neurotransmitter that mediates the relaxation of the smooth muscle layer present in the cavernous body and is known to be important before erection.
- NO which acts on the penile erection mechanism, has two different NO synthase enzymes, namely It is produced by NO synthase (endothelial NOS, eNOS) and nervous system NO synthase (neuronal NOS, nNOS) present in the vascular system.
- NO synthase endothelial NOS, eNOS
- nNOS nervous system NO synthase
- the increase in the expression of eNOS and nNOS which is decreased in diabetes indicates that C3G increases the biological activity of NO and eventually improves erectile function.
- C3G down-expresses 8-0HdG a marker for oxidative damage of DNA in the cavernous tissue
- up-expresses SOD which indicates that C3G oxidative damage under the oxidative stress environment of the cavernous body. Decrease and restore cells to inhibit the progression of erectile dysfunction (FIGS. 3A and B).
- the present invention for the first time through the diabetic erectile dysfunction rat model has been identified for the first time that C3G can protect and improve the erectile function by minimizing cavernous cell death.
- the composition of the present invention is a nutrient, vitamin, electrolyte, flavoring agent, coloring agent, neutralizing agent, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acid, protective colloid thickener, pH It may further contain regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks.
- the components may be added independently or in combination.
- the content of the additional component is preferably added in the range of 0.1 to 20 parts by weight per 100 parts by weight of the C3G or the Audi extract containing it, or in the range of 100 to 10,000,000 parts by weight per 100 parts by weight of licoridine. It is not limited.
- the content of the C3G or Audi extract in the composition can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the progress of the symptoms, the condition of the patient, and the like, for example, 0.0001 to 99.9% by weight based on the total composition increase, preferably 0.001 to 50 wt% is preferably, but is not limited thereto.
- the content ratio is a solvent The value is based on the amount of drying removed.
- the composition may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions, and may be prepared in a conventional manner as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. It may be used in the form of an oral dosage form, external preparation, suppository or sterile injectable solution.
- a diluent or excipient such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants which are commonly used.
- Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsulants, and the like, and such solid preparations may include at least one or more excipients and / or lubricants.
- Liquid preparations for oral administration include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups. In addition to water, liquid paraffin, which is a commonly used simple diluent, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, etc. May be included.
- Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
- the preferred dosage of the composition depends on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
- the dosage of the composition of the present invention is preferably 0.1 mg / kg to 20 mg / kg per day based on the active ingredient, but is not limited thereto. Administration may be once a day or may be divided several times.
- the compositions of the present invention can be administered by various routes to an animal, preferably a mammal, including a human. All modes of administration can be expected, for example by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous injection, and the like.
- the pharmaceutical dosage form of the composition of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt of the active ingredient, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable collection.
- the present invention relates to a dietary supplement for improving the erectile function of diabetic erectile dysfunction comprising C3G.
- the present invention is to improve the erectile function of diabetic erectile dysfunction comprising the step of ingesting a dietary supplement containing C3G to the subject It is about a method.
- the present invention relates to a health functional food composition for improving the erectile function of diabetic erectile dysfunction comprising the C3G-containing extract of Audi. ⁇
- the present invention relates to a method for improving the erectile function of diabetic erectile dysfunction comprising the step of ingesting a dietary supplement comprising the C3G-containing Audi extract.
- the food means a natural product or processed product containing one or more nutrients, and preferably means a state in which it can be directly eaten through a certain processing process. It is used to mean food, nutraceuticals, beverages, food additives and beverage additives. Examples of the foods include various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, and functional foods.
- the food in the present invention includes special nutritional products (eg, formulated oils, infants, baby food, etc.), processed meat products, fish products, tofu, jelly, noodles (eg, ramen, noodles, etc.), health supplements, seasoned foods ( For example, soy sauce, miso, red pepper paste, mixed soy sauce), sauces, sweets (eg snacks), dairy products (eg fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, kimchi, pickles (various kimchi, pickles, etc.), drinks ( Examples include, but are not limited to, fruits, vegetable drinks, soy milk, fermented beverages, ice cream, etc., natural seasonings (eg, ramen soup, etc.), vitamin complexes, alcoholic beverages, alcoholic beverages, and other health supplements.
- the health functional food, beverages, food additives or beverage additives may be prepared by a conventional manufacturing method.
- the dietary supplement may include food acceptable food additives, and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
- the amount of the C3G or Audi extract may be included as 0.00001% by weight to 50% by weight 3 ⁇ 4 of the total food weight, if the food is a beverage based on 100 ml of the entire food volume It may be included in a ratio of 0.001 g to 50 g, preferably 0.01 g to 10 g, but is not limited thereto.
- the C3G concentrate extracted from the pigment of the Audi fruit used in this experiment was supplied from the Rural criminal Authority of Korea. Specifically, in order to extract the Audi pigment C3G from raw, frozen and lyophilized Audi, filtered with 0.1% citric acid and 70% ethanol. After the extraction solvent was added to the Audi was extracted by hand squeezing the audio by hand or using a shaking incubator (shaking incubator) for 24 hours at 4 ° C. The extracted filtrate was used to separate the concentrate in a large amount at 40 ° C 85 mbar, 50 rpm using a rotary vacuum concentrator. (Kim HB, et al. Korean J Crop Sci. 2011; 56: 18-22).
