KR101498772B1 - 항체 생성의 최적화 방법 - Google Patents

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Abstract

예를 들면, 치료 효능을 증대시키기 위해, 예를 들면, 특정 회수 시점 및/또는 특정 정제 방법을 선택함으로써, 크로마토그래피 방법에 의해 항체 변이체로부터 항체 분자를 분리함으로써, 정제된 항체를 생성하기 위한 일반적인 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물의 제조 방법을 개시한다: 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플을 제공하고; 상기 샘플의 분취액중 항체 분자 및/또는 그의 변이체의 존재, 및/또는 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 측정하고, 앞에서 수득한 데이터를 기준으로 후속 회수 시점 및/또는 항체 정제 방법을 결정함으로써, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물을 생성한다.

Description

항체 생성의 최적화 방법{OPTIMIZING THE PRODUCTION OF ANTIBODIES}
본 발명은 폴리펩티드 제조 및 정제 분야에 관한 것이다. 예를 들면, 치료 효과를 증대시키기 위해, 예를 들면, 특정 회수 시점 및/또는 특정 정제 방법을 선택함으로써, 크로마토그래피 방법에 의해 항체 변이체로부터 항체 분자를 분리함으로써, 정제된 항체를 생성하기 위한 일반적인 방법이 제공된다.
단클론성 항체는 중요한 치료 잠재력을 가지며 오늘날의 의학적 포트폴리오에서 중요한 역할을 한다. 지난 십여년 동안, 제약 산업에서의 중요한 동향은 암, 천식, 관절염, 다발성 경화증 등과 같은 많은 질환의 치료를 위한 치료제로서 단클론성 항체(mAb)의 개발이었다. 최근의 보고는 376개 mAb 개발 프로그램(전임상부터 시판까지) 및 단클론성 항체는 현재 임상 시험되고 있는 모든 생물의약품의 약 20%를 구성하고 있음을 보여준다. 단클론성 항체는 주로 유전 공학처리된 포유동물 세포 배양물중 재조합 단백질로서 제조된다. 전형적으로, 회수, 크로마토그래피에 의한 포획 및 정련(polishing) 단계로 이루어지는 하위 공정이 뒤따르는 상위 공정인, 분비된 mAb의 제조에 교반 탱크 생물반응기를 사용한다. 이어서, 전형적으로 액체인 약물 물질은 약물 제품으로 제형화된다.
인간에 적용하기 위해, 모든 약학 물질은 분명한 기준을 충족시켜야 한다. 인간에 생물약제의 안전성을 보장하기 위해, 제조 공정 후에 하나 이상의 정제 단계가 이어져야 한다. 그러므로, 하위 공정 개발의 목표는 고순도의 생성물을 제공하는, 고수율의, 확실하고 확장가능하며 신뢰성있는 공정을 개발하는 것이다. 상기 공정에서 전형적인 오염물은 DNA, 숙주 세포 단백질(HCP). 바이러스, 응집 및 단편화 산물 및 잔류 배지 성분들을 포함한다. 이들 오염물로부터 항체 생성물의 분리는 다양한 방식의 정제를 사용하는 직교 정제 공정을 필요로 한다. 일반적으로, mAb 정제 공정은 여과 및 크로마토그래피 단계의 다양한 조합을 포함한다. 순도이외에, 처리량 및 수율은 제약 산업에서 적절한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 단클론성 항체의 제조 비용의 대략 40 내지 60%가 하위 공정으로부터 발생한다.
국제 협력조화 회의(Internation Conference on Harmonization, ICH) 지침서에 따르면, 약물 물질 이질성은 그의 질을 규정하며, 그 정도 및 프로필은 로트별(lot-to-lot) 일관성을 보장하기 위해 모니터하고 특성화되어야 한다. 그러므로, mAb의 미세이질성(microheterogenity)은 제조, 특히 하위 공정에 관한 문제이다. 생성물의 특성화는, 유사한 성질을 갖도록 존재할 수 있으며 정제를 복잡하게 만들 수 있는 변이체를 결정하는데 필수적이다(예를 들면, 문헌 [Ahrer, K. and Jungbauer, A., J. Chromatogr. B 841, 110-122 (2006)] 참조). mAb의 미세이질성은, 예를 들면, 표적 단백질의 번역 후 변형, 효소적 변형, 잘못된 번역, 및 가공 및 변이에 의해 야기된 변형으로부터 비롯된다. 각각의 변형은 최종 생성물의 생물 활성 또는 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 단백질의 여러 변이체를 분리하기 위해 신속하고, 신뢰할 수 있으며 정량적인 분석 방법이 필요하다. 예를 들면, 크로마토그래피 및 전기영동 방법은 단백질 변이체의 해결을 위한 도구이다.
단백질중 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 측쇄의 비-효소적 탈아미드화가 종종 재조합 단백질의 전하 이질성의 원인이 된다. 상기 아미노산들의 비하전 측쇄는 이소-글루타메이트 및 이소-아스파테이트 잔기로 또는 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기로 변형된다. 그러므로, 변형당 추가의 전하가 단백질에 도입된다[Aswald, D.W., et al., J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 21, 1129-1136 (2000)].
재조합 단클론성 항체의 경우, 탈아미드화는 분비 후에, 정제시에, 저장시에, 및 상이한 조건의 변형력하에, 세포 내부로부터 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 아스파라긴의 탈아미드화는 항체 또는 그의 분리된 분획을 승온에서 염기성 pH 하에 배양한 후 보다 산성인 종의 관찰에 의해 단클론성 항체의 전하 이질성에 수반되는 것으로 보고되었다(개관: 문헌 [Liu, H., et al., J. Pharmc. Sciences 97, 2426-2447 (2008)]). 탈아미드화는 하나의 추가 음전하를 항체에 도입시키며 산성 종을 생성하여, 일반적으로 양이온 교환 크로마토그래피시에 보다 이른 용출을 유발한다.
항체의 다른 전형적인 변형은, 예를 들면, 세포 배양 과정 동안에 달라질 수 있거나 또는 배양 조건으로 인해 달라질 수 있는 당-변이체를 야기하는 그의 글리코실화 패턴과 관련된다(개관을 위해, 문헌 [Beck, A., et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9, 482-501 (2008)] 참조).
재조합적으로 생성된 면역글로불린의 정제시, 종종 다양한 컬럼 크로마토그래피 단계의 조합이 이용된다. 일반적으로, 친화성 크로마토그래피 단계는 하나, 둘 또는 훨씬 더 많은 추가의 분리 단계가 뒤따른다. 최종 정제 단계는 응집 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소와 같은 미량의 불순물 및 오염물의 제거를 위한 소위 "정련 단계"이다.
문헌 [Tsai, P.K., et al., Pharmac. Res. 10, 1580-1586 (1993)]은 항-인간 CD18 단클론성 항체의 등전 이질성을 기술하였다. 전하 이질성은 면역글로불린 중쇄의 순차적 탈아미드화로부터 야기되는 것으로 추정하였다.
문헌 [Moorhouse, K.G., et al., J. Pharmac. Biomed. Anal. 16, 593-603 (1997)]은 항-인간 CD20 단클론성 항체의 전하 이질성 분석을 위해 HPLC의 사용을 고찰하였다.
문헌 [Kaltenbrunner, O., et al., J. Chrom 639, 41-49 (1993)]은 그 pI 값이 상이한 항체 변이체를 분리하기 위해 염 구배와 결합된 선형 pH 구배를 이용하였다.
WO 2006/084111 호(글락소 그룹 리미티드(Glaxo Group Ltd.))에는, 탈아미드화된 폴리펩티드의 양에 따라 회수 시점을 산출하는 방법이 언급되어 있다.
문헌 [Robinson, D.K., et al., Biotech. and Bioeng. 44, 727-735 (1994)]은 여러 산성 단클론성 항체 종이 생성된 유가식 공정을 개시하였는데, 상기 공정에서 발생은 배양 조건에 따라 달라졌다.
중쇄의 C-말단에서 라이신 잔기의 존재가 상이한 3개의 mAb 변이체를 중성 pH에서 선형 NaCl 구배를 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다[Weitzhandler, M., Proteomics 1, 179-185 (2001)].
RhuMAb HER2 또는 트라스투주맙(Trastuzumab)(상표명 허셉틴(Herceptin, 등록상표)하에 시판)은 HER2 과발현/HER2 유전자 증폭 전이성 유방암의 치료를 위해 사용되는 재조합 인간화 항-HER2 단클론성 항체(본원에서 her2 항체)이다. 트라스투주맙은 문헌 [Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol 9, 1165-1172 (1989)]에 기술된 뮤린 항-HER2 항체 4D5와 동일한 HER2의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 트라스투주맙은 rhuMAb 4D5 또는 트라스투주맙으로 지칭되는, 뮤린 항-HER2 항체 4D5의 재조합 인간화 변이체이며, 집중적인 사전 항암 치료를 받은, HER2-과발현 전이성 유방암을 갖는 환자에서 임상적으로 활성적이었다[Baselga, J., et al., J. Clin. Oncol. 14, 737-744 (1996)]. 트라스투주맙 및 그의 제조 방법은 US 5,821,337 호에 기술되어 있다. 수용체 티로신 키나제의 HER 부류는 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개체이다. 수용체 부류는 상피 성장 인자 수용체(EGFR, ErbB1 또는 HER1), HER2(ErbB2 또는 p185neu), HER3(ErbB3) 및 HER4(ErbB4 또는 tyro2)를 포함하는 4개의 별개의 구성원을 포함한다.
her2 / neu 유전자의 유전자 산물에 대해 유도된 단클론성 her2 항체는 7개의 상이한 변이체로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 재조합적으로 생성된 her2 항체의 탈아미드화 및 기타 산성 변이체는 전하 이질성을 유발하므로, 상기 변이체들은 용출시 이온 강도의 선형 증가를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 주 피크 이외에, 6개의 부차적 형태는 모두 분석 기술, 특히 이온 교환 크로마토그래피(IEC)의 조합을 이용하여 지정될 수 있다. 문헌 [Harris R. J. et al., J. Chromatogr. B 752, 233-245 (2001)]은 IEC-피크 3이 73.8%의 피크 면적을 가지며 가장 많은 변이체인 her2 항체의 활성 형태를 나타낸다고 보고하였다. 탈아미드화 및 기타 산성 변이체는 분리된 모든 항체의 약 25%를 구성하였다.
EP1075488B1 및 EP1308455B9 호는 4번째 전도도에서 용출(결합-용출 방식)에 앞서 상이한 전도도 하의 세척 단계를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 her2 항체의 정제를 보고하였다. 이에 의해 조성물중 산성 변이체의 양이 감소된 her2 항체의 조성물이 수득되었다. 유사하게, WO 2004/024866 호(제넨테크 인코포레이티드(Genentech Inc.))는 특히 구배 세척을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 her2 항체의 정제를 개시하였다.
본 명세서에 따르면, 시판되는 허셉틴(등록상표)은, 분석적 이온-교환 크로마토그래피 프로필에서 피크 4에 상응하는 65% 이상의 활성 형태(IEC 피크 3/3*) 및 20% 이하의 불활성 형태를 함유해야 한다(도 2 및 표 1 참조).
본 발명의 목적은 재조합적으로 생성된 항체의 정제 및 그의 항체 변이체에 비해 항체 분자의 증대를 위한 또 다른 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여, 비용 및 치료 효능에 관하여 균형을 얻을 수 있다. 또한, 항체 조성물의 제조시, 항체 분자 및/또는 그의 변이체의 존재, 및/또는 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 및 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 회수 또는 정제 방법의 결정 전에 결정하는 공정-제어 단계를 도입함으로써 최적화를 이룰 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 방법에 의해, 회수 시점 및 정제 방법이 변이체 패턴 또는 항체 공급원 물질의 양에 적합화된다.
그러므로, 본 발명의 첫 번째 양태는 하기의 단계를 포함하는, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물의 제조 방법이다:
a) 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 샘플의 분취액중 항체 분자 및 그의 변이체의 존재, 및/또는 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 측정하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 수득한 데이터를 기준으로 후속 회수 시점 및/또는 항체 정제 방법을 결정함으로써, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물을 생성하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 샘플의 후속 폴리펩티드 정제 방법의 결정을 위해 폴리펩티드를 포함하는 샘플의 분취액의 분석적 이온 교환 크로마토그래피의 사용이다.
도 1은 발효중 허셉틴 변이체 분포를 나타낸 것이다. 발효일 10, 11 및 12일째에(F10, F11 및 F12) 이온-교환 크로마토그램(도 3 참조)에서 피크 1, 3/3* 및 4 각각에 해당하는 특정 변이체의 퍼센트를 나타내었다. 15개 발효 작업으로부터의 평균값 및 표준 편차를 나타내었다.
도 2는 분석용 이온 교환 크로마토그램이다. 양이온 교환 컬럼상에서의 트라스투주맙 분리를 나타낸 것이다. 피크 지정은 표 1에 나타내었다.
도 3은 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용출을 위해 사용된 완충제 프로필이다: a) 구배 용출, b) 단계 용출.
본 발명은 첫 번째 양태로 높은 비율의 항체 분자를 포함하는 항체의 대규모 생성을 고수율로 가능하게 하고 매우 경제적인 항체 조성물의 제조 방법을 제공한다.
그러므로, 본 발명의 첫 번째 양태는 하기 단계를 포함하는, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물의 제조 방법이다:
a) 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 항체 분자 및 그의 변이체의 존재, 및/또는 항체 분자의 양 및 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 측정하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 수득한 데이터를 기준으로 후속 회수 시점 및/또는 항체 정제 방법을 결정함으로써, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물을 생성하는 단계.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 샘플의 후속 폴리펩티드 정제 방법의 결정을 위해 폴리펩티드를 포함하는 샘플의 분취액의 분석적 이온 교환 크로마토그래피의 사용을 포함한다.
본 발명의 실시는 당해 분야의 전문가의 기술에 속하는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 상기 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); Glover, D.M. (ed.), DNA Cloning - A Practical Approach, Volumes I and II, IRL Press Limited (1985); Gait, M.J. (ed.), Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach, IRL Press Limited (1984); Hames, B.D. and Higgins, S.J. (eds.), Nucleic acid hygridisation, IRL Press Limited (1984); Freshney, R.I. (ed.), Animal cell culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Perbal, B., A practical guide to molecular cloning, Wiley Interscience (1984); the series Mehtods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Miller, J.H. and Calos, M.P. (eds.), Gene trasfer vectors for mammalian cells, Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods in Enzymology, Vol. 154 and Vol. 155(Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively); Mayer and Walker (eds.), Immunochemical methods in cell and molecular biology, Academic Press, London (1987); Scopes, R.K., Protein Purification - Principles and Practice, second ed., Springer-Verlag, N.Y. (1987); and Weir, D.M. and Blackwell, C. (eds.), Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell Scientific Publications (1986)]을 참조하시오.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Heftmann, E. (ed.), Chromatography, fifth ed., Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amesterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elservier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, N.Y. (1987); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sceond Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons, Inc., New York; or Freitag, R., Chromatographical Techniques in the Downstream Processing of (Recombinant) Proteins, Mehtods in Biotechnology, Vol. 24: Animal Cell Biotechnology: Methods and Protocols, 2nd ed., Humana Press Inc., pp.421-453 (2007)]을 참조하시오.
