JP5551069B2 - 蛍光焦点変調顕微鏡システムおよびその方法 - Google Patents

Description

本発明は、概して光学顕微鏡に関し、特に、蛍光共焦点光学顕微鏡システムおよびその方法に関する。

様々な光学顕微鏡が開発され、現代の生物学研究および臨床診断において利用されている。これらは、細胞およびその細胞下構造を観察する上で必要である。現代の細胞生物学の起源でもある、３００年以上前における細胞の最初の発見は、顕微鏡が発明されたことの直接的な帰結でもあった。古典的光学顕微鏡は、画像化深度において非常に限定的である。表面の微視的構造のみを観察することが可能であるか、あるいは、サンプルを機械的に薄片化して非常に薄いスライスにする必要がある。

米国特許第３０１３４６７号に記載の共焦点顕微鏡の発明は、その光学的切片化の機能性をもって画像化深度の飛躍的な伸びをもたらした。生体組織においては、２００ミクロンの透過深度を達成した。一般に、共焦点顕微鏡は、蛍光色素と協働することにより、分子感応性および選択性を発揮する。蛍光分子を多光子励起することにより、画像化深度をさらにおよそ７００ミクロン程度まで向上させることができる。しかしながら、多光子顕微鏡は、高価なパルスレーザを使用する必要がある。さらに、パルスレーザ出力は、生細胞に非線形光子誘起損傷を与える。このことは、人間の被験者に対する利用に適さない。

生体組織は、微視的スケールから巨視的スケールまで不均質である。一般に、可視および近赤外の光に対して不透明である。そのため、光子は強力な散乱および吸収を受ける。散乱、とりわけ多重散乱、は、光子の伝播方向を変化させるため、画像学において好ましくない現象である。共焦点顕微鏡でより深く生体組織内部を見ることができない主たる要因は、多重散乱である。非合焦領域からの蛍光発光は合焦容積内へ拡散するため、共焦点ピンホールで十分に排除することができず、その結果、背景信号に含まれることになる。信号対背景の比および空間分解能は、深度が深まるにつれて急速に悪化する。連続する散乱事象間の平均距離である散乱平均自由行程ｌ_ｓは、ヒトの軟組織においては、一般に、およそ１００ミクロン程度である。

従来の広視野顕微鏡は、非常に薄いサンプルしか扱うことができなかったため、共焦点顕微鏡の発明は、その光学的切片化の能力によって、現代の光学顕微鏡に顕著な進歩をもたらした。共焦点顕微鏡においては、サンプルは、合焦ビームで照射され、次から次へとスキャンされ、検出システムが共焦点ピンホールの作用により標本の同一の領域をフォーカスする。理想的な状況下では、サンプルからの非合焦光のほとんどが排除され、焦点からの信号が収集される。

しかしながら、この選択的検出手法は、散乱光子が弾道光子に優越する程度の深さまで焦点がサンプル内部へ入った場合には有効でなくなる。空間的分解能を決定する、点広がり関数は、画像化深度の増大につれて急速に空間的に広がる。ｌ_ｓの数倍を超える深度においては、兄弟なターゲットであれば検出できる場合もあるが、ターゲットが表面からｌ_ｓ程度のところに位置する場合でさえ、高解像度の細部は背景信号によってあっけなくマスクされてしまう。共焦点顕微鏡を用いた細胞下イメージングは、通常、数十ミクロンの最大画像化深度で行われる。

多光子顕微鏡法においては、合焦照射ビームは、さらに、１ピコ秒未満の超短時間ウィンドウ内に凝集される。非線形吸収率が焦点から外れるにつれて急激に減衰するため、この選択的励起法は、１ミリメートル未満の画像化深度において有効である。多光子顕微鏡法は、画像化深度の向上および局所化された光化学によって、共焦点顕微鏡法に代わって急速に広まった。しかしながら、多光子顕微鏡法は、超短パルスのレーザ源を使用する非常に高価な技術である。さらに、単一光子励起の方が、多光子励起よりも好ましい場合もある。非線形光損傷、蛍光プローブの利用可能性、組織自発蛍光背景、および、画像が取得されるまでの速さ、等に課題がある。

光コヒーレンス・トモグラフィは比較的新しい画像化法であり、高解像度の構造画像を得ることが可能である。コヒーレンス・ゲーティングを用いて異なる深度からの信号を分解する。多重散乱光子からの寄与は、大幅に抑制される。なぜなら、それらのコヒーレンス特性は散乱によって失われるからである。本手法によれば、数ミリメートルの画像化深度は容易に達成される。

本手法を網膜域および前側域のイメージングへの適用はすでに商用化されている。本手法の、組織工学による生成物の性質決定、血管の評価、皮膚癌の診断、および、消化管（ＧＩ）の癌の検出への適用について、活発な研究は現在も進行中である。残念なことに、光コヒーレンス・トモグラフィのコントラスト機構は、後方散乱に基づくものであって、蛍光との適合性がない。多くの研究グループが、吸収や二次高調波生成といった分子特異手法を光コヒーレンス・トモグラフィに追加しようと試みている。

しかしながら、これらを組み合わせることによって、様々な制限事項に加え、空間分解能についても大きく譲歩することを余儀なくされる。光コヒーレンス・トモグラフィにおけるコヒーレンス・ゲーティング機構は、所望の信号をピックアップする上で非常に効果的である。多重散乱光が光検出器に到達しようとも、明確な光学距離および偏光状態を有する、後方散乱の、一度だけ散乱された、すなわち、反射光のみが、画像形成のためのフリンジ信号を生成する。フーリエ領域手法により画像化深度および速さは近年さらに改善されている。残念ながら、光コヒーレンス・トモグラフィは蛍光に適用することができない。ヒトの目や管腔器官の精細な構造のインビボにおける視覚化への適用は成功を納めたのだが、分子イメージングの能力は未だ限定的である。

