DE3842174A1 - Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, und mikroorganismen, die dieses gen exprimieren - Google Patents

Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, und mikroorganismen, die dieses gen exprimieren

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Description

Gen und Genstruktur, codierend für eine Aminotransferase, und Mikroorganismen, die dieses Gen exprimieren.
In der deutschen Patentanmeldung P 38 18 851.1 (HOE 88/F 140) wurde bereits eine neue Aminotransferase (Transaminase) vorgeschlagen, die aus E. coli DH-1 isoliert wurde.
Es wurde nun das Gen gefunden, das für diese neue Transaminase codiert. Die Erfindung bezieht sich somit auf dieses Gen, Genstrukturen und Plasmide, die dieses Gen enthalten, sowie transformierte Mikroorganismen, die dieses Gen exprimieren können. Weitere Aspekte der Erfindung und ihre bevorzugten Ausgestaltungen ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und aus den Patentansprüchen.
Die Erfindung erlaubt es, das Enzym in größeren Mengen als nach dem früheren Vorschlag herzustellen, aber auch die spezifischen Transaminierungsreaktionen mit einem erfindungsgemäß transformierten Mikroorganismus durchzuführen. Die Isolierung und Charakterisierung des Gens erlaubt somit sehr viel effektivere Transaminierungen, als sie mit dem isolierten Enzym entsprechend dem früheren Vorschlag möglich sind.
In der deutschen Patentanmeldung P 38 18 581.1 ist das neue Enzym u. a. durch die Aminosäuresequenz des N-Terminus charakterisiert. Die ersten 30 dieser Aminosäuren sind im folgenden wiedergegeben:
Im Bereich der Aminosäuren 4 bis 10 findet sich Methionin, für das nur ein Triplett codiert, sowie vier Aminosäuren, die nur durch zwei Tripletts codiert werden. Lediglich Leucin ist im genetischen Code sechsfach "degeneriert". Diese Sequenz eignet sich somit besonders gut zur Konstruktion einer Sonde aus 20 Nucleotiden (20 mer):
Diese Sonde wurde in an sich bekannter Weise nach dem Phosphoamidit-Verfahren synthetisiert. Weiterhin wurde ein 38 mer des nicht-codierenden Stranges für die Aminosäuren 15 bis 27 synthetisiert.
Auch dieses Oligonucleotid wurde nach der Phosphoamidit-Methode synthetisiert.
Diese Sonden wurden zum "Screening" einer Cosmid-Genbank von E. coli-DH 1 eingesetzt. Hybridisierungspositive Klone wurden zunächst auf erhöhte L-PPT-Transaminase-Aktivität getestet und dann durch Restriktionskartierung näher charakterisiert. Durch Subklonierung und Aktivitätstests von Teilfragmenten gelang es, die Lages des Gens im Genom einzugrenzen und anschließend durch Exonuclease-Abbau noch weiter zu definieren. Durch Klonierung von Restriktionsfragmenten in geeignete Vektoren konnte die Transaminase-Aktivität gegenüber dem Ausgangsstamm um das etwa Fünfzigfache erhöht werden.
Die Ausbeute an Enzym bzw. Enzymaktivität läßt sich durch die Wahl geeigneter Anzuchtbedingungen noch erhöhen. So hat beispielsweise der Glucosegehalt im Medium einen wesentlichen Einfluß: Während bei Konzentrationen bis zu 0,05% die Aktivität deutlich steigt, ergibt sich bei höheren Konzentrationen ein drastischer Abfall. Auch bei Kontrollstämmen, die nur die bakterienchromosomale Kopie des Transaminase-Gens exprimieren, ist diese Abhängigkeit nachweisbar.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das Gewicht.
Beispiel 1 Klonierung des L-PPT-Transaminase-Gens aus E. coli-DH 1/ Konstruktion von Expressionsplasmiden
