JP2019518067A - 免疫細胞機能を促進するための方法および組成物 - Google Patents

免疫細胞機能を促進するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、少なくとも部分的には、例えば、有核細胞を凍結および／または融解する１回またはそれより多くのサイクル後に、細胞機能、例えば免疫細胞機能を保存するための方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、免疫細胞と、ＩＬ−１５複合体を含むタンパク質ナノ粒子とを接触させる工程を含む。本開示は、少なくとも部分的には、少なくとも１つの保存された機能を有する（例えば、保存された生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを有する）有核細胞、例えば、免疫細胞を（例えば、エクスビボで）生産するための最適化された方法および組成物を特徴とする。

Description

関連出願
本出願は、２０１６年６月１３日に出願された米国出願第６２／３４９，４７３号に対する優先権を主張し、その内容全体が本明細書に援用される。
発明の背景
免疫細胞療法、例えば養子細胞療法（ＡＣＴ）は、被験体から免疫細胞を収集する工程、細胞を拡大する（ｅｘｐａｎｄ）工程、および細胞を同じ被験体または異なる被験体に再導入する工程を含む。例えば、ドナー由来のエクスビボで拡大したヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のＡＣＴは、がんを処置するための有望なアプローチとして登場した。ＡＣＴの例としては、培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、単離および拡大されたＴ細胞クローン、ならびに従来のＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を発現する遺伝子操作リンパ球（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。遺伝子操作リンパ球は、特定の抗原を発現するがん細胞を排除するように設計されており、拡大されて患者に送達される。ＡＣＴは、患者における腫瘍細胞の減少をもたらす腫瘍特異的リンパ球（例えば、Ｔ細胞）を提供し得る。
免疫細胞ベースの治療の重要な制限は、特に凍結融解処理後、エクスビボにおける免疫細胞の生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）および機能の急速な低下である。免疫細胞の単離、保存、凍結、融解および／または拡大のための既存のプロトコールの制限は依然として残っている。したがって、例えば同じまたは異なる被験体への再導入前に、被験体由来の免疫細胞の機能を保存する、例えば最適化する必要性が存在する。
本開示は、少なくとも部分的には、少なくとも１つの保存された機能を有する（例えば、保存された生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを有する）有核細胞、例えば、免疫細胞を（例えば、エクスビボで）生産するための最適化された方法および組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、例えば、有核細胞の凍結および／または融解の１回またはそれより多くのサイクル後に、細胞機能、例えば免疫細胞機能を保存するための方法が本明細書に開示される。実施形態では、有核細胞、例えば免疫細胞と、保存剤を含む粒子、例えばナノ粒子、例えばタンパク質（例えば、本明細書に記載されるタンパク質ナノゲル）を含むナノ粒子とを接触させることによって、有核細胞の凍結組成物を調製および／または融解する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、接触工程は、エクスビボで行われる。特定の実施形態では、免疫細胞は、被験体から得られた免疫細胞の集団である。実施形態では、ナノ粒子中の前記タンパク質は、１つまたはそれより多くの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの）治療用タンパク質、例えばサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦａ）、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）（そのバリアント形態、例えば変異体を含む）；ポリペプチドと共にサイトカイン分子を含む複合体、例えばサイトカイン受容体複合体；その融合形態またはアゴニスト形態）；成長因子；および他の分子、例えば共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドから選択され得、例えば、共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される。
実施形態では、保存剤、例えば治療用タンパク質は、例えば、分解性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）によって、ナノ粒子に共有結合的にカップリングされる、例えば架橋される。いくつかの実施形態では、保存剤は、依然として生物学的に活性であり、例えば、少なくとも１回の凍結融解サイクルおよびナノ粒子からの放出後に、保存剤としてのその機能を維持する。ナノ粒子処置有核細胞は、未処置有核細胞と比較して、凍結融解サイクル後に、有意に増加した機能、例えば生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを示し得る。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、細胞療法、例えば免疫療法のための優位な利益を提供し得る。
したがって、一態様では、本発明は、有核細胞と、少なくとも１つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物（本明細書では「有核細胞−ナノ粒子複合体」とも称される）を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも１つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤とを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物の少なくとも一部は、凍結されている。
他の態様では、本開示は、有核細胞の凍結組成物を作製する方法を提供する。前記方法は、ａ）本明細書に記載される有核細胞の非凍結組成物、例えば、有核細胞と、少なくとも１つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の組成物を提供する工程、およびｂ）前記組成物が凍結するのに十分に前記組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の前記組成物を凍結する工程を含む。
いくつかの態様では、本開示は、有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、
ａ）有核細胞と、少なくとも１つの保存剤、例えば本明細書に記載の保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の凍結組成物を提供する工程；およびｂ）有核細胞の凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程を含む方法を提供とする。
他の態様では、本開示は、ａ）保存剤、例えば本明細書に記載されるＩＬ−１５複合体と、ｂ）１０〜１５０、２０〜１００、２０〜８０、２０〜６０、２０〜４０または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンとを含み、ｃ）場合により、ＰＥＧ分子、例えば約１〜１０、２〜８、４〜６または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ分子をさらに含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリリジンおよびＰＥＧは、ブロックコポリマーを形成する。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、保存剤にカップリングされる、例えば（例えば、静電気力によって）共有結合的または非共有結合的にカップリングされる。いくつかの実施形態では、保存剤は、タンパク質ナノゲルを形成する。
いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、
（ａ）組成物の少なくとも一部は凍結されており、
（ｂ）保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
（ｃ）
（ｉ）サイトカイン分子は、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧＣＳＦから選択されるか；または
（ｉｉ）共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、
（ａ）組成物の少なくとも一部は凍結されており；
（ｂ）保存剤は、
配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、抗体分子またはＦｃドメインを含む第２の異種ドメイン
を含むポリペプチドと複合体化されたＩＬ−１５分子複合体を含む、組成物を提供する。
実施形態では、組成物が融解されると、保存剤は、ナノ粒子の非存在下における有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを改善する。
ある実施形態では、Ｆｃドメインは、野生型であるか、または変異されている。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８のもの）を含むＩＬ−１５受容体もしくはその断片およびエフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメイン、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の異種ドメインを含むポリペプチドを含むナノ粒子を提供する。
以下の態様および実施形態は、上記方法および組成物を含む本明細書の任意の態様および実施形態と組み合わされ得る。
実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。実施形態では、保存剤は、免疫刺激性サイトカイン、例えば、一般的なγ鎖または４つのα−ヘリックスバンドルファミリーに属するサイトカインである。
実施形態では、組成物、例えばナノ粒子および／または保存剤は、ポリペプチド、例えばＩＬ−１５受容体またはそのＩＬ−１５結合断片と例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含むＩＬ−１５複合体を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−１５受容体アルファまたはＩＬ−１５結合断片、例えば、そのＩＬ−１５結合ドメインを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列（全長野生型ＩＬ−１５受容体アルファ）、またはそのＩＬ−１５結合断片；あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（野生型ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列（ＩＬ−１５受容体アルファアイソフォームＣＲＡ＿ｄのＥＣＤ）、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号２、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号４、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および／または保存剤、ＩＬ−１５複合体を含み、前記ＩＬ−１５複合体は、ＩＬ−１５受容体もしくはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５分子は、ＩＬ−１５変異体、例えば、１つもしくはそれより多くのアミノ酸置換を有するヒトＩＬ−１５ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５分子は、７２位における置換、例えば、ＮからＤへの置換を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８のもの）およびエフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の異種ドメインを含む。
実施形態では、組成物は、緩衝液をさらに含む。実施形態では、組成物は、水性媒体をさらに含む。
実施形態では、凍結組成物が融解されると、保存剤、例えばＩＬ−１５複合体は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。実施形態では、生存能力の促進は、例えばアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウムで染色することによって、例えば実施例３２のアッセイによって測定した場合に、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、生存能力を少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍または５倍増加させることを含む。実施形態では、増殖の促進は、例えば第１および第２の時点で生細胞をカウントすることによって、例えば実施例３３のアッセイによって測定した場合に、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、増殖を少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍または５倍増加させることを含む。実施形態では、細胞傷害活性の促進は、例えばがん細胞株、例えばＤａｕｄｉ細胞に対する細胞傷害活性のアッセイ、例えば実施例２８のアッセイにおいて、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、細胞傷害活性を少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍または５倍増加させることを含む。実施形態では、活性化の促進は、例えばＣＤ４５ＲＡに対する抗体を使用したフローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例２６のアッセイにおいて、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、活性化を少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍または５倍増加させることを含む。
実施形態では、保存剤、例えばＩＬ−１５複合体は、ナノ粒子から放出される。実施形態では、融解されると、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化は、参照、例えば有核細胞を含むナノ粒子を欠く以外は同様の組成物と比較して促進される、例えば保存または増強される。実施形態では、凍結組成物が融解されると、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定される。いくつかの実施形態では、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性、活性化またはインターフェロンガンマ産生の１つ、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多くが促進される。
実施形態では、組成物は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含む。実施形態では、組成物は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。実施形態では、組成物は、第２の保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含む。実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合して、有核細胞−ナノ粒子複合体を形成する。
