JP4031049B2 - タンパク質精製 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的に、タンパク質精製に関する。特に本発明は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体及びイムノアドヘシンのようなCH2/CH3領域含有タンパク質を精製するための方法に関する。
関連分野の説明
タンパク質のラージスケールで実用的な精製は、ますますバイオテクノロジー産業について重要な問題である。一般的にタンパク質は、該タンパク質についての遺伝子を含有する組換えプラスミドの挿入によって興味あるタンパク質を生産するように操作された哺乳動物または細菌細胞系のそれぞれを用いて、細胞カルチャーによって生産される。用いられる細胞系は生きている生物であるため、それらは糖、アミノ酸、及び増殖因子を含み、通常動物血清の調製物から補われる複雑な増殖培地を用いて培養しなければならない。ヒトの治療薬としての使用のための十分な純度に、該細胞から与えられ、細胞自身の生産物由来である化合物の混合物からの望ましいタンパク質の分離は、大変困難なチャレンジを引き起こす。
細胞破片からのタンパク質の精製法は、初めに該タンパク質の発現部位に依存する。あるタンパク質は細胞から周囲の培地への直接的な分泌を引き起こしうる；他のものは細胞内に存在する。後者のタンパク質については、精製方法の第一の工程には細胞の溶解が含まれ、それは機械的破壊、浸透圧ショック、または酵素的処理を含む様々な方法によってなされる。上記破壊は、ホモジェネート内に該細胞の完全な内容物を放出し、さらにそれらの小さなサイズのため取り出すことの困難である細胞以下の断片を生ずる。これらは一般的に、様々な遠心分離または濾過によって除去される。より小さいサイズであるが、細胞の自然な死、及び実施されたタンパク質生産の過程における細胞内宿主細胞タンパク質の放出のために、直接的に分泌されたタンパク質に関しても同じ問題が生ずる。
一度興味あるタンパク質を含む精製溶液が得られると、該細胞から生産された他のタンパク質からのその分離は通常、様々なクロマトグラフィー法の組み合わせを用いて実施される。これらの方法は、タンパク質の混合物をその電荷、疎水性の程度、またはサイズに基づいて分離する。いくつかの様々なクロマトグラフィー樹脂がこれらの方法のそれぞれについて入手可能であり、含まれる特定のタンパク質に対する精製スキームの正確な設計を可能にする。これらの分離法のそれぞれの本質は、タンパク質を長いカラムを通じて様々な速度で移動させ、それらがカラムをさらに移動するために増大していく物理的分離を成し遂げること、または分離媒体に選択的に接着させ、様々な溶媒によって異なって溶出されるようにすることのいずれかを引き起こす。ある場合には、不純物が特異的に該カラムに接着し、興味あるタンパク質は接着しない場合、望ましいタンパク質は不純物から分離され、つまり興味あるタンパク質は「フロースルー」内に存在する。
アフィニティークロマトグラフィーは、精製されるタンパク質と固定化した捕捉試薬の間の特異的な相互作用を利用するものであり、あるタンパク質についてのオプションとして存在する。プロテインＡは、Fc領域を含む抗体のようなタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーについて有用な吸着剤である。プロテインＡは、抗体のFc領域に対して高アフィニティー（ヒトIgGに対して約10-8M）で結合するStaphylococcus aureas由来の41kD細胞壁タンパク質である。
発明の概要
混在したタンパク質調製物のプロテインＡクロマトグラフィーに関連した問題がここで明らかにされている。特に、プロテインＡを吸着するためのガラスまたはシリカ表面を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにおいて（例えばプロテインＡが制御された直径を有するガラスカラムまたはケイ酸カラムに固定化されている場合）、タンパク質調製物における不純物（タンパク質調製物がCHO細胞から由来する場合のChinese Hamster Ovaryタンパク質(CHOP)のような）は、固相のガラスまたはシリカ表面に接着することが観察されている。これは、固相に対する非特異的な接着を妨げることを目指して固相が試薬（グリセロールのような）を用いて皮膜されている場合でさえ生じることが見出された。この問題に答えるために、中間的な洗浄工程がここで用いられている。この洗浄工程は不純物を除去するのに役立つが、固相から固定化プロテインＡまたはプロテインＡに結合した興味あるタンパク質は除去しない。特に、疎水性電解質、例えば塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)及び塩化テトラエチルアンモニウム(TEAC)が、中間的洗浄工程で用いられ得ることが見出されている。
したがって本発明は、以下の連続的に実施される工程を含むプロテインＡクロマトグラフィーによるタンパク質の不純化した溶液から、CH2/CH3領域を含むタンパク質の精製法を提供する：(a)シリカまたはガラスを含む固相上に固定化したプロテインＡに対するタンパク質の吸着；(b)疎水性電解質溶媒を用いた固相の洗浄による固相に結合した不純物の除去；及び(c)固相からのタンパク質の回収。
好ましい実施態様として、該タンパク質は抗体（例えば抗HER2，抗IgEまたは抗CD20抗体）またはイムノアドヘシン（例えばTNFレセプターイムノアドヘシン）である。
好ましい実施態様の詳細な説明
定義：
ここで用いられる場合、「プロテインＡ」なる語はその天然のソースから回収されたプロテインＡ、合成的に生産されたプロテインＡ（例えばペプチド合成または組換え法によって）、及びCH2/CH3領域を有するタンパク質を結合する能力を維持するその変異体を包含する。プロテインＡは、Repligen、Phamacia及びFermatechから商業的に購入可能である。
プロテインＡは固相に固定化される。「固相」によって、プロテインＡが接着しうる非水性のマトリックスを意味する。ここで興味ある固相とは、ガラスまたはシリカ表面を含むものである。該固相は、精製カラムまたは分離した粒子の非連続的な相であろう。好ましい実施態様として、該固相は制御された直径のガラスカラムまたはケイ酸カラムである。特定の実施態様として、該固相はそれに対する不純物の非特異的な接着を妨げることを企図して試薬（グリセロールのような）を用いて皮膜されている。
ここで興味あるタンパク質はCH2/CH3領域を含み、それ故プロテインＡクロマトグラフィーによる精製に適したものである。ここで用いられる「CH2/CH3領域」なる語は、プロテインＡと相互作用するイムノグロブリン分子のFc領域におけるアミノ酸残基をいう。好ましい実施態様として、CH2/CH3領域は完全なCH2領域を含み、それに完全なCH3領域が引き続き、最も好ましくはイムノグロブリンのFc領域を含む。CH2/CH3領域含有タンパク質の例としては、抗体、イムノアドヘシン及びCH2/CH3領域と融合した、または接合した興味あるタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。
「中間的洗浄工程」は、興味あるタンパク質が固相に位置しプロテインＡに吸着した後、該タンパク質がカラムから回収される前に実施される工程である。中間的洗浄工程は、固相から興味あるタンパク質を有意に溶出することなく、固相に非特異的に結合した不純物を除去するように機能する。中間的洗浄工程においては、固相は疎水性電解質溶媒を用いて洗浄される（例えば該疎水性電解質溶媒は固相がカラムである場合、プロテインＡカラムを通過する）。
中間的洗浄工程における「疎水性電解質溶媒」は、固定化プロテインＡまたはそれに吸着した興味あるタンパク質を有意に溶出することなく、該固相に結合した不純物を溶出することが可能である。好ましくは該疎水性電解質溶媒は、一つ以上の疎水性電解質を含む水性キャリアー（例えばバッファー）である。疎水性電解質の例として、アルキルアミン；塩化テトラメチルアンモニウム(TEMAC)、塩化テトラエチルアンモニウム(TEAC)、塩化テトラプロピルアンモニウム及び塩化テトラブチルアンモニウムが含まれる。
「バッファー」とは、酸−塩基接合構成要素の機能によってpHの変化を妨げる緩衝溶液である。ここで「平衡バッファー」とは、興味あるタンパク質を流すための固相（固定化プロテインＡを有する）を調製するために用いられるものである。平衡バッファーは好ましくは等張性であり、一般的に約６から約８の範囲のpHを有する。実施例の平衡バッファーは、25mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.1であった。「ローディングバッファー」とは、プロテインＡが固定化されている固相上のCH2/CH3領域含有タンパク質及び不純物の混合物を流すために用いられるものである。しばしば平衡バッファー及びローディングバッファーは同じ意味で用いられる。「溶出バッファー」は、固定化プロテインＡからCH2/CH3領域含有タンパク質を溶出するために用いられる。好ましくは該溶出バッファーは低pHを有し、それによってプロテインＡと興味あるタンパク質の間の相互作用を破壊する。好ましくは低pH溶出バッファーは、約２から約５の範囲、最も好ましくは約３から約４の範囲のpHを有する。この範囲内にpHを制御するであろうバッファーの例として、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、及びアンモニウムの各バッファー、同様にこれらの組み合わせが含まれる。好ましい上記バッファーはクエン酸塩及び酢酸塩バッファーであり、最も好ましくはクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムバッファーである。他の溶出バッファーは、高pHバッファー（例えば９以上のpHを有するもの）または興味あるタンパク質を溶出するためのMgCl2(2mM)のような化合物または組成物を含むバッファーを含むことが企図される。
「抗体」なる語は最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体（フルレングスモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、マルチ特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びここで定義されるCH2/CH3領域を維持するまたはそれを含むように修飾された範囲で抗体断片を特異的にカバーする。
「抗体断片」には、フルレングス抗体の一部分、一般的にはその抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体断片の例としては、Fab,Fab',F(ab')2及びFv断片；単一鎖抗体分子；ディアボディー；直鎖状抗体；及び抗体断片から形成されたマルチ特異性抗体が含まれる。
ここにおいて使用される「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均質な抗体、すなわち母集団を含むそれぞれの抗体がわずかに存在してもよい天然に生じ得る変異を除いて同等であるような母集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均質な抗体の母集団から得られ、いずれかの特定方法による産生を要求するものとも解されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler等，Nature 256:495(1975)により最初に記述されたハイブリドーマ法により調製されてよく、あるいは組換えDNA法により調製されてもよい（米国特許第4,816,567号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等，Nature 352:624-628(1991)及びMarks等，J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記述される技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
ここにおけるモノクローナル抗体は、特定的には「キメラ」抗体（イムノグロブリン）を含み、そのH及び／またはL鎖の一部は特定の種から誘導された抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または特定の抗体種若しくは亜種に属するものであり、その一方で鎖の残る部分は他の種から誘導された抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または他の抗体種若しくは亜種に属するものであり、加えて、それらが所望の生物学的活性を示す限りこのような抗体の断片も含む（Cabilly等，前出文献；Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)）。
ここで用いられる「超可変領域」なる語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域には、「相補性決定領域」または「CDR」（すなわち軽鎖可変ドメインにおける24-23(L1),50-56(L2)及び89-97(L3)残基、及び重鎖可変ドメインにおける31-35(H1),50-65(H2)及び95-102(H3)残基；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)）由来のアミノ酸残基、及び／または「超可変ループ」（すなわち軽鎖可変ドメインにおける26-32(L1),50-52(L2)及び91-96(L3)残基、及び重鎖可変ドメインにおける26-32(H1),53-55(H2)及び96-101(H3)残基；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)）由来の残基が含まれる。「フレームワーク」または「FR」残基は、ここで定義される超可変領域残基以外の可変ドメインの残基である。
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトイムノグロブリンから由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合において、ヒト化抗体は受容者の超可変領域残基が、望ましい特異性、アフィニティー、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置換されているヒトイムノグロブリン（受容者抗体）である。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、相当する非ヒト残基によって置換されている。さらにヒト化抗体は、受容者抗体またはドナー抗体の両者で見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の能力をさらに洗練するためになされる。一般的にヒト化抗体は、少なくとも一つ、そして典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、その場合超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒトイムノグロブリンのものに相当し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒトイムノグロブリン配列のものである。ヒト化抗体は場合により、イムノグロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトイムノグロブリンのものの少なくとも一部もまた含むであろう。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)参照。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる語は、異種「アドヘシン」タンパク質（例えばレセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を、イムノグロブリン定常ドメインのエフェクター機能と結合した抗体様分子を示す。構造的にイムノアドヘシンは、抗体（すなわち「異種」である）及びイムノグロブリン定常ドメイン配列の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外のものである望ましい結合特異性と、アドヘシンアミノ酸配列の融合物を含む。イムノアドヘシンにおけるイムノグロブリン定常ドメイン配列は好ましくはγ１，γ２またはγ４重鎖から由来し、それはこれらの領域を含むイムノアドヘシンはプロテインＡクロマトグラフィーによって精製しうるからである(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。
