JP4141463B2 - 改良された環状部位特定変異誘発 - Google Patents

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Description

本発明は分子生物学の分野、さらに特定的に言うと部位特定変異誘発の分野に関する。
部位特異的突然変異誘発は、分子生物学において著しく有用な手段であることが立証されてきた。今や予め定められた配列をもつポリヌクレオチドを意のままに設計することができる。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 及びその他のさまざまな周期性増幅反応が、部位特異的突然変異誘発において使用するように適合されてきた。PCR(ポリメラーゼ連鎖反応）を通しての部位特異的突然変異誘発が広く用いられているものの、 PCRをベースとした部位特異的突然変異誘発技術にはいくつかの欠点がある。
２本鎖 DNA分子について部位特異的突然変異誘発を実施しようとする場合に、いくつかの問題が存在する。これらの問題としては、親の（突然変異を受けていない)DNAに対するストランド分離及び選択が含まれる。標準的な部位特異的手順においては、望ましい配列変化を内含する単一のポリヌクレオチドプライマが、ハイブリダイゼーション部位を求めてはるかに長い相補的ストランドと競合しなければならないことから、効果的なストランド分離が重要である。ストランド分離のために物理的及び化学的方法の両方が使用されてきた。
物理的方法には、プラスチックビーズといったような固相に対する DNA鎖の付着(Hall, et al. Protein Eng . 4: 601 0 (1991); Hultman, et al. Nucleic Acids Research 18: 5107-5112 (1990); Weiner, et al. Gene 126: 35-41 (1993)、又は変性剤としての熱の使用（Landt, et al. Gene 96: 125-128 (1990); Sugimoto Analytical Biochemistry 179.: 309-311 (1989) がある。ストランド分離のための化学的方法は通常、DNA ２重鎖を含有する溶液のpHを増加させることに依存している(Weiner, et al. Gene 126: 35-41 (1993)。
ストランド分離の後、プライマは、親ストランドにアニールされ、 DNA複製を開始するのに用いられる。複製の後、細胞形質転換の前又は後のヘテロ２重鎖の親プラスミド DNA寄与率を減少させるための手段が使用されなくてはならない。この減少のためのインビボ及びインビトロの両方の方法が開発されてきた。増幅に基づかないインビボの部位特異的方法においては、ベクターの成長中の親 DNA内へのdUTPの取込みに対して dut+ , ung+ E. Coli 細胞内で選択を行なうことができる(Kunket Proc.Natl.Acad.Sci. (U.S.A.) 82: 488-492 (1985) 。
突然変異を受けたストランドの選択のためのインビトロ方法としては、ｉ）非反復制限部位の削除(Deng, et al. Analytical Biochemistry 200181-88 (1992); 固相技術（親 DNAが固相に付着した状態にとどまる場合： Hultman et al. Nucleic Acids Research 18: 5107-5112 (1990); Weiner, et al. Gene 126: 35〜41 (1993) 及びiii）新たに複製された DNA内への修飾塩基の取込み（Taylor et al. Nucleic Acids Research 13: 8765-8785 (1985); Vandeyar, et al. Gene 65: 129-133 (1988) が含まれる。
部位特異的突然変異誘発のために PCRが使用された時点で、ストランド分離は、循環する反応において高温変性段階の間に達成される。親 DNAに対する選択は、通常、出発鋳型の量を減少させ循環回数を増大させることによって達成される。このサイクル数の増大は、特に Taq DNAポリメラーゼといったような誤りがちなポリメラーゼが使用される場合、自然第２部位突然変異の率を増大させるという不利な効果をもつ。標準的な実験においては、突然変異を受けたフラグメントは往々にして１つのベクタからもう１つのベクタへとサブクローニングされる。往々にして、異なる抗生物質耐性マーカーが交代利用されるか又は突然変異を受けたフラグメントがゲル分離される。
部位特異的突然変異誘発におけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR) の使用についての記述は、 Hall, et al. Protein Eng . 4: 601 (1991); Hemsley, et al. Nucleic Acids Research 17: 6545-6551 (1989); Ho, et al. Gene 77: 51-59 (1989); Hultman, et al. Nucleic Acids Research 18: 5107-5112 (1990); Jones, et al. Nature 344: 793-794 (1990); Jones, et al. Biotechniques 12: 528-533 (1992); Landt, et al. Gene 96: 125-128 (1990); Nassal, et al. Nucleic Acids Research 18: 3077-3078 (1990); Nelson, et al. Analytical Biochemistry 180: 147-151 (1989); Vallette, et al. Nucleic Acids Research 17: 723-733 (1989); Watkins, et al. Biotechniques 15: 700-704 (1993); Weiner, et al. Gene 126: 35-41 (1993). Yao, et al. PCR Mathods and Applications 1: 205-207 (1992)の中に見い出すことができる。部位特異的突然変異誘発の使用は同様にWeiner et al. Gene 151: 1/9-123 (1994)の中でも記述されている。
部位特異的突然変異誘発の数多くの異なる方法が現在使用されていることから現在利用可能などの単一の技術も、部位特異的突然変異誘発に付随する問題の全てを解決するものではないということは、明白である。当該技術分野の技術的現状から考えると、研究者（産業及び学術の両方の）に部位特異的突然変異誘発の新しい方法を提供するのが明らかに有利である。この目的のため、発明人は、部位特異的突然変異誘発のためのその他の技術に比較して有利な特長の組合せをもつ部位特異的突然変異誘発のための新しい技術を開発した。これらの有用な特長としては、（１）低い二次的突然変異の頻度、（２）高い突然変異効率及び（３）最小限の段階数、があり、かくして、突然変異体配列を含有する宿主細胞の生成が24時間未満で可能となっている。