- Diabetic serum levels were maintained throughout the experiment.
- C3G was dissolved in water and orally administered to rats of the DM + C3G group for 8 weeks daily.
- the intracavernosal pressure (ICP) was measured, and after ICP measurement, the skin was removed from the penile bone.
- the middle part of the shaft) was excised and fixed overnight in 10% formalin, washed and stored at 4 ° C in 70% alcohol until paraffin-embedded tissue sections (5 um) were made. Tissue was stored -8 (C to perform the experiment.
- Rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 0.2 mL of Zyltilamine (Zoletil®). The rat's back was placed on the floor (supine position), the penis was dissected and the corpus cavernosum and crus of the penis were exposed. In order to access the pelvis, the lower abdomen was incised and exposed from the pelvic ganglion side to the right side of the prostate. For KP measurement, after degolve the penile skin, a 23G butterfly needle was inserted into the heparinized corpus cavernosum, and the corpus cavernosum was identified.
- Zyltilamine Zyltilamine
- a bipolar stimulation generator was placed on the ganglion and treated with 10 V and 2.4 mA at 0.5 ms for 50 seconds. Cavernous nerve stimulation was performed at least three times and the stimulation interval was maintained for more than 10 minutes. Mean arterial pressure (MAP) and cavernous internal pressure were continuously monitored during electrical stimulation. The area under the curve and ICP / MAP were compared during the electrical stimulation. After the stimulation test, the spongy bodies were removed and divided into two. The first part was cryopreserved in liquid nitrogen and the other part was fixed in formalin.
- TUNEL analysis was performed using ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kits (Millipore Co., MA, US). An organization was prepared for detecting apoptosis according to the manufacturer's protocol. After TUNEL analysis, testis tissue sections were observed under an optical microscope. For TUNEL analysis, the number of positive cells was counted and the difference between each experimental group was evaluated. To count positive cells for TUNEL analysis, five sites were randomly selected from each experimental slide. The number of positive cells was taken as the average value of 5 sites measured at 400x magnification on an optical microscope. Example 5. Masson's tri chrome staining
- the medial section of the skinned penile shaft is excised, fixed in 10% formalin overnight, washed, and made paraffin-embedded tissue sections (5um) at 4 ° C in 70% alcohol. It was stored as. Tissues were stored at -80 ° C until experimental performance. Cavernous tissue was obtained for Masson's trichrome staining. After staining, color distribution in muscle tissue was calculated using Adobe Photoshop CS 8.0. After calculating the overall color distribution of the image, the muscle tissue distribution was selected and expressed in red. There were some standard deviations in the calculations due to the ambiguity of color spectrum and color overlay (over lay) of muscle tissue.
- the homogenized buffer solution was placed on ice for 15 minutes, centrifuged at 13000 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and the supernatant solution was separated. Proteins quantified at 30 ug were denatured at 95 ° C for 5 min and electrophoresis was performed on 12% discontinuous SDS-PAGE (sodium dodecy 1 su 1 f at e-po 1 yacry 1 am i de) gel. Next, the proteins were electroblotted at 25V for 150 minutes on a 0.2 ⁇ m polyvinylidenedif luoride (PVDF) membrane (Amershambioscience, USA).
- PVDF polyvinylidenedif luoride
- the membrane was reacted with a blocking buffer (5% skim milk in TBS-T buffer) for 30 minutes at ambient temperature, endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and neurogenic nitric oxide synthase (neuronal).
- eNOS endothelial nitric oxide synthase
- neuronal neurogenic nitric oxide synthase
- SOD superoxide dismutase
- Anti-eNOS antibodies 140KDa / l: 100 / BD Biosciences, USA), anti-nNOS antibodies (155KDa / l: 1000 / BD Biosciences, USA), and anti-SOD antibodies (155KDa / l: 5000 / Abeam pic) Used. After washing with 1 x TTBS, the membrane was treated with anti-mouse IgG for nNOS and anti-rabbit IgG for eNOS at room temperature for 1 hour, and SOE Zymed Laboratories, USA) was diluted 1: 1000. Next, the membrane was washed 6 times with TTBS again at 5 minute intervals.
- Oxidative stress of cavernous tissue was measured by quantifying the level of 8-0HdG as oxidatively modified DNA.
- Total DNA was extracted from testes using the DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
- the level of 8-OHdG was measured using a DNA oxidation kit (Highly Sensitive 8-0HdG Check ELISA; Japan Institute for the Control of Aging, Fukuroi, Japan).
- Table 1 shows changes in blood glucose and body weight in the control and experimental groups. During the experiment, serum glucose levels in two DM groups were maintained. No significant difference is noted. Body weight of DM group was significantly decreased compared to control group. '
- Table 2 below shows the cavernous internal pressure for electrical stimulation of the cavernous nerve in rats of each experimental group. Specifically, the peak ICP and ICP / MAP ratios were decreased in the DM group compared to the control group, and significantly improved in the C3G treated group. The control and DM + C3G groups had similar peak ICP and ICP / MAP ratios and were significantly higher than the DM group.
- the mean cell death index ⁇ standard deviation of the three groups detected by TUNEL analysis was 15.3 ⁇ 3.0 (control), 39.6 4.6 (DM), and 21.3 1.7 1.7 (DM + C3G).