ここで用いられる「リガンド結合ドメイン」なる語は、いかなる天然の細胞表面レセプター、または相当する天然のレセプターの質的にリガンド結合を少なくとも維持するそれらの領域または誘導体を指す。特異的な実施態様として、該レセプターはイムノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに対して異種である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチド由来である。イムノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないがそれにも関わらずこの定義によって特異的にカバーされる他のレセプターは、サイトカインに対するレセプター、特にチロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）、ヘマトポイエチン及び神経成長因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、及び細胞接着分子、例えば(E-,L-及びP-)セレクチンである。
「レセプター結合ドメイン」なる語は、細胞接着分子、または相当する天然のリガンドの質的なレセプター結合能力を少なくとも維持する上記天然のリガンドのいかなる領域または誘導体を含む、レセプターに対するいかなる天然のリガンドをも指すために用いられる。この定義は他のもののうちで特異的に、上記記載のレセプターに対するリガンド由来の結合配列を含む。
「抗体−イムノアドヘシンキメラ」とは、抗体（ここで定義されている）の少なくとも一つの結合ドメインを、少なくとも一つのイムノアドヘシン（本出願で定義されている）と結合した分子を含む。例示的な抗体−イムノアドヘシンキメラは、Berg et al.,PNAS(USA)88:4723-4727(1991)及びChamow et al.,J.Immunol.153:4268(1994)に記載されている二重特異性CD4-IgGキメラである。
発明の実施の形態
ここでの工程は、プロテインＡクロマトグラフィーによる不純物からのCH2/CH3領域含有タンパク質の精製を含む。好ましい実施態様として、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製されるタンパク質は、抗体、イムノアドヘシンまたはCH2/CH3領域と融合または接合したタンパク質である。上記分子を生産する方法は以下に議論されるであろう。
１．抗体
(i)抗体選択及び調製
ここでの抗体は興味ある抗原に対して向けられている。好ましくは該抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または疾病に苦しんでいる哺乳動物に対する抗体の投与が該哺乳動物における治療上の利益を引き起こしうる。しかしながら非ポリペプチド抗原（腫瘍関連グリコリピドのような；米国特許第5,091,178号参照）に向けられた抗体もまた企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えばレセプター）または増殖因子のようなリガンドであろう。例示的な抗原には、以下のセクション(3)に記載されたタンパク質が含まれる。本発明によって包含される抗体に対する好ましい分子ターゲットには、CD3,CD4,CD8,CD19,CD20及びCD34；EGFレセプター，HER2,HER3またはHER4レセプターのようなErbBレセプターファミリーのメンバー；LFA-1,Mac1,P150,95,VLA-4,ICAM-1,VCAM及びαまたはβサブユニットを含むαv/β3インテグリン（例えば抗CD11a,抗CD18または抗CD11b抗体）のような細胞接着分子；VEGFのような増殖因子；IgE；血液型抗原；flk2/flt3レセプター；肥満(OB)レセプター；mplレセプター；CTLA-4；プロテインＣ等が含まれる。
場合により他の分子に接合した可溶性抗原またはその断片は、抗体を生産するための免疫原として用いられ得る。レセプターのような膜貫通分子については、これらの断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）は免疫原として用いられ得る。代わりに、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として用いられ得る。上記細胞は天然のソースから由来し得（例えばガン細胞系）、または膜貫通分子を発現するための組換え法によってトランスフォームされている細胞である。
抗体を調製するのに有用な他の抗原及びその形態は、当業者に明らかであろう。
(ii).ポリクローナル抗体
一般にポリクローナル抗体は、関連する抗原及びアジュバントの複数回の経皮的(sc)または腹腔内的(ip)注射により、動物に生じさせうる。関連する抗原を、免疫されるべき種に対して免疫原性のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター等と、二官能性または誘導化試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介しての接合）、N-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR及びR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを使用して接合させることは有用であろう。
動物は、100μgまたは5μgのペプチドまたは接合体（それぞれウサギまたはマウス）を３体積のフロイント完全アジュバントと合わせ、該溶液を複数部位に皮内的に注射することにより、抗原、免疫原性接合体または誘導体に対して免疫される。１ヶ月後に動物は、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたは接合体の基の量の１／５ないし１／１０を用い、複数部位の経皮注射により追加免疫される。７〜１４日後に、動物は採血され、血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は力価がプラトーにはいるまで追加免疫される。好ましくは動物は、同じ抗原の接合体であるが、異なるタンパク質に接合するか及び／または異なった交差結合試薬を介して接合する接合体にて追加免疫される。接合体は、タンパク質融合体として組換え細胞培養においても調製されうる。アルム等の凝集剤も、免疫応答を向上するために好適に使用される。
(iii).モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495(1975)によって最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して作成されるか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第4,816,567号）によって作成されてもよい。
ハイブリドーマ法において、ハムスターまたはアカゲザル等の適当な宿主動物は、免疫に使用したタンパク質に対して特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生しうるリンパ細胞を引き出すために、上述したようにして免疫される。別法として、リンパ細胞はin vitroにおいて免疫される。次いで、リンパ細胞は、ポリエチレングリコール等の適当な融合試薬を使用して、ミエローマ細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103（Academic Press, 1986））。
斯くして調製されたハイブリドーマ細胞は、非融合の親ミエローマ細胞の生育または生存を阻害する１種以上の物質を好ましくは含有する、適当な培養培地に播種され育成される。例えば親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く場合には、ハイブリドーマのための培地は、典型的にはHGPRT-欠損細胞の生育を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むであろう。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により安定した高水準の抗体産生を支持し、かつＨＡＴ培地等の培地に感受性のものである。これらの内で好ましいミエローマ細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの、及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手可能なＳＰ−２細胞等のネズミミエローマ系である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマも、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記述されている（Kozbor et al., J. Immunol. 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63（Marcel Dekker, Inc. New York, 1987））。
ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地は、該抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降または放射性免疫検定法(RIA)若しくは固相酵素免疫検定法(ELISA)等のin vitro結合アッセイにより測定される。
ハイブリドーマが、所望の特異性、親和性及び／または活性の抗体を産生することが同定された後は、該クローンは限定希釈法によりサブクローン化され得、標準法により育成される（Goding，前出文献）。この目的のために適当な培地は、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物内で腹水腫瘍としてin vivoにおいて生育されうる。
サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えばタンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー等の慣用のイムノグロブリン精製方法により、培養培地、腹水または血清から好適に分離される。好ましくは、ここに記載されるプロテインＡクロマトグラフィー法が用いられる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用方法により容易に単離され、配列決定される（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブの使用により）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されれば、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、これは次いで、大腸菌細胞、霊長類ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはイムノグロブリンタンパク質を別途産生しないミエローマ細胞にトランスフェクトさせ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。
DNAは例えば、異種ネズミ配列の場所にヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984)）、または非イムノグロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたは一部を、イムノグロブリンコード配列に共有結合することによって修飾しうる。
典型的には、一つの抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作成するために、上記非イムノグロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインに対して置換され、またはそれらは抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換される。
更なる実施態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature 348:552-554（1990）に記述される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離されうる。Clackson et al., Nature 352:624-628（1991）及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597（1991）は、ファージライブラリーを使用して、ネズミ及びヒト抗体の単離をそれぞれ記述している。引き続く文献は、鎖シャフルによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology 10:779-783（1992））、並びに極めて大きいファージライブラリー構築のための計画として組み合わせ感染及びインビボ組換え（Waterhouse et al. Nuc. Acids Res. 21:2265-2266（1993））を記述している。しかしてこれらの技術は、モノクローナル抗体の単離に関する伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対して生存可能な別の技術であり得る。