米国特許第３０１３４６７号

このように、限界に対処、あるいは、上述のような従来型の光学顕微鏡に付随した課題を少なくとも軽減する光学顕微鏡が必要である。とくに、深い領域における近回折限界分解能を維持しつつ多重散乱光子が画像形成に含まれることを効果的に避けるための機構を開発する必要がある。

本発明の一態様は、蛍光焦点変調顕微鏡システムを提供する。当該システムは、光線を発生してサンプルのターゲット領域を照射する光源アセンブリと、光線の光路上に配され、光線を第１ビームおよび第２ビームに分離する空間的位相変調器であって、第１ビームは第２ビームに対して平行かつ空間的に離れており、第２ビームは第１ビームと異なる位相遅延で変調される、空間的位相変調器と、第１ビームおよび第２ビームを受けてサンプルのターゲット領域に照射する集束（フォーカシング）アセンブリと、照射されたサンプルのターゲット領域が発したルミネセンス信号を受けて、光検出器によって検出された該ルミネセンス信号を直流（ＤＣ）成分および交流（ＡＣ）成分を有する光電信号へ変換する光検出器アセンブリと、を有する。

本システムの実施形態においては、さらに、プロセッサおよびディスプレイを有する。該プロセッサは、光電信号を受信して、交流成分の交流振幅と直流成分の直流の大きさとの総和からの最大発光強度の計算に基づいてディスプレイ上の画像を処理し、かつ／または、該プロセッサは、光電信号を受信して、光電信号の交流成分の画像に基づいてディスプレイ上の画像を処理する。

空間的位相変調器は、波長走査源、および、差動遅延ラインを備えてよい。波長走査源は、反復的に、光源の波長をスイープ（掃引）し、所定の光路長差を与えるように構成されてよい。空間的位相変調器は、第１ミラーおよび第２ミラーを備えてよい。第２ミラーは第１ミラーに対して可動であり、第２ビームを第１ビームに対して変調してよく、ここで、第２ミラーは、圧電アクチュエータ上に配置され、第１および第２ビーム間の相対的位相シフトは圧電アクチュエータに印加される電圧に依存してよい。空間的位相変調器は、光源が発する光線の経路および照射されたサンプルのターゲット領域から発せられるルミネセンスの経路に沿って配置されてよい。集束アセンブリは、ダイクロイックミラーおよび対物レンズを備えてよい。空間的位相変調器は、光線の経路に関し該ダイクロイックミラーの上流または下流に配されてよい。

本システムは、さらに、サンプルに対して第１ビームおよび第２ビームを走査する走査アセンブリを有してよく、ここでは、走査アセンブリは、サンプルに対して第１ビームおよび第２ビームを走査するステアリングミラーを備えてよく、かつ／または、走査アセンブリは、サンプルを保持するホルダもしくは可動ステージ、および、第１光線および第２光線に対してサンプルを可動的に走査するアクチュエータを備えてよい。

本システムは、さらに、照射されたサンプルのターゲット領域から発せられたルミネセンスの経路上に、サンプルの非ターゲット領域から発せられたルミネセンスが光検出器に到達することを阻止するアパーチャを有してもよい。ここでは、当該アパーチャは、例えば、ピンホール、スリット、ロングパスフィルタ、光ファイバケーブル等でよい。光源は、単一光子励起型、多光子励起型等でよい。光検出器アセンブリは、さらに、光検出器によって検出されたルミネセンス信号を直流成分および交流成分を有する光電信号へ変換する光電子増倍器を有してもよい。

本発明の一態様は、蛍光焦点変調顕微鏡法を実施する方法を提供する。当該方法は、光線を発生してサンプルのターゲット領域へ照射するステップと、光線の光路上に配された空間的位相変調器で光線を第１ビームおよび第２ビームに分離するステップであって、第１ビームは第２ビームに対して平行かつ空間的に離れており、第２ビームは第１ビームと異なる位相遅延で変調される、ステップと、集束アセンブリで第１ビームおよび第２ビームを集束させるステップと、第１ビームおよび第２ビームをサンプルのターゲット領域へ照射するステップと、照射されたサンプルのターゲット領域が発したルミネセンス信号を受けるステップと、光検出器によって検出された該ルミネセンス信号を直流（ＤＣ）成分および交流（ＡＣ）成分を有する光電信号へ変換するステップと、を有する。

本方法の実施形態においては、本方法は、さらに、光電信号の受信、および、交流成分の交流振幅と直流成分の直流の大きさとの総和からの最大発光強度の計算に基づいてディスプレイ上の画像を処理するステップ、かつ／または、光電信号の受信、および、光電信号の交流成分の画像に基づいてディスプレイ上の画像を処理するステップを有する。

光線を分離するステップは、反復的に光源の波長をスイープし、所定の光路長差を与えるステップを含んだ、光線を第１ビームおよび第２ビームに分離するステップを備えてよい。構成を第１ビームおよび第２ビームに分離するステップは、第１ミラーおよび第２ミラーを備えた空間的位相変調器を有してよく、当該空間的位相変調器は、第２ミラーを第１ミラーに対して移動させて第２ビームを第１ビームに対して変調する。第２ミラーは、圧電アクチュエータ上に配置されてよく、当該第２ミラーは、圧電アクチュエータに電圧が印加されることによって第１および第２ビーム間に相対的位相シフトを与える。本方法は、さらに、サンプルに対して第１ビームおよび第２ビームを走査するステップを有してよい。本方法は、さらに、照射されたサンプルのターゲット領域から発せられたルミネセンスの経路上にアパーチャを配置してサンプルの非ターゲット領域から発せられたルミネセンスが光検出器に到達することを阻止するステップを有してもよい。光線を分離する空間的位相変調器は、光源で発せられた光線の経路に沿って配されてよい。空間的位相変調器は、また、照射されたサンプルのターゲット領域から合せられたルミネセンスの経路に沿って配されてもよい。

