JP5390076B2 - Pcrを用いた変異導入方法 - Google Patents
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Kunkel,T.A.(1985)Pro.Natl.Acad.Sci USA 82,488. Hashimoto−Gotoh,T. et al.(1995)Gene 152,271. LA−PCR in vitro mutagenesis Kit(タカラバイオ社製、製品コード:RR016)取扱説明書 Mutan(登録商標)−Super Express Km(タカラバイオ社製、製品コード:RR022)取扱説明書 KOD−Plus−Mutagenesis Kit(東洋紡株式会社製、製品コード:SMK−101)取扱説明書
以上のように、操作が簡便で、変異導入効率に優れ、さらに目的以外の変異が入らない変異導入方法という観点からするとまだまだ不十分な方法であるのが現状である。
(1)鋳型となる環状DNA、前記鋳型DNAにアニールし、5’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも1組の変異導入用プライマー対、並びにDNAポリメラーゼからなる混合液を調製する工程、ここで、変異を導入する部位は前記のプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在し;
(2)工程(1)で調製した混合物をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)に供し、5’突出末端を有するDNA断片を含むPCR産物として増幅する工程;
(3)工程(2)で得られたPCR産物を用いて、宿主を形質転換する工程。
本発明の第1の発明において、プライマー対が5’末端側の互いに相補的な領域の長さが9〜30塩基、変異導入部位から3’末端の長さが12〜30塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対であってもよく、宿主が相同組換え能欠損株であってもよく、コンピテントセルであってもよい。
(1)鋳型となる環状DNA;
(2)(1)の鋳型DNAにアニールし、5’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも1組のプライマー対、ここで、変異を導入する部位はプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在する;および
(3)DNAポリメラーゼ。
本発明の第2の発明において、プライマー対が5’末端側の互いに相補的な領域の長さが9〜30塩基、変異導入部位から3’末端の長さが12〜30塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対であってもよい。
また、本発明の変異導入方法は、置換のみならず、欠失、挿入変異のいずれにおいても好適に使用できる。
本発明の変異導入方法は、変異導入が望まれる核酸断片を含むプラスミドDNAを鋳型にして、それぞれの5’末端側が相補的なプライマー対と5’−3’エキソヌクレアーゼ活性および鋳型置換活性を有しないα様DNAポリメラーゼを用いることにより、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって上記プライマーの互いに相補的な部分(オーバーラップ領域)が5’突出となった二本鎖DNAを作製することを特徴とする。当該二本鎖DNAは、宿主の形質転換が可能な環状構造(部分的環状構造)をとることができる。
さらに、変異導入用プライマーは、オーバーラップ領域に接してその3’末端側に、鋳型DNAに相補的な配列を有する。この鋳型DNAに相補的な配列は、前記変異導入部位から3’末端側に12〜30塩基、特に好ましくは、15〜21塩基の領域があればよい。
本発明の方法において、上記変異導入用プライマーの設計は、置換、欠失、挿入変異のいずれの場合も同様にして行えばよく、普遍的にプライマーの設計が行える利点を有する。本発明の方法において、特に限定はされないが例えば、置換および挿入の場合は1〜30塩基の範囲、特に好ましくは、1〜21塩基の範囲で変異導入を効果的に行うことができる。特に欠失の場合は、欠失させる鎖長に制限はない。
本発明の方法に用いるα様DNAポリメラーゼには、特に限定はないが例えば、Pfu DNAポリメラーゼ(ストラタジーン)、KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡)、PrimeSTAR DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)等が好適に使用できる。
本発明で使用するDNAポリメラーゼは、上記特性を有する限り、野生型でもよく、変異体あるいは融合体であっても良い。特に限定はないが例えば、Pfx50 DNA ポリメラーゼ(インビトロジェン社)、Phusion DNAポリメラーゼ(フィンザイム社)、iProof DNAポリメラーゼ(キアゲン)等が本発明に好適に使用できる。
前記の補助因子を含有するDNAポリメラーゼとして、特に限定はないが例えば、PfuTurbo DNAポリメラーゼ、PfuTurbo Cx DNAポリメラーゼ、PfuUltra DNAポリメラーゼ、PfuUltraII Fusion DNAポリメラーゼ(ストラタジーン)、Accuprime Pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)、PrimeSTAR Max DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ)等が好適に使用できる。
