JP5918782B2 - 新たなハイブリッドプロモーター及びそれを含む組換えベクター - Google Patents

新たなハイブリッドプロモーター及びそれを含む組換えベクター Download PDF

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Description

本発明は、ＣＭＶエンハンサーの全部又は一部、β−アクチンプロモーターの全部又は一部、ＣＭＶプロモーターの全部又は一部、及びβ−アクチンイントロンの全部又は一部が作動可能に連結されたハイブリッドプロモーター、それを含む組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、前記組換えベクター又は形質転換体を含む薬学的組成物、並びに前記組換えベクター又は形質転換体を用いた標的タンパク質の製造方法に関する。
宿主細胞内で標的遺伝子を発現させるためには、細胞内に所望の構造遺伝子を伝達してそれを発現させる発現ベクター及び遺伝子伝達技術を必要とする。ここで、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片を発現させることのできる発現ベクターは、一般にプロモーターやエンハンサーなどの調節要素を含む。これら調節要素は、これらに作動可能に連結された標的遺伝子の発現を促進する。前記発現ベクターは、宿主細胞の種類、発現時期、発現量などに依存して選択され、様々な発現ベクターがその所望の目的を満足させるために開発されている。
Reeck et al., Cell 50: 667, 1987 Creighton, (1993), Posttranslational Covalent Modification of Proteins, W.H. Freeman and Company, New York B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 Seifter, et al., (1990) Meth Enzymol 182: 626-646 Rattan et al., (1992) Ann N Y Acad Sci 663: 48-62 American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981) Manual of Methods for General Bateriology Sambrook J et al., 2001 Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
このような背景の下、本発明者らは標的タンパク質の発現レベルを増加させるのに適したベクターを開発するために鋭意努力した結果、ＣＭＶエンハンサーの全部又は一部、β−アクチンプロモーターの全部又は一部、ＣＭＶプロモーターの全部又は一部、及びβ−アクチンイントロンの全部又は一部が作動可能に連結されたハイブリッドプロモーターが標的タンパク質の発現量を大幅に増加させることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、ＣＭＶエンハンサーの全部又は一部、β−アクチンプロモーターの全部又は一部、ＣＭＶプロモーターの全部又は一部、及びβ−アクチンイントロンの全部又は一部が作動可能に連結されたハイブリッドプロモーターを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ハイブリッドプロモーター及びそれに作動可能に連結された標的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記組換えベクター又は形質転換体を含む薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、１）本発明の形質転換体を培養する段階と、２）前記形質転換体から標的タンパク質の発現を誘導する段階と、３）前記形質転換体又はその培養液から発現した標的タンパク質を得る段階とを含む標的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、抗体又はＤＮＡワクチンの生産に最適化された新規なハイブリッドプロモーターに関する。前記ハイブリッドプロモーターを含む組換えベクターに様々な標的遺伝子を挿入する際に、標的遺伝子の転写及び発現を改善することができる。よって、本発明のハイブリッドプロモーターを含む組換えベクターは、抗体の開発又はＤＮＡワクチンの生産に有用である。
本発明に用いられた基本ベクターであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターの構造を示す図である。 前記ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃベクターにＳＶ４０プロモーターが導入されたｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＶ４０）ベクターの構造を示す図である。 前記ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターにβ−アクチンプロモーターが導入されたｐＧＬ３−ＢＡベクターの構造を示す図である。 本発明に用いられたｐｃＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域を示す図である。 ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに、β−アクチンプロモーター（１．９ｋｂ）及びＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を含むハイブリッドプロモーターが導入されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターの構造を示す図である。 ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに、β−アクチンプロモーター（１．９ｋｂ）、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）、及びβ−アクチンイントロン領域を含むハイブリッドプロモーターが導入されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターの構造を示す図である。 ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに、β−アクチンプロモーター（１５０ｂｐ）、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）、及びβ−アクチンイントロン領域を含むハイブリッドプロモーターが導入されたｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターの構造を示す図である。 ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに、β−アクチンプロモーター（１５０ｂｐ）、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）、β−アクチンイントロン領域、及びＣＭＶエンハンサー領域を含むハイブリッドプロモーターが導入されたｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターの構造を示す図である。 前述した各ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞におけるルシフェラーゼの発現レベルを比較した結果を示す図である。
一態様として、本発明は、ＣＭＶエンハンサーの全部又は一部、β−アクチンプロモーターの全部又は一部、ＣＭＶプロモーターの全部又は一部、及びβ−アクチンイントロンの全部又は一部が作動可能に連結されたハイブリッドプロモーターを提供する。
本発明において、「β−アクチン」という用語は、細胞の骨格をなす細胞骨格の主な構成要素としてほとんどの細胞に存在し、細胞の移動、構造及び維持に関与する高度に保存されたタンパク質を意味する。β−アクチンをコードする遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子（house keeping gene）の性質を有し、外部の条件にそれほど影響されることなく所定の発現量を示す。
本発明において、「プロモーター」という用語は、それに作動可能に連結された遺伝子の転写を許容し、その発現を調節するポリヌクレオチド配列を意味する。前記プロモーターは、ＲＮＡ重合酵素により認識される配列及び転写開始位置を含む。特定の細胞型又は宿主細胞内で標的タンパク質を発現させるためには、適切な機能性プロモーターを慎重に選択しなければならない。例えば、前記プロモーター配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託されており、市販されているか、各供給源からポリヌクレオチド配列内にクローニングされた単数又は複数の別個の要素として入手することができる。
本発明において、「β−アクチンプロモーター」という用語は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン遺伝子の転写活性の調節に関与する構造遺伝子を意味する。プロモーターの転写調節下にあるコード配列の発現に影響を与える場合、前記β−アクチンプロモーターはコード配列に作動可能に連結される。コード配列は、正方向又は逆方向の転写を調節する遺伝子のヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