本発明の実施形態を、非限定的例を用いて完全かつ明確に理解することを目的として、添付の図面と共に以下に説明を記す。以下では、同様の参照数字は、同様の、または、対応する要素、領域、部分を指す。

本発明の実施の形態による、空間的位相変調部を備えた蛍光焦点変調顕微鏡の概略的ブロック図 本発明の実施の形態による空間的位相変調の構成を示す図 本発明の実施の形態による空間的位相変調の構成を示す図 本発明の実施の形態による、波長走査源を有する空間的位相変調器の概略図 本発明の実施の形態による空間的位相変調器の概略図 本発明の実施の形態による、空間的位相変調部を備えた蛍光焦点変調顕微鏡の概略的ブロック図 本発明の実施の形態による蛍光ミクロスフェアの共焦点顕微鏡画像の図 本発明の実施の形態による蛍光ミクロスフェアの焦点変調顕微鏡画像の図 本発明の実施の形態による焦点変調顕微鏡法および共焦点顕微鏡法の信号をデフォーカスの関数として表したグラフ 深度４００ミクロンにおける軟骨細胞の共焦点顕微鏡画像 深度４００ミクロンにおける軟骨細胞の焦点変調顕微鏡画像 本発明の実施の形態による拡大図 本発明の実施の形態による拡大図 本発明の実施の形態による方法のフローチャート

焦点変調顕微鏡システムおよびその方法を開示する。本発明の実施の形態にかかる技術は、分子選択性（特異性）を備え光コヒーレンス・トモグラフィに匹敵する画像化深度を達成すること目標とする。励起光光路において空間的位相変調器を使用することで、焦点が混濁媒質の内部深くにある場合であっても、主として合焦容積のみにおける強度変調が可能となる。検出される蛍光信号における振動成分は、多重散乱によって生じる背景信号と容易に分別可能である。

本実施形態は、共焦点顕微鏡画像および焦点変調顕微鏡画像を同時的に取得することが可能である。焦点変調顕微鏡法の有利点は、組織ファントムおよびニワトリの軟骨組織を用いた一連の画像化実験で実例説明される。従来の共焦点顕微鏡システムよりも向上された画像化透過深度は、本発明の実施の形態による、低ノイズレーザおよび低暗電流光検出器を有する焦点変調顕微鏡によって達成される。

図１に、本発明の実施の形態による蛍光焦点変調顕微鏡システム１０を示す。本システムの設定は、共焦点顕微鏡のそれと類似しており、励起光光源１６と、対物レンズ３０、２次元走査ミラー２８、ダイクロイックミラー２２、レンズ２０、アパーチャ２４、光検出器２６、ならびに、サンプル４０を保持するためのホルダもしくはステージ３２を備えた集束アセンブリとを有する。

光源は、励起光３４を発生させる。空間的位相変調器１８は、励起光光路内に導入され、画像形成のために時変発光信号を取得する。励起ビームは光源において発生される。当該光源には、例えば、レーザ、あるいは、低時間コヒーレンス源等が可能である。しかしながら、励起ビーム３４は、良好な空間コヒーレンスを有してよく、かつ、平行ビームに整形されてもよい。空間的位相変調器は、反射型、あるいは、透過型のいずれも使用可能である。空間的変調器１８は、高変調周波数（ｆ〜ＭＨｚ）を使用可能な程度の高速応答性能を備えてもよい。

プロセッサ３８、メモリ１１８、入力部１１６、および、データ取得（ＤＡＱ）システム１４を備えたパーソナルコンピュータ１２が検出器で検出された信号を処理し、サンプルの画像をディスプレイ１１４に表示させてもよい。

図２Ａ、図２Ｂは、位相変調器の変調パターンを２例示す図である。図２Ａにおいては、アパーチャは、おおよそ同一の面積を有する２つの円形ゾーン５０に分割されている。励起ビーム３４は、同一強度の中心ビーム５２および周辺ビーム５４に分離される。透明（白色）ゾーンを通過する周辺ビームは、一定の位相遅延を受けている。中心ビームの位相は、例えば周波数（ｆ）の高調波信号といった時変信号で変調され、２つのビームの間の位相差は、０およびπの間で択一的に切り替わる。

図２Ｂにおいては、アパーチャ６０は、２つの半円６２、６４に分割されている。位相変調は、影付きゾーン５２、６２のみで実施される。両方の場合において、２つの平行ビームには時変的な位相差が与えられる。両者はダイクロイックミラーを通過し、２Ｄ走査ミラーによって無限補正対物レンズへ偏向される。焦点近傍における励起光強度は、２つの入射ビームの間の位相差に依存する。２つのビームが同位相である場合、両者は互いに建設的に干渉し合い、合焦容積内における強度は最大化される。位相差がπである場合、焦点において２つのビームは互いに破壊的に干渉し合い、光学的パワーは合焦容積のすぐ外側に向けられる。

強度の振動は、同一周波数における位相変調のために生じ、それは焦点周りの領域に限定される。肉厚の組織サンプルにおける他の領域での励起光分布は一定のままである。なぜなら、入射ビームの弾道成分は、焦点においてのみ互いに遭遇するからである。多重散乱された光子は、コヒーレンスを喪失しており、強度変動を生じない。合焦容積からの蛍光発光３６は同一の対物レンズで収集され、２Ｄ走査ミラーによってデスキャンされ（descanned）、ダイクロイックミラーによって反射され、レンズによって集束され、ピンホールを通過して光検出器によって検出される。

他の光学フィルタを光検出器の前に挿入し、光検出器をさらに抑制することも可能である。アパーチャ２４は、ピンホールでよい。また、ピンホールは、小さいコア径を有する光ファイバに置き換えてもよい。ピンホールは、他の光学的構成要素とともにサンプル内の検出容積を規定する。光検出器アセンブリ２６は、例えば線形ＣＣＤ等のような検出器アレイを有してよい。