本発明は、線形周期性増幅反応が関与する部位特異的突然変異誘発の改善された方法を提供する。本発明は、標的 DNAの中に問題の特異的突然変異を効果的に導入する極めて単純でかつ有効な方法を提供する。
本発明は、標的 DNA配列に関して少なくとも１つの突然変異部位を内含するように選択される突然変異誘発プライマ対を用いて問題の環状 DNAの中に部位特異的突然変異誘発を導入する方法を提供する。突然変異誘発プライマ対は同様に、互いに完全に又は部分的に相補的なものとなるようにも選択され、ここで突然変異部位（単複）は、両方の突然変異誘発プライマの相補性領域の中に位置設定されている。
本発明の方法においては、突然変異誘発プライマ対が突然変異誘発されるべき DNA配列を含む環状 DNA分子の相対するストランドに対しアニールされる。アニーリングの後、各々突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマ対の一員を取り込んでいる第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖が、線形周期性増幅反応によって合成される。合成された第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖は、２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を形成するため充分な長さをもっている。線形周期性増幅反応は、その後の操作のため充分な量の第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖を生成するべく、数サイクルにわたり反復することができる。
線形周期性増幅で媒介された合成段階が完了した後、反応混合物は、親の鋳型ストランドを消化する選択酵素で処理され、かくして、反応混合物を、第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖の濃度に関して富化する。消化段階は新たに合成された突然変異誘発された DNA鎖にアニールした親ストランド及び互いに対しアニールした親ストランドを消化するのに役立つ。消化段階の後、第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖は互いにハイブリッド形成させられて２本鎖環状 DNA中間体を形成することができる。２本鎖環状 DNA中間体は、適当なコンピテント宿主細胞の中で形質転換され、問題の望ましい単数又は複数の突然変異を含んでいる閉環状２本鎖 DNAを、形質転換された細胞から適切に回収することができる。
本発明の方法の中の鋳型消化段階は、選択酵素が関与するさまざまな方法のいずれかにおいて実施可能である。例えば制限エンドヌクレアーゼといった選択酵素は、親のポリヌクレオチドを消化し、新たに合成された突然変異誘発されたポリヌクレオチドを消化しない酵素である。選択酵素が好ましくは親の鋳型ポリヌクレオチドの消化の触媒として作用するような形で、複製の前の鋳型ポリヌクレオチドが修飾されるか又は複製中に合成されたポリヌクレオチドが修飾されるかのいずれかである。本発明の一実施形態においては、突然変異誘発のためのポリヌクレオチドは、dam メチル化２本鎖 DNAであり、親のポリヌクレオチド鎖を消化させるのに用いられる制限酵素は DpnＩである。
本発明のもう１つの形態は、高い効率での部位特異的突然変異誘発のためのキットを提供することにある。問題のキットは、当該方法を実施するために必要とされる試薬を含んでいる。
定 義
本書で使用される用語「線形周期性増幅反応」という語は一定の与えられたポリヌクレオチドを線形増幅させるべくポリヌクレオチドプライマ対を利用し、各々ポリヌクレオチド複製を結果としてもたらす単数又は複数のサイクルを通して進行するさまざまな酵素媒介されたポリヌクレオチド合成反応のことを指す。本発明の方法において使用される線形周期性増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) とは著しく異なっている。ポリメラーゼ連鎖反応は、サイクル数に関して量的に指数増殖する増幅産物を生成する。線形周期性増幅反応は、この反応において産生される増幅産物の量が実行されたサイクル数に関して線形であるという点で、 PCRと異なっている。
この反応産物蓄積速度の差は、互いに相補的な又は部分的に相補的なものである突然変異誘発プライマを使用した結果である、線形周期性増幅反応サイクルは、２本鎖鋳型を変性する段階、変性された鋳型に対しプライマをアニールする段階及びプライマからポリヌクレオチドを合成する段階を標準的に含んで成る。このサイクルは、望ましい量の新たに合成されたポリヌクレオチド産物を産生するべく、数回くり返すことができる。
線形周期性増幅反応は PCRとは著しく異なっているもののPCR: A Practical Approach , M.J.McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications , by Innis, et al., Academic Press (1990), and PCR Technology: Principals and Applications of DNA Amplification, H.A.Erlich, Stockton Press (1989) を含む、 PCRについて記述した文献を再検討することによって、線形周期性増幅反応のさまざまな段階を実施する上での指針を得ることができる。
PCRは同様に、本書に引用により繰り入れられる米国特許 4,683,195号、 4,683,202号； 4,800,159号、 4,965,188号、 4,889,818号、 5,075,216号、 5,079,352号、 5,104,792号、 5,023,171号及び 5,091,310号及び 5,066,584号を含む数多くの米国特許の中でも記述されている。分子生物学の分野の当業者には、増幅技術の数多くの変形形態が知られている。これらの変形形態としては、 DNA末端の高速増幅（RACE-PCR）、増幅回復突然変異システム（ARMS）、PLCR（ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応の組合せ）、リガーゼ連鎖反応(LCR) 、自立式配列複製(SSR) 、Ｑ−ベータ増幅及びストランド置換増幅(SDA) などがある。当業者であれば、本発明の方法において使用される線形周期性増幅反応を修正するためにこれらの方法を使用する可能性がある。
「突然変異誘発プライマ」という語は、プライマが精確に標的ハイブリダイゼーション配列と対合しない、線形周期性増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドプライマのことを指す。突然変異誘発プライマ内の不正対合ヌクレオチドは、突然変異誘発プライマに関する突然変異部位として言及されている。かくして増幅反応の間、プライマの不正対合ヌクレオチドは、増幅産物の中に取り込まれ、その結果、標的配列を突然変異誘発する合成をプライミングするのに用いられた突然変異誘発プライマを含む突然変異誘発された DNA鎖の合成がもたらされる。