폴리펩티드를 정제하기 위한 방법은 잘 확립되어 있으며 널리 사용된다. 이들은 단독으로 또는 함께 사용된다. 상기 방법은, 예를 들면, 미생물-유래 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피(예, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예, 양이온 교환 (카복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환 크로마토그래피), 친황성 흡착(예, 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예, 페닐-세파로스, 친-아자-아레노성 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피, 및 예비 전기영동 방법(예를 들면, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 93-102 (1998)]이다.
재조합적으로 생성된 면역글로불린의 정제시 종종 다양한 컬럼 크로마토그래피 단계의 조합이 사용된다. 일반적으로, 친화성 크로마토그래피 단계는 하나, 둘 또는 훨씬 더 많은 추가의 분리 단계가 뒤따른다. 최종 정제 단계는 응집 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소와 같은 미량의 불순물 및 오염물의 제거를 위한 소위 "정련 단계"이다. 상기 정련 단계를 위해, 종종 관류(flow-through) 방식의 음이온 교환 물질이 사용된다.
하기의 용어들은, 달리 언급하지 않는 한, 하기의 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다:
용어 "숙주 세포"는 식물 세포 및 동물 세포를 포함한다. 동물 세포는 무척추동물, 비-포유류 척추동물(예, 조류, 파충류 및 양서류) 및 포유동물 세포를 포함한다. 무척추동물 세포의 예로는 다음의 곤충 세포가 포함된다: 스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda)(모충), 아데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 아데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(과실파리) 및 보믹스 모리(Bombyx mori)(예를 들면, 문헌 [Luckow, V.A. et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller, D.W., et al., Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al. (eds.), Vol. 8, Plenum Publishing, pp.277-298 (1986); and Maeda, S., et al., Nature 315, 592-594 (1985)] 참조).
용어 "발현" 또는 "발현하다"는 숙주 세포내에서 일어나는 전사 및 번역을 말한다. 숙주 세포에서 생성물 유전자의 발현 수준은 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양, 또는 세포에서 발현되는 구조 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 양을 기준으로 측정할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "배양"은 숙주 세포의 발효, 즉, 이종 폴리펩티드의 생성이 수행된 용기의 전체 내용물을 의미한다. 상기 용어는 생성된 이종 폴리펩티드, 배지에 존재하는 다른 단백질 및 단백질 단편, 숙주 세포, 세포 단편, 및 배양시 영양 배지와 함께 공급되고 숙주에 의해 생성된 모든 구성성분을 포함한다.
용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 다세포 유기체 또는 조직 외부의 인공적 시험관내 환경에서 세포의 유지, 성장, 증식 또는 팽창을 위한 영양 용액을 말한다. 세포 배양 배지는, 예를 들면, 세포 성장을 촉진하기 위해 배합된 세포 배양 성장 배지, 또는 재조합 단백질 생성을 촉진하기 위해 배합된 세포 배양 생성 배지를 포함하여, 특정 세포 배양 용도에 맞춰 최적화될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유가식 세포 배양" 및 "유가식 배양"은 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 및 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고 추가의 배양 영양소가 연속적으로 또는 불연속적 증분으로 배양 과정 동안의 배지에, 배양 완료 전에, 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 회수하거나 회수하지 않고 공급되는 세포 배양을 말한다. 공급은 특정 세포 배양 성분들의 소비를 기준으로 할 수 있다.
본원에서, 정제될 "샘플"이란 용어는 해당 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함한다. 상기 조성물은, 예를 들면, "부분적으로 정제"(즉, 단백질 A 크로마토그래피와 같이 하나 이상의 정제 단계에 적용)되거나, 또는 예를 들면, 폴리펩티드를 생성하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다(예를 들면, 조성물은 회수된 세포 배양액을 포함할 수 있다).
용어 "오염물"은 적재액과 같은 용액에 존재하는 임의의 외래 또는 바람직하지 않은 분자를 말한다. 오염물은 정제되는 해당 단백질의 샘플에 또한 존재하는, DNA, RNA, 또는 정제되는 해당 단백질 이외의 다른 단백질과 같은 생물학적 거대분자일 수 있다. 오염물은, 예를 들면, 바람직하지 않은 단백질 변이체, 예를 들면, 응집 단백질, 잘못접혀진 단백질, 다이설파이드-결합하의 단백질, 고분자량 종; 정제되는 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터의 다른 단백질, 숙주 세포 DNA, 세포 배양 배지로부터의 성분들, 이전 정제 단계 동안 샘플내에 침출되는 친화성 크로마토그래피를 위해 설정된 흡수제의 일부인 분자, 예를 들면, 단백질 A; 내독소; 핵산; 바이러스; 또는 임의의 상기 물질의 단편을 포함한다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기가, 바람직하게는 공유 결합에 의해 결합된 벌크 코어 물질을 포함하는 고체 물질을 의미한다. 벌크 코어 물질은 크로마토그래피 공정, 즉, 분리된 폴리펩티드와 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 작용기 사이의 상호작용에 수반되지 않는 것으로 이해된다. 상기 물질은 단지 그에 크로마토그래피 작용기가 결합되고 분리된 물질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 작용기에 확실히 접근할 수 있게 하는 3차원 틀을 제공한다. 바람직하게, 상기 벌크 코어 물질은 고체상이다. 따라서, 바람직하게, 상기 "크로마토그래피 물질"은 그에 크로마토그래피 작용기가, 바람직하게는 공유 결합에 의해 결합되는 고체상이다. 바람직하게, 상기 "크로마토그래피 작용기"는 이온성 소수성 기, 또는 소수성 기, 또는 상이한 크로마토그래피 작용기가 특정 유형의 폴리펩티드 또는 공유 결합된 하전된 기에만 결합하기 위해 혼합된 복합체 기이다.
"고체 상"은 비-유체 물질을 의미하며, 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로부터 제조된 입자(미세입자 및 비드 포함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 제올라이트 및 기타 다공성 물질을 포함한다. 고체 상은 고정 성분, 예를 들면, 충전된 크로마토그래피 컬럼일 수 있거나, 또는 비-고정 성분, 예를 들면, 비드 및 미세입자일 수 있다. 상기 입자는 중합체 입자, 예를 들면, 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트); 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 산화 금속 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다(예를 들면, 문헌 [Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 322A-327A (1998)]).
본 출원에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "소수성 전하 유도 크로마토그래피" 또는 "HCIC"는 "소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. "소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질"은 하나의 pH 범위에서 분리된 물질에 대해 소수성 결합을 형성할 수 있고 다른 pH 범위에서는 양으로 또는 음으로 하전되는, 크로마토그래피 작용기를 포함하는, 즉, HCIC가 이온화가능한 소수성 기를 크로마토그래피 작용기로 사용하는 크로마토그래피 물질이다. 일반적으로, 폴리펩티드는 중성 pH 조건하에서 소수성 전하 유도 물질에 결합되고 그 후에 pH 값의 변화에 의한 전하 반발력의 생성에 의해 회수된다. 대표적인 "소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질"은 바이오세프라(BioSepra) MEP 또는 HEA 하이퍼셀(Hypercell)(폴 코포레이션(Pall Corp.), 미국)이다.
본 출원에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피" 또는 "HIC"는 "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"이 사용되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"은 그에 부틸-, 옥틸- 또는 페닐-기와 같은 소수성 기가 크로마토그래피 작용기로서 결합되는 크로마토그래피 물질이다. 폴리펩티드는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질의 소수성 기와 상호작용할 수 있는 그의 표면 노출 아미노산 측쇄의 소수성에 따라 분리된다. 폴리펩티드와 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용은 온도, 용매 및 용매의 이온 강도에 의해 영향받을 수 있다. 온도 증가는, 예를 들면, 아미노산 측쇄의 이동이 증가하고 폴리펩티드 내부에 삽입된 소수성 아미노산 측쇄가 근접가능하게 됨에 따라 폴리펩티드와 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용을 촉진한다. 또한, 소수성 상호작용은 코스모트로픽(kosmotropic) 염에 의해 촉진되며 카오트로픽(chaotropic) 염에 의해 감소된다. "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"은 예를 들면, 벌크 물질에 글리시딜-에터 커플링에 의해 수득되는, 페닐세파로스 CL-4B, 6 FF, HP, 페닐 슈퍼로즈, 옥틸세파로스 CL-4B, 4 FF 및 부틸세파로스 4 FF(모두 독일의 GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences)에서 시판함)이다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "친화성 크로마토그래피"는 "친화성 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 친화성 크로마토그래피에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 작용기에 대한 정전 상호작용 형성, 소수성 결합 및/또는 수소 결합 형성에 따라 그의 생물 활성 또는 화학적 구조를 기준으로 분리된다. 친화성 크로마토그래피 물질로부터 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 회수하기 위해, 경쟁 리간드를 첨가하거나, 또는 완충제의 pH 값, 극성 또는 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건을 변화시킨다. "친화성 크로마토그래피 물질"은 특정 유형의 폴리펩티드에만 결합하기 위해 상이한 단일 크로마토그래피 작용기가 혼합된 복합 크로마토그래피 작용기를 포함하는 크로마토그래피 물질이다. 상기 크로마토그래피 물질은 그 크로마토그래피 작용기의 특이성에 따라 특정 유형의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 대표적인 "친화성 크로마토그래피 물질"은 다수의 표면 노출된 히스티딘, 시스테인 및/또는 트립토판 잔기를 갖는 헥사히스티딘 표지 또는 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드의 결합을 위한, Ni(II)-NTA 또는 Cu(II)-NTA 함유 물질과 같은 "금속 킬레이트화 크로마토그래피 물질", 또는 단백질 A 또는 항원과 같은 "항체 결합 크로마토그래피 물질", 또는 효소 기질 유사체, 효소 보조인자 또는 효소 억제제를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질과 같은 "효소 결합 크로마토그래피 물질", 또는 폴리사카라이드, 세포 표면 수용체, 당단백질 또는 비손상 세포를 크로마토그래피 작용기로서 포함하는 크로마토그래피 물질과 같은 "레시틴 결합 크로마토그래피 물질"이다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "단백질 A"는 그의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로(예를 들면, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해) 생성된 단백질, 및 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질을 결합시키는 능력을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 단백질 A는, 예를 들면, 독일의 GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈로부터 상업적으로 구매할 수 있다.
"단백질 A 친화성 크로마토그래피"는 단백질 A가 일반적으로 고체상에 고정화된 단백질 A를 사용한 물질 및/또는 입자의 분리 또는 정제를 말한다. CH2/CH3 영역을 포함하는 단백질은 단백질 A에 가역적으로 결합되거나 또는 단백질 A에 의해 흡착될 수 있다. 본원에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 사용하기 위한 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼의 예로는 제어된 기공 유리 주쇄상에 고정화된 단백질 A, 폴리스티렌 고체상에 고정화된 단백질 A, 예를 들면, 포로스(POROS) 50A(등록상표) 컬럼(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드(Applied BioSystems Inc.); 또는 아가로스 고체상에 고정화된 단백질 A, 예를 들면, 프로테인 에이 세파로스 패스트 플로우(PROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOW, 등록상표) 또는 맵셀렉트(MABSELECT, 등록상표) 컬럼(GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 독일)이 포함된다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "금속 킬레이트 크로마토그래피"는 "금속 킬레이트 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 금속 킬레이트 크로마토그래피는 크로마토그래피 작용기로서 벌크 물질에 결합되는 Cu(II), Ni(II) 또는 Zn(II)와 같은 금속 이온과, 특히 이미다졸 함유 측쇄 및 티올기 함유 측쇄를 갖는, 폴리펩티드의 표면 노출된 아미노산 측쇄의 전자 공여기 사이에 킬레이트의 형성을 기초로 한다. 킬레이트는 상기 측쇄들이 적어도 부분적으로 양성자화되지 않는 pH 값에서 형성된다. 결합된 폴리펩티드는, 예를 들면, 양성자화에 의해 pH 값의 변화에 의해 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 대표적인 "금속 킬레이트화 크로마토그래피 물질"은 하이트랩(HiTrap) 킬레이트화 HP(GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 독일), 또는 프락토겔(Fractogel) EMD(EMD 케미칼스 인코포레이티드, USA)이다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "이온 교환 크로마토그래피"는 "이온 교환 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 양이온이 "양이온 교환 크로마토그래피"에서 교환되는지 여부에 따라 "양이온 교환 크로마토그래피 물질"을 포함하거나, 또는 음이온이 "음이온 교환 크로마토그래피"에서 교환되는지 여부에 따라 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"을 포함한다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기로서 공유 결합된 하전 기를 갖는 고정 고분자량 고체상을 의미한다. 전체 전하 중립성을 위해, 공유 결합되지 않은 상대 이온이 그와 결합한다. "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 주위 용액의 유사하게 하전된 이온을 그의 공유 결합되지 않은 상대 이온과 교환시키는 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 상대 이온의 전하에 따라서, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 "양이온 교환 크로마토그래피 물질" 또는 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"로 지칭된다. 또한 하전된 기의 성질에 따라서, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은, 예를 들면, 설폰산기(S) 또는 카복시메틸기(CM)를 갖는 경우에 양이온 교환 크로마토그래피 물질로 지칭된다. 하전된 기의 화학적 성질에 따라서, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은, 공유 결합된 하전된 치환체의 강도에 따라 강 또는 약 이온 교환 크로마토그래피 물질로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들면, 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 설폰산기를 가지고, 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 카복실산기를 갖는다. 예를 들어, "양이온 교환 크로마토그래피 물질"은, 예를 들면, 다음과 같은 다수의 회사로부터 다양한 명칭하에 시판된다: 바이오-렉스, 마크로-프레프(Bio-Rex, Macro-Prep) CM(바이오래드 래버러토리즈(BioRad Laboratories)에서 시판, 미국 캘리포니아주 허큘레스), 약 양이온 교환기 WCX2(시퍼겐(Ciphergen)에서 시판, 미국 캘리포니아주 프레몬트), 도웩스(Dowex, 등록상표) MAC-3(다우 케미칼 캄파니(Dow Chemical Company)에서 시판 - 액체 분리, 미국 미들랜드주 미들랜드), 무스탕(Mustang) C(폴 코포레이션(Pall Corp.)에서 시판, 미국 뉴욕주 이스트 힐즈), 셀룰로스 CM-23, CD-32, CM-52, 하이퍼-D 및 파티스피어(Partisphere)(와트만 피엘씨(Whatman plc)에서 시판, 영국 브렌트포드), 앰버라이트(Amberlite, 등록상표) IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT 73(토소 바이오사이언스 게엠베하(Tosoh Bioscience GmbH)에서 시판, 독일 스터트가르트), CM 1500, CM 3000(바이오크롬 랩스(BioChrom Labs)에서 시판, 미국 인디애나주 테러호트), 및 CM-세파로스(등록상표) 패스트 플로우(GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈에서 시판, 독일). 상업적으로 시판하는 양이온 교환 수지로는 또한 카복시메틸-셀룰로스, 베이커본드(Bakerbond) ABX(등록상표), 아가로스상에 고정화된 설포프로필(SP)(예를 들면, GE 헬쓰케어 - 아머샴 바이오사이언시즈 유럽 게엠베하(Amersham Biosciences Europe GmbH, 독일 브라이버그)에서 시판하는 SP-세파로스 패스트 플로우(등록상표) 또는 SP-세파로스 하이 퍼포먼스(등록상표)), 및 아가로스상에 고정화된 설포닐(예를 들면, 독일 GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈에서 시판하는 S-세파로스 패스트 플로우(등록상표))이 포함된다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "하이드록실아파타이트 크로마토그래피"는 크로마토그래피 물질로서 특정 형태의 인산칼슘을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 대표적인 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 물질은 바이오-겔(Bio-Gel) HT, 바이오-겔 HTP, 마크로-프레프 세라믹(바이오래드 래버러토리즈에서 시판), 하이드록실아파타이트 유형 I, 유형 II, HA 울트로겔(시그마 앨드리치 케미칼 코포레이션(Sigma Aldrich Chemical Corp.), 미국), 하이드록실아파타이트 패스트 플로우 및 하이 레졸루션(칼바이오켐(Calbiochem)) 또는 TSK 겔 HA-1000(토소 하스 코포레이션(Tosoh Haas Corp.))이다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "완충된"은 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 완충제 물질에 의해 균등화되는 용액을 의미한다. 상기 효과를 제공하는 임의의 완충제 물질을 사용할 수 있다. 바람직하게, 예를 들면, 인산 또는 그의 염, 아세트산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 모폴린 또는 그의 염, 2-(N-모폴리노) 에탄설폰산 또는 그의 염, 히스티딘 또는 그의 염, 글리신 또는 그의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 그의 염과 같은 약학적으로 허용되는 완충제 물질이 사용된다. 인산 또는 그의 염, 또는 아세트산 또는 그의 염, 또는 시트르산 또는 그의 염, 또는 히스티딘 또는 그의 염이 특히 바람직하다. 선택적으로, 완충 용액은, 예를 들면, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨과 같은 추가의 염을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "막"은 미세다공성 또는 거대다공성 막 둘 다를 의미한다. 막 자체는, 예를 들면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리아미드(나일론, 예를 들면, 제타포어(Zetapore, 등록상표), N66 포시딘(Posidyne, 등록상표)), 폴리에스터, 셀룰로스 아세테이트, 재생 셀룰로스, 셀룰로스 복합체, 폴리설폰, 폴리에터설폰, 폴리아릴설폰, 폴리페닐설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 부직포 및 직물(예, 타이벡(Tyvek, 등록상표)), 섬유 물질과 같은 중합체 물질로 이루어지거나, 또는 제올라이트, SiO2, Al2O3, TiO2 또는 하이드록실아파타이트와 같은 무기 물질로 이루어진다.