本発明のもう1つの形態は、本発明の部位特異的変異導入方法を実施するためのキットである。本発明のキットは、当該方法を実施する上で使用するための単数又は複数の酵素又はその他の試薬を含む。本発明のキットには、当該方法を実施するときに精度と正確さの両方を確保するよう、予め測定された量の試薬が含まれていてもよい。また、本発明のキットには、本発明の方法を実施方法が記載された指示書が含まれていてよい。本発明のキットは、最低限、以下のものを含む:α様DNAポリメラーゼ、対照鋳型核酸、対照用変異導入プライマー対。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については、2001年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T.Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第3版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.)に記載の方法によった。
本発明の方法を用いた、プラスミドDNApUC118(全長:3.2kbp)への部位特異的な変異誘導効率について検討した。本実施例では、プラスミドDNApUC118と大腸菌JM109のLacZ表現系を利用し、このpUC118を鋳型に表現型が変化する変異導入をPCRにて行い、その産物で直接大腸菌を形質転換して、選択培地上で培養し生じたコロニーの表現型より変異導入効率を評価することにした。
pUC118の塩基配列(GenBank Acc.No.E14304)をもとに部分特異的変異を含むpUC−sub3Fプライマー(配列番号1)とpUC−sub3Rプライマー(配列番号2)、pUC−del3Fプライマー(配列番号3)とpUC−del3Rプライマー(配列番号4)およびpUC−ins6Fプライマー(配列番号5)とpUC−ins6Rプライマー(配列番号6)の3種類のプライマー対を合成した。
変異導入効率は、以下のようにして測定した。すなわちpUC118DNA 10pgを鋳型に、上記(1)で作製した各10pmolの変異導入用プライマーとPrimeSTAR(登録商標) Max Premix(2×)(タカラバイオ社製)25μlを用いて反応容量50μlのPCRを行なった。反応条件は98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒を1サイクルとする30サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物の2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル(タカラバイオ社製)100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG,X−gal)上で培養し、白コロニー(変異体)と青コロニー(バックグラウンド)の数をカウントした。
その結果を表1に示す。
上記変異導入体(挿入)白コロニーより117個を任意に選択し培養後、プラスミドDNAを取得しそれぞれの全塩基配列を決定し解析した。その結果、117クローンすべてにおいて目的の変異導入が確認された。さらに驚くべきことに、目的部位以外の変異は全塩基数370,656塩基中わずか4塩基のみであった。市販されているKOD−plus−Mutagenesisキットでは、80%を越える変異導入効率で、48,000塩基に1塩基であることと比較しても、本発明の方法の変異導入効率は驚くほど高いうえに、変異導入部位以外の正確性も非常に高いものであることを確認した。
本発明の方法を用いて長鎖のDNA断片の変異導入ができるかどうかを確認した。まず、pUC118DNAのHinc IIサイトに8.5kbのDNA断片(GenBank Acc.No.NT 009237記載の塩基配列の核酸番号4034224〜4042731の範囲のDNA断片)を挿入したプラスミドDNAを作製し、このプラスミドDNAより8.5kbを欠失させるための変異導入用プライマー、pUC−del8KF(配列番号7)とpUC−del8KR(配列番号8)を合成した。pUC−del8KFプライマーとpUC−del8KRプライマーは、いずれもその5’末端より15塩基が当該プライマー間で相補的であり、pUC−del3Fプライマーの5’末端から7番目と8番目の塩基の間で鋳型DNAに相補的な8.5kbが欠失している。一方、pUC−del8Rプライマーは、その5’末端から8番目と9番目の塩基の間で鋳型DNAに相補的な8.5kbが欠失している。つまり、全長25塩基のpUC−sub3Fプライマーと全長26塩基のpUC−sub3Rプライマーは、8508塩基対欠失した鋳型DNAに相補的である。前記構成において、欠失変異が導入された形質転換体は、プラスミドDNAがpUC118に復帰し青コロニーを形成し、欠失変異が導入されない形質転換体は白コロニーを形成する。
また、変異導入体(青コロニー)10個より取得したプラスミドDNAについて電気泳動によりそのサイズを確認した。その結果を図2に示す。図2において、レーン1は変異導入前、レーン2〜11は変異導入後のDNAを示す。レーンMはλ/HindIIIマーカーを示す。
すなわち、Inverse 非PCR法とエンドヌクレアーゼを組み合わせた変異導入方法(特許文献3)では変異導入用プライマーの5’末端側および3’末端側の配列双方が効率よく鋳型にアニールしないために不可能であった長鎖DNA断片の欠失も、本発明の変異導入方法において、簡便、高効率に取得できることが確認できた。