ここで突然変異誘発プライマに関して用いられている「オリゴヌクレオチド」という語は、広義で用いられる。オリゴヌクレオチドは DNAのみならず、そのさまざまな類似体をも内含している。このような類似体は、塩基類似体及び／又はバックボーン類似体、例えばホスホロチオエート、ホスフォン酸塩などであってよい。例えばホスホロアミダイト化学を通してのオリゴヌクレオチドの合成のための技術は、当業者にとっては周知のものであり、なかんづく、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach（オリゴヌクレオチドと類似体：実践的アプローチ）、ed. Eckstein, IRL Press, Oxford (1992)の中で記述されている。好ましくは、本発明の方法の中で使用されるオリゴヌクレオチドは、 DNA分子である。
選択酵素の酵素活性に関し本書で用いられている「消化」という語は、広義に、（ｉ）ポリヌクレオチド前駆物質分子へのポリヌクレオチドの変換の触媒として作用する酵素、及び（ii）ポリヌクレオチドの（自律的又はその他の形での）複製能力を不利な形で妨害するか又はポリヌクレオチドが宿主細胞内へ形質転換される能力を不利な形で妨害するべくポリヌクレオチド上の少なくとも１つの結合の加水分解に触媒として作用することのできる酵素の両方を指すものとして使用される。ポリヌクレオチドを「消化」できる酵素の一例としては、制限エンドヌクレアーゼがある。標準的には、一定の与えられた状況下で選択酵素として機能する制限エンドヌクレアーゼが、消化される鋳型ストランドのホスホジエステルバックボーンの中へ多数の分割を導入することになる。ポリヌクレオチドを「消化」できるその他の酵素には、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
「選択酵素」という語は、突然変異誘発のためのポリヌクレオチド鋳型の消化の触媒として作用することができるものの、新たに合成された突然変異誘発されたポリヌクレオチド鎖を著しく消化しない酵素のことを指す。選択酵素は親鋳型ポリヌクレオチドに対する修飾又は新たに合成された突然変異誘発されたポリヌクレオチドに対する修飾を基準にして、鋳型と新たに合成されたポリヌクレオチドを弁別することができる。本発明において使用するのに適した選択酵素は、線形周期性増幅反応段階において生成された第１又は第２の突然変異誘発された DNA鎖と親ストランドの間で形成されたヘテロ２重鎖の親ストランドを選択的に消化する特性をもつ。選択酵素の例としては、制限エンドヌクレアーゼ及びエンドグリコシラーゼが内含されている。
本書で使用されている「２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体」という語は、当該方法の中で形成された第１の突然変異誘発された DNA鎖を第２の突然変異誘発された DNA鎖に対しアニールすることによって形成された２本鎖環状 DNA構造のことを言う。２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体が、宿主細胞内へ形質転換された時点で、宿主細胞酵素は、問題の単数又は複数の特定の部位特異的突然変異を内含するように修飾された突然変異誘発用の当初の DNA分子に対応する閉環状２本鎖 DNAを提供するべく、分子内のニック（及び考えられる小さなギャップ）を修復する能力をもつ。
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、なかでも、部位特異的突然変異誘発のための改善された方法を提供する。本書で記述されている部位特異的突然変異誘発の改善された方法は、突然変異誘発の効率の増大及び一次的突然変異の導入の低下を提供する。本発明の方法には、線形周期性増幅反応における相補的（又は部分的に相補的な）突然変異誘発プライマ対の使用が関与している。本発明の方法は、最低限の数の DNA操作しか必要とせず、従って、望ましい突然変異体を獲得する時間とコストが削減されることになる。数多くの例において、望まれる突然変異を伴う DNA構成体を含む形質転換体は、たった一日（突然変異誘発プライマを調製する時間は除外する）で得ることができる。
本発明の方法は、問題の DNA配列内に単数又は複数の突然変異を導入するのに用いることができる。当該突然変異誘発方法による修飾のための問題の DNA配列は、必然的に、環状 DNA分子すなわち鋳型分子の一部である。本発明の方法は、突然変異誘発のための２本鎖環状分子に対し第１及び第２の突然変異誘発プライマをアニールする段階を含んで成る。突然変異誘発プライマは、全体的にはリン酸化されないが、５′リン酸化され得る。突然変異誘発のたの DNA分子は２本鎖であることから、アニーリルグ段階の前には必然的に変性段階が先行する。
アニーリング段階は標準的に、線形周期性増幅反応の１サイクルの一部である。突然変異誘発プライマのアニーリングの後、第１及び第２の突然変異誘発プライマからそれぞれ第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖が合成される。第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖の合成は、線形周期性増幅反応の合成段階の間に起こる。合成から生成された第１の突然変異誘発された DNA鎖は、必然的にその５′末端に第１の突然変異誘発プライマを含む。同様にして、第２の突然変異誘発された DNA鎖は、第２の突然変異誘発プライマを含む。
線形周期性増幅反応は、その後の操作のため、第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖が様々な充足度で産生されるまで、複数のサイクルを通して反復することができる。線形周期性増幅反応段階すなわち第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖合成が完了した後、親鋳型 DNAは、選択酵素を添加することによって消化される。選択酵素は、親ストランド DNAを消化するのに役立つ。消化された親ストランド DNAは、線形周期性増幅反応段階で産生された第１又は第２の突然変異誘発された DNA鎖と親ストランドの間で形成されたヘテロ２重鎖の形をしていてよい。
付加的には、選択酵素によって消化される親ストランドは、親ストランド間で形成された２重鎖で構成されていてよい。消化段階が完了した後、第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖は、互いに対しアニールされ、２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を産生する。２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体は、その後コンピテント宿主細胞を形質転換するのに使用される。形質転換された宿主細胞はこのとき、コロニーとして分離され得、突然変異誘発のための初期 DNA分子に対応するものの望ましい単数又は複数の部位特異的突然変異を内含するプラスミドすなわち閉環状 DNAを、形質転換された細胞から分離することができる。
