JP6096802B2 - 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用 - Google Patents

発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP6096802B2
JP6096802B2 JP2014547983A JP2014547983A JP6096802B2 JP 6096802 B2 JP6096802 B2 JP 6096802B2 JP 2014547983 A JP2014547983 A JP 2014547983A JP 2014547983 A JP2014547983 A JP 2014547983A JP 6096802 B2 JP6096802 B2 JP 6096802B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
expression
cells
nucleic acid
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014547983A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2015500656A5 (ja
JP2015500656A (ja
Inventor
ピーター ミカエル ヒュエルスマン
ピーター ミカエル ヒュエルスマン
ヘンドリク クノエトゲン
ヘンドリク クノエトゲン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JP2015500656A publication Critical patent/JP2015500656A/ja
Publication of JP2015500656A5 publication Critical patent/JP2015500656A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6096802B2 publication Critical patent/JP6096802B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K16/2854—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72 against selectins, e.g. CD62
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/36—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription termination element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Description

プロモーター、ポリAシグナル配列、および転写ターミネーターのような発現ベクター要素の新規の組み合わせ、発現ベクター構成、それらの組み合わせ、ならびに新規のトランスフェクション法または選択法のような産生細胞株の生成のための新規の方法、ならびに関心対象のポリペプチドの組換え産生のためのこれらの発現ベクターおよび産生細胞株の使用が、本明細書に報告される。
発明の背景
遺伝子の転写レベルは、その発現レベルに対して強い影響を及ぼすことができ、従って、細胞の産生能を決定する。それは、主として、3種のベクター要素：プロモーター、ポリAシグナル配列、および（存在する場合）転写ターミネーターによって影響を受ける。
抗体重鎖をコードする核酸は、一般に、タンパク質の成熟によって除去されるリーダー配列（シグナル配列）（およそ57bp/19aa）、可変領域VH（およそ350bp/115aa）、および定常領域CH（およそ990bp/330aa）を含む。抗体軽鎖をコードする核酸は、一般に、タンパク質の成熟によって除去されるリーダー配列（およそ66bp/22aa）、可変領域VKまたはVL（およそ350bp/115aa）、および定常領域CKまたはCL（およそ321bp/107aa）から構成される。
真核細胞における抗体の組換え産生は、発現システムの作出を含む（McCafferty,J.,et al.,(eds.),Antibody Engineering,A Practical Approach.,IRL Press(1997)（非特許文献1）を参照のこと）。抗体発現システムの開発のためには、プロモーターおよびポリアデニル化（ポリA）領域が隣接した、軽鎖をコードする核酸を含む発現カセットが、作出される。プロモーターおよびポリA領域が隣接した、重鎖をコードする核酸を含む重鎖発現カセットも、作出される。重鎖の発現カセットは、重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットの両方を含有している単一のベクターにおいて軽鎖発現カセットと組み合わせられてもよいし、または2種の別々のベクターに組込まれてもよい。
免疫グロブリンDNAカセット分子、モノボディ（monobody）構築物、それらの産生法および使用法は、米国特許第7,053,202号（特許文献1）に報告されている。米国特許第5,168,062号（特許文献2）には、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター制御DNA配列を含有しているトランスファーベクターおよび微生物が報告されている。ヒトポリペプチド鎖伸長因子1αのためのプロモーター領域を含有しているDNA断片、その塩基配列、および高い発現能力での広範囲の宿主細胞への高い適用可能性を有する、DNA断片を含有している発現プラスミドは、米国特許第5,225,348号（特許文献3）に報告されている。米国特許第5,266,491号（特許文献4）には、SV40複製起点およびヒトポリペプチド鎖伸長因子1α遺伝子のためのプロモーター領域を有するDNA断片を含有している発現プラスミドが、報告されている。組換えDNA化合物およびtPAのようなポリペプチドの発現は、米国特許第5,122,458号（特許文献5）に報告されている。米国特許第7,422,874号（特許文献6）には、動物細胞のための発現ベクターが報告されている。
Sanna Pietro,P.は、哺乳動物細胞における抗体Fab断片および免疫グロブリン全体の発現を報告している（Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395（非特許文献2））。B型肝炎表面抗原に対するヒト抗体の可変領域の遺伝子クローニングのための細胞ディスプレイライブラリーは、Higuchi,K.らによって報告されている（J.Immunol.Meth.202(1997)193-204（非特許文献3））。Kim,D.らは、転写終結領域を操作することによって改善された哺乳動物発現システムを報告している（Biotechnol.Progress 19(2003)1620-1622（非特許文献4））。モノクローナル抗体産生のための細胞工学についてのガイドラインは、Costa,R.A.らによって報告されている（Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138（非特許文献5））。Kim,D.W.らは、多用途の効率的な発現システムとしてヒト伸長因子1αプロモーターの使用を報告している（Gene 91(1990)217-223（非特許文献6））。イントロン依存性遺伝子発現とイントロン非依存性遺伝子発現との比較は、Buchman,A.R.らによって報告されている（Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405（非特許文献7））。Wang,F.らは、哺乳動物細胞における抗体発現を報告している（Therapeutic monoclonal antibodies-From bench to clinic,Wiley(2009)pages 557-572（非特許文献8））。組換えIgG抗体の哺乳動物発現のための異なるベクター設計の比較研究は、Liらによって報告されている（J.Immunol.Meth.318(2007)113-124（非特許文献9））。Ho,S.C.L.らは、モノクローナル抗体を高発現するCHO細胞株の生成を増強するためのIRESによって媒介されるトリシストロンベクターを報告している（J.Biotechnol.157(2011)130-139（非特許文献10））。組換え動物細胞による抗CD2キメラ抗体の産生は、Hotta,A.らによって報告されている（J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303（非特許文献11））。Lee,J-C.らは、エンテロウイルス71内部リボソーム進入によって媒介される高効率タンパク質発現を報告している（Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662（非特許文献12））。WO2008/142124（特許文献7）には、Avian EBX（登録商標）細胞における組換えタンパク質産生が報告されている。
米国特許第7,053,202号 米国特許第5,168,062号 米国特許第5,225,348号 米国特許第5,266,491号 米国特許第5,122,458号 米国特許第7,422,874号 WO2008/142124
McCafferty,J.,et al.,(eds.),Antibody Engineering,A Practical Approach.,IRL Press(1997) Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395 J.Immunol.Meth.202(1997)193-204 Biotechnol.Progress 19(2003)1620-1622 Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138 Gene 91(1990)217-223 Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405 Therapeutic monoclonal antibodies-From bench to clinic,Wiley(2009)pages 557-572 J.Immunol.Meth.318(2007)113-124 J.Biotechnol.157(2011)130-139 J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303 Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662
発現ベクターの性能が、その意図された使用に大きく依存し、一過性トランスフェクション、安定プール、および単一クローン選択のための最良のベクターが異なることが見出された。
主な発見の強調：一過性トランスフェクションについては、抗体の軽鎖および重鎖の双方向発現、ならびにイントロンAを含む全長hCMVプロモーターの使用が、有利であった。しかしながら、安定トランスフェクションについては、（1）抗体軽鎖、（2）抗体重鎖、および（3）選択マーカーの一列配置が有利であることが示された。
しかし、hEF1αプロモーターは、安定プールにおいては、hCMVプロモーターより明白に優れているが、単一クローンレベルでは、明白な逆の効果が見出された。ここでは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー（hCMV）によって、最も高い産生能を有するクローンが入手された。
さらに、産生能および発現の安定性の両方を増加させる、bGHポリAシグナルおよびヒトガストリン遺伝子のターミネーター配列（hGT）と組み合わせることによって、hCMVプロモーターの性能をさらに改善することができる。
プロモーター、構造遺伝子、およびポリAシグナル配列を各々含み、任意で、ターミネーター配列を含む、抗体重鎖のための発現カセットおよび抗体軽鎖のための発現カセットを含む発現ベクターの使用は、（i）プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーター（hCMV）であり、ポリAシグナル配列がウシ成長ホルモンポリAシグナル配列（bGHポリA）であり、ターミネーター配列がヒトガストリン遺伝子転写ターミネーター配列（hGT）であるか、または（2）プロモーターがヒト伸長因子1αプロモーター（hEF1α）であり、ポリAシグナル配列がウシ成長ホルモンポリAシグナル配列（bGHポリA）であり、ターミネーター配列が存在しない場合、トランスフェクション後に、より多数の抗体産生／分泌細胞クローンをもたらすことが見出された。
上述のような発現ベクターを使用することによって、トランスフェクション後に、より多数の抗体産生／分泌細胞を入手することができ、従って、大規模組換え抗体産生のために適当な高産生細胞を同定するために必要とされる努力が、軽減される。
従って、本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、組換え哺乳動物細胞を選択する方法である：
（a）−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトし、それによって、多数の組換え哺乳動物細胞を入手する工程、ならびに
（b）多数の組換え哺乳動物細胞から（単一の）組換え哺乳動物細胞を選択する工程。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されている。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、一方向に配置されている。一つの態様において、発現カセットは、LC-HC-SMの順に配置されている。
一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。一つの態様において、哺乳動物細胞は、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、CHO細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、HEK細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体を産生する方法である：
（a）−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
を含む哺乳動物細胞を培養する工程、ならびに
（b）細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、抗体の安定産生のため、一方向に配置されている。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、抗体の一過性産生のため、双方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、一方向に配置されている。一つの態様において、発現カセットは、LC-HC-SMの順に配置されている。
一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。一つの態様において、哺乳動物細胞は、抗体の安定産生のため、CHO細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、抗体の一過性産生のため、HEK細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクターである。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されている。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、一方向に配置されている。一つの態様において、発現カセットは、LC-HC-SMの順に配置されている。
安定的な組換え抗体産生／分泌細胞株の生成のため、bGHポリAシグナル配列と組み合わせてヒト伸長因子1αプロモーター（hEF1α）を使用する時、hGTターミネーター配列の存在が、入手可能な発現収率を低下させることが見出された。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、組換え哺乳動物細胞を選択する方法である：
（a）−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトし、それによって、多数の組換え哺乳動物細胞を入手する工程、ならびに
（b）多数の組換え哺乳動物細胞から（単一の）組換え哺乳動物細胞を選択する工程。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されている。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、一方向に配置されている。一つの態様において、発現カセットは、LC-HC-SMの順に配置されている。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、イントロンAを含む。
一つの態様において、発現ベクターは、転写ターミネーター配列を含まない。一つの態様において、ターミネーター配列は、hGT配列である。
一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。一つの態様において、哺乳動物細胞は、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、CHO細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、HEK細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体を産生する方法である：
（a）−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む哺乳動物細胞を培養する工程、ならびに
（b）細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されている。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、一方向に配置されている。一つの態様において、発現カセットは、LC-HC-SMの順に配置されている。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、イントロンAを含む。
一つの態様において、発現ベクターは、転写ターミネーター配列を含まない。一つの態様において、ターミネーター配列は、hGT配列である。
一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。一つの態様において、哺乳動物細胞は、抗体の安定産生のため、CHO細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、抗体の一過性産生のため、HEK細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクターである。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されている。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、一方向に配置されている。一つの態様において、発現カセットは、LC-HC-SMの順に配置されている。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、イントロンAを含む。
一つの態様において、発現ベクターは、転写ターミネーター配列を含まない。一つの態様において、ターミネーター配列は、hGT配列である。
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、3種の発現カセットが、一方向に、第一の発現カセット-第二の発現カセット-第三の発現カセットの順に構成されている発現ベクターの、抗体の安定的な組換え産生のための使用が、安定トランスフェクトされた組換え哺乳動物細胞における改善された発現収率をもたらすことが見出された。
上記とは対照的に、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、発現カセットが双方向に構成され、第一の発現カセットと第二の発現カセットとが逆方向に配置されている発現ベクターの、抗体の一過性の組換え産生のための使用は、一過性トランスフェクトされた組換え哺乳動物細胞における改善された発現収率をもたらすことが見出された。
逆方向に、という用語は、一方の発現カセットが5'→3'方向に転写され、一方の発現カセットが3'→5'方向に転写されることを意味する。
従って、本明細書に報告される一つの局面は、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、3種の発現カセットが、一方向に、第一の発現カセット-第二の発現カセット-第三の発現カセットの順に構成されている発現ベクターの、哺乳動物細胞における抗体の安定的な組換え産生のための使用である。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列は存在しhGTターミネーター配列である。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットは転写ターミネーター配列を含まない。
一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、3種の発現カセットが、一方向に、第一の発現カセット-第二の発現カセット-第三の発現カセットの順に構成されている発現ベクターである。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列は存在しhGTターミネーター配列である。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットは転写ターミネーター配列を含まない。
本明細書に報告される一つの局面は、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、発現カセットが双方向に構成され、第一の発現カセットと第二の発現カセットとが逆方向に配置されている発現ベクターの、哺乳動物細胞における抗体の一過性の組換え産生のための使用である。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列は存在しhGTターミネーター配列である。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットは転写ターミネーター配列を含まない。
一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。一つの態様において、哺乳動物細胞は、HEK細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、発現カセットが双方向に構成され、第一の発現カセットと第二の発現カセットとが逆方向に配置されている発現ベクターである。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列は存在しhGTターミネーター配列である。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターはhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列はbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットは転写ターミネーター配列を含まない。
さらに、イントロンAを含まない短いヒトCMVプロモーターの代わりに、イントロンAを含むhCMVプロモーターおよびヒトEf1αプロモーターを含む発現ベクターが、一過性遺伝子発現およびプール遺伝子発現を増強することが、とりわけ、見出された。
本明細書に報告される一つの局面は、発現カセットの一方または両方がポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列をさらに含んでいる、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、および第一のポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、および第二のポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む発現プラスミドである。
一つの態様において、第一および第二のポリAシグナル配列は、SV40ポリAシグナル配列およびウシ成長ホルモンポリAシグナル配列から相互に独立に選択される。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターは、ヒトCMVプロモーター、SV40プロモーター、およびヒト伸長因子1αプロモーターから相互に独立に選択される。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。一つの態様において、発現カセットおよび選択マーカーは、双方向に配置されている。
本明細書に報告される一つの局面は、抗体の一過性発現または抗体の安定発現のための、本明細書に報告される発現プラスミドの使用である。
本明細書に報告される一つの局面は、本明細書に報告される発現プラスミドを含む真核細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、
−本明細書に報告される発現プラスミドを含む真核細胞または本明細書に報告される細胞を培養する工程、
−真核細胞または培養培地から抗体を回収する工程
を含む、抗体の産生の方法である。
一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。一つの態様において、哺乳動物の細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。
本明細書に報告される一つの局面は、第一および／または第二のプロモーターがヒト伸長因子1αプロモーターである、
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、および第一のポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、および第二のポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む発現プラスミドである。
一つの態様において、発現カセットの一方または両方は、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列をさらに含まない。
一つの態様において、発現カセットの一方または両方は、ヒトガストリンターミネーター配列を含まない。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターはイントロンAを含む。
一つの態様において、第一および第二のポリAシグナル配列は、SV40ポリAシグナル配列およびウシ成長ホルモンポリAシグナル配列から相互に独立に選択される。
一つの態様において、第一および第二のプロモーターは、ヒトCMVプロモーター、SV40プロモーター、およびヒト伸長因子1αプロモーターから相互に独立に選択される。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。
一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットは、一方向に配置されている。
一つの態様において、発現プラスミドは、選択マーカーをさらに含む。
一つの態様において、第一の発現カセットおよび選択マーカーは、双方向に配置されている。
本明細書に報告される一つの局面は、抗体の一過性発現または抗体の安定発現のための、本明細書に報告される発現プラスミドの使用である。
本明細書に報告される一つの局面は、本明細書に報告される発現プラスミドを含む真核細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、
−本明細書に報告される発現プラスミドを含む真核細胞または本明細書に報告される細胞を培養する工程、
−真核細胞または培養培地から抗体を回収する工程
を含む、抗体の産生の方法である。
一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。一つの態様において、哺乳動物の細胞は、CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択される。
本明細書に報告される一つの局面は、5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体重鎖または抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、選択マーカーをコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEMCV-IRES要素である発現プラスミドである。
一つの態様において、核酸は抗体重鎖をコードする。
一つの態様において、選択マーカーは、式A-C-S［Aは検出可能ポリペプチドであり、Cは真核生物シグナル配列であり、Sは選択可能マーカーである］の融合タンパク質である。
一つの態様において、タンパク質分解シグナル配列は、オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列である。
一つの態様において、検出可能ポリペプチドは緑色蛍光タンパク質である。
一つの態様において、選択可能マーカーはネオマイシンである。
本明細書に報告される一つの局面は、N末端からC末端への方向に、緑色蛍光タンパク質、オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列、およびネオマイシンを含むポリペプチドをコードする核酸である。
本明細書に報告される一つの局面は、N末端からC末端への方向に、緑色蛍光タンパク質、オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列、およびネオマイシンを含むポリペプチドをコードする核酸の、抗体分泌細胞の選択のための使用である。
本明細書に報告される一つの局面は、5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体重鎖または抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、選択マーカーをコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEMCV-IRES要素である発現カセットの、抗体産生細胞の選択のための使用である。
一つの態様において、核酸は抗体重鎖をコードする。
一つの態様において、選択マーカーは、式A-C-S［Aは検出可能ポリペプチドであり、Cは真核生物シグナル配列であり、Sは選択可能マーカーである］の融合タンパク質である。
一つの態様において、タンパク質分解シグナル配列は、オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列である。
一つの態様において、検出可能ポリペプチドは緑色蛍光タンパク質である。
一つの態様において、選択可能マーカーはネオマイシンである。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体を発現する真核細胞の選択の方法である：
−（i）この局面において報告される発現プラスミドと、（ii）この局面において報告される発現プラスミドによってコードされないそれぞれの他の抗体鎖をコードする核酸とを含む真核細胞を培養する工程、
−検出可能ポリペプチドを発現する細胞を選択する工程。
本明細書に報告される一つの局面は、5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、抗体重鎖をコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEV71-IRES要素である発現プラスミドである。
一つの態様において、プロモーター配列は、イントロンAを含むかまたは含まないヒトCMVプロモーター配列、SV40プロモーター配列、およびイントロンAを含むかまたは含まないヒト伸長因子1αプロモーター配列から選択される。
一つの態様において、ポリAシグナル配列は、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびSV40ポリAシグナル配列から選択される。
一つの態様において、プラスミドは、ポリAシグナル配列の3'にヒトガストリンターミネーター配列を含む。
本明細書に報告される一つの局面は、5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、抗体重鎖をコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEV71-IRES要素である発現プラスミドの、抗体の発現のための使用である。
一つの態様において、プロモーター配列は、イントロンAを含むかまたは含まないヒトCMVプロモーター配列、SV40プロモーター配列、およびイントロンAを含むかまたは含まないヒト伸長因子1αプロモーター配列から選択される。
一つの態様において、ポリAシグナル配列は、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびSV40ポリAシグナル配列から選択される。
一つの態様において、プラスミドは、ポリAシグナル配列の3'にヒトガストリンターミネーター配列を含む。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体の産生の方法である：
−本明細書に報告される発現プラスミドを含む真核細胞を培養する工程、
−細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって、抗体を産生する工程。
一つの態様において、hCMVプロモーターは、SEQ ID NO:01の配列を有する。これは、イントロンAを含まず5'UTRを含まないhCMVプロモーターである。
一つの態様において、hCMVプロモーターは、SEQ ID NO:02の配列を有する。これは、イントロンAを含まず5'UTRを含むhCMVプロモーターである。
一つの態様において、hCMVプロモーターは、SEQ ID NO:03の配列を有する。これは、イントロンAを含む全長hCMVプロモーターである。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、SEQ ID NO:04の配列を有する。これは、イントロンAを含まないhEF1αプロモーターである。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、SEQ ID NO:05の配列を有する。これは、イントロンAを含むhEF1αプロモーターである。
一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、SEQ ID NO:06の配列を有する。これは、イントロンAを含み5'UTRを含む短いhEF1αプロモーターである。
一つの態様において、ラットCMVプロモーターは、SEQ ID NO:07の配列を有する。
一つの態様において、SV40ポリAシグナル配列は、SEQ ID NO:08の配列を有する。
一つの態様において、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列は、配列SEQ ID NO:09を有する。
一つの態様において、ヒトガストリンターミネーターは、SEQ ID NO:10の配列を有する。
一つの態様において、SV40プロモーターは、SEQ ID NO:11の配列を有する。
一つの態様において、オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列は、SEQ ID NO:12の配列によってコードされる。