(iv).ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば“輸入”残基と称され、これは典型的には“輸入”可変領域から採られる。ヒト化は、基本的には齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体配列で置換することにより、Winter及び共同研究者の方法に従って行われうる（Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1985);Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536(1988)）。従って、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第4,816,567号）であり、実質的に完全なヒト可変領域より少ない部分が非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際的には、ヒト化抗体は典型的にはＣＤＲ残基のいくらか及び、たぶんＦＲのいくらかが、齧歯類抗体の類似部位からの残基により置換されている。
軽鎖及び重鎖の両方のヒト化抗体を作成するために使用される可変領域の選択は、抗原性を低減するために重要である。いわゆる“最適化”方法に従えば、齧歯類抗体の可変領域の配列が、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで齧歯類のものに最も近接したヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトＦＲとして認められる（Sims et al., J Immunol. 151:2296(1993)）。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列から誘導される特定の骨格を使用する。同じ骨格は、いくつかの異なるヒト化抗体についても使用され得る（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:4285(1992); Presta et al., J.Immunol. 151:2623(1993)）。
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的性質を保ってヒト化されることは更に重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従えば、ヒト化抗体は親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化生成物の分析工程により調製される。三次元イムノグロブリンモデルは、一般に利用可能であり当業者にはなじみがある。選択された候補のイムノグロブリン配列の可能な三次元配置構造を描いて映し出すコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレーを見ることは、候補のイムノグロブリン配列の機能における残基のそれらしい役割の分析、即ち候補のイムノグロブリンの抗原に対する結合能力に影響を与える残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基が、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特性が達成される様に、共通及び輸入配列から選択され、組み合わされる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗体結合への影響において、直接的かつ最も実質的に関与するものである。
別法として、免疫により、内因性イムノグロブリン産生を伴わずに完全量のヒト抗体を産生しうるトランスジェニック動物（例えばマウス）の作成が可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合的削除が、内因性抗体の産生を完全に阻害することが記述されている。このような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子の並びの移送は、抗原の攻撃に対してヒト抗体の産生を生じるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33(1993);及びDuchosal et al. Nature 355:258(1992)参照。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーにおいても産生されうる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581(1991);Vaughan et al.Nature Biotech 14:309(1996)）。
(V).抗体断片
抗体断片の生産のための様々な方法が開発されている。伝統的には、これらの断片は完全な抗体のタンパク質溶解性切断を介して由来する（例えば、Morimoto等,Jounal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)及びBrennan等,Science,229:81(1985)）。しかしながら、現在ではこれらの断片は、組換えホスト細胞によって直接的に生産され得る。例えば、抗体断片を上記開示されている抗体ファージライブラリーから単離し得る。代わりに、Fab'-SH断片を大腸菌から直接的に回収し得、F(ab')2断片を形成するために化学的に結合し得る(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。さらなるアプローチにしたがって、F(ab')2断片を組換えホスト細胞カルチャーから直接的に単離し得る。抗体断片の生産のための他の方法も当業者には明白であろう。他の実施態様では、選択物の抗体は単一鎖Fv断片(scFv)である。WO 93/16185参照。
(vi).マルチ特異性抗体
マルチ特異性抗体は、少なくとも2の異なる抗原に対する結合特異性を有する。上記分子が通常2の抗原のみを結合する一方で（すなわち二重特異性抗体,BsAb）、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を有する抗体がここで用いられるこの表現によって包含される。
二重特異的抗体の調製方法はこの技術において知られている。全長二重特異的抗体の伝統的産生は、２種のイムノグロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここにおいて２本の鎖は異なる特異性を有する（Milstein et al., Nature 305:537-539(1983)）。イムノグロブリン重鎖及び軽鎖の無作為の寄せ集めのために、これらのハイブリドーマ（クアッドローマ：Quadromas）は、１種のみが正しい二重特異性構造を有する１０種の異なる異なる抗体分子の可能な混合物を生じる。通常アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩雑であり、また生成物の収率も低い。同様な手法は、WO 93/08829及びTraunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
WO96/27011に記載されたもう一つのアプローチにしたがって、抗体分子のペアの間の界面を、組換え細胞カルチャーから回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作し得る。好ましい界面には、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部が含まれる。この方法においては、第一の抗体分子の界面由来の一つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）を用いて置換される。大きい側鎖（類）に対する同一のまたは同様のサイズの埋め合わせとなる「空洞」は、より小さなアミノ酸側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）を用いて大きいアミノ酸側鎖を置換することによって第二の抗体分子の界面に作り出される。これはホモダイマーのように他の望まれない最終産物以上にヘテロダイマーの収率を増大するためのメカニズムを提供する。
二重特異的抗体は、交差結合または“異種接合”抗体を含む。例えば、異種接合体の一方の抗体はアビジンと結合され、他方がビオチンと結合されうる。このような抗体は、例えば免疫系細胞を望ましからぬ細胞に向ける為（米国特許第4,676,980）及びＨＩＶ感染の治療のため（WO 91/00360, WO 92/200373及びEP 03089）に提案された。異種接合抗体は、都合よい交差結合方法により作成されうる。このような交差結合試薬は既知であり、種々の交差結合方法と共に米国特許第4,676,980に開示されている。
抗体断片から二重特異的抗体を生産する方法が文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は化学的接合を用いて調製され得る。Brennan等,Science,229:81(1985)は、完全な抗体をF(ab')2断片を生産するためにタンパク質溶解的に切断する方法を記載する。これらの断片は、ビシナルジチオール(vicinal dithiols)を安定化し、分子内ジスルフィド形成を妨げるために、ジチオール複合体化試薬亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。それから生産されたFab'断片を、チオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。Fab'-TNB誘導体の一つをそれから、メルカプトエチルアミンを用いた還元反応によってFab'-チオールに再変換し、二重特異的抗体を形成するために等モル量の他のFab'-TNB誘導体と混合する。生産された二重特異的抗体を、選択された酵素の固定化のための試薬として用い得る。
最近の進歩により、大腸菌からFab'-SH断片の直接的な回収が容易になり、該断片は二重特異的抗体を形成するために化学的に結合され得る。Shalaby等,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の生産を記載する。それぞれのFab'断片は、大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにin vitroで直接的な化学的結合を受ける。それ故形成された二重特異性抗体は、HER2受容体及び通常ヒトT細胞を過剰発現する細胞に結合し得、同様にヒト乳腫瘍ターゲットに対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を引き出し得る。
組換え細胞培養物から直接に二価抗体断片を製造及び単離する種々の方法も記述されている。例えば、二価異種二量体は、ロイシンジッパーを使用して調製された。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992)。Fos及びJunタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２種のことなる抗体のFab'部分を連結している。該抗体同種ダイマーは、ヒンジ領域にて還元されてモノマーが形成され、次いで再度酸化されて抗体異種ダイマーが形成された。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)により記述されている「ディアボディ」技術は、BsAb断片を作成するための別の機構を提供した。該断片は、リンカーにより軽鎖可変領域(VL)に連結する重鎖可変領域(VH)を有し、リンカーは同じ鎖の２つの領域の間で対形性を許容するには短すぎるものである。従って、一つの断片のVH及びVL領域は、他の断片の相補的VL及びVH領域と対形性することを強いられ、これによって２個の抗原結合部位が形成される。単鎖Fv(sFv)二量体を使用してBsAbを作成する他の方法も報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368(1994)参照。代わりに該抗体は、Zapata et al.Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)に記載された「直鎖状抗体」としても存在しうる。略記するとこれらの抗体は、抗原結合領域のペアを形成するタンデムFd部分(VH-CH1-VH-CH1)のペアを含む。直鎖状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
２より大きい価数を持つ抗体が計画されている。例えば三重特異的抗体が調製され得る。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
２．イムノアドヘシン
最も単純で最も直接的なデザインは、アドヘシンの結合ドメイン（例えばレセプターの細胞外ドメイン(ECD)）をイムノグロブリン重鎖のヒンジ及びFc領域と結合する。通常、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、イムノグロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端で融合するであろうが、N末端での融合もまた可能である。
典型的には、上記融合物においてコード化されたキメラポリペプチドは、イムノグロブリン重鎖の定常ドメインの少なくとも機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを維持するであろう。融合はまた、定常ドメインのFc部分のC末端で、または重鎖のCH1あるいは軽鎖の相当する領域に対して中間的にN末端でなされる。融合がなされる正確な部位は必須ではない；特定の部位が周知であり、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択される。
好ましい実施態様として、アドヘシン配列をイムノグロブリンG1(IgG1)のFc部分のN末端に融合する。アドヘシン配列に完全な重鎖定常領域を融合することが可能である。しかしながらより特には、IgG Fcをキメラ様に定義するパパイン切断部位の丁度上流のヒンジ領域中に配列を始めること（すなわち、残基216であり、重鎖定常領域の第一の残基を114にする）、または他のイムノグロブリンの類似の部位を融合物中で用いる。特に好ましい実施態様として、アドヘシンアミノ酸配列を(a)ヒンジ領域及びCH2とCH3，または(b)IgG重鎖のCH1,ヒンジ,CH2及びCH3ドメインに融合する。
二重特異性イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンはマルチマーとして、特にヘテロダイマーまたはヘテロテトラマーとして集合する。一般的にこれらの集合したイムノグロブリンは、周知のユニット構造を有するであろう。基本的な４鎖構造的ユニットは、IgG,IgD及びIgEが存在する形態である。４鎖ユニットは、より高次の分子量イムノグロブリンで繰り返される；IgMは一般的に、ジスルフィド結合によって集められた４の基本的ユニットのペンタマーとして存在する。IgAグロブリン、及び場合によりIgGグロブリンもまた、血清中でマルチマー形態で存在しうる。マルチマーの場合には、４のユニットのそれぞれは同じまたは異なるであろう。
ここでの範囲内にある様々な例示的な集合イムノアドヘシンは、以下のように図式的に表される：
ここで各Aは同一のまたは異なるアドヘシンアミノ酸配列を表す；
VLはイムノグロブリン軽鎖可変ドメインを表す；
VHはイムノグロブリン重鎖可変ドメインを表す；
CLはイムノグロブリン軽鎖定常ドメインを表す；
CHはイムノグロブリン重鎖定常ドメインを表す；
nは１より大きい整数を表す；
Yは共有結合架橋試薬の残基を表す。