(1)変異導入用プライマーの合成
プライマー構造が変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の4対のプライマーを合成した。
pUC118DNA 10pgを鋳型に、前記の各10pmolの変異導入用プライマー対とPrimeSTAR Max Premix(2×)25μlを用いて反応容量50μlのPCRを行なった。反応条件は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒を1サイクルとする35サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X−gal)上で培養し、白コロニー(変異体)数をカウントした。
(1)変異導入およびその効率
pUC118 10pgを鋳型にそれぞれ10pmolの前記変異導入用プライマーpUC−ins6F(配列番号5)とpUC−ins6Rプライマー(配列番号6)を用いて50μlの反応系でPCRを行った。PCRにはPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)、KOD−plus−DNAポリメラーゼ(東洋紡社製)、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)、rTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を使用し、反応組成は各製品添付の取り扱い説明書に従った。PCR条件は、PCR増幅産物量および増幅の特異性をそろえるために、以下のように設定した。
PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ;
98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 4分を1サイクルとする30サイクル反応
KOD−plus−DNAポリメラーゼ;
98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 4分を1サイクルとする30サイクル反応
Pyrobest DNAポリメラーゼ;
98℃ 10秒、68℃ 4分を1サイクルとする30サイクル反応
rTaq DNAポリメラーゼ;
98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 4分を1サイクルとする40サイクル反応
プライマーの5’末端側領域の鋳型DNAへのアニーリングと形質転換効率について検討した。100pgのpUC118と100pgのpUC118DNAのHinc IIサイトに8.5kbのDNA断片を挿入したプラスミドDNAを鋳型に、前述のpUC−del8KF(配列番号7)とpUC−del8KRプライマー(配列番号8)各10pmolとPrimeSTAR Max Premix(2×)25μlを用いて反応容量50μlでPCRを行なった。反応条件は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒を1サイクルとする30サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X−gal)上で培養し、青コロニー(変異体)数をカウントした。なお、本実施例においては、pUC118DNAのHinc IIサイトに8.5kbのDNA断片を挿入したプラスミドDNAは、当該8.5kbのDNA断片の欠失変異が起こるため、選択プレート上では白コロニーから青コロニーになる。
鋳型となる核酸がpUC118の場合には、プライマーの5’末端側の15塩基が鋳型DNAに連続して相補的であるのでそれぞれのプライマーからの伸長鎖は鋳型を一周して自己の5’末端でストップし、効率よく部分的環状二本鎖DNAを産生するためのプライマー伸長産物ができるのに対し、鋳型DNAがpUC118 DNAのHinc IIサイトに8.5kbのDNA断片を挿入したプラスミドDNAの場合、プライマーの5’末端側の15塩基に相補的な配列が8.5kbのインサートで7塩基と8塩基に分断されているために、プライマーの5’末端側の8塩基が鋳型にアニールしにくく、自己の5’末端でストップしたプライマー伸長産物ができにくい。このことにより部分的環状二本鎖DNAができる効率に差が生じ、形質転換体取得効率に差が生じたと考えられる。以上のことから、本発明の方法は、PCR過程で生じる部分的環状二本鎖構造が生成することにより、従来の相同的組み換え型の変異導入方法よりも変導導入効率を大幅に改善することができることを確認した。
(1)変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の3対のプライマーを合成した。
プライマー対1:pUC−sub3F−21−9(配列番号15)プライマーとpUC−sub3R−21−9(配列番号16)プライマーは、いずれもその5’末端より21塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの5’末端から10〜12番目の塩基が鋳型DNAと相補的でない。また、pUC−sub3F−21−9プライマーおよびpUC−sub3R−21−9プライマーは全長30塩基中27塩基が鋳型DNAに相補的である。