一つの態様において、GFP配列は、SEQ ID NO:13の配列によってコードされる。
一つの態様において、ネオマイシン選択マーカーは、SEQ ID NO:14の配列を有する。
一つの態様において、GFP-PEST-NEO融合ポリペプチドは、SEQ ID NO:15の配列によってコードされる。
一つの態様において、EMCV-IRESは、SEQ ID NO:16の配列を有する。
一つの態様において、EV71-IRESは、SEQ ID NO:17の配列を有する。
本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、抗体は二特異性抗体である。
一つの態様において、二特異性抗体は、第一の抗原または抗原上の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合特異性または結合部位を有し、かつ第二の抗原または抗原上の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合特異性または結合部位を有する。
一つの態様において、発現ベクターは、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第四の発現カセット
または
−5'から3'への方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、ここで、抗体軽鎖が両方の抗体重鎖に共通の軽鎖である、第一の発現カセット
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
のいずれかを含む。
本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、発現ベクターは、
−抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、抗体重鎖発現カセットの少なくとも一方、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、
一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されているか、または5'から3'へ、抗体軽鎖発現カセット、抗体重鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている。
本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、発現ベクターは、
−第一の抗体軽鎖発現カセット、
−第二の抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、抗体重鎖発現カセットの少なくとも一方、抗体軽鎖発現カセットの少なくとも一方、および選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、
一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されているか、または5'から3'へ、抗体軽鎖発現カセット、抗体重鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている。
一つの態様において、抗体重鎖発現カセットの一方は、ホール変異を含む抗体重鎖をコードする。
一つの態様において、抗体重鎖発現カセットの一方は、ノブ変異を含む抗体重鎖をコードする。
一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットの一方は、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体軽鎖をコードし、かつ／または抗体軽鎖発現カセットの一方は、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体軽鎖CLドメインを含む抗体軽鎖をコードする。
一つの態様において、抗体重鎖発現カセットの一方は、第一定常ドメインとして抗体軽鎖定常ドメイン（CL）を含む抗体重鎖をコードし、かつ／または抗体重鎖発現カセットの一方は、第一定常ドメインとして抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体重鎖をコードする。
[本発明1001]
以下の工程を含む、組換え哺乳動物細胞を選択する方法：
（a）−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトし、かつそれによって、多数の組換え哺乳動物細胞を入手する工程、ならびに
（b）多数の組換え哺乳動物細胞から（単一の）組換え哺乳動物細胞を選択する工程。
[本発明1002]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1001または1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されていることを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
発現プラスミドが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1001〜1004および1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
発現カセットがLC-HC-SMの順に配置されていることを特徴とする、本発明1001〜1004および1006〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
哺乳動物細胞が、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、CHO細胞であることを特徴とする、本発明1001〜1004および1006〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
哺乳動物細胞が、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、HEK細胞であることを特徴とする、本発明1001〜1003および1005〜1008のいずれかの方法。
[本発明1012]
以下の工程を含む、抗体を産生する方法：
（a）−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
を含む哺乳動物細胞を培養する工程、ならびに
（b）細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
[本発明1013]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1012の方法。
[本発明1014]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1012〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、抗体の安定的な産生のため、一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1012〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、抗体の一過性の産生のため、双方向に配置されていることを特徴とする、本発明1012〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
発現プラスミドが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、本発明1012〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1012〜1015および1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
発現カセットがLC-HC-SMの順に配置されていることを特徴とする、本発明1012〜1015および1017〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、本発明1012〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
哺乳動物細胞が、抗体の安定産生のため、CHO細胞であることを特徴とする、本発明1012〜1015および1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
哺乳動物細胞が、抗体の一過性産生のため、HEK細胞であることを特徴とする、本発明1012〜1014および1016〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクター。
[本発明1024]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1023の発現ベクター。
[本発明1025]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1023〜1024のいずれかの発現ベクター。
[本発明1026]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1023〜1025のいずれかの発現ベクター。
[本発明1027]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されていることを特徴とする、本発明1023〜1025のいずれかの発現ベクター。
[本発明1028]
発現プラスミドが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、本発明1023〜1027のいずれかの発現ベクター。
[本発明1029]
発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1023〜1026および1028のいずれかの発現ベクター。
[本発明1030]
発現カセットがLC-HC-SMの順に配置されていることを特徴とする、本発明1023〜1026および1028〜1029のいずれかの発現ベクター。
[本発明1031]
以下の工程を含む、組換え哺乳動物細胞を選択する方法：
（a）−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトし、かつそれによって、多数の組換え哺乳動物細胞を入手する工程、ならびに
（b）多数の組換え哺乳動物細胞から（単一の）組換え哺乳動物細胞を選択する工程。
[本発明1032]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1031の方法。
[本発明1033]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1031〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1031〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されていることを特徴とする、本発明1031〜1033のいずれかの方法。
[本発明1036]
発現プラスミドが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、本発明1031〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1031〜1034および1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
発現カセットがLC-HC-SMの順に配置されていることを特徴とする、本発明1031〜1034および1036〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
ヒト伸長因子1αプロモーターがイントロンAを含むことを特徴とする、本発明1031〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
発現ベクターが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1031〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
ターミネーター配列がhGT配列であることを特徴とする、本発明1040の方法。
[本発明1042]
哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、本発明1031〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
哺乳動物細胞が、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、CHO細胞であることを特徴とする、本発明1042の方法。
[本発明1044]
哺乳動物細胞が、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、HEK細胞であることを特徴とする、本発明1042の方法。
[本発明1045]
以下の工程を含む、抗体を産生する方法：
（a）−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む哺乳動物細胞を培養する工程、ならびに
（b）細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
[本発明1046]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1045の方法。
[本発明1047]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1045〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されていることを特徴とする、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
発現プラスミドが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、本発明1045〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1045〜1048および1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
発現カセットがLC-HC-SMの順に配置されていることを特徴とする、本発明1045〜1048および1050〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
ヒト伸長因子1αプロモーターがイントロンAを含むことを特徴とする、本発明1045〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
発現ベクターが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1045〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
ターミネーター配列がhGT配列であることを特徴とする、本発明1054の方法。
[本発明1056]
哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、本発明1045〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
哺乳動物細胞が、抗体の安定産生のため、CHO細胞であることを特徴とする、本発明1056の方法。
[本発明1058]
哺乳動物細胞が、抗体の一過性産生のため、HEK細胞であることを特徴とする、本発明1056の方法。
[本発明1059]
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第一の発現カセット、ならびに
−5'から3'への方向に、hEF1αプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、およびbGHポリAシグナル配列を含む第二の発現カセット
を含む発現ベクター。
[本発明1060]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1059の発現ベクター。
[本発明1061]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1059〜1060のいずれかの発現ベクター。
[本発明1062]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、安定トランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1059〜1061のいずれかの発現ベクター。
[本発明1063]
第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、一過性トランスフェクトされた細胞の選択のため、双方向に配置されていることを特徴とする、本発明1059〜1061のいずれかの発現ベクター。
[本発明1064]
発現プラスミドが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、本発明1059〜1064のいずれかの発現ベクター。
[本発明1065]
発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、本発明1059〜1062および1064のいずれかの発現ベクター。
[本発明1066]
発現カセットがLC-HC-SMの順に配置されていることを特徴とする、本発明1059〜1062および1064〜1065のいずれかの発現ベクター。
[本発明1067]
ヒト伸長因子1αプロモーターがイントロンAを含むことを特徴とする、本発明1059〜1066のいずれかの発現ベクター。
[本発明1068]
発現ベクターが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1059〜1067のいずれかの発現ベクター。
[本発明1069]
ターミネーター配列がhGT配列であることを特徴とする、本発明1068の発現ベクター。
[本発明1070]
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、3種の発現カセットが、一方向に、第一の発現カセット-第二の発現カセット-第三の発現カセットの順に構成されている発現ベクターの、哺乳動物細胞における抗体の安定的な組換え産生のための使用。
[本発明1071]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1070の使用。
[本発明1072]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1070〜1071のいずれかの使用。
[本発明1073]
第一および第二のプロモーターがhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列が存在しかつhGTターミネーター配列であることを特徴とする、本発明1070〜1072のいずれかの使用。
[本発明1074]
第一および第二のプロモーターがhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1070〜1072のいずれかの使用。
[本発明1075]
哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、本発明1070〜1074のいずれかの使用。
[本発明1076]
哺乳動物細胞がCHO細胞であることを特徴とする、本発明1070〜1075のいずれかの使用。
[本発明1077]
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、3種の発現カセットが、一方向に、第一の発現カセット-第二の発現カセット-第三の発現カセットの順に構成されている発現ベクター。
[本発明1078]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1077の発現ベクター。
[本発明1079]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1077〜1078のいずれかの発現ベクター。
[本発明1080]
第一および第二のプロモーターがhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列が存在しかつhGTターミネーター配列であることを特徴とする、本発明1077〜1079のいずれかの発現ベクター。
[本発明1081]
第一および第二のプロモーターがhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1077〜1079のいずれかの発現ベクター。
[本発明1082]
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、発現カセットが双方向に構成され、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが逆方向に配置されている発現ベクターの、哺乳動物細胞における抗体の一過性の組換え産生のための使用。
[本発明1083]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1082の使用。
[本発明1084]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1082〜1083のいずれかの使用。
[本発明1085]
第一および第二のプロモーターがhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列が存在しかつhGTターミネーター配列であることを特徴とする、本発明1082〜1084のいずれかの使用。
[本発明1086]
第一および第二のプロモーターがhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1082〜1084のいずれかの使用。
[本発明1087]
哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、本発明1082〜1086のいずれかの使用。
[本発明1088]
哺乳動物細胞がHEK細胞であることを特徴とする、本発明1082〜1087のいずれかの使用。
[本発明1089]
−5'から3'への方向に、第一のプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、第一のポリAシグナル配列を含み、任意で、第一の転写ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、第二のプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、第二のポリAシグナル配列を含み、任意で、第二の転写ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、第三のプロモーター、選択剤に対する耐性を付与する核酸、第三のポリAシグナル配列を含み、任意で、第三の転写ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
を含み、発現カセットが双方向に構成され、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが逆方向に配置されている発現ベクター。
[本発明1090]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1089の発現ベクター。
[本発明1091]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、本発明1089〜1090のいずれかの発現ベクター。
[本発明1092]
第一および第二のプロモーターがhCMVプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ転写終結配列が存在しかつhGTターミネーター配列であることを特徴とする、本発明1089〜1091のいずれかの発現ベクター。
[本発明1093]
第一および第二のプロモーターがhEF1αプロモーターであり、第一および第二のポリAシグナル配列がbGHポリAシグナル配列であり、かつ発現カセットが転写ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1089〜1091のいずれかの発現ベクター。
[本発明1094]
5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体重鎖または抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、選択マーカーをコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEMCV-IRES要素である発現プラスミド。
[本発明1095]
5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体重鎖または抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、選択マーカーをコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEMCV-IRES要素である発現カセットの、抗体産生細胞の選択のための使用。
[本発明1096]
以下の工程を含む、抗体を発現する真核細胞の選択の方法：
−（i）本発明1094の発現プラスミドと（ii）本発明1094の発現プラスミドによってコードされないそれぞれの他の抗体鎖をコードする核酸とを含む真核細胞を培養する工程、
−検出可能なポリペプチドを発現する細胞を選択する工程。
[本発明1097]
5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、抗体重鎖をコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEV71-IRES要素である発現プラスミド。
[本発明1098]
5'から3'への方向に、プロモーター配列、抗体軽鎖をコードする核酸、IRES要素、抗体重鎖をコードする核酸配列、およびポリAシグナル配列を含み、IRES要素がEV71-IRES要素である発現プラスミドの、抗体の発現のための使用。
[本発明1099]
以下の工程を含む、抗体を発現する真核細胞の選択の方法：
−（i）本発明1097の発現プラスミドと（ii）本発明1097の発現プラスミドによってコードされないそれぞれの他の抗体鎖をコードする核酸とを含む真核細胞を培養する工程、
−検出可能なポリペプチドを発現する細胞を選択する工程。
[本発明1100]
発現ベクターが、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第四の発現カセット
または
−5'から3'への方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセットであって、ここで抗体軽鎖が両方の抗体重鎖に共通の軽鎖である、第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
のいずれかを含むことを特徴とする、本発明1001〜1099のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1101]
発現ベクターが二特異性抗体をコードすることを特徴とする、本発明1001〜1100のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1102]
二特異性抗体が、第一の抗原または抗原上の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合特異性または結合部位を有し、かつ第二の抗原または抗原上の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合特異性または結合部位を有することを特徴とする、本発明1100〜1101のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1103]
発現ベクターが、
−抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含むことを特徴とする、本発明1100〜1102のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1104]
発現ベクターが、
−第一の抗体軽鎖発現カセット、
−第二の抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含むことを特徴とする、本発明1100〜1103のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1105]
抗体重鎖発現カセットの一方が、ホール変異を含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、本発明1100〜1104のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1106]
抗体重鎖発現カセットの一方が、ノブ変異を含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、本発明1100〜1105のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1107]
抗体軽鎖発現カセットの一方が、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体軽鎖バリアントをコードし、かつ／または抗体軽鎖発現カセットの一方が、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体軽鎖CLドメインを含む抗体軽鎖をコードすることを特徴とする、本発明1100〜1106のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
[本発明1108]
抗体重鎖発現カセットの一方が、第一定常ドメインとして抗体軽鎖定常ドメイン（CL）を含む抗体重鎖バリアントをコードし、かつ／または抗体重鎖発現カセットの一方が、第一定常ドメインとして抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、本発明1100〜1107のいずれかの発現プラスミドまたは使用または方法。
発明の詳細な説明
I. 一般的な局面
当業者に公知であるように、組換えDNAテクノロジーの使用は、核酸および／またはポリペプチドの多数の誘導体の産生を可能にする。そのような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失、または挿入によって1個または数個の位置において改変されていてよい。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって実施され得る。そのような改変は、当業者によって容易に実施され得る（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999)を参照のこと）。組換えテクノロジーの使用によって、当業者は、様々な宿主細胞を異種核酸によって形質転換することが可能となる。異なる細胞の転写および翻訳、即ち、発現の機構は、同一の要素を使用するが、異なる種に属する細胞は、とりわけ、異なるいわゆるコドン使用頻度を有する場合がある。それによって、（アミノ酸配列に関して）同一のポリペプチドが、異なる核酸によってコードされ得る。また、遺伝暗号の縮重によって、異なる核酸が同一のポリペプチドをコードし得る。
組換えDNAテクノロジーの使用は、核酸および／またはポリペプチドの多数の誘導体の産生を可能にする。そのような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失、または挿入によって1個または数個の位置において改変されていてよい。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって実施され得る。そのような改変は、当業者によって容易に実施され得る（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999)；Hames,B.D.and Higgins,S.J.,Nucleic acid hybridization-a practical approach,IRL Press,Oxford,England(1985)を参照のこと）。
組換えテクノロジーの使用によって、様々な宿主細胞の異種核酸による形質転換が可能となる。異なる細胞の転写および翻訳、即ち、発現の機構は、同一の要素を使用するが、異なる種に属する細胞は、とりわけ、異なるいわゆるコドン使用頻度を有する場合がある。それによって、（アミノ酸配列に関して）同一のポリペプチドが、異なる核酸によってコードされ得る。また、遺伝暗号の縮重によって、異なる核酸が同一のポリペプチドをコードし得る。
定義
「親和性成熟」抗体とは、そのような変更を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、1個以上の超可変領域（HVR）における1個以上の変更を有する抗体をさす。
「抗体」という用語は、本明細書において、最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、完全抗体が結合する抗原に結合する完全抗体の一部分を含む、完全抗体以外の分子をさす。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ（diabodies）；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の起源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる起源または種に由来する抗体をさす。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有している定常ドメインまたは定常領域の型をさす。抗体の五つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2へさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞内で起こる転写および／または翻訳の過程をさす。細胞における関心対象の核酸配列の転写のレベルは、細胞に存在する対応するmRNAの量に基づき決定され得る。例えば、関心対象の配列から転写されたmRNAを、RT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化することができる（Sambrook et al.,1999（前記）を参照のこと）。関心対象の核酸によってコードされたポリペプチドは、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることによって、またはポリペプチドを認識し結合する免疫グロブリンを使用したウエスタンブロットもしくはラジオイムノアッセイのような、そのような活性に依存しないアッセイを利用することによって定量化され得る（Sambrook et al.,1999（前記）を参照のこと）。
「発現カセット」とは、少なくとも細胞に含有されている核酸の発現のために必要な、プロモーターおよびポリアデニル化部位のような制御要素を含有している構築物をさす。