Chromosomale DNA aus E. coli-DH 1 wurde gemäß der in Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology: 5.3.2.-5.4.3., 5.7.1.-5.7.3. beschriebenen Methode isoliert, partiell mit Sau3A gespalten und im Agarose-Gel größenfraktioniert. DNA-Fragmente in der Größe von etwa 25-40 kb wurden in den mit BamHI geschnittenen Cosmid-Vektor pTBE [Grosveld, F. G. et al. (1982), Nucleis Acids Research 10: 6715] ligiert und in lambda-Phagen verpackt [Amersham: in vitro packaging system for Lambda DNA, Code Nr. 334Z, bzw. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: 296-299]. Nach Transfektion des Rezipientenstammes E. coli-DH 1 wurden 2000 Einzelklone isoliert, was mehreren Genomäquivalenten von E. coli entspricht. Zum Auffinden des gesuchten Gens in der angelegten Cosmid-Genbank wurden zwei zu Bereichen der N-terminalen Aminosäureresequenz des L-PPT-Transaminase-Proteins korrespondierende Oligonucleotide synthetisiert (20 mer und 38 mer, siehe Text).
Anschließend wurden die aus den Einzelklonen isolierten Cosmide (entsprechend Maniatis et al.: 331) mit Hilfe einer BRL "Dot-Blot"-Absaugapparatur an Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schüll BA85) gebunden und mit den ³²p-endmarkierten Oligonucleotiden hybridisiert (Ausubel et al.: 6.4.1.-6.4.4.). Von 4 hybridisierungspositiven Klonen zeigten 2 im L-PPT-Transaminase-Enzymtest (siehe unten, Beispiel 2) eine 3- bis 5fach erhöhte Aktivität. Beide Klone enthielten eine identische 15 kb SalI-Insertion, deren Restriktionskarte in Fig. 1 dargestellt ist.
Von diesem DNA-Abschnitt wurden ein 5,6 kb HindIII/SalI- und ein 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment, die beide mit den 5′-spezifischen Oligonucleotiden der L-PPT-Transaminase hybridisieren, in beiden Orientierungen hinter den E. coli-lac-Promoter in die Vektoren pUC12 und pMLC12/13 kloniert [Perbal, B. (1984), A Practical Guide to Molecular Cloning: 259-272] und die rekombinanten Plasmide anschließend auf Transaminase-Aktivität getestet (Fig. 1). Während die Enzymaktivitäten der Konstrukte (1) und (2) nur wenig über dem Hintergrund lagen, zeigten (3) und (4) (pTRANS2 und pTRANS3), die das gleiche DNA-Fragment in der entgegengesetzten Orientierung zum lac-Promoter wie (1) und (2) enthielten, eine etwa 50fach erhöhte L-PPT-Transaminase-Expression. Daraus ließ sich die Transkriptionsrichtung des Gens, wie in Fig. 1 dargestellt, ermitteln.
Die Lage des Transaminase-Gens auf dem 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment wurde durch weitere Restriktionskartierung, sowie durch Herstellen einer Reihe von ExoIII/S1-Deletionen [Henikoff, S. (1984), Gene 28: 351-359] genauer festgelegt. Bei letzterem Verfahren wurde das in pMLC12/13 klonierte 3,8 kb Fragment jeweils von einem Ende her für verschieden lange Zeiten enzymatisch abgedaut. Die verkürzten Insertionen wurden anschließend auf Enzymaktivität getestet. Unter der Voraussetzung, daß bei nicht mehr aktiven DNA-Fragmenten Teile des Transaminase-Strukturgens deletiert waren, ließ sich die Lage des Gens, wie in Fig. 1 unten gezeigt, feststellen.
In Fig. 2 sind drei verschiedene rekombinante Plasmide dargestellt, die das klonierte L-PPT-Transaminase-Gen aus E. coli-DH 1 tragen und in den folgenden Beispielen verwendet werden.
Das Plasmid pTRANS1 enthält das 15 kb SalI-Insert im Cosmid-Vektor pTBE und exprimiert die Transaminase unter Kontrolle des endogenen Promoters. Die beiden anderen Konstrukte sind Expressionsplasmide mit dem C. coli-lac-Promoter: pTRANS2 enthält das 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment in pMLC13, pTRANS3 das 5,6 kb HindIII/SalI-Fragment in pUC12.
Beispiel 2 L-PPT-Produktion in E. coli-DH 1 mit verschiedenen Transaminase-Expressionsplasmiden