上記目的を達成するために、β−アクチンプロモーターは、ｉ）配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と、ｉｉ）配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と、ｉｉｉ）ＤＮＡ断片ｉ）及びｉｉ）のヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を有するＤＮＡ断片であり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節活性を有するＤＮＡ断片とからなる群から選択される少なくとも１つのＤＮＡ断片からなるものである。
本発明は、ヌクレオチド配列が前述したＤＮＡ断片の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するＤＮＡ断片を含む。
本発明のβ−アクチンプロモーターは、配列番号１及び２で表される正方向及び逆方向プライマーを用い、β−アクチンプロモーター配列の全部又は一部を鋳型として用いるＰＣＲにより増幅することができる。こうして増幅したβ−アクチンプロモーターは、約１．９ｋｂのサイズ又は約１５０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であってもよい。
５’−ＢＡ １＿Ｆ（ＮｈｅＩ）：５’−ＣＡＧ ＣＴＡ ＧＣＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＡＣ ＣＡＴ ＡＡ−３’（配列番号１）
３’−ＢＡ ４＿Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＧＧＣ Ａ−３’（配列番号２）
当業界で知られているβ−アクチンプロモーターであれば、いかなる種類であっても制限なく本発明に用いることができ、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞のβ−アクチンプロモーターを用いることが好ましい。
配列番号９のＤＮＡ断片は、ＣＨＯ細胞由来のβ−アクチンプロモーター全長をコードする１９３０ｂｐのヌクレオチドを含み、配列番号１０のＤＮＡ断片は、β−アクチンプロモーター活性を有するＵ２０１１４断片をコードする１５４ｂｐのヌクレオチドを含む。
本発明において、「β−アクチンイントロン」という用語は、β−アクチン遺伝子又はその転写産物内に存在する遺伝子の転写を調節する配列、及び前記遺伝子の最終ＲＮＡ産物には含まれない配列を意味する。イントロンのヌクレオチド配列は、アミノ酸配列に関する情報を持たない。
本発明の目的上、本発明のβ−アクチンイントロンは、ｉ）配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と、ｉｉ）ＤＮＡ断片ｉ）を構成するヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を有するＤＮＡ断片であり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節の活性を有するＤＮＡ断片とからなる群から選択されるＤＮＡ断片からなるものであってもよい。
本発明は、前述したＤＮＡ断片の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片を含む。
本発明のβ−アクチンイントロンは、配列番号６及び２で表される正方向及び逆方向プライマーを用い、β−アクチンイントロンのＤＮＡ全部又は一部を鋳型として用いるＰＣＲにより増幅することができる。こうして増幅したβ−アクチンイントロンは、約１ｋｂのサイズのＤＮＡ断片であってもよい。
５’−ＣＢｉｎｔ ＿Ｆ（ＮｈｅＩ）：５’−ＣＡＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＣＣＴ ＴＴＣ−３’（配列番号６）
３’−ＢＡ ４＿Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＧＧＣ Ａ−３’（配列番号２）
本発明において、「ＣＭＶ（cytomegalovirus）」という用語は、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）として知られるウイルス群に属するウイルス属を意味する。ヒトが感染する前記種は、一般にヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）又はヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）として知られている。これは、α-ヘルペスウイルスファミリーとγ-ヘルペスウイルスファミリーに区分され、全てのヘルペスウイルスは、人体に感染すると長期間の潜伏期を有することを特徴とする。
本発明において、「ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）」という用語は、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus; CMV）初期プロモーターを意味する。ｐＣＭＶは、強力な調節要素として知られており、様々な細胞において活性を示す。
本発明において、「ＴＡＴＡボックス」という用語は、相当数の真核生物のプロモーターに含まれる、ＴＡＴＡＡＡのヌクレオチド配列で構成された領域を意味する。通常、前記ＴＡＴＡボックスは、転写開始位置に極めて近接しており（約５０塩基対以内）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（TATA binding protein）が前記領域に結合してＲＮＡ重合酵素の転写開始複合体の形成を補助する役割を果たす。
本発明の目的上、本発明のＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域は、ｉ）配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と、ｉｉ）ＤＮＡ断片ｉ）のヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を有するＤＮＡ断片であり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節の活性を有するＤＮＡ断片とからなるものであってもよい。
本発明は、ＤＮＡ配列が前述したＤＮＡ断片の配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するＤＮＡ断片を含む。
本発明における「ＴＡＴＡボックス」は、プロモーター領域内に存在する転写開始位置のチミン（Ｔ）とアデニン（Ａ）が交互に連結されたものであり、ほとんどの生物種で共通して高度に保存されている。
前記ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域は、配列番号４及び５で表される正方向及び逆方向のプライマーを用い、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域の全部又は一部を鋳型として用いるＰＣＲにより増幅することができる。こうして増幅したＴＡＴＡボックス領域は、約１３０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であってもよい。
５’−ＣＭＶ ＴＡ＿Ｆ（ＳａｌＩ）：５’−ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＧ ＣＧＴ ＧＴＡ ＣＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ−３’（配列番号４）
３’−ＢＧＨ リバースプライミングサイト：５’−ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＧＧ−３’（配列番号５）
本発明において、「ＣＭＶエンハンサー」という用語は、転写開始複合体の他のタンパク質と結合してその関連プロモーターにより行われる転写開始を促進する配列を意味する。
本発明の目的上、ＣＭＶエンハンサーは、ｉ）配列番号１３で表されるＤＮＡ断片と、ｉｉ）前記ｉ）を構成するヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドが欠失、置換又は挿入されたものであり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節の活性を有するＤＮＡ断片とからなる群から選択されるＤＮＡ断片からなることを特徴とするプロモーターであってもよい。
本発明のＣＭＶエンハンサーは、配列番号７及び８で表される正方向及び逆方向プライマーを用い、ＣＭＶエンハンサーのＤＮＡの全部又は一部を鋳型として用いるＰＣＲにより増幅することができる。こうして増幅したＣＭＶエンハンサーは、約５３０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であってもよい。
５’−ＣＭＶ Ｅｎ＿Ｆ（ＭｌｕＩ）：５’−ＣＡＧ ＡＣＧ ＣＧＴ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＡＣＴ−３’（配列番号７）
３’−ＣＭＶ Ｅｎ＿Ｒ（ＮｈｅＩ）：５’−ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＧＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＴＧ−３’（配列番号８）
本発明において、「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」という用語は、ＤＮＡ断片の１つ又は複数のコピーを１０の乗数倍に増幅し、特定の核酸配列の数千〜数百万のコピーを生成する分子生物学の科学的方法を意味する。
前記方法は、１）ＤＮＡ鋳型を加熱して単一鎖ＤＮＡ分子を生成する変性段階と、２）前記単一鎖ＤＮＡ鋳型にプライマーをアニーリングしてプライマー・鋳型ハイブリッドにＤＮＡ重合酵素を結合させるアニーリング段階と、３）ＤＮＡ鋳型鎖に相補的な新しいＤＮＡ鎖を合成し、標的ＤＮＡの指数（幾何学的）増幅をもたらす拡張/伸長段階とからなる繰り返しサイクルを含む温度サイクルに依存する。