実施形態では、有核細胞は、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞から選択される免疫細胞）または造血幹細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、リンパ球を含む。実施形態では、有核細胞は、Ｔ細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、Ｂ細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、有核細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えばがん抗原に結合するＣＡＲを含む、例えば発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。他の実施形態では、有核細胞は、外因性高親和性Ｆｃ受容体を発現する。
実施形態では、有核細胞は、患者から取得された免疫細胞、例えばＮＫ細胞、例えば患者の血液である。他の実施形態では、有核細胞は、健常ドナーから取得された免疫細胞、例えばＮＫ細胞である。例えば、それは、同種Ｔ細胞が枯渇したＮＫ細胞集団である。実施形態では、有核細胞は、胚性幹細胞および／またはｉＰＳＣ細胞由来の免疫細胞、例えばＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、細胞株、例えば安定細胞株または不死化細胞株（例えば、ＮＫ細胞不死化細胞株）である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、患者、例えば血液がん、例えば白血病またはリンパ腫を有する患者から取得される。実施形態では、有核細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＫｌｉｎｇｅｍａｎｎ，Ｈら、（２０１６）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７（Ａｒｔ．９１）：１−７（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えばＮＫ−９２（例えば、ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）、ＮＫ−ＹＳ、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫＧ、ＳＮＫ−６、ＩＭＣ−１から選択されるＮＫ細胞株である。一実施形態では、有核細胞は、ＮＫ９２細胞株、例えば高親和性Ｆｃ受容体を発現するバリアントＮＫ９２細胞、例えばＦｃガンマＲＩＩＩａ発現細胞（例えば、１５８Ｖ）である。他の実施形態では、ＮＫ９２細胞株は、例えばＫｌｉｎｇｅｍａｎｎら（前掲）にも記載されているように、がん抗原に結合するＣＡＲを含む。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の例えば表面に共有結合的にコンジュゲートしている。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に共有結合的にコンジュゲートしていない。
実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、互いに共有結合的に連結された複数の保存剤によって形成されたタンパク質ナノゲルである。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、ポリリジン、例えば、ｐｏｌｙＫ３０またはｐｏｌｙＫ２００を含む。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジンである。ある実施形態では、ポリリジンは、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、または４００〜５００アミノ酸の平均長を有する。ある実施形態では、ポリリジンは、１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有する。ある実施形態では、ポリリジンは、１００〜３００、１５０〜２５０、または約２００アミノ酸の平均長を有する。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、１０〜１５０、２０〜１００、２０〜８０、２０〜６０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有する。
ある実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ある実施形態では、ＰＥＧは、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｋＤの分子量を有する。実施形態では、ＰＥＧは、約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ（例えば、本明細書に記載されるＰＥＧ、例えば約１〜１０、２〜８、４〜６または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ）と、ポリリジン（例えば、本明細書に記載されるポリリジン、例えば１０〜５０、２０〜４０もしくは約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジン；または１００〜３００、１５０〜２５０もしくは約２００アミノ酸の平均長を有するポリリジン）とを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む。実施形態では、カチオン性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０またはＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ２００を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号７または配列番号８のｓｕｓｈｉドメインあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１１のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｕｓｈｉ−Ｆｃポリペプチド；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
実施形態では、組成物は、（例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして）溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、および／またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む。実施形態では、化合物は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。実施形態では、組成物は、（例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして）サイトカイン分子、成長因子分子、共刺激分子を含む。実施形態では、組成物は、（例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして）サイトカイン分子、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ、そのバリアント、またはサイトカイン複合体、例えばＩＬ−１５複合体（例えば、本明細書に記載されるＩＬ−１５スーパーアゴニスト）を含む。実施形態では、組成物は、（例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして）分子、例えば共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＮＫ細胞上に存在するタンパク質、例えば受容体に結合するエンティティを含む。例えば、ナノ粒子は、ＮＫ細胞上の刺激性受容体または阻害性受容体に結合するエンティティを含み得る。
実施形態では、エンティティは、ＮＫ細胞上の刺激性受容体のアゴニストであり、例えば、エンティティは、アゴニストリガンドまたはアゴニスト抗体分子であり得る。実施形態では、刺激性受容体は、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０ａ，ｂ、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＤＡＰ１２、ＦｃεＲＩ−γ、ＣＤ３−ζ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０またはＣＤ２２５（２Ｂ４）である。実施形態では、刺激性受容体は、ＩＴＡＭモチーフ、例えば（Ｄ／Ｅ）ＸＸＹＸＸ（Ｌ／Ｉ）Ｘ６−８ＹＸＸ（Ｌ／Ｉ）を含む。実施形態では、刺激性受容体は、天然細胞傷害性受容体またはＭＨＣ結合活性化受容体ある。