簡略化して言うと、外来構造のみがキーの性質を示す；それらはイムノグロブリンの結合ドメイン(J)または他のドメインを示さないだけでなく、ジスルフィド結合も示さない。しかしながら上記ドメインが結合活性に必要である場合には、それらはイムノグロブリン分子に占める通常の位置で存在するように構築される。
代わりにアドヘシン配列は、キメラ重鎖を含むイムノグロブリンが得られるように、イムノグロブリン重鎖及び軽鎖配列の間で挿入されうる。この実施態様においてはアドヘシン配列は、ヒンジとCH2ドメインの間で、またはCH2とCH3ドメインの間でのそれぞれで、イムノグロブリンの各腕においてイムノグロブリン重鎖の3'末端で融合される。同様な構造は、Hoogenboom et al.,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
イムノグロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないが、イムノグロブリン軽鎖はアドヘシン−イムノグロブリン重鎖融合タンパク質に共有結合で会合するか、またはアドヘシンに直接的に融合されて存在する。前者の場合には、イムノグロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的に、アドヘシン−イムノグロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと共発現される。分泌においては、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は、2のジスルフィド結合イムノグロブリン重鎖−軽鎖ペアを含むイムノグロブリン様構造を提供するために共有結合で会合するであろう。上記構造の調整のために適した方法は、例えば1989年3月28日に査定された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは、イムノグロブリンcDNA配列にフレーム中でアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合することによって最も簡便に構築される。しかしながらゲノムイムノグロブリン断片への融合もまた用いられ得る（例えばAruffo et al.,Cell 61:1303-1313(1990);及びStamenkovic et al.,Cell 66:1133-1144(1991)参照）。後者のタイプの融合は、発現のためのIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、脾臓または抹消血リンパ球から由来するcDNAライブラリー由来の印刷された配列に基づいて単離されうる。イムノアドヘシンの「アドヘシン」部分及びイムノグロブリン部分をコードするcDNAは、選択された宿主細胞での効率的な発現に向けられるプラスミドベクター内にタンデムに挿仕入される。
３．他のCH2/CH3領域含有タンパク質
他の実施態様においては、精製されるタンパク質は、CH2/CH3領域に融合または接合されたものである。上記融合タンパク質は、該タンパク質の血清半減期を増大するため、及び／またはプロテインＡクロマトグラフィーによる該タンパク質の精製を容易にするため生産される。
この方法で接合されうる生物学的に重要なタンパク質の例として、レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ-1-アンチトリプシン；インスリンA鎖；インスリンB鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、及びフォン・ビルブラント因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織タイププラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)のようなプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；RANTES（通常Ｔ細胞が発現し分泌する活性化の調節因子）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP-1-アルファ)；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；Muellerian阻害物質；レラキシンA鎖；レラキシンB鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼのような細菌タンパク質；DNアーゼ；IgE；CTLA-4のような細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原(CTLA)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(VEGF)；ホルモンまたは増殖因子に対するレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロピン-3,-4,-5または-6(NT-3,NT-4,NT-5またはNT-6)あるいはNGF−βといった神経成長因子のような神経栄養因子；血小板由来増殖因子(PDGF)；aFGF及びbFGFのような線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子(EGF)；TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4またはTGF-β5を含むTGF-アルファ及びTGF-ベータのようなトランスホーミング増殖因子(TGF)；インスリン様増殖因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質；CD3,CD4,CD8,CD19及びCD20のようなCDタンパク質；エリスロポイエチン；骨芽誘導因子；イムノトキシン；骨マクロファージタンパク質(BMP)；インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマのようなインターフェロン；例えばM-CSF,GM-CSF及びG-CSFといったコロニー刺激因子(CSF)；例えばIL-1からIL-10といったインターロイキン(IL)；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばAIDSエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；CD11a,CD11b,CD11c,CD18,ICAM,VLA-4及びVCAMのようなインテグリン；HER2,HER3またはHER4レセプターのような腫瘍関連抗原；及び上記掲げたポリペプチドのいかなるものの断片が含まれる。
４．タンパク質精製
ここに記載される方法を用いて精製されるタンパク質は一般的に、組換え法を用いて生産される。組換えタンパク質を生産する方法は、例えば米国特許第5,534,625号及び第4,816,567号に記載されており、それらは参考として特異的にここで取り込まれる。好ましい実施態様として、興味あるタンパク質はCHO細胞において生産される（例えばWO94/11026参照）。ここに記載される方法を用いて生産され得るタンパク質の例として、抗HER2抗体(WO92/22653)；ヒト化抗IgE抗体(Presta et al.,J.Immunol.151:2623-2632(1993))；キメラ抗CD20抗体(WO94/11026);及びTNFレセプターイムノアドヘシン(Ashkenazi et al.Proc.Natl.Acad.Sci(USA)88:10535-10539(1991))が含まれる。
組換え法を用いる場合、該タンパク質は細胞内、ペリプラズム空間内、または培地に直接分泌されて生産され得る。もし該タンパク質が細胞内で生産されるならば、第一の工程として、宿主細胞または溶解断片といった特定の破片が、例えば遠心分離または超濾過によって除去される。該タンパク質が培地内へ分泌される場合、組換え宿主細胞は例えば接線方向のフロー濾過によって細胞培養培地から分離される。
固相に固定化されたプロテインＡを、CH2/CH3領域含有タンパク質を精製するために用いる。該固相は好ましくは、プロテインＡを固定化するためのガラスまたはシリカ表面を含むカラムである。好ましくは該固相は、制御された直径のガラスカラムまたはケイ酸カラムである。場合により該カラムは、カラムへの非特異的に接着を妨げるために、グリセロールのような試薬を用いてコートされている。Bioprocessing Limitedから商業的に入手可能なPROSEP ATMカラムが、グリセロールを用いてコートされたプロテインＡ制御化直径ガラスカラムの例である。
プロテインＡクロマトグラフィーに対する固相は、適切なバッファーをもちいて平衡化される。例えば、平衡バッファーは25mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.1である。
組換え宿主細胞から由来する不純化調製物を、平衡バッファーと同様であるローディングバッファーをもちいて平衡化された固相に乗せる。不純化調製物は固相を通じて流れながら、タンパク質は固定化プロテインＡに吸着し、ここで発見されているような他の不純物（該タンパク質がCHO細胞で生産される場合、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)のような）が固相に非特異的に結合する。
連続的に実施される次の工程は、中間的洗浄工程において疎水性電解質溶媒を用いて固相を洗浄することによる固相に結合した不純物の除去を引き起こす。好ましい実施態様として、この洗浄溶媒における疎水性電解質は、TEMAC及び／またはTEACである。単一の疎水性電解質は洗浄溶媒中に存在する一方で、特定の実施態様においては、２以上の上記電解質が用いられる。疎水性電解質は好ましくは、約４から約８の範囲のpH、好ましくは約５から約７の範囲のpHを有するpH緩衝溶液に加えられる。この目的に対する適切なバッファーには、Tris、リン酸、MES、及びMOPSOバッファーが含まれる。洗浄溶媒中の疎水性電解質に対する好ましい最終濃度は、約0.1から約1.0Mの範囲、好ましくは約0.25から約0.5Mの範囲である。
上記パラグラフの中間的洗浄工程に引き続き、興味あるタンパク質をカラムから回収する。これは通常、適切な溶出バッファーを用いて達成される。該タンパク質は例えば、約２から約５の範囲、好ましくは約2.5から約3.5の範囲の低pHを有する溶出バッファーを用いてカラムから溶出される。この目的に対する溶出バッファーの例には、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーが含まれる。
溶出されたタンパク質調製物は、プロテインＡクロマトグラフィーの前または後のそれぞれでさらなる精製工程を受ける。例示的なされなる精製工程には、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー；透析；タンパク質を捕捉するための抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)；硫酸アンモニウム沈降；アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈降；逆相HPLC；シリカ上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；及びゲル濾過が含まれる。
そうして回収されたタンパク質は製薬学的に許容されうるキャリアーに処方され、様々な診断、治療または上記分子について周知である他の用途のために用いられる。
以下の実施例は説明のためのみに機能し、制限するために機能しない。明細書中の全ての引例の開示は、参考としてここで完全に取り込まれる。
実施例１
PROSEP ATMカラム(Bioprocessing,Ltd)は、グリセロールコート制御化直径ガラスカラム上に固定化されたプロテインＡを有する。グリセロール皮膜は、不純物との非特異的な相互作用に利用されるガラス表面を減少するが、ここで示されているように不純物は今だカラムに接着しうる。
プロテインＡクロマトグラフィーは、CH2/CH3領域含有タンパク質；ヒト化抗HER2抗体(humAb4D5-8)(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:4285-4289(1992))の精製における最初のクロマトグラフィー工程であった。この抗HER2抗体は、CHO細胞において組換え的に生産された。タンパク質生産及び細胞カルチャー培地への分泌に引き続き、CHO細胞を接線方向のフロー濾過(PROSTACKTM)によって細胞カルチャー培地から分離した。この発現系においては、ほとんどの無関係な不純物は、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)であることがわかった。
PROSEP ATMカラムを25mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.1（バッファーA）を用いて平衡化した。プロテインＡクロマトグラフィーを、ローディングバッファーとしてバッファーAを用いて平衡化されたPROSEP ATMカラムに対して直接的にCHO細胞由来の回収された細胞カルチャー液体(HCCP)を適用することによって実施した。それから該カラムを、HCCP及び非結合タンパク質を洗い流すためにバッファーAを用いて洗浄した。抗HER2抗体を、低pH(2.5-3.5)を有するバッファーBを用いて該カラムを洗浄することによってプロテインＡカラムから溶出した。バッファーBは25mMクエン酸ナトリウム,pH2.8であった。バッファーBの低pHは、プロテインＡと抗HER2抗体の間の相互作用を破壊した。それはまた、該カラムのさらされたガラス表面と非特異的結合不純物CHOPの間の相互作用をも破壊した。これは、〜4000ppmのタンパク質プールを含む溶出抗HER2におけるCHOP不純物のレベルを引き起こした（表１）。
溶出したタンパク質プールにおける不純物に関するこの問題に応じるために、「中間的洗浄工程」を評価した。該カラムからの抗体の溶出の前に、プロテインＡカラムを様々な濃度のTMACまたはTEACを加えた洗浄バッファー（様々なpH）を用いて洗浄した（表１）。
表１に示されているように、TMACまたはTEACのそれぞれを含むバッファーを用いる中間的洗浄工程は、溶出された抗体プールにおけるCHOPのレベルを低下するのに有効であった。TMACまたはTEACのそれぞれの濃度は、好ましくは少なくとも0.25Mであった。したがって、洗浄溶媒中の好ましいTMACまたはTEAC濃度は、約0.1から約1.0M、好ましくは約0.25から約0.5Mであった。
洗浄溶液のpHのバリエーションに関して、より低いpHが洗浄工程中のCHOPのより大きい除去を導くことが見出された。しかしながら7.0より小さいpHでは、タンパク質もまた洗浄工程の間部分的に溶出するであろう。それ故中間的洗浄工程について好ましいpHは約４から約８，好ましくは約５から約７である。
発明の分野
本発明は一般的に、タンパク質精製に関する。特に本発明は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体及びイムノアドヘシンのようなCH2/CH3領域含有タンパク質を精製するための方法に関する。
関連分野の説明
