JP7041066B2 - L-グルホシネートを作製する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年3月2日に出願された米国仮出願第62/302,421号、2016年5月16日に出願された米国仮出願第62/336,989号、および2016年10月26日に出願された米国仮出願第62/413,240号に対する優先権を主張するものであり、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
D-グルホシネートの、L-グルホシネートへの変換方法が提供される。本明細書中に記載する方法は、低コストのDおよびL-グルホシネートのラセミ混合物の原料を、L-グルホシネートに富んだより価値のある生成物に変換する手段を提供する。変換方法は、2工程を含み、それらは、1つまたは複数の別々の容器で行うことができる。第1工程は、D-グルホシネート(DおよびL-グルホシネートのラセミ混合物中に存在し得る)の、PPO(2-オキソ-4-(ヒドロキシ(メチル)ホスフィノイル)酪酸)への酸化的脱アミノ化である。この工程は、D-アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)酵素、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ(DAAD)酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。第2の工程は、1つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用した、PPOの、L-グルホシネートへの特異的アミノ化である。かかるアミン供与体は、グルタメート、L-グルタメート、リジン、アラニン、イソプロピルアミン、sec-ブチルアミン、フェニルエチルアミン等から選択することができる。この工程は、トランスアミナーゼ(TA)酵素、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ(LAAD)酵素、または化学変換によって、触媒反応を進めることができる。本明細書中に記載する方法を使用して、実質的に精製されたL-グルホシネートの組成物を得ることができる。
D-グルホシネート+O2+H2O ⇒ H2O2+NH3+PPO。
2H2O2 ⇒ 2H2O+O2。
D-グルホシネート+H2O+受容体 ⇒ NH3+還元受容体+PPO。
PPO+アミン供与体 ⇒ L-グルホシネート+ケト酸。
NH3+還元受容体+PPO ⇒ L-グルホシネート+H2O+受容体。
また、上述する反応生成物を含む組成物が、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に、L-グルホシネートおよびハイドロクロライド、アンモニウムもしくはイソプロピルアンモニウム塩などの許容可能な陽イオン性または陰イオン性の塩形態を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、L-グルホシネート、PPO、およびD-グルホシネートの混合物を含む。
トリタックなどのアミド系除草剤が挙げられる。本発明の除草組成物はさらに、グリホセート耐性または2,4-D耐性作物に対して、グリホセートまたは2,4-Dと併用して使用することができる。一般的に、本発明の組成物は、処理される作物に関して選択的で、かつ、用いられる施用率でこれらの組成物によって防除される雑草の範囲を補完する除草剤と組み合わせて使用することが好ましい。さらに一般的には、本発明の組成物および他の補完的な除草剤を、複合配合物として、またはタンクミックスとして同時に施用することが好ましい。
本明細書中に記載する組成物は、圃場または、例えば、鉄道、芝生、ゴルフコース、および雑草の防除が望ましい他の場所を含む任意の他の区域において、雑草を選択的に防除する方法において使用することができる。任意で、圃場または他の区域は、グルホシネートに対して耐性である植栽種子の1つまたは複数の作物を含有できる。その方法は、本明細書中に記載するようなL-グルホシネートを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程を含むことができる。
非限定的な実質形態は、下記を含む:
D-グルホシネートを、D-アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)酵素と反応させて、PPO(2-オキソ-4-(ヒドロキシ(メチル)ホスフィノイル)酪酸)を形成する工程と、
1つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ(TA)酵素によって、PPOをL-グルホシネートにアミノ化する工程と
を含み、D-グルホシネートの少なくとも70%が、L-グルホシネートに変換される方法。
D-グルホシネートに対して90%を超える鏡像体過剰率でのL-グルホシネートを含む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