実施形態では、エンティティは、ＮＫ細胞上の阻害性受容体の阻害剤であり、例えば、エンティティは、阻害剤リガンドまたは阻害剤抗体分子であり得る。実施形態では、阻害性受容体は、ＫＩＲ、ＬＩＬＲ、Ｌｙ４９またはＮＫＧ２Ａである。実施形態では、阻害性受容体は、ＩＴＩＭモチーフ、例えば（Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｓ）ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ）を含む。実施形態では、阻害性受容体は、ＭＨＣクラスＩ阻害性受容体または非ＭＨＣ結合阻害性受容体である。
実施形態では、ＮＫ細胞受容体は、Ｌａｎｉｅｒ“Ｕｐ ｏｎ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔｒｏｐｅ：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ”Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｍａｙ；９（５）：４９５−５０２、Ｓｅｎｔｍａｎら、“ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６ ２４９−２９２またはＰａｒｄｏｌｌ“Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２ Ｍａｒ ２２；１２（４）：２５２−６４に記載されている受容体である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、高密度タンパク質構造（８０重量％超のタンパク質）であり、タンパク質は、分解されると機能的形態、例えばネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている。
実施形態では、ナノ粒子は、レドックス（例えば、リンカーはジスルフィド結合を含む）またはｐＨ（例えば、リンカーは加水分解性基を含む）または酵素（例えば、リンカーはプロテアーゼ切断部位を含む）に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。
実施形態では、本明細書の組成物は、粒子、例えばナノ粒子またはマイクロ粒子またはナノ粒子およびマイクロ粒子の両方を含む。実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、３０ｎｍ〜１２００ｎｍ、４０ｎｍ〜１，１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１，０００ナノメートル、例えば５０〜５００ｎｍ、より典型的には７０〜４００ｎｍの（例えば、動的光散乱によって測定された）平均流体力学直径を有する。実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、１５０ｎｍ〜３５０ｎｍまたは２００ｎｍ〜３００ｎｍの（例えば、動的光散乱によって測定された）平均強度に基づくサイズを有する。実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、６０ｎｍ〜１００ｎｍまたは７０ｎｍ〜９０ｎｍの（例えば、動的光散乱によって測定された）平均数に基づくサイズを有する。
実施形態では、組成物は、凍結されている。実施形態では、組成物は、凍結部分および液体部分を含む。
実施形態では、組成物の温度は、０℃未満に低下される。
実施形態では、組成物の温度は、−１０℃未満に低下される。実施形態では、組成物の温度は、−１０℃未満、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−１００℃、−１２０℃、−１４０℃、−１６０℃、−１８０℃または−２００℃に低下される。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を少なくとも２、４、６、１２もしくは２４時間、または１、２、３、４、５もしくは６日間、または１、２、３もしくは４週間、または１、２、３もしくは６カ月間、または１、２、３、４もしくは５年間凍結したままに維持する工程を含む。
実施形態では、提供する工程は、有核細胞と、保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子と有核細胞とを組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティから有核細胞の非凍結組成物を受け取ることを含む。
実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を別のエンティティ、例えばヘルスケアプロバイダ、例えば病院、診療所または医院に提供または放出する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を加温する前に、有核細胞の凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持する工程を含む。実施形態では、組成物の凍結調製物が融解されると、保存剤は、ナノ粒子から放出され、ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。実施形態では、前記方法は、有核細胞の融解組成物を被験体に投与する工程を含む。
実施形態では、提供する工程は、別のエンティティ、例えば有核細胞の組成物を作製および／または凍結するエンティティから凍結組成物を受け取ることを含む。実施形態では、提供する工程は、有核細胞を、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子と有核細胞とを組み合わせることを含む。
実施形態では、前記方法は、例えば融解後に細胞を拡大する工程を含む。実施形態では、細胞は、（例えば、２日間で）少なくとも２倍拡大される。実施形態では、細胞は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０または１００倍拡大される。
実施形態では、前記方法は、例えば融解後に細胞を活性化する工程をさらに含む。実施形態では、（例えば、ＣＤ４５ＲＡに対する抗体を使用したフローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例２６のアッセイにおいてＣＤ４５ＲＡ＋の比率として測定される）活性化細胞、例えば活性化ＣＤ８＋細胞のパーセントは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。
実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞（例えば、融解細胞）は、例えば実施例２７に記載されているアッセイを使用して決定される細胞傷害活性を有する。実施形態では、細胞傷害活性は、実施例２７のアッセイにおいて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の死滅率を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、がん細胞株、例えばＤａｕｄｉ細胞に対する細胞傷害活性のアッセイ、例えば実施例２８のアッセイにおいて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の死滅率を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、実施例２９のアッセイにおいて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の死滅率を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、実施例３０のアッセイにおいて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の死滅率を含む。
実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞（例えば、融解細胞）は、例えば細胞を被験体に注射し、その後の時点で血液を採取し、フローサイトメトリーによって拡大したドナー細胞をカウントするアッセイ、例えば実施例３５のアッセイにおいて、インビボ拡大活性を有する。実施形態では、本明細書の組成物で処置された融解細胞はインビボで拡大して、組成物で処置されない以外は同様の細胞と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％超の細胞を生じさせる。