- the cells stained positively in the TUNEL analysis in the C3G-administered group were significantly smaller (p ⁇ 0.05), and a representative figure is shown in FIG. 2.
- the degree of oxidative stress in the cavernous tissue was quantitatively measured.
- 8-OHdG was 0.140 ⁇ 0.13, 0.917 ⁇ 0.247 and 0.626 0.4 0.423, respectively.
- the DM group showed a significant increase in oxidative stresser ⁇ 0.05).
- the oxidative stress was significantly reduced compared to the DM group ( P ⁇ 0.05).
- Western blot analysis SOD was significantly reduced in the DM group compared to the control group, the C3G-treated DM group was expressed more than the control group (Fig. 3A and B).
- C3G protects erectile function by minimizing cavernous cell death, and this study was the first to demonstrate that C3G can protect and enhance erectile function in a diabetic erectile dysfunction rat model.
- composition comprising the C3G or an audiovisual extract containing the same is a composition derived from a natural product having excellent therapeutic effect against diabetic erectile dysfunction and without toxicity and side effects, it is safer and more effective in treating diabetic erectile dysfunction. Can be applied.
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Abstract
본 발명은 C3G (Cyanidin-3-O-ß-d-glucopyranoside) 의 당뇨병성 발기부전 개선 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 C3G 를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능용 식품 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능용 식품 조성물에 관한 것이다.
Description
【명세서】
【발명의 명 칭】
C3G 또는 이를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물
【기술분야】
본 발명은 C3G (Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopyr anos i de ) 의 당뇨병성 발 기부전 개선 용도에 관한 것이다. 구체적으로,본 발명은 C3G 를 포함하는 당 뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능용 식품 조성 물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함하 는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능용 식품 조성물에 관한 것 이다.
【배경기술】
남성의학 분야에서 음경 발기부전 질환은 대표적 인 비뇨기과 질환으 로 분류된다. 발기부전의 원인은 크게 심 인성 (정신적 원인 )과 기질성 (신체적 원인 )으로 구분 할 수 있다. 기 질적 인 원인으로는 신경 계, 혈관계, 또는 내 분비 계통의 이상을 포함하며, 발기부전을 일으키는 대표적인 질환으로는 증 추신경 질환 (척수손상, 다발성 경화증), 말초신경 질환 (당뇨병, 골반수술), 고 혈압 및 신장질환 등을 포함한다.
특히, 당뇨 환자에서 발기부전의 빈도는 일반인에 비하여 3배 정도 높 으며, 보고자에 따라 다소 차이는 있지만 대략 35%에서 75%까지 보고되고 있 다 (Fedele, D. et al . , Int . J . Epidemiol . 2000, 29, 524-531; Johannes , C. B. et al . , J . Urol . 2000, 163, 460—463) .
당뇨병은 발기 기능에 증요한 요소인 해면체 신경 및 내피세포의 기 능을 해치며, 산화질소의 생성올 감소시킨다. 이로 인하여 체내 산화물질이 증가되어 혈관이 굳어지고 음경 해면체의 병변을 초래하게 되며, 신경내충의 혈류에도 장애가 발생하여 신경 병증이 생긴다. 또한, 당뇨환자에서 해면체 내 약물 주입 후 음경복합도플러 초음파 검사를 시 행하면 75% 이상에서 음경
1
대 체용지 (규칙 제 26조)
동맥의 혈류감소를 나타내는데, 이러한 혈관병증은 당뇨에서 발기부전을 일 으키는 원인이 된다. 또한, 당뇨병에서 과혈당증 (hyperglycaemia)은 초과산 화물 (superoxide, 02 )을 과다 생성하여 산화적 스트레스로 인한 해면체의 세 포 사멸을 유도함으로써 당뇨병 동물에서 발기 손상의 주요 원인으로 작용 한다.
일반적으로 발기부전을 치료하는 방법으로는 심리적 요법, 비수술적 방법, 수술적 방법이 있으며, 비수술적 치료에는 약물복용, 음경해면체 내에 발기유발제 투입법, 진공 음경흡입기 등이 있고, 수술적 치료에는 음경정맥 결찰술, 음경동맥재건술, 음경 보형물 삽입술 등이 있다. 현재 전세계적으로 가장 효과가 있는 발기부전 치료제는 비아그라©이며, 이를 대체할만한 약물 을 개발하려는 연구가 계속되고 있으나, 대부분 화학적으로 합성된 약물이므 로 심혈관계 및 시력장애의 부작용 등을 갖는 문제점이 있으며, 특히 당뇨병 성 발기부전 환자에게 효과적인 약물의 개발은 이루어지지 않고 있는 실정 이다.
한편, 오디는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하는 뽕나무 Uforus aH)a L) 및 동속 근연식물의 성숙한 열매로서 한방에서 상심 , 상실, 오심, 혹심 등으로 지칭된다. 오디는 전통적으로 당뇨병을 치료 또는 예방하기 위한 한약재로 사용되어 왔으며, 오디 나무의 뿌리 껍질은 항염증제, 이뇨제, 진해제 및 해 열제 용도의 한약재로 사용되어 왔다.