D-グルホシネートに対して90%を超える鏡像体過剰率でのL-グルホシネートおよび0.01%を上回るが、10%未満であるPPOを含む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
D-グルホシネートに対して90%を超える鏡像体過剰率でのL-グルホシネートおよび0.01%を上回るが、10%未満であるPPOを含む有効量の組成物を圃場に施用する工程
を含む方法。
Rhodosporidium toruloides由来の変異型DAAOのコード配列(例えば、MMARIRLリーダー配列ならびにF58KおよびM213Sの変異で構成される)をpET14bベクターへクローニングして、N末端で6×Hisをタグ付けしたタンパク質の発現を可能にした。このpET14b-RgDAAOプラスミドで、BL21(BE3)trxB PLysS細胞を形質転換した。本明細書に記載する番号付け全てに対応するRhodosporidium toruloides由来の野生型DAAOの配列は、下記である:
MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTGHAMWLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSSECPPGAIGVTYDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDGADLVVNATGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGTYGVGDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGTIEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDRTKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL(配列番号2)
DAAO活性は、Berneman et alと同様に決定した。簡潔に述べると、基質およびHRP(50mMリン酸カリウム、pH8中に0.1mg/mLのHRP、Sigma社 P8375、および所望量のD-グルホシネートまたはラセミD/L-グルホシネート)100μLを、Brand社 製のUVマイクロキュベットに添加した。そこに、50μLの色素(50mMリン酸カリウム、pH8中に60μg/mLのTBHBA、Sigma社 439533、および1mg/mLの4-アミノアンチピリン、Sigma社 A4382)を添加し、続いて50μLの酵素ミックス(100mMリン酸カリウム、pH8中に所望であるようなDAAO濃度)を添加した。反応は、分光光度計で510nmにて適切な時間にわたってモニタリングして、酵素動態を決定した。フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、DAAOの精製または反応に添加されなかったが、この試薬は任意に含むことができる。実施例1のように精製したRhodosporidium toruloides のDAAOの2つの例示的な変異体であるAC201(F58KおよびM213Sを含有する)およびAC263(N54T、T56M、F58K、およびM213Sを含有する)は、このアッセイを使用して検査され、過酸化水素を生産することが示され、D-グルホシネートを酸化する際にはそれらの活性があることを実証していた。AC201およびAC263は、類似したVmaxを有するが、AC263は、より低いKMを有する。
例えば、Escherichia coli gabTトランスアミナーゼ(http://www.uniprot.org/uniprot/P22256)を精製するために、遺伝子をE. coli K12株ER2925から増幅させて、pET-14bでクローニングされ、N末端で6×Hisをタグ付けした型を生成した。次に、誘導のため、このプラスミドでBL21(DE3)細胞を形質転換した。自己誘導性培地中での誘導後、細胞を超音波処理によって溶解させて、6×Hisタグ付き酵素を実施例1に記載しているように精製した。
非限定的な例において、トランスアミノ化アッセイに関するPPOの供給源は、DAAOによってPPOに変換されたD-グルホシネートまたはラセミD/L-グルホシネートであり得る。第1の工程では、39mMラセミD/L-グルホシネートを、0.5mg/mlの精製した、F58K、M213SであるRhodosporidium toruloides のDAAOおよび10μg/mLのカタラーゼとともに、50mMリン酸カリウム、pH8の緩衝液中で、30℃で20時間インキュベートした。これにより、D-グルホシネートの大部分はPPOに変換された。続いて、精製したE. coli gabTを20μg/mLで添加して、L-グルタメートをアミン供与体として、50mMで添加した。適切な時点で試料を10分間沸騰し、続く等量のアセトニトリルによる沈殿によって停止させた。個々の化学種は、Chirobiotic T2カラムを用いたHPLCで分解され、真正標準物質との比較によって定量化された。