「発現ベクター」とは、宿主細胞に含まれる構造遺伝子の発現のために必要とされる全ての要素を提供する核酸である。典型的には、発現プラスミドは、複製起点を含む原核生物プラスミド繁殖単位、例えば、大腸菌（E.coli）のもの、ならびに選択可能マーカー、真核生物選択マーカー、ならびにプロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナル（ポリAシグナル配列）を各々含む関心対象の構造遺伝子の発現のための1個以上の発現カセットを含む。遺伝子発現は、一般的には、プロモーターの調節下に置かれ、そのような構造遺伝子はプロモーターに「機能的に連結」されていると言われる。同様に、制御要素がコアプロモーターの活性をモジュレートする場合、それらの制御要素およびコアプロモーターは機能的に連結されている。
「Fc領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部分を含有している免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。その用語には、ネイティブ配列Fc領域およびバリアントFc領域が含まれる。一つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は、存在してもよいしまたは存在しなくてもよい。本明細書中に他に特記されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242に記載されているような、EUインデックスと呼ばれるEU番号付けシステムに従う。
「Fc領域」とは、周知の用語であり、抗体重鎖のパパイン切断に基づき定義される。本明細書に報告される複合体は、一つの態様において、抗体重鎖ヒンジ領域ポリペプチドとして、ヒトFc領域またはヒト起源に由来するFc領域を含み得る。さらなる態様において、Fc領域は、サブクラスIgG4のヒト抗体のFc領域、またはFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa)結合および／もしくはC1q結合が検出され得ないよう改変されたサブクラスIgG1、IgG2、もしくはIgG3のヒト抗体のFc領域のいずれかである。一つの態様において、Fc領域は、ヒトFc領域であり、特に、ヒトIgG4サブクラスに由来するか、またはヒトIgG1サブクラスに由来する変異型Fc領域のいずれかである。一つの態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスに由来する。IgG4は、低下したFcγ受容体（FcγRIIIa）結合を示し、その他のIgGサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭水化物の欠損）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、または／およびHis435は、変更された場合、低下したFcγ受容体結合を提供する残基である（Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,et al.,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434）。一つの態様において、本明細書に報告される局面において、発現される抗体は、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのものであるか、またはL234、L235、および／もしくはD265に変異を有するIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有する。一つの態様において、変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および／またはPVA236（PVA236とは、IgG1のアミノ酸位置233〜236からのアミノ酸配列ELLG（1文字アミノ酸コードで与えられる）もしくはIgG4のEFLGが、PVAに置換されていることを意味する）である。一つの態様において、変異は、IgG4のS228P、ならびにIgG1のL234AおよびL235Aである。抗体のFc領域は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）およびCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。Fcγ受容体および／または補体因子C1qに結合しない複合体は、抗体依存細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発しない。ノブ改変とは、抗体のCH3ドメインにおける変異T366Wを意味する（Kabatによる番号付け）。ホール改変とは、抗体のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、およびY407Vを意味する。ノブ改変およびホール改変に加えて、一方のCH3ドメインに変異S354Cが存在し、かつ他方のCH3ドメインに変異Y349Cが存在してもよい。
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基をさす。可変ドメインのFRは、一般に、4個のFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、VH（またはVL）において、HVRおよびFRの配列は、一般に、以下の順に現われる：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
「全長抗体」、「完全抗体」、および「抗体全体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似している構造を有するか、または本明細書において定義されるFc領域を含有している重鎖を有する抗体をさすため、本明細書において交換可能に使用される。
「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現に影響することができるセグメント、例えば、染色体上またはプラスミド上のセグメントである核酸を意味する。コード領域、即ち、構造遺伝子に加えて、遺伝子は、その他の機能要素、例えば、シグナル配列、プロモーター、イントロン、および／またはターミネーターを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性の核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）をさす。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、それらには、初代形質転換細胞、および継代回数に関わらないそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたかまたは選択されたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のものに相当するアミノ酸配列を保有するものである。非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は、ヒト抗体のこの定義から特に除外される。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基とヒトFRに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体をさす。ある種の態様において、ヒト化抗体は、HVR（例えば、CDR)の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに相当し、FRの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに相当する、少なくとも1個、典型的には、2個の可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体をさす。
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書において使用されるように、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々をさす。一般に、ネイティブの4本鎖抗体は、6個のHVR；VH内の3個（H1、H2、H3）およびVL内の3個（L1、L2、L3)を含む。HVRは、一般に、最も高い配列可変性を有しかつ／または抗原認識に関与している、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（CDR)に由来するアミノ酸残基を含む。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する（Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917）。例示的なCDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3）は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、およびH3の95〜102に存在する（Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242）。VH内のCDR1を例外として、CDRは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮型（abbreviated）CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDRの領域に含有されている。例示的なa-CDR（a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3）は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に存在する（Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633）。他に示されない限り、可変ドメイン内のHVR残基およびその他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書において、Kabat et al.（前記）に従い、番号付けされる。
「内部リボソーム進入部位」または「IRES」とは、IRESの5'の遺伝子とは無関係の翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において単一の転写物から2個のシストロン（オープンリーディングフレーム）が翻訳されることを可能にする配列を表す。IRESは、その直ぐ下流（下流とは3'と交換可能に本明細書において使用される）のオープンリーディングフレームの翻訳のための独立のリボソーム進入部位を提供する。多シストロン性であり得る、即ち、mRNAから逐次的に翻訳される数種の異なるポリペプチドをコードし得る細菌mRNAと異なり、動物細胞の大部分のmRNAは、単シストロン性であり、1種のタンパク質の合成のみをコードする。真核細胞における多シストロン性転写物では、翻訳が、最も5'の翻訳開始部位から開始し、最初の終止コドンで終結し、転写物がリボソームから放出され、mRNA内に最初にコードされたポリペプチドの翻訳のみがもたらされるであろう。真核細胞において、転写物内の第二のまたはそれ以降のオープンリーディングフレームに機能的に連結されたIRESを有する多シストロン性転写物は、同一の転写物によってコードされた2種以上のポリペプチドを産生するため、下流のオープンリーディングフレームの逐次的な翻訳を可能にする。ベクター構築におけるIRES要素の使用は、以前に記載されており、例えば、Pelletier,J.,et al.,Nature 334(1988)320-325；Jang,S.K.,et al.,J.Virol.63(1989)1651-1660；Davies,M.V.,et al.,J.Virol.66(1992)1924-1932；Adam,M.A.,et al.,J.Virol.65(1991)4985-4990；Morgan,R.A.,et al.Nucl.Acids Res.20(1992)1293-1299；Sugimoto,Y,et al.,Biotechnology 12(1994)694-698；Ramesh,N.,et al.,Nucl.Acids Res.24(1996)2697-2700；およびMosser,D.D.,et al.,BioTechniques 22(1997)150-152)を参照のこと。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、実質的に均質の抗体の集団から入手される抗体をさし、即ち、例えば、天然に存在する変異を含有しているか、またはモノクローナル抗体調製物の産生の間に発生する、可能性のあるバリアント抗体（そのようなバリアントは一般に微量に存在する）を除き、集団を構成する個々の抗体が、同一でありかつ／または同一のエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質の集団から入手されるような抗体の形質を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しているトランスジェニック動物を利用する方法、ならびに本明細書に記載されるモノクローナル抗体を作成するためのそのような方法およびその他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない、多様な技術によって作成され得る。
「ネイティブ抗体」とは、変動する構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子をさす。例えば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合した2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖から構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）を有し、続いて、3個の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）を有する。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）を有し、続いて、定常軽鎖（CL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの型のうちの一つに割り当てられ得る。
「核酸」とは、本明細書において使用されるように、個々の（塩基とも呼ばれる）ヌクレオチドa、c、g、およびt（またはRNAにおいてはu）からなる重合体分子、例えば、DNA、RNA、またはそれらの改変体をさす。このポリヌクレオチド分子は、天然に存在するポリヌクレオチド分子、または合成ポリヌクレオチド分子、または1種以上の天然に存在するポリヌクレオチド分子と1種以上の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせであり得る。1個以上のヌクレオチドが（例えば、変異誘発によって）変化しているか、欠失しているか、または付加されている天然に存在するポリヌクレオチド分子も、この定義に包含される。核酸は、単離されていてもよいし、またはもう一つの核酸、例えば、発現カセット、プラスミド、もしくは宿主細胞の染色体に組込まれていてもよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によっても同様に特徴決定される。
アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列へ変換する手法および方法は、当業者に周知である。従って、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴決定され、それによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列によっても同様に特徴決定される。
「核酸」とは、本明細書において使用されるように、組換え産生され得る、ポリペプチドをコードする、天然に存在するかまたは部分的にもしくは完全に天然には存在しない核酸をさす。核酸は、単離されたまたは化学的手段によって合成されたDNA断片から構築されてもよい。核酸は、もう一つの核酸、例えば、発現プラスミドまたは真核宿主細胞のゲノム／染色体へ組込まれていてもよい。プラスミドには、シャトルプラスミドおよび発現プラスミドが含まれる。典型的には、プラスミドは、複製起点（例えば、ColE1複製起点）を含む原核生物繁殖単位、ならびに原核生物におけるプラスミドの複製および選択のためのそれぞれの選択可能マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはテトラサイクリン耐性遺伝子）を含むであろう。
「機能的に連結された」とは、そのように記載された成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にある、2種以上の成分の並置をさす。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、連結された配列の転写を調節するかまたはモジュレートするためにシスに作用する場合、コード配列に機能的に連結されている。必ずしもそうではないが、一般に、「機能的に連結された」DNA配列は、連続しており、分泌リーダーおよびポリペプチドのような2種のタンパク質をコードする領域を接合する必要がある場合には、連続しかつ（リーディング）フレーム内にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは、一般に、コード配列の上流に位置するが、必ずしも連続していない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置していてよく、プロモーターから相当の距離に位置していてもよい。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通りポリアデニル化配列へ進むよう、コード配列の下流末端に位置している場合、コード配列に機能的に連結されている。翻訳終止コドンは、翻訳がコード配列を通り終止コドンへ進み、そこで終結するよう、コード配列の下流末端（3'末端）に位置している場合、エクソン核酸配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR方法論を使用して、かつ／または便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。便利な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣習的な実務に従い使用される。
「多シストロン性転写単位」とは、複数の構造遺伝子が同一プロモーターの調節下にある転写単位である。
「ポリアデニル化シグナル」という用語は、本願において使用されるように、特定の核酸配列セグメントの一次転写物の切断およびポリアデニル化を誘導するために使用される核酸配列を意味する。ポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域は、SV40、ウシ成長ホルモン（bGH）のための遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、およびチミジンキナーゼ遺伝子（tk、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル）に由来するポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域からなる群より選択され得る。
「プロモーター」とは、それが機能的に連結された遺伝子／構造遺伝子または核酸配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列をさす。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択された配列の発現が企図される宿主細胞の細胞型において機能性のものであろう。多様な異なる起源に由来する構成型プロモーター、誘導型プロモーター、および抑制型プロモーターを含む、多数のプロモーターが、当技術分野において周知であり（GenBankのようなデータベースにおいて同定されており）、（例えば、ATCCのような寄託機関およびその他の商業的なまたは個人的な起源から）クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中に入手可能である。
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指図するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の5'非コード領域または非翻訳領域に位置している。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴決定される。これらのプロモーター要素には、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素（DSE；McGehee,R.E.,et al.,Mol.Endocrinol.7(1993)551）、サイクリックAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE；Treisman,R.,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47）、グルココルチコイド応答要素（GRE）、ならびにCRE/ATF（O'Reilly,M.A.,et al.,J.Biol.Chem.267(1992)19938）、AP2（Ye,J.,et al.,J.Biol.Chem.269(1994)25728）、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253）、およびオクタマー因子（一般に、Watson,et al.,(eds.),Molecular Biology of the Gene,4th ed.(The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.(1987))およびLemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14を参照のこと）のようなその他の転写因子のための結合部位が含まれる。プロモーターが誘導型プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成型プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤によって制御されない。抑制型プロモーターも公知である。例えば、c-fosプロモーターは、細胞表面上の受容体に成長ホルモンが結合することによって特異的に活性化される。テトラサイクリン（tet）によって制御される発現は、例えば、CMVプロモーターとそれに続く2個のTetオペレーター部位からなる人工ハイブリッドプロモーターによって達成され得る。Tetリプレッサーが、2個のTetオペレーター部位に結合し、転写を阻止する。誘導剤テトラサイクリンが添加されると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から放出され、転写が進む（Gossen,M.and Bujard,H.,PNAS 89(1992)5547-5551）。メタロチオネインおよび熱ショックプロモーターを含むその他の誘導型プロモーターについては、例えば、Sambrook et al.（前記）およびGossen et al.,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520を参照のこと。高レベル発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1α（CHEF-1、例えば、米国特許第5,888,809号を参照のこと）、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV IE）が含まれる。
「プロモーター」は、構成型または誘導型であり得る。エンハンサー（即ち、転写を増加させるためにプロモーターに作用するシス作用性のDNA要素）は、プロモーター単独によって入手される発現のレベルを増加させるためプロモーターと共に機能するよう必要であり得、転写制御要素として含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列（例えば、CMVまたはSV40）も含むであろう。
「安定的に形質転換された」、「安定トランスフェクトされた」、または「安定」という用語は、本願において使用されるように、宿主細胞ゲノム／染色体への外来性の核酸の遺伝可能な安定的な組込みを意味する。安定トランスフェクトされた細胞は、選択培養条件の下で、即ち、1種以上の選択マーカーの存在下で、細胞選択過程の後に入手される。
「構造遺伝子」とは、シグナル配列を含まない遺伝子の領域、即ち、コード領域を意味する。
「転写ターミネーター」という用語は、mRNA合成の終結のためのシグナルをRNAポリメラーゼに与える、50〜750塩基対長のDNA配列を意味する。特に、強力なプロモーターを使用する時には、RNAポリメラーゼのリードスルーを防止するため、発現カセットの3'末端に、極めて効率的な（強力な）ターミネーターが存在することが望ましい。非効率的な転写ターミネーターは、不要な、例えば、プラスミドによってコードされた遺伝子の発現の理由となり得るオペロン様mRNAの形成をもたらす場合がある。
本発明の範囲内で、当技術分野において公知の実質的に任意の種類のトランスフェクション法によって、トランスフェクトされた細胞を入手することができる。例えば、電気穿孔または微量注入によって、核酸を細胞へ導入することができる。あるいは、FuGENE 6（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、X-tremeGENE（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、およびLipofectAmine（Invitrogen Corp.,USA）のようなリポフェクション試薬を使用してもよい。あるいは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクターシステムによって、核酸を細胞へ導入することもできる（Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314）。
「一過性トランスフェクション」という用語は、本願において使用されるように、細胞へ導入された核酸が、その細胞のゲノムまたは染色体DNAへ組込まれない過程を示す。それは、実際、染色体外要素として、例えば、エピソームとして、細胞内に維持される。エピソームの核酸の転写過程は影響を受けず、例えば、エピソームの核酸によってコードされたタンパク質が産生される。一過性トランスフェクションは「一過性トランスフェクトされた」細胞をもたらす。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインをさす。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖（それぞれVHおよびVL）の可変ドメインは、一般に、類似した構造を有し、各ドメインが、4個の保存されたフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（HVR）を含む（例えば、Kindt,T.J.,et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page 91を参照のこと）。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分である場合もある。さらに、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングするため、それぞれ、抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを使用して、特定の抗原に結合する抗体を単離することができる（例えば、Portolano,S.,et al.,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.,et al.,Nature 352(1991)624-628を参照のこと）。
「ベクター」という用語は、本明細書において使用されるように、それが連結されたもう一つの核酸を繁殖させることができる核酸分子をさす。その用語には、自己複製性核酸構造としてのベクターも含まれるし、導入された宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結された核酸の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
抗体
本明細書において提供される方法および組成物は、組換えモノクローナル抗体の産生のためのものである。抗体は、以下に限定されないが、単特異性抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、抗体断片、一価抗体、多価抗体（例えば、二価抗体）のような様々な構造のものであり得る。
ある種の態様において、抗体は抗体断片である。抗体断片には、Fab断片、Fab'断片、Fab'-SH断片、F(ab')2断片、Fv断片、およびscFv断片、ならびに下記のその他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の概説については、Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134を参照のこと。scFv断片の概説については、例えば、Plueckthun,A.,In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315を参照し；WO 1993/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号も参照すること。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFab断片およびF(ab')2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
ダイアボディとは、二価または二特異性であり得る、2個の抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134；およびHolliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照のこと）。トリアボディ（triabodies）およびテトラボディ（tetrabodies）も、Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134に記載されている。
シングルドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある種の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis,Inc.,Waltham,MA；例えば、米国特許第6,248,516号を参照のこと）。
本明細書に記載されるように、完全抗体のタンパク質消化および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって、抗体断片を作成することができる。
ある種の態様において、抗体はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号；およびMorrison,S.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルのような非ヒト霊長類に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化させられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
ある種の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させるため、非ヒト抗体がヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来する、1個以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの態様において、ヒト化抗体におけるいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するかまたは改善するため、非ヒト抗体（例えば、HVR残基が由来した抗体）に由来する対応する残基に置換される。
ヒト化抗体およびそれらを作成する方法は、例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann,I.,et al.,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；米国特許第5,821,337号、米国特許第7,527,791号、米国特許第6,982,321号、および米国特許第7,087,409号；（SDR（a-CDR）グラフティングを記載している）Kashmiri,S.V.,et al.,Methods 36(2005)25-34；（「リサーフェイシング（resurfacing）」を記載している）Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498；（「FRシャフリング（shuffling）」を記載している）Dall'Acqua,W.F.,et al.,Methods 36(2005)43-60；ならびに（FRシャフリングのための「ガイデッドセレクション（guided selection）アプローチ」を記載している）Osbourn,J.,et al.,Methods 36(2005)61-68およびKlimka,A.,et al.,Br.J.Cancer 83(2000)252-260にさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：「ベストフィット（best-fit）」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims,M.J.,et al.,J.Immunol.151(1993)2296-2308を参照のこと）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；およびPresta,L.G.,et al.,J.Immunol.151(1993)2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞変異を受けた）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633を参照のこと）；ならびにFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca,M.,et al.,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684およびRosok,M.J.,et al.,J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618を参照のこと）。