このような検出器アレイを備えた光検出器アセンブリは、スリット状アパーチャ等と組み合わせて用いてよいし、また、別の実施の形態において、検出器アレイ自身をスリット状アパーチャのように作用させてもよい。

光検出器アセンブリは、光検出器によって検出されたルミネセンス信号を直流成分および交流成分を有する光電信号へ変換する光電子増倍器（光電子増倍管（ＰＭＴ））１０２を備えてよい。

検出容積が合焦容積と一致、あるいは、合焦容積に取り囲まれた場合、検出された光電気信号に大きな交流成分が含まれる。該交流信号の振幅は、蛍光容積内の蛍光分子濃度のみに比例する。本構成は、ピンホール無しでも動作可能である。その場合、交流信号は、焦点周りにおける蛍光濃度の微分変化と関係する。サンプルは、ちょうど従来型の共焦点顕微鏡のように、点ごとに逐一的にスキャンされ、交流の振幅および／または位相の２次元もしくは３次元マップが得られる。これが、本顕微鏡が実現可能な分子特異画像（分子選択的画像）である。

図２Ａ、図２Ｂは、変調パターンの例を示すものであるが、当然の事ながら、これら以外の構成を有する位相変調器も想定されている。それらには、例えば、図２Ａ、図２Ｂに示すよりもより大きな間隔を２つのビームの間に設けるものも含み、アパーチャは、起伏のある境界等を示す鋸歯状アパーチャであってもよい。

空間的位相変調器を実現するための別の手法としては、図３に示す波長走査源８０の利用が挙げられる。波長走査源を備えた空間的位相変調器７０が示されており、光源からの出力ビーム７８は、差動遅延ライン７２を通過する。当該差動遅延ラインは、或る特定の異なる光路長差、例えば、ノンゼロ、を有する２つの平行ビームを生成する。第１ビーム７４は、非変調ビーム８４であり、第２ビーム７６は、変調ビーム８６である。

光源の波長が反復的にスイープ（掃引）された場合、２つのビームの間の位相差も変調される。検出された蛍光発光に含まれる交流信号は、合焦容積のみから到来するため、集束変調法（焦点変調法（focal modulation technique））は、多光子顕微鏡法における選択的励起と等価である。単一光子励起のための本システムの実施の形態においては、低パワーＣＷ光源のみでよい。しかしながら、本質的には、当該手法は、さらに深い画像化深度のために多光子励起と組み合わせることも可能である。

図５は、本システムの別の実施形態を示す図である。図５は、本発明の実施の形態による焦点変調顕微鏡システムプロトタイプ１００の概略図である。図５は、焦点変調顕微鏡システムプロトタイプの概略図である。２つの平行ミラー９０、９２（それぞれＭ１、Ｍ２）を用い、６６０ナノメートル励起ビーム３４の空間的位相分布を変調する。該システムは、ビーム・エキスパンダ１１０を備えてもよい。

図４に詳細に示されるように、Ｍ１は、ビームに対して静止し、Ｍ２は、Ｍ１に対し、軸方向に振動する。Ｍ２は、例えば、５ｋＨｚで振動すればよい。合焦容積からの蛍光発光３６は、ファイバベースの共焦点検出システムによって集められ、そして、５ｋＨｚの振動成分が、画像形成のために取得される。

パーソナルコンピュータ１２は、本システムと相互接続１１２され、プロセッサ３８によるデータ取得および分析（ＤＡＱ）１４、高速ステアリングミラー２８による横方向走査、および、３Ｄステージによる軸方向走査に用いられる。

当然のことながら、走査用のアセンブリを本例と異なるように構成し、サンプル４０を保持するホルダもしくはステージ３２がビームに対して走査されるようにしてもよい。さらに、空間的位相変調器１８は、光源から発せられた光線の光路上に配されるように図示されるが、空間的位相変調器１８は、該光線の光路に沿って別の位置に配されてよく、そして、照射されたサンプルのターゲット領域から発せられるルミネセンスの光路上に、例えば、対物レンズ２０と、ダイクロイックミラー２２もしくは走査ミラー２８との間に、配されてよい。ある実施の形態においては、変調器は、蛍光もまた検出される前に変調器を通過するように、例えば、ビームスプリッタと走査ミラー群との間に、配される。

図８は、本発明の実施の形態による方法２００のフローチャートである。

光線が生成される２０２。光線は、第１ビームおよび第２ビームに分離される２０４。

第２ビームは、第１ビームに対して変調され、第１ビームおよび第２ビームは集束されて２０６サンプルのターゲット領域へ照射される。

検出器は、照射されたサンプルのターゲット領域が発するルミネセンス信号を受け取る２０８。

ルミネセンス信号は、直流成分および交流成分を有する光電信号へ変換される２１０。

光電信号による画像は、コンピュータ１２のプロセッサ１４、３８で処理されディスプレイ１１４上に表示されてよい。プロセッサは、ディスプレイ１１４上の画像を、受信した光電信号、および、交流成分の交流振幅および直流成分の直流の大きさの総和から計算した最大発光強度に基づいて処理してよい。

プロセッサは、ディスプレイ１１４上の画像を、受信した光電信号、および、光電信号の交流成分による画像に基づいて処理してもよい。信号のその他の成分を検出してもよい。例えば、交流信号の位相を、例えば、信号の同相成分および直交成分を検出するロックイン増幅器によって、検出してもよい。

このように、焦点変調顕微鏡システムは、共焦点顕微鏡に基づいている。空間的位相変調器１８は、励起光の光路上に挿設される。光源は、例えば、６６０ナノメートル固体レーザであり、その５ミリワット出力ビームは、直径にして１ミリメートルからおよそ５ミリメートルに拡大される。そのようなレーザの例としては、アメリカ合衆国、ニュー・ジャージー、バリントンのエドムンド・オプティクス・インコーポレイテッドのＮＴ５７−９６８がある。