実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞（例えば、融解細胞）は、例えば腫瘍を切除し、フローサイトメトリーによって拡大したドナー細胞をカウントした場合に、例えば実施例３６のアッセイにおいて、腫瘍浸潤活性を有する。実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞は、腫瘍１ｍｇ当たり少なくとも２００、４００、６００または８００個の細胞をもたらす。実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞は、組成物で処置されない以外は同様の細胞と比較して例えば少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍または５倍大きい腫瘍浸潤レベルをもたらす。
実施形態では、被験体は、有核細胞を提供したドナー被験体である。実施形態では、ドナー被験体は、がん、糖尿病、自己免疫疾患もしくは心血管疾患を有するか、または移植を必要とする。実施形態では、被験体は、ドナー被験体以外の被験体である。実施形態では、ドナー被験体以外の被験体は、健常被験体である。
いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、組成物の凍結調製物が融解されると、保存剤が、場合によりナノ粒子から放出され、ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進し、例えば保存または増強し、保存剤が、例えばＩＬ−１５受容体またはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む、組成物を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−１５受容体アルファもしくはそのＩＬ−１５結合断片を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインを含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列（全長野生型ＩＬ−１５受容体アルファ）、またはそのＩＬ−１５結合断片；あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（野生型ＩＬ−１５受容体アルファのＥＣＤ）、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列（ＩＬ−１５受容体アルファアイソフォームＣＲＡ＿ｄのＥＣＤ）、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および／または保存剤、は、ＩＬ−１５複合体を含み、前記ＩＬ−１５複合体は、ＩＬ−１５受容体もしくはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号６のヒトＩＬ−１５ Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号５のＩＬ１５ＲａＳｕ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８のもの）およびエフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の異種ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号７または配列番号８のｓｕｓｈｉドメインあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１１のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｕｓｈｉ−Ｆｃポリペプチド；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。
実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定される。
実施形態では、媒体は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含有する。実施形態では、媒体は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。
実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合している。
実施形態では、有核細胞は、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）または造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、免疫細胞または本明細書に記載の細胞株である。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートする。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしない。実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。
実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。実施形態では、組成物は、溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、かつ／またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。
ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、成長因子分子、共刺激分子を含む。ある実施形態では、組成物は、サイトカイン分子を含む第１および／または第２の保存剤を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、それらのバリアント、またはサイトカイン複合体、あるいは前記の任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５複合体、例えば、本明細書に記載のＩＬ−１５スーパーアゴニストを含む。ある実施形態では、組成物は、共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、またはＣＤ１３７のアゴニストから選択される。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む。
実施形態では、ナノ粒子は、レドックス（例えば、ジスルフィド）またはｐＨ（例えば、加水分解性基）または酵素（例えば、プロテアーゼ）に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。
実施形態では、組成物は、凍結されている。実施形態では、組成物は、凍結部分および液体部分を含む。
別の態様では、本発明は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば増強するための方法を特徴とする。実施形態では、有核細胞は、患者から単離されているかまたは単離される。前記方法は、有核細胞と、緩衝化水溶液と、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を保存または増強する少なくとも１つの薬剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることによって、有核細胞を改変する工程を含む。
別の態様では、本発明は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば増強するための方法を特徴とする。実施形態では、有核細胞は、患者から単離されているかまたは単離され、緩衝化水溶液と、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を保存または増強する少なくとも１つの薬剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子と組み合わせることによって改変される。前記方法は、有核細胞を少なくとも１回の凍結融解サイクルに供する工程を含む。
ある特定の態様では、本発明は、有核細胞の凍結組成物を作製する方法であって、