反応は、実施例4と同様に設定した。系(5.45mL、30℃)は、pH7.3のリン酸緩衝液にて実行した。pH8.0での50mMリン酸緩衝液は、アミノ酸添加を緩衝するには不十分であること、およびこの系におけるアミノ酸添加後の未調節pHは、pH6.4であることが観察された。pHは、容量5.45mLになるように1Mの塩基の塩K2HPO4を使用して調節されていたため、添加による実際の初期基質濃度は275mMになることを意味していた。反応の開始時に基本的に同時に下記試薬を添加した:D,L-グルホシネート271mg、グルタメート420mg、AC263 DAAO 15mg、カタラーゼ 50μg、およびE. coli gabTトランスアミナーゼ1.0mg。図2は、全ての試薬を添加すると、ほんのわずかのPPOの蓄積を伴って、D-PPT(D-グルホシネート)の量は、減少したことを示している。この結果は、RgDAAO/EcgabT酵素対によるD/L-グルホシネートの、L-グルホシネートへの効率的な脱ラセミ化を示している。
上記で概略が述べられているタンパク質の変異誘発戦略を使用して、改良した変異体DAAO酵素を同定した。酵素は、以下に記載する手順に従ってアッセイされた。
下記色素ストック溶液を調製した:20mg/mLの2,4,6-トリブロモ-3-ヒドロキシ安息香酸(TBHBA)のDMSOでのストック溶液、および100mg/mLの4-アミノアンチピリン(4-AAP)の水でのストック溶液。下記酵素ストック溶液を調製した:pH8.0のリン酸カリウム緩衝液中の1mg/mLのホースラディッシペルオキシド(HRP)6型ストック溶液。下記基質ストック溶液を調製した:pH8.0のリン酸カリウム緩衝液中の様々な濃度のDまたはDLアミノ酸。
下記の反応混合物を調製した:
混合物Aは、基質およびHRP酵素の組合せである。溶液は、反応緩衝液を使用してアッセイされるべき各基質濃度に関して調製された。溶液は、最終的な基質濃度の2倍であり、HRP溶液に関しては0.2mg/mLであった。
混合物Bは、乾燥混合物である。反応緩衝液5mLに、TBHBA溶液120μLおよび4-AAP溶液400μLを添加した。
混合物Cは、酵素混合物である。反応緩衝液中でDAAOの0.1mg/mL溶液となるように調製した。最終反応濃度は、25μg/mLであった。
分光光度計は、4-AAP/TBHBAに関して最大吸光度に相当し、吸光係数が29400M-1cm-1である点である波長510nmで使用した。アッセイを実施するための温度は30℃であった。反応動態は、15分間ごとに測定することによって得られた。測定の間に、標準的な強度での20秒の軌道振とうを行い、続いて定着時間を10秒とした。
当業者に既知のアプローチを使用して、脱ラセミ化のスケールを増加させる。試薬およびそれらの相対比は、実施例5と実質的に同様であるが、量は、有意に多い。振とう機におけるチューブではなく、反応は、任意でブロスもしくはヘッドスペースの空気または酸素スパージングを含む攪拌型ジャケット付反応器中で実施する。これらの反応器は、10mL未満の反応から何万または何十万リットルまでサイズが多様である。攪拌速度は、電力消費およびせん断を最低限に抑えながら、反応混合および速度を増加するように選択される。
攪拌型ジャケット付反応器または固定化カラムは通常、幾らかの酸素移動を可能にするが、受動通気によって提供される酸素取込みの速度は、効率的なプロセスにとって十分ではない。一例では、反応は、実施例7と同じ器中で実質的に同じ条件下ではあるが、低減された(0.01VVM)状態で、容量に基づくと2倍のAC302 DAAO(1.5g/Lに対して3g/L)で、イソプロパノールを用いずに実行された。この場合、反応は、平衡に達するのに60時間を超えてかかり、効率的な反応のためには通気が極めて重要であることを実証した。
DAAOおよびTA酵素を、EziG制御孔ガラスビーズ(EnginZyme社)上に共固定した。EziG 3型ビーズ100mgを、50mlのFalconチューブにおいてpH7.5、50mMリン酸カリウム緩衝液、0.5MのNaCl、20mMイミダゾール中に精製したAC302 DAAO 16mgおよび精製したgabT 1.6mgを含有する溶液3mlとともに室温で振とうした。30分後、ビーズを遠心沈降させて、固定化用溶液を除去して、ビーズを、10mlのpH7.5、100mMリン酸カリウム緩衝液で3回洗浄した。
可溶性AC302 DAAOおよびE. coli gabT TA酵素を使用する場合、50mMを上回るリン酸緩衝液が、完全活性に必要とされる。100mLの反応液を、パラフィルムで覆った500mLのフラスコ中で、30℃で振とう(250rpm)しながらインキュベートした。最初の5時間は、空気ポンプを使用して、空気を反応物に通してバブリングした。空気ポンプは、一晩のインキュベーションに関しては取り外すため、反応は泡立たず、空気孔を有する新たなパラフィルムをガス交換用に使用した。反応混合物は、300mMのD/L-グルホシネート、905mMのL-グルタミン酸、AC302 DAAO(0.8mg/mL)80mg、gabT 14.5mg(0.145mg/mL)、カタラーゼ2mg、および消泡試薬としてイソプロパノール(初期濃度10%のイソプロパノールは、2時間後(2mL)、3時間後(1mL)、3.5時間後(1mL)、および4時間後(2mL)にさらに添加した)を含有した。500μLの1N NaOH を使用(酵素の前に添加)して、pHを約6から約7に調節した。pHは、さらに調節することなく、反応全体に関して約7のままであった。ストック酵素緩衝液中のリン酸カリウムに起因して、最終的な混合物は、45mMリン酸緩衝液であった。200mMリン酸緩衝液を用いた場合の同様の反応と比較して、反応速度は、200mM緩衝液を用いた反応の50~60%であった。