空間的位相変調器を通過すると、ビームは、２つの空間的に分離されたハーフ・ビームに分割される。これらは、異なる位相遅延を受けている。実施の形態においては、空間的位相変調器は、破線のボックス内の２つの平行ミラー（Ｍ１およびＭ２）で実施されており、これらはそれぞれ、励起ビームの半分を、別のミラーＭ３に向けて偏向する。Ｍ１は、静止したベースにマウントされ、Ｍ２は、圧電アクチュエータ上にマウントされる。このような圧電アクチュエータとしては、アメリカ合衆国、ニュー・ジャージー、ニュートンのトーラブス・インコーポレイテッドのＡＥ０２０３Ｄ０４がある。

２つのハーフ・ビーム間における相対的位相シフトは、圧電アクチュエータに印加される電圧に依存する。本構成においては、単一周波数ｆ＝５ｋＨｚの正弦電圧信号が適当な直流バイアスに重ねられ、相対的位相シフトが周期的に０とπとの間で変化する。空間的位相変調を受けた励起光は、Ｍ３で偏向され、５０／５０ビームスプリッタ（ＢＳ）もしくはダイクロイックミラーを通過し、２次元高速ステアリングミラーによって２０Ｘ対物レンズへ向けられる。

ステアリングミラーとしては、例えば、アメリカ合衆国、カリフォルニア、アーバインのニューポート・コーポレーションのＦＳＭ−３００−０１を使用することができる。対物レンズとしては、例えば、日本国、東京のオリンパス・インコーポレイテッドのＬＵＣＰＬＦＬＮ２０Ｘを使用することができる。

空間的位相分布の変化により、対物のアパーチャへ入射する励起光は、必ずしも焦点に収束しない。その結果、当該焦点周りでの励起光強度変調が実現される。焦点が混濁媒質内に含まれる場合、焦点に到達する励起光子には、弾道的、非散乱光子および散乱光子の両方が含まれる。弾道光子はよく定まった位相および偏光極性を有するため、弾道光子のみが、振動する励起率（励起レート）に寄与する。たとえあったとしても、蛍光発光は、同じ対物レンズで集光され、同じ高速ステアリングミラーでデスキャンされる（de-scanned）。

ロングパスフィルタ１０６を用いて６６０ナノメートルの励起光が排除される。ロングパスフィルタとしては、例えば、アメリカ合衆国、バーモント、ブラットルボロのオメガ・オプティカル・インコーポレイテッドの３ＲＤ６７０を使用することができる。そして、蛍光は、アクロマート１０８でフォーカスされ、単一モード光ファイバ１１９へ接続される。これは、検出ピンホールとして機能することができる。

光電子増倍管（ＰＭＴ）１０２が、光ファイバで案内された弱い光信号を電気信号へ変換する。そして、４０デシベル増幅器１０４で強化されてから、パーソナルコンピュータ１２でデジタイズされる。取得した光電信号は、直流成分、変調励起に起因する５キロヘルツの交流成分、および、ランダムノイズを含む。光電子増倍管１１６としては、例えば、日本国のハママツ・フォトニクス・カンパニーのＲ７４００Ｕ−２０を使用することができる。

パーソナルコンピュータ上で高速フーリエ変換（ＦＦＴ）が実行され、交流信号および直流信号の両方が取得される。交流振幅および直流の大きさの総和は、最大発光強度に等しいから、従来の共焦点顕微鏡信号と等価である。しかしながら、焦点変調顕微鏡は、画像形成において交流成分のみを使用する。パーソナルコンピュータ１２は、２次元高速ステアリングミラーを制御してサンプルを次々と、ポイント・ツー・ポイントで、走査し、共焦点顕微鏡画像および焦点変調顕微鏡画像の両方を同時的に取得する。

蛍光ミクロスフェアのイメージング
組織ファントムでイメージングを行い、焦点変調顕微鏡の散乱媒質における光学切片化性能を明らかにした。例えばアメリカ合衆国、カリフォルニア、カールスバッドのインビトロゲン・インコーポレイテッドのフルオスフェアス（FluoSpheres）Ｆ８８４３といったスカーレット蛍光ポリスチレンミクロスフェアを、カバースリップの表面に分布させた。該ミクロスフェアの励起／発光ピークは、それぞれ６４５／６８０ナノメートルである。

例えば、オリンパス・インコーポレイテッドのＬＵＣＰＬＦＬＮ２０Ｘといった２０Ｘの対物レンズを用いた当該ミクロスフェアの直接イメージングでは、横方向および軸方向の分解能（解像度）に関して共焦点顕微鏡法による画像と焦点変調顕微鏡法による画像との間に瑣末な差違が見られる。次に、白色ののり（ホワイトグルー、white glue）で形成した均一散乱層で蛍光層を覆った。当該散乱層の厚さは、約１００ミクロン、およそｌ_ｓの２倍、であった。そして、サンプルを、例えば、最小増分移動５０ナノメートルのトーラブス・インコーポレイテッドのＴ２５ＸＹＺ／Ｍといった３軸モータ駆動移動ステージに載置した。

図６Ａは、励起ビームを小さなミクロスフェアの上端表面に合焦させた場合に得られるミクロスフェアの共焦点顕微鏡画像の図である。図６Ｂは、同時に得た焦点変調顕微鏡画像の図である。本図のほうがより明確に表面の細部を示している。見て明らかだが、焦点変調顕微鏡画像の中央部にあるミクロスフェアでは、中心部が暗く、その境界部のみを見ることが可能である。その理由としては、このミクロスフェアが他よりも大きく、その上端部表面が非合焦状態になったことが挙げられる。逆に、同一のミクロスフェアは、共焦点顕微鏡画像においては、無損傷で他と殆ど同じ明るさで見ることができる。さらに、光学切片化能力について比較すれため、移動ステージを増分４ミクロンで移動させながら、同一物を軸方向に走査した。