前段では、主として、突然変異誘発のための標的としての２本鎖環状 DNAの使用に関し記述してきた。当業者であれば、環状１本鎖 DNAの部位特異的突然変異誘発を提供するべく手順を容易に修正することができる。突然変異誘発のための１本鎖環状 DNA分子の場合、初期段階では、第１の突然変異誘発プライマのみがアニールされる。第１のプライマがアニールされた後、第１の突然変異誘発されたストランドの合成が進行し、第１の突然変異誘発された DNA鎖及び親の１本鎖鋳型を含む２本鎖環状 DNA分子を産生する。環状２本鎖分子の形成後、この方法は、前段で記述した通りに進行し得る。
本発明の方法は、第１の突然変異誘発プライマと第２の突然変異誘発プライマから成る突然変異誘発プライマ対を利用する。突然変異誘発プライマの長さは約20〜50塩基、より好ましくは約25〜45塩基対である。ただし本発明のいくつかの実施形態においては、望ましい突然変異誘発結果を得るべく長さが20塩基未満又は50塩基以上である突然変異誘発プライマを使用することが必要となるかもしれない。第１及び第２の突然変異誘発プライマは、同じか又は異なる長さのものであり得る。ただし、本発明の好ましい実施形態では、第１及び第２の突然変異誘発プライマは同じ長さである。
第１及び第２の突然変異誘発プライマは、突然変異誘発されるべき標的 DNA配列に関して単数又は複数の突然変異誘発部位、すなわち不正対合場所を内含している。突然変異誘発部位（単複）は、突然変異誘発のための DNA配列内にさまざまな突然変異タイプを導入するために使用できる。このような突然変異としては、置換、挿入及び欠失がある。
単一のオリゴヌクレオチドプライマでの部位特異的突然変異誘発の原理は、当業者にとって周知のものであり、例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring, Cold Spring Harbor, NY (1989)及び Wu et al., Recombinant DNA Methodology , Adademic Press, San Diego, CA (1989)の中に見られる。この情報は、当該方法の中で利用される第１及び第２の突然変異誘発プライマの中で突然変異誘発部位を設計するために使用できる。
本発明の第１及び第２の突然変異誘発プライマは、互いに完全に相補的であるか又は互いに部分的に相補的である。好ましくは、第１及び第２の突然変異誘発プライマは、互いに完全に相補的となるように選択される。第１及び第２の突然変異誘発プライマが互いに部分的に相補的である場合、相補性領域は隣接しているべきである。第１及び第２の突然変異誘発プライマが互いに部分的に相補的である本発明の実施形態においては、相補性領域は、突然変異誘発プライマが突然変異誘発のため DNA分子に対しアニールできるよう充分広くなくてはならない。
必然的ではないものの好ましくは、相補性領域は、プライマの長さの少なくとも50％である（第１及び第２のプライマが異なる長さのものである場合大きい方のプライマの50％）。第１及び第２の突然変異誘発プライマの突然変異誘発部位は、プライマの中央又はその近くに位置設定される。好ましくは、突然変異誘発部位は、突然変異誘発のための鋳型 DNA鎖に対するプライマのアニーリングを提供するべく、適正なすなわち不正対合されていない配列の約10〜15の塩基によってフランキングされている。
当該方法の好ましい実施形態においては、突然変異誘発プライマのGC含有量は、アニールされたプライマの安定性を増大させるため、少なくとも40％である。好ましくは、第１及び第２の突然変異誘発プライマは、単数又は複数のＧ又はＣ塩基で終結するように選択される。本発明において使用するための第１及び第２の突然変異誘発プライマは、任意には５′リン酸化されており、５′リン酸化は、例えばＴ−４ポリヌクレオチドキナーゼ処理といった当業者にとって周知の一定数の方法を用いて達成できる。
リン酸化の後、リン酸化されたプライマは、突然変異誘発手順を妨害しうる汚染物質を除去するべく、本発明の方法における使用に先立ち精製されなくてはならない。好ましい精製方法は、高速ポリヌクレオチド液体クロマトグラフィ（FPLC）又はポリアクリルアミドゲル電気泳動である。ただし、その他の精製方法も使用できる。これらの精製段階は、当該方法においてリン酸化されていない突然変異誘発プライマが使用される場合には不要である。
第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖は、線形周期性増幅反応により合成される。使用される線形周期性増幅反応の１サイクルの各々の部分の正確なパラメータは、使用された DNAポリメラーゼ、プライマのGC含有量、 DNA濃度などといった要因に応じて変動し得る。問題のサイクルパラメータとしては、サイクルの各部分（変性、アニーリング、合成）の時間及びサイクルの各部分が行なわれる温度、が含まれる。当業者であれば、個々の実験について周期性増幅反応段階のパラメータを最適化する上での指針を、 PCRを記述する刊行物の中に見い出すことができるということがわかるかもしれない。
当該突然変異誘発方法の中で使用される線形周期性増幅反応の合成段階は、長さ（突然変異誘発プライマ内の挿入又は欠失を除く）が突然変異誘発用環状 DNA分子と等しい第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖を産生するのに充分な時間的長さだけ進行しなくてはならない。線形周期性増幅反応の触媒として作用するべく Pfu DNAポリメラーゼが用いられる場合、線形周期性増幅反応の合成段階は、最適には、60°〜68℃の温度範囲で起こる；これ以上に高い温度では、突然変異誘発プライマの置換の望ましくない効果が結果としてもたらされることになる。
線形周期性増幅反応すなわち合成反応には、熱安定性又は非熱安定性ポリメラーゼ酵素が触媒として作用する可能性がある。当該方法の線形周期性増幅反応の中で使用するためのポリメラーゼは、鋳型に対しアニールされていない突然変異誘発プライマを置換させない特性を有し、かくして新たに合成されたストランドが誘導された鋳型と基本的に同じ長さの突然変異誘発された DNA鎖を産生する。好ましくは、使用されるポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。使用されるポリメラーゼは、自然に発生する細胞から分離されてもよいし、或いは又組換え型 DNA技術によって産生されてもよい。
請求対象の発明の線形周期性増幅反応段階で使用するためには、好熱性始原菌 Pyrococcus furiosusにより天然に産生される DNAポリメラーゼである Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いることが特に好ましい。 Pfuポリメラーゼは、望ましい２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体の形成のため適切な長さの第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖を産生する上できわめて有効である。