"적재 완충제"는 해당 폴리펩티드 분자 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 이온 교환 수지상에 적재시키기 위해 사용되는 완충제이다. 적재 완충제는 해당 폴리펩티드 분자(및 일반적으로 하나 이상의 오염물)가 이온 교환 수지에 결합되게 하는 전도도 및/또는 pH를 갖는다.
용어 "세척 완충제"는 해당 폴리펩티드 분자를 용출시키기 전에, 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 이온 교환 수지를 세척하거나 재평형화시키기 위해 사용되는 완충제를 말한다. 세척 완충제 및 적재 완충제는 동일할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
"용출 완충제"는 해당 폴리펩티드를 고체상으로부터 용출시키기 위해 사용되는 완충제이다. 예를 들면, 용출 완충제의 전도도 및/또는 pH는 해당 폴리펩티드가 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 이온 교환 수지로부터 용출될 수 있도록 적합화된다.
용어 "재생 완충제"는 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 이욘 교환 수지 또는 단백질 A 수지가 재사용될 수 있도록 이들을 재생하기 위해 사용될 수 있는 완충제를 말한다.
용어 "전도도"는 두 전극 사이의 전류를 전도하는 수용액의 능력을 말한다. 전도도에 대한 측정 단위는 mS/cm이며, 전도계를 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 전도도는 용액중 이온의 양을 변화시킴으로써 변화될 수 있다. 예를 들면, 용액중 완충제의 양 및/또는 염(예, NaCl)의 양은 목적하는 전도도를 달성하기 위해 변화시킬 수 있다.
폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 용액으로부터 항체 또는 폴리펩티드를 "정제"하는 것은 조성물로부터 하나 이상의 오염물을 제거함으로써 용액중 항체 또는 폴리펩티드의 순도를 증가시키는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 단백질이 순전하를 갖지 않는 pH를 말한다. 등전점 이하에서, 단백질은 양의 순전하를 가지며, 그 이상에서는 음의 순전하를 갖는다. 등전점은 단백질 정제에 있어 중요하며, 예를 들면, 등전점 전기영동 또는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 분석용 이온 교환 크로마토그래피는 매우 유사한 pI 값을 갖는, 즉, 예를 들면, 0.1 pI 단위 만큼만 차이나는 단백질 변이체를 분리할 수 있다.
분자를 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 이온 교환 물질에 "결합"시키는 것은, 분자와 이온 교환 물질의 하전된 기 또는 하전된 기들 사이의 이온성 상호작용에 의해 분자가 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 이온 교환 물질중에 또는 물질상에 가역적으로 고정화되도록 하는 적절한 조건(pH/전도도)하에서 분자를 이온 교환 물질에 노출시키는 것을 의미한다.
물질을 "세척"하는 것은 크로마토그래피 물질, 예를 들면, 이온 교환 물질을 통해 또는 그 위로 적절한 완충제를 통과시키는 것을 의미한다.
분자를 "용출"시키는 것은, 예를 들면, 크로마토그래피 물질로부터, 용매를 사용하여 하나의 물질(예, 폴리펩티드 또는 오염물)을 또 다른 물질(예, 항체)로부터 분리하는 작용을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "결합-용출 방식" 및 그의 문자적 동의어는, 해당 물질을 함유하는 용액을 정지상, 바람직하게는 고체상과 접촉시킴으로써 해당 물질이 정지상에 결합하는 크로마토그래피 방법의 작동 방식을 의미한다. 그 결과, 해당 물질은 정지상에 유지되는 반면, 해당되지 않은 물질은 관류 또는 상등액과 함께 제거된다. 해당 물질은 그 후에 제 2 단계로 정지상으로부터 용출되어 용출액과 함께 정지상으로부터 회수된다. 이것은 반드시 해당되지 않는 물질 100%가 제거되는 것을 의미하는 것이 아니라, 해당되지 않는 물질의 기본적으로 100%가 제거되는 것, 즉, 해당되지 않는 물질의 50% 이상이 제거되는 것, 바람직하게는 해당되지 않는 물질의 75% 이상이 제거되는 것, 바람직하게는 해당되지 않는 물질의 90% 이상이 제거되는 것, 바람직하게는 해당되지 않는 물질의 95% 이상이 제거되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "관류 방식" 및 그의 문자적 동의어는 해당 물질을 함유하는 용액을 정지상, 바람직하게는 고체상과 접촉시킴으로써 해당 물질이 상기 정지상에 결합하지 않는 크로마토그래피 방법의 작동 방식을 의미한다. 그 결과, 해당 물질은 관류중에 또는 상등액중에 수득된다. 또한 용액중에 존재하는 해당되지 않는 물질은 정지상에 결합하여 용액으로부터 제거된다. 이것은 반드시 해당되지 않는 물질 100%가 용액으로부터 제거되는 것을 의미하는 것이 아니라, 해당되지 않는 물질의 기본적으로 100%가 제거되는 것, 즉, 해당되지 않는 물질의 50% 이상이 용액으로부터 제거되는 것, 바람직하게는 해당되지 않는 물질의 75% 이상이 용액으로부터 제거되는 것, 바람직하게는 해당되지 않는 물질의 90% 이상이 용액으로부터 제거되는 것, 바람직하게는 해당되지 않는 물질의 95% 이상이 용액으로부터 제거되는 것을 의미한다.
본 출원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "구배 용출", "구배 용출 방식", "연속 용출" 및 "연속 용출 방법"은, 본원에서, 예를 들면, 용출, 즉, 크로마토그래피 물질로부터 결합 물질의 해리를 야기하는 물질의 양이 연속적으로 증가 또는 감소되는, 즉, 용출을 야기하는 물질의 양의 2%, 바람직하게는 1% 이하의 일련의 작은 단계들 각각에 의해 변화되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 상기 "구배 용출"에서, 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염의 양 및/또는 크로마토그래피 방법의 유량은 선형적으로 변화되거나, 또는 지수적으로, 또는 점근적으로 변화될 수 있다. 바람직하게, 상기 변화는 선형적이다. 상기 선형적 변화는 정지상에 의해 분리될 수 있다. 또한, 선형적 변화의 경사도는 용출시에 달라질 수 있다. 단계 용출이 하기에 기술하는 바와 같이, 특정 컬럼으로부터 결합 분자의 용출을 위해 특정 크로마토그래피 단계에서 구배 용출 후에 이어질 수 있다.
본 출원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단계 용출", "단계 용출 방식" 및 "단계 용출 방법"은, 예를 들면, 용출, 즉, 크로마토그래피 물질로부터 결합 물질의 해리를 야기하는 물질의 양이 즉시, 즉, 한 값/수준에서 다음 값/수준으로 바로 증가 또는 감소되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 상기 "단계 용출"에서는, 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염의 양 및/또는 크로마토그래피 방법의 유량이 모두 첫 번째 값, 예를 들면, 출발 값으로부터 두 번째 값, 예를 들면, 최종 값으로 즉시 변화된다. 단계의 변화는 용출을 야기하는 물질의 양의 5%, 바람직하게는 10%보다 크다. "단계 용출"은 조건이 선형적 변화와 대비하여 증가적으로, 즉, 단계적으로 변화된다. 각각의 증가 후, 조건들은 용출 방법의 다음 단계까지 유지된다.
용어 "단계 용출만 사용"은 폴리펩티드를 용출하기 위해 단계 용출만을 사용하고 각각의 크로마토그래피 단계에 구배 용출은 사용하지 않는 특정 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출을 말한다.
"단일 단계"는 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염의 양 및/또는 크로마토그래피의 유량이 모두 출발 값으로부터 최종 값으로 한번에 변화되는, 즉, 조건들이 선형적 변화와 대비하여 증가적으로, 즉, 단계적으로 변화되는 공정을 의미한다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "적용되는" 및 그의 문법적 동의어는 정제될 해당 물질을 함유하는 용액을 정지상과 접촉시키는 정제 방법의 부분 단계를 의미한다. 이것은 a) 용액을 정지상이 위치한 크로마토그래피 장치에 부가하거나, 또는 b) 정지상에 용액에 부가되는 것을 의미한다. a)의 경우에, 정제될 해당 물질을 함유하는 용액은 정지상을 통과하여 정지상과 용액중 물질 사이의 상호작용을 가능케 한다. 예를 들면, pH, 전도도, 염의 양, 온도 및/또는 유량과 같은 조건에 따라서, 용액의 일부 물질은 정지상과 결합하므로, 용액으로부터 제거된다. 다른 물질들은 용액중에 남아 있다. 용액중에 잔류하는 물질은 관류중에서 발견될 수 있다. "관류"는 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 의미한다. 바람직하게, 상기 크로마토그래피 장치는 컬럼 또는 카세트이다. 정지상에 결합하지 않은 해당 물질은, 예를 들면, 침전, 염석, 한외여과, 투석여과, 동결건조, 친화성 크로마토그래피 또는 농축 용액을 수득하기 위한 용매 부피 감소와 같이, 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 방법들에 의해 관류로부터 회수될 수 있다. b)의 경우에는, 정지상을, 예를 들면, 분말로서, 정제될 해당 물질을 함유하는 용액에 부가하여 정지상과 용액중 물질 사이의 상호작용을 가능케 한다. 상호작용 후에, 예를 들면, 여과에 의해 정지상을 제거하고, 정지상에 결합되지 않은 해당 물질이 상등액중에 수득된다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "결합하지 않는" 및 그의 문자적 동의어는 해당 물질, 예를 들면, 면역글로불린이 정지상, 예를 들어, 이온 교환 물질과 접촉할 때 용액중에 남아 있는 것을 의미한다. 이것은 반드시 해당 물질의 100%가 용액중에 잔류하는 것을 의미하는 것이 아니라, 기본적으로 100%의 해당 물질이 용액중에 잔류하는 것, 즉, 해당 물질의 50% 이상이 용액중에 잔류하는 것, 바람직하게는 해당 물질의 65% 이상이 용액중에 잔류하는 것, 바람직하게는 해당 물질의 80% 이상이 용액중에 잔류하는 것, 바람직하게는 해당 물질의 90% 이상이 용액중에 잔류하는 것, 바람직하게는 해당 물질의 95% 이상이 용액중에 잔류하는 것을 의미한다.
용어 "공정-제어 파라미터(In-Process-Control Parameter)"(IPC)는 공정 평가에 적용되는 반응 공정을 모니터하기 위해 사용되는 파라미터이다. IPC는, 예를 들면, 항체를 발현하는 세포를 배양하는 동안에 모니터링될 수 있다. "공정-제어 파라미터"를 측정함으로써, 반응 공정에 대한 특정 작용을 유발하는 값이 수득된다. "IPC"에 대한 예는, 예를 들면, 항체의 발효시 산소 및 글루코스 수준, pH 및 CO2 값이다. 상기 파라미터를 측정함으로써 유발되는 작용은, 예를 들면, 산소 및 글루코스 공급에 대한 피드백 제어이다. 다른 IPC는 생성될 항체에 대한 정보, 예를 들면, 배양 배지중 양, 질, 예를 들면, 활성 및 불활성 변이체의 비율, 또는 특정 당-변이체의 함량을 제공할 수 있다. 특정 IPC를 측정하기 위해, 샘플을, 예를 들면, 배지로부터 회수할 수 있거나, 또는 IPC는 발효시 온라인으로 측정할 수 있다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 또는 합성적으로 생성된, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 고분자이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있는 반면, 2개 이상의 폴리펩티드로 이루어지거나 또는 100개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예를 들면, 탄수화물기, 금속 이온 또는 카복실산 에스터를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩티드는 본원에서 그의 아미노산 주쇄 구조 또는 이를 암호화하는 핵산에 관하여 정의된다. 탄수화물기와 같은 부가물은 일반적으로 명시되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "재조합 폴리펩티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환 또는 형질감염되었거나 또는 상동성 재조합의 결과로서 폴리펩티드를 생성된 숙주 세포에서 생성된 폴리펩티드를 말한다.
