JP5687469B2 - タンパク質精製方法 - Google Patents
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Description
(1)以下の段階:
1)生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のpHの低伝導度の水溶液状態とし、
2)生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
(2)低伝導度の水溶液の伝導度が、0〜100mMのモル濃度である前記(1)記載の方法。
(3)低伝導度の水溶液のイオン強度が、0〜0.2である前記(1)又は(2)記載の方法。
(4)低伝導度の水溶液の導電率が、0〜300 mS/mである前記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される前記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)水溶液のpHが生理活性タンパク質の等電点以下、かつpH2.0以上である前記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)不純物がDNA夾雑物である(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)不純物がウイルスである(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(9)DNA夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のDNA夾雑物がDNA濃度22.5pg/ml以下である(7)に記載の方法。
(10)生理活性タンパク質が抗体である前記(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)抗体がIgG抗体である前記(10)に記載の方法。
(12)抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記(10)又は(11)に記載の方法。
(13)抗体がヒト型化抗IL−6レセプター抗体である前記(12)記載の方法。
(14)抗体がヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体である前記(12)記載の方法。
(15)抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体(抗PTHrP抗体)である前記(12)記載の方法。
(16)生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記(1)〜(9)のいずれかに記載の方法
(17)粒子をフィルター濾過によって除去する前記(1)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(18)生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整することによって1)の工程を行う、(1)の方法。
(19)生理活性タンパク質が抗体であって、該抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを該抗体の等電点以下のpHに調整することによって1)の工程を行う、(1)の方法。
(20)緩衝液がTris水溶液である前記(18)又は(19)記載の方法。
(21)前記(1)〜(20)のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
(22)前記(1)〜(20)のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。
さらに、抗体にはFab, (Fab')2, Fc, Fc', Fdなどの抗体断片や、1価又は2価以上の一本鎖抗体(scFV)などの再構成したものも含む。
1)生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のpHの低伝導度水溶液状態とし、
2)生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。
1)生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、
2)得られる試料に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整し、
3)生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
1)抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマト
グラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
2)得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整し、
3)生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、不純物がDNAである場合、上記粒子は生理活性タンパク質とDNAとによって形成される複合体であると推定している。タンパク質が等電点より低いpHになることにより正に帯電し、一方、DNAが負に帯電することにより、DNAとタンパク質の複合体が形成されると推定している。さらに、低伝導度の水溶液にすることにより、より複合体が形成されやすくなると考えている。粒子をフィルター除去することによってDNA-生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数%であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約90%を回収することができた。
ウイルス定量法としては、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50(tissue culture infective dose (50%);50%培養細胞感染量)、並びに画分中のウイルス量を定量できるRT/Q-PCRおよびQ-PCRにより測定するが、これらに限定されるものではない。
1.1.試験方法
(1)検討材料(抗体含有試料)
hPM−1抗体(ヒト型化抗IL−6レセプター抗体)産生CHO細胞培養上清液(以下CMと略す)(細胞遠心除去済み:-80℃保存)含有試料は、上記CMを0.22μm Cellulose Acetate(CAと略す)Filter System (CORNING)を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、hPM−1抗体は、国際特許出願公開番号WO92/19759号公報の実施例10に記載されたヒトエロンゲーションファクターIαプロモーターを利用し、特開平8−99902号公報の参考例2に記載された方法に準じて作成した(等電点:pH9.0)。
(2)使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC:L-6200 Intelligent Pump(HITACHI)
L-4200 UV-VIS Detector(HITACHI)
D-2500 Chromato-Integrator(HITACHI)
カラム:HR5/2(Pharmacia社),5mmI.D.×20mmH
Media:POROS 50A(PerSeptive社),0.4ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
粒子検討時
HPLC:Waters PrepLC4000 System(Waters)
Waters2000 System Controller(Waters)
Waters486 Tunable Absorbance Detector(Waters)
Waters741 Data Module(Waters)
分光光度計:U-2000(HITACHI)
カラム:XK26(Pharmacia社),26mmI.D.×100mmH
Media:POROS 50A(PerSeptive社),53ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
(3)分析、定量法
hPM−1定量法:直線濃度勾配法によるPLRP-Sカラム(ポリマーラボラトリーズ社)を用いる逆相HPLCにより定量する。
DNA量測定法:スレッシュホールド総DNA定量法により測定する。測定に先だってDNA抽出操作(DNAエキストラクターキット<和光純薬>等)を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総DNA定量キット(モレキュラーデバイス社製)を用いる。
濁度測定法:粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計U-2000(HITACHI)に供し、660nmにおける吸収を測定する。
1.2.溶出条件の検討
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、hPM−1回収率及び溶出液によるDNA除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表1に示す条件でカラムにかけた。
表1に示す平衡化緩衝液にてプロテインA樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷、その後、洗浄1、洗浄2、溶出と実施する。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中C-P Bufferはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。