ＰＣＲは、定量的又は半定量的条件下で、標的分子の存在を検出し、核酸の開始プール（starting pool）内で標的分子の相対的量を決定する手段を提供する。
本発明において、「下流（downstream）」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’に位置するヌクレオチド配列を意味する。具体的には、下流ヌクレオチド配列は、転写開始位置に続く配列である。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始位置の下流に位置する。
本発明において、「作動可能に連結された（operably linked）」という用語は、プロモーターと第２の配列の間で機能的連結されたことを意味し、ここでプロモーター配列は第２の配列に対応するＤＮＡの転写を開始及び仲介する。特に、前記「作動可能に連結された」という用語は、転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー又はその他）若しくは翻訳調節配列の制御下に標的遺伝子配列の発現（作動）が行われたことを意味する。
本発明の好ましい態様において、前記ハイブリッドプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの全部又は一部、β−アクチンプロモーターの全部又は一部、ＣＭＶプロモーターの全部又は一部、及びβ−アクチンイントロンの全部又は一部を作動可能に連結するように製造された。本発明によるハイブリッドプロモーターは、当業界で知られている一般的なプロモーターに比べて、標的遺伝子の転写及び標的タンパク質の発現効率を大幅に増加させることが確認された（図９参照）。
具体的な態様において、本発明によるハイブリッドプロモーターは、配列番号１３で表されるＣＭＶエンハンサーと、配列番号１１で表されるＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域と、配列番号９で表されるβ−アクチンプロモーターと、配列番号１２で表されるβ−アクチンイントロン領域とを含み、ＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックス、β−アクチンプロモーター及びβ−アクチンイントロンが互いに作動可能に連結されたプロモーターであってもよい。
また、本発明によるハイブリッドプロモーターは、配列番号１３で表されるＣＭＶエンハンサーと、配列番号１１で表されるＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域と、配列番号１０で表されるβ−アクチンプロモーターと、配列番号１２で表されるβ−アクチンイントロン領域とを含み、ＣＭＶプロモーター、ＴＡＴＡボックス、β−アクチンプロモーター及びβ−アクチンイントロンが互いに作動可能に連結されたプロモーターであってもよい。
本発明によるハイブリッドプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、挿入及び欠失変異体、並びにそれらの組み合わせを含んでもよい。ここで用いられる置換変異体は、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの塩基が除去されて他の塩基がその位置に挿入された変異体である。ここで用いられる挿入変異体は、少なくとも１つの塩基がヌクレオチドが配列内の予め決定された部位に導入された変異体である。ここで用いられる欠失変異体は、少なくとも１つの塩基がヌクレオチドから除去された変異体である。ここで、置換、欠失及び挿入の任意の組み合わせは、構成要素の機能が維持されるように行われる。
本発明によるハイブリッドプロモーターのＤＮＡ断片は、そのＤＮＡ配列が前記配列番号１３で表されるＤＮＡ断片、配列番号１１で表されるＤＮＡ断片、配列番号９又は配列番号１０で表されるＤＮＡ断片、及び配列番号１２で表されるＤＮＡ断片と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するＤＮＡ断片を含んでもよい。
本発明において、配列（例えば、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、その他）間の関係における「相同性」という用語は、２つ以上の遺伝子配列間の同一性の割合を意味する。よって、与えられた遺伝子間の相同性が大きいほど、これらの配列間の同一性又は類似性は大きい。２つの遺伝子間に相同性があるか否かは、これらの配列を直接比較して決定するか、厳重な条件下で混成化して決定することができる。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、前記遺伝子が代表的に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有すれば、これらの遺伝子は相同性があるという。
本発明において、「相同」という用語は、全ての文法形態やスペリングの変形において、スーパーファミリー由来のタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）及び異種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖）を含み、「共通の進化起源」を有するタンパク質間の関係を意味する（非特許文献１）。そのようなタンパク質（及びそれらのコード遺伝子）は、高度の配列類似性により反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な使用及び本発明における「相同」は、「非常に高い」などの形容詞で修飾される場合、共通の進化起源を意味するのではなく、配列類似性を意味する。
本発明において、「配列類似性」という用語は、共通の進化起源を有する又は有しないタンパク質のヌクレオチド配列やアミノ酸配列間の同一性や相同性の程度を意味する。具体的には、２つのＤＮＡ配列がＤＮＡ配列の所定の長さに対してヌクレオチドの一致が少なくとも２１％（好ましくは少なくとも約５０％、最も好ましくは約７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）である時、「実質的に相同」又は「実質的に類似」であるという。
本発明において、「実質的に類似」という用語は、少なくとも１つのヌクレオチド塩基の変化が少なくとも１つのアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質の機能的特性には影響を与えない核酸断片である場合を意味する。また、「実質的に類似」は、少なくとも１つのヌクレオチド塩基が核酸断片の機能に影響を与えないが、アンチセンス又は同時抑制技術による遺伝子発現の変化をもたらす核酸断片である場合を意味する。「実質的に類似」は、得られる転写産物の機能的特徴に実質的に影響を与えない、少なくとも１つのヌクレオチド塩基の欠失や挿入などの本発明の核酸断片の修飾をも意味する。よって、本発明は、特定の例示的な配列異常を含むものと解される。前述した各修飾は、コードされた生産物の生物学的活性の維持を判定することのように、当業者によく知られている。
ここで用いられたアミノ酸配列及び塩基配列の類似性、同一性及び相同性は、デフォルトパラメータと共にＦＡＳＴＡを用いて比較する。代案として、同一性調査は、例えばＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．２．９（２００４年５月１２日発表）を用いて行ってもよい。ここで用いられた同一性の値は、一般にデフォルトパラメータを用いて前述したＢＬＡＳＴでアライメント（Alignment）した結果の値である。パラメータの変化がより高い値を示す場合は、最も高い値が同一性の値とみなされる。複数の部位に対して同一性を測定する場合は、最も高い値が同一性の値とみなされる。
他の態様として、本発明は、前記ハイブリッドプロモーター及びそれに作動可能に連結された標的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
本発明において、「組換えベクター」という用語は、標的細胞に所望のポリヌクレオチド配列を伝達するベクターを意味する。このようなベクターは、自己複製又は宿主細胞（例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物固体など）内の染色体に挿入され、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有している。前記組換えベクターは、構造的遺伝子、その発現を調節するプロモーター、さらに、宿主細胞内で機能する様々な調節要素を含んでもよい。動物などの生きた個体の組換えベクターの種類及び調節要素が用いる宿主細胞の種類により変化することは、当業者によく知られている。
本発明の具体的態様において、本発明の組換えベクターは、前記ハイブリッドプロモーターを含んでもよい。より具体的には、本発明は、ＣＭＶエンハンサーの全部又は一部、β−アクチンプロモーターの全部又は一部、ＣＭＶプロモーターの全部又は一部、及びβ−アクチンイントロンの全部又は一部が互いに作動可能に連結されたハイブリッドプロモーターを含む組換えベクターを提供する。
本発明の組換えベクターは、配列番号１３で表されるＣＭＶエンハンサー、配列番号１１で表されるＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域、配列番号９又は配列番号１０で表されるβ−アクチンプロモーター、及び配列番号１２で表されるβ−アクチンイントロン領域が互いに作動可能に連結されたハイブリッドプロモーターを含むものがより好ましい。本発明の組換えベクターは、図８に示す開裂地図を有するｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎであるベクターが最も好ましい。本発明の組換えベクターは標的遺伝子の転写及び標的タンパク質の発現を効果的に誘導することが確認された（図９参照）。