図６Ｃにおいては、ミクロスフェアが合焦面にあるときのピーク値で正規化した信号レベルを、デフォーカスΔＺの関数としてプロットしている。焦点変調顕微鏡信号は、およそ７ミクロンのＦＷＨＭ（半値全幅）内に収まっており、この値は、対物レンズの被写界深度（〜６．５ミクロン）と同程度である。共焦点顕微鏡信号のピーク位置は、僅かに後方へシフトしており、そのＦＷＨＭは、およそ２３ミクロンまで増加した。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃに見られるように、およそ４００ミクロン程度の画像化震度が実現されている。

図６Ａおよび図６Ｂは、厚さ２ｌ_ｓの散乱媒質に覆われた蛍光ミクロスフェアの画像である。図６Ａは、当該蛍光ミクロスフェアの共焦点顕微鏡画像１２０である。図６Ｂは、同時的に得られた焦点変調顕微鏡画像１２２である。本図では高解像度で細部が見られる。図６Ｃは、デフォーカスの関数として、共焦点顕微鏡信号１３２および焦点変調顕微鏡信号１３４をプロットしたグラフ１３０である。焦点変調顕微鏡による非常に狭い軸方向プロファイルは、光学切片化性能が散乱によって低下しないことを示している。

ニワトリ軟骨組織の軟骨細胞のイメージング
細胞および細胞内の構造および機能のインビボイメージングの方法を実際に示すために、ニワトリ軟骨組織をサンプル組織として焦点変調顕微鏡のパフォーマンスの評価を行った。軟骨細胞は、軟骨組織において見られる唯一の細胞である。当該細胞は、通常、丸い、あるいは、はっきりとした角を有する形状であって、２つもしくはそれより多くのグループになって、腺もしくは均質なマトリックスにある。脂溶性蛍光トレーサを用いて細胞膜をラベルし、蛍光焦点変調顕微鏡画像および共焦点顕微鏡画像において軟骨細胞のみが可視となるようにする。

ニワトリ軟骨組織を厚さおよそ１ミリメートルのスライスにカットし、発光ピーク７８０ナノメートルの脂溶性トレーサ、ＤｉＲ（ＤｉｌＣ_１８（７））でラベルした。２２０ミクロンから４００ミクロンまで、様々な深度にて、焦点変調顕微鏡システムプロトタイプを用いてサンプルを走査した。深度およそ２２０ミクロンにて、共焦点顕微鏡画像を取得した。個々のセルの境界部はぼやけており、それらは全て類似した形状を有する。

対応する焦点変調顕微鏡画像においては、より高い分解能およびよりよいコントラストがはっきりと見られる。深度２８０ミクロンにて、共焦点顕微鏡画像では背景信号がより強大になる。合焦深度の外側にある細胞がその影を投影し、合焦面内にある細胞との区別をつけることができない。彩度、焦点変調顕微鏡画像を取得すると、その光学切片化能力および空間分解能は低下していなかった。このことは、細胞密度の正確な推定、ならびに、細胞形態および蛍光色素の部位特異的結合効率の研究にとって極めて重要である。

組織サンプルの準備
新鮮なニワトリの翼を取得し、軟骨組織を厚さ１ミリメートルのスライスにカットする。当該軟骨組織スライスをＰＢＳで洗浄し、摂氏４度で２４時間かけて４％パラホルムアルデヒドで固定化する。固定化された組織を、摂氏４度で２４時間以上、エタノール中１ｍＭ ＤｉＲ（ＤｉｌＣ_１８（７）、インビトロゲン）に浸漬し、深い領域において適切な細胞の染色を可能とする。ラベル付けしたサンプルをＰＢＳでリンスしてから、例えば、アメリカ合衆国、ミズーリ、セントルイスのシグマ−アルドリッチの製品番号１０９８１といったフェーディング防止ポリビニルアルコール封入剤（antifading polyvinyl alcohol mounting medium）を用いてスライドガラス上に載置し、カバーガラスで覆った。

焦点変調顕微鏡画像および共焦点顕微鏡画像を取得する際、正確なモータ駆動位置決めを行うために３軸ステージ上にサンプルを載置した。焦点変調顕微鏡画像および共焦点顕微鏡画像は、ポイント毎の、ポイント・ツー・ポイントの走査によって同時的に得られた。各ピクセルにおける休止時間は、画像化深度および信号強度に従属するようにして１ミリ秒から２０ミリ秒まで変化させた。各画像は、刻み幅０．５ミクロンの２００かける２００ピクセルからなり、４００かける４００ピクセルに補間された。ニワトリ軟骨組織を用いた画像化実験においては、例えば、トーラブス・インコーポレイテッドのＲＧ７１５といった追加的発光フィルタを追加し、さらに励起光を排除した。

図７Ａ乃至図７Ｄは、それぞれ、ニワトリ軟骨組織から得た軟骨細胞の深度４００ミクロンにおける共焦点変調画像１４０（図７Ａ）、焦点変調顕微鏡画像１４２（図７Ｂ）である。また、図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれ、図７Ａおよび図７Ｂのボックスで囲んだ領域の高倍率観察画像１４４、１４６であり、スケールバーは２０ミクロンである。図７Ｂは、焦点変調顕微鏡画像であり、図７Ａは、共焦点顕微鏡画像である。４００ミクロンの深度で得た。焦点変調顕微鏡画像、図７Ｂ、から推定される細胞密度は、より浅い領域におけるそれと類似する。それに対し、共焦点顕微鏡画像、図７Ａ、は、近接する層よりも多くの細胞を含んでいる。画質比較のため、視野の左下隅部の小領域を拡大して図７Ｃ、図７Ｄに示す。

以上、肉厚生体組織の高解像度分子イメージングのための、単一光子励起蛍光を用いた蛍光焦点変調顕微鏡システムおよびその方法を示した。焦点変調、すなわち、散乱光によって励起された背景蛍光信号を抑制するための方法の使用により、光学切片化および回折限界空間分解能は、多重散乱媒質内部のイメージングにおいても維持される。