イソプロピルアミンは、適切なTAを使用したPPOの、L-グルホシネートへの変換用のアミン供与体として使用することができる。PPOは、下記構成成分を用いた反応において、L-グルホシネートに変換された:
・0.25mg/mLの配列番号1によってコードされるTA
・25mMのPPO
・0.2mMリン酸ピリドキサール
・250mMイソプロピルアミン(H3PO4を用いて8へpH調整)
・100mMのKphos緩衝液pH8.0
リジンは、適切なTAを使用したPPOの、L-グルホシネートへの変換用のアミン供与体として使用することができる。PPOは、下記構成成分を用いた反応において、L-グルホシネートに変換された:
・0.4mg/mLのgabT(実施例3のように精製される)
・25mMのPPO(NaOHを用いて8へpH調整)
・0.2mMリン酸ピリドキサール
・75mMのL-リジンジヒドロクロリド(NaOHを用いて8へpH調整)
・100mMのKphos緩衝液pH8.0
実施例9に記載する手順に従って、いくつかのバッチを調製したが、より大きなスケールで生成された。ビーズを除去した後、各バッチを少なくとも10分間90℃へ加熱して、20~25℃に冷却した後、濾過して、少量の固体を除去した。個々のバッチに、37%HClが滴下により添加され、グルタミン酸の沈殿をもたらした。添加した37%HClの量は、バッチのおよそ10%の容量であった。得られた白色固体を濾過によって除去した。バッチを合わせて、真空下で油状物質になるまで濃縮し、油状物質は、およそ153グラムのL-グルホシネートを含有していた。油状物質は、5倍容量の水で希釈され、37%HClを添加して、溶液をpH1に調節された。溶液を、それぞれが予め洗浄した各分のDOWEX 50WX8陽イオン交換樹脂がおよそ3.0kgとなるようにして、2回の処理を順次行った。各処理において、溶液を樹脂と30分間混合した後、樹脂をフィルター上で単離した。各分の両方の樹脂を合わせて、まずは水で洗浄し、続いて4M NH4OHで溶出した。溶離液を真空下で油状物質になるまで濃縮し、PPOおよび2-オキソグルタレートは、油状物質で存在しなかった。油状物質およそ100グラムを水で希釈して、pHがおよそ9になるまで、水酸化アンモニウム水を添加した。バッチに、予め洗浄したDOWEX Monosphere(水酸化物形態)陰イオン交換樹脂1.0kgを添加して、混合物をおよそ40分間攪拌した。等量の予め洗浄したDOWEX Monosphere樹脂をガラスカラムに充填した。水中のDOWEX樹脂のスラリーを、予め洗浄した樹脂の最上部でカラムに添加した。水800mLをカラムに充填した後、0.1N酢酸を充填し、全てのグルタミン酸が溶出されるまで、HPLCで測定しながらカラムに通して流し続けた。全てのL-グルホシネートがカラムから溶出されるまで、HPLCで測定しながら、4N酢酸をカラムに供給した。L-グルホシネートの溶液を真空下で濃縮した。得られた油状物質を水で希釈して、最小容量の2倍になるまで真空下で濃縮した。透明な溶液が得られるまで、メタノールを添加して、等容量のヘプタンを添加した。最小容量になるまで、混合物を真空下で濃縮し、その手順を繰り返した。陽イオン交換処理から回収した油状物質の残りの168グラムを、同様の様式で処理して、総計108グラムの粗製L-グルホシネートを得た。L-グルホシネート対グルタミン酸の比は、NMRによる測定で、99:1を超えた。得られた固体を水酸化アンモニウム水と混合して乾固するまで濃縮し、L-グルホシネートアンモニウム111グラムが得られた。メタノールも酢酸も、生成物のNMR分析によって検出されなかった。
って、この記述は、請求項の要素の列挙と関連して、「単独で」、「唯一」等のような排
他的な用語、または「否定的な」限定を使用するための前提として役割を果たすことが意
図されている。本開示を読んでいる当業者に明らかであるように、本明細書中に記載およ
び図示する個々の実施形態それぞれが、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、他
のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離され得るか、またはその特徴と組み
合わされ得る別個の構成成分および特徴を有する。任意の引用方法は、列挙される事象の
順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実行してもよい。本明細書中に記載する
ものに類似するか、または等しい任意の方法および材料もまた、本発明の実施または実験
において使用してもよいが、ここには代表的な例示的方法および材料を記載する。
<付記>
項1
L-グルホシネートを作製する方法であって、
D-グルホシネートを、D-アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)酵素と反応させて、P