ある種の態様において、抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374およびLonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459に一般に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、完全ヒト抗体またはヒト可変領域を有する完全抗体を産生するよう改変されたトランスジェニック動物へ、免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しており、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わっているか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体へランダムに組込まれている。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を入手する方法の概説については、Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125を参照し、例えば、XENOMOUSE（商標）テクノロジーを記載している米国特許第6,075,181号および米国特許第6,150,584号；HUMAB（登録商標）テクノロジーを記載している米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）テクノロジーを記載している米国特許第7,041,870号、ならびにVELOCIMOUSE（登録商標）テクノロジーを記載しているUS2007/0061900も参照すること。そのような動物によって生成された完全抗体に由来するヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変してもよい。
ハイブリドーマに基づく方法によって、ヒト抗体を作成することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.,et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；およびBoerner,P.,et al.,J.Immunol.147(1991)86-95を参照のこと）。ヒトB細胞ハイブリドーマテクノロジーを介して生成されたヒト抗体も、Li,J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562に記載されている。付加的な方法には、例えば、（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生を記載している）米国特許第7,189,826号および（ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している）Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268に記載されたものが含まれる。ヒトハイブリドーマテクノロジー（トリオーマテクノロジー）も、Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937およびVollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191に記載されている。
ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによっても、ヒト抗体を生成することができる。次いで、そのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載される。
所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、抗体を単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom,H.R.,et al.,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37に概説され、例えば、McCafferty,J.,et al.,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.,et al.,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.,et al.,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.,et al.,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.,et al.,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；およびLee,C.V.,et al.,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132にさらに記載されている。
ある種のファージディスプレイ法において、Winter,G.,et al.,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455に記載されるように、VH遺伝子およびVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組換え、次いで、それを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Fv（scFv）断片としてまたはFab断片として抗体断片をディスプレイする。免疫感作された起源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths,A.D.,et al.,EMBO J.12(1993)725-734によって記載されるように、免疫感作なしに、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対する抗体の単一の起源を提供するため、（例えば、ヒトから）未感作レパートリーをクローニングすることができる。最後に、Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388によって記載されるように、高度に可変性のCDR3領域をコードし、インビトロで再編成を達成するため、再編成されていないV遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダム配列を含有しているPCRプライマーを使用することによって、未感作ライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許刊行物には、例えば、米国特許第5,750,373号、ならびにUS 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936、およびUS 2009/0002360が含まれる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書において、ヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
ある種の態様において、抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体は、少なくとも2種の異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の態様において、結合特異性の一方は第一の抗原に対するものであり、他方は異なる第二の抗原に対するものである。ある種の態様において、二特異性抗体は、同一抗原の2種の異なるエピトープに結合してもよい。二特異性抗体は、抗原を発現する細胞へ細胞毒性剤を局在化するために使用されてもよい。二特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多特異性抗体を作成するための技術には、異なる特異性を有する2種の免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、WO 93/08829、およびTraunecker,A.,et al.,EMBO J.10(1991)3655-3659を参照のこと）ならびに「ノブ・ホール（knob-in-hole）」工学（例えば、米国特許第5,731,168号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。抗体Fcヘテロ二量体分子を作成するための静電的ステアリング（electrostatic steering）効果の工作（WO 2009/089004）；2種以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第4,676,980号およびBrennan,M.,et al.,Science 229(1985)81-83を参照のこと）；二特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny,S.A.,et al.,J.Immunol.148(1992)1547-1553を参照のこと）；二特異性抗体断片を作成するための「ダイアボディ」テクノロジーの使用（例えば、Holliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照のこと）；ならびに単鎖Fv（sFv）二量体の使用（例えば、Gruber,M .,et al.,J.Immunol.152(1994)5368-5374を参照のこと）；ならびに、例えば、Tutt,A.,et al.,J.Immunol.147(1991)60-69に記載されたような三特異性抗体の調製によっても、多特異性抗体を作成することができる。
「オクトパス（Octopus）抗体」を含む、3種以上の機能性の抗原結合部位を有するよう工作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、US 2006/0025576を参照のこと）。
抗体は、第一の抗原に結合し、かつもう1種の異なる抗原にも結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab（Dual Acting Fab）」または「DAF」であってもよい(例えば、US 2008/0069820を参照のこと）。
抗体または断片は、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、またはWO 2010/145793に記載されているような多特異性抗体であってもよい。
方法
ある種の態様において、本明細書に提供される方法は、抗体がグリコシル化される程度を変更するため、即ち、増加させるかまたは減少させるため、使用される。
抗体がFc領域を含む場合、それに付着した炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生されたネイティブ抗体は、典型的には、一般に、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に付着している、分枝を有する二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32を参照のこと）。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸を含み、二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてGlcNAcに付着したフコースも含む。いくつかの態様において、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを作出するため、本発明の抗体においてオリゴ糖の改変を行うことができる。
一つの態様において、提供された方法は、Fc領域に（直接または間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体の産生をもたらす。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であり得る。フコースの量は、例えば、WO 2008/077546に記載されるように、MALDI-TOF質量分析によって測定されるような、Asn297に付着した全ての糖鎖構造（例えば、複合型構造、混合型構造、および高マンノース型構造）の合計に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって、決定される。Asn297とは、Fc領域内の約297位（Fc領域残基のKabatによるEU番号付け）に位置するアスパラギン残基をさす；しかしながら、Asn297は、抗体における軽微な配列変動によって、297位の±3アミノ酸上流または下流、即ち、294位〜300位に位置する場合もある。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたADCC機能を有し得る（例えば、US 2003/0157108；US 2004/0093621を参照のこと）。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する刊行物の例には、以下のものが含まれる：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.,et al.,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13 CHO細胞（Ripka,J.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；およびWO 2004/056312、特に、実施例11）、ならびにα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（FUT8）ノックアウトCHO細胞のようなノックアウト細胞株（例えば、Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.,et al.,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；およびWO 2003/085107を参照のこと）が含まれる。
ある種の態様において、提供された方法は、二分（bisected）オリゴ糖を有する抗体、例えば、抗体のFc領域に付着した二分岐オリゴ糖がGlcNAcにより二分される抗体を産生するために使用され得る。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、WO 2003/011878；米国特許第6,602,684号；およびUS 2005/0123546に記載されている。Fc領域に付着したオリゴ糖の中に少なくとも1個のガラクトース残基を有する抗体バリアントを産生することもできる。そのような抗体バリアントは、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、WO 1997/30087；WO 1998/58964；およびWO 1999/22764に記載されている。
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換え法および組成物を使用して、抗体を産生してもよい。核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる態様において、そのような核酸を含む1種以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つのそのような態様において、宿主細胞は、（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、によって形質転換されている）。一つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0）である。一つの態様において、抗体の発現のために適当な条件の下で、上に提供されるような、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程を含み、任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程を含む、抗体を作成する方法が提供される。
抗体の組換え産生のためには、抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のため、1種以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための適当な宿主細胞には、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFc領域エフェクター機能が必要でない時、細菌において抗体を産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、米国特許第5,789,199号、および米国特許第5,840,523号を参照し；大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254も参照すること。発現の後、可溶性画分内の細菌細胞ペーストから抗体を単離することができ、さらに精製してもよい。
原核生物に加えて、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、「ヒト化」されたグリコシル化経路を有する真菌および酵母の株を含む、糸状菌または酵母のような真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適当なクローニング宿主または発現宿主である（Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；およびLi,H.,et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215を参照のこと）。
グリコシル化抗体の発現のための適当な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来してもよい。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。昆虫細胞と共に、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために使用され得る、多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用することができる（例えば、（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）テクノロジーを記載している）米国特許第5,959,177号、米国特許第6,040,498号、米国特許第6,420,548号、米国特許第7,125,978号、および米国特許第6,417,429号を参照のこと）。
脊椎動物細胞も宿主として利用することができる。例えば、懸濁培養に順応した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham,F.L.,et al.,J.Gen Virol.36(1977)59-74に記載されているような293または293細胞）；ベビーハムスター腎細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252に記載されているようなTM4細胞）；サル腎細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA）；イヌ腎細胞（MDCK）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（Hep G2）；マウス乳癌（MMT 060562）；例えば、Mather,J.P.,et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載されているようなTRI細胞；MRC 5細胞；およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR陰性（DHFR-）CHO細胞（Urlaub,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；ならびにY0、NS0、およびSp2/0のような骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生のために適当なある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268を参照のこと。
II. 発明の具体的な局面
ベクター構成に依って、（1）ベクター設計および（2）同一ベクターについての発現ベクターの性能が、一過性トランスフェクションと安定トランスフェクションとの間で異なることが見出された。
一過性トランスフェクションおよび安定トランスフェクションのための最適なベクター構成が、明白に異なり得ることが見出された。この理論によって拘束はされないが、いくつかの点が、これらの違いに寄与する可能性がある：（1）それぞれのベクター設計に依存しかつ特異的であり、一過性のシステムには存在しない、宿主ゲノムに組込まれたベクターコピーの間の転写干渉現象、（2）それぞれのベクター構成に依存し、安定的なシステムにおいては重要な役割を果たすが、一過性のシステムにおいてはそうでない、選択過程および選択ストリンジェンシーの影響、ならびに（3)モノクローナル抗体の一過性発現と安定発現とで明確に異なり、安定トランスフェクションより一過性トランスフェクションの方が低い、最適なLC/HCポリペプチド比。
一過性トランスフェクションについては、LCおよびHCの双方向発現が、全ての試験されたベクター構成の中で最も高い産物力価に達することが見出された。理論によって拘束はされないが、このベクター設計は、（A）LCポリペプチドおよびHCポリペプチドの高い発現レベル、ならびに（B）最適な「一過性」LC/HCポリペプチド比という最適なIgG発現のための基準の両方を満たすと想定され、（C)LCおよびHCの双方向発現は、RNAポリメラーゼのリードスルー効果としての転写干渉機序も最小化する可能性がある。
しかしながら、安定トランスフェクションについては、LCおよびHCの双方向発現は、一列構成LC-HC-SMより悪いことが見出された。この理論によって拘束はされないが、（1）LC、HC、およびSMのための発現カセットの収束性の構成は、組込まれたベクターコピーの間の転写干渉現象を低下させる可能性があり、（2）HCの上流にLCが存在することによって、安定トランスフェクションのために（より）最適であるLC/HCポリペプチド比が明確に容易になり、（3）選択マーカーの下流への位置付けによって、選択のストリンジェンシーが明確に増加する。さらに、IgG産生細胞の割合および細胞株の産生能が増加していることが見出された。抗体発現カセットの双方向に上流に選択マーカーを含有しているベクターについては、選択圧の濃度の増加によって、選択のストリンジェンシーは明白に増加したが、安定プールまたは安定クローンの産生能は増加しなかった（示されないデータ）。
hCMVプロモーターおよびSV40ポリシグナルを、hEF1αプロモーターおよびbGHポリAシグナルに同時に交換することによって、抗体発現カセットを一方向に構成した時には、一過性産物力価が有意に増加するが、LC発現カセットおよびHC発現カセットを双方向に位置付けた時には、産物力価が減少することが見出された。
hEF1αプロモーターは、多数の高産生クローン、および極めて少数の非産生クローンまたは低産生クローンを生成することが見出された。しかしながら、フェドバッチ分析において、hEF1αプロモーターの最良の個々のクローンについての産物力価は、hCMVプロモーターのクローンより低かった。しかし、hCMVプロモーターについての上位クローンの全体数は比較的低く、それらの同定は一般的に高度のスクリーニング努力を必要とする。
hGTの使用は、一過性トランスフェクションにおいても、安定トランスフェクションにおいても、SV40またはbGHのポリAシグナルと組み合わせられた時、hCMVプロモーターを含有しているベクターについて、産生能を有意に増加させることが見出された。しかしながら、hEf1αプロモーターを含有するベクターについて、産物力価に対するその効果は、bGHポリAシグナルと組み合わせられた時、無視し得る程度であった。従って、ベクター性能に対するhGTの影響は、使用されるプロモーターに依存することが見出された。
完全に調節された大規模発酵における最終評価のための適切なクローンの選別は、一般的に、振とうフラスコにおけるバッチ分析またはフェドバッチ分析に基づく。バッチ分析とフェドバッチ分析との間に、いくつかの発現ベクターまたは要素の性能および順位の差が存在することが見出された。SV40ポリAをbGHポリAシグナルに交換することによって、バッチ分析においては、hCMVプロモーターを含有しているベクターについての産生能が増加したが、フェドバッチ分析においてはそうでなかった。hGTは、バッチ分析においては、クローンの産物力価に対して有意な影響を及ぼさなかったが、フェドバッチ分析においてはそうでなかった。選択マーカーの位置またはプロモーター（hEf1αプロモーターであるかhCMVプロモーターであるか）が異なるベクターの間の違いは、バッチ分析においては中程度に明白であったが、フェドバッチ分析においては強く明確であった。発現レベルおよび比産生速度は、バッチモードよりフェドバッチモードの方が高い。
大部分のクローンについて、絶対産物力価のレベルにおいてのみならず、順位においても、異なるベクターおよびクローンの間に、フェドバッチ分析および2L発酵の性能における良好な相関が見出された。
選択マーカーの下流への位置付けは、抗体発現カセットの上流への選択マーカーの双方向性の位置付けと比較して、産生能の損失をわずかに低下させることが見出された。理論によって拘束はされないが、これは、増加した選択ストリンジェンシー、従って、より高いmRNAレベルによるか、または改善されたLC/HC mRNA比もしくはポリペプチド比による可能性がある。両方の要因が、産生能の変化に対するより高い抵抗性をもたらした可能性がある。
bGHポリAシグナルは、SV40ポリAシグナルと比較して、クローンにおける抗体発現の安定性を有意に減少させた。しかしながら、bGHポリAシグナルの下流へのhGTの挿入は、発現の安定性を明白に増加させた。安定性に対するhGTの正の効果は、選択圧の非存在下で最も明白であった。
安定プールの安定性分析は、細胞が、hCMVによって生成された時には産生能を急速に失うが、hEf1αプロモーターによって生成された時にはそうでないことを明らかにした。著しくは、hGTは、hEf1αプロモーターを含有しているベクターについて、クローンの産生能を減少させたが、安定性をわずかに増加させた。
クローンの極一部分のみが、選択過程の後に抗体を有意に産生する。しかしながら、ベクター構成および／または要素の改変は、IgG非産生クローンに対するIgG産生クローンの比を有意に増加させた。異なるベクター構成、従って、選択のストリンジェンシーを決定する選択マーカーの異なる発現レベルも、IgG産生細胞の割合に明白に影響する。スクリーニング過程のデータに基づく統計的シミュレーションは、いくつかの発現ベクターが、スクリーニング過程における作業量を相当に減少させる可能性も保持することを証明した。この事実は、バイオ医薬品企業のコストに対して多大な影響を及ぼす。
転写過程の改善
プロモーターによる転写開始
プロモーターは、遺伝子の転写レベルを決定し、従って、細胞株の産生能および安定性に対して強い影響を及ぼす：
−プロモーターによって媒介される転写開始は、組換えタンパク質へ翻訳され得るmRNAの量を決定する；
−安定的組込みにも関わらず、クローンの長期産生能は、（（例えば、プロモーターメチル化による）遺伝学的遺伝子サイレンシングの結果として）急速に減少する場合がある；
−プロモーター活性は細胞型依存性である。
多様な細胞株において強力なプロモーターであることが示されたプロモーターが、記載されている。イントロンはエンハンサー様要素を含有している場合があることが公知である。しばしば、最初のイントロン（イントロンA）が、制御要素の大部分を含有している。このイントロンAは、全長天然プロモーター配列／組織内に最初に存在するイントロンである。
ポリAシグナルによって媒介されるmRNAのポリアデニル化
mRNAのポリアデニル化は様々な機能を有している。それは、核からのmRNA輸出、翻訳開始、およびmRNA安定性に対して強く影響を及ぼす。従って、ポリアデニル化過程の効率は、遺伝子の発現レベルに対して、従って、産生能に対して強力な影響を及ぼす。
いくつかの刊行物が、ポリアデニル化シグナルがタンパク質発現に対して強い影響を及ぼし得ることを示している。ウシ成長ホルモンに由来するポリAシグナル（bGHポリAシグナル）は、SV40ポリAシグナルの代わりに用いられた時、増強されたタンパク質発現をもたらし得ることが報告された。
ウシ成長ホルモンポリAシグナルは、抗体鎖の組換え産生において改善された特性を有し得ることが見出された。
転写ターミネーターによって支援された転写終結
発現ベクターに含まれる要素は、相互に強く干渉する場合がある（転写干渉）。これは転写過程における競合による。例えば、立体的制約による転写因子および／またはRNAポリメラーゼへの最適でないプロモーターの接近が、転写機構の資源の利用可能性を低下させる。異なる近接発現カセットの間にも、干渉が起こり得る。例えば、非効率的な転写終結のため、第一の発現単位から第二の発現単位へのRNAポリメラーゼのリードスルーが起こる場合がある。
非効率的な転写終結は、転写干渉をもたらし、遺伝子の非効率的な発現をもたらす場合があることが報告されている。ヒトガストリン遺伝子転写ターミネーター（hGT）の使用は、転写終結を改善し、従って、組換えタンパク質の増強された発現に寄与することができる。この効果は、hGTが組み合わせられるプロモーターに依る。さらなる効果的な転写ターミネーターが公知である。
抗体発現カセットの初期SV40ポリAシグナルの後に、ヒトガストリン転写ターミネーターの配列を挿入することによって、増強された転写終結、および発現カセット間の、例えば、抗体軽鎖の発現カセットと抗体重鎖の発現カセットとの間の転写干渉の防止が、達成され得ることが見出された。
結果
1種以上のコード核酸、例えば、抗体鎖をコードする構造遺伝子の増強された発現のための発現ベクターが、本明細書に報告される。
転写のために必要とされる遺伝要素が適切に選ばれ配置された時、構造遺伝子を発現する組換え細胞の産生能が改善されることが見出された。
ポリAシグナル配列および転写ターミネーター配列
ベクターp5068において、発現カセットは、SV40ポリAシグナルで終結していた。
ベクターpx6001において、発現カセットは、SV40ポリAシグナルの下流に置かれたヒトガストリン転写ターミネーター（hGT）をさらに含有していた。
ベクターpx6007において、発現カセットは、bGHポリAシグナルおよびhGT転写ターミネーターで終結していた。
ベクターpx6008において、発現カセットは、付加的な転写ターミネーターなしにbGHポリAシグナルで終結していた。
これらのベクターをCHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、トランスフェクションの6日後、細胞培養上清を採集し、培養上清中に産生された抗体の量をELISAによって決定した。
SV40ポリAシグナルのbGHポリAシグナルへの置換、およびSV40ポリAシグナルの後へのヒトガストリンターミネーター（hGT）の付加／挿入（ベクターpx6001）は、対照ベクターp5068と比較して、約45％〜30％の一過性発現における産生能の増加をもたらした。bGHポリAシグナルとヒトガストリンターミネーター（hGT）との組み合わせは、対照ベクターp5068と比較して、最も大きな力価増加（+58％）をもたらした。
Figure 0006096802
従って、一過性発現システムにおいて、bGHポリAシグナルによるポリアデニル化、およびヒトガストリン転写ターミネーターの付加による改善された転写終結が、抗体分泌を増強することが見出された。
安定的な抗体発現細胞株を生成するため、ベクターp5068、px6001、px6007、およびpx6008を使用した。
Figure 0006096802
バッチ抗体産生においてベクターp5068によって生成された最良の15個の単一クローンの平均産生能は、624μg/mlであった。（ヒトガストリンターミネーター（hGT）を含有している）ベクターpx6001または（bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせを含有している）ベクターpx6007によって生成されたクローンは、ベクターp5068と比較して、それぞれ、23％および40％増加した産生能を有していた（ベクターpx6001については770μg/ml、ベクターpx6007については872μg/ml）(図1を参照のこと）。産生能のこの増加は、上位クローンレベルでも反映されている（ベクターpx6001については+23％(939μg/ml）、ベクターpx6007については+31％（1001μg/ml）；値は、各ベクターによって入手された3個の最良のクローンについて計算された）。
ベクターpx6008によって生成されたクローンは、576μg/mlという15個の最良のクローンの平均産生能を有していた。
ベクターpx6008についての3個の最良のクローンの平均産生能は、760μg/mlである。
プロモーター配列
ベクターpx6051において、発現カセットは、イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーターおよびSV40ポリAシグナルを含んでいた。
ベクターpx6052において、発現カセットは、ヒトEf1αプロモーターおよびSV40ポリAシグナルを含んでいた。
ベクターpx6062において、発現カセットは、イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーターおよびbGHポリAシグナルおよびヒトガストリンターミネーターを含んでいた。
ベクターpx6063において、発現カセットは、ヒトEf1αプロモーターおよびbGHポリAシグナルおよびヒトガストリンターミネーターを含んでいた。
Figure 0006096802
各ベクターについて入手された最良の18個の安定クローンを同定し、クローンの産生能をバッチ分析において試験した。
SV40ポリAシグナルの、bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせへの交換は、平均産生能を増強する：hEF1αプロモーターの場合、約19％（ベクターpx6063についての505μg/ml、対、ベクター6052についての426μg/ml）、全長hCMVプロモーターの場合、約71％（ベクターpx6062についての333μg/ml、対、ベクターpx6051の195μg/ml）。
産生能の増加は、上位クローンレベルでも見られた（ベクターpx6063（693μg/ml）対ベクターpx6052(511μg/ml）について+36％、ベクターpx6062（529μg/ml）対ベクターpx6051(262μg/ml）について+102％、値は、各ベクターの3個の最良のクローンについて計算された）（図2を参照のこと）。
従って、選択マーカーのための発現カセットが一方の転写方向にあり、重鎖のための発現カセットの上流にある軽鎖のための発現カセットがそれぞれの他方の転写方向にある双方向ベクター構成を使用した安定トランスフェクションにおいて、hEF1αプロモーターとbGHポリAシグナルおよびhGTとの組み合わせが、産生能を増強することが見出された（px6052を参照のこと）。
さらに、軽鎖のための発現カセットが重鎖のための発現カセットの上流にあり、それらが選択マーカーのための発現カセットの上流に位置している一方向ベクター構成（LC-HC-SM発現カセットの5'→3'方向）(px9005を参照のこと）を使用しても、または選択マーカーのための発現カセットが一方の転写方向にあり、重鎖のための発現カセットの上流にある軽鎖のための発現カセットがそれぞれの他方の転写方向にある双方向ベクター構成（px6007を参照のこと）を使用しても、安定トランスフェクションにおいて、bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせが、hCMVプロモーターについて、産生能を増強することが見出された。
bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせを、一過性トランスフェクションアプローチにおいても利用した。（bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせと共に、全長hCMVプロモーターまたはhEF1αプロモーターを含有している）ベクターpx6062およびpx6063を、（SV40ポリAシグナルと共に、全長hCMVプロモーターまたはhEF1αプロモーターを含有している）ベクターpx6051およびpx6052と直接比較した。