ａ）有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも１つの保存剤、例えば有核細胞の凍結調製物が融解されると、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する薬剤を含むナノ粒子とを含む非凍結組成物を提供する工程（例えば、非凍結有核細胞ーナノ粒子複合体を提供する工程）、
ｂ）場合により、組成物が凍結するのに十分に組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の組成物を凍結する工程
を含む、方法を特徴とする。
実施形態では、組成物の温度は、０℃未満に低下される。実施形態では、組成物の温度は、−１０℃未満に低下される。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持する工程を含む。
実施形態では、提供する工程は、有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせて、有核細胞−ナノ粒子複合体を形成することを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子を有核細胞および緩衝化水性媒体溶液と組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティから有核細胞の非凍結組成物を受け取ることを含む。
実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を別のエンティティ、例えばヘルスケアプロバイダ、例えば病院、診療所または医院に提供または放出する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供する工程を含む。
実施形態では、組成物の凍結調製物が融解されると、保存剤は、ナノ粒子から放出され、ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。
実施形態では、前記方法は、有核細胞の融解組成物を被験体に投与する工程を含む。実施形態では、被験体は、ドナー被験体である。実施形態では、ドナー被験体は、がん、糖尿病、自己免疫障害を有するか、または移植を必要とする。実施形態では、被験体は、ドナー被験体以外の被験体である。実施形態では、ドナー被験体以外の被験体は、健常被験体である。
前記組成物および方法のいくつかの実施形態では、保存剤は、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト、例えば、野生型ＩＬ−１５よりも高い活性を有するＩＬ−１５分子を含む。ある実施形態では、保存剤は、ＩＬ−１５分子およびポリペプチド、例えば、ＩＬ−１５ポリペプチド受容体アルファ断片（例えば、ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメイン）を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号２のアミノ酸配列（野生型ＩＬ−１５受容体アルファ）、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号３のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
一実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号４のアミノ酸配列（ＩＬ−１５受容体アルファアイソフォームＣＲＡ＿ｄのＥＣＤ）、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および／または保存剤、は、ＩＬ−１５複合体を含み、前記ＩＬ−１５複合体は、ＩＬ−１５受容体もしくはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号６のヒトＩＬ−１５ Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号５のＩＬ１５ＲａＳｕ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８のもの）およびエフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の異種ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号７または配列番号８のｓｕｓｈｉドメインあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１１のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｕｓｈｉ−Ｆｃポリペプチド；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。
実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定され得る。
実施形態では、媒体は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含有する。実施形態では、媒体は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。
実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞、例えば有核細胞の表面と例えば共有結合的または非共有結合的に会合し、そうすることで有核細胞−ナノ粒子複合体を形成する。
実施形態では、有核細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）または造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えばがん抗原に結合するＣＡＲを含む、例えば発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。他の実施形態では、有核細胞は、外因性高親和性Ｆｃ受容体を発現する。実施形態では、有核細胞は、患者または健常ドナーから取得されたＮＫ細胞である。他の実施形態では、有核細胞は、ＮＫ細胞株、例えば本明細書に記載される安定細胞株または不死化細胞株である。一実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞株である。
実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートする。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしない。
実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを場合により含む。実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
実施形態では、組成物は、溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、かつ／またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。
ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、成長因子分子、または共刺激分子を含む。ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、それらのバリアント、またはサイトカイン複合体、例えば、ＩＬ−１５複合体（例えば、本明細書に記載のＩＬ−１５スーパーアゴニスト）を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、（例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、例えば、免疫グロブリンＦｃ、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体をさらに含む、例えば、これらにカップリング（例えば、融合）されている。
ある実施形態では、組成物は、共刺激分子、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、またはＣＤ１３７のアゴニストのアゴニスト（例えば、抗体分子またはアゴニストリガンド）を含む。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面にコンジュゲートされた抗ＣＤ４５親和性または結合リガンドを含む。実施形態では、ナノ粒子は、レドックスに対して感受性（例えば、ジスルフィド）またはｐＨに対して感受性（例えば、加水分解性基）または酵素に対して感受性（例えば、プロテアーゼ）である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。