本発明の組換えベクターは、１つ又は複数の複製起源（origin）、選択マーカー、ターミネーターなどの１つ又は複数の調節要素をさらに含んでもよい。
発明において、「選択マーカー」という用語は、核酸作製物又はベクターを含む宿主細胞を選択するためのリーダーとして機能する遺伝子を意味する。前記選択マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、蛍光マーカー、発光マーカー、薬剤選択マーカーなどが挙げられる。前記蛍光マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。前記発光マーカーは、これらに限定されるものではないが、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質を含む。本発明に適した薬剤選択マーカーは、これらに限定されるものではないが、アンピシリン（ampicillin）、ストレプトマイシン（streptomycin）、ゲンタマイシン（gentamycin）、カナマイシン（kanamycin）、ハイグロマイシン（hygromycin）、テトラサイクリン（tetracyclin）、クロラムフェニコール（chloramphenicol）及びネオマイシン（neomycin）などの抗生物質耐性遺伝子を含む。
本発明において、「ターミネーター」という用語は、遺伝子のタンパク質コード領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結とポリＡ配列の付加に関与する配列を意味する。ターミネーターがｍＲＮＡの安定性に寄与し、遺伝子の発現量に影響を与えることはよく知られている。前記ターミネーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＴＡＡＡを含む配列が挙げられる。
標的遺伝子の発現レベルを増加させると共に生体内で免疫反応を引き起こすハイブリッドプロモーターを開発するために、本発明は、様々なプロモーター／エンハンサー配列、ポリＡ配列及びイントロン配列の組み合わせにより、次のベクターを作製した。 ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図１参照） ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＳＶ４０）：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，ＳＶ４０プロモーター，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図２参照） ｐＧＬ３−ＢＡ：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，β−アクチンプロモーター，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図３参照） ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，β−アクチンプロモーター（１．９ｋｂ）−ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したプロモーター，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図５参照） ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，β−アクチンプロモーター（１．９ｋｂ）とＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター，β−アクチンイントロン，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図６参照） ｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，β−アクチンプロモーターのＵ２０１１４部分（１５０ｂｐ）とＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター，β−アクチンイントロン，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図７参照） ｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ：ｆ１ ｏｒｉ，合成ポリＡ／転写休止部位，ＭＣＳ，ＣＭＶエンハンサー，β−アクチンプロモーターのＵ２０１１４部分（１５０ｂｐ）とＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター，β−アクチンイントロン，ｌｕｃ＋，ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル，ルシフェラーゼ，Ａｍｐｒ（図８参照）
標的タンパク質の発現能を確認するために、前述した各組換えベクターをＣＨＯ細胞に形質転換し、その後リポーター遺伝子に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを比較した。対照群としては、本発明に用いられたベクターの基本構造を有し、本発明によるプロモーター及びエンハンサー配列が除去されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターを用いた（図１参照）。その結果、β−アクチンプロモーターを有する組換えベクター（図３のｐＧＬ３−ＢＡ）、１．９ｋｂのβ−アクチンプロモーター及びＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域のハイブリッドプロモーターを有する組換えベクター（図５のｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ）、１．９ｋｂのサイズのβ−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域及びβ−アクチンイントロン領域のハイブリッドプロモーターを有する組換えベクター（図６のｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ）、並びに１５０ｂｐのサイズのβ−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域及びβ−アクチンイントロン領域のハイブリッドプロモーターを有する組換えベクター（図７のｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ）と比較して、ＣＭＶエンハンサー、１５０ｂｐのβ−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター及びβ−アクチンイントロンを融合したハイブリッドプロモーターが導入された組換えベクター（図８のｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ）においてルシフェラーゼの発現レベルが大幅に増加したことが確認された（表１、表２及び図９参照）。
よって、本発明による組換えベクターに、ルシフェラーゼ遺伝子の代わりに標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入した場合、本発明によるハイブリッドプロモーターの活性により、前記標的遺伝子の転写及び発現が増加し、標的タンパク質の大量生産が可能になる。
さらに他の態様として、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
本発明において、「形質転換」という用語は、核酸を宿主細胞内に導入することを意味する。エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム共沈殿（calcium phosphate co-precipitation）、レトロウイルス感染（retroviral infection）、微量注入法（microinjection）、ＤＥＡＥ−デキストラン（DEAE-dextran）、カチオン性リポソーム（cationic liposome）などの当業界で公知の様々な方法を含む、宿主細胞内にＤＮＡを導入する方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、「形質転換体」という用語は、外来ＤＮＡが形質転換により導入された、細胞などの有機体の全部又は一部を意味する。前記宿主細胞の例としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、好ましくは動物細胞又は動物由来細胞であり、最も好ましくはＣＨＯ細胞である。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）などの増幅可能な遺伝子と共に標的遺伝子をＣＨＯ細胞に形質転換すると、必要なタンパク質の発現に対する効果的なプラットフォームを提供することができる。ＤＨＦＲシステムは、ＤＨＦＲ活性が不足するＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−）に頻繁に用いられる。標的遺伝子は、ＤＨＦＲマーカー遺伝子と共に細胞に、通常は同じプラスミドベクターに伝達される。形質転換された細胞のＤＨＦＲ阻害剤、メトトレキサート（ＭＴＸ）への露出によってＤＨＦＲ及び共に形質転換された標的遺伝子の増幅が促進される。ＭＴＸ処理は遺伝子のコピー数を増加させ、特定のタンパク質の生産を向上させる。
さらに他の態様として、本発明は、前記組換えベクター又は形質転換体を有効成分とし、薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。本発明の組成物は、薬学的に有効な量を投与することができる。
本発明において、有効成分に関する「薬学的に有効な量」という用語は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味する。
