CN103403166B - 新的杂合启动子及包含其的重组载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杂合启动子，其可操作性地连接有整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV(巨细胞病毒)启动子、及整个或部分的β-肌动蛋白内含子，本发明还涉及一种含有所述杂合启动子的重组载体，一种由所述重组载体转化的转化体，一种含有所述重组载体或杂合启动子的药物组合物，以及一种采用所述的重组载体或转化体制备目标蛋白的方法。本发明所述的杂合启动子能够在真核细胞中诱导目标蛋白高表达。因此，本发明的杂合启动子可有效地用于开发抗体或生产DNA疫苗。

Description

新的杂合启动子及包含其的重组载体
技术领域
本发明涉及一种杂合启动子(hybrid promoter)，其中，可操作地相互连接有整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV启动子、以及整个或部分的β-肌动蛋白内含子；一种含有所述启动子的重组载体；一种经所述重组载体转化的转化体；一种含有所述重组载体或转化体的药物组合物；以及一种利用所述重组载体或转化体制备目标蛋白的方法。
背景技术
为了在宿主细胞中表达目标基因，需要有表达载体，和能够携带感兴趣的结构基因并使其在细胞中表达的基因转移技术。在这方面，能够表达所插入其中的DNA片段的表达载体通常包括调控元件，如启动子或增强子。这类调控元件有利于表达与其可操作地连接的目标基因。表达载体可根据宿主细胞类型、目标基因表达水平、需要表达的类型等来选择，为了达到所需的目的，已经开发出了各种表达载体。
发明内容
技术问题
因此，本发明人尝试开发了一种适于提高目标蛋白表达水平的表达载体，并发现了一种杂合启动子能够显著提高目标蛋白的表达水平，从而完成了本发明，所述杂合启动子中可操作地连接有整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV启动子、及整个或部分的β-肌动蛋白内含子。
解决方案
本发明的一个目的是提供一种杂合启动子，其中，可操作地相互连接有整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV启动子、及整个或部分的β-肌动蛋白内含子。
本发明的另一目的是提供一种重组载体，其含有所述杂合启动子和与其可操作地连接的目标蛋白编码基因。
本发明的又一目的是提供一种引入重组载体的转化体。
本发明的又一目的是提供一种药物组合物，其包含所述重组载体或所述转化体。
本发明的又一目的是提供一种制备目标蛋白的方法，包括以下步骤：
1）培养本发明的转化体；
2）从所述转化体中诱导目标蛋白的表达；和
3）从所述转化体或其培养液中获得所表达的目标蛋白。
本发明的有益效果
本发明涉及一种为生产抗体或DNA疫苗而作优化新型杂合启动子。当多种目标基因插入含有所述杂合启动子的重组载体时，能够增强目标基因的转录和表达。因此，含有本发明杂合启动子的重组载体能够有效地应用于抗体的开发或DNA疫苗的生产。
附图说明
图1显示了用作本发明的起始载体的pGL3-基础载体的结构；
图2显示了pGL3-启动子(SV40)载体的结构，其中pGL3-基础载体中引入了SV40启动子；
图3显示了pGL3-BA载体的结构，其中pGL3-基础载体中引入了β-肌动蛋白启动子；
图4显示了用于本发明pcDNA3.1载体的CMV启动子TATA盒区；
图5显示了pGL3-B/CTA载体的结构，其中，pGL3-基础载体中引入了含有β-肌动蛋白启动子(1.9kb)及CMV启动子TATA盒区(130bp)的杂合启动子；
图6显示了pGL3-B/CTA/Bin载体的结构，其中，pGL3-基础载体中引入了含有β-肌动蛋白启动子(1.9kb)、CMV启动子TATA盒区(130bp)及β-肌动蛋白内含子区的杂合启动子；
图7显示了pGL3-U/CTA/Bin载体的结构，其中，pGL3-基础载体中引入了含有β-肌动蛋白启动子(150bp)、CMV启动子TATA盒区(130bp)及β-肌动蛋白内含子区的杂合启动子；
图8显示了pGL3-Ceh/U/CTA/Bin的结构，其中，pGL3-基础载体中引入了含有β-肌动蛋白启动子(150bp)、CMV启动子TATA盒区(130bp)、β-肌动蛋白内含子区及CMV增强子区的杂合启动子；和
图9显示了由上述各载体转化的CHO细胞中荧光素酶表达水平的比较结果。
最佳实施方式
在一实施例中，本发明提供了一种杂合启动子，其中可操作地相互连接有整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV启动子、以及整个或部分的β-肌动蛋白内含子。
如本文所用，术语“β-肌动蛋白”作为细胞骨架的主要成份存在于大多数细胞类型中，且为参与细胞运动性、结构组织和完整性有关的一类高度保守的蛋白。编码β-肌动蛋白的基因起着管家基因的作用，并能够在不受环境条件限制的情况下维持一定的表达水平。
如本文所用，术语“启动子”指的是允许与其可操作地连接的目标基因进行转录并调控其表达的多聚核苷酸序列。所述启动子包括能被RNA聚合酶识别的序列和转录起始位点。为了在特定的细胞类型或宿主细胞中表达目标蛋白，必须仔细选择适当功能的启动子。例如，一些启动子序列已经收录在诸如GenBank之类的数据库中，并可以从而作为克隆在多聚核苷酸序列内的一个或多个独立元件从商业或个人来源获得。
如本文所用，术语“β-肌动蛋白启动子”指的是参与调控管家基因，β-肌动蛋白的转录活性的结构基因。如果在启动子的转录调控作用下影响编码序列的表达，将β-肌动蛋白启动子可操作地连接于编码序列。可将所述编码序列正向或反向地可操作连接于调控转录的核苷酸序列。
本发明目的在于，本发明的β-肌动蛋白启动子可以由选自下组的一个或多个DNA片段组成：
i）含有如SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的DNA片段，
ii）含有如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的DNA片段，或
iii）在i)和ii）所述DNA片段的核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的缺失、取代或插入的DNA片段，其具有启动子活性和调控可操作地连接于启动子下游的目标基因表达的活性。
本发明可包括与上述DNA片段的核苷酸序列有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性的DNA片段。
本发明的β-肌动蛋白启动子可通过PCR反应扩增，其采用如SEQ ID NO：1和2所示的正向和反向引物以及整个或部分的β-肌动蛋白启动子序列作为模板。所得的β-肌动蛋白启动子可以是大小约1.9kb或150bp的DNA片段。