용어 "이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 주어진 세포내에 천연적으로는 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자 집단 또는 폴리펩티드의 집단을 말한다. 특정 세포에 이종인 DNA 분자는 세포의 DNA가 비-세포 DNA(즉, 외인성 DNA)와 혼합되는 한 세포의 종으로부터 유래된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들면, 프로모터를 포함하는 세포의 DNA 단편에 작용가능하게 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 비-세포 DNA를 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 간주된다. 반대로, 외인성 DNA 분자는 외인성 프로모터와 작용가능하게 연결된 외인성 구조 유전자를 포함할 수 있다. 비-세포 DNA 분자에 의해 암호화된 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
용어 "항체"는 임의의 면역글로불린 또는 그의 단편을 말하며, 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 다클론성, 단클론성, 단일특이성, 다중특이성, 비-특이적, 인간화, 인간, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 그라프트, 이중특이성, 삼중특이성 및 시험관내 생성된 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb를 포함하며, 이들은 항원-결합 기능을 가질 수 있다. 전형적으로, 상기 단편들은 항원-결합 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양"은 폴리펩티드 또는 항체의 양에 상응한다. 상기 양은 상대 단위, 예를 들면, 크로마토그램에서 피크하 면적, 또는 예를 들면, ㎍으로 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 분자"는, 예를 들면, 그의 변이체에 비해 가장 활성 형태일 수 있는 해당 항체를 말한다. 변이체 및 항체 분자는 동일 서열로부터 발현된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "활성 항체 또는 활성 변이체"는 높은 생물 효능을 갖는 항체를 말한다, 즉, "활성 변이체"의 활성은 모든 항체 변이체(항체 변이체는 동일한 항체 서열로부터 발현된다)의 평균 활성의 70 내지 150%이다. 예를 들면, 이온 교환 크로마토그램(도 2 및 표 1 참조)에서 주 피크, 피크 3/3*에 상응하는, 그의 아스파라긴 잔기의 탈아미드화 또는 이성질체화를 갖지 않는 허셉틴 변이체가 분리된 다른 변이체에 비해 가장 높은 생물 효능을 갖는다.
항체 분자의 "활성 변이체"는 해당 항체 분자보다 산성인(예를 들면, 등전점 전기영동 또는 이온 교환 크로마토그래피로 측정) 해당 항체 분자의 변이체이다. 산성 변이체의 한 예는 탈아미드화 변이체이다. 이온 교환 크로마토그래피 시에, 주 피크에 비해 산성 영역에서 용출되는 모든 변이체도 또한 포함된다.
폴리펩티드 분자의 "탈아미드화" 변이체는, 예를 들면, 원래 폴리펩티드의 하나 이상의 아스파라긴 잔기(들)이 아스파테이트로 전환된, 즉, 중성 아미드 측쇄가 전체적으로 산성 특성을 갖는 잔기로 전환된 폴리펩티드이다. 예를 들면, 탈아미드화 her2 변이체는, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그램(도 2, 표 1)에서 피크 1에 상응하는, 아미노산 위치 30에서 아스파라긴의 아스파테이트로의 전환을 갖는 her2 항체 변이체이다.
항체 분자의 "염기성 변이체"는 해당 항체 분자보다 염기성(예를 들면, 등전점 전기영동 또는 이온 교환 크로마토그래피로 측정)인 항체 분자의 변이체이다. 여기서, 이론적으로 항체의 전체적인 이론상의 전하는 변화시키지 않아야 하지만 항체가 이온 교환 크로마토그래피 시에 비변형 항체에 비해 보다 염기성 영역에서 용출되도록 하는 항체의 구조를 야기할 수 있는, 예를 들면, 아스파라긴의 이성질체화만이 상이한 변이체도 또한 포함된다. 이것은, 예를 들면, 피크 4(도 2, 표 1)에 분해된 허셉틴 변이체의 경우이다.
용어 당-변이체는 항체 분자에 비해 상이한 글리코실화 패턴을 특징으로 하는 항체 변이체를 말한다. 이것은 항체에 결합된 폴리사카라이드(글리칸)의 유형 및 분포가 당-변이체 사이에서 다양한 것을 의미한다. 항체 분자의 당-변이체는 또한, 그의 pI 값이 항체 분자와 상이한 경우 염기성 또는 산성 변이체 범주로 분류될 수 있다.
모든 항체 변이체는 항체 분자와 동일한 서열로부터 발현되므로, 예를 들면, 생체내 또는 시험관내에서 번역 후 변형된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "임계비"는 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 특정한 결정이 취해진 그의 변이체의 양의 합의 비를 말한다. 예를 들면, 임계비는 정제 방법 또는 발효시 회수 시점에 결정적일 수 있다. 또는, 수행된 양이온 교환 크로마토그래프의 유형에 결정적이다, 즉, 임계비 미만에서 용출은 상기 비가 임계비보다 높은 경우 수행된 용출과 차별적으로 수행된다(예를 들면, 구배 대 단계 용출).
용어 "항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비"는 특정 부피중 항체 분자 및 그의 변이체의 양에 대한 동일 부피중 항체 분자 또는 그의 변이체의 양의 몫에 상응하는 비이다. 따라서, 항체 분자 또는 그의 변이체의 양은 항체 분자의 양 및 그의 변이체의 전체량의 합에 대해 설정된다. 따라서, 항체 함유 용액중 각각의 항체 변이체 및 항체 분자에 대해, 특정 비가 추정될 수 있으며, 모든 상기 비의 합은 100%이어야 한다. 상기 비는, 예를 들면, UV 흡수가 플롯팅된 도 2에 도시된 바와 같은, 이온 교환 크로마토그램으로부터 결정될 수 있거나, 또는 항체 함량을 측정한 후에 단백질 측정에 의해 결정될 수 있다. 단지 비일 뿐이며 절대값이 아니기 때문에, 상기 비의 결정에 절대 단백질 측정치가 필요한 것은 아니지만, 단지 특정 단백질 양에 상응하는 UV 흡수면 상기 비를 계산하는데 충분할 수 있다. 예를 들면, 크로마토그램 아래 피크 면적을 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 합의 비의 결정에 사용할 수 있다. 이어서, 모든 피크들(항체 분자 및 변이체)의 면적의 합은 분모에 상응하며, 단일 피크하 면적은 각각의 분자에 상응한다.
달리 언급하지 않는 한, 용어 "her2"는 본원에서 사용될 때 인간 her2 단백질을 말하고, "her2"는 인간 her2 유전자를 말한다. 인간 her2 유전자 및 her2 단백질은, 예를 들면, 문헌 [Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) and Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)](진뱅크 등록 번호 X03363)에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약물 제품"은 환자의 치료에 사용되는 제형화 완충액중 정제된 항체를 말한다. 약물 제품은 최소 수준의 활성 항체 변이체 및 최대 수준의 불활성 변이체를 함유한다. 상기 값은 개발시에 평가되어 보건 당국에 제출된다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 방지용 조치를 모두 포함한다. 치료가 필요한 사람으로는 이미 질환을 앓고 있는 사람뿐만 아니라 질환을 예방해야 하는 사람이 포함된다.
"질환"은 본원에 기술된 바와 같이 정제된 폴리펩티드를 사용한 치료로부터 이익을 얻는 임의의 질병이다. 상기 질환은, 포유동물을 문제의 질환에 걸리기 쉽게 만든 병리학적 상태를 포함하여 만성 및 급성 질환 또는 질병을 포함한다.
항체 및 항체 분자의 발효시, 해당 항체뿐만 아니라 상기 항체의 변이체도 생성된다. 이들 변이체는 항체 분자와 비교하여 유사한 활성을 가질 수 있으나, 또한, 예를 들면, 환자에서 치료시 덜 활성일 수 있으며 원료 약품에서 필요치 않을 수 있다. 한 예는 탈아미드화 항체 변이체로, 이것은 생체내 분해에 보다 민감할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 원치않는 변이체에 대해 항체 분자를 고수율 및 고순도로 생성할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 방법은, 예를 들면, 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비로 표현될 수 있는 변이체 분포와 관련하여 항체 조성물이 항체의 회수 시점 및/또는 후속 항체 정제 방법을 조정함으로써 바람직한 방향으로 변화될 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 한다.
따라서, 본 발명은 첫 번째 양태로, 하기 단계를 포함하는, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물의 제조 방법을 제공한다:
a) 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플을 제공하고;
b) 상기 샘플의 분취액중 항체 분자 및 그의 변의체의 존재, 및/또는 상기 샘플의 분취액중 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 측정하고;
c) 단계 b)에서 수득된 데이터를 기준으로 후속 회수 시점 및/또는 항체 정제 방법을 결정함으로써, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 항체 조성물을 생성한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 샘플은 세포 및 세포 파편이 없는 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 세포 배양물이거나, 또는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계의 용출물이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플은, 음이온 교환 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼 등과 같이, 항체 분리에 사용되는 다른 컬럼으로부터 수득된 용출물이다.
본 발명의 특정 양태에서, 항체 분자의 변이체는 산성 변이체, 염기성 변이체, 당-변이체, 또는 항체 분자에 비해 정의된 항원에 상이한 결합 친화도를 갖는 변이체이다.
또 다른 바람직한 태양에서, 항체 분자의 변이체는 항체 분자 자체보다 덜 활성인 변이체이다. 활성은, 예를 들면, "시험관내" 분석(예를 들면, 항원을 중성화시키는 효능) 또는 동물 모델에서 측정될 수 있다.
또 다른 바람직한 태양에서, 항체 분자의 pI는 항체 분자의 pI와 0.1 내지 0.5 pI 단위만큼 상이하다. pI 값은, 예를 들면, 분석될 단백질의 서열을 알고 있는 경우 이론적 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 또는 예를 들면, 등전점 전기영동과 같이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 방법에 의해 측정된다.
본 발명의 특정 양태에서, 배지, 세포, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플을 제공하는 것은 하기 단계를 포함한다:
i) 상기 항체 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는 세포를 제공하는 단계;
ii) 상기 세포를 배지중에서 4 내지 28 일 동안 배양하는 단계; 및
iii) 배지로부터 샘플을 수득하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단계 ii)에서 배지중에 세포를 배양하는 것은 적어도 4 내지 28 일, 바람직하게는 4 내지 18 일, 가장 바람직하게는 4 내지 16 일이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단계 ii)에서 배지중에 세포를 배양하는 것은 특정 항체 농도, 200 mg 이상, 바람직하게는 800 mg/l 이상, 보다 바람직하게는 1000 mg/ml 이상, 가장 바람직하게는 1500 mg/ml 이상이 수득될 때까지 수행된다. 상기 농도는 특히 발현된 항체의 종류에 따라 달라진다. 허셉틴의 경우, 200 mg/l 이상의 항체 농도가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 항체 분자 및/또는 그의 변이체의 존재, 및 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 합의 비는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, 분석용 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정된다. 상기 기술은 일반적으로 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 구배 용출을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 항체 분자 및 그의 변이체의 상대량의 계산을 위해, 분리된 각각의 피크에 대해 피크하 면적을 측정한다(가능한 방법의 상세한 내용은 하기의 실시예를 참조하시오). 항체 분자 및/또는 그의 변이체의 존재의 측정은 항체 분자 및/또는 그의 변이체가 특정 샘플에 함유되어 있는지 아닌지 여부의 단순한 측정이다. 그 상대량에 무관하게, 특정 변이체가 함유되어 있다는 단순한 관찰은 회수 시점 또는 정제 방법에 결정적일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 항체 분자, 즉, 해당 항체 분자, 또는 그의 변이체의 비율은 숙련된 자에게 공지된 다른 적당한 방법, 예를 들면, 등전점 전기영동(이에 관하여, 또한 문헌 [Ahrer and Jungbauer, J. of Chromatog. Vol. 841, pages 110-122 (2006)]의 고찰 참조)에 의해 측정된다.
본 발명의 다른 양태에서, 당-변이체의 존재 및/또는 양은, 예를 들면, MALDI-TOF(매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화 비행 시간) 분석, 또는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 다른 방법에 의해 측정된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 가장 활성인 변이체 및 그의 다른 변이체의 합에 대한, 이온 교환 크로마토그램에서 피크 3/3*에 상응하는 가장 활성인 her2 항체 변이체의 양을 측정한다(예를 들면, 도 2 및 표 1 참조)(문헌 [Harris, R.J., J. Chromatogr. B 752, 233-245 (2001)] 참조).
본 발명의 또 다른 태양에서, 항체 분자 및/또는 그의 변이체의 존재 또는 비는, 예를 들면, 발효 3, 5 또는 7 일 후에, 매일, 격일로, 또는 다른 규정된 증분으로, 또는 발효 배지중 0.2 내지 1.5 mg/ml의 특정 항체 농도가 도달한 후 매일 또는 격일로 측정한다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 활성 항체의 상대량은 특정 발효 기간 후에, 바람직하게는 허셉틴의 경우 발효 10, 11 또는 12 일 후에 발효 과정 동안에 단지 1회 측정한다.
본 발명 방법의 특정 태양에서, 특정 발효일에 전체 항체량(샘플중 항체 분자 및 모든 변이체의 양의 합)은, 예를 들면, 단백질 측정 및 ELISA(효소-결합 면역흡착 분석)와 같이 숙련된 자에게 공지된 방법을 이용하여 측정한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 특정 시점에서 전체 항체량은 이전의 유사한 발효 작업에서 알려진 전체 항체량의 시간 경로를 기준으로 산출한다. 하기 실시예에서는, 샘플중 her2의 양의 측정에 대표적인 방법이 기술된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 항체 분자 및 그의 변이체는, 선택적으로 친화성 크로마토그래피 단계를 수행한 후, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그러나, 사용된 용출 방식은 공급 물질의 순도, 즉, 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비에 따라 달라진다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 양이온 교환 컬럼으로부터 항체의 용출은, 단계 a1)에서 측정된 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 임계비 미만인 경우 i) 양이온 교환 컬럼에 적용된 완충제의 전도도 및/또는 pH의 점진적 증가 및 ii) 두번째로, 양이온 교환 컬럼에 적용된 용출 완충제의 전도도 및/또는 pH의 단계적 증가를 통해, 또는 단계 a1)에서 측정한 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 임계비 이상인 경우 컬럼에 적용된 용출 완충제의 전도도 및/또는 pH의 점진적 증가 없이 전도도 및/또는 pH의 단계적 증가를 통해 수행된다.
본 발명에 있어서 상기 임계비는 다음과 같이 측정될 수 있다: 목적은 상기 항체의 상술에서 나타낸, 미리결정된 최소 수준의 해당 항체 분자 및 미리결정된 최대 수준의 그의 변이체를 갖는 제형화된 치료용 항체 약물(원료 약물 제품)이다. 상기 수준은, 예를 들면, 규제 위원회(Regulatory Authorities)에 타당하다. 변이체는, 예를 들면, 생체내에서 덜 활성일 수 있으며 다른 이유로 필요치 않다. 상기 임계비는 현재 회수 시점 및 정제 방법, 특히, 양이온 교환 크로마토그래피시 용출 방식을 결정짓는다. 예를 들면, 임계비 미만에서, 항체는, 충분히 높은 순도의 항체 분자 및 수율을 얻기 위해 양이온 교환 크로마토그래피에서 구배 용출 후 단계 용출에 의해 정제되며, 상기 비 이상에서 항체는 고수율을 얻기 위해서 단계 용출에 의해서만 정제되며 항체는 여전히 만족스러운 기준을 충족시킨다. 따라서, 임계치는 공급 물질의 성질과 무관하게 규제 위원회의 요구를 충족시키는 항체가 수득되고, 가능한 최고 수율이 수득될 수 있도록 설정된다. 또 다른 바람직한 태양에서, 임계비는 회수 시점을 결정지으므로, 예를 들면, 회수는 양이온 교환 크로마토그래피에서 단계 용출 방식만을 항상 사용하기 위해 임계치 이상의 값이 도달하는 경우(하기 참조)에만 수행된다. 여기서 배경은, 발효시 특정 항체 변이체가 발생되고 그의 상대량을 증가시킬 수 있는 반면, 항체 분자의 양은 발효시 감소될 수 있다는 것이다.