本発明において、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的製剤又は農業用化学物質（例えば、動物治療剤）の生産に用いられ、有効成分に対して副作用のない物質を意味する。当業者に知られた薬学的に許容可能な担体は、いかなるものでも本発明の薬学的組成物に用いることができる。
経口投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、溶解剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、発色剤及び香料を含んでもよい。
注射投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、緩衝化剤、保存剤、鎮痛剤、溶解剤、等張化剤及び安定化剤を含んでもよい。局部投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤を含んでもよい。
本発明の薬学的組成物は、前述した薬学的に許容可能な担体と共に様々な製剤に剤形化することができる。例えば、経口投与の場合、薬学的組成物は、錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ又はウエハに剤形化することができる。注入投与の場合、薬学的組成物は、単一投与形態のアンプルやマルチ投与容器のような単位剤形に剤形化することができる。薬学的組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル及び持続性剤形に剤形化することができる。
一方、本発明の薬学的組成物に適した担体、賦形剤又は希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、オキシ安息香酸メチル、オキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどが挙げられる。また、本発明の薬学的組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料及び防腐剤をさらに含んでもよい。
本発明の薬学的組成物は、目的の組織に到達可能であれば、あらゆる一般的な経路で投与することができる。腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、経口、局所的、鼻腔内、肺内及び腸内を含む様々な投与経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
しかし、ペプチドは経口投与すると消化されるので、経口投与用薬学的組成物の有効成分は、コーティングされるか、胃内での分解から保護されるように剤形化しなければならない。本発明の薬学的組成物は、注入可能な形態で投与されることが好ましい。また、本発明の薬学的組成物は、標的細胞に有効成分を送達する特定の器具を用いて投与することができる。
本発明の薬学的組成物の投与頻度及び服用量は、有効成分としての薬剤の種類だけでなく、治療する疾患の種類、投与経路、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度を含む様々な関連要素により決定される。本発明の組成物は、単独で又は他の治療剤と共に、順次又は同時に、一回量又は大量に投与することができる。前述した全ての要素に鑑み、副作用を起こすことなく最大効果を得ることのできる最小量は、当業者により容易に決定される。
さらに他の態様として、本発明は、１）本発明の形質転換体を培養する段階と、２）前記形質転換体に標的タンパク質の発現を誘導する段階と、３）前記形質転換体又はその培養液から発現した標的タンパク質を得る段階とを含む標的タンパク質の製造方法を提供する。
本発明において、「標的タンパク質」という用語は、抗体、酵素、サイトカイン、リンフォカイン、接着分子、受容体、及びその誘導体又は断片を意味するが、これらに限定されるものではない。一般に、作用剤もしくは拮抗剤として作用し、かつ／又は治療学的もしくは診断学的適用性を有するあらゆるポリペプチドが標的タンパク質として用いられる。他の標的タンパク質は、例えば抗アポトーシスタンパク質、シャペロン、代謝酵素、グリコシル化酵素、及びその誘導体又は断片を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明において、「ポリペプチド」という用語は、重合体の長さとは関係なく、アミノ酸の重合体を意味する。よって、ポリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。
前記ポリペプチドの化学的な修飾又は発現後の修飾は、特定の態様として本発明に含まれることもあり、排除されることもあるが、前記用語は、発明のポリペプチドの化学的な修飾又は発現後の修飾を特定するものでもなく、排除するものでもない。よって、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂肪基、及びその他の共有結合を含むポリペプチドの修飾は、前記用語の表現に含まれる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合生成、脱メチル化、システイン形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化などのｔＲＮＡ媒介タンパク質へのアミノ酸添加（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）を含む。また、アミノ酸の少なくとも１つの類似体（例えば、非自然に発生したアミノ酸、無関係な生物学的システムにおいてのみ自然発生したアミノ酸、哺乳類のシステムから修飾されたアミノ酸などを含む）、自然又は非自然に発生する、当業界で知られている他の修飾だけでなく、置換されたリンクを有するポリペプチドは、上記定義に含まれる。
本発明の方法により製造できる標的タンパク質の例としては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロンアルファ、ベータ及びガンマ、水溶性タイプＩインターフェロン受容体など）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グルカゴン類似ペプチド類（ＧＬＰ−１など）、Ｇタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptor）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、α-ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼアルファ（agalsidase alpha）、β又はα-Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（platelet-activating factor acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）など）、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質類（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類（angiopoietin）、ヘモグロビン、トロンビン（thrombin）、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン（thrombomodulin）、 血液第ＶＩＩ因子 、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン（hirudin）、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（angiostatin）、アンジオテンシン（angiotensin）、骨髄造血成長因子（myelopoiesis growth factor）、骨髄造血促進因子（myelopoiesis stimulating factor）、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（elcatonin）、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neutrophil inhibitor factor）、神経栄養因子、ニュールツリン（neurturin）など）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（autotaxin）、ラクトフェリン（lactoferrin）、ミオスタチン（myostatin）、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄ）及びウイルス由来ワクチン抗原など様々な種類が挙げられるが、上記の例示された種類に限定されるものではない。抗体断片は、特定の抗原に結合する能力を有するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ又はｓｃＦｖであり、好ましくはＦａｂ’である。
前記標的タンパク質を製造する生産系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであってもよく、ｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ生産系は、真核細胞又は原核細胞を用いるものであってもよい。例えば、本発明の形質転換体をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより、標的タンパク質を得ることができる。形質転換体の培養は当業界における一般的な方法により行うことができ、温度、時間、培地のｐＨなどの条件は適宜調節することができる。培養に用いられる培養培地は、適切な方式で特定の菌株の成長における要求を満たす必要がある。様々な菌株の培養培地は、例えば非特許文献５に開示されている。