뽕나무 오디에 함유된 천연 색소는 안토시아닌의 한 형태인 C3G
(Cyanidin-3-0-I3-d-glucopyranoside)로서, 안정적이고 분리방법이 간단할 뿐만 아니라, 과실 전체에 색소를 함유하여 그 함량이 높고 분리수율 또한 높다. 오디의 C3G의 함량은 포도의 23배, 유색미의 2.3배에 달한다. 오디에 다량 함유된 C3G 는 자유 라디칼 소기 작용을 하며 염증을 억제하는 활성을 보인다고 알려져 왔다.
C3G와 관련하여,국내등록특허 제 0601320호는 혹미에서 추출한 C3G의 고지혈증 치료 용도에 관하여 기술하고 있고, 국내등록특허 제 0880876호는 검정공에서 추출한 C3G 의 허혈-재관류 손상 치료 용도에 관하여 기술하고 있으며, 국내공개특허 제 2011-00144이호는 C3G 를 함유하는 복분자 추출물
을 유효성분으로 하는 위염 및 위궤양 치료 용도에 관하여 기술하고 있다. 이와 같이, C3G 의 다양한 약리활성은 보고되어 있지만, 당뇨병성 발기부전 의 개선 효과에 대해서는 아직까지 알려져 있지 않으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 인체에 무해하며 당뇨병성 발기부전에 예방 또는 치료 효과를 갖는 약제를 개발하기 위하여 생약재를 탐색하던 중, 오디에 다량 함 유된 C3G가 당뇨병 랫트 모델에서 발기 기능을 향상시키는데 우수한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 하나의 목적은, C3G ( Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopyr anos i de ) 를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하 는 것이다. .
본 발명의 또 하나의 목적은, C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함하 는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은, C3G 를 포함하는 조성물의 유효량을 개 체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, C3G 를 함유하는 오디 추출물의 유효량 을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 치료방법을 제공 하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, C3G 를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능 개선용 건강기능식품 을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함하 는 당뇨병성 발기부전의 발기기능 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은, C3G를 포함하는 건강기능식품을 개체에
섭취시키는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능을 개선하는 방 법을 제공하는 것이다.
발명의 또 하나의 목적은, C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 건강기능식품을 개체에 섭취시키는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 대조군 (A), 당뇨균 (B)및 C3G를 처리한 당뇨군 (C)의 해면체 조 직에서 콜라겐 (파란색) 및 평활근 (붉은색)의 Masson' s trichrome 염색 결과 를 나타낸다. 배율: 200x.
도 2는 대조군 (A)ᅳ당뇨균 (B)및 C3G를 처리한 당뇨군 (C)의 해면체 조 직에서 세포사멸 (apoptosis)에 대한 면역조직화학 (immunohistochemical) 인 시추 TUNEL 검출 결과를 나타낸다. 세포사멸이 일어난 세포는 TUNEL 분석에 서 검은색 또는 어두운 갈색으로 보여지고, 살아있는 세포는 밝은 점으로 나 타나있다. 배율: 400x.
도 3은 eNOS, nNOS 및 SOD 의 발현 정도를 나타낸 것이다. (A)는 해면 체 조직에서 eNOS, nNOS 및 SOD 의 웨스턴 블랏 결과를 나타내고, (B)는 베 타 액틴에 대하여 상대적인 음영계측 분석 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 士 SD로 표현하였다. *는 대조군과 DM군 간의 유의적인 차이를 나타내며, ** 는 DM 군과 C3G-처리된 DM군 간의 유의적인 차이를 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
하나의 양태로서, 본 발명은 C3G
( Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopy r anos i de ) 를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예 방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 C3G 을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 치료방법에 관한 것 이다.
본 발명에서 C3G는 안토시아닌계 색소 성분으로, 시아니딘 (cyanidin)
이 포도당 (glucose)과 결합된 형태이다. 본 발명에 따른 C3G 는 천연으로부 터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 C3G는 오디에서 추출 및 분리한 것일 수 있다. 오디는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하는 뽕나무 iorus alba L) 및 동속 근연 식물의 성숙한 열매로서, 오디의 C3G 의 함량은 포도의 23배, 유색미의 2.3 배에 달하며, 오디에 함유된 C3G 는 안정적이고 분리방법이 간단할 뿐 아니 라 과실 전체에 색소를 함유하여 그 함량이 높고 분리수율 또한 높다.
본 발명의 C3G는 오디 추출물에 다량으로 함유되어 있으므로, C3G를 함유하는 오디 추출물 역시 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료하 '는 용도 로 사용될 수 있다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 C3G (Cyanidin-3— Ο-β-d-glucopyranoside)를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 C3G 를 함유하는 오디 추출물의 유효 량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 치료방법에 관 한 것이다.
본 발명에서 오디 추출물은 C3G 를 함유하는 한, 추출 방법 및 추출 용매를 불문하고 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 오디 추출물은, 오디를 물, C3 내지 C5의 케톤, 및 C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지 형 알코올 및 이들의 흔합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추 출하여 얻어진 추출물, 그 추출물에서 물, C5 내지 C7의 알칸, C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트로 이루어진 군 에서 선택된 1종 이상으로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 바 람직한 추출용매는 물 또는 에탄올이며, 더욱 바람직하게는 0.1% 구연산 및 70% 에탄올이다.