5′-BA1_F(NheI)：5′-CAG CTA GCG GGA CCA AGA CAG AAC CATAA-3(SEQ ID NO：1)
3′-BA4_R(HindIII)：5′-GTA AGC TTC GGC GAA CTA TAT CAG GGCA-3(SEQ ID NO：2)
本领域已知的任何种类的β-肌动蛋白启动子可用作本发明的β-肌动蛋白启动子而没有特别限制，优选的β-肌动蛋白启动子可以是CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的β-肌动蛋白启动子。
SEQ ID NO：9所示DNA片段含有1930bp的核苷酸序列，其编码CHO细胞来源的β-肌动蛋白启动子全长，SEQ ID NO：10所示DNA片段含有154bp的核苷酸序列，它编码具有β-肌动蛋白启动子活性的U20114片段。
如本文所用，术语“β-肌动蛋白内含子”指的是能调控基因转录的一段序列，它位于β-肌动蛋白基因或其基因转录本之中，且其不包括在基因的最终RNA产物之中。内含子的核苷酸序列不含有氨基酸序列的信息。
本发明目的在于，本发明的β-肌动蛋白内含子可以由下述DNA片段组成：
i）含有如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的DNA片段，
ii）在i)所述DNA片段的核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的缺失、取代或插入的DNA片段，其具有启动子活性和调控可操作地连接在启动子下游的目标基因表达的活性。
本发明可包括与上述DNA片段的DNA序列有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性的DNA片段。
本发明β-肌动蛋白内含子可通过PCR反应扩增，其采用如SEQ ID NO：6和2所示正向和反向引物：并以整个或部分的β-肌动蛋白内含子序列为模板。所得的β-肌动蛋白内含子可以是大小约1kb的DNA片段。
5′-CBint_F(NheI)：5′-CAA GCT AGC GAG CAC AGG CCT TTC-3′(SEQID NO：6)
3′-BA4_R(HindIII)：5′-GTA AGC TTC GGC GAA CTA TAT CAG GGCA-3′(SEQ ID NO：2)
如本文所用，术语“CMV（巨细胞病毒）”属于已知的疱疹病毒科的一个病毒属。人感染的病毒种通常称为人巨细胞病毒（HCMV）或人疱疹病毒-5（HHV-5）。它被归类于α-疱疹病毒科和γ-疱疹病毒科，且所有的疱疹病毒都具有长期潜伏于体内的特征性能力。
如本文所用，术语“CMV启动子（pCMV）”指的是巨细胞病毒（CMV）早期启动子。pCMV公认是强大的调控元件，并在多种细胞中表现出活性。
如本文所用，术语“TATA盒”指的是由TATAAA的核苷酸序列所组成的区域，包括在许多真核启动子内。TATA盒通常非常接近转录起始位点（50个碱基对以内），且TATA结合蛋白会结合在这一区域，以助于形成RNA聚合酶转录复合物。
就本发明目的而言，本发明CMV启动子的TATA盒区可以由以下DNA片段组成：
i）含有如SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的DNA片段，或
ii）在i)所述的DNA片段的核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的缺失、取代或插入的DNA片段，其具有启动子活性和调控可操作地连接在启动子下游的目标基因表达的活性。
本发明可包括与上述DNA片段的核苷酸DNA序列有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性的DNA片段。
如本文所用。术语“TATA盒”指的是位于启动子区转录起始位点的一段交替的胸腺嘧啶（T）和腺嘌呤（A）序列，且它是一个普遍存在于生物体中的高度保守的区域。
所述的CMV启动子的TATA盒区可通过PCR反应扩增，其采用如SEQ IDNOs：4和5所示正向和反向引物，和整个或部分的CMV启动子的TATA盒区作为模板。所得的TATA盒区可以是大小约130bp的DNA片段。
5′-CMV TA_F(SalI):5′-CAG TCG ACT AGG CGT GTA CGG TGG GAG-3′(SEQ ID NO:4)
3′-BGH反向启动位点:5′-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3′(SEQ IDNO:5)
如本文所用，术语“CMV增强子”指的是结合于其他转录起始复合物蛋白的一段序列，并且它能够增强相关启动子所调控的转录起始。
对于本发明的目的，本发明的CMV增强子由下述DNA片段组成：
i)含有如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的DNA片段，或
ii）在i)所述DNA片段的核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的缺失、取代或插入的DNA片段，其具有启动子活性和调控可操作地连接在启动子下游的目标基因表达的活性。
本发明可包括与上述的DNA片段的DNA序列有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性的DNA片段。
本发明的CMV增强子可通过PCR反应扩增，其采用如SEQ ID NO：7和8所示正向和反向引物，并以整个或部分的CMV增强子为模板。所得的CMV增强子可以是大小约530bp的DNA片段。
5′-CMV En_F(MluI)：5′-CAG ACG CGT TGA CAT TGA TTA TTG ACT-3′(SEQ ID NO：7)
3′-CMV En_R(NheI)：5′-CAG GCT AGC AGT TGT TAC GAC ATT TTG-3′(SEQ ID NO：8)
如本文所用，术语“PCR(聚合酶链式反应)”是指一种分子生物学中的科学技术，用来在若干个数量级上扩增单个或几个DNA片段拷贝，生成数以万计的特定DNA序列的拷贝。此方法依据的热循环（方法）包括下述的重复循环步骤：
1）变性步骤：加热DNA模板，生成单链DNA分子，
2）退火步骤：引物退火至单链DNA模板，DNA聚合酶结合至引物-模板杂合体，和
3）扩展/延伸步骤：合成与DNA模板链互补的新DNA链，引起目标DNA的指数式（几何级数的）扩增。
PCR提供了一种在定量或半定量条件下检测靶分子是否存在和在核酸起始库中测定其相对量的手段。
如本文所用，术语“下游”指的是位于参比核苷酸序列3′端的核苷酸序列。具体地，下游核苷酸序列通常涉及其后有转录起始位点的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