培養培地の炭素供給源は、糖及び炭水和物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース）、オイル及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノレン酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）並びに有機酸（例えば、酢酸）であってもよい。前記炭素源は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。窒素供給源はまた、窒素を含む有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉類抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素）であってもよい。前記窒素源は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。リン供給源は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそのナトリウム塩であってもよい。また、前記培養培地は、成長に必要な金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）を含む。最後に、前記培養培地は、前述した物質以外にも、アミノ酸やビタミンなどの生存に必要な物質をさらに含んでもよい。適切な前駆体が前記培養培地に含まれてもよい。培養培地のこれらの成分は、バッチごとに培養培地に添加することもでき、培養過程中に継続して添加することもできる。
前記培養培地のｐＨは、塩基化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸化合物（例えば、リン酸又は硫酸）により調節することができる。脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤が泡の生成防止のために追加されてもよい。好気性状態は、酸素又は酸素を含むガス（例えば、空気）を培養培地に注入することにより維持することができる。
例えば、動物細胞の培養液としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ、Ｆ１０培地、Ｆ１２培地が挙げられる。前記培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清補助剤（serum supplement）を併用してもよく、無血清培養してもよい。さらに、トランスアクチベーターを培地に添加してもよい。培養は、ｐＨ約６．０〜８．０で行われることが好ましい。培養は、通常約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行う。必要に応じて、培地の交換、通気、攪拌を加える。
培養条件は用いる細胞の種類により異なるため、当業者であれば適宜条件を設定することができる。例えば、ＣＨＯ細胞であれば、通常、気相のＣＯ２濃度が０〜４０％、好ましくは２〜１０％の雰囲気下、３０〜３９℃、好ましくは約３７℃で、１〜１４日間培養する。
様々な培養装置が動物細胞の培養に用いられ、発酵槽型タンク培養装置（fermentation tank-type tank culture apparatuses）、エアーリフト型培養装置（airlift-type culture apparatuses）、カルチャーフラスコ型培養装置（culture flask-type culture apparatuses）、スピナーフラスコ型培養装置（spinner flask-type culture apparatuses）、マイクロキャリア型培養装置（microcarrier-type culture apparatuses）、流動層型培養装置、ホローファイバー型培養装置（hollow fiber-type culture apparatuses）、ローラーボトル型培養装置（roller bottle-type culture apparatuses）、充填槽型培養装置（packed bed-type culture apparatuse）などが挙げられる。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏ生産系としては、動物を用いる生産系や植物を用いる生産系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを生産させて回収することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、以下の実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の内容が以下の実施例により限定されるものではない。
一般の分子生物学的技術
制限酵素処理、アガロースゲル電気泳動、ゲル抽出キット（Gel Extraction Kit, QIAGEN）、プラスミドＤＮＡ精製、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ断片の結合、大腸菌の形質転換などの分子生物学で一般に用いる方法は、非特許文献６に紹介された方法に最小限の変更を加えて行った。
プラスミドベクターの作製
＜２−１＞ｐＧＬ３−ＢＡベクターの作製
ＣＨＯ細胞から得た全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、β−アクチンプロモーター遺伝子を増幅し、その増幅した産物をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。こうして得られたβ−アクチンプロモーターＤＮＡ断片（３．０ｋｂ）を、同じ制限酵素で処理されたベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Promega）に挿入してｐＧＬ３−ＢＡベクターを作製した（図３）。ここで、ＰＣＲは、９４℃で５分間変性し、その後９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で３．５分間の重合の過程を２５回繰り返し、最終的に７２℃で７分間伸長した。
５’−ＢＡ １＿Ｆ（ＮｈｅＩ）：５’−ＣＡＧ ＣＴＡ ＧＣＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＡＣ ＣＡＴ ＡＡ−３’（配列番号１）
３’−ＢＡ ４＿Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＧＧＣ Ａ−３’（配列番号２）
図３に示すように、作製されたｐＧＬ３−ＢＡベクターは、ｆ１ ｏｒｉ、合成ポリＡ／転写休止位置、ＭＣＳ、β−アクチンプロモーター、ｌｕｃ＋、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、及びＡｍｐ耐性遺伝子を含む。
＜２−２＞ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターの作製
ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）を鋳型とし、配列番号４及び５のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を増幅し（図４）、その増幅した産物をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。こうして得られたＴＡＴＡボックス領域ＤＮＡ断片を、ｐＧＬ３−ＢＡベクターをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した部位に挿入してｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターを作製した（図５）。ここで、作製されたベクターｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡは、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位がない。ここで、前記ＰＣＲは、最初に９４℃で５分間変性し、その後９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で２．５分間の重合の過程を２５回繰り返し、最終的に７２℃で７分間伸長した。
５−ＣＭＶ ＴＡ＿Ｆ（ＳａｌＩ）：５’−ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＧ ＣＧＴ ＧＴＡ ＣＧＧ ＴＧＧ ＧＡＧ−３’（配列番号４）
３’−ＢＧＨ リバースプライミングサイト：５’−ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＧＧ−３’（配列番号５）
図５に示すように、作製されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターは、ｆ１ ｏｒｉ、合成ポリＡ／転写休止位置、ＭＣＳ、β−アクチンプロモーター（１．９ｋｂ）−ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター、ｌｕｃ＋、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、及びＡｍｐ耐性遺伝子を含む。
＜２−３＞ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターの作製