安定トランスフェクションとは対照的に、一過性トランスフェクションにおいては、bGHポリAシグナルとヒトガストリンターミネーター（hGT）との組み合わせは、イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーターの場合にも、イントロンAを含むヒトEF1αプロモーターの場合にも、産生能を増加させない（ベクターpx6052についての2.38μg/ml、対、ベクターpx6063についての2.32μg/ml）。イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーターの場合、bGHポリAシグナルとヒトガストリンターミネーター（hGT）との組み合わせは、ベクターpx6062Aについては2.74μg/ml、ベクターpx6051については3.64μg/mlの産生能をもたらした。
一過性トランスフェクションによって入手された細胞においては、短いhCMVプロモーターとウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびヒトガストリンターミネーターとの組み合わせが、改善された抗体発現収率をもたらすことが見出された。
安定細胞クローンのトランスフェクションおよび選択によって入手された細胞株においては、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列とヒトガストリンターミネーターとの組み合わせが、使用されるプロモーターと無関係に、改善された抗体発現収率をもたらすことが見出された。
ベクターp5068においては、抗体の軽鎖（LC）および重鎖（HC）の両方をコードする遺伝子の発現が、短いヒトCMVプロモーター（hCMV）によって駆動される。このプロモーターは、広範囲の細胞型において活性であり、哺乳動物発現プラスミドにおいて一般的に使用されている。プロモーター活性は強く細胞型依存性であり、hCMVプロモーターはプロモーターメチル化としての遺伝子サイレンシング効果に対して感受性があることが公知であるため、おそらくはCHO-K1細胞においてより強力なかつ／またはより耐性のプロモーターが存在する。
異なるプロモーターを含む発現ベクターを構築した：（i)イントロンAを含まない短縮hCMV、（ii）イントロンAを含む全長hCMVプロモーター、（iii）イントロンAを含む全長ラットCMVプロモーター、および（iv）イントロンAを含むhEF1αプロモーター。
全長hCMVプロモーター（px6051）、hEf1αプロモーター（px6052）、およびラットCMVプロモーター（px6053）を含有しているベクターを構築し、一過性トランスフェクションおよび安定トランスフェクションのために使用した。
Figure 0006096802
発現ベクターp5068、px6051、px6052、およびpx6053をヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、トランスフェクションの4日後、細胞培養上清を採集し、産生能をELISAによって決定した。
イントロンAを含むhEF1aプロモーター（px6052）またはイントロンAを含む全長hCMVプロモーター（px6051）を含有しているベクターは、発現ベクターp5068と比較して、それぞれ、53％および134％増加した産生能を有していた（ベクターpx6051については3.64μg/ml、ベクターpx6052については2.38μg/ml、ベクターp5068については1.56μg/ml）。しかしながら、ラットCMVプロモーターを含有しているベクターpx6053は、およそ50％低下した産生能を示した（p5068については0.8μg/ml）（図3を参照のこと）。
全長ヒトCMVプロモーター（ベクターpx6051およびpx6062）またはイントロンAを含むhEF1αプロモーター（ベクターpx6052およびpx6063）を含有しているベクターを、安定トランスフェクションにも使用した。
発現ベクターp5068、px6051、px6052、およびpx6053を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、安定プールを選択した。プールの産生能をバッチ分析において分析した。
安定プールのバッチ分析は、イントロンAを含むhEF1αプロモーターを含有しているベクター（ベクターpx6052）によってトランスフェクトされた細胞からの抗体力価が、短縮hCMVプロモーターを含有しているベクター（ベクターp5068）またはイントロンAを含む全長hCMVプロモーターを含有しているベクター（ベクターpx6051）によってトランスフェクトされた細胞の4倍を超えていたことを示した（ベクターpx6052については78μg/ml、ベクターp5068については14μg/ml、ベクターpx6051については17μg/ml、ベクターpx6053については8.46μg/ml）(図4）。
発現ベクターp5068、px6051、およびpx6052を使用して、安定クローンを生成した。さらに、（両方とも、SV40ポリAシグナルの代わりにbGHポリAシグナルとヒトガストリンターミネーターとの組み合わせを含有している）ベクターpx6062およびpx6063を使用した。
Figure 0006096802
各ベクターについて入手された最良の54個のクローンのバッチ分析は、ベクターpx6052によってトランスフェクトされた細胞からの平均産生能が316μg/mlであり、ベクターp5068については341μg/mlであったことを示した。全長hCMVプロモーターを含有しているベクターpx6051およびpx6062によって生成されたクローンは、ベクターpx6051については141μg/ml、ベクターpx6062については220μg/mlの平均産生能を有していた。
（bGHポリAシグナルおよびhGTと組み合わせられたhEF1αプロモーターを含有している）ベクターpx6063によってトランスフェクトされた54個の試験されたクローンのバッチ分析における平均産生能は、367μg/mlの産生能を有していた。最も高い力価を有する最良のクローンは、ベクターpx6063に由来する（それぞれ、748μg/mlおよび731μg/ml）。
ヒトEF1αプロモーターを含有しているベクター（px6052およびpx6063）によって生成されたクローンは、低下した数の低産生クローンを示すことが見出された。
クローンを抗体産生の安定性について試験した。ベクターp5068およびpx6052によって入手された12個のクローンを、3回の継代の間、ハイグロマイシンBの存在下および非存在下で培養した。
選択圧（ハイグロマイシンB）の非存在下では、3回の継代の間に、イントロンAを欠く短縮hCMVプロモーターについて、12個の試験されたクローンの平均産生能の35％の減少が観察された（p5068；264μg/ml対410μg/ml）。対照的に、イントロンAを含むhEF1αプロモーターについては、平均産生能の18％の減少しか観察されなかった（px6052；256μg/ml対312μg/ml）。
選択圧の存在下では、ベクターp5068によって入手されたクローンは、27％の平均産生能の減少を示し（298μg/ml対410μg/ml）、イントロンAを含むhEF1αプロモーターを含有しているベクターpx6052によって入手されたクローンからの力価は、15％減少した（266μg/ml対312μg/ml）。
イントロンAを欠く短縮hCMVプロモーターを含有しているベクターp5068、またはイントロンAを含むhEF1αプロモーターを含有しているベクターpx6052によってトランスフェクトされた安定クローンの数を、選択圧の存在下または非存在下での3回の継代の後に決定した。3回の継代の後にクローンが「安定」しているか否かを決定するため、継代ゼロからのIgG力価を100％に設定し、しきい値を80％と定義した。選択圧の存在下または非存在下での3回の継代の後に、継代ゼロ（継代0）でのIgG力価の80％未満である相対IgG力価を示すクローンを、不安定と定義した。
選択圧の存在下または非存在下での3回の継代の後、p5068によってトランスフェクトされた全てのクローンからの相対抗体力価は、継代ゼロの抗体力価と比較して80％未満に低下した。安定細胞クローンとは、選択圧の存在下でも選択圧の非存在下でも、継代ゼロの抗体力価と比較して80％以上である抗体力価を産生するクローン細胞集団である。
選択圧の存在下または非存在下での3回の継代の後、px6052によってトランスフェクトされたクローンからの相対力価は、12例中8例において、継代ゼロのIgG力価と比較して80％未満に低下したが、4クローンは「安定」と定義された。ベクターp5068によって生成されたクローンとは対照的に、ベクターpx6052によって生成された12個のクローンのうちの8個が、選択圧の存在下で「安定」している。対照的に、ベクターp5068に由来するクローンは、1個のみが、選択圧の存在下で安定している。
ベクターpx6014、px6014A、およびpx6014Bは、抗体の軽鎖の前にhEF1aプロモーターを含有し、重鎖の前に短いhCMVプロモーターを含有している。これらのベクターは、軽鎖の5'UTRにおいて変動している（px6014：PmeI制限部位を含有しているhEF1αプロモーターの5'UTR；px6014A：PmeI制限部位を含まないhEF1αプロモーターの5'UTR；px6014B：hEF1αプロモーターの5'UTR＋ベクターp5068の5'UTR）。ベクターを、ヌクレオフェクションを使用してCHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトした。
ベクターpx6014Aおよびpx6014Bは、ベクターpx6014と比較して、それぞれ20％および40％増強された産生能を示す（ベクターpx6014Bについては2.01μg/ml、ベクターpx6014Aについては1.71μg/ml、ベクターpx6014については1.41μg/ml）。
一過性トランスフェクションにおいて、ヒトEF1αプロモーターまたは全長ヒトCMVプロモーター（両方ともイントロンAを含む）を含有しているベクターは、ベクターp5068と比較して改善された産生能を示すことが見出された。
ヒトEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成された安定プールは、ベクターp5068と比較して改善された産生能をバッチ分析において示すことが見出された。
イントロンAを含むヒトEF1αプロモーターを含有しているベクターによる安定トランスフェクションによって入手された細胞クローンは、低下した数の低産生クローンを示すことが見出された。
イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーターを含有しているベクターによる安定トランスフェクションによって入手された細胞クローンは、平均でも、上位クローンレベルでも、強く低下した産生能を示すことが見出された。
従って、選択マーカーのための発現カセットが一方の転写方向にあり、重鎖のための発現カセットの上流にある軽鎖のための発現カセットがそれぞれの他方の転写方向にある双方向ベクター構成（px6052を参照のこと）を使用した安定トランスフェクションにおいて、bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせが、使用されたプロモーターと無関係に、SV40ポリAと比較して産生能を増強することが見出された。
さらに、軽鎖のための発現カセットが重鎖のための発現カセットの上流にあり、それらが、選択マーカーの発現カセットの上流に位置している一方向ベクター構成（LC-HC-SM発現カセットの5'→3'方向）を使用した安定トランスフェクションにおいて、bGHポリAシグナルとhGTとの組み合わせが、hCMVプロモーターについて、産生能を増強することが見出された。
選択過程の改善
多数の非産生クローンおよび低産生クローンならびに遺伝子発現の低い安定性のため、現在の細胞株開発は極めて時間がかかり高コストである。数千個のクローンの中から、通常、わずか数個の安定的な「高産生体」が見出される。
理論によって拘束はされないが、選択戦略の低い選択性およびストリンジェンシーの可能性のある理由は、抗体発現に対して選択圧をかけない使用されたベクターシステムにおける抗体および選択マーカーの別々の発現であり得る（例えば、ベクターp5069を参照のこと）。
IRES要素の使用によって、この問題を克服し得ることが見出された。
IRES要素は、mRNAレベルで、内部リボソーム進入部位として機能し、従って、1種のmRNAからの2種の遺伝子の発現を可能にするDNA要素である。
選択マーカーおよび抗体鎖のIRESによって連結された発現は、全抗体発現（即ち、選択マーカーおよび抗体鎖の両方をコードする1種のmRNA）に選択圧をかけ、従って、選択の選択性を保証する。遺伝子発現の安定性が増加し得る。
弱いIRES活性を有するIRES要素の使用は、選択マーカーの弱い発現を可能にする。選択マーカーのこの弱い発現は、選択のストリンジェンシーを増加させ得る。
選択マーカーおよび抗体鎖のIRESによって連結された共発現によって、
−産生細胞の数の増加、
−遺伝子発現の安定性の増強、および
−選択過程のストリンジェンシーの増強
によって、選択過程が改善され得る。
抗体および選択マーカーのIRESによって連結された共発現のため、使用されるIRES要素は、二つの要件を満たさなければならない。
−IRES要素はmRNA安定性／抗体発現に影響しないかまたは最小限に影響する。
−選択マーカーがわずかにしか発現されないよう、IRES要素は弱いIRES活性を示さなければならない。
軽鎖および重鎖をコードする核酸を、数種のIRES要素、EV71-IRES要素、ELF4G-IRES要素、およびEMCV-IRES要素（ベクターpx6015A、px6015B、およびpx6015C）によって連結した。発現カセットは、5'から3'への方向に、ヒトCMVプロモーター、軽鎖をコードする核酸、IRES、重鎖をコードする核酸、およびポリA部位を含む。
参照としてのIRES要素を含まないベクターp5068、ならびにベクターpx6015A、px6015B、およびpx6015Cを、CHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、産生能をELISAによって決定した。
（ELF4G-IRESおよびEMCV-IRESをそれぞれ含有している）ベクターpx6015Bおよびpx6015Cは、0.1μg/ml〜0.15μg/mlのIgG発現を示す。ベクターp5068は、2μg/mlのIgG発現を示す。EV71-IRESを含有しているベクターpx6015Aは、1.7μg/mlの産生能を示す。
あるいは、選択マーカーネオマイシンを、IRES要素によって、抗体の重鎖に直接連結することができる。ベクターは、5'から3'への方向に、要素、ヒトCMVプロモーター、軽鎖をコードする核酸、ポリA部位、ヒトCMVプロモーター、重鎖をコードする核酸、IRES要素、ネオマイシン選択マーカー核酸、およびポリA部位を含む。
ベクターpx6010A、px6010B、およびpx6010Cを、記載されたように、CHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、産生能をELISAによって決定した。
EMCV-IRESを含有しているベクターpx6010Cは、13μg/mlの産生能を示す。ベクターp5069は、14μg/mlの産生能を示す。EV71-IRES（ベクターpx6010A）またはELF4G-IRES（ベクターpx6010B）を含有しているベクターは、それぞれ4.3μg/mlおよび2.4μg/mlの産生能を示す。
従って、EMCV-IRES要素が、選択マーカーのIRESによって連結された発現のために必要な要件を満たすことが見出された：
−(選択マーカーがわずかにしか発現されないような）弱いIRES活性
−IRES要素（それぞれIRESによって連結された選択マーカーの発現）の抗体発現に対する最大でも最小限の影響。
従って、(G418に対する耐性を媒介する）選択マーカーネオマイシンを、EMCV-IRESによって、重鎖をコードする核酸に連結することができる。
ベクターp5069およびpx6010Cを、安定トランスフェクションにおいて、プールおよび単一クローンレベルの両方で、産生能および安定性について試験した。
ベクターをヌクレオフェクションテクノロジーによってCHO-K1細胞へトランスフェクトした。安定プールを選択し、プールの産生能をバッチ分析において分析した。
ベクターpx6010Cによって生成されたプールは、バッチ分析において、14μg/mlの産生能を示す。ベクターp5069によって生成されたプールは、バッチ分析において、5.4μg/mlの産生能を示す（図5）。
ベクターpx6010Cによって生成されたプールは、（ベクターp5069と比較して）より多くの産生細胞（またはより多くの高産生細胞）からなり、かつ／またはIgG発現の安定性が増強されていることが見出された。
ベクターpx6010Cにおける選択マーカーネオマイシンのIRESによって連結された発現も、プールの増強された安定性をもたらすことが見出された。安定プールを、選択圧の存在下および非存在下で、30代にわたり培養した。安定性試験の開始時（＝0代目）および終了時（＝30代目）に、プールの産生能をバッチ分析において決定した。
ベクターpx6010Cによって生成されたプールは、ベクターp5069によって生成されたプールと比較して、バッチ分析において、IgG発現の増強された安定性を示す。バッチ分析において、ベクターp5069によって入手されたプールの産生能は、選択圧の存在下でも非存在下でも、30代の後、強く減少した（＞80％；検出限度未満の値）。ベクターpx6010Cによって生成されたプールの産生能も、選択圧の非存在下で約70％減少した。しかしながら、選択圧の存在下で、ベクターpx6010Cによって生成されたプールの産生能は、10％しか減少しなかった（図6）。
ベクターp5069およびベクターpx6010CをヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、上記のように、安定クローンを生成した。クローンをスクリーニングし、各トランスフェクションの最良の15個のクローンの産生能をバッチ分析において分析した。各ベクターの2回の独立のトランスフェクションを実施した。
ベクターpx6010Cによって生成されたクローンは、348μg/mlの平均産生能を示す。ベクターp5069によって生成されたクローンは、239μg/mlの平均産生能を示す。ベクターpx6010Cによって生成されたクローンの増加した平均産生能は、上位クローンがより良好であったためではなく、低産生クローンの数が明白に減少したためである。ベクターp5069とは対照的に、ベクターpx6010Cによって生成されたクローンは、バッチ分析において200μg/mlより低い産生能を示さない（図7）。
45世代にわたる選択圧の存在下および非存在下での培養によって、抗体発現の安定性を、それぞれ17個のクローン（p5069）および14個のクローン（px6010C）について試験した。クローンの産生能を、バッチ分析において、安定性試験の開始時（0世代目）および45世代目に測定した。45世代目のIgG力価を、安定性試験の開始時のクローンの産生能と比較した。
ベクターp5069によって生成された17個のクローンの平均産生能は、選択圧の存在下でも非存在下でも45世代の後に減少した（産生能のおよそ43％の損失）。ベクターpx6010Cによって生成された14個のクローンの平均産生能は、選択圧の非存在下では、およそ45％減少した。しかしながら、選択マーカーの存在下では、これらのクローンについての産生能の減少は4％である。
選択圧の存在下で、ベクターp5069によって生成された17個の試験されたクローンのうちの6個のみが、0世代目における産生能の80％をまだ超えている産生能を示す。対照的に、ベクターpx6010Cによって生成された14個の試験されたクローンのうちの10個が、0世代目における産生能の80％を超える産生能を示す。
選択圧の非存在下では、ベクターp5069およびベクターpx6010Cによってそれぞれ生成されたクローンの間に、安定性の有意差は存在しない。
選択およびスクリーニングの過程の改善
強度のスクリーニング努力のため、現在の細胞株開発は、極めて時間がかかり高コストである。数千個のクローンの中から、一般に、ほんの数個の安定高産生体しか見出されない。
現在、高産生クローンの同定のための数種のスクリーニング戦略が存在する：
−産生されたタンパク質の直接検出のためのELISAに基づくスクリーニング戦略（時間がかかり高コストである）；
−産生されたタンパク質の直接検出のための蛍光に基づくスクリーニング戦略（時間がかかり高コストである）；
−産生されたタンパク質の間接検出／定量化のための定量的スクリーニングマーカー（表面タンパク質またはGFPのような蛍光マーカー）を共発現する細胞のFACSに基づくソート。
ほとんどの場合、蛍光マーカーの発現は、抗体の発現に関連していない。これは、蛍光強度と産生能との依存を限定し、従って、しばしば、蛍光強度と産生能との間に良好な相関は存在しない。
（蛍光マーカーの例としての）GFPタンパク質は、安定しており、蓄積する傾向がある。細胞内の蛍光マーカーの発現レベル（蛍光強度）とそれらの産生能との間に、（ほとんどの場合）良好な相関は存在しない。
抗体発現と蛍光マーカー発現とを連結することによって、組み合わせられた選択およびスクリーニングの戦略が、増強された安定性および産生能を有する細胞クローンを同定するが、同時に、簡便であり、従って、高産生体の迅速かつ容易な同定を可能にすることが見出された。
融合タンパク質のIRESによって連結された発現が、選択マーカーとしても、定量的スクリーニングマーカーとしても、機能することが見出された。
IRES要素によって抗体の重鎖に直接連結された緑色蛍光タンパク質（GFP）および選択マーカーネオマイシンの融合タンパク質を構築した。融合タンパク質内の緑色蛍光タンパク質と選択マーカーネオマイシンとは、PEST配列（マウスオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子（mODC）のコドン423〜449に相当する配列）によって分離されている。このPEST配列は、タンパク質レベルで、強力なタンパク質分解シグナル配列として機能し、従って、タンパク質の半減期を明白に低下させる。
GFP-PEST-Neo融合タンパク質は、選択マーカーとしてのみならず、さらに、定量的スクリーニングマーカーとしても機能する。
PEST配列の使用は、PESTによって媒介される融合タンパク質の半減期の減少（選択のストリンジェンシーの増強）のため、クローンの改善された選択を提供する。
PEST配列の使用は、抗体および選択マーカーのIRESによって連結された共発現のため、融合タンパク質のGFP蛍光強度と抗体発現レベルとの間の良好な相関を提供する。
PEST配列の使用は、タンパク質の減少した半減期のため、融合タンパク質の蓄積を低下させる。
安定単一クローンのGFP発現レベルを、FACSによって分析し、バッチ分析における産生能と相関させた。安定プールから、異なるGFP発現レベルを有する集団を、FACSによってソートし、ソートされた集団の産生能を分析した。
このアプローチのための要件を満たすIRES要素：
−融合タンパク質がわずかにしか発現されないよう、弱いIRES活性を提供しなければならない；
−抗体発現レベルに影響してはならない。
数種のIRES要素、EV71-IRES要素、ELF4G-IRES要素、およびEMCV-IRES要素（ベクターpx6015A、px6015B、およびpx6015Cを参照のこと）によって、軽鎖および重鎖の発現を連結することによって、IRESの活性または強度を決定した。参照としての（IRES要素を含まない）ベクターp5068、ならびにベクターpx6015A、px6015B、およびpx6015Cを、CHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、産生能をELISAによって測定した。
（それぞれELF4G-IRESおよびEMCV-IRESを含有している）ベクターpx6015Bおよびpx6015Cは、0.1〜0.15μg/mlのIgG発現を示す。ベクターp5068については、2μg/mlのIgG発現が示された。EV71-IRESを含有しているベクターpx6015Aは、1.7μg/mlの産生能を示し、このことから、EV71-IRES要素がCHO-K1細胞において強力なIRES活性を有することが示された。
GFP-PEST-Neo融合タンパク質を、IRES要素によって、抗体の重鎖をコードする核酸と直接連結する（図8を参照のこと）。
ベクターpx6011A、px6011B、およびpx6011Cに含まれる、選択マーカーがIRES要素によって抗体の重鎖に連結された構築物を、記載されるように、CHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、産生能をELISAによって決定した。
EMCV-IRESを含有しているベクターpx6011Cは、8.7μg/mlのIgG産生能を示し、ベクターp5059は、10.8μg/mlのIgG産生能を示した。EV71-IRESを含有しているベクターpx6011Aは、3.9μg/mlのIgG産生能を示した。ELF4G-IRESを含有しているベクターpx6011Bは、関連する産生能を示さなかった。
IRESによって連結されたGFP-PEST-Neo融合タンパク質を含むベクターpx6011C、ベクターp5069、およびベクターpx6010Cを、安定プールおよび安定クローンのバッチ分析において試験した。
ベクターp5069、px6010C、およびpx6011Cを、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトした。記載されるように、安定プールを選択し、安定プールの産生能をバッチ分析において分析した。
IRESによって連結された選択マーカーを含有しているベクターpx6010Cによって生成された安定プールは、9.5μg/mlのIgG産生能を示した。ベクターp5069によって生成された安定プールは、5.4μg/mlのIgG産生能を示した。IRESによって連結された融合タンパク質を含有しているベクターpx6011Cによって生成されたプールは、36.3μg/mlの産生能を示した（図9）。
これらのデータは、ベクターpx6010Cおよびpx6011Cによって生成されたプールが、明らかに、（ベクターp5069によって生成された）プールよりはるかに多い産生細胞または高産生細胞からなることを示唆する。px6010Cプールおよびpx6011Cプールの／におけるIgG発現の増強された安定性も、産生能の増加に寄与した可能性がある。
安定クローンにおいて、発現ベクターp5068の産生能を、ベクターpx6010Cおよびpx6011Cと比較するため、ベクターをヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトした。記載されるように、安定クローンを選択し、クローンをスクリーニングした。各ベクターの最良の15個のクローンの産生能を、バッチ分析において分析した。
ベクターp5068については、384ウェルプレートにおける全部で3072個のウェルのうちの95個が、2μg/ml（バックグラウンド）を超えるIgG産生を示した。IRESによって連結された選択マーカーの発現（px6010C）は、産生クローン／ウェルの数を195へと2倍にし、IRESによって連結された融合タンパク質（px6011C）の場合には、産生細胞／ウェルの数がさらに280を超えるまでに増加した。
さらに、産生クローンの数のみならず、ベクターpx6010Cおよびpx6011Cによって生成されたIRES含有クローンの平均産生能も、より高い（各ベクターの最良の100個のクローンについて、ベクターp5069については3.4μg/ml、ベクターpx6010Cについては4.2μg/ml、ベクターpx6011Cについては8.1μg/ml；各ベクターの最良の250個のクローンについて、ベクターp5069については2.2mg/ml、ベクターpx6010Cについては3.0μg/ml、ベクターpx6011Cについては5.1μg/ml）。
IRESベクターpx6010Cおよびpx6011Cならびにp5059によって生成されたクローンは、24ウェルスクリーニングにおいて、ベクターpx6011Cについては212μg/ml、ベクターpx6010Cについては178μg/ml、ベクターp5069については118μg/mlの平均産生能を示す（細胞分割後4日目に不明確な細胞数を有する24ウェル培養物において決定された）。ベクターpx6010Cおよびpx6011Cについては、低下した数の非産生クローンまたは低産生クローン、および増加した数の高産生細胞が見られる（図10）。
単一クローンのバッチ分析は、ベクターpx6010Cによって生成された15個の最良のクローンの平均産生能が348μg/mlであり、ベクターp5069については239μg/mlであることを示した。ベクターpx6010Cによって生成された15個の最良のクローンの平均産生能は、404μg/mlである。最も高い全体力価を有するクローンは、ベクターpx6011Cによるトランスフェクタントに由来する。ベクターpx6010Cおよびベクターpx6011Cによって生成されたクローンは、バッチ分析において200μg/mlより低い産生能を示さない。
抗体発現の安定性についてクローンを試験するため、各ベクターによって入手された14〜19個のクローンを、45世代にわたり、選択圧（G418）の存在下および非存在下で培養した。クローンの産生能を、安定性試験の開始時（0世代目）および45世代目に、バッチ分析において測定した。45世代目のIgG力価を、安定性試験の開始時の0世代目のクローンの産生能（100％に設定された値）と比較した。
ベクターp5069によって生成された17個のクローンの平均産生能は、選択圧の存在下でも非存在下でも、45世代の後に減少した（産生能のおよそ43％の損失）。ベクターpx6010Cおよびpx6011Cによって生成された14〜19個のクローンの平均産生能も、選択圧の非存在下では、それぞれ減少したが（産生能のおよそ45〜35％の損失）、選択マーカーG418の存在下では、これらのクローンについての平均産生能の45世代後の減少は、わずか0〜4％である。
選択圧G418の存在下で、ベクターp5069によって生成された17個の試験されたクローンのうちの6個が、0世代目における産生能の80％を超える産生能を示した。対照的に、ベクターpx6010Cによって生成された14個の試験されたクローンのうちの10個、ベクターpx6011Cによって生成された19個の試験されたクローンのうちの17個が、0世代目における産生能の80％を超える産生能を示した。
選択圧の非存在下では、ベクターp5069、px6010C、およびpx6011Cによって生成されたクローンは、比較可能な挙動を示す。
IRESを含むベクター、従って、それらから入手されたクローンは、選択マーカーの存在下で、増強された安定性を有することが見出された。
しかしながら、選択マーカーの非存在下では、IRES含有ベクターまたはIRES不含ベクターによって入手されたクローンの間に安定性の差は存在しない。
GFP-PEST-Neo融合タンパク質は、定量的スクリーニングマーカーとして有用である。ベクターpx6011Cによって生成されたクローンのGFP蛍光レベルは、それらの産生能を予測する。
単一クローンのGFP発現レベル／蛍光強度を決定し、結果を、バッチ分析におけるクローンの産生能と相関させ、異なるGFP発現レベル／蛍光強度を有する集団を、FACSによって安定プールからソートし（各ベクター1,000細胞）、次いで、これらの異なる集団の産生能をバッチ分析において分析した。3種の異なる集団をソートした：
集団1：GFP発現なし、FL1-H（＝GFP）の幾何平均（GM）0〜4
集団2：低いGFP発現レベル、GM 4〜5.5
集団3：高いGFP発現、GM 5.5〜7。
バッチ分析およびFACS分析は、単一クローンでも、プールレベルでも、クローン／プールのGFP蛍光とそれらの産生能との間に良好な相関が存在することを示す。高いGFP蛍光を有するクローンまたはプールは、一般に、低いGFP蛍光を示す細胞より高い産生能を示す。一般に、クローン／プールの産生能は、その蛍光強度と共に増加する（図11および12）。
安定プールからの、高GFP蛍光単一クローンの、FACSに基づくソートによって、直接、高産生クローンを同定することができる。GFP発現を示さないかまたは高いGFP発現を示す単一クローンを、FACSによってソートした。振とうされた6ウェルプレートにおいてクローンを増大させ、クローンの産生能をバッチ分析において決定した。
選択マーカーまたはGFP-PEST-Neo融合タンパク質のEMCV-IRESによって連結された発現は、選択の選択性を明白に増強し（より多くの産生クローンをもたらし）、選択のストリンジェンシーも増強する（産生クローンの平均産生能がより高い）ことが見出された。従って、スクリーニング労力が明白に軽減される。
IRESによって連結された選択マーカー（px6010C）と比較して、より強力であった、IRESによって連結された融合タンパク質（px6011C）の効果は、恐らく、融合タンパク質の半減期の低下および／または融合タンパク質の選択剤に対する親和性の低下（いずれの要因も、明らかに、選択のストリンジェンシーを増強する）を媒介する融合タンパク質内のPEST配列による。
ベクター構成と組み合わせられたベクター要素
以下のベクターを、CHO-K1宿主細胞株において、一過性トランスフェクション、安定プールにおいて試験し、いくつかを単一クローンレベルで試験した。
Figure 0006096802
一過性トランスフェクションにおける異なるベクターの性能を、CHO-K1細胞へのヌクレオフェクションの後に試験した。
（ベクター構成LC-HC-SMに基づき）ヒト伸長因子1αプロモーター（hEF1α）を含有しているベクターは、hCMVプロモーターの使用と比較して、使用されたポリAシグナル配列に依存して、それぞれ、約+34％（px9003対px9002；SV40ポリAシグナル配列）および+30％（px9006対px9004；bGHポリAシグナル配列）の増加した産生能を有する。
hCMVを含有しているベクターについて、bGHポリAシグナル配列へのヒトガストリンターミネーター（hGT）の付加は、産生能に対して正の効果を及ぼす（px9005対px9004；+13％）。
抗体の軽鎖および重鎖の双方向発現に基づく発現ベクターは、改善された性能を示す。産物力価が、対照ベクターpx9001と比較して、使用されたプロモーター（hEF1αであるかhCMVであるか）および使用されたポリAシグナル配列（SV40ポリAシグナル配列であるかbGHポリAシグナル配列であるか）に依存して、約2.7〜3.4倍増加する。
ヒト伸長因子1αプロモーターおよびbGHポリAシグナル配列の使用は、ベクター構成LC-HC-SMにおいては、産生能に対して正の効果を及ぼすが（+50％；px9006およびpx9002を比較すること）、ベクター構成LC(3'-5')-HC-SMにおいては、そうでないことが見出された（-28％；px9010およびpx9011を比較すること）。
発現ベクターpx9002の産生能を、ベクターpx9003〜9007と比較するため、ベクターをヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、安定プールを選択した。プールの産生能をバッチ分析において分析した（図10を参照のこと）。
安定プールのバッチ分析は、ヒト伸長因子1αプロモーターを含有しているベクター（px9003、px9006、px9007）によってトランスフェクトされたプールからの抗体力価が、短縮hCMVプロモーターを含有する参照ベクター（ベクターpx9002）によってトランスフェクトされた細胞よりおよそ7〜8倍高いことを示した（ベクターpx9003、px9006、およびpx9007についての97.5μg/ml、112.5μg/ml、および95.6μg/mlを、ベクターpx9002についての14.0μg/mlと比較すること）。
ベクターpx9001、px9002、およびpx9004〜px9007を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、最良の単一クローンを古典的なスクリーニング過程によって同定した。各ベクターの最良の36個のクローンの産生能をバッチ分析において分析し、バッチ分析における最良の15個のクローンをフェドバッチ分析において試験した。