본 발명의 오디 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제 조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출, 가압 추출, 환류 추출, 온침 추출, 초음파 추출 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기한 바와 같이 제조된 추출물은 이후 감압 여과과정을 수행하거나 추가
로 농축 및 /또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 오디 추출물은 통상적 방법으로 건조된 건조물과 추 출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에서 당뇨병성 발기부전이란 당뇨병 하에서 나타나는 음경 해 면체 조직의 신경병증 및 혈관병증으로 인하여 발기를 획득하거나 유지하는 데 있어서 충분한 기능을 발휘하지 못하는 상태를 의미한다. 따라서, 본 발 명의 조성물은 진성 당뇨병 (diabetes mellitus), 특히 제 1형 및 제 2형 당뇨 병을 가진 대상체에 사용할 수 있다.
본 발명의 C3G포함 조성물의 당뇨병성 발기부전에 대한 예방 또는 치 료 활성은, 당뇨병 발기부전의 동물 모델을 통하여 직접적으로 입증되었다. 우선, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 오디 색소로부터 추출된 C3G 가 당뇨병 랫트에서 감소된 해면체 내압 (intracavernosal pressure, ICP)을 유의적으로 향상시키는 것을 확인하였다 (실시예의 표 1 참조). 음경 해면체 내압의 증가는 음경 발기를 용이하게 하는데, 남성에게서 관찰되는 발기 과 정을 모방하기 위하여 실험모델에서 해면체 신경에 전기적 자극을 주었을 때, 당뇨병 랫트에서는 ICP 및 ICP/MAP (해면체 내압 /평균 동맥압) 이 감소 한다. 그러나 당뇨병 랫트에 C3G를 투여한 경우 피크 ICP 및 ICP/MAP 이 유 의적으로 향상됨을 확인할 수 있었다. '
또한, 본 발명자들은 C3G가 음경 해면체의 평활근 기능을 회복시킴으 로써 음경 조직 기능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다 (도 1). Masson' s trichrome 염색 결과, C3G처리군에서는 당뇨병에서 감소되었던 평활근 함량 이 증가하고 콜라겐 함량이 감소함을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 당뇨병성 발기부전 랫트 모델에서 C3G가 해면체 세포사멸을 최소화함으로써 발기 기능을 향상시킨다는 것을 확인하였다 (도 2). 세포사멸에 대한 TUNEL 분석 결과 당뇨병 랫트군과 비교하여 당뇨병 랫 트에 C3G를 투여한 경우 양성으로 염색된 세포가 유의적으로 적었으므로 해 면체 내 세포사멸이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 C3G 가 eNOS 및 nNOS 단백질의 발현을 활성화시
킨다는 것을 확인하였다 (도 3A 및 B). 산화질소 (NO)는 해면체에 존재하는 평활근 층의 이완을 매개하는 중요한 신경전달물질로서 발기기전에 증요한 물질로 알려져 있으며, 음경발기 기전에 작용하는 NO는 2가지의 다른 NO 합 성 효소, 즉 혈관계에 존재하는 NO 합성효소 (endothelial NOS, eNOS) 및 신 경계 NO 합성효소 (neuronal NOS, nNOS) 에 의해 생성된다. 따라서, 본 발명 에서 C3G 가 당뇨병에서 감소되는 eNOS 및 nNOS 의 발현을 증가시킨다는 것 은 C3G 가 NO 의 생물학적 활성을 증가시켜 종국적으로 발기 기능을 향상시 킨다는 것을 나타낸다.
아을러, 본 발명에서는 C3G가 해면체 조직에서 DNA의 산화적 손상에 대한 마커인 8-0HdG를 하향 발현시키며 SOD를 상향 발현시키는 것을 확인하 였는데, 이는 C3G가 해면체의 산화적 스트레스 환경 하에서 산화적 손상을 감소시키고 세포를 회복시켜 발기부전의 진행을 저해함을 나타내는 것이다 (도 3A 및 B).
이상과 같이, 본 발명은 당뇨병성 발기부전 랫트 모델을 통하여 C3G 는 해면체 세포 사멸을 최소화함으로써 발기 기능을 보호 및 향상시킬 수 있음을 처음으로 규명하였다.
본 발명의 조성물은 유효성분인 C3G 또는 이를 함유하는 오디 추출물 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함 유할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상 기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 C3G또는 이를 함유하는 오디 추출 물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위 또는 리코리시딘 100 중량부 당 100 내지 10,000,000 중량부 범위에서 추가할 수 있으나, 이에 제한되는 것 은 아니다.