本焦点変調顕微鏡システムは、励起光光路３４上に総説された空間的位相変調器１８を有する。該変調器は、合焦容積近辺のコヒーレント励起光の空間的分布を予め定めた周波数で周期的に変化させる。蛍光焦点変調画像１２２、１４２は、復調された蛍光を用いてディスプレイ１１４上に形成され、他方、共焦点画像１２０、１４０もまた同時的に利用可能となる。本発明の実施の形態は、光コヒーレンス・トモグラフィ法および多光子顕微鏡法と同程度の透過深度を達成している。

本発明の実施の形態によれば、達成される画像透過深度は、従来型共焦点蛍光顕微鏡において実現されるそれよりも著しく大きい。しかしながら、本発明の実施の形態は、選択励起のためのパルスレーザ源を必要としない。上述のとおり、本発明の実施の形態は、弾道励起光のコヒーレンス特性を用い、焦点変調法によって、選択的に、合焦容積からの寄与のみをピックアップする。励起ビームを走査して焦点まわりにおける強度の変動（うねり、振動）を発生させる。

当該エリアからの蛍光発光は、同じ周波数を有する交流成分を含んでおり、当該成分は背景信号には存在しない。交流信号の由来は、弾道励起光によって定まる小さな容積内に限定されるので、深い画像化深度において分解能およびコントラストが、共焦点顕微鏡法よりもよく維持される。実施の形態は、蛍光との適合性があり、市場に流通される様々な蛍光色素を用いて実施することができる。人間の被験者あるいは動物モデルの細胞の構造および機能のインビボイメージングが、手の届くコストで可能になる。この新規な画像化法は、広範な適用用途を有する。

当然のことだが、図１乃至図８を参照して説明した実施の形態の説明は、例示を目的としており、当該開示にかかる実施の形態例は、様々な具体的なハードウェアを用いて実施可能である。

例えば、本実施の形態にかかるパーソナルコンピュータ１２の機能およびその変形例は、１つまたはそれ以上のプログラム可能なコンピュータシステムもしくは装置で実施され、例示のシステムにかかる装置および下位システムの機能を実現することができる。図１乃至図８を参照して説明した本システム例は、本願が開示する様々な処理に関する情報を格納することに用いてよい。この情報は、例えば、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＲＡＭ等のような本実施形態の装置および下位システムの記憶手段に格納されてよい。当該装置および下位システムに関連する１つまたはそれ以上のデータベースが、当該情報を格納して、本実施形態例が実施されてもよい。データベースは、例えば、レコード、テーブル、アレイ、フィールド、グラフ、ツリー、リスト等といった、様々なメモリ装置のような１つまたはそれ以上の記憶手段に格納されたデータ構造を用いて編成されてよい。

図１乃至図８を参照して説明された本システム例の全てまたは一部分は、本願記載の実施形態例の教示に基づいてプログラムされた１つまたはそれ以上の汎用コンピュータシステム、マイクロプロセッサ、デジタル・シグナル・プロセッサ、マイクロ・コントローラ、等を用いて適宜実施されてよい。通常の技能を有するプログラマであれば、本願記載の実施形態例の教示に基づいて適切なソフトウェアを作成することは容易である。また、本システム例は、特定用途向け集積回路を作成することで、あるいは、部分回路の適当なネットワークを相互接続することで、実施可能である。

本発明の実施形態について説明し例示したが、当然のことながら、関連技術の通常の技能を有するものであれば、本発明から逸脱することなしに設計および構造の細部において多くの変形および修正を行うことが可能である。

１６ ・・・ 励起光光源（６６０ｎｍレーザ）
１８ ・・・ 空間的位相変調器
２０ ・・・ 対物レンズ
２８ ・・・ 高速ステアリングミラー
３２ ・・・ ３Ｄステージ
３８ ・・・ プロセッサ
４０ ・・・ サンプル
８０ ・・・ 波長走査源
１０２ ・・・ ＰＭＴ
１０４ ・・・ 増幅器
１０６ ・・・ ロングパスフィルタ
１０８ ・・・ アクロマート
１１０ ・・・ ビーム・エキスパンダ
１１４ ・・・ ディスプレイ
１１６ ・・・ 入力部
１１８ ・・・ メモリ

Claims (28)