ベクターpx9001によって生成された最良の36個の単一クローンのバッチ分析における平均産生能は、356μg/mlである。ベクターpx9002、または（SV40ポリAシグナルの代わりに（単独でもしくはHGTと組み合わせて）bGHポリAシグナルをさらに含有している）ベクターpx9004および9005によって生成されたクローンは、対照ベクターpx9001と比較して、それぞれ37％（px9002）、61％（px9004）、53％（px9005）の産生能の増加を示す。ベクターpx9006およびpx9007のクローンは、それぞれ約19％および7％の産生能の増加を示す。
フェドバッチ実験において、バッチ分析において各ベクターによって入手された最良の15個のクローンを、14日間のフェドバッチ分析において試験した。
（ベクターpx9001によって生成された）最良の15個の単一クローンのフェドバッチ分析における平均産生能は、1345μg/mlである。ベクターpx9002、または（SV40ポリAシグナル配列の代わりに（単独でもしくはhGTと組み合わせて）bGHポリAシグナル配列をさらに含有している）ベクターpx9004およびpx9005によって生成されたクローンは、対照ベクターpx9001と比較して、それぞれ80％（px9002）、58％（px9004）、92％（px9005）の産生能の増加を示す。
平均産生能の増加（上記参照）に加え、上位クローンの性能も強く改善される。ベクターpx9002、px9004、およびpx9005は、上位5個のクローンの産生能に関して、対照ベクターpx9001と比較して、約64％（px9002）、50％（px9004）、および88％（px9005）の増加を示す。
以下において、異なるベクターの各々についての産生細胞と非産生細胞のそれぞれの割合を直接比較した。ベクターpx9001によって生成されたクローンの14.2％が、抗体を産生し、耐性クローンの残りにおいては、抗体発現がサイレンシングされているかまたはクローンがその他の欠陥を有している。
ベクターpx9002のベクター構成は、産生細胞の割合を（26.0％に）ほぼ2倍にした。SV40ポリAシグナル配列の代わりに、単独で（ベクターpx9004）またはhGTと組み合わせて（ベクターpx9005）bGHポリAシグナル配列をさらに含有しているベクターは、産生細胞の割合のおよそ3倍の増加を示す（それぞれ39％および43％）。
hCMVプロモーターの代わりにヒト伸長因子1αプロモーターを使用することによって、産生細胞の数が5倍にまで増加した（選択過程後に入手されたクローンの70％超が実際に抗体を産生する）。
（フェドバッチ結果に基づく）ベクターpx9001〜9007によるトランスフェクションによって入手された最良の15個のクローンを、15回の継代（＝およそ60世代）の間、ハイグロマイシンBの存在下および非存在下で培養した。15回の継代の後のバッチ分析におけるクローンの産物力価を、安定性試験の開始時のバッチにおけるクローンの産物力価と比較した。
選択圧の存在下で、15回の継代の後の、各ベクターの15個のクローンの産物力価の変化は、ベクターpx9007についての-14.7％からベクターpx9002についての+0.2％まで変動する。
選択圧の非存在下で、産物力価の減少は、ベクターpx9004についての25.5％からベクターpx9005についての5.9％まで変動する。
選択マーカーの存在下でも非存在下でも、出発点（G0）における値と比較したバッチ分析における産物力価の＞80％のような定義された安定性基準を満たすクローンの数は、4〜10まで変動する。ベクターpx9005、px9007、およびpx9002は、選択圧／選択マーカーの存在下および非存在下で、同様に、最も多数の安定クローンをもたらす（px9005：10；px9007：7；px9002：6）。
従って、ベクターpx9005の構成は、特に、選択圧の非存在下で、安定性に対して正の効果を示し、安定クローンの数を増加させることが見出された。
bGHポリAとhGTとの組み合わせは、使用されるプロモーターと無関係に、転写ターミネーター（hGT）を含まないSV40ポリAと比較して、安定クローンの産生能を明白に増加させることが見出された。
一過性トランスフェクション：
−（イントロンAを含む）ヒト伸長因子1αプロモーターの使用は、（LC-HC-SM構成において）増強された産生能を提供する。
−ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列の使用は、SV40ポリAシグナル配列の使用と比較して増強された産生能を提供する。
−bGHポリAシグナル配列へのHGTの付加は、hCMVプロモーターを含有しているベクターにおいて、増加した産生能をもたらす。
−ベクター構成LC(3'-5')-HC-SMは改善された発現をもたらす。
安定プール
−hEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成されたプールは、バッチ分析において増強された産生能を示す。
−hEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成されたクローンは、低下した数の低産生クローンを示す。
−hEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成されたクローンは、IgG発現のより高い安定性を示す。
単一クローン
−選択マーカーが下流に位置付けられたベクター構成（LC-HC-SM）は、安定単一クローンの産生能に対して正の効果を及ぼす。
−bGHポリAシグナル配列およびhGTを含有しているベクターで生成されたクローンは、より高い産生能および安定性を有している。
要約
数種の異なる転写関連遺伝要素およびそれらの組み合わせを、参照遺伝要素組み合わせと比較した。比較一過性実験に基づき、軽鎖および重鎖の発現カセット（軽鎖発現カセットが重鎖発現カセットの上流）の反対方向に選択マーカーのための発現カセットを含む双方向ベクター構成について、以下の結果が入手された（下記表を参照のこと）。
Figure 0006096802
異なるプロモーターを、bGHポリAシグナルおよびhGT転写ターミネーターと組み合わせた（下記表を参照のこと）。
Figure 0006096802
数種の転写関連遺伝要素およびそれらの組み合わせを、参照ベクター（px9001、ベクター構成SM（3'-5'方向）-LC-HC（5'-3'方向））と比較した。比較実験に基づき、軽鎖および重鎖のための発現カセット（軽鎖発現カセットが重鎖発現カセットの上流）ならびに選択マーカーのための発現カセットを同一方向に含む一方向ベクター構成について、参照ベクター（px9001、双方向ベクター構成SM（3'-5')-LC-HC(5'-3')）と比較して、以下の結果が入手された（下記表を参照のこと）。
Figure 0006096802
Figure 0006096802
Figure 0006096802
使用されたベクター
Figure 0006096802
本明細書に報告されるベクター要素／要素組み合わせを使用して、増加した発現（産生能）を達成し得ることが見出された：
−イントロンAを含まないヒトCMV：100％（参照）
−イントロンAを含むヒトのCMV：一過性234％、安定プール123％、安定クローン38％
−イントロンAを含むラットCMV：一過性50％、プール60％
−イントロンAを含むヒトEF1α：一過性153％、プール564％、安定クローン：84％（SV40ポリA）、およそ100％（bGHおよびhGT）
−イントロンAおよび最適化された5'UTRを含むヒトEF1α：+40％（ヒトEF1αに対して）
−MPSV：29％
−bGHポリA：一過性146％、安定92％
−hGT：一過性131％、安定プール138％、単一クローン123％
−bGHポリAおよびhGT：一過性158％、安定プール163％、単一クローン140％
ヒトCMVプロモーター：
Xu et al.,J.Control.Release,81(2002)155-163.
Xia et al.,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
ラットCMVプロモーター：
Xia et al.,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
ヒトEF1αプロモーター：
Teschendorf et al.,Anticancer Res.22(2002)3325-3330.
Li et al.,J.Immunol.Methods 318(2007)113-124.
MPSVプロモーター：
Xia et al.,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
Artelt et al.,Gene 68(1988)213-219.
Stocking et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)5746-5750.
Lin et al.,Gene 147(1994)287-292.
MPSV-CMVハイブリッドプロモーター：
Liu et al.,Anal.Biochem.246(1996)150-152.
IRESによって連結された選択マーカーの発現のための発現カセットを使用することによって、高選択性かつ高ストリンジェンシーの選択過程を提供することができる：
−抗体発現に対する選択圧は、高い選択性をもたらす。
−抗体および選択マーカーの連結された発現は、高い選択性をもたらす。
−弱い活性を有するIRES要素の使用は、高いストリンジェンシー、即ち、高い抗体産生および低い選択マーカー産生をもたらすことが見出された。
−IRES要素による抗体および選択マーカーの発現の連結。
−IgG発現をわずかに変更する弱い活性を有するIRES要素（EMCV/Gtx）の同定。
−選択マーカーとしてもスクリーニングマーカーとしても機能する融合タンパク質の使用。
−二機能性GFP-ネオマイシン融合タンパク質。
−オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列は、強力なタンパク質分解シグナル配列であり、タンパク質の低下した半減期を付与する。
−融合タンパク質のIRESによって連結された発現は、高い選択性をもたらす。
−タンパク質分解シグナル配列による短い半減期は、高いストリンジェンシーをもたらす。
−融合タンパク質の弱い発現および短い半減期のため、強力な発現が必要とされる。
−FACSによる高産生体の迅速な同定（高GFP発現クローンのソートが高産生体の選択を提供する）。
異なるIRES要素によって抗体重鎖に連結された選択マーカー
−px5068（IRESなし）：100％抗体発現（参照）
−Gtx-IRES：20〜27％
−EMCV-IRES 81〜94％
−EV71-IRES 20〜36％
−ELF4G-IRES 3〜17％
−Gtx-IRES（合成）88％
異なるIRES要素によって抗体重鎖に連結されたGFP-Neo融合タンパク質
Figure 0006096802
Gtx-IRES：
Komuro et al.,EMBO J.12(1993)1387-1401.
EMCV-IRES：
Mountford et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1991)4303-4307.
EV71-IRES：
Lee et al.,Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662.
ELF4G-IRES：
Wong et al.,Gene Ther.9(2002)337-344.
Gtx（合成）-IRES：
Chappell et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)1536-1541.
EV71-IRES要素による重鎖発現カセットへの軽鎖発現カセットの連結を使用して、増加した発現（産生能）を達成し得ることが見出された：
−IRESなしのpx5068：100％抗体発現（参照）
−Gtx-IRES（合成）：3％
−EV71-IRES：82％
−ELF4G-IRES：5％
−EMCV-IRES：7％
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:06の配列を有する最適化された5'UTRを含む最適化されたヒト伸長因子1αプロモーターである。
以下の実施例、図面、および配列は、本発明についての理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の本旨を逸脱することなく、示された手法を改変し得ることが理解される。
配列
SEQ ID NO:01 イントロンAを含まない短いヒトCMVプロモーター
SEQ ID NO:02 イントロンAを含まず5'UTRを含む短いヒトCMVプロモーター
SEQ ID NO:03 イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーター
SEQ ID NO:04 イントロンAを含まない全長ヒトEF1αプロモーター
SEQ ID NO:05 イントロンAを含む全長ヒトEF1αプロモーター
SEQ ID NO:06 イントロンAを含み5'UTRを含む短いヒトEF1αプロモーター
SEQ ID NO:07 イントロンAを含む全長ラットCMVプロモーター
SEQ ID NO:08 SV40ポリAシグナル配列
SEQ ID NO:09 bGHポリAシグナル配列
SEQ ID NO:10 hGTターミネーター配列
SEQ ID NO:11 SV40プロモーター
SEQ ID NO:12 オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列
SEQ ID NO:13 GFPをコードする核酸配列
SEQ ID NO:14 ネオマイシン選択マーカー
SEQ ID NO:15 GFP-PEST-NEO融合ポリペプチドをコードする核酸
SEQ ID NO:16 EMCV-IRES
SEQ ID NO:17 EV71-IRES
ベクターp5068、px6001、px6008、およびpx6007によって生成された安定クローンの産生能。全部で3回の独立のトランスフェクションのバッチ分析における各ベクターによって入手された最良の15個のクローンの平均産生能が示される。 ベクターpx6051、px6062、px6052、およびpx6063によって生成された安定クローンの産生能。全部で3回の独立のトランスフェクションのバッチ分析における各ベクターの最良の18個のクローンの平均産生能が示される。 Amaxaの96ウェルシャトルシステムを使用した一過性トランスフェクションにおける、ベクターp5068、px6051、px6052、およびpx6053の産生能。ELISAによって測定された、トランスフェクション後4日目の各ベクターの8回の独立のトランスフェクションの平均産生能が示される。 バッチ分析におけるベクターp5068、px6051、px6052、およびpx6053によって生成された異なる安定プールの産生能。7日目の各ベクターの3つのプールの平均産生能が示される。 ベクターp5069およびpx6010Cによって生成された安定プールの産生能。7日目のバッチ分析における各ベクターの2つ（px5069）または3つ（px6010C）のそれぞれ異なるプールの平均産生能が示される。 ベクターp5069およびpx6010Cによって生成された安定プールにおける遺伝子発現の安定性。継代0の7日目（100％に設定、黒カラム）ならびに選択圧（G418）の存在下（白カラム）および非存在下（模様付きカラム）での30世代目における、バッチ分析における各ベクターの2つの異なるプールの平均産生能が示される。 ベクターp5069およびpx6010Cによって生成された最良の15個のクローンの産生能。全部で2回の独立のトランスフェクションのバッチ分析における各ベクターの最良の15個のクローンの平均産生能。 IRESによって媒介されるGFP-PEST-NEO融合タンパク質の発現を媒介するベクターpx6011Cのベクター設計の概略図。GFP-PEST-Neo融合タンパク質は、EMCV-IRESによって、抗体の重鎖に連結されている。抗体の重鎖および融合タンパク質のコード配列が、1個のmRNAにおいて、短いヒトCMVプロモーターによって転写される。このmRNAの翻訳は、抗体の重鎖およびGFP-PEST-NEO融合タンパク質をもたらす。 バッチ分析における、ベクターp5069、px6011C、およびpx6010Cによって生成された異なる安定プールの産生能。7日目の各ベクターの2つの異なるプールの平均産生能が示される。 ベクターp5069、px6010C（EMCV-IRES要素によって抗体の重鎖に連結された選択マーカーネオマイシンを発現するベクター）、およびpx6011C（EMCV-IRES要素によって抗体の重鎖に連結されたGFP-PEST-ネオマイシンの融合タンパク質を発現するベクター）によって生成された最良の15個のクローンの産生能。（A）全部で2回の独立のトランスフェクションのバッチ分析における各ベクターの最良の15個のクローンの産生能分布。（B）全部で2回の独立のトランスフェクションのバッチ分析における各ベクターの最良の15個のクローンの平均産生能。 ベクターpx6011Cによって生成された11個のクローンについての、GFP発現レベル／蛍光強度とバッチ分析における産生能との依存が示される。クローンを24ウェルスクリーニングフォーマットでランダムに選び、次いで、増大させ、最後に、バッチ分析において分析した。各クローンのGFP蛍光強度の幾何平均（GM）およびGFP陽性細胞の割合を、FACSによって決定した。（A）11個の単一クローンについてのGFP蛍光強度とバッチ分析における産生能との依存。（B）11個の単一クローンについての各クローンのGFP陽性細胞の割合とバッチ分析における産生能との依存。 異なるGFP蛍光強度を有する安定プールのバッチ分析における産生能。異なるGFP発現レベル／蛍光強度（低（1）、中（2）、および高（3））を有する細胞を、FACSによってソートした。プールを増大させ、プールの産生能を7日目にバッチ分析において決定した。 px6007のプラスミド地図。 px6053のプラスミド地図。 px6062のプラスミド地図。
発現ベクターp5068およびp5069
発現プラスミドp5068およびp5069は、WO 2005/100402に報告されるような抗P-セレクチン抗体の発現のための発現カセット（エクソン-イントロン構成が保持されているゲノム的に構成された発現カセット）を含む。
抗P-セレクチンHuMabの軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞発現ベクターにおいて別々に組み立てた。
それによって、抗P-セレクチンHuMabの軽鎖可変領域（VL）およびヒトκ軽鎖定常領域（CL）をコードする遺伝子セグメントを接合し、抗P-セレクチンHuMabの重鎖可変領域（VH）およびヒトγ1重鎖定常領域またはヒトγ4重鎖定常領域（CH1-ヒンジ-CH2-CH3）のための遺伝子セグメントも同様に接合した。
コドン使用頻度を推定することができるヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication No 91-3242に与えられている。
抗P-セレクチンHuMabκ軽鎖の転写単位は、以下の要素から構成されている：
−ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−コザック配列を含む合成5'-UT、
−シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−独特のBsmI制限部位が5'末端に、スプライスドナー部位および独特のNotI制限部位が3'末端に配置された、クローニングされた抗P-セレクチンHuMab可変軽鎖cDNA、
−イントロン2マウスIg-κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域（Picard,D.,and Schaffner,W.Nature 307(1984)80-82）、ならびに
−ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。
抗P-セレクチンHuMabγ1重鎖の転写単位は、以下の要素から構成されている：
−ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−コザック配列を含む合成5'-UT、
−シグナル配列イントロンを含む改変されたマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−独特のBsmI制限部位が5'末端に、スプライスドナー部位および独特のNotI制限部位が3'末端に配置された、クローニングされた抗P-セレクチンHuMab可変重鎖cDNA、
−マウスIgμ-エンハンサーを含むゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域（Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378）、ならびに
−ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。
抗P-セレクチンHuMabのκ軽鎖またはγ1重鎖の発現カセットに加え、これらのプラスミドは、
−ハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルス（EBV）の複製起点oriP
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製起点、および
−大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子
を含有している。
組換えDNA技術
Sambrook et al.,1999（前記）に記載されるような標準的なクローニング技術を使用して、クローニングを実施した。（他に示されない限り）全ての分子生物学的試薬が、市販されているものであり、製造業者の説明書に従って使用された。
核酸合成
異なる遺伝要素のDNAは、Geneart AG（Regensburg）によって合成された。
核酸配列決定
DNA配列は、SequiServe（SequiServe GmbH,Germany）において実施された二本鎖配列決定によって決定された。
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
Vector NTI Advanceスイートバージョン9.0を、配列の生成、マッピング、分析、アノテーション、および図解のために使用した。
細胞培養技術
CHO-K1細胞を、1×HTサプリメント（Invitrogen Corp.,Gibco（登録商標）、カタログ番号11067-030）が補足されたCD-CHO培地（Invitrogen Corp.,Gibco（登録商標）、カタログ番号10743-011）において培養した。
安定トランスフェクトされたCHO-K1プール／細胞株の選択のため、400〜800μg/ml G418または200〜400μg/mlハイグロマイシンを添加した（Roche Diagnostics GmbH,Roche Applied Sciences,Germany、カタログ番号：843555）。
全ての細胞株を、120〜140rpm/分で絶えず攪拌しながら5％CO2を含む37℃の加湿されたインキュベーターにおいて維持した。3〜4日毎に、細胞を新鮮な培地へ分割した。培養物の密度および生存能を、Casey TTまたはCedex Hiresセルカウンター（Roche innovates AG,Bielefeld）を使用して決定した。細胞のトランスフェクションを、Amaxaヌクレオフェクションテクノロジー（Lonza GmbH,Germany）によって実施した。
Bonifacino,J.S.,et al.,(eds.),Current Protocols in Cell Biology,John Wiley and Sons,Inc.(2000)に記載されるような標準的な細胞培養技術をさらに適用した。
細胞計数および細胞生存能の決定
（a）電場細胞計数システム（CASY）
CASY（登録商標）Technology Cell Counter、モデルTT（Roche Innovatis AG,Bielefeld）は、細胞計数のために電流を使用する。細胞が低電圧フィールド内の測定孔を通過する時に作出されるシグナルから情報を得るため、パルスエリア解析が使用された。細胞膜の構造的完全性は、細胞生存能の程度である。従って、生存能の決定のために、トリパンブルーのような色素は必要とされない。
（b）自動トリパンブルー排除法（Cedex）
Cedex HiResシステム（Roche Innovatis AG,Bielefeld）を、プール選択における細胞生存能の決定、および自動細胞計数のために使用した。
トリパンブルーは、完全細胞膜を通って細胞に侵入することができない色素である。傷害を受けた細胞膜を有する細胞のみが染色され、死細胞としてマークされる。染色過程、細胞計数、および結果のグラフィカル分析を、デジタル画像認識によって、Cedexシステムによって自動的に実施した。その他の測定パラメータは、細胞サイズ、形態学、および凝集速度である。マルチサンプラーによって、20もの試料を連続的に測定した。
トランスフェクションにおけるプラスミドの正確な比較のためのプラスミド調製および品質チェック
トランスフェクション効率、従って、産生能は、DNAの量および品質のような数種の因子によって強く影響される。各ベクターについての等しい出発条件を保証するため、全てのベクターのDNAの量および品質を、トランスフェクション前に入念にチェックした。
−発現ベクターの同時調製
全てのベクターを、製造業者の説明書に従って、High Speed Maxiプラスミド単離キット（Qiagen GMBH,Hilden）によって同時に調製した。
−フェノール／クロロホルム精製およびエタノール沈殿
全てのベクターを、フェノール／クロロホルム精製によって同時に精製した。各々500μgの直鎖化されたプラスミドDNAを、200μlのトリス緩衝50％(v/v)フェノール、48％(v/v)クロロホルム、2％(v/v)イソアミルアルコール溶液と混合し、13,000rpmで1分間遠心分離した。次いで、上方の水相を新しいチューブへ移し、200μlの96％(v/v)クロロホルム、4％(v/v)イソアミルアルコールと混合し、13,000rpmで1分間遠心分離した。上相を、新しいチューブへ再び移し、1/10（全容積）の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および2.5倍（全容積）の100％エタノールと混合した。反応物を混合し、室温で5分間インキュベートした後、DNAをペレット化するため、混合物を13,000rpmで5分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを900μlの70％(v/v)エタノールによって洗浄し、室温で5分間インキュベートした。5分間の最大スピードでの最後の遠心分離工程の後、上清を廃棄し、ペレットを乾燥させ、滅菌H2Oに再懸濁させた。
−DNA決定
各ベクターのDNA量を、BioPhotometer（Eppendorf；Hamburg）を使用して決定した。DNA測定は、常に、トリス（pH8.0）での1:20希釈を使用することによって、トリプリケートに実施された。
−アガロースゲル
各プラスミドのDNAの品質を、0.8％アガロースゲル上でチェックした。DNA分解、ベクターコンフォメーション、およびDNA濃度を決定した。比較可能な量および品質（DNA分解なし、類似したスーパーコイル（ccc）型、ゲル上の類似したDNA量）を示すベクターを、一過性トランスフェクションおよび安定トランスフェクションに使用した。
一過性トランスフェクション
全てのベクターを、製造業者の説明書に従って、Amaxa 96ウェルシャトルシステム（Lonza GmbH,Germany）によってCHO-K1細胞にトランスフェクトした。各ベクターを8リプリケートでトランスフェクトした。トランスフェクトされたベクターのDNA量を、1μｇの参照発現プラスミド（p5068またはp5069）により等モル量／コピー数に標準化した。トランスフェクション後4〜7日目に、産生能を決定するため、ワンステップユニバーサルELISA（Dianova）によって、無細胞細胞培養上清をIgG力価について分析した。
Amaxa 96ウェルシャトルシステム：
スピナフラスコにおいて培養したCHO-K1細胞を、850rpmでの5分間の遠心分離によってペレット化し、培養培地に再懸濁させた。環状プラスミドを、1μgの参照発現ベクターp5068またはp5069により等モル濃度で96ウェルヌクレオフェクションプレートに播種した。次いで、細胞を、1ウェル当たり4×105細胞の濃度でプレートへ添加した。トランスフェクションをAmaxaプログラムDN-137によって実施した。細胞をトランスフェクション後10分間インキュベートし、次いで、200μl培養培地を含有している96ウェル平底インキュベーションプレートへ移した。次いで、細胞を静置培養した。トランスフェクション後4〜6日目に、ワンステップユニバーサルELISAを使用して、IgGレベルを決定した。
安定トランスフェクションおよび組換えCHO細胞株の生成
安定トランスフェクションを、製造業者の説明書に従って、ヌクレオフェクションテクノロジー（Amaxa Biosystems,Lonza cologne AG）によって実施した。トランスフェクション前に、プラスミドを制限酵素SgrA Iによって直鎖化した。各プラスミドをデュプリケートまたはトリプリケートにトランスフェクトした。5×106個の細胞および1.2pmolの直鎖化プラスミドを1回のトランスフェクションに使用した（Nucleofector Kit T、AmaxaプログラムA33）。
トランスフェクションのため、細胞をNucleofector溶液Tに再懸濁させ、2mlチューブに等分した。プラスミドの添加の後、パルスを適用することによってトランスフェクションを実施した。次いで、細胞を、余熱された4mlの新鮮培地および4mlの条件培地を含有しているT25組織培養フラスコへ移した。トランスフェクションの24時間後に、250μg/mlハイグロマイシンBを添加することによって選択圧をかけた。
安定プールの生成
ベクターをAmaxaヌクレオフェクションテクノロジーによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、選択剤としてハイグロマイシンBまたはG418を使用して、安定プールを選択した。各トランスフェクションをトリプリケートに実施した。安定プールの生成のため、全てのプラスミドを、SgrA Iによる制限消化によって均一に直鎖化した。AmaxaによるNucleofector Kit Tを、安定トランスフェクションを実施するために使用し、各プラスミドをトリプリケートにトランスフェクトした。
安定プールを以下のように確立した：5×106個の細胞および1.2pmolの直鎖化されたプラスミドを、各トランスフェクションのために使用した。細胞を、溶液Tに再懸濁させ、2mlチューブへ等分した。プラスミドの添加の後、パルスを適用することによってトランスフェクションを実施した（AmaxaプログラムA33）。トランスフェクトされた細胞プールを、余熱された4mlの新鮮培地および4mlの条件培地を含有しているT25組織培養フラスコにおいて静置培養した。
トランスフェクションの24時間後に、選択圧をかけた：細胞を800rpmで5分間遠心分離し、300μg/mlハイグロマイシンBを含有している3mlの培養培地に再懸濁させた。トランスフェクションの3日後に、細胞を平底6ウェルプレートへ移した。次いで、細胞生存能が最低になり、再び99％を超えて上昇するまで、細胞を2週間培養した。細胞の数および生存能をCedex HiResシステム（Innovatis,Bielefeld）によって絶えず決定した。培養中、細胞片を遠心分離によって除去し、細胞を常に3mlの新鮮培地に再懸濁させた。
Caliperロボットシステムを使用した安定クローンの生成
ベクターを上記のようにCHO-K1細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、選択圧をかけ（ハイグロマイシンBまたはG418）、自動ハイスループットクローン単離システム（Sciclone ALH 3000 workstation,Caliper Life Sciences GmbH,Mainz）を使用して、1ウェル当たり350〜700細胞の濃度で384ウェル平底プレートへ細胞を播種した。
10〜14日後、ELISAに基づくウルトラハイスループットスクリーニング（ELSIA uHTS）を使用して、384ウェルプレートをIgGレベルについてスクリーニングした。一次スクリーニングから、最良の産生クローンを選び、平底96ウェルプレートへ移した。3〜6日後、細胞をIgGレベルについて二次スクリーニングした。再び、最良の産生クローンを選び、平底24ウェルプレートへ手動で移した。さらなるELISAに基づくスクリーニング工程の後、最良のクローンを選び、平底6ウェルプレートに移した。振とうされた6ウェルプレートにおけるバッチ培養のための最終的な最良のクローンを同定するため、6ウェルプレートにおけるIgGレベルを、ProtA測定によって決定した。
プール／単一クローンのバッチ分析
産生能および安定性の差を検出するため、Caseyセルカウンターを使用してクローン／プールの細胞数を計数し、3×105細胞/mlの濃度および3.0mlの全容積で平底6ウェルプレートに均一に播種した。全てのバッチ培養物を12日間培養し、4日目、7日目、9日目、11日目、または12日目に、細胞培養上清をヒトIgGレベルについてスクリーニングした。
IgG定量化
一過性実験およびスクリーニングフォーマット（384ウェル〜24ウェル）におけるIgG力価を、ワンステップユニバーサルELISAを使用することによって決定した。バッチ実験における安定プールおよび安定単一クローンの産生能を、プロテインA HPLCによって決定した。
ワンステップユニバーサルELISA
ワンステップユニバーサルELISA（Dianova）を、細胞培養上清からのヒトIgGレベルを決定するために使用した。希釈緩衝液（PBS＋5％(w/v)RPLA1）を使用した、0.3125〜20ng/mlの範囲の抗P-セレクチン抗体（F.Hoffmann-La Roche AG,Basle,Switzerland）の段階希釈を使用して、標準曲線を調製した。0.5μg/mlビオチン化F(ab')2-抗ヒトFc抗体（Jackson laboratories）および0.1μg/mlペルオキシダーゼ標識F(ab')2-抗ヒトFcγ抗体（Jackson laboratories；Suffolk）を含有している95μlの抗体ミックスを、ストレプトアビジンによってコーティングされた96ウェルMTP（StreptaWell,Roche Diagnostics GmbH）へ添加した。1:20,000希釈の細胞培養上清5μlを、プレートへ添加し、1時間インキュベートした。抗体によってコーティングされたプレートを、200μlの洗浄緩衝液（PBS＋0.05％(v/v)Tween20）によって3回洗浄した。100μlのABTS（Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）をプレートへ添加し、492nmの参照波長で、405nmにおいて吸光度を測定した。
ProtA測定
バッチ分析のIgG力価は、ワンステップユニバーサルELISAと組み合わせられたHPLCに基づくクロマトグラフィを使用して、プロテインAによって決定された。
FACS
安定トランスフェクトまたは一過性トランスフェクトされた細胞の（GFP発現細胞に基づく）トランスフェクション効率またはGFP発現レベルを決定するため、蛍光標示式細胞ソートを使用した。一般に、各クローンまたは各プールの5×106個の細胞を、FACSCalibur Flow Cytometer（BD Biosciences,San Diego,CA）を使用して測定した。前方散乱および側方散乱のデータを、細胞サイズ、生存能、および細胞形態学を決定するために使用した。