상기 조성물 내의 상기 C3G 또는 오디 추출물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 증량을 기준으로 0.0001내지 99.9증량 %,바람직하게는 0.001내 지 50중량 %인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매
를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀견, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외 용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결 합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조 제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡술제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 한 가지 이상의 부형제 및 /또는 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순회석제인 물, 리퀴 드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보 존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비 수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택 될 수 있다. 보다 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물의 투여량은 유 효성분을 기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 하는 것이 좋으나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염 의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 C3G를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 C3G를 포함하는 건강기능식품을 개체 에 섭취시키는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능을 개선하는
방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능 개선용 건강기능식품 조성물에 관 한 것이다. ·
또 하나의 양태로서, 본 발명은 C3G 를 함유하는 오디 추출물을 포함 하는 건강기능식품을 개체에 섭취시키는 단계를 포함하는 당뇨병성 발기부 전의 발기기능을 개선하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거 쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료,식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의 미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복 합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품 (예,조제유류, 영,유아식 등),식육가공품,어육제품,두부류,묵류,면류 (예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 흔합 장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (각종 김치류,장아찌 등),음료 (예,과실,채소류 음 료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료 (예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 건강기능식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가 제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품에 있어서, 상기 C3G 또는 오디 추출물의 양 은 전체 식품 중량의 0.00001 중량 % 내지 50 중량 ¾로 포함될 수 있으며, 상 기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml를 기준으로 0.001 g내 지 50 g, 바람직하게는 0.01 g내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한 정되는 것은 아니다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 오디 열매와 천연 색소의 준비
본 실험에서 사용한 오디 열매 색소에서 추출한 C3G 농축물을 대한민 국 수원에 위치한 농촌진홍청에서 공급받아 사용하였다. 구체적으로, 생오디, 넁동 오디 및 동결건조된 오디에서 오디 색소 C3G 를 추출하기 위하여 0.1% 구연산 및 70% 에탄올로 추출하여 여과하였다. 오디에 추출용매를 가한 후 손으로 직접 오디를 짓이겨 추출하거나 진탕기 (shaking incubator)를 이용하 여 4°C에서 24시간 동안 추출하였다. 상기 추출된 여과액은 대용량 회전진공 농축기를 이용하여 40°C에서 85mbar, 50rpm으로 대량으로 농축물을 분리하여 사용하였다. (Kim HB, et al.. Korean J Crop Sci. 2011; 56:18-22). 실시예 2. 동물그룹 및 처리 프로토콜
12주령의 수컷 Sprague-Dawley 랫트 36마리를 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Co隱 it tee) (CUMO201(H) 137—02)에서 승 인된 프로토콜에 따라 처리하였으며 미국국립보건원 (National Institutes of Health, NIH)의 가이드라인을 준수하였다. 랫트를 균등하게 세 그룹으로 나 누었다 (각각 n=12): 대조군, 당뇨균 (DM), 및 C3G 농축 물질을 처리한 당뇨 균 (DM+C3G). DM군 및 DM+C3G군에 속한 모든 랫트에 대하여 스트렙토조토신 50 mg/kg 을 단 회 복강내 투여하여 당뇨병을 유발하였다. 1주일 안에 모든 랫트가 유의하게 당뇨 상태 (혈청 포도당 > 250mg/dl) 임을 확인하였으며, 매 주마다 혈당 및 체중을 측정하였다. 당뇨의 혈청 수준은 실험 내내 유지하였 다. 당뇨를 유발한 지 4주 후에, DM+C3G군의 랫트에 대하여 C3G를 물에 녹 여 8주 동안 매일 경구 투여하였다. 12주 후에 해면체 내압 (intracavernosal pressure, ICP)을 측정하였고, ICP측정 후, 피부를 벗긴 음경 골간 (penile
shaft)의 중간 부분을 절제하고 10% 포르말린에서 밤새 고정시킨 후 세척하 고, 파라핀-포매된 조직 절편 (5um)을 제작할 때까지 70% 알코올에서 4°C 로 보관하였다. 조직은 실험 수행까지 -8( C 에서 보관하였다. 실시예 3. 해면체 내압측정
랫트에 0.2mL 의 틸레타민 (Zoletil®) 을 복강 내 주사하여 마취시켰 다. 랫트의 등을 바닥에 눕히고 (supine position), 음경을 해부하고 음경 해 면체 및 음경각 (corpus cavernosum and crus of the penis)을 노출시켰다. 골 반에 접근하기 위하여 복부를 낮게 중앙 절개하였고, 골반신경절 (pelvic ganglion) 측면에서 전립선 우측까지 노출시켰다. KP 측정을 위하여, 음경 피부를 degolve 한 후 해파린 처리된 음경해면체에 23G 버터플라이 니들 (butterfly needle) 을 삽입하고 음경 해면체를 확인하였다. 다음으로, 해면 체 신경올 자극하기 위하여 신경절에 양극의 자극 발생기를 두고 50초 동안 0.5ms 로 10V 및 2.4mA 처리하였다. 해면체 신경 자극은 최소한 3회 수행하 였으며 자극 간격은 10분 이상으로 유지하였다. 평균 동맥압 (arterial pressue, MAP) 및 해면체 내압은 전기 자극 동안 계속적으로 모니터링하였다. 전기 자극 동안 이에 대웅하는 곡선하 면적 및 ICP/MAP를 비교하였다. 자극 테스트 후에, 해면체를 제거하여 둘로 나누었다. 첫번째 부분은 액체 질소에 서 저온 보존하였고 다른 부분은 포르말린에 고정하였다.