如本文所用，术语“可操作地连接”指的是在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中，启动子序列启动并介导第二序列对应的DNA的转录。具体地，术语“可操作地连接”意指目标基因序列的表达（操作）位于转录调控序列（例如，启动子、增强子等）或翻译调控序列的控制之下。
在本发明的一个优选例中，杂合启动子构建如下，将整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV启动子、及整个或部分的β-肌动蛋白内含子可操作地相互连接。业已发现，相比于本领域已知的常规启动子，本发明的杂合启动子能显著促进目标基因的转录和目标蛋白的表达(见图9)。
在另一具体实施例中，本发明的杂合启动子可为包含下述（元件）的启动子：
如SEQ ID NO：13所示的CMV增强子，
如SEQ ID NO：11所示的CMV启动子的TATA盒区，
如SEQ ID NO：9所示的β-肌动蛋白启动子，和
如SEQ ID NO：12所示的β-肌动蛋白内含子区，
其中，CMV启动子、TATA盒、β-肌动蛋白启动子和β-肌动蛋白内含子相互可操作地连接。
此外，本发明的杂合启动子可为包含下述（元件）的启动子：
如SEQ ID NO：13所示的CMV增强子，
如SEQ ID NO：11所示的CMV启动子的TATA盒区，
如SEQ ID NO：10所示的β-肌动蛋白启动子，和
如SEQ ID NO：12所示的β-肌动蛋白内含子区，
其中，CMV启动子、TATA盒、β-肌动蛋白启动子和β-肌动蛋白内含子相互可操作地连接。
本发明的杂合启动子可包括一个或多个核苷酸的取代、插入和缺失变体，及它们的结合。本文所用的取代变体可以是核苷酸序列中的至少一个碱基被除去并被取代为其他碱基的变体。本文所用的插入变体可以是一个或多个碱基被引入核苷酸序列内预先确定区域的变体。本文所用的缺失变体可以是从核苷酸序列中除去一个或多个碱基的变体。就此而言，可以作出取代、缺失和插入的任何结合以维持各部件功能完整。
本发明的杂合启动子可包含DNA片段，其DNA序列与下述DNA片段的DNA序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性：如SEQ ID NO：13所示的DNA片段、如SEQ ID NO：11所示的DNA片段、如SEQ ID NO：9或10所示的DNA片段、及如SEQ ID NO：12所示的DNA片段。
如本文所用，序列（例如，核酸序列、氨基酸序列等）相关的术语“同源性”指的是在两个或多个基因序列之间的相同性比例。因此，两个特定基因之间同源性越高，它们的序列之间的相同性或相似性就越高。两个基因是否具有同源性，是通过直接比较它们的序列或在严格条件下的杂交法来确定的。直接互相比较两个基因序列时，如果基因的DNA序列典型地至少有50%的彼此相同性，则这两个基因就有同源性，较佳地，至少70%的彼此相同性，更佳地，至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的彼此相同性。
如本文所用，术语“同源的”在其所有的语法形式和拼写变化中均指的是两种蛋白质之间的关系，即拥有“共同的进化起源”的蛋白质，包括超家族衍生蛋白（如，免疫球蛋白超家族），以及由不同物种衍生出来的同源的蛋白（例如肌球蛋白轻链）(Reeck等.,Cell50：667,1987)。这些蛋白（及其编码基因）拥有序列同源性，反映为其高度的序列相似性。然而，在普遍用法和本发明的上下文中，由副词（如“高度地”）修饰的术语“同源的”指的是序列相似性，而非共同的进化起源。
如本文所用，术语“序列相似性”指的是具有或不具有共同进化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列的相同性或相关性程度。在某一具体实施例中，当在给定长度的DNA序列上，有至少约21%（较佳地，至少约50%，最佳地，约75%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）的核苷酸匹配时，称两段DNA序列为“实质上同源”或“实质上相似”。
如本文所用，术语“实质上相似”指下述核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的取代，但并不影响其所编码的蛋白的功能特性。“实质上相似”还指下述核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变通过反义或共抑制技术介导基因表达的变化，但不影响其功能特性。“实质上相似”还指核酸片段的修饰，如删除或插入实质上不影响所得转录产物功能特性的一个或多个核苷酸碱基。所以，应理解，本发明（的范围）包括但不限于特定的示范性序列。每一种所提供的修饰均为本领域技术人员所熟知，其是保留所编码产物的生物活性的决定因素。
在本文中，利用FASTA与默认参数比较氨基酸序列和碱基序列的相似性、相同性和同源性。或者，可进行相同性检索，例如用NCBI的BLAST2.2.9（2004.05.12发布）。如本文所用，相同性值通常指应用默认参数，以上述BLAST进行比对的结果的数值。如果参数的改变会导致更高的数值，则在此最高数值用作相同性值。当评估多个区域的相同性时，在此最高数值用作相同性值。
在另一实施例中，本发明提供了一种重组载体，其包含了杂合启动子和与其可操作地连接的目标蛋白编码基因。
如本文所用，术语“重组载体”指的是能将感兴趣的多聚核苷酸序列转移到目标细胞的载体。此类载体能自我复制或结合进宿主细胞染色体（宿主细胞有，例如原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体、和植物个体等），并可在适合本发明多聚核苷酸转录的位点含有启动子。重组载体可包含结构基因和调控其表达的启动子，此外，还有能在宿主细胞中起作用的各种调控元件。本领域熟知，生物活体（如动物）的重组载体类型及所用调控元件的种类可根据所用宿主细胞的类型而改变。
在一具体实施例中，本发明的重组载体可包括杂合启动子。更确切地说，本发明提供包含杂合启动子的重组载体，其中可操作地相互连接有整个或部分的CMV增强子、整个或部分的β-肌动蛋白启动子、整个或部分的CMV启动子、及整个或部分的β-肌动蛋白内含子。
更佳地，本发明的重组载体可包括杂合启动子，其中，可操作地相互连接有如SEQ ID NO：13所示的CMV增强子、如SEQ ID NO：11所示的CMV启动子TATA盒区、如SEQ ID NO：9或10所示的β-肌动蛋白启动子、及如SEQ IDNO：12所示的β-肌动蛋白内含子。最佳地，本发明的重组载体可以是具有图8所示酶切图谱的pGL3-Ceh/U/CTA/Bin载体。现已发现，本发明的重组载体能极有效地诱导目标基因的转录和目标蛋白的表达（见图9）。
本发明的重组载体还可包括一个或多个调控元件，诸如复制起点、选择标记、终止子等。