Claims (23)

  1. （a）・5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
    ・5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
    を含み、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが一方向に配置されている発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、それによって、多数の組換え哺乳動物細胞を入手する工程、ならびに
    （b）多数の組換え哺乳動物細胞から単一または複数の安定にトランスフェクトされた組換え哺乳動物細胞を抗体発現収率に基づいて選択する工程
    を含む、
    安定にトランスフェクトされた組換え哺乳動物細胞を選択する方法。
  2. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
  3. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
  4. 発現ベクターが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. 発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 発現カセットが、軽鎖−重鎖−選択マーカーの順に配置されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. 哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. 哺乳動物細胞が、安定にトランスフェクトされた細胞の選択のため、CHO細胞であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. （a）・5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
    ・5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
    を含む発現ベクターを安定にトランスフェクトされ、抗体を産生している哺乳動物細胞を培養する工程、ならびに
    （b）細胞または培養培地から抗体を回収する工程
    を含み、
    第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、抗体の安定的な産生のため、一方向に配置されている、
    抗体を産生する方法。
  10. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、請求項9記載の方法。
  11. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、請求項9または10記載の方法。
  12. 発現ベクターが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. 発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、請求項9〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. 発現カセットが、軽鎖−重鎖−選択マーカーの順に配置されていることを特徴とする、請求項9〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 哺乳動物細胞がCHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞、およびSP2/0細胞から選択されることを特徴とする、請求項9〜14のいずれか一項記載の方法。
  16. 哺乳動物細胞が、抗体の安定的な産生のため、CHO細胞であることを特徴とする、請求項9〜15のいずれか一項記載の方法。
  17. ・5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
    ・5'から3'への方向に、hCMVプロモーター、抗体重鎖をコードする核酸、bGHポリAシグナル配列、およびhGTターミネーター配列を含む第二の発現カセット
    を含む、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞の選択のための発現ベクター。
  18. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、請求項17記載の発現ベクター。
  19. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸がcDNAであることを特徴とする、請求項17または18記載の発現ベクター。
  20. 第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが、安定にトランスフェクトされた細胞の選択のため、一方向に配置されていることを特徴とする、請求項17〜19のいずれか一項記載の発現ベクター。
  21. 発現ベクターが選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、請求項17〜20のいずれか一項記載の発現ベクター。
  22. 発現カセットおよび選択マーカーが一方向に配置されていることを特徴とする、請求項17〜21のいずれか一項記載の発現ベクター。
  23. 発現カセットが、軽鎖−重鎖−選択マーカーの順に配置されていることを特徴とする、請求項17〜22のいずれか一項記載の発現ベクター。
JP2014547983A 2011-12-22 2012-12-19 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用 Active JP6096802B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11195361 2011-12-22
EP11195361.8 2011-12-22
PCT/EP2012/076203 WO2013092743A2 (en) 2011-12-22 2012-12-19 Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017026502A Division JP6417436B2 (ja) 2011-12-22 2017-02-16 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2015500656A JP2015500656A (ja) 2015-01-08
JP2015500656A5 JP2015500656A5 (ja) 2016-01-28
JP6096802B2 true JP6096802B2 (ja) 2017-03-15