PO(2-オキソ-4-(ヒドロキシ(メチル)ホスフィノイル)酪酸)を形成する工程
と、
1つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ(TA
)酵素によって、PPOをL-グルホシネートにアミノ化する工程と
を含み、D-グルホシネートの少なくとも70%が、L-グルホシネートに変換される方
法。
項2
アミン供与体が、グルタメート、L-グルタメート、アラニン、sec-ブチルアミン
、フェニルエチルアミン、グリシン、リジン、バリン、セリン、グルタミン、イソプロピ
ルアミン、エタノールアミン、2-アミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸または任意の第二
級アミンもしくはアミノ酸からなる群から選択される、項1に記載の方法。
項3
D-グルホシネートが、DおよびL-グルホシネートまたはそれらの塩のラセミ混合物
中に元々存在する、項1に記載の方法。
項4
DAAO酵素が、Rhodosporidium toruloides(UniProt P80324)、Trigonopsis varia
bilis(UniProt Q99042)、Neolentinus lepideus(KZT28066.1)、Trichoderma reesei
(XP_006968548.1)、またはTrichosporon oleaginosus(KLT40252.1)由来の酵素から選
択される、項1に記載の方法。
項5
DAAO酵素が、変異型DAAOである、項1に記載の方法。
項6
変異型DAAOが、Rhodosporidium toruloides由来の配列に基づく変異型DAAOで
ある、項5に記載の方法。
項7
変異型DAAOが、54位、56位、58位、213位、および238位で1つまたは
複数の変異を含む、項5に記載の方法。
項8
54位での変異が、N54C、N54L、N54T、およびN54Vからなる群から選
択される、項7に記載の方法。
項9
56位での変異が、T56Mである、項7に記載の方法。
項10
58位での変異が、F58A、F58G、F58H、F58K、F58N、F58Q、
F58R、F58S、およびF58Tからなる群から選択される、項7に記載の方法。
項11
213位での変異が、M213Sである、項7に記載の方法。
項12
変異型DAAOが、変異F58KおよびM213Sを含む、項5に記載の方法。
項13
変異型DAAOが、54位および56位での変異を含む、項5に記載の方法。
項14
変異型DAAOが、変異N54TおよびT56Mを含む、項5に記載の方法。
項15
変異型DAAOが、変異F58QまたはF58Hを含む、項5に記載の方法。
項16
変異型DAAOが、変異N54VおよびF58Qを含む、項5に記載の方法。
項17
変異型DAAOが、変異N54V、F58Q、およびM213Sを含む、項5に記
載の方法。
項18
TA酵素が、Escherichia coli(UniProt P22256)由来のgabTトランスアミナーゼであ
る、項1に記載の方法。
項19
TA酵素が、配列番号1によってコードされる酵素である、項1に記載の方法。
項20
反応させる工程およびアミノ化する工程が、単一容器中で実施される、項1に記載の方法。
項21
全ての試薬が、反応の開始時に実質的に添加される、項20に記載の方法。
項22
反応させる工程用の試薬およびアミノ化する工程用の試薬が、異なる時期に単一容器に
添加される、項20に記載の方法。
項23
反応させる工程およびアミノ化する工程が、別々の容器中で実施される、項1に記載の方法。
項24
D-グルホシネート、PPO、およびL-グルホシネートを含む組成物。
項25
L-グルホシネートの量が、D-グルホシネート、PPO、およびL-グルホシネート
の総量に基づいて、90%以上である、項24に記載の組成物。
項26
項25に記載の組成物を有する固体が得られる、項1に記載の方法。
項27
除草活性を有する配合物における使用のためのL-グルホシネートの溶液が得られる、
項1に記載の方法。
項28
配合物の10~30重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の10~40重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の0.5~
2重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、配合物の4~18重量%の量のジプロ
ピレングリコール、および配合物の4~20重量%の量のアルキルポリサッカライドから
なる群から選択される1つまたは複数のさらなる構成成分、ならびに
配合物の残余としての水
を含む配合物。
項29
配合物の12.25重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の31.6重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の1重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、
配合物の8.6重量%の量のジプロピレングリコール、