如本文所用，术语“选择标记”指起到选择包含核酸构建物或载体的宿主细胞的指导作用的基因。选择标记可包括（但不限于）：荧光标记、发光标记和药物选择标记等。荧光标记可包括（但不限于）荧光蛋白编码基因，如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(dsRFP)等。发光标记物可包括（但不限于）发光蛋白编码基因，如荧光素酶。适用于本发明的药物选择标记可包括（但不限于）：抗生素的抗性基因，如氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、匀霉素、四环素、氯霉素、及新霉素。
如本文所用，术语“终止子”指的是位于基因的蛋白编码区域下游的一段序列，其在DNA转录为mRNA时参与转录终止，是一段多聚-A(poly A)序列的增加物。目前已知，终止子对mRNA的稳定性具有贡献，且对基因表达的量有所影响。终止子包括但不限于包含AATAAA的序列。
为了开发通过增加目标基因的表达水平从而在诱导体内免疫反应的合适杂合启动子，本发明通过组合多种启动子/增强子序列、多聚（A）序列和内含子序列，从而制备了下述重组载体：
pGL3-基础：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、多克隆位点(MCS)、荧光素酶报告基因(luc+)、SV40后期多聚腺苷酸化信号、Ampr（见图1）
pGL3-启动子（SV40）：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、SV40启动子、荧光素酶基因(luc+)、SV40后期多聚腺苷酸化信号、氨苄西林抗性基因(Ampr)（见图2）
pGL3-BA：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、β-肌动蛋白启动子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、Ampr（见图3）
pGL3-B/CTA：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含有β-肌动蛋白启动子(1.9kb)和CMV启动子TATA盒区(130bp)的杂合启动子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、Ampr（见图5）
pGL3-B/CTA/Bin：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含有β-肌动蛋白启动子(1.9kb)和CMV启动子TATA盒区(130bp)的杂合启动子、β-肌动蛋白内含子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、Ampr（见图6）
pGL3-U/CTA/Bin：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含有β-肌动蛋白启动子U20114区(150bp)和CMV启动子TATA盒区(130bp)的杂合启动子、β-肌动蛋白内含子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、Ampr（见图7）
pGL3-Ceh/U/CTA/Bin：f1 ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、CMV增强子、含有β-肌动蛋白启动子U20114区(150bp)和CMV启动子TATA盒区的杂合启动子(130bp)、β-肌动蛋白内含子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、Ampr（见图8）
为了检验诱导目标代表表达的能力，将上述重组载体各自转入CHO细胞，然后比较作为报告基因插入的荧光素酶基因的表达水平。pGL3-基础载体用作对照组，其带有本发明所用载体的基础结构但不含本发明的启动子和增强子序列。（见图1）。结果可见，相较于含β-肌动蛋白启动子的重组载体(图3中的pGL3-BA)、含1.9kbβ-肌动蛋白启动子和CMV启动子TATA盒区的杂合启动子的重组载体(图5中的pGL3-B/CTA)、含1.9kb的β-肌动蛋白启动子和CMV启动子TATA盒区及β-肌动蛋白内含子区的杂合启动子的重组载体(图6中的pGL3-B/CTA/Bin)、及含150bp的β-肌动蛋白启动子和CMV启动子TATA盒区及β-肌动蛋白内含子区的杂合启动子的重组载体(图7中的pGL3-U/CTA/Bin)，含有CMV增强子、150bp的β-肌动蛋白启动子、CMV启动子和β-肌动蛋白内含子的重组载体(图8中的pGL3-Ceh/U/CTA/Bin)对荧光素酶的表达水平有显著的增强（见表1、表2和图9）。
因此，已发现，当目标蛋白编码基因，而非荧光素酶基因插入本发明的重组载体时，本发明杂合启动子的活性使得目标基因的转录和表达增强，从而大批量产生目标蛋白。
在另一实施例中，本发明提供了经重组载体转化的转化体。
如本文所用，术语“转化”指的是将核酸引入宿主细胞。任何能将DNA引入宿主细胞的技术均可用于作为转化的方法，包括多种为人所熟知的技术，诸如电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、逆转录病毒感染法、显微注射法、DEAE-葡聚糖法和阳离子脂质体法，但并不仅限于此。
如本文所用，术语“转化体”指的是通过转化引入外源性DNA的整个或部分生物体，如细胞。宿主细胞例子可包括原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等，较佳地为动物细胞或动物细胞衍生的细胞，最佳地为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。将目标基因连同扩增基因，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)，共同转化CHO细胞为表达所需蛋白提供了有效的平台。DHFR系统常用于缺乏DHFR活性(DHFR-)的CHO细胞。目标基因通常在同一质粒载体中与DHFR标记基因一起递送至细胞。将转化的细胞暴露于DHFR酶抑制剂-甲氨蝶呤(MTX)，促进了DHFR及共转化的目标基因扩增。MTX的处理使得特异性蛋白的产量随着基因拷贝数的增加而提高。
在另一实施例中，本发明提供了含有重组载体或转化体作为有效成分以及药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的组合物以药学上的有效量给药。
如本文所用，就有效成分而言，术语“药学上的有效量”指的是，在合理的益处/风险系数下足以表现出预期效果的用量，从而适用于医学治疗。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指的是用于产生药物制剂或农用化学品（如兽用药）、且对有效成分没有不利作用的材料。任何本领域已知的药学上可接受的载体均可用于本发明的药物组合物。