線形周期性増幅において使用できるその他の酵素の例としては、 Taqポリメラーゼ、ファージＴ７ポリメラーゼ、ファージＴ４ポリメラーゼ、 E. coli DNAポリメラーゼＩ、VentTM (New England Biolabs, Beverly MA) DNAポリメラーゼ、 Deep VentTM DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly MA)、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素などがあるが、これらに限られるわけではない。突然変異誘発のための DNA分子が比較的長い場合、１つの DNAポリメラーゼが５′−３′エキソヌクレアーゼ活性をもちもう１つの DNAポリメラーゼに５′−３′エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているような熱安定性の DNAポリメラーゼの混合物を使用することが望ましい可能性がある。
これらのポリメラーゼ混合物を用いて DNAの長い領域をいかにして増幅するかについての記述は、中でも、米国特許No. 5,436,149, Cheng et al., Proc.Natl.Aca.Sci. USA 91: 5695-9 (1994)、及び Barnes Proc.Natl.Aca.Sci. USA 91: 2216-2220 (1994) の中に見い出すことができる。一定の与えられた一組の条件下での）線形周期性増幅反応の合成段階の触媒として使用するのに、一つの与えられたポリメラーゼ（又は多数のポリメラーゼ組成物）が適しているか否かを見極めるために、プライマの置換が起こるか否かを見極めるべく、プライマ及び環状鋳型を用いた単純な検定を実施することができる。プライマの置換は、検定混合物のゲル電気泳動分析を行なうことによって直ちに検出できる。
本発明の方法において利用されるような線形周期性増幅反応は、好ましくは第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖を望ましい数量だけ産生するのに必要とされる最小限の数の増幅サイクルで実施される。好ましくは、線形周期性増幅反応段階の中のサイクル数は、30サイクル以下であり、より好ましくは、20以下のサイクルしか行なわれず、さらに一層好ましくは、サイクル数は、10以上20以下である。ただし、サイクルの好ましい実施形態は、突然変異誘発のための DNA分子内に導入されるよう求められる突然変異の数に応じて変動することになる。
一般に、最適な反応サイクル数は、突然変異誘発のための DNA分子の中に導入されるべき突然変異の複雑さと共に増大することになる。多数の増幅サイクルの使用は、増幅された配列内への望ましくない二次的突然変異の導入すなわち意図された部位特異的突然変異誘発標的以外の突然変異の導入を理由として、問題の多いものである。線形周期性増幅反応において使用される多くのポリメラーゼ、特に Taq DNAポリメラーゼは比較的高い誤り率を有し、かくして増幅サイクル数の増加が、生成される２次的突然変異数を増大させる。
本発明以前は、比較的低い濃度の増幅標的を使用する必要性のため線形周期性増幅突然変異誘発のために多数の増幅サイクルが要求された。過去においては、反応混合物中の突然変異誘発されていない産物の量が線形周期性増幅反応により産生される望ましい突然変異誘発された産物の量よりも著しく少なく、かくして突然変異誘発されていないポリヌクレオチドを含む形質転換体の数が減少することになるように、増幅標的の低い濃度が求められてきた。
当該部位特異的突然変異誘発方法は、突然変異誘発されていない DNA分子の受容できないほど高いバックグラウンドを生成することなく比較的大量の鋳型を使用できることから、比較的少数の増幅段階の使用を可能にするものである。消化段階は、突然変異誘発されていない DNA分子のバックグラウンドを低下させるのに役立つ。線形周期性増幅突然変異誘発反応の中で例えば５〜10回といった少数の増幅サイクルが使用される場合、突然変異誘発のための鋳型 DNA分子の量は、突然変異誘発された産物が充分な量だけ産生させられるように、増大されなくてはならない。
本発明の方法は、突然変異誘発用 DNA分子すなわち親鋳型ストランドが、酵素を触媒とする反応によって消化される「消化用」又は「消化」段階を含んで成る。この酵素は、「選択酵素」と呼ばれる。部位特異的突然変異誘発における親バックグラウンドを減少させるべく親ストランド消化段階を利用するため、親ストランド消化段階の前にポリヌクレオチド修飾段階が利用されなくてはならない。
部位特異的突然変異誘発の当該方法の中で使用するためのポリヌクレオチド修飾段階においては、（１）突然変異誘発のための親鋳型ポリヌクレオチドの単数又は複数のヌクレオチドが酵素的（又は化学的）に修飾され、例えば線形周期性増幅反応といった複数反応中に合成された第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖は修飾されないか、又は（２）線形周期性増幅反応中に合成された第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖の単数又は複数のヌクレオチドが酵素的に（又は化学的に）修飾され、突然変異誘発のための親鋳型 DNA分子のヌクレオチドは修飾されないかのいずれかである。
本発明の一定の与えられた実施形態において使用するために選択される正確な修飾反応は、消化段階で使用される特定の選択酵素と合わせて選択され、かくして選択酵素が親ストランドすなわちもとの鋳型ポリヌクレオチドを消化でき、新たに合成された第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖を著しく消化できないようになっている。
親ストランド消化段階と合わせて使用するための修飾段階は、修飾用作用物質に対し修飾のための DNA分子を露呈する工程を含むことができる。修飾段階は、線形周期性増幅反応段階の前又はその間のいずれでも実施可能である。修飾用作用物質は、問題のポリヌクレオチドの中で塩基のメチル化の触媒として作用するメチラーゼ酵素であってよい。本発明の中で使用するための適切なメチラーゼの例としては、dam メチラーゼ、dcm メチラーゼ、 AluＩメチラーゼなどがある。修飾反応は、インビボでもインビトロでも起こりうる。
インビボメチル化は、適切なメチラーゼ酵素を内因的に産生する原核又は真核のいずれかの細胞中でポリヌクレオチドを増殖させることによって、便利に達成できる。本発明の好ましい実施形態においては、修飾段階を実施するのにインビボメチル化が使用される。ポリヌクレオチド修飾段階は、ポリヌクレオチドが完全に合成された後でこれを直接修飾するのではなくむしろ、例えば６メチル−ATP といった修飾された塩基を含むヌクレオチドを用いてポリヌクレオチドを合成することによっても達成できる。修飾反応がメチル化反応であり、選択酵素が、活性のためメチル化塩基を必要とする制限エンドヌクレアーゼである場合、メチル化段階は、好ましくはインビボで実施される。