また、各溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したところ、塩酸溶出画分(溶出法2、溶出法3)では粒子が生じた。更に、粒子形成とhPM−1回収率及び残存DNA量との相関を求める検討をも行った。
1.3.回収率
各溶出条件におけるhPM−1回収率を測定した。その結果、溶出法1における回収率は98.6%と良好であった。また溶出法2における回収率では83.8%〜97.1%、溶出法2における回収率では83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因(樹脂量:0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討(溶出法2)では安定してhPM−1回収率90%以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、hPM−1の回収率は良好であることが判明した。
1.4.溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表2に示す。
ヒト型化抗PTHrP抗体含有試料(CHO細胞で培養した培養上清を0.45+0.2μm CA SARTOBRAN Pフィルター(sartorius)で濾過したもの)をプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、PTHrP抗体は、国際特許出願公開番号WO98/13388号公報に記載の方法によって作成した(等電点:pH8.3)。
2.1.実験条件
精製装置:AKTA explorer (Amersham Pharmacia Biotech)
カラム:HR5/5, C10, XK-26 (Amersham Pharmacia Biotech)
樹脂:rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷:培養上清直接負荷(pH6.6〜7.5)
溶出画分調整:1M Tris水溶液により各種pHに調整し、0.2μm Cellulose Acetate(以下CAと略す)フィルター濾過によりDNAを除去(以下の(1)において条件を検討)。
2.2.溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインA溶出画分を、1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(未調整(2.7), 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 )に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量を行った。表3に各検討pH及び放置時間と残存DNAの結果示す。
ヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体含有試料(CHO細胞で培養した培養上清)をプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表4に記載の条件により精製した。なお、HM1.24抗原モノクローナル抗体は、国際特許出願公開番号WO98/14580号公報に記載の方法によって作成した(等電点:pH9.0)。
3.1.実験条件
カラム:rProtein A FF, 5 mL (16 mmID x 25 mmH)
流速 :5 mL / min (150 cm / h)
サンプル:培養上清直接負荷
3.2.溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインA溶出画分を、1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(pH = 4.5 - 7.5)に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量及び逆相カラムによるヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表5にDNA量の測定結果を、また表6にヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。
G−CSF含有試料(CHO細胞で培養:中外製薬製)を用いて以下の条件検討を実施した(等電点:pH5.5〜5.7)。
4.1.溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。G−CSF含有試料に低伝導度の酸性溶液(2.5mM HCl水溶液)を添加し、更に20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料DNAを添加した。1.0M Tris 水溶液により以下の各検討pH(pH = 4.3又は6.6)に調整し、続いて0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後、ろ過前後の画分のDNA定量を行った。表7にDNA量の測定結果を示す。
実施例5:hPM−1(ヒト型化抗IL−6レセプター抗体)精製におけるウイルス除去効果
5.1 検討材料(抗体含有試料)
hPM−1抗体(ヒト型化IL−6レセプター抗体)産生CHO細胞培養上清液(CM)(細胞遠心済み:−80℃保存)含有試料に、それぞれX-MuLV、Reo3、MVMを添加後、各CMを0.45μmフィルター(ボトルトップフィルター:CORNING社製)を用いてろ過し、精製検討用に使用した。なお、hPM−1抗体は、実施例1と同様に作成した。なお、使用した各ウイルスはATCC(American Type Culture Collection)から入手した。
5.2 rProtein Column Chromatographyでの精製
5.1で作製したウイルス添加試料をrProtein Column Chromatographyで精製した。具体的な条件は以下の通りである。
機器:AKTA explorer100、AKTApurifier
カラム:XK16/20、XK16/40
樹脂高:11.5 cm
溶出条件
平衡化:1 mol/L NaCl, 20 mmol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄1:1 mol/L NaCl, 20 mmol/L C-P Buffer,
pH7.5±0.2, Conductivity 8.5±0.5 S/m
洗浄2:10 mmol/L C-P Buffer,
pH7.7±0.2, Conductivity 165±20 mS/m
溶出:2.5 mmol/L HCl,
pH2.7±0.2, Conductivity 107±10 mS/m
5.3 低pH処理
5.2で得られた溶出画分を1 mol/L 塩酸でpH3.2 ± 0.1に調整し、室温15±5℃で30分以上保持した。その後、各溶出画分を300 mmol/L Tris溶液でpH7.2 ± 0.1に調整した。そのうちの40.0 mLを、グラスファイバーフィルター(Millipore社製)(0.2μm、PALL社製)を一次側、バイオイナート(0.2μm、PALL社製)(PALL社製のフィルターホルダーに直径15 mmのアジャスターを装着)を二次側になるよう連結したろ過ユニットを用いて0.03 ± 0.01 MPaで加圧ろ過した。
5.4 ウイルスの検出
採取したサンプルは全てTCID50で測定を行った。また、X-MuLVおよびMVMのクリアランス能試験では、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50に加え、画分中のウイルス量を定量できるRT/Q-PCRおよびQ-PCRによる測定を行った。
5.5 結果
5.4の測定の結果を以下の表に示す。
Claims (12)
- 1)抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、モル濃度が0〜50mMであって、pH2.0〜3.9の水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを該抗体の等電点未満かつ4.5以上のpHに調整し、
ここで、pH調整後の溶出液のイオン強度は0〜0.12であり、
2)生じる粒子を除去する、
段階を含む、抗体含有試料中のDNA夾雑物またはウイルスを除去する方法であって、
粒子除去処理後の抗体含有試料中のウイルス力価が、TCID 50 法で1.03(Log 10 /ml)以下である、前記方法。 - 水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される請求項1に記載の方法。
- 粒子除去処理後の抗体含有試料中のDNA夾雑物が、DNA濃度22.5pg/ml以下である請求項1または2に記載の方法。
- アフィニティーカラムが、プロテインAもしくはプロテインGのアフィニティーカラムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がIgG抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗IL−6レセプター抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体(抗PTHrP抗体)である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 粒子をフィルター濾過によって除去する請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1)の工程の緩衝液がTris水溶液である請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用抗体製剤の製造方法。
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