L
실시예 4. TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) 분석
해면체 조직 내 세포사멸 (apoptosis)를 관찰하기 위하여, ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kits (Millipore Co. , MA, US) 를 사용하여 TUNEL 분석올 수행하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 세포사멸을 검출하기 위한 조 직을 준비하였다. TUNEL분석 후에, 정소 조직 절편을 광학 현미경으로 관찰 하였다. TUNEL분석을 위하여 양성 세포의 수를 계수하고 각 실험군 간의 차 이를 평가하였다. TUNEL분석을 위한 양성 세포의 계수를 위하여, 각 실험군 의 슬라이드에서 5개 부위를 무작위적으로 선별하였으며, TUNEL분석을 위한
양성 세포의 수는 5개 부위를 광학현미경에서 400x 배율로 측정한 평균값으 로 하였다. 실시예 5. Masson' s tri chrome 염색법
ICP후에, 피부를 벗긴 음경 골간 (penile shaft)의 중간 부분올 절제 하고 10% 포르말린에서 밤새 고정시킨 후 세척하고, 파라핀-포매된 조직 절 편 (5um)을 제작할 때까지 70% 알코올에서 4°C 로 보관하였다. 조직은 실험 수행까지 -80°C 에서 보관하였다. Masson' s trichrome 염색을 위하여 해면 체 조직을 수득하였다. 염색 후에, Adobe Photoshop CS 8.0 을 사용하여 근 육 조직 내 색상 분포를 계산하였다. 이미지의 전체 색상 분포를 계산한 후, 근육 조직 분포를 선택한 후, 붉은색으로 표현하였다. 근육 조직의 색상 스 펙트럼의 모호함과 색상 오버레이 (over lay)로 인하여 계산에 다소의 표준편 차가 존재하였다. 실시예 6. 웨스턴 블랏으로 eNOS. nNOS 및 SOD단백질 발현의 확인
0.32M 수크로스, 0.2M 헤페스 (pH 7.4), ImM EDTA(ethylenediaminetetraacet ic acid) , ImM DTT(dithiothreitol ) , 10 μ g/mL 류펩틴, 2 g/mL아프로티닌, 1 yg/mL 펩스타틴, 10 yg/mL트립신 저해제, 및 ImM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)을 포함하는 버퍼 용액에서 해 면체 절편올 각각 균질화하였다. 균질화된 버퍼 용액을 15분간 아이스에 두 고 4°C 에서 15분간 13000 rpm 으로 원심분리한 후 상층액 용액을 분리하였 다. 30ug으로 정량한 단백질을 95°C 에서 5분간 변성시킨 후 12% 의 불연속 적 SDS-PAGE( sodium dodecy 1 su 1 f at e-po 1 yacry 1 am i de ) 젤에서 전기영동을 수 행하였다. 다음으로 단백질을 0.2um 의 PVDF(polyvinylidenedif luoride)(Amershambioscience, USA) 멤브레인 상에서 25V에서 150 분간 일렉트로 블랏팅 하였다. 상기 멤브레인은 주위 온도에서 30분간 차단 버퍼 (5% skim milk in TBS-T buffer) 와 반웅시켰으며, 혈관내 피 산화질소 합성효소 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) , 신경원성 산화질소 합성효소 (neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 및 과산화물 제
거효소 (superoxide dismutase, SOD)에 대한 각각의 항체를 처리하여 4°C에 서 밤새 배양하였다. 항 -eNOS 항체 (140KDa/l:100/BD Biosciences, USA), 항 -nNOS 항체 (155KDa/l:1000/ BD Biosciences, USA), 및 항 -SOD 항체 (155KDa/l:5000/ Abeam pic)를 사용하였다. 1 x TTBS 로 세척한 후, 멤브레 인에 nNOS에 대한 항—마우스 IgG 및 eNOS 에 대한 항 -토끼 IgG를 상온에서 1 시간 동안 처리하였고, SOE Zymed Laboratories, USA) 를 1:1000 으로 희석 하였다. 다음으로, 멤브레인을 다시 TTBS 로 5분 간격으로 6회 세척하였다. 증강된 화학발광 웨스턴 ¾"(enhanced chemi luminescence Western blotting) 검출 시약을 사용하여 화학발광을 검출하였으며, BiolD 소프트웨어 (version 97; Vilber Lourmat , France)를 사용하여 자가방사기록사진 (autoradiogram) 상의 밴드의 음영농도를 계측하였다. 실시예 7. 8-OHdG (8-hydroxy-2-deoxyguanos ine) 의 측정
산화적으로 변형된 DNA 로서 8-0HdG 의 수준을 정량함으로써 해면체 조직의 산화적 스트레스를 측정하였다. DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여, 제조자의 지침서에 따라 정소로부터 총 DNA 를 추출하였다. 또한, DNA oxidation kit (Highly Sensitive 8-0HdG Check ELISA; Japan Institute for the Control of Aging, Fukuroi , Japan) 를 사 용하여 , 제조자의 지침서에 따라 8-OHdG 의 수준을 측정하였다. 8-OHdG표준 (0.5- 40 ng/mL) 또는 정소에서 정제한 15~20 ug 의 DNA를, 8-0HdG로 프리 코팅 (precoating)된 마이크로타이터 플레이트에서 1시간 동안 8-OHdG 에 대 한 단클론항체와 함께 배양하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 첨가하여 최종 색상이 발색된 후, 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선으로부 터 조직 샘플 농도를 계산하였고 DNA 농도로 보정하였다. 실험결과
1. 당뇨병의 일반적인 특징
하기 표 1은 대조군 및 실험군에서 혈당 및 체중의 변화를 나타낸다. 실험을 수행하는 동안, 2 개의 DM 군에성의 혈청 포도당 수준이 유지되었으
며 유의한 차이는 나타나지 않$다. DM군의 체중의 경우 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다. '
【표 1】
2. 인 비보측정 및 발기 기능
하기 표 2는 각 실험군의 랫트에서 해면체 신경의 전기적 자극에 대 한 해면체 내압을 나타낸다. 구체적으로, 대조군에 비하여 DM 군에서 피크 ICP 및 ICP/MAP 비율이 감소하였으며 C3G 처리군에서는 유의적으로 향상되었 다. 대조군 및 DM+C3G 군은 통계적으로 피크 ICP 및 ICP/MAP 비율이 유사하 였으며 , DM 군보다는 유의하게 높았다.