对于口服给药，药学上可接受的载体可包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香味剂。对于注射给药，药学上可接受的载体可包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部给药，药学上可接受的载体可包括基料、赋形剂、润滑剂和保鲜剂(preserving agent)。
本发明的药物组合物可与上述的药学上可接受的载体组合而配制成多种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆或薄片(wafer)。对于注射给药，药物组合物可在安瓿内配制成单剂量剂型或单位剂型，如多剂量容器。药物组合物还可配制成溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊和长效制剂。
另一方面，适用于本发明药物组合物的载体、赋形剂和稀释剂的例子可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。另外，本发明的药物组合物还可包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香味剂和防腐剂(antiseptics)。
本发明的药物组合物可通过任何常规途径给药，只要能够到达所需的组织。考虑了多种给药方式，包括腹膜内、静脉、肌肉内、皮下、皮内、口服、外用(topically)、鼻腔内、肺内和直肠内给药，但并不仅限于此。
然而，由于口服给药后肽类会被消化，所以口服给药的药物组合物的有效成分应有包衣或经配制以便保护免遭胃内降解作用。较佳地，本发明的药物组合物可采用可注射的形式给药。此外，可应用能够将有效成分转运至目标细胞内的某些设备来给予本发明的药物组合物。
本发明药物组合物的给药频率和剂量可根据下述的一些相关因素来确定，包括待治疗疾病的类型、给药途径、患者年龄、性别、体重和疾病的严重程度、以及作为有效成分的药物的类型。本发明的组合物可单独给药或与其他治疗剂顺次或同时地联合给药，或以单剂或多剂量给药。综合上述因素，本领域技术人员不难确定能获得最大功效且无副作用的最小剂量。
在另一实施例中，本发明提供了一种制备目标蛋白的方法，包括以下步骤：
1）培养本发明的转化体；
2）从所述转化体诱导目标蛋白的表达；和
3）从所述转化体或其培养液中获得所表达的目标蛋白。
如本文所用，术语“目标蛋白”包括抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、黏附分子、受体及其衍生物或其片段，但并不仅限于此。通常，所有作为激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的多肽种类均可用以作为目标蛋白。其他的目标蛋白包括：例如，抗凋亡蛋白、伴侣蛋白、代谢酶、糖基化酶及其衍生物或其片段，但并不仅限于此。
如本文所用，术语“多肽”指的是未限定长度的氨基酸聚合物；因此，多肽的定义包括了肽、寡肽、及蛋白。尽管具体实施例中可以包括或排除这些多肽的化学修饰或表达后修饰，但这一术语并不特指或排除本发明多肽的化学修饰或表达后修饰。因此，此术语明确地包含了对多肽的修饰，包括糖基基团、乙酰基基团、磷酸盐基团、脂质基团等的共价结合。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价结合、血红素的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇共价结合、交联反应、环化、二硫键形成、去甲基化、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解法、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸盐化、由转移RNA介导的添加氨基酸至蛋白如精氨酰化、及泛素化，（参见，例如，Creighton，(1993)，《蛋白的翻译后共价修饰》W.H.Freeman andCompany，纽约B.C.Johnson编.,学术出版社，纽约1-12；Seifter等，(1990)，Meth Enzymol 182：626-646；Rattan等，(1992)，Ann N Y Acad Sci663:48-62）。该定义还包括了含有一个或多个氨基酸类似物的多肽（包括，如，非天然存在的氨基酸、仅在无关的生物体系中天然存在的氨基酸、经修饰的哺乳动物体系来源的氨基酸），具有天然或非天然存在的取代的连接键以及本领域已知的其它修饰的多肽。
根据本发明方法制备的目标蛋白的例子可包括但不仅限于：人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体（例如，α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素、I型可溶性干扰素受体等）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSFs）、胰高血糖素样肽（GLP-1等）、G蛋白偶联受体、白细胞介素（如，IL-1受体，IL-4受体等）、酶（如葡萄糖脑苷脂酶、己醛糖酸盐-2硫酸酯酶、α-牛乳糖-A、α-半乳糖苷酶，β或α-L己醛糖酸、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽内切酶、髓过氧化物酶等）、白介素或细胞因子结合蛋白（如IL-18bp、TNF结合蛋白等）、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制物、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、移行生长因子、α-1胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、红细胞生成素、高糖基化红细胞生成素、促血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制素、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板源生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨髓生长因子、骨髓刺激因子、降钙素、胰岛素、心房肽、软骨诱导素、依降钙素、联合组织活化因子、组织因子通道抑制物、卵泡刺激素、孕激素生成激素、孕激素生成激素释放激素、神经生长因子（如、神经生长因子、纤毛状神经营养因子、轴突生长因子-1(axogenesis factor-1)、脑钠肽、胶质细胞衍生神经营养因子、神经生长导向因子(netrin)、嗜中性粒细胞抑制因子、神经营养因子、neuturin等）、甲状旁腺素、松弛肽、赛莱汀(cycretin)、生长调节介素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌激素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、受体（例如，TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体,VEGF受体,B细胞活化因子受体等）、受体拮抗剂(如IL1-Ra等)，细胞表面抗原(如CD2,3,4,5,7,11a,11b,18,19,20,23,25,33,38,40,45,69等)，单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段(如scFv,Fab,Fab′,F(ab′)2和Fd)，病毒源性疫苗抗原。