タンパク質のラージスケールで実用的な精製は、ますますバイオテクノロジー産業について重要な問題である。一般的にタンパク質は、該タンパク質についての遺伝子を含有する組換えプラスミドの挿入によって興味あるタンパク質を生産するように操作された哺乳動物または細菌細胞系のそれぞれを用いて、細胞カルチャーによって生産される。用いられる細胞系は生きている生物であるため、それらは糖、アミノ酸、及び増殖因子を含み、通常動物血清の調製物から補われる複雑な増殖培地を用いて培養しなければならない。ヒトの治療薬としての使用のための十分な純度に、該細胞から与えられ、細胞自身の生産物由来である化合物の混合物からの望ましいタンパク質の分離は、大変困難なチャレンジを引き起こす。
細胞破片からのタンパク質の精製法は、初めに該タンパク質の発現部位に依存する。あるタンパク質は細胞から周囲の培地への直接的な分泌を引き起こしうる；他のものは細胞内に存在する。後者のタンパク質については、精製方法の第一の工程には細胞の溶解が含まれ、それは機械的破壊、浸透圧ショック、または酵素的処理を含む様々な方法によってなされる。上記破壊は、ホモジェネート内に該細胞の完全な内容物を放出し、さらにそれらの小さなサイズのため取り出すことの困難である細胞以下の断片を生ずる。これらは一般的に、様々な遠心分離または濾過によって除去される。より小さいサイズであるが、細胞の自然な死、及び実施されたタンパク質生産の過程における細胞内宿主細胞タンパク質の放出のために、直接的に分泌されたタンパク質に関しても同じ問題が生ずる。
一度興味あるタンパク質を含む精製溶液が得られると、該細胞から生産された他のタンパク質からのその分離は通常、様々なクロマトグラフィー法の組み合わせを用いて実施される。これらの方法は、タンパク質の混合物をその電荷、疎水性の程度、またはサイズに基づいて分離する。いくつかの様々なクロマトグラフィー樹脂がこれらの方法のそれぞれについて入手可能であり、含まれる特定のタンパク質に対する精製スキームの正確な設計を可能にする。これらの分離法のそれぞれの本質は、タンパク質を長いカラムを通じて様々な速度で移動させ、それらがカラムをさらに移動するために増大していく物理的分離を成し遂げること、または分離媒体に選択的に接着させ、様々な溶媒によって異なって溶出されるようにすることのいずれかを引き起こす。ある場合には、不純物が特異的に該カラムに接着し、興味あるタンパク質は接着しない場合、望ましいタンパク質は不純物から分離され、つまり興味あるタンパク質は「フロースルー」内に存在する。
アフィニティークロマトグラフィーは、精製されるタンパク質と固定化した捕捉試薬の間の特異的な相互作用を利用するものであり、あるタンパク質についてのオプションとして存在する。プロテインＡは、Fc領域を含む抗体のようなタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーについて有用な吸着剤である。プロテインＡは、抗体のFc領域に対して高アフィニティー（ヒトIgGに対して約10-8M）で結合するStaphylococcus aureas由来の41kD細胞壁タンパク質である。
発明の概要
混在したタンパク質調製物のプロテインＡクロマトグラフィーに関連した問題がここで明らかにされている。特に、プロテインＡを吸着するためのガラスまたはシリカ表面を用いたプロテインＡクロマトグラフィーにおいて（例えばプロテインＡが制御された直径を有するガラスカラムまたはケイ酸カラムに固定化されている場合）、タンパク質調製物における不純物（タンパク質調製物がCHO細胞から由来する場合のChinese Hamster Ovaryタンパク質(CHOP)のような）は、固相のガラスまたはシリカ表面に接着することが観察されている。これは、固相に対する非特異的な接着を妨げることを目指して固相が試薬（グリセロールのような）を用いて皮膜されている場合でさえ生じることが見出された。この問題に答えるために、中間的な洗浄工程がここで用いられている。この洗浄工程は不純物を除去するのに役立つが、固相から固定化プロテインＡまたはプロテインＡに結合した興味あるタンパク質は除去しない。特に、疎水性電解質、例えば塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)及び塩化テトラエチルアンモニウム(TEAC)が、中間的洗浄工程で用いられ得ることが見出されている。
したがって本発明は、以下の連続的に実施される工程を含むプロテインＡクロマトグラフィーによるタンパク質の不純化した溶液から、CH2/CH3領域を含むタンパク質の精製法を提供する：(a)シリカまたはガラスを含む固相上に固定化したプロテインＡに対するタンパク質の吸着；(b)疎水性電解質溶媒を用いた固相の洗浄による固相に結合した不純物の除去；及び(c)固相からのタンパク質の回収。
好ましい実施態様として、該タンパク質は抗体（例えば抗HER2，抗IgEまたは抗CD20抗体）またはイムノアドヘシン（例えばTNFレセプターイムノアドヘシン）である。
好ましい実施態様の詳細な説明
定義：
ここで用いられる場合、「プロテインＡ」なる語はその天然のソースから回収されたプロテインＡ、合成的に生産されたプロテインＡ（例えばペプチド合成または組換え法によって）、及びCH2/CH3領域を有するタンパク質を結合する能力を維持するその変異体を包含する。プロテインＡは、Repligen、Phamacia及びFermatechから商業的に購入可能である。
プロテインＡは固相に固定化される。「固相」によって、プロテインＡが接着しうる非水性のマトリックスを意味する。ここで興味ある固相とは、ガラスまたはシリカ表面を含むものである。該固相は、精製カラムまたは分離した粒子の非連続的な相であろう。好ましい実施態様として、該固相は制御された直径のガラスカラムまたはケイ酸カラムである。特定の実施態様として、該固相はそれに対する不純物の非特異的な接着を妨げることを企図して試薬（グリセロールのような）を用いて皮膜されている。
ここで興味あるタンパク質はCH2/CH3領域を含み、それ故プロテインＡクロマトグラフィーによる精製に適したものである。ここで用いられる「CH2/CH3領域」なる語は、プロテインＡと相互作用するイムノグロブリン分子のFc領域におけるアミノ酸残基をいう。好ましい実施態様として、CH2/CH3領域は完全なCH2領域を含み、それに完全なCH3領域が引き続き、最も好ましくはイムノグロブリンのFc領域を含む。CH2/CH3領域含有タンパク質の例としては、抗体、イムノアドヘシン及びCH2/CH3領域と融合した、または接合した興味あるタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。
「中間的洗浄工程」は、興味あるタンパク質が固相に位置しプロテインＡに吸着した後、該タンパク質がカラムから回収される前に実施される工程である。中間的洗浄工程は、固相から興味あるタンパク質を有意に溶出することなく、固相に非特異的に結合した不純物を除去するように機能する。中間的洗浄工程においては、固相は疎水性電解質溶媒を用いて洗浄される（例えば該疎水性電解質溶媒は固相がカラムである場合、プロテインＡカラムを通過する）。
中間的洗浄工程における「疎水性電解質溶媒」は、固定化プロテインＡまたはそれに吸着した興味あるタンパク質を有意に溶出することなく、該固相に結合した不純物を溶出することが可能である。好ましくは該疎水性電解質溶媒は、一つ以上の疎水性電解質を含む水性キャリアー（例えばバッファー）である。疎水性電解質の例として、アルキルアミン；塩化テトラメチルアンモニウム(TEMAC)、塩化テトラエチルアンモニウム(TEAC)、塩化テトラプロピルアンモニウム及び塩化テトラブチルアンモニウムが含まれる。
「バッファー」とは、酸−塩基接合構成要素の機能によってpHの変化を妨げる緩衝溶液である。ここで「平衡バッファー」とは、興味あるタンパク質を流すための固相（固定化プロテインＡを有する）を調製するために用いられるものである。平衡バッファーは好ましくは等張性であり、一般的に約６から約８の範囲のpHを有する。実施例の平衡バッファーは、25mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.1であった。「ローディングバッファー」とは、プロテインＡが固定化されている固相上のCH2/CH3領域含有タンパク質及び不純物の混合物を流すために用いられるものである。しばしば平衡バッファー及びローディングバッファーは同じ意味で用いられる。「溶出バッファー」は、固定化プロテインＡからCH2/CH3領域含有タンパク質を溶出するために用いられる。好ましくは該溶出バッファーは低pHを有し、それによってプロテインＡと興味あるタンパク質の間の相互作用を破壊する。好ましくは低pH溶出バッファーは、約２から約５の範囲、最も好ましくは約３から約４の範囲のpHを有する。この範囲内にpHを制御するであろうバッファーの例として、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、及びアンモニウムの各バッファー、同様にこれらの組み合わせが含まれる。好ましい上記バッファーはクエン酸塩及び酢酸塩バッファーであり、最も好ましくはクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムバッファーである。他の溶出バッファーは、高pHバッファー（例えば９以上のpHを有するもの）または興味あるタンパク質を溶出するためのMgCl2(2mM)のような化合物または組成物を含むバッファーを含むことが企図される。
「抗体」なる語は最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体（フルレングスモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、マルチ特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びここで定義されるCH2/CH3領域を維持するまたはそれを含むように修飾された範囲で抗体断片を特異的にカバーする。
「抗体断片」には、フルレングス抗体の一部分、一般的にはその抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体断片の例としては、Fab,Fab',F(ab')2及びFv断片；単一鎖抗体分子；ディアボディー；直鎖状抗体；及び抗体断片から形成されたマルチ特異性抗体が含まれる。
ここにおいて使用される「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均質な抗体、すなわち母集団を含むそれぞれの抗体がわずかに存在してもよい天然に生じ得る変異を除いて同等であるような母集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。「モノクローナル」なる修飾語は、実質的に均質な抗体の母集団から得られ、いずれかの特定方法による産生を要求するものとも解されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler等，Nature 256:495(1975)により最初に記述されたハイブリドーマ法により調製されてよく、あるいは組換えDNA法により調製されてもよい（米国特許第4,816,567号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等，Nature 352:624-628(1991)及びMarks等，J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記述される技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
ここにおけるモノクローナル抗体は、特定的には「キメラ」抗体（イムノグロブリン）を含み、そのH及び／またはL鎖の一部は特定の種から誘導された抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または特定の抗体種若しくは亜種に属するものであり、その一方で鎖の残る部分は他の種から誘導された抗体の対応する配列に同等、若しくは相同的であるか、または他の抗体種若しくは亜種に属するものであり、加えて、それらが所望の生物学的活性を示す限りこのような抗体の断片も含む（Cabilly等，前出文献；Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)）。
ここで用いられる「超可変領域」なる語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域には、「相補性決定領域」または「CDR」（すなわち軽鎖可変ドメインにおける24-23(L1),50-56(L2)及び89-97(L3)残基、及び重鎖可変ドメインにおける31-35(H1),50-65(H2)及び95-102(H3)残基；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)）由来のアミノ酸残基、及び／または「超可変ループ」（すなわち軽鎖可変ドメインにおける26-32(L1),50-52(L2)及び91-96(L3)残基、及び重鎖可変ドメインにおける26-32(H1),53-55(H2)及び96-101(H3)残基；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)）由来の残基が含まれる。「フレームワーク」または「FR」残基は、ここで定義される超可変領域残基以外の可変ドメインの残基である。
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトイムノグロブリンから由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合において、ヒト化抗体は受容者の超可変領域残基が、望ましい特異性、アフィニティー、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置換されているヒトイムノグロブリン（受容者抗体）である。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、相当する非ヒト残基によって置換されている。さらにヒト化抗体は、受容者抗体またはドナー抗体の両者で見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の能力をさらに洗練するためになされる。一般的にヒト化抗体は、少なくとも一つ、そして典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含み、その場合超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒトイムノグロブリンのものに相当し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒトイムノグロブリン配列のものである。ヒト化抗体は場合により、イムノグロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトイムノグロブリンのものの少なくとも一部もまた含むであろう。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)参照。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる語は、異種「アドヘシン」タンパク質（例えばレセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」を、イムノグロブリン定常ドメインのエフェクター機能と結合した抗体様分子を示す。構造的にイムノアドヘシンは、抗体（すなわち「異種」である）及びイムノグロブリン定常ドメイン配列の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外のものである望ましい結合特異性と、アドヘシンアミノ酸配列の融合物を含む。イムノアドヘシンにおけるイムノグロブリン定常ドメイン配列は好ましくはγ１，γ２またはγ４重鎖から由来し、それはこれらの領域を含むイムノアドヘシンはプロテインＡクロマトグラフィーによって精製しうるからである(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。