いくつかの態様では、本発明は、有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、
ａ）有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、例えば、有核細胞の凍結調製物が融解されると、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の凍結組成物を提供する工程（例えば、本明細書に開示される有核細胞−ナノ粒子複合体を提供する工程）；および
ｂ）有核細胞の凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程
を含む方法を特徴とする。
いくつかの実施形態では、提供する工程は、別のエンティティ、例えば有核細胞の組成物を作製および／または凍結するエンティティから凍結組成物を受け取ることを含む。いくつかの実施形態では、提供する工程は、有核細胞を、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせ、そうすることで有核細胞ーナノ粒子複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子を、有核細胞および緩衝化水性媒体溶液と組み合わせることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、有核細胞の凍結組成物を加温する前に、有核細胞の凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持する工程を含む。
実施形態では、被験体は、有核細胞を提供したドナー被験体である。実施形態では、ドナー被験体、例えば患者は、がん、糖尿病、自己免疫疾患もしくは心血管疾患を有するか、または移植を必要とする。実施形態では、被験体は、ドナー被験体以外の被験体である。実施形態では、ドナー被験体以外の被験体は、健常被験体である。
いくつかの実施形態では、保存剤は、以下：
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列；
から選択されるＩＬ−１５ポリペプチド受容体アルファ断片、および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体、を含む。一実施形態では、第２の異種ドメインは、ＦｃドメインもしくはＦａｂである。
いくつかの実施形態では、保存剤は、ＩＬ−１５分子およびＩＬ−１５ポリペプチド受容体アルファ断片の複合体を含む。
ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および／または保存剤、は、ＩＬ−１５複合体を含み、前記ＩＬ−１５複合体は、ＩＬ−１５受容体もしくはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号６のヒトＩＬ−１５ Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号５のＩＬ１５ＲａＳｕ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８のもの）およびエフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の異種ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号７または配列番号８のｓｕｓｈｉドメインあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１１のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｕｓｈｉ−Ｆｃポリペプチド；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ナノ粒子）は、
配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号１５のｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む。
実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。
実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定され得る。
実施形態では、媒体は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含有する。実施形態では、媒体は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。
実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合している。
実施形態では、有核細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）または造血幹細胞である。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートする。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしない。
実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。
実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
実施形態では、組成物は、溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、かつ／またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物、例えば、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む。
ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、ポリペプチド、例えば、その受容体またはその受容体の断片もしくは部分、成長因子分子、または共刺激分子に複合体化されたサイトカインを含む。ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、それらのバリアント、またはサイトカイン複合体、例えば、本明細書に記載のＩＬ−１５複合体（例えば、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト）を含む。ある実施形態では、保存剤は、ＩＬ−１５受容体α鎖の断片、例えば、本明細書に記載の断片に会合されたサイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、（例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、例えば、免疫グロブリンＦｃ、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体をさらに含む、例えば、これらにカップリング（例えば、融合）されている。ある実施形態では、組成物は、アゴニスト、例えば、共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、またはＣＤ１３７のアゴニストから選択される。
実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、レドックスに対して感受性（例えば、ジスルフィド）またはｐＨに対して感受性（例えば、加水分解性基）または酵素に対して感受性（例えば、プロテアーゼ）である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。
いくつかの態様では、本発明は、有核細胞およびナノ粒子（例えば、有核細胞−ナノ粒子複合体）を凍結するための方法であって、前記有核細胞を−１０℃未満で凍結して少なくとも１時間後に融解し、前記ナノ粒子が、融解後に前記ナノ粒子から場合により放出される少なくとも１つの薬剤であって、ナノ粒子なしで凍結された有核細胞の組成物と比較して前記細胞の機能を維持する、例えば前記細胞の生存能力を保存する薬剤を含む方法を特徴とする。