E. coli-DH 1-Transformanten mit den rekombinierten Plasmiden pTRANS1, pTRANS2 und pTRANS3 bzw. den Vektorplasmiden pTBE, pMLC13 und pUC12 als Kontrolle wurden in 10 ml Kulturen in LB-Medium [Luria-Bertani-Medium, Maniatis et al. (1982): 68] mit 50 µg des entsprechenden Antibiotikums (Ampicillin bei pTRANS1, pTRANS3, pTBE und pUC12 bzw. Chloramphenicol bei pTRANS2 und pMLC13) für 15 h bei 37°C angezogen. Anschließend wurden die Zellen für 5 min bei 5000×g abzentrifugiert, 2mal in je 5 ml 10 mM NaCl, 10 mM NaPhosphat, (pH=7,5) gewaschen und für den Transaminase-Aktivitätstest in 1 ml "Reaktionsmix" (5 mM NaCl, 5 mM NaPhosphat, 30 g/l (3-Carboxy-oxopropyl)-methylphosphinsäure, 90 g/l L-Glutaminsäure, 100 mM Tris/HCl, pH=8,0) resuspendiert. Die Zellen wurden 1 h bei 37°C unter Schütteln in dieser Lösung inkubiert und dann für 10 min bei 95°C denaturiert. Die Reaktionsüberstände wurden im Aminosäureanalysator (Biotronic Amino Acid Analyzer LC 5001, 3,2×130 mm BTC-2710 Säule) auf gebildetes L-PPT analysiert.
Die mit den verschiedenen Konstrukten erzielten Raum-Zeit-Ausbeuten sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Die weitaus höchsten Enzymaktivitäten wurden mit den beiden lac-Expressionsplasmiden erreicht, wobei das pUC12-Derivat pTRANS3, vermutlich wegen der größeren Kopienzahl pro Zelle, noch besser abschneidet als das pMLC13-Derivat pTRANS2. Mit pTRANS3 wurden Raum-Zeit-Ausbeuten gemessen, die etwa 60fach über den Ergebnissen der mit pUC12-Vektorplasmid transformierten Kontrollzellen lagen.
L-PPT-Produktion in E. coli-DH 1 mit verschiedenen Transaminase-Expressionsplasmiden
Plasmid
Raum-Zeit-Ausbeute (mg L-PPT gebildet/l/h)
pTBE
100
pMLC13 60
pUC12 70
pTRANS1 300
pTRANS2 2400
pTRANS3 4300
Beispiel 3 Einfluß der Glucosekonzentration im Anzuchtmedium auf die L-PPT-Transaminase-Aktivität
E. coli-DH 1-pTRANS3 und E. coli-DH 1-pUC12 wurden in 10 ml LB-Medium ohne Glucose und mit steigenden Glucose-Konzentrationen (0,01%, 0,05%, 0,1% und 0,5%) wie in Beispiel 2 angezogen, aufgearbeitet und auf L-PPT-Transaminase-Aktivität getestet. Das Ergebnis zeigt die Tab. 2. Sowohl das lac-exprimierte Transaminase-Gen auf dem Plasmid pTRANS3 als auch das chromosomale Gen aus dem Kontrollstamm (mit pUC12) wurden durch Glucosekonzentrationen <0,05% reprimiert. Die maximale L-PPT-Syntheserate konnte mit 0,05% Glucose im Medium erzielt werden.
Tabelle 2
Abhängigkeit der L-PPT-Transaminase-Aktivität in E. coli- DH 1 von der Glucosekonzentration im Anzuchtmedium
Beispiel 4 Überexpression des L-PPT-Transaminase-Proteins aus E. coli-DH 1
E. coli-DH 1-pTRANS3 und E. coli-DH 1-pUC12 wurden wie in Beispiel 3 angezogen. Die gewaschenen und in 1 ml 10 mM NaCl, 10 mM NaPhosphat (pH=7,5) resuspendierten Zellen wurden durch 5×20 sec Ultrabeschallung aufgeschlossen und Aliquots gleicher Proteinmengen dieser Rohextrakte auf ein 12,5%iges SDS/Polyacrylamid-Gel aufgetragen [Laemmli, V. K. (1970), Nature 227: 680].
Im Proteinmuster der Extrakte aus E. coli-DH 1-pTRANS3 erscheint das überexprimierte L-PPT-Transaminase-Protein als zusätzliche Bande von 43 000 Dalton. Diese fehlt im Expressionsstamm in der Probe mit 0,5% Glucose im Anzuchtmedium sowie im Kontrollstamm E. coli-DH 1-pUC12 mit 0,05% Glucose.

Claims (6)

1. Gen für eine L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure (L-PPT)-spezifische Transaminase, gelegen auf einem 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment aus dem Genom von E. coli-DH 1.
2. Gen nach Anspruch 1, charakterisiert durch die Restriktionskarte gemäß Fig. 1.
3. Plasmid, enthaltend ein Gen nach Anspruch 1 oder 2.
4. Mikroorganismus, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 3.
5. E. coli, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 3.
6. Verfahren zur stereoselektiven Produktion von L-PPT aus (3-Carboxy-3-oxopropyl)-methylphosphinsäure durch Transaminierung mit Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach Anspruch 4 oder 5 eingesetzt wird.
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