所述的抗体片段可与特异性抗原结合，其包括Fab,Fab′,F(ab′)2,Fd或scFv，优选为Fab′。
上述的目标蛋白生产体系可为体内或体外。体外的生产体系可采用真核或原核细胞。例如，可通过在体外培养本发明的转化体从而获得目标蛋白。可按照本领域常规方法培养转化体，可适当调控诸如温度、时间、培养基的pH等条件。用于培养的培养基需要满足特定菌株在适当方式下的生长需要。各种菌株的培养基公开于，如美国细菌学协会出版的“通用细菌学方法手册”（美国.华盛顿.1981）(Manual of Methods for General Bacteriology"from AmericanSociety for Bacteriology)。用于培养基的碳源可以是糖和碳水化合物（例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、蜜糖、淀粉和纤维素），油和脂肪（例如，大豆油、葵花油、花生油和椰油），脂肪酸（例如，棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸），醇类（例如，丙三醇和乙醇），及有机酸（例如，醋酸）。碳源可以单独使用或混合使用。氮源还可以是含氮有机化合物（如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽汁、玉米浆、大豆粉以及尿素）或含氮非有机化合物（如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵）。氮源可单独或混合使用。磷源可为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其钠盐。此外，培养基必须含有生长必须的金属盐（如硫酸镁或硫酸铁）。最后，除了以上提到的物质外，培养基还包括生长必须的物质如氨基酸和维生素。培养基中还可加入适当的前体。可在培养过程中向培养基中分批或连续加入培养基的诸组分。
例如，用于动物细胞的液体培养基可包括DMEM、MEM、RPM11640、IMDM、F10培养基及F12培养基。培养基可包括血清添加剂，如胎牛血清(FCS)，或可为无血清培养基。此外，可向培养基中加入反式激活因子。较佳地，在pH值约6.0至8.0下进行培养。培养通常在约30至40℃进行大约15至200小时。若需要，可对培养基进行更换、充气或搅拌。
由于培养的条件需随所使用细胞的类型而变化，本领域技术人员可适当地确定适宜的条件。例如，CHO细胞可在0-40%的二氧化碳环境，较佳地2-10%，30-39℃的温度下，较佳地37℃，培养1-14天。
多种培养设备可用于动物细胞，例如发酵罐式培养罐装置、气升式培养装置、培养瓶式培养装置、转瓶式培养装置、微载体式培养装置、流罐式培养装置、中空纤维式培养装置、滚瓶式培养装置、填充床式培养装置或其类似。
同时，体内生产体系可包括，例如，利用动物或植物的生产体系。将感兴趣的DNA引入此类动物或植物，并收集动物或植物体内产出的多肽。
实施方式
在下文中，将结合实施例描述本发明的更多细节。但是，这些实施例仅作说明目的，且本发明不应仅限于这些实施例。
实施例1：通用分子生物学技术
分子生物学通用方法，如限制性酶处理法、琼脂糖凝胶电泳、凝胶提取、质粒DNA纯化、聚合酶链式反应(PCR)、DNA片段连接反应和E.coli转化，根据文献所描述的方法进行并作细微调整（Sambrook J等，2001分子克隆：实验手册(Molecular cloning:A laboratory manual)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）。
实施例2：质粒载体的制备
<2-1>pGL3-BA载体的制备
采用CHO细胞的整个基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：1和2所示引物对，对β-肌动蛋白启动子基因进行PCR扩增，将如此扩增后的PCR产物经限制性内切酶NheI和HindII处理。将所得的β-肌动蛋白启动子DNA片段(3.0kb)插入经相同限制性内切酶处理的pGL3-基础载体（购自普洛麦格公司(Promega)），从而制得pGL3-BA载体（图3）。其中，进行PCR的条件如下：在94℃下进行初始变性反应5分钟；然后进行25次以下循环操作：94℃下进行变性反应1分钟，55℃进行退火1分钟，72℃进行聚合反应3.5分钟；最后在72℃下延长7分钟。
5′-BA1_F(NheI)：5′-CAG CTA GCG GGA CCA AGA CAG AAC CATAA-3′(SEQ ID NO：1)
3′-BA4_R(HindIII)：5′-GTA AGC TTC GGC GAA CTA TAT CAG GGCA-3′(SEQ ID NO：2)
如图3所示，制得的pGL3-BA载体含有f1 ori，合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、β-肌动蛋白启动子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号以及氨苄西林（Amp）抗性基因。
<2-2>pGL3-B/CTA载体的制备
采用pcDNA3.1载体（英杰公司）(Invitrogen)作为模板以及如SEQ ID NO：4和5所示引物对，对CMV启动子TATA盒区(130bp)(图4)进行PCR扩增，将如此扩增后的PCR产物经限制性内切酶SalI和HindIII处理。将所得的TATA盒区的DNA片段插入经限制性内切酶XhoI和HindIII处理的pGL3-BA载体，从而制得pGL3-B/CTAA载体（图5）。所得的载体pGL3-B/CTA不含SalI和XhoI的限制性酶切位点。其中，进行PCR的条件如下：在94℃下进行初始变性反应5分钟；然后进行25次以下循环操作：94℃下进行蛋白变性反应1分钟，55℃进行退火1分钟，72℃下进行聚合反应2.5分钟；最后在72℃下延长7分钟