임계비에 대한 값은 물론 특히 정제될 항체, 발효 조건, 보건 당국의 요구, 및 사용된 하류 및 제형화 절차(크로마토그래피 단계, 여과 등)에 따라 달라지므로, 각각의 치료용 항체 제조 과정에 대해 개별적으로 규정되어야 한다.
규정된 임계비 미만에서, 특정한, 예를 들면, 원치않는 변이체의 상대량은 비교적 높으며, 해당 항체 분자의 양은 비교적 낮다. 이 경우, 구배 용출 방식 후 동일 컬럼에서 단계 용출이 변이체로부터 항체 분자를 판매하기에 적합한 약물 제품이 수득될 수 있는 정도로 정제하는데 적합한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 단계 용출만 사용하는 방식은 이 경우에 그 변이체로부터 항체 분자의 보다 낮은 정제도로 인해 덜 적합하다. 가장 최악의 경우, 정제될 항체 함유 용액이 임계비 미만의 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그 변이체의 양의 합의 비를 갖는 경우, 단계 용출은 판매에 적합한 약물 제품을 제공하지 못한다(하기 실시예 참조).
다른 한편으로, 정제될 항체 함유 용액중 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 임계비보다 더 높은 경우, 양이온 교환 크로마토그래피시 단계 용출만 사용하는 방식이 바람직한데, 그 이유는 상기 용출 방식이 구배 용출에 이은 단계 용출과 비교하여, 더 높은 수율을 제공하며, 판매하기에 적합한 약물 제품이 수득되기 때문이다. 즉, 비로 나타내는, 양이온 교환 컬럼에 적용되는 공급 물질의 보다 높은 순도로 인해, 수율을 위해 최적화된 용출 방식이 선택될 수 있다(단계 용출).
양이온 교환 크로마토그래피시 단계 용출 방식이 수율과 관련하여 유리하므로, 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 항상 임계비보다 더 높도록 회수 조건이 선택될 수 있으며, 따라서 단계 용출은 항상 허용가능한 약물 제품을 제공할 것이다.
바람직하게, 항체는, 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 임계비보다 0 내지 2% 더 높을 때 세포 배양 배지로부터 회수하며, 임계비에 아주 가깝거나 동일한 것이 가장 바람직하다. 이때, 높은 절대량의 항체를 얻기 위해 발효를 가능한 한 오래 지속하되 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 불리한 비를 배제하기 위해 너무 오래 지속하지 않도록 한다. 본 발명의 발견에 따르면, 특정 발효 기간 후에, 항체 분자의 비율이 감소하는 반면, 그의 변이체의 비율은 증가한다(허셉틴의 경우 도 1 참조).
본 발명의 특정 양태에서, 항체가 구배 용출 후 단계 용출을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리되는지, 아니면 단계 용출만을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리되는지 여부를 결정하기 위한 임계비는 50 내지 100%, 바람직하게는 60 내지 80%의 범위, 가장 바람직하게는 65 내지 75%의 범위이다. 본 발명의 더욱 바람직한 태양에서, 임계비는 67.5%이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 방법에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이며, 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 항체의 재조합 생산을 위한 일반적인 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 원핵 또는 진핵 세포에서 단백질 발현에 이어 항체의 분리 및 통상적으로 약학적으로 허용되는 제품으로의 정제를 포함한다(예를 들면, 다음의 고찰을 참조하시오: 문헌 [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202 (1999); Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8, 271-282 (1996); Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16, 151-160 (2000); Werner, R.G., Drug Res. 48, 870-880 (1998)].
숙주 세포에서 전술한 바와 같은 항체의 발현을 위해, 각각의 변형된 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터내에 삽입된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA의 공급원으로 작용할 수 있다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터내에 삽입될 수 있으며, 이어서 상기 발현벡터는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, PER.C6 세포, 효모, 이. 콜라이(E. Coli) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내에 형질감염되어, 숙주 세포에서 재조합 단클론성 항체의 합성을 제공한다. 숙주 세포는 이종 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양되며, 이종 폴리펩티드는 세포 또는 배양 상등액으로부터 분리된다.
일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 재조합 단백질의 제조에 유용하다. 재조합 단백질은 유전 공학 방법에 의해 생성된 단백질이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 제조에 특히 바람직한 단백질은 생물제제로도 알려진 단백질-기재 치료제이다. 바람직하게, 단백질은 세포외 산물로서 분비된다.
본 발명 방법의 한 태양에서, 세포는 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 세포 클론이다.
본 발명에 따른 방법은 원칙적으로 어떤 항체의 제조에도 적합하다. 한 태양에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 면역글로불린은 재조합 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 인간화 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 면역글로불린 결합체 또는 키메라 면역글로불린이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항체는 단클론성 및 다클론성 항체 군에서 선택된다. 바람직한 태양에서, 항체는 단클론성 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 IgG 또는 IgE 부류의 면역글로불린의 정제이다. 한 바람직한 태양에서, 항체는 단클론성 항체이다. 또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 항체는 치료 또는 진단용 항체이다. 한 바람직한 태양에서, 항체는 치료용 항체이다.
이종 폴리펩티드의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에 유용한 세포는 원칙적으로, 예를 들면, 효모 세포 또는 곤충 세포 또는 원핵 세포와 같은 임의의 진핵 세포일 수 있다. 그러나, 본 발명의 한 태양에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 바람직하게, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포주, 또는 BHK 세포주, 또는 HEK293 세포주, 또는 인간 세포주, 예를 들면, PER.C6(등록상표)이다. 또한, 본 발명의 한 태양에서, 진핵 세포는, 예를 들면, 인간 세포주 HeLaS3[Puck, T.T., et al., J. Exp. Meth. 103, 273-283 (1956); Nadkarni, J.S., et al., Cancer 23, 64-79 (1969)], HT1080[Rasheed, S., et al., Cancer 33, 1027-1033 (1974)] 또는 이들로부터 유도된 세포주와 같은 동물 또는 인간 기원의 연속 세포주이다.
본 발명의 특정 양태에서, 세포는 항체가 발현되는 조건하에 배지중에서 배양된다. 재조합 세포 클론은 일반적으로 임의의 바람직한 방식으로 배양될 수 있다. 본 발명의 상기 양태에 따라 첨가되는 영양소는, 예를 들면, 글루타민 또는 트립토판과 같은 필수 아미노산, 또는/및 탄수화물, 및 선택적으로, 비-필수 아미노산, 비타민, 미량 원소, 염, 또는/및 예를 들면, 인슐린과 같은 성장 인자, 및/또는 예를 들면, 식물 유래 펩티드를 포함한다. 한 태양에서, 영양소는 세포의 전체 성장 단계(배양)에 걸쳐 첨가된다. 본 발명에 따른 세포 배양물은 배양 세포에 적합한 배지중에서 제조된다. 본 발명의 한 태양에서, 배양 세포는 CHO 세포이다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Cleveland, W.L., et al., J. Immunol. Methods 56, 221-234 (1983)] 참조). 또한, 특정 세포주에 대한, 그 양을 포함하여, 배지를 위한 필수 영양소 및 성장 인자는, 예를 들면, 문헌 [Mather(ed.), Mammalian cell culture, Plenum Press, NY (1984); Rickwood, D., and Hames, B.D.(eds.), Animal cell culture: A Practical Approach, 2nd ed., Oxford University Press, NY (1992); Barnes and Sato, Cell 22, 649 (1980)]에 기술된 바와 같이 과도한 실험 없이 실험적으로 결정될 수 있다.
용어 "발현에 적합한 조건하에서"는 폴리펩티드를 발현하는 세포의 배양에 사용되고 공지되어 있거나 당해 분야에 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 조건을 의미한다. 당해 분야에 숙련된 자에게 상기 조건은 배양되는 세포의 유형 및 발현되는 폴리펩티드의 유형에 따라 달라질 수 있는 것으로 공지되어 있다. 일반적으로, 세포는, 예를 들면, 20 내지 40 ℃의 온도에서 및 결합체의 효과적인 생성을 가능케 하기에 충분한 시간 동안, 예를 들면, 4 내지 28 일 동안 배양한다.
본 발명의 한 태양에서, 배양물은 현탁 배양물이다. 또한, 또 다른 태양에서, 세포는 낮은 혈청 함량, 예를 들면, 최대 1%(v/v)를 함유하는 배지중에서 배양된다. 바람직한 태양에서, 배양물은, 예를 들면, 무혈청의 저-단백질 발효 배지중 무혈청 배양물(예를 들면, WO 96/35718 호 참조)이며, 또 다른 바람직한 환경에서, 배지는 단백질-비함유 및/또는 완전 합성 배지이다. 적절한 첨가제를 함유하는, 함(Ham's) F10 또는 F12(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지(MEM, 시그마), RPMI-1640(시그마) 또는 둘벡코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, 시그마)와 같은 상업적으로 시판하는 배지가 대표적인 영양소 용액이다. 임의의 상기 배지에는 필요한 대로 상기 언급한 바와 같은 성분들이 보충될 수 있다.
항체의 대규모 또는 소규모 생성을 위한 세포 배양 절차는 잠재적으로 본 발명의 맥락에서 유용하다. 유동층 생물반응기, 중공섬유 생물반응기, 회전병 배양, 또는 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이로 한정되지는 않는 절차가, 뒤의 두 시스템에서는 미세운반체의 존재 또는 부재하에, 사용될 수 있다. 상기 시스템은 회분식, 유가식(fed-batch), 분할-회분식(split-batch), 연속 또는 연속-관류 방식 중 하나로 운전될 수 있다. 본 발명의 특정 태양에서, 배양은, 배양의 필요에 따른 공급하에 분할-회분식 공정으로 수행되는데, 상기 공정에서는 배양액의 일부가 성장 단계 후에 회수되며 나머지 배양액은 발효조에 잔류하여 계속해서 새로운 배지와 함께 작업 부피 이하로 공급된다. 본 발명에 따른 방법은 목적 항체가 매우 고수율로 회수되게 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 유가식 또는 연속 세포 배양 조건은 세포 배양의 성장 단계 동안에 포유동물 세포의 성장을 강화하도록 설계된다. 성장 단계에서, 세포는 성장을 위해 최대화된 조건하에서 및 기간 동안 성장된다. 온도, pH, 용존 산소(DO2) 등과 같은 배양 조건은 특정 숙주에 사용되는 조건이며 숙련된 자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 세포 배양물의 생성 단계시 세포-배양 환경이 제어된다. 생성될 항체에 대한 배양 조건은 하기의 파라미터에 의해 규정된다:
a) 기본 배지: 영양소량, 선택적인 혈장 성분, 성장 인자, 염 및 완충제, 뉴클레오시드 및 염기, 단백질 가수분해물, 항생물질 및 지질, 적합한 담체의 양 및 유형,
b) 탄수화물량, 용존 산소량, 암모늄량, pH 값, 삼투몰농도, 온도, 세포 밀도, 성장 상태의 유형 및 양,
c) 선택적으로 추가의 첨가제(예를 들면, 혈장 성분, 성장 인자, 예를 들어, 혈청 성분, 성장 호르몬, 펩티드 가수분해물, 소분자(덱사메타손, 코티솔, 철 킬레이트화제 등), 무기 화합물(셀렌 등), 및 글리코실화 프로필의 효과를 갖는 것으로 알려진 화합물(부티레이트 또는 퀴니딘, 알카노산 또는 구리, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 호르몬, 염, 무기 이온, 완충제, 뉴클레오시드 및 염기, 단백질 가수분해물, 항생물질, 지질, 예를 들어, 리놀레산)이 첨가된다.
또 다른 첨가제는, 예를 들면, 세포 성장 및/또는 세포 생존 증대 및/또는 임의의 바람직한 방향으로 글리코실화 항체의 글리코실화 프로필의 조작을 자극하는 비-필수 화합물이다.
폴리펩티드 생성 단계는 일반적으로 성장 단계 시작 후 적어도 3 시간 후에, 예를 들면, 성장 단계 시작 후 약 12 내지 약 224 시간, 또는 약 120 내지 192 시간 후에 시작된다. 생성 단계는, 예를 들면, 4 내지 14 일간 지속될 수 있다. 또는, 생성 단계는 18 내지 21 일 또는 그보다 훨씬 더 오래, 예를 들면, 28 일까지 될 수 있다. 상기 단계 동안, 세포 성장은 일반적으로 안정상태를 유지한다, 예를 들면, 대수적 세포 성장이 종료되고 단백질 생성이 주요하게 된다.
본 발명의 한 양태에서, 예를 들면, 특정 세포 배양 파라미터(락테이트 생성, 항체량)의 측정 또는 생성된 항체의 품질 검사(활성 및 불활성 변이체의 상대량 측정)를 위해, 배양 배지의 간헐적 샘플링을 이용할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 세포는 특정 항체의 발현에 적합하고 그 변이체에 비해 특정 비율의 항체를 유도하는 조건하에 배지중에서 배양한다. 상기 비율은 발효시에 달라질 수 있다, 즉, 예측가능하거나(예를 들면, 선형 감소/증가 또는 특정 화학식에 따라) 또는 예측할 수 없을 정도로 증가 또는 감소할 수 있다. 일반적으로, 항체를 암호화하는 핵산은 동일하지만 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 구조 및 아미노산 서열과 관련하여 동일하지 않으나, 발효시에 및 발효 후에 상이한 공정에 의해 변형된다. 통상적인 변형은, 예를 들면, 탈아미드화 및 글리코실화이며, 이것은 단일 발효 배치에서 생성된 항체의 전하 이질성을 야기할 수 있다. 전하 이질성을 야기하는 다른 변형은 불완선 다이설파이드 결합 형성, N-말단 피로글루타민 환화, C-말단 라이신 가공, 이성질체화 및 산화, 및 말레우르산에 의한 N-말단 아미노산의 덜 일반적인 변형 및 C-말단 아미노산의 아미드화이다.
회수 시점은 항체의 발효시, 항체가 회수되는, 즉, 배양물로부터 회수되고 예를 들면, 배지로부터 냉동 또는 분리되는 시점을 나타낸다. 상기 시점은 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비로 나타내는, 항체 함유 배지의 조성 또는 질을 기준으로 본 발명에 따라 선택된다. 예를 들면, 특정 변이체(예를 들면, 산성, 염기성, 당-변이체)의 존재 또는 발생은, 예를 들면, 추가의 배양시에 원치 않는, 예를 들면, 덜 활성인 항체 변이체의 추가의 농축을 방지하기 위해 발효가 중단되어야 하는 지를 결정할 수 있다. 그러나, 특정 변이체 대 해당 항체 분자의 상대량, 즉, 항체 분자의 변이체 및 항체 분자 및 그 변이체의 양의 합의 비는 또한, 바람직한 정제 방법을 결정하는 목적 항체 조성물을 수득하기 위해 회수 시점을 결정할 수 있다.