ここで用いられる「リガンド結合ドメイン」なる語は、いかなる天然の細胞表面レセプター、または相当する天然のレセプターの質的にリガンド結合を少なくとも維持するそれらの領域または誘導体を指す。特異的な実施態様として、該レセプターはイムノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに対して異種である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチド由来である。イムノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないがそれにも関わらずこの定義によって特異的にカバーされる他のレセプターは、サイトカインに対するレセプター、特にチロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ）、ヘマトポイエチン及び神経成長因子レセプタースーパーファミリーのメンバー、及び細胞接着分子、例えば(E-,L-及びP-)セレクチンである。
「レセプター結合ドメイン」なる語は、細胞接着分子、または相当する天然のリガンドの質的なレセプター結合能力を少なくとも維持する上記天然のリガンドのいかなる領域または誘導体を含む、レセプターに対するいかなる天然のリガンドをも指すために用いられる。この定義は他のもののうちで特異的に、上記記載のレセプターに対するリガンド由来の結合配列を含む。
「抗体−イムノアドヘシンキメラ」とは、抗体（ここで定義されている）の少なくとも一つの結合ドメインを、少なくとも一つのイムノアドヘシン（本出願で定義されている）と結合した分子を含む。例示的な抗体−イムノアドヘシンキメラは、Berg et al.,PNAS(USA)88:4723-4727(1991)及びChamow et al.,J.Immunol.153:4268(1994)に記載されている二重特異性CD4-IgGキメラである。
発明の実施の形態
ここでの工程は、プロテインＡクロマトグラフィーによる不純物からのCH2/CH3領域含有タンパク質の精製を含む。好ましい実施態様として、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製されるタンパク質は、抗体、イムノアドヘシンまたはCH2/CH3領域と融合または接合したタンパク質である。上記分子を生産する方法は以下に議論されるであろう。
１．抗体
(i)抗体選択及び調製
ここでの抗体は興味ある抗原に対して向けられている。好ましくは該抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または疾病に苦しんでいる哺乳動物に対する抗体の投与が該哺乳動物における治療上の利益を引き起こしうる。しかしながら非ポリペプチド抗原（腫瘍関連グリコリピドのような；米国特許第5,091,178号参照）に向けられた抗体もまた企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（例えばレセプター）または増殖因子のようなリガンドであろう。例示的な抗原には、以下のセクション(3)に記載されたタンパク質が含まれる。本発明によって包含される抗体に対する好ましい分子ターゲットには、CD3,CD4,CD8,CD19,CD20及びCD34；EGFレセプター，HER2,HER3またはHER4レセプターのようなErbBレセプターファミリーのメンバー；LFA-1,Mac1,P150,95,VLA-4,ICAM-1,VCAM及びαまたはβサブユニットを含むαv/β3インテグリン（例えば抗CD11a,抗CD18または抗CD11b抗体）のような細胞接着分子；VEGFのような増殖因子；IgE；血液型抗原；flk2/flt3レセプター；肥満(OB)レセプター；mplレセプター；CTLA-4；プロテインＣ等が含まれる。
場合により他の分子に接合した可溶性抗原またはその断片は、抗体を生産するための免疫原として用いられ得る。レセプターのような膜貫通分子については、これらの断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）は免疫原として用いられ得る。代わりに、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として用いられ得る。上記細胞は天然のソースから由来し得（例えばガン細胞系）、または膜貫通分子を発現するための組換え法によってトランスフォームされている細胞である。
抗体を調製するのに有用な他の抗原及びその形態は、当業者に明らかであろう。
(ii).ポリクローナル抗体
一般にポリクローナル抗体は、関連する抗原及びアジュバントの複数回の経皮的(sc)または腹腔内的(ip)注射により、動物に生じさせうる。関連する抗原を、免疫されるべき種に対して免疫原性のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター等と、二官能性または誘導化試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介しての接合）、N-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR及びR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRを使用して接合させることは有用であろう。
動物は、100μgまたは5μgのペプチドまたは接合体（それぞれウサギまたはマウス）を３体積のフロイント完全アジュバントと合わせ、該溶液を複数部位に皮内的に注射することにより、抗原、免疫原性接合体または誘導体に対して免疫される。１ヶ月後に動物は、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたは接合体の基の量の１／５ないし１／１０を用い、複数部位の経皮注射により追加免疫される。７〜１４日後に、動物は採血され、血清が抗体力価についてアッセイされる。動物は力価がプラトーにはいるまで追加免疫される。好ましくは動物は、同じ抗原の接合体であるが、異なるタンパク質に接合するか及び／または異なった交差結合試薬を介して接合する接合体にて追加免疫される。接合体は、タンパク質融合体として組換え細胞培養においても調製されうる。アルム等の凝集剤も、免疫応答を向上するために好適に使用される。
(iii).モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495(1975)によって最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して作成されるか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第4,816,567号）によって作成されてもよい。
ハイブリドーマ法において、ハムスターまたはアカゲザル等の適当な宿主動物は、免疫に使用したタンパク質に対して特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生しうるリンパ細胞を引き出すために、上述したようにして免疫される。別法として、リンパ細胞はin vitroにおいて免疫される。次いで、リンパ細胞は、ポリエチレングリコール等の適当な融合試薬を使用して、ミエローマ細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103（Academic Press, 1986））。
斯くして調製されたハイブリドーマ細胞は、非融合の親ミエローマ細胞の生育または生存を阻害する１種以上の物質を好ましくは含有する、適当な培養培地に播種され育成される。例えば親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く場合には、ハイブリドーマのための培地は、典型的にはHGPRT-欠損細胞の生育を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むであろう。
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により安定した高水準の抗体産生を支持し、かつＨＡＴ培地等の培地に感受性のものである。これらの内で好ましいミエローマ細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの、及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手可能なＳＰ−２細胞等のネズミミエローマ系である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマも、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記述されている（Kozbor et al., J. Immunol. 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63（Marcel Dekker, Inc. New York, 1987））。
ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地は、該抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降または放射性免疫検定法(RIA)若しくは固相酵素免疫検定法(ELISA)等のin vitro結合アッセイにより測定される。
ハイブリドーマが、所望の特異性、親和性及び／または活性の抗体を産生することが同定された後は、該クローンは限定希釈法によりサブクローン化され得、標準法により育成される（Goding，前出文献）。この目的のために適当な培地は、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物内で腹水腫瘍としてin vivoにおいて生育されうる。
サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えばタンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー等の慣用のイムノグロブリン精製方法により、培養培地、腹水または血清から好適に分離される。好ましくは、ここに記載されるプロテインＡクロマトグラフィー法が用いられる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用方法により容易に単離され、配列決定される（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブの使用により）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されれば、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、これは次いで、大腸菌細胞、霊長類ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはイムノグロブリンタンパク質を別途産生しないミエローマ細胞にトランスフェクトさせ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。
DNAは例えば、異種ネズミ配列の場所にヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984)）、または非イムノグロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたは一部を、イムノグロブリンコード配列に共有結合することによって修飾しうる。
典型的には、一つの抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作成するために、上記非イムノグロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインに対して置換され、またはそれらは抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換される。
更なる実施態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature 348:552-554（1990）に記述される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離されうる。Clackson et al., Nature 352:624-628（1991）及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597（1991）は、ファージライブラリーを使用して、ネズミ及びヒト抗体の単離をそれぞれ記述している。引き続く文献は、鎖シャフルによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marks et al., Bio/Technology 10:779-783（1992））、並びに極めて大きいファージライブラリー構築のための計画として組み合わせ感染及びインビボ組換え（Waterhouse et al. Nuc. Acids Res. 21:2265-2266（1993））を記述している。しかしてこれらの技術は、モノクローナル抗体の単離に関する伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対して生存可能な別の技術であり得る。
(iv).ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば“輸入”残基と称され、これは典型的には“輸入”可変領域から採られる。ヒト化は、基本的には齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体配列で置換することにより、Winter及び共同研究者の方法に従って行われうる（Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1985);Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536(1988)）。従って、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第4,816,567号）であり、実質的に完全なヒト可変領域より少ない部分が非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際的には、ヒト化抗体は典型的にはＣＤＲ残基のいくらか及び、たぶんＦＲのいくらかが、齧歯類抗体の類似部位からの残基により置換されている。