pUC118DNA 100pgを鋳型に、前記の各10pmolの変異導入用プライマー対とPrimeSTAR Max Premix(2×)25μlを用いて、反応容量50μlのPCRを行なった。反応条件は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 15秒を1サイクルとする30サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X−gal)上で培養し、白コロニー(変異体)の数をカウントした。
(1)変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の4対のプライマーを合成した。
プライマー対1:pUC−sub3F−21−15(配列番号19)プライマーとpUC−sub3R−21−15(配列番号20)プライマーは、いずれもその5’末端より21塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの5’末端から10〜12番目の塩基が鋳型DNAと相補的でない。また、pUC−sub3F−21−15プライマーおよびpUC−sub3R−21−15プライマーは全長36塩基中33塩基が鋳型DNAに相補的である。
pUC118DNA 100pgを鋳型に、前記の各10pmolの変異導入用プライマー対とPrimeSTAR Max Premix(2×)25μlを用いて、反応容量50μlのPCRを行なった。反応条件は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒を1サイクルとする30サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X−gal)上で培養し、白コロニー(変異体)の数をカウントした。
(1)変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために、以下の5対のプライマーを合成した。
プライマー対1:pUC−sub3F−15−18(配列番号25)プライマーとpUC−sub3R−15−18(配列番号26)プライマーは、いずれもその5’末端より15塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの5’末端から7〜9番目の塩基が鋳型DNAと相補的でない。また、pUC−sub3F−15−18プライマーおよびpUC−sub3R−15−18プライマーは全長33塩基中30塩基が鋳型DNAに相補的である。
pUC118DNA 100pgを鋳型に、前記の各10pmolの変異導入用プライマー対とPrimeSTAR Max Premix(2×)25μlを用いて、反応容量50μlのPCRを行なった。反応条件は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒を1サイクルとする30サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X−gal)上で培養し、白コロニー(変異体)の数をカウントした。
実施例8 プライマーの構造と変異体取得効率の検討
(1)変異導入用プライマーの合成
プライマー構造の変異体取得効率に及ぼす影響を明らかにするために以下の7対のプライマーを合成した。
プライマー対1:pUC−FC9−18(配列番号33)プライマーとpUC−RC9−18(配列番号34)プライマーは、いずれもその5’末端より9塩基が当該プライマー間で相補的であり、双方のプライマーの5’末端から1〜9番目の塩基が鋳型DNAと相補的でない。また、pUC−FC9−18プライマーおよびpUC−RC9−18プライマーは全長27塩基中18塩基が鋳型DNAに相補的である。
pUC118DNAのHinc IIサイトに4kbのDNA断片(GenBank Acc.No.AC104389 記載の塩基配列の核酸番号20359〜24408の範囲のDNA断片)を挿入したプラスミドDNA 100pgを鋳型に、前記の各10pmolの変異導入用プライマー対とPrimeSTAR Max Premix(2×)25μlを用いて、反応容量50μlのPCRを行なった。反応条件は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 20秒を1サイクルとする30サイクル反応で行なった。反応終了後、増幅産物2μlをそのままE.coli JM109コンピテントセル100μlに添加し、0℃ 30分、42℃ 45秒の処理後、SOC培地1mlを加えて37℃で1時間振とう培養した。そのうち100μlを選択プレート(LB+Amp、IPTG、X−gal)上で培養し、白コロニー(変異体)の数をカウントした。
SEQ ID NO:2: Synthetic primer pUC-sub3R
SEQ ID NO:3: Synthetic primer pUC-del3F
SEQ ID NO:4: Synthetic primer pUC-del3R
SEQ ID NO:5: Synthetic primer pUC-ins6F
SEQ ID NO:6: Synthetic primer pUC-ins6R
SEQ ID NO:7: Synthetic primer pUC-del8KF
SEQ ID NO:8: Synthetic primer pUC-del8KR
SEQ ID NO:9: Synthetic primer pUC-insXhoIF+3
SEQ ID NO:10: Synthetic primer pUC-insXhoIR+3
SEQ ID NO:11: Synthetic primer pUC-insXhoIC6,7F
SEQ ID NO:12: Synthetic primer pUC-insXhoIC6R
SEQ ID NO:13: Synthetic primer pUC-insXhoIC7,8R