결정된 비는 이어서, 예를 들면, 목적 항체 조성물을 수득하기 위해 특정 크로마토그래피 프로토콜이 뒤따를 수 있도록 발효가 중단되거나 또는 계속되어야 하는 (규정된) 임계비와 비교될 수 있다. 예를 들면, 특정 샘플에서, 특정한 불리한 변이체의 상대량이 비교적 높거나 또는 해당 항체 분자의 상대량이 낮으면, 불리한 변이체가 허용될 정도로 낮도록 해당 항체 분자의 정제를 가능케 하는 정제 프로토콜이 선택되어야 하는 경우일 수 있다. 다른 한편으로, 단계 b)에서 측정된 비는 발효가 목적하는 비가 수득될 때까지 더 지속되어야 하는 지를 나타낼 수 있다. 비의 결정은 반복적으로 수행될 수 있지만, 상기 비는 또한 추가의 배양을 위해 추정될 수 있다(하기 참조).
항체 생성 세포주의 발효 기간 및 하위 절차시의 조건은, 예를 들면, 샘플중 해당 항체 분자에 비교하여 탈아미드화 변이체의 상대량에 영향을 미치는 것으로 나타난 대표적 파라미터이다(하기 실시예 참조).
하위 절차가 단일 아미노산의 전하에서만 상이할 수 있는 밀접하게 관련된 항체 변이체의 정제에 특정 한계를 정한다고 가정하면, 예를 들면, 발효 배지중 항체 분자의 수준은, 하위 절차가 충분히 순수한 원료 약물 제품을 고수율로 제공하도록 특정 임계치 미만으로 떨어지지 않아야 한다. 그러므로, 발효는, 항체 분자의 상대량이 규정된 임계비보다 높은 경우, 예를 들면, 세포 배양 배지로부터 항체를 회수함으로써 특정 시점에서 중단되어야 한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 항체가 배양 배지로부터 회수되는 시점은 앞에서 정의한 임계비와의 비교로부터 유도된다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 회수 시점은, 항체 분자의 상대량의 선형 감소 또는 증가를 특정한 일일 비율에 의해 추정함으로써, 항체 분자 또는 그의 변이체의 양 및 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 평가함으로써 결정된다. 특히, 이 경우에, 분석용 이온 교환 크로마토그래피에 의한, 항체 분자 또는 그의 변이체 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비의 단일 측정은 배양 배지로부터 항체를 회수하기 위한 시점을 측정하기에 충분할 수 있는데, 그 이유는 상기 시점이 추가의 측정으로부터 유도되는 대신 계산될 수 있기 때문이다. 특정 태양에서, 항체 회수 시점은, 배지중 항체 분자의 양이 특정한 일일 비율에 의한 특정한 배양 기간 후에 감소하는 것을 가정함으로써 계산된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 샘플링 및 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비의 측정은, 상기 비가 특정 임계비보다 0 내지 2% 높을 때까지 수행되고/되거나, 하기 수학식 1에 따라 비를 계산하여, 단계 iii)에서 샘플이 수득된 날 이후에 배양을 위해 배지중 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 외삽함으로써 수행된다:
[수학식 1]
Rx = R0 - C x (Dx - D0)
상기 식에서,
D0는 단계 (c)에서 샘플이 수득되는 배양일이고,
Dx는 D0 후의 배양일이고,
Rx는 Dx 동안 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비이고,
R0는 단계 iv)에서 측정된, D0에서 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비이고,
C는 1 내지 5%/일의 범위의 값이다.
이어서, 항체 분자를, 배지중 Rx가 임계비보다 0 내지 2% 높을 때 배지로부터 회수한다.
바람직하게, 항체 분자는, 배지에서의 Rx가 임계비보다 0 내지 2% 높을 때, 가장 바람직하게는 상기 비가 임계치에 가깝거나 심지어 동일할 때 회수한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 임계 비는 특히 항체 분자의 성질 및 항체 조성물중 수득될 순도의 정도에 따라 달라진다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 이온-교환 크로마토그램에서 피크 3/3*에 상응하는 활성 her2의 양은 특정 배양 시간 후에, 예를 들면, 10 일 배양 후에 매일 약 2% 만큼 감소한다(도 1 참조).
본 발명의 특정 양태에서, Rx는 바람직하게는 회수 직전에(예를 들면, 회수 1 내지 2 일 전에 또는 예를 들면, 허셉틴 발효의 경우 11 일째에) 단지 1회만 측정된다. 상기와 같이 측정된 Rx가, 예를 들면, 임계비보다 2% 높은 경우, 배양은 추가 1 일 동안 수행되며, 따라서 항체의 회수는 Rx의 측정 1 일 후에 이루어진다. 허셉틴 발효의 경우, 임계 비는 많은 이전의 발효 작업으로부터 알려지듯 발효 11일부터 12일까지 약 2% 감소하므로, 회수시 Rx는 임계비에 매우 근접할 것이다.
그러나, 제 11 일에 측정된 Rx가 임계비보다 2% 미만으로 높은 경우, 예를 들어, 발효 11 일(d11)에 상기 비보다 1.5% 높은 경우, 허셉틴 발효는 원료 약물 제품의 충분히 높은 품질을 보장하기 위해 즉시 중단되어야 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 배양 배지로부터 샘플을 수득한다. 또 다른 태양에서, 샘플링은 1 회 이상, 예를 들면, 매일, 2일마다 등, 또는 하루에 1회 이상 수행된다. 상기 샘플링은 배양 시작하고 즉시 또는 특정 시간 후, 예를 들면, 배양 7 또는 10 일 후에 개시될 수 있다. 상기 샘플에서, 항체 분자 및/또는 그의 변이체 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비, 즉, 활성 항체 변이체의 비율을 측정한다. 또는, 상기 샘플에서 다른 파라미터를 측정한다. 샘플링은 당해 분야에 숙련된 자에 의해 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 활성 항체의 절대량도 또한 측정할 수 있다.
샘플링은 자동 또는 수동으로 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 태양에서, 샘플링 단계는 자동으로 수행된다. 샘플 부피는 1 내지 10,000 ㎕의 범위일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 기술된 방법으로 수득할 수 있는 원료 약물 제품중 활성 her2 항체 변이체의 비율은 65% 이상이며, 불활성 her2 변이체의 비율은 20% 이하인데, 여기서 활성 her2 변이체는 이온 교환 크로마토그램에서 피크 3/3*에 상응하고, 이와 관련하여 불활성 변이체는 상기 크로마토그램의 피크 4에 상응한다(도 1 참조).
본 발명의 특정 양태에서, 생성된 항체 조성물중 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비는 50 내지 100%, 바람직하게는 60 내지 100%, 가장 바람직하게는 65 내지 100%이다. 상기 값들은 특히 정제될 항체에 따라 달라진다.
본 발명의 특정 양태에서, 해당 폴리펩티드는 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되지만, 상기 폴리펩티드는 또한 분비 신호 없이 직접 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수도 있다. 회수, 즉, 세포 배양 배지로부터 항체의 회수는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 발효 배지로부터 세포를 분리시킴으로써 수행된다. 제 1 단계로, 배양 배지 또는 용해물은, 예를 들면, 원심분리되어 입자 세포 파면 및 세포를 제거한다. 심층 여과 또는 다른 여과 및/또는 원심분리 단계가 이어질 수 있다. 그 후에, 세포 및 세포 파편을 함유하지 않는 항체 함유 용액이 수득된다.
이어서, 폴리펩티드를 전형적인 적합한 정제 절차인 하기 절차에 의해 오염물로부터 정제한다: 면역친화성 및 이온-교환 컬럼상에서의 분류; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카상 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들면, 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과; 및 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼. 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF) 또는 EDTA와 같은 프로테아제 억제제도 또한 정제시 단백질분해성 분해를 억제하는데 유용할 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자는 해당 폴리펩티드에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양물에서 발현시 폴리펩티드의 특성의 변화의 원인이 되는 변형을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 항체의 정제는 친화성 크로마토그래피에 이은 양이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 두 크로마토그래피 단계 사이에, 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 항체의 정제에 적합한 추가의 크로마토그래피 및/또는 여과 단계, 및 양이온 교환 크로마토그래피 단계 후 및 단백질 A 친화도 단계 전에 추가의 크로마토그래피 및/또는 여과 단계가 포함될 수 있다. 크로마토그래피의 순서를 거꾸로 하는 것도 또한 가능하다. 정제 방법의 한 단계(또는 후속 단계)에 용액을 적용하기 전에, 예를 들면, 용액의 pH 값 또는 전도도와 같은 파라미터가 조정되어야 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 항체 분자 및 그의 변이체를 함유하는 배지를 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하고 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 숙주 세포 단백질 및 배양 부산물의 대부분의 제거를 위해 제일 처음 정제 단계로서 친화성 크로마토그래피 단계를 사용한다. 상기 단계를 위한 조건은 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 친화성 컬럼 물질은 단백질 A 물질, 단백질 G 물질, 금속 친화성 크로마토그래피 물질, 소수성 전하 유도 크로마토그래피 물질(HCIC) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질(HIC, 예를 들면, 페닐-세파로스, 친-아자-아레노성 수지 또는 m-아미노페닐보론산)이다. 바람직하게, 친화성 컬럼 물질은 단백질 A 물질 또는 금속 친화성 크로마토그래피 물질이다.
본 발명의 특정 양태에서, 고체상 위에 고정화된 단백질 A를 사용하여 항체를 정제한다. 고체상은 바람직하게는 단백질 A를 고정화하기 위한 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼이다. 바람직하게, 고체상은 제어된 기공 유리 컬럼 또는 실릭산 컬럼이다. 때때로, 컬럼은 컬럼에 비특이적 부착을 방지하기 위한 시도로 글리세롤과 같은 시약으로 코팅되었다. 바이오프로세싱 리미티드(Bioprocessing Limited)로부터 상업적으로 시판하는 프로셉(PROSEP) A 컬럼은 글리세롤로 코팅되는 단백질 A 제어 기공 유리 컬럼의 한 예이다. 본 발명의 특정 양태에서, 단백질 A 물질은 25 mg 항체/단백질 A 물질 ml보다 큰 결합 능력을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 에폭시 활성화에 의해 C-말단 시스테인에서 기본 매트릭스에 단백질 A가 커플링되는 고-유량 아가로스 기본 매트릭스를 친화성 크로마토그래피 단계에 사용한다. 본 발명에 따른 방법에 적합한 단백질 A 물질에 대표적인 물질은 맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure) 및 맵셀렉트 엑스트라(Mabselect Xtra)(둘 다 독일의 GE 헬쓰케어 라이프사이언시즈에서 입수가능함)이다.
본 발명의 특정 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피를 위한 고체상은 적절한 완충제로 평형화시킨다. 예를 들면, 평형 완충제는 TRIS, NaCl(pH 7.1)이다. 본 발명의 특정 양태에서, 상기 완충제는 EDTA 또는 또 다른 프로테아제 억제제 및/또는 항체 안정화제를 함유한다.
본 발명의 특정 양태에서, 예를 들면, 원심분리 및/또는 여과 또는 심층 여과에 의해 세포 및 세포 파편으로부터 분리된 항체-함유 배지를, 평형 완충제와 동일할 수 있는 적재 완충제를 사용하여 평형화된 고체상에 적재시킨다. 오염된 제제가 고체상을 통해 유동할 때, 단백질은 고정화된 단백질 A에 흡착되고, 단백질이 CHO 세포에서 생성될 때 차이니즈 햄스터 난소 단백질(CHOP)과 같은 다른 오염물 및 DNA는 고체상에 비특이적으로 결합한다.
그 후에 수행되는 다음 단계는 고체상에 결합된 오염물을 제거하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 예를 들면, TMAC 및/또는 TEAC(약 0.1 내지 약 1.0 M)가 2가 이온 또는 용매를 포함할 수 있으므로, 세척 완충제는 세척 단계에서 소수성 전해질 용매를 포함한다. 상기 목적에 적합한 완충제로는, 예를 들면, TRIS, 포스페이트, MES 및 MOPSO 완충제가 포함된다(하기 실시예 참조). 본 발명의 또 다른 양태에서, 세척 완충제는 중성 또는 산성 pH에서 아르기닌을 포함한다.
상기 언급한 세척 단계 후에, 해당 단백질을 적당한 용출 완충제를 사용하여 컬럼으로부터 회수한다. 단백질은, 예를 들면, 약 2 내지 약 5 범위의 낮은 pH를 갖는 용출 완충제를 사용하여 컬럼으로부터 용출될 수 있다. 이를 위한 용출 완충제의 예로는 시트레이트 또는 아세테이트 완충제가 포함된다. 또는, 용출 완충제는 아르기닌, 2가 염 또는 용매를 포함한다.
용출 단백질 제제는 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다. 대표적인 추가의 정제 단계는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피; 투석, 단백질을 포획하기 위한 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HCIC), 황산암모늄 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카상 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 겔 여과를 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피 다음에 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피가, 사이에 다른 크로마토그래피 단계 없이, 친화성 크로마토그래피 단계 바로 뒤에 이어진다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 다른 크로마토그래피 단계 및/또는 정제 단계가 친화성 및 양이온 교환 크로마토그래피 사이에 사용된다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 정제될 단백질을 함유하는 용액중 원치않는 항체 변이체, 숙주 세포 단백질(HCP)뿐만 아니라, 또한 침출된 단백질 A, 기타 침출 물질, 및/또는 바이러스의 양을 감소시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 특정 양태에 따라서, 항체를 정제하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 특히, 양이온 교환 크로마토그래피 과정 동안에 사용될 수 있는 예시적인 완충제 프로필을 나타낸 도 3을 참조로 하여, 각각의 완충제의 pH 및/또는 전도도를 진행 완충제에 대해 증가시킨다. 해당 폴리펩티드 및 오염물(들)을 포함하는 수용액을, 폴리펩티드 및 오염물이 양이온 교환 수지에 결합하도록 하는 pH 및/또는 전도도의 적재 완충제를 사용하여 양이온 교환 수지 상에 적재시킨다.
적재 완충제의 예시적인 전도도는 낮을 수 있다, 예를 들면, 약 5.2 내지 약 6.6 mS/cm일 수 있다. 적재 완충제에 대한 예시적인 pH는 5.7 mS/cm일 수 있다.
본 발명에 따른 단계 또는 구배 용출 방식에서, 양이온 교환 수지는 증가하는 전도도 및/또는 pH를 갖는 세척 완충제로 세척할 수 있다. 단계 용출 방식에서, 1차 세척 완충제는 적재 완충제와 동일한 전도도 및/또는 pH를 가질 수 있다. 하기의 실시예에서, 양이온 교환 컬럼을 세척 완충제 I(적재 완충제와 동일한 전도도 및 pH, 예를 들면, pH 5.6, κ = 5.7±0.5 mS/cm)로 세척한 후, 오염물의 대부분은 용출시키나 해당 폴리펩티드는 용출시키지 않기 위해 제 2의 전도도 및/또는 pH를 갖는 세척 완충제 II로 세척한다. 이것은 세척 완충제의 전도도 또는 pH, 또는 둘 다를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 상기 완충제는 7.0 내지 8.5 mS/cm, 바람직하게는 7.6 +/- 0.5 mS/cm의 전도도를 갖는다. 세척 완충제 I로부터 세척 완충제 II로의 변화는 단계 용출 방식에서 단계적이다.