実施例２−１で作製されたｐＧＬ３−ＢＡベクターを鋳型とし、配列番号６及び２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、β−アクチンイントロン部分を増幅し、その増幅した産物をＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断してβ−アクチンイントロンＤＮＡ断片（１ｋｂ）を得た。また、実施例２−２で作製されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターをＥｃｏＲＶ及びＳａｃＩで切断してＴＡＴＡボックス領域ＤＮＡ断片（３７０ｂｐ）を得た。ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、次いでβ−アクチンイントロンＤＮＡ断片（１ｋｂ）とＴＡＴＡボックス領域ＤＮＡ断片（３７０ｂｐ）を前記ベクターに挿入し、ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターを作製した（図６）。ここで、作製されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／ＢｉｎベクターにはＳａｃＩ制限酵素が２つ存在する。前記ＰＣＲは、９４℃で５分間変性し、その後９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で３．５分間の重合の過程を２５回繰り返し、最終的に７２℃で７分間伸長した。
５’−ＢＡ−ｉｎｔ（ＳａｃＩ）：５’−ＣＡＡ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＡＡ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＣ−３’（配列番号６）
３’−ＢＡ ４＿Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＧＧＣ Ａ−３’（配列番号２）
図６に示すように、作製されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターは、ｆ１ ｏｒｉ、合成ポリＡ／転写休止位置、ＭＣＳ、β−アクチンプロモーター（１．９ｋｂ）−ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター、β−アクチンイントロン、ｌｕｃ＋、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、及びＡｍｐ耐性遺伝子を含む。
＜２−４＞ｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターの作製
実施例２−３で作製されたｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターを鋳型とし、配列番号３及び２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、β−アクチン部分のＵ２０１１４部分をカバーするＤＮＡ断片、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域、及びβ−アクチンのイントロン部分を増幅し、その増幅した産物を制限酵素ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。こうして得られたＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で切断されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに挿入してｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターを作製した（図７）。ここで、前記ＰＣＲは、９４℃で５分間変性し、その後９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１．５分間の重合の過程を２５回繰り返し、最終的に７２℃で７分間伸長した。
５’−Ｕ２０１１４＿Ｆ（ＮｈｅＩ）：５’−ＣＡＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＴ−３’（配列番号３）
３’−ＢＡ ４＿Ｒ（ＨｉｎｄＩＩＩ）：５’−ＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＧＧＣ Ａ−３’（配列番号２）
図７に示すように、作製されたｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターは、ｆ１ ｏｒｉ、合成ポリＡ／転写休止位置、ＭＣＳ、β−アクチンプロモーターのＵ２０１１４部分、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター、β−アクチンイントロン、ｌｕｃ＋、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、及びＡｍｐ耐性遺伝子を含む。
＜２−５＞ｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターの作製
ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）を鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＭＶプロモーターのエンハンサー部分を増幅し、その増幅した産物を制限酵素ＭｌｕＩとＮｈｅＩで切断した。こうして得られたＣＭＶエンハンサーＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で切断されたｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターに挿入してｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターを作製した（図８）。ここで、前記ＰＣＲは、９５℃で５分間変性し、その後９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の重合の過程を２５回繰り返し、最終的に７２℃で７分間伸長した。
５’−ＣＭＶ Ｅｎ＿Ｆ（ＭｌｕＩ）：５’−ＣＡＧ ＡＣＧ ＣＧＴ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＡＣＴ−３’（配列番号７）
３’−ＣＭＶ Ｅｎ＿Ｒ（ＮｈｅＩ）：５’−ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＧＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＴＧ−３’（配列番号８）
図８に示すように、作製されたｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターは、ｆ１ ｏｒｉ、合成ポリＡ／転写休止位置、ＭＣＳ、ＣＭＶエンハンサー、β−アクチンプロモーターのＵ２０１１４部分、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域（１３０ｂｐ）を融合したハイブリッドプロモーター、β−アクチンイントロン、ｌｕｃ＋、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、及びＡｍｐ耐性遺伝子を含む。
プラスミドベクターの試験管内（in vitro）の効能分析
実施例２で作製された各組換えベクターをＣＨＯ細胞に形質転換し、その後ＥＬＩＳＡによりルシフェラーゼ（Luciferase）の発現レベルを調査した。
まず、ＣＨＯ細胞への形質転換は、リポフェクタミン（lipofectamine, Invitrogen）を用いて行った。具体的には、熱失活した１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum, GIBCO-BRL）を含有するＤＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagles's medium, GIBCO-BRL）でＣＨＯ細胞を維持した。培養したＣＨＯ細胞に、β−ｇａｌを含むｐＣＨ１１０ベクターと、実施例２で作製された組換えベクターのそれぞれを同時形質転換した。形質転換１日前に、１ウェル当たり６×１０４個のＣＨＯ細胞を２４ウェルプレート（Falcon）に培養した。
一方、実施例２で作製された各組換えベクター５００ｎｇ、β−ｇａｌ補正のためのｐＣＨ１１０ベクター１５０ｎｇ、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．８３μＬ、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ ２３．９２μＬを入れたチューブ１（１ウェル反応量）と、リポフェクタミン１．２５μＬ、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ ３０μＬを入れたチューブ２（１ウェル反応量）をそれぞれ室温で１５分間放置した。次に、２つのチューブを混合し、さらに１５分間室温で反応させた。培養したＣＨＯ細胞を含むウェルプレートの培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２００μＬに交換し、その後各ウェルに前記混合液を６０μＬずつ添加した。次に、前記ウェルプレートを３７℃にて３時間インキュベータ（５％ＣＯ２）で培養した。培養後、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を各ウェルに２６０μＬずつ添加し、さらに２日間培養した。
２日経過後、各ウェルの培地を除去し、３００μＬのＰＢＳでウェルプレートを洗浄した。各ウェルに１×レポーター溶解緩衝液（Promega）を１００μＬずつ添加して凍結させ、その後再び３７℃で融解した。反応液を常温で軽く振盪し、その後２０μＬずつ分析プレートに移してルシフェラーゼ分析とβ−ｇａｌ分析を行った。β−ｇａｌ分析は形質転換が均一に行われたかを確認するためのものであり、ルシフェラーゼ分析結果をβ−ｇａｌ分析結果により補正した。