【표 2】
3. Masson' s trichrome 염색 결과
대조군과 비교하여, DM군에서 해면체 조직의 평활근 함량이 감소하고 콜라겐 침착 (collagen deposition)이 증가하였으며, C3G 처리군에서는 평활 근 함량이 증가하고 콜라겐 함량이 감소하였다 (도 1). 근육 /콜라겐 비율은 27.3 土 3.0 (대조군), 10.6 土 4.6 (DM군), 및 21.8 士 1.7 (DM+C3G군) 이 었다. 대조군과 비교하여 DM군에서 근육 /콜라겐 비율의 유의적인 감소가 나 타났으며, C3G 처리군에서는 근육 /콜라겐 비율이 유의적으로 증가하였다.
4. 세포사멸에 대한 TUNEL분석 결과
TUNEL 분석으로 검출된 세 그룹의 평균 세포사멸 지수 土 표준편차는 15.3 土 3.0 (대조군), 39.6 士 4.6 (DM군), 및 21.3 士 1.7 (DM+C3G군) 이 었다. DM군과 비교하여, C3G투여 군에서 TUNEL 분석 결과 양성으로 염색된 세포가 유의적으로 적었으며 (p < 0.05), 대표 도면을 도 2에 나타내었다.
6. eNOS 및 nNOS 단백질의 발현
모든 그룹에서, 액틴에 대한 N0S 의 발현에 차이가 있었고 따라서 본 발명자들은 N0S의 발현을 비교하기 위하여 보정올 하였다. 액틴에 대한 N0S 의 발현을 100으로 보정하였으며 N0S 의 발현을 비교하였다. 웨스턴 블랏 결 과, 대조군과 비교하였을 때 DM군에서 eNOS및 nNOS단백질이 감소하였으며, densitogram 에서 나타나듯이 C3G 처리군에서는 그 수준이 증가하였다 (도
3A 및 B).
7. 해면체 조직에서 산화적 스트레스의 측정
해면체 조직에서 8-OHdG 를 측정함으로써 해면체 조직 내 산화적 스 트레스의 정도를 정량적으로 측정하였다. 정상군, DM군 및 DM+C3G 군에서 8-OHdG는 각각 0.140 土 0.13, 0.917 土 0.247 및 0.626 士 0.423 였다. 정 상 대조군과 비교하여 DM군에서 산화적 스트래서의 유의적인 증가가 나타났 다 < 0.05). 그러나, C3G로 처리한 DM군에서는 DM군과 비교했을 때 산 화적 스트레스가 통계적으로 유의하게 감소하였다 P < 0.05). 또한, 웨스턴 블랏 분석 결과, 대조군과 비교하여 DM 군에서 SOD 가 유의적으로 감소하였 으나, C3G로 처리한 DM군의 경우 대조군에 비하여 더 많이 발현되었다 (도 3A 및 B).
8. 결과 종합
C3G는 해면체 세포 사멸을 최소화함으로써 발기 기능을 보호하며 , 본 연구는 당뇨병성 발기 부전 랫트 모델을 통해서 C3G가 발기 기능의 보호 및 향상시킬 수 있음을 처음으로 규명한 것이다.
【산업상 이용가능성】
본 발명에 따른 C3G또는 이를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 조성 물은 당뇨 병성 발기부전에 대한 치료 효과가 우수하면서도 독성과 부작용 이 없는 천연물 유래의 조성물이므로, 당뇨병성 발기부전의 치료에 보다 안 전하고 효과적으로 적용될 수 있다.
Claims
【청구항 1】
C3G ( Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopy r anos i de ) 또는 C3G를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 C3G는 오디 열매에서 유래한 것인 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
【청구항 4】
C3G ( Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopyr anos i de ) 또는 C3G를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 당뇨병성 발기부전의 발기기능 개선용 건강기능식품.
【청구항 5】
제 4항에 있어서, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 추가 로 포함하는 건강기능식품. .
【청구항 6】
C3G ( Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopyr ano s i de ) 또는 C3G를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당 뇨병성 발기부전의 치료방법.
【청구항 7】
게 6항에 있어서,상기 C3G는 오디 열매에서 유래한 것인, 당뇨병성 발 기부전의 치료방법 .
【청구항 8】
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적 으로 포함하는 것인, 당뇨병성 발기부전의 치료방법.
【청구항 9】
C3G ( Cyan i d i n-3-0- β -d-g 1 ucopyr anos i de ) 또는 C3G를 함유하는 오디 추출물을 포함하는 건강기능식품을 개체에 섭취시키는 단계를 포함하는 당 뇨병성 발기부전의 발기기능을 개선하는 방법.
【청구항 10】
제 9항에 있어서,상기 C3G는 오디 열매에서 유래한 것인, 당뇨병성 발 기부전의 발기기능을 개선하는 방법.
【청구항 11】 '、
제 9항에 있어서, 상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함하는 것인, 당뇨병성 발기부전의 발기기능을 개선 하는 방법ᅳ
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