대표적인 세척 완충제 II는 적재 완충제 및 세척 완충제 I보다 큰 전도도를 갖는다. 또는, 세척 완충제 II의 pH는 적재 완충제 및 세척 완충제 I의 pH를 초과할 수 있다.
구배 용출 방식에서, 양이온 교환 컬럼의 세척 과정 동안, 예를 들면, 적재 완충제중 정의된 비율의 용출 완충제로 세척함으로써, pH 및/또는 전도도는 연속적으로, 그러나 반드시 선형적일 필요 없이 증가된다(하기 실시예에서, 21% 용출 완충제에서 72% 용출 완충제로). 다중경사 구배가 본 발명에 바람직하다.
세척 단계 후에, 구배 또는 단계 용출 방식에서, 용출은, 목적 폴리펩티드가 더 이상 양이온 교환 수지에 결합하지 않으므로 컬럼으로부터 용출될 수 있도록 하는 pH 및/또는 전도도를 갖는 용출 완충제를 사용하여 달성된다. 용출 완충제의 pH 및/또는 전도도는 일반적으로 단계 용출 방식에서 이전 단계에 사용된 적재 완충제, 세척 완충제 I 및 세척 완충제 II의 pH 및/또는 전도도를 초과한다. 용출 완충제의 대표적인 전도도는 약 9.5 내지 약 11 mS/cm의 범위이다.
항체의 용출시 전도도 및/또는 pH의 변화는 단계 용출 방식에서는 용출에 단계적이며, 구배 용출에서는 점진적이다.
본 발명의 특정 양태에서, 단일 파라미터인, 전도도 또는 pH는 폴리펩티드 및 오염물 둘 다를 갖는 양이온 교환 컬럼으로부터 단계 또는 구배 용출을 위해 변화되는 반면, 다른 파라미터(즉, pH 또는 전도도 각각)는 대략 일정하게 유지된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 이온 교환 수지는 폴리펩티드의 용출 후에 재생 완충제로 재생되어, 컬럼이 재사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 사용되는 양이온 교환 물질은 패스트 플로우 세파로스 FF(GE 헬쓰케어 라이프사이언시즈, 독일)와 같이, 설포프로필기를 갖는 강한 양이온 교환체이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 다른 적합한 양이온 교환 물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질은, 본 발명의 방법에서 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 또는 후에 음이온 교환 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피 후에 분리된다. 전도도의 변화는 일반적으로 양이온 교환 수지에 대해 전술한 바와 같다. 그러나, pH의 변화의 방향은 음이온 교환 수지에 대해 상이하다. 또는, 음이온 교환 크로마토그래피는 관류 방식으로 수행된다.
이온 교환 크로마토그래피 단계 후 회수된 항체 조성물은, 필요한 경우, 상기 논의한 바와 같이 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 단백질은, 추가의 3가지 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 임의 순서로 사용하는 친화성 크로마토그래피 후에 분리된다.
본원에 개시된 크로마토그래피 방법은 항체 분자를 하나 이상의 오염물로부터 분리하는데 특히 유용한데, 이때 오염물 및 해당 항체 분자는, 예를 들면, 탈아미드화 또는 이성질체화로 인해 전하 이질성을 나타내는 단백질의 경우에서 그러하듯이, 그의 등전점에서만 단지 약간 상이하다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여, 폴리펩티드 및 오염물의 pI가 약 0.05 내지 약 0.2 pI 단위 만큼만 차이나는 경우, 이들을 분리할 수 있다. 하기의 실시예에서, 상기 방법을 이용하여 8.87의 pI를 갖는 her2 항체를 8.79의 pI를 갖는 그의 단일-탈아미드화 변이체로부터 분리할 수 있다(문헌 [Harris et al., R.J. et al., J. Chromatogr. B 752, 233-245 (2001)] 참조).
본 발명의 또 다른 태양에서, 예를 들면, 비변이체 폴리펩티드에 비해 상이한 시알산 분포를 갖는 폴리펩티드의 변이체를 분리하기 위해, 그의 당-변이체로부터 항체 분자를 분리하기 위한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 분리될 항체는 하나 이상의 이종 분자에 결합된다. 상기 이종 분자는, 예를 들면, 폴리펩티드(예, PEG), 세포독성 분자(예, 독소, 화학치료 약물 또는 방사성 동위원소 등)의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있거나, 또는 상기 분자는 표지(예를 들면, 효소, 형광성 표지 및/또는 방사성핵종)일 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 정제될 항체 함유 용액은 오염물 및 특정 수준의 활성 항체 변이체를 함유하는 항체를 함유하는 임의의 물질, 예를 들면, 여과 또는 크로마토그래피 방법에 의해 예비-정제된 샘플일 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 단일 크로마토그래피 단계에서 구배 용출 후 단계 용출을 사용하여 수행한다.
본 발명의 특정 양태에서, 정제될 항체는 단클론성 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 종양 항원(예를 들면, 성장 인자 수용체 및 성장 인자)에 대해 유도된다: EGFR, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, PDGF-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸(apoptosis)의 TNF 유사 유도체(TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, CEA, CD20 또는 IGF1-R, 종양 형성에 수반되는 성장 인자, 예를 들면, VEGF, EGF, PDGF, HGF 및 안지오포이에틴.
또 다른 태양에서, 단클론성 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: 알렘투주맙, 아폴리주맙, 세툭시맙, 에프라투주맙, 갈릭시맙, 겜투주맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 니모투주맙, 마파투무맙, 마투주맙 및 퍼투주맙, ING-1, 조마(Xoma)에 의해 발현된 항-Ep-CAM 항체, 바람직하게는 트라스투주맙, 세툭시맙 및 퍼투주맙, 보다 바람직하게는 트라스투주맙.
본 발명의 바람직한 양태에서, 정제될 항체는 단클론성 항-HER2 항체, 즉, her2 항체, 바람직하게는 트라스투주맙 또는 퍼투주맙, 보다 바람직하게는 트라스투주맙이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 원료 약물 her2 생성물은, 이온 교환 크로마토그램에서 각각 피크 3/3* 및 피크 4에 상응하는, 65%보다 많은 활성 항체 및 20% 미만의 불활성 항체의 함량을 갖는다(도 2 참조).
단일 크로마토그래피 단계에서 구배 용출 후 단계 용출에 대한 예는 도 3a에 나타내었다. 본 발명에 따라서, 구배 용출 또는 연속 용출에서, 전도도 및/또는 pH는 항체가 오염물로부터 분리될 수 있도록 연속적으로 증가된다. 상기 변화는 선형 변화일 수 있으며 정지 상에 의해 분리될 수 있다. 또한, 선형 변화의 경사도는 용출시 변화될 수 있다(예를 들면, 도 3a 참조). 또는, 상기 변화는 또한 비-선형, 예를 들면, 지수적일 수 있다. 원칙적으로, 단계 용출 또는 구배 용출 방식으로 수행된 양이온 교환 크로마토그래피는 유사한 완충제를 사용한다(다양한 태양에 대해 상기 참조). 본 발명의 특정 양태에서, 용출 완충제의 전도도는 약 9.5 내지 약 11 mS/cm의 범위이다.
본 발명의 특정 양태에서, 단일 크로마토그래피 단계에서, 구배 용출 단계 후에 세척 단계(예를 들면, 적재 완충제와 동일한 전도도 및/또는 pH) 및 이어서 단계 용출이 이어진다. 또 다른 양태에서, 구배 용출 후 단계 용출은 전도도가 9.5 내지 약 11 mS/cm의 범위인 용출 완충제 100%를 사용하여 수행된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 활성 변이체는 구배 용출 후 전도도 및/또는 pH를 단계적으로 상승시킴으로써 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된다.
본 발명의 특정 양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 항체의 용출에 사용된 구배는 다음의 완충제를 순차적으로 포함한다: 3.9 컬럼 부피: 21%에서 49.4% 용출 완충제, 3.6 컬럼 부피: 49.4%에서 58.5% 용출 완충제, 7.8 컬럼 부피: 58.5%에서 72% 용출 완충제, 1 컬럼 부피: 0% 완충제 B, 6.5 컬럼 부피: 100% B.
하기의 실시예에서, 활성 her2 변이체는 도 3b에 나타낸 완충제 프로필을 사용하여 전도도의 단계적 증가를 통해 용출된다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용출 방식(구배 또는 단계)을 공급 물질의 순도, 즉, 활성 변이체의 비율에 맞춤으로써, 충분히 높은 질에서 고수율이 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 용출 방식은 활성 her2 변이체의 비율과 관련하여 순도에 맞춘다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 용출 방식은 정제될 용액중 탈아미드화, 산성 또는 염기성 변이체의 비율에 맞춰지며, 본 발명의 특정 양태에서는 탈아미드화 및 산성 her2 변이체의 비율에 맞춰진다. 본 발명의 다른 특정 양태에서, 용출 방식은 측정된 특정 당-변이체의 비율과 관련하여 순도에 맞춰진다.
양이온 교환 크로마토그래피에서 단계 용출에 의해, 구배 용출 후 단계 용출에 비해 더 높은 수율이 수득될 수 있지만, 오염 변이체로부터의 분리는 구배 용출 방식 후 단계 용출에 의한 것 만큼 좋지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 더 정제될 단백질의 순도가 특정 임계치를 초과하여 단계 용출과 관련하여 고수율을 활용하는 경우에, 전자의 용출 유형이 바람직하다. 반대로, 더 정제될 항체의 순도가 특정 임계치 미만인 경우, 구배 용출에 비해 더 낮은 분해로 인해 구배 용출 후 단계 용출을 사용하지 않음으로써 더 낮은 수율이 얻어진다. 즉, 치료 효능 및 안전성을 위해 필요한 순도는, 정제될 샘플중 가장 원치않는 항체 변이체, 항체 분자의 비율이 특정 비율보다 높은 경우(또는 원치않는 항체 변이체의 상대량이 특정 비율보다 낮은 경우), 구배 용출에 의해서만 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 컬럼에 적용되는 완충제의 전도도 및/또는 pH의 점진적 증가 없이 전도도 및/또는 pH의 단계적 증가를 통해 수행된 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 생성된 항체 조성물중 항체 분자 및 그의 변이체의 양 대 양이온 교환 크로마토그래피상에 적재된 항체 분자 및 그의 변이체를 함유하는 단계 a2)의 용출물중 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 비인 수율은 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계는 항체 분자의 양 및 항체 분자 및 항체 변이체의 양의 비의 측정 단계와 양이온 교환 크로마토그래피 단계 사이에 수행된다.
크로마토그래피 단계 후 회수된 단백질은 약학적으로 허용되는 담체중에 배합될 수 있으며, 다양한 진단, 치료 또는 상기 분자에 알려진 다른 용도에 사용된다.
본 발명의 특정 양태는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 her2 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하기의 실시예, 참조 및 도면은 그 진정한 범위를 첨부한 특허청구범위에 나타낸 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고 나타낸 절차에 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
허셉틴(등록상표), her2 항체(WO 99/57134 호)는 본 발명 당시 본 연구실에서 충분한 양으로 이용가능하였으므로, 본 발명은 상기 면역글로불린으로 예시된다. 유사하게, 본 발명은 일반적으로 면역글로불린을 사용하여 실행가능하다. 상기 예시된 설명은 예로서만 나타낸 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 이들 실시예는 그 진정한 범위를 첨부한 특허청구범위에 나타낸 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.
실시예 1
발효시 항체 변이체 패턴의 변화
발효시 허셉틴 항체의 변이체 분포를 배양 시작 후 10, 11 및 12 일에, 원료 약물 제품을 제공하는 상기 항체의 대규모 발효에 대해 분석하였다. 샘플을 10, 11 및 12 일에 수거하고, 변이체 패턴 및 변이체의 비율에 대해 분석용 이온 교환 크로마토그래피로 분석하였다. 변이체의 비율은 수득된 각각의 크로마토그램에서 피크 면적으로부터 산출하였다. 15회 대규모 발효 작업으로부터 수득된 데이터를 요약한 도 1에서 볼 수 있듯이, 발효 10 일 내지 12 일에, 이온-교환 크로마토그램에서 피크 1 및 4에 해당하는 변이체의 명확한 증가가 존재한다(도 2 및 표 1과 비교). 피크 1은 허셉틴의 산성, 탈아미드화 및 덜 활성인 변이체에 해당한다. 피크 4는 아스파라긴 및/또는 Lys450 잔기의 이성질체화를 갖는 변이체로 이루어진다. 또한, 동시에, 허셉틴의 변형되지 않은 가장 활성인 형태에 상응하는, 10 내지 12 일에 수거된 샘플에서 관찰된, 주 피크 3/3*의 감소가 또한 존재한다. 따라서, 발효 10 내지 11 일 사이에, 변이체 패턴에 분명한 변화가 존재한다, 즉, 변이체의 상대량이 증가한 반면 해당 항체 분자의 상대량은 동시에 감소한다.
트라스투주맙 양이온 교환 크로마토그래피 피크 분획에 대한 지정

피크
구조적 차이(들)
경쇄 Asn30
중쇄 Asn55
중쇄 Asp102		 NeuAc 또는
탈아미드화 HC 함유a
a 두 경쇄 모두의 Asn30에서
탈아미드화(Asp로)
Asp/Asp
Asn/Asn
Asp/Asp
없음
b 한 중쇄의 Asn55에서 탈아미드화(이소Asp로)
Asn/Asn
Asn/isoAsp
Asp/Asp
없음
1* 한 경쇄의 Asn30에서 탈아미드화(Asp로), 산성형태
Asn/Asp
Asn/Asn
Asp/Asp
있음
1 한 경쇄의 Asn30에서 탈아미드화(Asp로)
Asn/Asp
Asn/Asn
Asp/Asp
없음

2		 한 경쇄의 Asn30에서 탈아미드화 (Asp로) 및 한 중쇄의 Asp102에서 이성질체화(이소Asp로)

Asn/Asp

Asn/Asn

Asp/isoAsp

없음

3*		 주 피크, 산성 형태, 또는 하나의 Lys450 잔기를 갖는
피크 1 형태
Asn/Asn
Asn/Asp
Asn/Asn
Asn/Asn
Asp/Asp
Asp/Asp
있음
없음
3 주 피크 Asn/Asn Asn/Asn Asp/Asp 없음

4		 한 중쇄의 Asp102에서 이성질체화(이소Asp로) 및/또는 하나의 Lys450 잔기를 갖는 주피크 형태
Asn/Asn
Asn/Asn
Asn/Asn
Asn/Asn
Asp/isoAsp
Asp/Asp
없음
없음
c 한 중쇄의 Asp102 위치에
숙신이미드(Asu)
Asn/Asn
Asn/Asn
Asp/Asu
없음
주: 주피크 형태로부터의 차이는 굵은 활자 형태로 나타냄.
a N-아세틸뉴라민산(NeuAc)의 존재, Asn387에서 중쇄에서의 탈아미드화 또는 중쇄 Asn392에서 탈아미드화를 말한다.