表１、表２及び図９に示すように、従来の公知のｐＧＬ３−ＢＡベクターと比較して、ｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターではルシフェラーゼの発現量が増加し、ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡ／Ｂｉｎ及びｐＧＬ３−Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクターではルシフェラーゼの発現量が同程度かやや低いレベルであった。それに対して、ｐＧＬ３−Ｂ／ＣＴＡベクターでは、ｐＧＬ３−ＢＡベクターよりルシフェラーゼの発現量が低かった。しかし、実験毎に補正のためにｐＣＨ１１０ベクターを同時形質転換してβ−ｇａｌ分析を行ったところ、ルシフェラーゼの発現量が高いｐＧＬ３−Ｃｅｈ／Ｕ／ＣＴＡ／Ｂｉｎベクター（３程度）と比較して、β−ｇａｌ値（０．７〜３）が低かった。

＊Luminescent：ベクター内に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子により発現される発光値を示す。
＊β-gal：β−ガラクトシダーゼの発現レベルを示す。
＊β-gal 補正：各プロモーターでβ−ガラクトシダーゼの発現レベルの差を比較するために補正した値を示す。
＊補正 LUC 平均：ルシフェラーゼの発現レベルを平均値で補正した値を示す。
＊Stdev：ルシフェラーゼの発現レベルの標準偏差を示す値である。
本発明は、抗体又はＤＮＡワクチンの生産に最適化された新規なハイブリッドプロモーターを提供する。本発明のハイブリッドプロモーターを含む組換えベクターに様々な標的遺伝子を挿入した場合、標的遺伝子の転写及び発現を高く維持することができる。よって、本発明によるハイブリッドプロモーターを含む組換えベクターは、抗体又はＤＮＡワクチンの開発に有用である。

Claims (18)

  1. ＣＭＶ(Cytomegalovirus)エンハンサー、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス、及び配列番号１２の塩基配列からなるβ−アクチンイントロンを含むハイブリッドプロモーターであって、前記ＣＭＶエンハンサー、前記β−アクチンプロモーター、前記ＣＭＶプロモーター及び前記β−アクチンイントロンは、５‘から３’方向にこの順序で作動可能に連結されたハイブリッドプロモーター。
  2. 前記β−アクチンプロモーターが、
    ｉ）配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、
    ｉｉ）配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、及び
    ｉｉｉ）ＤＮＡ断片ｉ）及びｉｉ）のヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を有するＤＮＡ断片であり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節活性を有するＤＮＡ断片とからなる群から選択される少なくとも１つのＤＮＡ断片からなるものである、請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  3. 前記β−アクチンプロモーターがＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞のβ−アクチンプロモーターである、請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  4. 前記ＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域が、
    ｉ）配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、又は
    ｉｉ）ＤＮＡ断片ｉ）のヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を有するＤＮＡ断片であり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節活性を有するＤＮＡ断片とからなる群から選択されるＤＮＡ断片からなるものである、請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  5. 前記ＣＭＶエンハンサーが、
    ｉ）配列番号１３で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片、又は
    ｉｉ）ＤＮＡ断片ｉ）のヌクレオチド配列において少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を有するＤＮＡ断片であり、プロモーター活性、及びプロモーターの下流に作動可能に連結された標的遺伝子の発現調節活性を有するＤＮＡ断片とからなる群から選択されるＤＮＡ断片からなるものである、請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  6. 前記ハイブリッドプロモーターが、配列番号１３で表されるＣＭＶエンハンサー、配列番号１１で表されるＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域、配列番号９で表されるβ−アクチンプロモーター、及び配列番号１２で表されるβ−アクチンイントロン領域を含むものである、請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  7. 前記ハイブリッドプロモーターが、配列番号１３で表されるＣＭＶエンハンサー、配列番号１１で表されるＣＭＶプロモーターのＴＡＴＡボックス領域、配列番号１０で表されるβ−アクチンプロモーター、及び配列番号１２で表されるβ−アクチンイントロン領域を含むものである、請求項１に記載のハイブリッドプロモーター。
  8. 請求項１のハイブリッドプロモーター及びそれに作動可能に連結された標的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
  9. 前記組換えベクターは、複製開始点、選別マーカー、リポーター遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの発現調節要素をさらに含むものである、請求項８に記載の組換えベクター。
  10. 前記選別マーカーが薬剤耐性遺伝子である、請求項９に記載の組換えベクター。
  11. 前記薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン（ampicillin）、ストレプトマイシン（streptomycin）、ゲンタマイシン（gentamycin）、カナマイシン（kanamycin）、ハイグロマイシン（hygromycin）、テトラサイクリン（tetracyclin）、クロラムフェニコール（chloramphenicol）及びネオマイシン（neomycin）からなる群から選択される抗生剤耐性遺伝子である、請求項１０に記載の組換えベクター。
  12. 前記リポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（green fluorescence protein, GFP）、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescence protein, CFP）、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescence protein, YFP）、赤色蛍光タンパク質（red fluorescence protein, dsRFP）、ルシフェラーゼ（luciferase, Luc）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ（LacZ）及びβ−グルクロニダーゼ（Gus）からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項９に記載の組換えベクター。
  13. 請求項８の組換えベクターが宿主細胞に導入された、形質転換体。
  14. 前記宿主細胞が動物細胞又は動物細胞由来の細胞である、請求項１３に記載の形質転換体。
  15. 前記宿主細胞がＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞である、請求項１４に記載の形質転換体。
  16. 有効成分である請求項８の組換えベクター又は請求項１３の形質転換体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、薬学的組成物。
  17. １）請求項１３の形質転換体を培養する段階、
    ２）前記形質転換体に標的タンパク質の発現を誘導する段階、及び
    ３）前記形質転換体又はその培養液から発現した前記標的タンパク質を得る段階を含む標的タンパク質の製造方法。
  18. 前記標的タンパク質は、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン様ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptors）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン又はサイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子 、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨髄造血成長因子（myelopoiesis growth factor）、骨髄造血促進因子（myelopoiesis stimulating factor）、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１７に記載の製造方法。
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