配合物の9.8重量%の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の36.75重量%の量の水
を含む、項28に記載の配合物。
項30
配合物の24.5重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の31.6重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の1重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、
配合物の8.6重量%の量のジプロピレングリコール、
配合物の9.8重量%の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の24.5重量%の量の水
を含む、項28に記載の配合物。
項31
配合物の12.25重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の15.8重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の0.5重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、
配合物の4.3重量%の量のジプロピレングリコール、
配合物の4.9重量%の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の62.25重量%の量の水
を含む、項28に記載の配合物。
項32
配合物の10~30重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の10~40重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、配合物の0.5~
2重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、および配合物の3~10重量%の量の
アルキルポリサッカライドからなる群から選択される1つまたは複数のさらなる構成成分
、ならびに
配合物の残余としての水
を含む配合物。
項33
配合物の12.25重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の22.1重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の1重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、
配合物の6.2重量%の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の58.45重量%の量の水
を含む、項32に記載の配合物。
項34
配合物の24.5重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の22.1重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の1重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、
配合物の6.2重量%の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の46.2重量%の量の水
を含む、項32に記載の配合物。
項35
配合物の12.25重量%の量のL-グルホシネートアンモニウム、
配合物の11.05重量%の量のアルキルエーテル硫酸ナトリウム、
配合物の0.5重量%の量の1-メトキシ-2-プロパノール、
配合物の3.1重量%の量のアルキルポリサッカライド、および
配合物の73.1重量%の量の水
を含む、項32に記載の配合物。
項36
区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
D-グルホシネートに対して90%を超える鏡像体過剰率でのL-グルホシネートを含
む有効量の組成物を区域に施用する工程
を含む方法。
項37
1ヘクタール当たりL-グルホシネートおよびD-グルホシネートの合計400グラム
未満の組成物の量が施用される、項36に記載の方法。
項38
区域において雑草を選択的に防除する方法であって、
D-グルホシネートに対して90%を超える鏡像体過剰率でのL-グルホシネートおよ
び0.01%を上回るが、10%未満であるPPOを含む有効量の組成物を区域に施用す
る工程
を含む方法。
項39
1ヘクタール当たりL-グルホシネート、D-グルホシネートおよびPPOの合計40
0グラム未満の組成物の量が施用される、項38に記載の方法。
項40
グルホシネートに対して耐性である植栽種子の1つまたは複数の作物を含有する区域に
おいて雑草を選択的に防除する方法であって、
D-グルホシネートに対して90%を超える鏡像体過剰率でのL-グルホシネートおよ
び0.01%を上回るが、10%未満であるPPOを含む有効量の組成物を圃場に施用す
る工程
を含む方法。
配列番号1:
MNIAAQSWERREATSFFHTFTDLPSLKTDGPVIIDHGEGPYIIDTVGRRYFEGNSGLWNMTLGFSERRLSDAALKQYQEFPGYHTFFGRNSKPTVELAERMLKLAPAPMSRVFFTNSGSEANESIVKLLWMMWAAEGRPERRKLLTRKNAYHGATVMASALTGKDYVKAFGLPGPEIVTLDCPHAWRFALPGEGDDEFAARLAANLETRILQEGPETIAGMFAEPVMGAGGVIVPPATYFAKIQPVLQRYGIPLIADEVICGFGRTGSLWGTLAVGQQPDIIVASKSMSAGYFPMGAVMLSADIDKRATAASEVWEEFPHGFTTGGHPVGCAISLEAIRIITEEGVFENVKSVSETFQSGLRALADHPMIGEARGMGLMGALETVADKKTKQSFSGDLRIGERISKEARDRGFIIRPLGSSVVLAPPFISTHGQIEELLAVLKEVLDVVYGTVKGEVA
MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVE
LVPTGHAMWLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSSECPPGAIGVTYDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERR
TVTSLEQAFDGADLVVNATGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGTYGV
GDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGTIEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDRTKSPLSLGRGSARAA
KEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL
配列番号3:
MNSNKELMQRRSQAIPRGVGQIHPIFADRAENCRVWDVEGREYLDFAGGIAVLNTGHLHPKVVAAVEAQLKKLSHTCFQVLAYEPYLELCEIMNQKVPGDFAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAATKRSGTIAFSGAYHGRTHYTLALTGKVNPYSAGMGLMPGHVYRALYPCPLHGISEDDAIASIHRIFKNDAAPEDIAAIVIEPVQGEGGFYASSPAFMQRLRALCDEHGIMLIADEVQSGAGRTGTLFAMEQMGVAPDLTTFAKSIAGGFPLAGVTGRAEVMDAVAPGGLGGTYAGNPIACVAALEVLKVFEQENLLQKANDLGQKLKDGLLAIAEKHPEIGDVRGLGAMIAIELFEDGDHNKPDAKLTAEIVARARDKGLILLSCGPYYNVLRILVPLTIEDAQIRQGLEIISQCFDEAKQ
Claims (10)
- L-グルホシネートを作製する方法であって、
通気しながら、D-グルホシネートを、D-アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)酵素と反応させて、PPO(2-オキソ-4-(ヒドロキシ(メチル)ホスフィノイル)酪酸)を形成する工程と、
1つまたは複数のアミン供与体由来のアミン基を使用して、トランスアミナーゼ(TA)酵素によって、PPOをL-グルホシネートにアミノ化する工程と
を含み、
D-グルホシネートの少なくとも70%が、L-グルホシネートに変換され、
ex vivoで実施され、
DAAO酵素は、3μmol/分*mgまたはそれを超える活性を有し、
DAAO酵素が、配列番号2を参照配列として用いて、54位、56位、58位、213位、および238位で1つまたは複数の変異を含む変異型DAAOであり、
54位での変異が、N54C、N54T、およびN54Vからなる群から選択され、56位での変異が、T56Mであり、58位での変異が、F58A、F58G、F58H、F58N、F58Q、F58R、F58S、およびF58Tからなる群から選択される、
方法。 - 変異が、N54V、F58Q、およびM213Sを含む、請求項1に記載の方法。
- TA酵素が、配列番号1によってコードされる酵素である、請求項1又は2に記載の方法。
- TA酵素が、配列番号3において規定されるアミノ酸配列を有するGabTトランスアミナーゼである、請求項1又は2に記載の方法。
- 反応させる工程およびアミノ化する工程が、単一容器中で実施される、請求項1又は2に記載の方法。
- 全ての試薬が、反応の開始時に実質的に添加される、請求項5に記載の方法。
- 反応させる工程用の試薬およびアミノ化する工程用の試薬が、異なる時期に単一容器に添加される、請求項5に記載の方法。
- 反応させる工程およびアミノ化する工程が、別々の容器中で実施される、請求項1又は2に記載の方法。
- アミン供与体が、グルタメートである、請求項1又は2に記載の方法。
- DAAO酵素及びTA酵素が支持体に固定化されている、請求項1に記載の方法。
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