選択酵素が、その認識配列がメチル化されていない場合にはその認識配列を分割しない制限エンドヌクレアーゼである場合、修飾反応は、新たに合成されたポリヌクレオチド鎖の中へのメチル化ヌクレオチドの取込みの触媒として作用するポリメラーゼによりインビトロで実施されるメチル化反応である。消化段階で使用される選択酵素が DpnＩである場合、修飾段階は、好ましくは、６メチルアデニン（dam メチラーゼ）を産生するためのアデニンのメチル化であり、メチル化反応は、好ましくは、適切な原核宿主細胞の中でプラスミドとして突然変異誘発のための DNAを増殖させることによってインビボで起こる。
消化段階には、突然変異誘発のための DNA分子の親のすなわち突然変異誘発されていないストランドを消化することができるものの、線形周期性増幅突然変異誘発の間に産生された新たに合成されたポリヌクレオチドを著しく消化しない選択酵素の添加が関与している。消化段階を実施することによって、突然変異誘発されていないポリヌクレオチドを含む形質転換体の数は著しく減少する。親ストランド消化段階には、線形周期性増幅反応が完了した後反応混合物に選択酵素を添加することが関与している。
選択酵素は、線形周期性増幅反応の中で親ストランドの消化例えば分割の触媒として作用することができるもののこの増幅反応段階中に新たに合成された DNA鎖を著しく消化しない制限エンドヌクレアーゼ又はその他の酵素であってよい。親ストランド消化段階において使用するための制限エンドヌクレアーゼは、親ストランドを分割できるものの新たに合成されたポリヌクレオチドを著しく分割しないように選択される。
消化段階において使用するために選択された制限エンドヌクレアーゼは、（１）線形周期性増幅突然変異誘発反応の間に合成された第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖の上に存在しない親ストランドの特異的修飾を必要とする可能性もあるし、或いは又（２）親ストランド消費段階において使用するために選択された制限エンドヌクレアーゼが、特異的に修飾されたポリヌクレオチドを消化できず、線形周期性増幅反応の間に合成された第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖がかかる修飾を有する（そして突然変異誘発のための親鋳型ポリヌクレオチドすなわち DNA分子に修飾が欠如している）可能性もある。
消化段階において選択酵素として使用するためには、制限エンドヌクレアーゼが好まれる。親ストランド消化段階において使用するための好ましい選択酵素は、アデニンがメチル化された場合（６−メチルアデニン）にのみポリヌクレオチド配列GATCを分割する制限エンドヌクレアーゼ DpnＩである。親ストランド消化段階において使用するために適しているその他の制限エンドヌクレアーゼとしては、 NanII，NmuDＩ及びNmuEＩがある。しかしながら、消化段階において選択酵素として使用するための制限エンドヌクレアーゼは、 DpnＩのアイソシゾマーである必要はない。
本発明のその他の実施形態においては、消化段階で使用される選択酵素は、制限エンドヌクレアーゼではない。選択酵素として使用するためのその他の酵素としては、ウラシルＮ−グリコシダーゼが含まれる。チミジンではなくむしろ単数又は複数のウラシル塩基を含有するべく突然変異誘発のための DNA分子を修飾することにより、選択酵素としてウラシルデグリコシラーゼを使用することができる。ウラシルの取込みは、好ましは、ウラシルデグリコシダーゼが親ストランドの消化を提供できるようにインビボで起こる。
DNA前駆物質としてdUTPを用いる DNA合成又は E. coliの dut' ung'菌株の中での複製を含むさまざまな方法によって、チミジン残基を内含するようにポリヌクレオチドを修飾することができる。ウラシル塩基を含むポリヌクレオチドは、ウラシルＮ−グリコシラーゼ及びその他の類似のグリコシラーゼ活性をもつ酵素による脱グリコシル化すなわち消化に対し感応性をもつ。ウラシルＮ−グリコシラーゼの利用については、何でもKunkel, PNAS USA, 82: 488-492 (1985)の中で記述されている。
「消化」段階が完了した後、又は「消化」段階すなわち選択酵素の添加と同時に、第１の突然変異誘発された DNA鎖及び第２の突然変異誘発された DNA鎖は、２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を産生するべく互いにアニールされる。２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体の形成は、核酸ハイブリダイゼーションの従来の原理に従って起こり、さまざまな条件下で実施することができる。適切には、２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を形成するための第１及び第２の突然変異誘発された DNA鎖のアニーリングは、「消化」段階と同時に起こり得る。
２本鎖の環状 DNA中間体の形成は、「消化」及び／又は線形環状増幅反応段階が起こるのと同じ反応容器の中で起こり得る。２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を形成するプロセスは、その後の形質転換段階において適切な数のクローンを提供するべく適切な数の２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を産生するのに充分な時間、進行しなくてはならない。一般に、37℃で１〜２時間のインキュベーションが、本発明の大部分の実施形態において充分であろう。しかしながら、これらの時間及び温度パラメータは、 DNA濃度、 DNA分子のGC含有量などといった要因を考慮に入れるべく当業者により容易に変動させられ得るものである。
２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体の形成が完了した時点で、コンピテント単細胞微生物宿主細胞を形質転換するため、反応混合物又はその一部分を使用することができる。宿主細胞の形質転換に先立って連結反応を行なう必要はない。連結段階が必要とされないことは、従来の部位特異的突然変異誘発方法に比べて本発明の方法を実施するのに必要とされる時間と費用を削減するのに役立つ。宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
好ましくは、宿主細胞は、原核細胞であり、より好ましくは形質転換のための宿主細胞は、 E. coli細胞である。コンピテント単細胞微生物を調製し形質転換するための技術は、当業者にとっては周知のものであり、例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Coldspring Harbor Press, Coldspring Harbor, NY (1989), Harwood Protocols For Gene Analysis, Methods In Molecular Biology Vol.31, Humana Press, Totowa, NJ (1994) などの中に見い出すことができる。本発明の方法を特に適切なものにするように凍結したコンピテント細胞を形質転換させることもできる。