5-CMV TA_F(SalI)：5′-CAG TCG ACT AGG CGT GTA CGG TGG GAG-3′(SEQ ID NO：4)
3′-BGH反向启动位点：5′-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3′(SEQ ID NO：5)
如图5所示，制得的pGL3-B/CTA载体含有f1ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含β-肌动蛋白启动子(1.9kb)及CMV启动子的TATA盒区(130bp)的杂合启动子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号以及氨苄西林（Amp）抗性基因。
<2-3>pGL3-B/CTA/Bin载体的制备
采用实施例2-1所制备的pGL3-BA载体作为模板和如SEQ ID NO：6和2所示引物对，对β-肌动蛋白内含子区进行PCR扩增，将如此扩增后的PCR产物经限制性内切酶SacI和HindIII处理，从而制得β-肌动蛋白内含子的DNA片段(1kb)。此外，将实施例2-2制得的pGL3-B/CTA载体经限制性内切酶EcoRV和SacI处理，从而制得TATA盒区的DNA片段(370bp)。在pGL3-B/CTA载体经限制性内切酶EcoRV和SacI处理后，将所述的β-肌动蛋白内含子的DNA片段(1kb)和所述的TATA盒区的DNA片段(370bp)插入载体，从而制得pGL3-B/CTA/Bin载体（图6）。所得的载体pGL3-B/CTA/Bin含有两个SacI限制性酶切位点。其中，进行PCR的条件如下：在94℃下进行初始变性反应5分钟；然后进行25次以下循环操作：94℃下进行蛋白变性反应1分钟，55℃进行退火1分钟，72℃进行聚合反应3.5分钟；最后在72℃下延长7分钟。
5'-BA-int(SacI):5'-CAA GAG CTC TCT GGC TAA CTG AGC ACA GGC CTT TC-3'(SEQ ID NO:6)
3'-BA4_R(HindIII):5'-GTA AGC TTC GGC GAA CTA TAT CAG GGC A-3'(SEQID NO:2)
如图6所示，制得的pGL3-B/CTA/Bin载体含有f1 ori，合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含β-肌动蛋白启动子(1.9kb)及CMV启动子的TATA盒区(130bp)的杂合启动子、β-肌动蛋白内含子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号以及Amp抗性基因。
<2-4>pGL3-U/CTA/Bin载体的制备
采用实施例2-3制得的pGL3-B/CTA/Bin载体作为模板和如SEQ ID NO：3和2所示引物对，对覆盖β-肌动蛋白启动子U20114区、CMV启动子的TATA盒区、及β-肌动蛋白内含子的DNA片段进行PCR扩增，将如此扩增后的PCR产物进行限制性内切酶NheI和HindIII处理。将DNA片段插入经相同的限制性内切酶处理的pGL3-基础载体，从而制得pGL3-U/CTA/Bin载体（图7）。其中，进行PCR的条件如下：在94℃下进行初始变性反应5分钟；然后进行25次以下循环：94℃下进行变性反应1分钟，55℃退火1分钟，72℃下进行聚合反应1.5分钟；最后在72℃下延长7分钟。
5′-U20114_F(NheI):5′-CAC GCT AGC TCT CTC TTT TTT TTT TTTTAT-3′(SEQ ID NO:3)
3′-BA4_R(HindIII):5′-GTA AGC TTC GGC GAA CTA TAT CAG GGCA-3′(SEQ ID NO:2)
如图7所示，所制备的pGL3-U/CTA/Bin载体含有f1ori、合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含β-肌动蛋白启动子U20114区和CMV启动子的TATA盒区(130bp)的杂合启动子、β-肌动蛋白内含子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、以及氨苄西林抗性基因。
<2-5>pGL3-Ceh/U/CTA/Bin载体的制备
采用pcDNA3.1载体（英杰公司）作为模板和如SEQ ID NOs：7和8所示的引物对，对CMV启动子的增强子区进行PCR扩增，将如此扩增后的PCR产物进行限制性内切酶MluI和NheI处理。将制得的CMV增强子的DNA片段插入经相同的限制性内切酶处理的pGL3-U/CTA/Bin载体，从而制得pGL3-Ceh/U/CTA/Bin载体（图8）。其中，进行PCR的条件如下：94℃下进行初始变性反应5分钟；然后进行25次以下循环：94℃下进行变性反应1分钟，55℃退火1分钟，72℃进行聚合反应1分钟；最后在72℃下延长7分钟。
5′-CMV En_F(MluI)：5′-CAG ACG CGT TGA CAT TGA TTA TTG ACT-3′(SEQ ID NO：7)
3′-CMV En_R(NheI)：5′-CAG GCT AGC AGT TGT TAC GAC ATT TTG-3′(SEQ ID NO：8)
如图8所示，所制备的pGL3-U/CTA/Bin载体包括f1 ori，合成多聚（A）/转录中止位点、MCS、含有CMV增强子、β-肌动蛋白启动子U20114区和CMV启动子的TATA盒区(130bp)的杂合启动子、β-肌动蛋白内含子、luc+、SV40后期多聚腺苷酸化信号、以及氨苄西林抗性基因。
实施例3：质粒载体的体外有效性试验
将实施例2中制备的每个重组载体转入CHO细胞，然后通过ELISA检测荧光素酶的表达水平。
首先，利用脂质体转染试剂（lipofectamine，英杰公司）将重组载体引入CHO细胞。具体地，将CHO细胞置于添加了10%热灭活FBS（胎牛血清，GIBCO-BRL）的DMEM培养基（达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′smodified Eagles′s medium)，GIBCO-BRL）中维持培养。将实施例2中每个制备的重组载体和含有β-半乳糖苷酶（β-gal）的pCH110载体共转化入培养的CHO细胞。转化前一日，将CHO置于24孔板（法尔孔公司(Falcon)）培养，培养密度为每孔6×104个细胞。
同时，试管1(供1个孔的反应量)中含有500ng由实施例2制得的重组载体、150ng用于修正β-半乳糖苷酶的pCH110载体、0.83μl的转染添加试剂(PlusReagent)、以及23.92μl Opti-MEM，试管2(供1个孔的反应量)中含有1.25μl的脂质体转染试剂以及30ml的Opti-MEM，将试管1和2分别在室温下放置15分钟。然后，将二试管彼此混合，再于室温下反应15分钟。将含有培养CHO细胞的孔板培养基换作200μl的Opti-MEM，然后每孔加入60μl的混合物。将孔板在37℃、5%CO2的环境中孵育3小时。孵育后，每孔加入260μl添加了20%的FBS的DMEM，继续培养2天。