SEQ ID NO:14: Synthetic primer pUC-insXhoIC8F
SEQ ID NO:15: Synthetic primer pUC-sub3F-21-9
SEQ ID NO:16: Synthetic primer pUC-sub3R-21-9
SEQ ID NO:17: Synthetic primer pUC-sub3F-9-12
SEQ ID NO:18: Synthetic primer pUC-sub3R-9-12
SEQ ID NO:19: Synthetic primer pUC-sub3F-21-15
SEQ ID NO:20: Synthetic primer pUC-sub3R-21-15
SEQ ID NO:21: Synthetic primer pUC-sub3F-21-12
SEQ ID NO:22: Synthetic primer pUC-sub3R-21-12
SEQ ID NO:23: Synthetic primer pUC-sub3F-21-6
SEQ ID NO:24: Synthetic primer pUC-sub3R-21-6
SEQ ID NO:25: Synthetic primer pUC-sub3F-15-18
SEQ ID NO:26: Synthetic primer pUC-sub3R-15-18
SEQ ID NO:27: Synthetic primer pUC-sub3F-15-15
SEQ ID NO:28: Synthetic primer pUC-sub3R-15-15
SEQ ID NO:29: Synthetic primer pUC-sub3F-15-9
SEQ ID NO:30: Synthetic primer pUC-sub3R-15-9
SEQ ID NO:31: Synthetic primer pUC-sub3F-15-6
SEQ ID NO:32: Synthetic primer pUC-sub3R-15-6
SEQ ID NO:33: Synthetic primer pUC-FC9-18
SEQ ID NO:34: Synthetic primer pUC-RC9-18
SEQ ID NO:35: Synthetic primer pUC-FC12-18
SEQ ID NO:36: Synthetic primer pUC-RC12-18
SEQ ID NO:37: Synthetic primer pUC-FC15-18
SEQ ID NO:38: Synthetic primer pUC-RC15-18
SEQ ID NO:39: Synthetic primer pUC-FC18-18
SEQ ID NO:40: Synthetic primer pUC-RC18-18
SEQ ID NO:41: Synthetic primer pUC-FC21-18
SEQ ID NO:42: Synthetic primer pUC-RC21-18
SEQ ID NO:43: Synthetic primer pUC-FC24-18
SEQ ID NO:44: Synthetic primer pUC-RC24-18
SEQ ID NO:45: Synthetic primer pUC-FC27-18
SEQ ID NO:46: Synthetic primer pUC-RC27-18
Claims (3)
- 下記工程を包含することを特徴とする、部位特異的変異導入方法;
(1)鋳型となる環状DNA、前記鋳型DNAにアニールし、5’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも1組の変異導入用プライマー対、並びに5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有さないDNAポリメラーゼからなる混合液を調製する工程、ここで、変異を導入する部位は前記のプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在し、かつ、プライマー対が5’末端側の互いに相補的な領域の長さが12〜21塩基、変異導入部位から3’末端の鋳型DNAに相補的な配列の長さが15〜21塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対であり;
(2)工程(1)で調製した混合物をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)に供し、5’突出末端を有するDNA断片を含むPCR産物として増幅する工程;
(3)工程(2)で得られたPCR産物を直接宿主と混合して、宿主を形質転換する工程。 - 宿主が相同組換え能欠損株である、請求項1記載の方法。
- 請求項1記載の部位特異的変異導入方法のためのキットであって、以下の構成品を含むキット;
(1)鋳型となる環状DNA;
(2)(1)の鋳型DNAにアニールし、5’末端側が互いに相補的な領域を有する少なくとも1組のプライマー対、ここで、変異を導入する部位はプライマー対の互いに相補的な領域に対となって存在し、かつ、プライマー対が5’末端側の互いに相補的な領域の長さが12〜21塩基、変異導入部位から3’末端の鋳型DNAに相補的な配列の長さが15〜21塩基であるプライマーからなる変異導入用プライマー対である;および
(3)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有さないDNAポリメラーゼ。
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