本発明のもう１つの形態は、本発明の部位特異的突然変異誘発方法を実施するためのキットを提供することにある。本発明のキットは、当該方法を実施する上で使用するための単数又は複数の酵素又はその他の試薬を提供する。キットには、当該方法を実施するときに精度と正確さの両方を確保するよう、予め測定された量の試薬が含まれていてよい。又キットには、本発明の方法を実施するための指示事項が含まれていてよい。本発明のキットは、最低限、以下のものを含む： DNAポリメラーゼ（好ましくは Pfu DNAポリメラーゼ）、選択酵素（好ましくは DpnＩ）、対照プライマ、及び対照鋳型。
本発明のキットには、以下の品目が含まれていてよい：個々のヌクレオチド三リン酸（dATP, dTTP, dCTP及びdGTPの等モル混合物を含む）ヌクレオシド三リン酸混合物、（Dam メチラーゼを含む）メチラーゼ、対照線形周期性増幅プライマ、メチル化されたプラスミド（又はファージ）を増殖させるための菌株、凍結コンピテント細胞、濃縮反応緩衝液など。好ましいキットは、 DNAポリメラーゼ、濃縮反応緩衝液、選択酵素、等モル量での４つの一次ヌクレオシド三リン酸のヌクレオシド三リン酸混合物、凍結コンピテント細胞、対照プライマ及び対照鋳型を含んで成る。
本書で用いられる「対照鋳型」及び「対照プライマ」という語は、それぞれ、本発明の方法により容易に検出可能な部位特異的突然変異誘発を提供するように選択される、環状２本鎖 DNA分子及び突然変異誘発プライマのことを指す。例えば、対照鋳型は、点突然変異を伴うlacZ遺伝子を含んでいてよく、対照プライマは、点突然変異と「修復する」部位特異的突然変異を導入するべく設計され得る。lacZ表現型は、指示培地例えば X-gal上で容易に検出されることから、突然変異誘発プロトコルの効果を容易に監視することができる。
本発明について記述してきたが、以下の例は、制限的な意味なく例示を目的として提供されるものである。
例
対照反応
プラスミドpWhitescriptTM 5.7-k.b. の部位特異的突然変異誘発を実施するための手順が以下で示されている。この手順は、異なるプライマを用いてその他の分子の部位特異的突然変異誘発のために容易に適合させることができる。プラスミドpWhitescriptTM 5.7-k.b. は、lacZマイナス表現型を産生する点突然変異を伴う突然変異体lacZをコードする。プライマは、指示培地上で成長させられた E. coli内でlacZの正の表現型を生じさせるプラスミドを産生させるべくこの突然変異を「修復する」ように設計されている。従って、pWhitescriptTM 5.7-k.bを、本発明のキット内の対照鋳型として使用することができる。
−反応の設定を行なう
１．正常なヌクレオチド配列すなわち第１及び第２の突然変異誘発プライマによりフランキングされた望ましい突然変異を含む２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成する。任意に、プライマは、５′リン酸化され、次の段階での使用に先立ってゲル精製される。
２．以下に示す通り対照反応を準備する：
・５μｌの10×反応緩衝液
・３μｌ（３ng、 0.001nM）のpWhitescriptTM 5.7-k.b. 対照鋳型 （１ng／μｌ）、
・1.25μｌ(125μｇ、22nM）のオリゴヌクレオチド対照プライマ＃ １〔34-mer(100ng／μｌ）〕．
・1.25μｌ(125ng、22nM）のオリゴヌクレオチド対照プライマ＃２ 〔34-mer(100ng／μｌ）〕．
・１μｌの 10mM dNTP混合物（各 NTP、 2.5mM）
・最終体積50μｌとなるまでの２重精製水(ddH2O)
次に以下のものを添加する：
１μｌの未変性 Pfu DNAポリメラーゼ(2.5Ｕ／μｌ）。
３．以下に示す通りサンプル反応を準備する：
２〜８ngの範囲のさまざまな濃度のds DNA鋳型（例えば２，４，６、及び８ngのds DNA鋳型）を用いた一連のサンプル反応を、最適な量を決定する目的で設定すべきである。
・５μｌの10×反応緩衝液、
・２・８ngのds DNA鋳型
・ 125ngのオリゴヌクレオチドプライマ＃１
・ 125ngのオリゴヌクレオチドプライマ＃２
・１μｌの10mMのdNTP混合物（各 NTP、 2.5mM）
・最終体積50μｌとなるまでの ddH2O
その後、以下のものを添加する：
・１μｌの未変性 Pfu DNAポリメラーゼ(2.5Ｕ／μｌ）
４．各反応に30μｌの鉱油をかぶせる。
Figure 0004141463
反応を循環させ、産物を消化する。
１．表１に概略的に示された循環パラメータを用いて各反応を熱循環させる。
２．望ましい突然変異タイプに応じて、10〜16回、循環パラメータのセグメント２をくり返す（すなわち、点突然変異について10サイクル、単一アミノ酸変化について12サイクルそして、多数のアミノ酸の欠失又は挿入について16サイクル）。
３．線形増幅の後、反応を37℃以下まで冷却させるため２分間反応を氷上に置く。
注：次の消化段階においては、反応試験管に DpnＩ制限酵素を添加するとき、鉱油オーバレイの下にピペットの先端を挿入することが重要である。
４．ピペットの先端で鉱油オーバレイの下に各増幅反応に対し直接 DpnＩ制限酵素（10Ｕ／μｌ）を１μｌ添加する。
５．溶液をピペットで数回吸い上げたりおろしたりすることにより、各々の反応混合物を穏やかにかつ撤底的に混合する。１分間マイクロ遠心分離機の中で反応混合物を遠心沈殿させ直ちに各反応を37℃で１〜２時間インキュベートさせて親の（すなわち突然変異を受けていない）スーパコイルds DNAを消化させる。
Epicurian Coli XL2-Blue UltracompetentTM細胞（Stratageneより入手可）内への形質転換。
以下のプロトコルは、アンピシリン又はクロランフェニコール耐性をコードするpBlue-script(R)誘導されたプラスミドで E. coliを形質転換するのに用いられ成功した。カナマイシン耐性をコードするプラスミドの形質転換は、 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第２版、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) の中に記述された形質転換プロトコルのステップ３と４の間での SOC培地（培地及び試薬の調製を参照）を用いた超コンピテント細胞の10倍希釈の後、30〜45分の外殖を必要とする。その他の選択も一定数の類似の外殖期間を必要とする可能性がある。
１．氷上で Epicurian Coli XL2-BlueTM超コンピテント細胞を穏やかに解凍させる。形質転換されるべき対照及びサンプル反応の各々について、アリコートを作る（予め深冷されたFalcon(R)2059ポリプロピレン管に約50μｌの超コンピテント細胞）。