실시예 2
단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용한 her2 항체의 정제 및 활성 her2 변이체의 비율의 측정
재조합 DNA 기술:
문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기술된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약을 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
단백질 측정:
각 크로마토그래피 분획의 단백질량을 각 샘플의 분광광도 스캔에 의해 측정하였다. 결과를 이용하여 생성물 회수 수율을 계산하였다. her2에 대한 흡광 계수는 1.45이었다. 결과를 유도하기 위해 사용된 계산은 다음과 같다:
단백질량(mg/ml) = 280 nm/1.45 x 희석 배율
각 분획중 단백질 질량(mg) = 단백질량(mg/ml) x 분획 부피(ml)
수율(%) = 분획 질량(mg)/총질량(mg) x 100
숙주 세포 단백질 측정:
마이크로타이터 플레이트의 웰들의 벽을 혈청 알부민과 스트렙타비딘(Streptavidin)의 혼합물로 코팅하였다. HCP에 대한 양 유도 다클론성 항체를 마이크로타이터 플레이트의 웰들의 벽에 결합시켰다. 세척 단계 후에 마이크로타이터 플레이트의 상이한 웰들을 상이한 양의 HCP 표준화 서열 및 샘플 용액과 함께 배양하였다. 배양 후 결합되지 않은 샘플 물질을 완충제 용액으로 세척하여 제거하였다. 검출을 위해 웰을 항체 퍼옥시다제 결합체와 함께 배양하여 결합된 숙주 세포 단백질을 검출하였다. 고정 퍼옥시다제 활성은 ABTS와 함께 배양하고 405 nm에서 검출하여 검출하였다.
DNA 측정:
샘플중 DNA 함량은 공지된 절차에 따라 정량적 PCR에 의해 측정하였다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피;
상이한 두 발효로부터 생성된 하기의 her2 항체 물질을 사용하였다:
F1: her2A <her2> = 0.907 mg/ml
F2: her2B <her2> = 1.739 mg/ml
발효 2로부터 생성된 상등액, 물질 F2를 인공적으로 탈아미드화된 항체 물질을 생성하기 위해 알칼리성 조건(pH 9)에서 12 시간 동안 저장하여, 낮은 품질 및 F1의 항체에 비해 더 낮은 비율의 활성 이성질체를 갖는 항체를 수득하였다. 활성 이성질체의 양에 상응하는 3/3* 피크 면적의 비율 감소는 이온 교환 크로마토그램에서 명백하였다(또한 표 2 참조). 하기에서 상기 샘플은 F2'로 표시하였다.
F2': her2B <her2> = 1.739 mg/ml
her2 항체를 함유하는 용액, 즉, F1, F2 및 F2'를 제 1 단계로 단백질 A 친화성 컬럼에 적용하였다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:
수지: 맵셀렉트 슈어(GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈, 독일)
평형: 25 mM 트리스, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH: 7.1
세척 단계 I: 25 mM 트리스, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH: 7.1
세척 단계 II: 25 mM 트리스, 500 mM TMAC, 5 mM EDTA, pH: 5.0
세척 단계 III: 25 mM 트리스, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH: 7.1 ± 0.5
용출: 25 mM 시트레이트; pH 2.8 ± 0.4
분석용 이온 교환 크로마토그래피:
활성 및 불활성 her2 항체 변이체의 상대량의 측정은 분석용 이온 교환 HPLC에 의해 수행하였다.
크로마토그래피 조건:
수지: 디오넥스 프로팩(Dionex ProPac, 등록상표) WCX-10 분석용, 4 x 250 mm, 디오넥스 54993(약 양이온 교환 크로마토그래피)
유량: 0.8 ml/분
적재량: 50 ㎕ 또는 50 ㎍
압력: 최대 210 바
완충제 A: 10 mM Na-포스페이트, pH 7.5
완충제 B: 완충제 A중 0.1 M NaCl
온도: 실온
평형, 구배 용출 및 재생은 하기 방법에 따라 수행하였다:
Figure 112012014237318-pct00001
활성 형태의 her2 항체의 비율은 피크 3 및 3*(하기 표에서 3/3*으로 나타냄)의 상대 피크 면적을 측정하여 계산하였으며, 여기서 3*는 피크 3의 작은 숄더(shoulder)를 나타낸다. 덜 활성인 her2 변이체의 비율은 피크 1 및 4의 상대 피크 면적을 측정하여 계산하였다. 피크 1에서, 탈아미드화된 산성 her2 변이체(한 경쇄중 위치 30에서 Asn이 Asp로)를 찾을 수 있으며, 피크 4에서는 한 중쇄중 위치 102에서 이소-아스파테이트를 특징으로 하는 her2 변이체를 찾을 수 있다(도 2 및 표 1 참조).
표 2는 하기 실시예 3에 기술된 양이온 교환 크로마토그래피에 사용된 F1, F2 및 F2' 샘플로부터 수득된 단백질 A 용출물의 질을 요약한 것이다. her2 항체의 주요 형태를 나타내는, 분석용 이온 교환 크로마토그램에서 피크하 상대 면적으로 나타낸 IEC 피크 3/3*이 노출 전에 샘플에 대해 알칼리성 조건에 노출된 샘플에서 감소하고(54.3% 대 58%), 반대로 피크 1 중 her2 변이체, 즉, 산성 탈아미드화 her2 변이체의 비율은 알칼리성 조건에 노출 후에 증가됨을 볼 수 있다.
비변형된 her2 샘플(F1 및 F2) 및 알칼리 조건에 노출된 her2 샘플(F2')의 단백질 A 크로마토그래피 후 her2 변이체 패턴
샘플 F1 F2 F2'
SEC(상대 면적) 98.8 98.7 98.8
IEC 피크 1(상대 면적) 9.7 9.8 13.3
IEC 피크 3/3*(상대 면적) 58 58.3 54.3
IEC 피크 4(상대 면적) 17.1 18.9 16.6
DNA(pgDNA/mg) 4.5 2 <2.0
HCP(ppm) 4376 1452 946
*SEC: 단량체 함량, HCP: 숙주 세포 단백질
실시예 3
상이한 용출 방식을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 친화성 정제된 her2 항체의 정제
단백질 A 크로마토그래피 후에, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 목적하는 her2 항체를 추가로 분리하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 전에, 단백질 A 용출물의 pH를 1M TRIS를 사용하여 5.5로 조정하였다. 각 샘플(F1, F2 및 F2'의 단백질 A 용출물)을 구배 용출 후 단계 용출 또는 단계 용출 만을 각각 사용하여 SP 세파로스 FF(GE 헬쓰케어) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하여 6개 실험물을 수득하였다. 수득된 크로마토그램의 각각을 단량체 함량(SEC), 변이체 패턴, 특히 활성 및 탈아미드화 변이체의 비율, DNA 및 HCP 감소에 대해 분석하였다.
크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:
수지: SP 세파로스 FF(GE 헬쓰케어)
컬럼 길이: 35 cm
적재량: 조정된 단백질 A 풀
구배 용출 후 단계 용출에 사용된 완충제:
평형 완충제 및 세척 완충제: 30 mM MES, 45 mM NaCl, pH 5.6 ± 0.05; κ = 5.7 ± 0.5 mS/cm
용출 완충제: 30 mM MES, 95 mM NaCl, pH 5.6 ± 0.05; κ = 10.35 ± 0.65 mS/cm
용출에 사용된 구배는 도 3a에 나타내었다.
단계 용출에 사용된 완충제:
평형 및 세척 완충제 I: 25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.6 ± 0.1; κ = 5.7 ± 0.5 mS/cm
세척 완충제 II: 25 mM MES, 70 mM NaCl, pH 5.6 ± 0.1; κ = 7.6 ± 0.5 mS/cm
용출 완충제: 25 mM MES, 95 mM NaCl, pH 5.6 ± 0.1; κ = 10.0 ± 0.5 mS/cm
단계 용출에 사용된 완충제 프로필은 표 3b에 나타내었다.
하기의 표 3 및 4는 단계 용출 만을 사용하거나 또는 구배 용출 후 단계 용출을 사용하여 수행된, 단백질 A 친화성 및 양이온 교환 크로마토그래피 후에 F1(표 3) 및 F2'(표 4) 샘플로부터 수득된 her2 항체의 변이체 분포, 순도 및 수율을 나타낸다.
F1 샘플로부터 수득된 her2 항체의 순도 및 수율
F1 단백질 A 용출물 단계용출만 구배용출 후 단계용출
단량체 함량(SEC)
(상대면적%)
98.8
99.7
99.6
변이체(IEC)
(상대 면적%)
 피크 1 9.7 10.4 6.9
피크 3/3* 58 60.9 65
피크 4 17.1 12.7 19.8
DNA-함량(pgDNA/mgMAK) 4.5 5.06 11.43
HCP-함량(ppm) 4376 544 537
수율(%) - 82 44
항체량(mg) - 903 481
F2' 샘플로부터 수득된 her 항체의 순도 및 수율
F2' 단백질 A 용출물 단계용출만 구배용출 후 단계용출
단량체 함량(SEC)
(상대면적%)
98.8
98.8
98.9
변이체(IEC)
(상대 면적%)
 피크 1 13.3 13.6 7.8
피크 3/3* 54.3 56.3 62.3
피크 4 16.6 14 24.4
DNA-함량(pgDNA/mgMAK) <2.0 <0.5 <2.03
HCP-함량(ppm) 946 327 88
수율(%) - 72 46
항체량(mg) - 789 502
표 3 및 4에서 볼 수 있듯이, 구배 용출 후 단계 용출은 단계 용출만을 사용한 경우와 비교하여 가장 활성 항체(3/3* 피크)의 더 높은 비율(4 내지 6%)을 제공한다. 구배 및 단계 용출은 오염 숙주 세포 단백질(HCP)의 양을 감소시키는데 동등하게 적합하다. 그러나, 수율은 구배 용출에 비해 단계 용출의 경우 현저히 더 높다(약 지수 2). 부분적으로, 이것은 구배 용출 방식에서 세척 구배시 항체의 손실에 기인한다. 따라서, 수율 또는 순도, 어떤 파라미터가 개선을 요하는지에 따라서, 구배 또는 단계 용출이 항체의 정제에 최적일 수 있다.
또한, 단백질 A 용출물이 이미 비교적 높은 함량의 가장 활성인 항체 변이체를 함유하는 경우, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 바람직한 종류의 용출은 단계 용출인데, 그 이유는 구배 용출 후 단계 용출에 비해 훨씬 더 높은 수율로 충분히 순수한 항체가 수득될 수 있기 때문이다. 현저히 더 높은 수율은 보다 높은 항체 생성률을 바로 제공하는 보다 높은 생성된 절대 항체량에 상응한다.
그러나, 활성이 가장 높은 항체(3/3*)가 단백질 A 용출물중 특정 비율보다 단지 적은 경우에, 구배 용출 후 단계 용출이 바람직한데, 그 이유는 상기 종류의 용출을 사용하여서만 충분히 활성인 her2 항체가 수득될 수 있기 때문이다. 상기 방법에 의해 수득된 보다 낮은 수율은 허용되어야 한다. 오염 DNA 및 HCP의 감소는 두 용출 방식 모두에서 유사하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 샘플의 분취액의 분석용 이온 교환 크로마토그래피를 상기 샘플의 후속 폴리펩티드 정제 방법의 결정에 이용한다. 폴리펩티드는 바람직하게는 항체, 보다 바람직하게는 단클론성 항체, 가장 바람직하게는 her2 항체이다. 샘플은 바람직하게는 세포 및/또는 세포 파편을 함유하지 않는 세포 배양물로부터 수득된 샘플이거나, 또는 폴리펩티드의 정제를 위한 크로마토그래피시에 수득된 샘플이다. 바람직하게, 분석용 이온 교환 크로마토그래피는 항체 변이체를 분리하는 것을 목적으로 한다. 바람직하게, 분석용 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 바람직하게, 분석용 이온 교환 크로마토그래피의 사용은 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 사용되는 프로토콜을 결정한다. 가장 바람직하게는, 후속 정제 방법에서, 항체는, 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 임계비 미만인 경우 i) 양이온 교환 컬럼에 적용된 용출 완충제의 전도도 및/또는 pH의 점진적 증가 및 ii) 두번째로, 양이온 교환 컬럼에 적용된 용출 완충제의 전도도 및/또는 pH의 단계적 증가를 통해, 또는 항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 임계비를 초과하는 경우 양이온 교환 컬럼에 적용된 용출 완충제의 전도도 및/또는 pH의 점진적 증가 없이 전도도 및/또는 pH의 단계적 증가를 통해 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된다.
항체 분자의 양 대 항체 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비는 바람직하게는 분석용 이온 교환 크로마토그램에서 피크 면적으로부터 결정된다.
임계비는 수득될 순도를 기준으로 결정되며, 특히 항체 자체 및 사용되는 정제 프로토콜에 따라 달라진다.

Claims (17)

  1. a) 트라스투주맙(Trastuzumab) 분자 및 그의 덜 활성인 변이체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 샘플의 분취액에 대해 수행된 분석 방법으로 상기 샘플 중 트라스투주맙 분자의 양 대 트라스투주맙 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비를 측정하는 단계; 및
    c) a2) 단계 a)의 샘플을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용함으로써 친화성 크로마토그래피를 수행하고,
    a3) 단계 b)에서 측정된 트라스투주맙 분자의 양 대 트라스투주맙 분자 및 그의 변이체의 양의 합의 비가 67.5%의 임계비 초과인 경우,
    i) 트라스투주맙을 함유하는 단계 a2)의 용출물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼상에 적재시키는 단계, 및
    ii) 용출 완충제의 전도도, pH 또는 이들 모두의 점진적 증가 없이 전도도를 단계적으로 증가시키며 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 트라스투주맙 분자를 용출시킴으로써, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계
    를 통해 트라스투주맙 분자 및 그의 덜 활성인 변이체를 포함하는 정제된 트라스투주맙 조성물을 제조하는 단계
    를 포함하고,
    상기 단계 ii)는 전도도가 증가하는 세척 완충제로 컬럼을 세척하는 것을 포함하는, 트라스투주맙 및 그의 덜 활성인 트라스투주맙 변이체를 포함하는 트라스투주맙 조성물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계 a)의 샘플이 단계 a2) 전에 여과, 원심분리, 또는 여과 및 원심분리되고, 생성된 샘플이 단계 a2)로 적용되는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    단계 a3)의 양이온 교환 크로마토그래피가, 단계 a2)의 용출물의 pH, 전도도 또는 이들 모두를 조정한 후에 수행되는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    트라스투주맙 분자의 pI가 변이체의 pI와 0.1 내지 0.5 pI 단위만큼 상이한, 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 분석 방법이 이온-교환 크로마토그래피, ELISA(효소-결합 면역흡착 분석) 또는 MALDI-TOF(매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화 비행 시간) 분석인, 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)의 샘플이 세포 및 세포 파편(debris)을 함유하지 않는 트라스투주맙 및 그의 변이체를 포함하는 세포 배양 배지인, 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플을 제공하는 단계 a)가
    i) 트라스투주맙 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는 세포를 제공하는 단계,
    ii) 상기 세포를 배지중에서 4 내지 28 일 동안 배양하는 단계, 및
    iii) 배지로부터 샘플을 수득함으로써, 배지, 세포, 항체 분자 및 그의 변이체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    친화성 크로마토그래피가 단백질 A, 단백질 G 또는 금속 친화성 크로마토그래피인, 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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