軽鎖及び重鎖の両方のヒト化抗体を作成するために使用される可変領域の選択は、抗原性を低減するために重要である。いわゆる“最適化”方法に従えば、齧歯類抗体の可変領域の配列が、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで齧歯類のものに最も近接したヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトＦＲとして認められる（Sims et al., J Immunol. 151:2296(1993)）。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列から誘導される特定の骨格を使用する。同じ骨格は、いくつかの異なるヒト化抗体についても使用され得る（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:4285(1992); Presta et al., J.Immunol. 151:2623(1993)）。
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的性質を保ってヒト化されることは更に重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従えば、ヒト化抗体は親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化生成物の分析工程により調製される。三次元イムノグロブリンモデルは、一般に利用可能であり当業者にはなじみがある。選択された候補のイムノグロブリン配列の可能な三次元配置構造を描いて映し出すコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレーを見ることは、候補のイムノグロブリン配列の機能における残基のそれらしい役割の分析、即ち候補のイムノグロブリンの抗原に対する結合能力に影響を与える残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基が、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特性が達成される様に、共通及び輸入配列から選択され、組み合わされる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗体結合への影響において、直接的かつ最も実質的に関与するものである。
別法として、免疫により、内因性イムノグロブリン産生を伴わずに完全量のヒト抗体を産生しうるトランスジェニック動物（例えばマウス）の作成が可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合的削除が、内因性抗体の産生を完全に阻害することが記述されている。このような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子の並びの移送は、抗原の攻撃に対してヒト抗体の産生を生じるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33(1993);及びDuchosal et al. Nature 355:258(1992)参照。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーにおいても産生されうる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581(1991);Vaughan et al.Nature Biotech 14:309(1996)）。
(V).抗体断片
抗体断片の生産のための様々な方法が開発されている。伝統的には、これらの断片は完全な抗体のタンパク質溶解性切断を介して由来する（例えば、Morimoto等,Jounal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)及びBrennan等,Science,229:81(1985)）。しかしながら、現在ではこれらの断片は、組換えホスト細胞によって直接的に生産され得る。例えば、抗体断片を上記開示されている抗体ファージライブラリーから単離し得る。代わりに、Fab'-SH断片を大腸菌から直接的に回収し得、F(ab')2断片を形成するために化学的に結合し得る(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。さらなるアプローチにしたがって、F(ab')2断片を組換えホスト細胞カルチャーから直接的に単離し得る。抗体断片の生産のための他の方法も当業者には明白であろう。他の実施態様では、選択物の抗体は単一鎖Fv断片(scFv)である。WO 93/16185参照。
(vi).マルチ特異性抗体
マルチ特異性抗体は、少なくとも2の異なる抗原に対する結合特異性を有する。上記分子が通常2の抗原のみを結合する一方で（すなわち二重特異性抗体,BsAb）、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を有する抗体がここで用いられるこの表現によって包含される。
二重特異的抗体の調製方法はこの技術において知られている。全長二重特異的抗体の伝統的産生は、２種のイムノグロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここにおいて２本の鎖は異なる特異性を有する（Milstein et al., Nature 305:537-539(1983)）。イムノグロブリン重鎖及び軽鎖の無作為の寄せ集めのために、これらのハイブリドーマ（クアッドローマ：Quadromas）は、１種のみが正しい二重特異性構造を有する１０種の異なる異なる抗体分子の可能な混合物を生じる。通常アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩雑であり、また生成物の収率も低い。同様な手法は、WO 93/08829及びTraunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
WO96/27011に記載されたもう一つのアプローチにしたがって、抗体分子のペアの間の界面を、組換え細胞カルチャーから回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作し得る。好ましい界面には、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部が含まれる。この方法においては、第一の抗体分子の界面由来の一つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）を用いて置換される。大きい側鎖（類）に対する同一のまたは同様のサイズの埋め合わせとなる「空洞」は、より小さなアミノ酸側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）を用いて大きいアミノ酸側鎖を置換することによって第二の抗体分子の界面に作り出される。これはホモダイマーのように他の望まれない最終産物以上にヘテロダイマーの収率を増大するためのメカニズムを提供する。
二重特異的抗体は、交差結合または“異種接合”抗体を含む。例えば、異種接合体の一方の抗体はアビジンと結合され、他方がビオチンと結合されうる。このような抗体は、例えば免疫系細胞を望ましからぬ細胞に向ける為（米国特許第4,676,980）及びＨＩＶ感染の治療のため（WO 91/00360, WO 92/200373及びEP 03089）に提案された。異種接合抗体は、都合よい交差結合方法により作成されうる。このような交差結合試薬は既知であり、種々の交差結合方法と共に米国特許第4,676,980に開示されている。
抗体断片から二重特異的抗体を生産する方法が文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は化学的接合を用いて調製され得る。Brennan等,Science,229:81(1985)は、完全な抗体をF(ab')2断片を生産するためにタンパク質溶解的に切断する方法を記載する。これらの断片は、ビシナルジチオール(vicinal dithiols)を安定化し、分子内ジスルフィド形成を妨げるために、ジチオール複合体化試薬亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。それから生産されたFab'断片を、チオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。Fab'-TNB誘導体の一つをそれから、メルカプトエチルアミンを用いた還元反応によってFab'-チオールに再変換し、二重特異的抗体を形成するために等モル量の他のFab'-TNB誘導体と混合する。生産された二重特異的抗体を、選択された酵素の固定化のための試薬として用い得る。
最近の進歩により、大腸菌からFab'-SH断片の直接的な回収が容易になり、該断片は二重特異的抗体を形成するために化学的に結合され得る。Shalaby等,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の生産を記載する。それぞれのFab'断片は、大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにin vitroで直接的な化学的結合を受ける。それ故形成された二重特異性抗体は、HER2受容体及び通常ヒトT細胞を過剰発現する細胞に結合し得、同様にヒト乳腫瘍ターゲットに対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を引き出し得る。
組換え細胞培養物から直接に二価抗体断片を製造及び単離する種々の方法も記述されている。例えば、二価異種二量体は、ロイシンジッパーを使用して調製された。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992)。Fos及びJunタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２種のことなる抗体のFab'部分を連結している。該抗体同種ダイマーは、ヒンジ領域にて還元されてモノマーが形成され、次いで再度酸化されて抗体異種ダイマーが形成された。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)により記述されている「ディアボディ」技術は、BsAb断片を作成するための別の機構を提供した。該断片は、リンカーにより軽鎖可変領域(VL)に連結する重鎖可変領域(VH)を有し、リンカーは同じ鎖の２つの領域の間で対形性を許容するには短すぎるものである。従って、一つの断片のVH及びVL領域は、他の断片の相補的VL及びVH領域と対形性することを強いられ、これによって２個の抗原結合部位が形成される。単鎖Fv(sFv)二量体を使用してBsAbを作成する他の方法も報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368(1994)参照。代わりに該抗体は、Zapata et al.Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)に記載された「直鎖状抗体」としても存在しうる。略記するとこれらの抗体は、抗原結合領域のペアを形成するタンデムFd部分(VH-CH1-VH-CH1)のペアを含む。直鎖状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
２より大きい価数を持つ抗体が計画されている。例えば三重特異的抗体が調製され得る。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
２．イムノアドヘシン
最も単純で最も直接的なデザインは、アドヘシンの結合ドメイン（例えばレセプターの細胞外ドメイン(ECD)）をイムノグロブリン重鎖のヒンジ及びFc領域と結合する。通常、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、イムノグロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端で融合するであろうが、N末端での融合もまた可能である。
典型的には、上記融合物においてコード化されたキメラポリペプチドは、イムノグロブリン重鎖の定常ドメインの少なくとも機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを維持するであろう。融合はまた、定常ドメインのFc部分のC末端で、または重鎖のCH1あるいは軽鎖の相当する領域に対して中間的にN末端でなされる。融合がなされる正確な部位は必須ではない；特定の部位が周知であり、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択される。
好ましい実施態様として、アドヘシン配列をイムノグロブリンG1(IgG1)のFc部分のN末端に融合する。アドヘシン配列に完全な重鎖定常領域を融合することが可能である。しかしながらより特には、IgG Fcをキメラ様に定義するパパイン切断部位の丁度上流のヒンジ領域中に配列を始めること（すなわち、残基216であり、重鎖定常領域の第一の残基を114にする）、または他のイムノグロブリンの類似の部位を融合物中で用いる。特に好ましい実施態様として、アドヘシンアミノ酸配列を(a)ヒンジ領域及びCH2とCH3，または(b)IgG重鎖のCH1,ヒンジ,CH2及びCH3ドメインに融合する。
二重特異性イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンはマルチマーとして、特にヘテロダイマーまたはヘテロテトラマーとして集合する。一般的にこれらの集合したイムノグロブリンは、周知のユニット構造を有するであろう。基本的な４鎖構造的ユニットは、IgG,IgD及びIgEが存在する形態である。４鎖ユニットは、より高次の分子量イムノグロブリンで繰り返される；IgMは一般的に、ジスルフィド結合によって集められた４の基本的ユニットのペンタマーとして存在する。IgAグロブリン、及び場合によりIgGグロブリンもまた、血清中でマルチマー形態で存在しうる。マルチマーの場合には、４のユニットのそれぞれは同じまたは異なるであろう。
ここでの範囲内にある様々な例示的な集合イムノアドヘシンは、以下のように図式的に表される：
VLはイムノグロブリン軽鎖可変ドメインを表す；
VHはイムノグロブリン重鎖可変ドメインを表す；
CLはイムノグロブリン軽鎖定常ドメインを表す；
CHはイムノグロブリン重鎖定常ドメインを表す；
nは１より大きい整数を表す；
Yは共有結合架橋試薬の残基を表す。
簡略化して言うと、外来構造のみがキーの性質を示す；それらはイムノグロブリンの結合ドメイン(J)または他のドメインを示さないだけでなく、ジスルフィド結合も示さない。しかしながら上記ドメインが結合活性に必要である場合には、それらはイムノグロブリン分子に占める通常の位置で存在するように構築される。
代わりにアドヘシン配列は、キメラ重鎖を含むイムノグロブリンが得られるように、イムノグロブリン重鎖及び軽鎖配列の間で挿入されうる。この実施態様においてはアドヘシン配列は、ヒンジとCH2ドメインの間で、またはCH2とCH3ドメインの間でのそれぞれで、イムノグロブリンの各腕においてイムノグロブリン重鎖の3'末端で融合される。同様な構造は、Hoogenboom et al.,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
イムノグロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないが、イムノグロブリン軽鎖はアドヘシン−イムノグロブリン重鎖融合タンパク質に共有結合で会合するか、またはアドヘシンに直接的に融合されて存在する。前者の場合には、イムノグロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的に、アドヘシン−イムノグロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと共発現される。分泌においては、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は、2のジスルフィド結合イムノグロブリン重鎖−軽鎖ペアを含むイムノグロブリン様構造を提供するために共有結合で会合するであろう。上記構造の調整のために適した方法は、例えば1989年3月28日に査定された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは、イムノグロブリンcDNA配列にフレーム中でアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合することによって最も簡便に構築される。しかしながらゲノムイムノグロブリン断片への融合もまた用いられ得る（例えばAruffo et al.,Cell 61:1303-1313(1990);及びStamenkovic et al.,Cell 66:1133-1144(1991)参照）。後者のタイプの融合は、発現のためのIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、脾臓または抹消血リンパ球から由来するcDNAライブラリー由来の印刷された配列に基づいて単離されうる。イムノアドヘシンの「アドヘシン」部分及びイムノグロブリン部分をコードするcDNAは、選択された宿主細胞での効率的な発現に向けられるプラスミドベクター内にタンデムに挿仕入される。
３．他のCH2/CH3領域含有タンパク質
他の実施態様においては、精製されるタンパク質は、CH2/CH3領域に融合または接合されたものである。上記融合タンパク質は、該タンパク質の血清半減期を増大するため、及び／またはプロテインＡクロマトグラフィーによる該タンパク質の精製を容易にするため生産される。
この方法で接合されうる生物学的に重要なタンパク質の例として、レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ-1-アンチトリプシン；インスリンA鎖；インスリンB鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、及びフォン・ビルブラント因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織タイププラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)のようなプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；RANTES（通常Ｔ細胞が発現し分泌する活性化の調節因子）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(MIP-1-アルファ)；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；Muellerian阻害物質；レラキシンA鎖；レラキシンB鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼのような細菌タンパク質；DNアーゼ；IgE；CTLA-4のような細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原(CTLA)；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(VEGF)；ホルモンまたは増殖因子に対するレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロピン-3,-4,-5または-6(NT-3,NT-4,NT-5またはNT-6)あるいはNGF−βといった神経成長因子のような神経栄養因子；血小板由来増殖因子(PDGF)；aFGF及びbFGFのような線維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子(EGF)；TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4またはTGF-β5を含むTGF-アルファ及びTGF-ベータのようなトランスホーミング増殖因子(TGF)；インスリン様増殖因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質；CD3,CD4,CD8,CD19及びCD20のようなCDタンパク質；エリスロポイエチン；骨芽誘導因子；イムノトキシン；骨マクロファージタンパク質(BMP)；インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマのようなインターフェロン；例えばM-CSF,GM-CSF及びG-CSFといったコロニー刺激因子(CSF)；例えばIL-1からIL-10といったインターロイキン(IL)；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばAIDSエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；CD11a,CD11b,CD11c,CD18,ICAM,VLA-4及びVCAMのようなインテグリン；HER2,HER3またはHER4レセプターのような腫瘍関連抗原；及び上記掲げたポリペプチドのいかなるものの断片が含まれる。
４．タンパク質精製
ここに記載される方法を用いて精製されるタンパク質は一般的に、組換え法を用いて生産される。組換えタンパク質を生産する方法は、例えば米国特許第5,534,625号及び第4,816,567号に記載されており、それらは参考として特異的にここで取り込まれる。好ましい実施態様として、興味あるタンパク質はCHO細胞において生産される（例えばWO94/11026参照）。ここに記載される方法を用いて生産され得るタンパク質の例として、抗HER2抗体(WO92/22653)；ヒト化抗IgE抗体(Presta et al.,J.Immunol.151:2623-2632(1993))；キメラ抗CD20抗体(WO94/11026);及びTNFレセプターイムノアドヘシン(Ashkenazi et al.Proc.Natl.Acad.Sci(USA)88:10535-10539(1991))が含まれる。
組換え法を用いる場合、該タンパク質は細胞内、ペリプラズム空間内、または培地に直接分泌されて生産され得る。もし該タンパク質が細胞内で生産されるならば、第一の工程として、宿主細胞または溶解断片といった特定の破片が、例えば遠心分離または超濾過によって除去される。該タンパク質が培地内へ分泌される場合、組換え宿主細胞は例えば接線方向のフロー濾過によって細胞培養培地から分離される。
固相に固定化されたプロテインＡを、CH2/CH3領域含有タンパク質を精製するために用いる。該固相は好ましくは、プロテインＡを固定化するためのガラスまたはシリカ表面を含むカラムである。好ましくは該固相は、制御された直径のガラスカラムまたはケイ酸カラムである。場合により該カラムは、カラムへの非特異的に接着を妨げるために、グリセロールのような試薬を用いてコートされている。Bioprocessing Limitedから商業的に入手可能なPROSEP ATMカラムが、グリセロールを用いてコートされたプロテインＡ制御化直径ガラスカラムの例である。
プロテインＡクロマトグラフィーに対する固相は、適切なバッファーをもちいて平衡化される。例えば、平衡バッファーは25mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.1である。
組換え宿主細胞から由来する不純化調製物を、平衡バッファーと同様であるローディングバッファーをもちいて平衡化された固相に乗せる。不純化調製物は固相を通じて流れながら、タンパク質は固定化プロテインＡに吸着し、ここで発見されているような他の不純物（該タンパク質がCHO細胞で生産される場合、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)のような）が固相に非特異的に結合する。
連続的に実施される次の工程は、中間的洗浄工程において疎水性電解質溶媒を用いて固相を洗浄することによる固相に結合した不純物の除去を引き起こす。好ましい実施態様として、この洗浄溶媒における疎水性電解質は、TEMAC及び／またはTEACである。単一の疎水性電解質は洗浄溶媒中に存在する一方で、特定の実施態様においては、２以上の上記電解質が用いられる。疎水性電解質は好ましくは、約４から約８の範囲のpH、好ましくは約５から約７の範囲のpHを有するpH緩衝溶液に加えられる。この目的に対する適切なバッファーには、Tris、リン酸、MES、及びMOPSOバッファーが含まれる。洗浄溶媒中の疎水性電解質に対する好ましい最終濃度は、約0.1から約1.0Mの範囲、好ましくは約0.25から約0.5Mの範囲である。
上記パラグラフの中間的洗浄工程に引き続き、興味あるタンパク質をカラムから回収する。これは通常、適切な溶出バッファーを用いて達成される。該タンパク質は例えば、約２から約５の範囲、好ましくは約2.5から約3.5の範囲の低pHを有する溶出バッファーを用いてカラムから溶出される。この目的に対する溶出バッファーの例には、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーが含まれる。
溶出されたタンパク質調製物は、プロテインＡクロマトグラフィーの前または後のそれぞれでさらなる精製工程を受ける。例示的なされなる精製工程には、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー；透析；タンパク質を捕捉するための抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)；硫酸アンモニウム沈降；アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈降；逆相HPLC；シリカ上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；及びゲル濾過が含まれる。
そうして回収されたタンパク質は製薬学的に許容されうるキャリアーに処方され、様々な診断、治療または上記分子について周知である他の用途のために用いられる。
以下の実施例は説明のためのみに機能し、制限するために機能しない。明細書中の全ての引例の開示は、参考としてここで完全に取り込まれる。
実施例１
PROSEP ATMカラム(Bioprocessing,Ltd)は、グリセロールコート制御化直径ガラスカラム上に固定化されたプロテインＡを有する。グリセロール皮膜は、不純物との非特異的な相互作用に利用されるガラス表面を減少するが、ここで示されているように不純物は今だカラムに接着しうる。
プロテインＡクロマトグラフィーは、CH2/CH3領域含有タンパク質；ヒト化抗HER2抗体(humAb4D5-8)(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:4285-4289(1992))の精製における最初のクロマトグラフィー工程であった。この抗HER2抗体は、CHO細胞において組換え的に生産された。タンパク質生産及び細胞カルチャー培地への分泌に引き続き、CHO細胞を接線方向のフロー濾過(PROSTACKTM)によって細胞カルチャー培地から分離した。この発現系においては、ほとんどの無関係な不純物は、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)であることがわかった。
PROSEP ATMカラムを25mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.1（バッファーA）を用いて平衡化した。プロテインＡクロマトグラフィーを、ローディングバッファーとしてバッファーAを用いて平衡化されたPROSEP ATMカラムに対して直接的にCHO細胞由来の回収された細胞カルチャー液体(HCCP)を適用することによって実施した。それから該カラムを、HCCP及び非結合タンパク質を洗い流すためにバッファーAを用いて洗浄した。抗HER2抗体を、低pH(2.5-3.5)を有するバッファーBを用いて該カラムを洗浄することによってプロテインＡカラムから溶出した。バッファーBは25mMクエン酸ナトリウム,pH2.8であった。バッファーBの低pHは、プロテインＡと抗HER2抗体の間の相互作用を破壊した。それはまた、該カラムのさらされたガラス表面と非特異的結合不純物CHOPの間の相互作用をも破壊した。これは、〜4000ppmのタンパク質プールを含む溶出抗HER2におけるCHOP不純物のレベルを引き起こした（表１）。
表１に示されているように、TMACまたはTEACのそれぞれを含むバッファーを用いる中間的洗浄工程は、溶出された抗体プールにおけるCHOPのレベルを低下するのに有効であった。TMACまたはTEACのそれぞれの濃度は、好ましくは少なくとも0.25Mであった。したがって、洗浄溶媒中の好ましいTMACまたはTEAC濃度は、約0.1から約1.0M、好ましくは約0.25から約0.5Mであった。
洗浄溶液のpHのバリエーションに関して、より低いpHが洗浄工程中のCHOPのより大きい除去を導くことが見出された。しかしながら7.0より小さいpHでは、タンパク質もまた洗浄工程の間部分的に溶出するであろう。それ故中間的洗浄工程について好ましいpHは約４から約８，好ましくは約５から約７である。
Claims (11)
- プロテインＡクロマトグラフィーによる不純化溶液からIgGのCH2/CH3領域を含むタンパク質を精製する方法であり、
(a)シリカまたはガラスを含む固相に固定化されたプロテインＡに該タンパク質を吸着させ；
(b)塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)および塩化テトラエチルアンモニウム(TEAC)から選択される疎水性電解質溶媒を用いて固相を洗浄することによって固相に結合した不純物を除去し；及び
(c)固相から該タンパク質を回収する
ことを含む精製法。 - 該タンパク質が抗体である請求項１の方法。
- 該タンパク質がイムノアドヘシンである請求項１の方法。
- 該疎水性電解質溶媒が塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)を含む請求項１の方法。
- 該疎水性電解質溶媒が塩化テトラエチルアンモニウム(TEAC)を含む請求項１の方法。
- 該固相が制御された直径のガラスカラムである請求項１の方法。
- 該固相がケイ酸カラムである請求項１の方法。
- 該不純物がチャイニーズハムスター卵巣タンパク質(CHOP)である請求項１の方法。
- 疎水性電解質溶媒中の疎水性電解質の濃度が0.1から1.0Mの範囲である請求項１の方法。
- 疎水性電解質溶媒のpHが４から８の範囲である請求項１の方法。
- 工程(c)が2.0から5.0の範囲のpHを有する溶出バッファーを用いて該タンパク質を溶出することを含む請求項１の方法。
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