1. 蛍光焦点変調顕微鏡システムであって、
   光線を生成し、サンプルのターゲット領域へ照射する光源アセンブリと、
   前記光線の光路上に配され、前記光線を第１ビームおよび第２ビームに分割する空間的位相変調器であって、前記第１ビームは、前記第２ビームと平行かつ空間的に離れており、前記第２ビームは、前記第１ビームと異なる位相遅延で変調され、前記第１ビームと前記第２ビームとの間の相対的位相シフトの量を時間に沿って周期的に変化させる空間的位相変調器と、
   互いに平行かつ空間的に離れた前記第１ビームおよび前記第２ビームを受けて前記第１ビームおよび前記第２ビームを、３次元的に局在化された合焦容積に集束させることにより、前記合焦容積に含まれる前記サンプルの前記ターゲット領域を照射する集束アセンブリと、
   照射された前記サンプルの前記ターゲット領域が発したルミネセンス信号を受け、光検出器が検出した前記ルミネセンス信号を、直流成分、および、前記相対的位相シフトの量の時間に沿った周期的な変化に応じて現れる交流成分を含んだ光電信号へ変換する光検出器アセンブリと、を有する蛍光焦点変調顕微鏡システム。
2. さらに、プロセッサおよびディスプレイを有し、
   前記プロセッサは、前記光電信号を受信して前記交流成分および前記直流の大きさの総和から計算した最大発光強度に基づいて、前記ディスプレイ上の画像を処理する、請求項１に記載のシステム。
3. さらに、プロセッサおよびディスプレイを有し、
   前記プロセッサは、前記光電信号を受信して前記光電信号の前記交流成分の画像に基づいてディスプレイ上の画像を処理する、請求項１に記載のシステム。
4. 前記空間的位相変調器は、波長走査源および差動遅延ラインを備える、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のシステム。
5. 前記波長走査源は、反復的に、前記光源の波長を掃引し、所定の光路長差を与える、請求項４に記載のシステム。
6. 空間的位相変調器は、第１ミラーおよび第２ミラーを備え、
   前記第２ミラーは、前記第１ミラーに対して可動であり、前記第２ビームを前記第１ビームに対して変調する、請求項１ないし５のいずれか１つに記載のシステム。
7. 前記第２ミラーは、圧電アクチュエータ上に配され、
   前記第１ビームと前記第２ビームとの間の相対的位相シフトは、前記圧電アクチュエータに印加される電圧に従う、請求項６に記載のシステム。
8. 前記集束アセンブリは、ダイクロイックミラーおよび対物レンズを備える、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のシステム。
9. 前記空間的位相変調器は、前記光線の光路に沿って前記ダイクロイックミラーの上流側に配されている、請求項８に記載のシステム。
10. 前記空間的位相変調器は、前記光線の光路に沿って前記ダイクロイックミラーの下流側に配されている、請求項８に記載のシステム。
11. 前記空間的位相変調器は、前記光源から発せられた前記光線の光路、および、照射された前記サンプルの前記ターゲット領域が発したルミネセンスの光路に沿って配されている、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載のシステム。
12. さらに、前記第１ビームおよび前記第２ビームを、前記サンプルに対して走査する走査アセンブリを有する、請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のシステム。
13. 前記集束アセンブリは、前記第１ビームおよび前記第２ビームを、前記サンプルに対して走査するステアリングミラーを備える、請求項１２に記載のシステム。
14. 前記走査アセンブリは、前記サンプルを保持するホルダ、および、前記サンプルを、前記第１ビームおよび前記第２ビームに対して可動的に走査するアクチュエータを備える、請求項１２に記載のシステム。
15. さらに、照射された前記サンプルの前記ターゲット領域が発したルミネセンス信号の光路上に、前記サンプルの非ターゲット領域から発せられたルミネセンスが前記光検出器に到達することを阻止するアパーチャを有する、請求項１ないし１４のいずれか１つに記載のシステム。
16. 前記アパーチャは、ピンホール、スリット、ロングパスフィルタ、光ファイバケーブルからなる群から選択される、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記光源は、単一光子励起型である、請求項１ないし１６のいずれか１つに記載のシステム。
18. 前記光源は、多光子励起型である、請求項１ないし１６のいずれか１つに記載のシステム。
19. 前記光検出器アセンブリは、さらに、前記光検出器が検出するルミネセンス信号を、直流成分および交流成分を含んだ光電信号に変換する光電子増倍器を備える、請求項１ないし１８のいずれか１つに記載のシステム。
20. 蛍光焦点変調顕微鏡法を実施する方法であって、
    光線を生成してサンプルのターゲット領域へ照射するステップと、
    前記光線の光路上に配された空間的位相変調器が、前記光線を、第１ビームおよび第２ビームに分割するステップであって、前記第１ビームは、前記第２ビームと平行かつ空間的に離れており、前記第２ビームは、前記第１ビームと異なる位相遅延で変調され、前記空間的位相変調機が前記第１ビームと前記第２ビームとの間の相対的移送シフトの量を時間に沿って周期的に変化させるステップと、
    集束アセンブリが、互いに平行かつ空間的に離れた前記第１ビームおよび前記第２ビームを３次元的に局在化された合焦容積に集束するステップと、
    前記第１ビームおよび前記第２ビームで、前記合焦容積に含まれる前記サンプルの前記ターゲット領域を照射するステップと、
    照射された前記サンプルの前記ターゲット領域が発したルミネセンス信号を受けるステップと、
    光検出器が検出したルミネセンス信号を、直流成分、および、前記相対的位相シフトの量の時間に沿った周期的な変化に応じて現れる交流成分を含んだ光電信号へ変換するステップと、を有する、蛍光焦点変調顕微鏡法を実施する方法。
21. さらに、前記光電信号を受信して前記交流成分および前記直流の大きさの総和から計算した最大発光強度に基づいて、前記ディスプレイ上の画像を処理するステップを有する、請求項２０に記載の方法。
22. さらに、前記光電信号を受信して前記光電信号の前記交流成分の画像に基づいてディスプレイ上の画像を処理するステップを有する、請求項２０に記載の方法。
23. 前記光線を第１ビームおよび第２ビームに分割するステップは、反復的に、前記光源の波長を掃引し、所定の光路長差を与えるステップを含む、請求項２０ないし２２のいずれか１つに記載の方法。
24. 前記光線を第１ビームおよび第２ビームに分割するステップは、第１ミラーおよび第２ミラーを備える空間的位相変調器が、前記第２ミラーを前記第１ミラーに対して移動させて前記第２ビームを前記第１ビームに対して変調させるステップを含む、請求項２０ないし２３のいずれか１つに記載の方法。
25. 前記第２ミラーは、圧電アクチュエータ上に配され、前記圧電アクチュエータに印加される電圧に従って前記第１ビームと前記第２ビームとの間に相対的位相シフトを与える、請求項２４に記載の方法。
26. さらに、前記第１ビームおよび前記第２ビームを、前記サンプルに対して走査するステップを有する、請求項２０ないし２５のいずれか１つに記載の方法。
27. さらに、照射された前記サンプルの前記ターゲット領域が発した前記ルミネセンス信号の光路上にアパーチャを配して前記サンプルの非ターゲット領域から発せられたルミネセンスが前記光検出器に到達することを阻止するステップを有する、請求項２０ないし２６のいずれか１つに記載の方法。
28. 前記光線を分割する前記空間的位相変調器は、前記光源から発せられた前記光線の光路、および、照射された前記サンプルの前記ターゲット領域が発したルミネセンスの光路に沿って配されている、請求項２０ないし２７のいずれか１つに記載の方法。

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