２．各々の対照及びサンプル反応からの１μｌの DpnＩ処理された DNAを、超コンピテント細胞の別々のアリコートに対し添加し、穏やかに旋回させて混合する。30分間氷上で形質転換反応をインキュベートするが、このときインキュベーション全体を通して定期的に旋回させる。
一つの任意の段階として、超コンピテント細胞の50μｌのアリコートに対し pUC18の対照プラスミドを１μｌ(0.1ng／nl）添加し上述の通りインキュベートすることにより、 Epicurian Coli XL2-Blue超コンピテント細胞の形質転換効率を確認する。
３．形質転換反応を45秒間42℃で（45秒で）ヒートパルスし、次に２分間反応を氷上に置く。このヒートパルスは、 Falcon 2059ポリプロピレン管のために最適化されていた。
４．以下に概略的に記す通り、形質転換反応を直ちに平板固定する。
ａ．20μｌの10％（ｗ／ｖ)X-gal及び20μｌの100mM IPTGが展着されたLB−アンピシリン−メチシリン寒天平板（以下の培地及び試薬の項を参照のこと）上で、全体積の対照形質転換反応及びわずか５μｌの pUC18対照形質転換反応（行なわれた場合）、を平板固定する。
注：IPTG及び X-galは、沈降することから、これらの化学物質を混合してはならない。 X-galは、ジメチルホルムアミド(DMF) 中で調製されなくてはならず、IPTGはフィルタで滅菌されたdH2O中で調製されなくてはならない。
ｂ．形質転換されつつあるプラスミドベクターにより付与される適切な抗生物質を含む寒天平板上に、各々のサンプル形質転換反応の全体積を平板固定する。
５．16時間以上37℃で形質転換平板をインキュベートする。
予想上のコロニー数は少なくとも50コロニーでなくてはならない。突然変異誘発された対照コロニーの80％以上が突然変異を含有し、IPTG及び X-galを含む寒天平板上に青色コロニとして現われるはずである。
pWhitescript 5.7-kbの対照鋳型のための突然変異誘発効率（ME）は、以下の公式から計算される。
Figure 0004141463
Figure 0004141463
引用による繰り入れ
引用された全ての特許、特許出願及び出版物は、本書に引用により繰り入れられる。
等価物
前出の書面による明細は、当業者が本発明を実践できるのに充分であるとみなされる。実際、分子生物学の分野又は関連する分野の当業者にとっては明白である本発明の実施のための上述の構成のさまざまな変更が、以下のクレームの範囲内に入るべきものとして意図されている。
図１は、部位特異的突然変異誘発の当該方法の一実施形態の概略図を提供している。段階（Ａ）は、環状閉２本鎖プラスミドを示す。突然変異誘発のための標的を表わすのに「目玉」記号が用いられている。段階（Ｂ）は、環状閉２本鎖プラスミドにアニールされた第１及び第２の突然変異誘発プライマを示す。十字記号は、突然変異誘発プライマ内の突然変異誘発部位を表わしている。矢印は、合成の方向を表わす。段階（Ｃ）は、線形周期性増幅段階からの DNA合成の結果を示す。比較的軽く隈取りされた円形領域は、突然変異誘発されたプライマに付加された新しく合成された DNAを表わしている。矢印は合成の方向を表わす。段階（Ｄ）は、選択酵素での処理の後にとどまっている突然変異誘発された DNA鎖を示す。第１及び第２の突然変異誘発されたストランドは、２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体を形成するべくアニールされているものとして示されている。各ストランド上のニックに留意されたい。段階（Ｅ）は、２本鎖の突然変異誘発された環状 DNA中間体でコンピテント細胞を形質転換させた後に回収される、結果として得られた突然変異誘発された環状２本鎖 DNA分子を示している。図中の十字記号が、段階（Ａ）の中の「目玉」に対応する突然変異誘発された部位を反映していることに留意されたい。

Claims (17)

  1. 変異誘発のため、選択された DNA分子の中へ特異的変異を導入する方法において、この DNA分子が２本鎖環状 DNA分子であり、
    前記 DNA分子に対し第１の変異誘発プライマ及び第２の変異誘発プライマをアニールする段階であって、この第１の変異誘発プライマが第２の変異誘発プライマに対し相補的な領域を含み、前記第１及び第２の変異誘発プライマがそれぞれ前記 DNA分子に対して少なくとも１個の変異部位を含む、段階、
    線形周期性増幅反応を用いて、第１の変異誘発プライマを含む第１の変異誘発された DNA鎖及び前記第２の変異誘発プライマを含む第２の変異誘発された DNA鎖を合成させる段階であって、第１の変異誘発された DNA鎖と第２の変異誘発された DNA鎖が２本鎖の変異誘発された環状 DNA中間体を形成しうる、合成段階、及び
    変異誘発のための前記 DNA分子を消化させる段階において、消化が選択酵素により媒介される、消化段階、
    を含んで成る方法。
  2. 前記選択酵素が、メチル化された DNA鎖を消化し、変異誘発のための前記選択された DNAがメチル化されている、請求項１に記載の方法。
  3. 変異誘発のための前記選択された DNA分子が、インビボでメチル化される、請求項２に記載の方法。
  4. 変異誘発のための前記選択された DNA分子がインビトロでメチル化される請求項２に記載の方法。
  5. 選択酵素が制限エンドヌクレアーゼである請求項１に記載の方法。
  6. 選択酵素が DpnＩである請求項２に記載の方法。
  7. 線形周期性増幅反応に、 Pfu DNAポリメラーゼが触媒として作用する請求項１に記載の方法。
  8. 第１及び第２の変異誘発プライマが５′リン酸化されている請求項１に記載の方法。
  9. 線形周期性増幅反応が、20回未満のサイクルだけ反復される請求項１に記載の方法。
  10. 第１及び第２の変異誘発プライマが、互いに完全に相補的である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１の変異誘発された DNA鎖及び第２の変異誘発された DNA鎖をアニールして２本鎖の変異誘発された環状 DNA中間体を形成する段階、及び
    前記２本鎖の変異誘発された環状 DNA中間体で宿主細胞を形質転換する段階をさらに含んで成る請求項１に記載の方法。
  12. 線形周期性増幅反応を用いて、選択された DNA分子の中に特異的変異を導入するためのキットにおいて、DNAポリメラーゼ、選択酵素、対照の第１及び第２の変異誘発プライマ及び対照の鋳型を含んで成るキット。
  13. さらにコンピテント細胞を含んで成る、請求項12に記載のキット。
  14. さらに濃縮された反応緩衝液を含んで成る請求項13に記載のキット。
  15. 前記 DNAポリメラーゼが Pfu DNAポリメラーゼである請求項12に記載のキット。
  16. 前記選択酵素が制限エンドヌクレアーゼである請求項12に記載のキット。
  17. 前記制限エンドヌクレアーゼが DpnＩである、請求項16に記載のキット。
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