2天后，从各孔中移除培养基，每孔采用300μl PBS进行洗涤。每孔中加入100μl1报告基因裂解缓冲液(1Reporter Lysis Buffer，购自普洛麦格公司)，然后冷冻孔板，再于37℃下解冻。在室温下轻柔振荡反应液，并各取20μl转移入分析板，进行荧光素酶测定以及β-半乳糖苷酶测定。测定β-半乳糖苷酶是为了确定转化是否一致产生，β-半乳糖苷酶的测定结果用于修正荧光素酶的测定结果。
如以下的表1、表2和图10所示，相较于已知的pGL3-BA载体，pGL3-Ceh/U/CTA/Bin载体显示出高荧光素酶表达水平，而pGL3-B/CTA/Bin和pGL3-U/CTA/Bin载体显示出相似的或略低的荧光素酶表达水平。与此相反，pGL3-B/CTA载体显示的荧光素酶表达水平低于pGL3-BA载体。然而，在每个实验中，当通过共转化用于修正的pCH110载体来进行β-半乳糖苷酶测定时，其显示了较低的β-半乳糖苷酶值(0.7-3)，相较于pGL3-Ceh/U/CTA/Bin载体而言，其显示了较高的荧光素酶表达水平。
【表1】
【表2】
*发光强度：代表了插入载体的荧光素酶基因表达后的发光值
*β-半乳糖苷酶：代表了半乳糖苷酶表达水平
*β-半乳糖苷酶修正值：代表了各启动子用于比较半乳糖苷酶表达水平的修正值
*LUC平均修正值：代表了平均修正后的荧光素酶表达水平
*标准差：代表了荧光素酶表达水平的标准偏差
工业应用
本发明提供了一种为抗体或DNA疫苗生产作优化的新型启动子。将各种目标基因插入包含本发明杂合启动子的重组载体，能够提高目标基因的转录和表达。因此，包含本发明杂合启动子的重组载体可用于抗体或DNA疫苗的开发。

Claims (12)

1.一种杂合启动子，其特征在于，其自5'端至3'端由以下组成：
(i)由SEQ ID NO.:13所示核苷酸序列组成的CMV增强子，(ii)由SEQ ID NO.:10所示核苷酸序列组成的β-肌动蛋白启动子，(iii)由SEQ ID NO.:11所示核苷酸序列组成的CMV(巨细胞病毒)启动子的TATA盒区，及(iv)由SEQ ID NO.:12所示核苷酸序列所示的β-肌动蛋白内含子，且所述的CMV增强子、β-肌动蛋白启动子、CMV启动子的TATA盒区以及β-肌动蛋白内含子相互可操作地连接。
2.一种含有如权利要求1所述的杂合启动子以及可操作连接的目标蛋白编码基因重组载体。
3.如权利要求2所述的重组载体，还包括一个或多个选自下组的表达调控元件：复制起始位点、选择性标记物、报告基因、终止子或其组合。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的选择性标记物为药物抗性基因。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的药物抗性基因是选自下组的抵抗抗生素的基因：氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、匀霉素、四环素、氯霉素以及新霉素。
6.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的报告基因为编码选自下组蛋白的基因：绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(dsRFP)、荧光素酶(Luc)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)以及β-葡萄糖醛酸酶(Gus)。
7.一种转化细胞，所述的转化细胞由如权利要求2所述的重组载体引入宿主细胞。
8.如权利要求7所述的转化细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为动物细胞或动物源性细胞。
9.如权利要求8所述的转化细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。
10.一种药物组合物，其含有如权利要求2所述的重组载体或如权利要求7所述的转化细胞作为有效成分，以及药学上可接受的载体。
11.一种制备目标蛋白的方法，包括步骤：
1)培养如权利要求7所述的转化细胞；
2)从所述的转化细胞中诱导目标蛋白的表达；和
3)从所述的转化细胞或其培养液中获得所表达的目标蛋白。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的目标蛋白选自下组：
人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体集落刺激因子、胰高血糖素样多肽、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、白介素或细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制物、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、移行生长因子、α-1胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、红细胞生成素、高糖基化红细胞生成素、促血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、凝血因子VII、VIIa、VIII、IX、XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制素、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板源生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨髓生长因子、骨髓刺激因子、降钙素、胰岛素、心房肽、软骨诱导素、依降钙素、联合组织活化因子、组织因子通道抑制物、卵泡刺激素、孕激素生成激素、孕激素生成激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、赛来汀、生长调节介素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌激素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、受体、受体拮抗剂细胞表面抗原、病毒源性疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段。
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