Family

ID=47504950

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014547983A Active JP6096802B2 (ja) 2011-12-22 2012-12-19 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
JP2017026502A Active JP6417436B2 (ja) 2011-12-22 2017-02-16 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
JP2018189605A Pending JP2019030311A (ja) 2011-12-22 2018-10-05 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
JP2019221805A Active JP7096806B2 (ja) 2011-12-22 2019-12-09 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017026502A Active JP6417436B2 (ja) 2011-12-22 2017-02-16 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
JP2018189605A Pending JP2019030311A (ja) 2011-12-22 2018-10-05 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
JP2019221805A Active JP7096806B2 (ja) 2011-12-22 2019-12-09 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用

Country Status (14)

Country Link
US (2) US20160208284A1 (ja)
EP (2) EP2794651B1 (ja)
JP (4) JP6096802B2 (ja)
KR (4) KR102229491B1 (ja)
CN (4) CN107119073A (ja)
CA (2) CA3149402A1 (ja)
ES (1) ES2930215T3 (ja)
HK (1) HK1200848A1 (ja)
HR (1) HRP20221383T1 (ja)
MX (2) MX355624B (ja)
PL (1) PL2794651T3 (ja)
RU (2) RU2639519C2 (ja)
SG (3) SG11201403443WA (ja)
WO (1) WO2013092743A2 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3059319A4 (en) * 2013-10-07 2017-04-26 Prestige Biopharma Pte. Ltd. Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same
CN105255867A (zh) * 2015-10-19 2016-01-20 北京益生合生物科技有限公司 一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用
JP6937309B2 (ja) 2016-01-27 2021-09-22 ジャスト−エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド ハイブリッドプロモーターおよびその使用
US11098310B2 (en) 2016-01-27 2021-08-24 Just-Evotec Biologics, Inc. Expression from transposon-based vectors and uses
US11261462B2 (en) 2016-01-27 2022-03-01 Just-Evotec Biologics, Inc. Inducible expression from transposon-based vectors and uses
EP3528852A4 (en) 2016-10-20 2020-06-03 Sangamo Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF FABRY'S DISEASE
JP7081139B2 (ja) * 2017-12-20 2022-06-07 東ソー株式会社 新規プロモーターおよびそれを含む発現ベクター
WO2022165001A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions of programmed death receptor 1 (pd-1) antibodies and methods of obtaining the compositions thereof
KR102640929B1 (ko) 2023-06-02 2024-02-27 (주) 멥스젠 미세생체조직시스템 형성 장치

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
JP3051411B2 (ja) 1989-03-14 2000-06-12 持田製薬株式会社 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
RU2201449C2 (ru) * 1994-10-14 2003-03-27 Сембайозис Дженетикс Инк. Слитый полипептид, способный к целенаправленному переносу к масляному телу, химерная днк-контрукция, экспрессирующая кассета
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
BR0110610A (pt) 2000-04-11 2003-04-29 Genentech Inc Anticorpos isolados, imunoconjugados, cadeias de polipeptìdeos, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo ou cadeia de polipeptìdeos, método de tratamento de disfunções em mamìferos, método de indução da apoptose de uma célula cancerosa, método para matar uma célula b, método para matar uma célula que expresse um receptor de erbb e usos dos anticorpos isolados
KR100408844B1 (ko) 2000-07-29 2003-12-06 한국산업기술평가원 동물세포 발현벡터
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
ES2620359T3 (es) 2000-10-06 2017-06-28 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células que producen unas composiciones de anticuerpo
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
KR20100018071A (ko) 2001-08-03 2010-02-16 글리카트 바이오테크놀로지 아게 항체 의존적 세포 독성이 증가된 항체 글리코실화 변이체
US7053202B2 (en) 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
KR20050044856A (ko) * 2001-11-16 2005-05-13 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 항체의 폴리시스트론 발현
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
EP1500698B1 (en) 2002-04-09 2011-03-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
BRPI0316779B8 (pt) 2002-12-16 2023-02-28 Genentech Inc Anticorpo anti-cd20 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, composição, artigo manufaturado e formulação líquida
CN100383244C (zh) * 2003-01-07 2008-04-23 西福根有限公司 用于生产重组多克隆蛋白质的方法
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
ME01775B (me) 2003-11-05 2011-02-28 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antitijela sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US7527791B2 (en) 2004-03-31 2009-05-05 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
BR122019012028B1 (pt) 2004-04-13 2023-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpos anti-p-selectina, molécula de ácido nucléico, vetor, e composição
CN101001953B (zh) * 2004-06-17 2013-03-13 惠氏公司 具有三个完整转录单元的质粒和用于诱导hiv免疫反应的免疫原性组合物
WO2007045465A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the recombinant expression of a polypeptide
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008077545A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Selection method
EP2142560A4 (en) * 2007-03-30 2010-12-01 Abbott Lab RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR ELEMENTS (REVE) FOR INCREASING THE EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEINS IN HOST CELLS
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
RU2491344C2 (ru) * 2007-06-29 2013-08-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Промотор
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2329020B1 (en) * 2008-08-28 2013-03-13 Novartis AG Cell surface display of polypeptide isoforms by stop codon readthrough
GB0903207D0 (en) * 2009-02-25 2009-04-08 Ucb Pharma Sa Method for expressing multimeric proteins
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
EP2435473B1 (en) 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN104011075A (zh) 2014-08-27
KR102166824B1 (ko) 2020-10-19
KR102229491B1 (ko) 2021-03-18
US20210024952A1 (en) 2021-01-28
JP2017108753A (ja) 2017-06-22
EP2794651B1 (en) 2022-09-21
MX355624B (es) 2018-04-25
CA3149402A1 (en) 2013-06-27
EP3354660A1 (en) 2018-08-01
SG10201700169PA (en) 2017-02-27
KR20140106585A (ko) 2014-09-03
RU2017140661A3 (ja) 2021-08-09
SG11201403443WA (en) 2014-07-30
EP2794651A2 (en) 2014-10-29
CN107119073A (zh) 2017-09-01
CA2854249C (en) 2022-05-03
RU2639519C2 (ru) 2017-12-21
KR102048556B1 (ko) 2019-11-26
RU2017140661A (ru) 2019-02-12
RU2756910C2 (ru) 2021-10-06
RU2014129727A (ru) 2016-02-20
CN104011075B (zh) 2017-06-06
ES2930215T3 (es) 2022-12-07
MX2014007359A (es) 2014-08-01
SG10201900915WA (en) 2019-03-28
CN113881702A (zh) 2022-01-04
BR112014014239A2 (pt) 2017-12-26
PL2794651T3 (pl) 2022-12-27
KR20190132702A (ko) 2019-11-28
JP6417436B2 (ja) 2018-11-07
WO2013092743A2 (en) 2013-06-27
JP2020054372A (ja) 2020-04-09
CN113896787A (zh) 2022-01-07
MX370481B (es) 2019-12-16
JP7096806B2 (ja) 2022-07-06
JP2019030311A (ja) 2019-02-28
US20160208284A1 (en) 2016-07-21
JP2015500656A (ja) 2015-01-08
WO2013092743A3 (en) 2013-10-03
KR20200032240A (ko) 2020-03-25
CA2854249A1 (en) 2013-06-27
KR102285184B1 (ko) 2021-08-03
KR20210031002A (ko) 2021-03-18
HK1200848A1 (en) 2015-08-14
HRP20221383T1 (hr) 2023-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7096806B2 (ja) 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
JP7057456B2 (ja) 発現ベクター構成、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
BR112014014239B1 (pt) Método para selecionar uma célula recombinante de mamífero transfectada estável, método para produzir um anticorpo e vetor de expressão

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20150428

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151203

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20151203

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161031

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170117

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170130

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170216

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6096802

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250