いくつかの実施形態では、薬剤は、有核細胞の生存能力を持続するための刺激分子である。実施形態では、有核担体細胞は、リンパ球である。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしている。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物、例えば有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物（例えば、有核細胞−ナノ粒子複合体）と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
実施形態では、本明細書の被験体は、細胞ベースの治療、例えば免疫細胞療法を必要とする。例えば、被験体は、養子細胞療法を必要とする。いくつかの実施形態では、被験体は、患者、例えばヒト患者である。いくつかの実施形態では、被験体は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、アレルギーもしくはアレルギー症状、喘息または心血管疾患から選択される疾患を有する。実施形態では、被験体は、移植を必要とする。
実施形態では、本明細書の方法は、複合体中の有核細胞の機能を評価する工程、例えば、例えば融解後に有核細胞の増殖、サイトカイン放出または細胞傷害効果の１つまたはそれよりも多くを評価する工程をさらに含む。
本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載されるものに類似またはそれと同等の方法および材料が使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。加えて、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、限定的なものであることを意図しない。
図１Ａ〜１Ｂは、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ融合構築物の概略図を示す。図１Ａは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端に融合したヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインと非共有結合的に会合したＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ：ＷＴヒトＩＬ−１５の概略図である。図１Ｂは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端に融合したヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインと非共有結合的に会合した、Ｎ７２Ｄ変異を含有するＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ：ヒトＩＬ−１５の概略図である。
図２は、タンパク質ナノゲル（バックパック）形成に使用したＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−ＩｇＧ１−Ｆｃ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。可逆的架橋剤による架橋後のＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（黒色）およびＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（青色）タンパク質ナノゲルの分析（レーン１および２）。得られたタンパク質ナノゲルは高度に架橋されており、ポリアクリルアミドゲルに効率的に侵入しない。還元（レーン３および４）および非還元（レーン５および６）ＩＬ−１５バリアントを示す対照も含まれる。同じＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の無関係なデータは、図から省略されている。
図３は、ＢｉｏＳｅｐ４０００サイズ排除クロマトグラフィーカラムのＨＰＬＣによって分析した架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（１１分のピークは、組み込まれていないリンカーである）を示す；５分のピークは、架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃである。
図４は、ＢｉｏＳｅｐ４０００サイズ排除クロマトグラフィーカラムのＨＰＬＣによって分析した非架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃを示す。
図５は、ＢｉｏＳｅｐ４０００サイズ排除クロマトグラフィーカラムによる、ｐｏｌｙＫ３０で官能化した架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲルのＨＰＬＣを示す。
図６は、ＢｉｏＳｅｐ４０００サイズ排除クロマトグラフィーカラムのＨＰＬＣによって分析した非架橋抗ＣＤ４５ ＩｇＧを示す。
ＢｉｏＳｅｐ４０００サイズ排除クロマトグラフィーカラムのＨＰＬＣによって分析した、抗ＣＤ４５ ＩｇＧ（上記と同じ初期濃度の抗ＣＤ４５ ＩｇＧ）で官能化した架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル。
ＢｉｏＳｅｐ４０００サイズ排除クロマトグラフィーカラムのＨＰＬＣによって分析した、抗ＣＤ４５ ＩｇＧおよびｐｏｌｙＫ３０で官能化した架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル。
図９は、ＣＤ８ Ｔ細胞とのタンパク質ナノゲル会合を示す。ＣＤ８ Ｔ細胞を、３重量％のＡｌｅｘａ−６４７コンジュゲートＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃを含有するＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させた。ＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ中で、ＣＤ８ Ｔ細胞を一晩凍結した。融解して、ＩＬ−２含有培地（２０ｎｇ／ｍｌ）中でＣＤ８ Ｔ細胞を培養し、示されている時点において、フローサイトメトリーによってそれらのＡｌｅｘａ−６４７蛍光を測定した。
図１０は、Ｔ細胞拡大分析を示す。ＣＤ８ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックとコンジュゲートしてから（右の群）、またはコンジュゲートせずに（左の群）、ＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ中で一晩凍結した。融解して、ＩＬ−２含有培地（２０ｎｇ／ｍｌ）中で両群を培養し、４時間後（灰色のバー）および２日目（黒色のバー）に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）であった。
図１１Ａ〜１１Ｂは、Ｔ細胞拡大分析を示す。図１１Ａでは、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で２週間凍結する前に、ＣＤ３ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させたか（右端の群）、または会合させなかった（左端の３つの群）。融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性））、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（０．６ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。１６時間後（灰色のバー）および９日目（黒色のバー）に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。図１１Ｂでは、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で一晩凍結する前に、ＣＤ３ Ｔ細胞をＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（バックパック）とコンジュゲートさせたか（右端の群）、またはコンジュゲートさせなかった（左端の３つの群）。融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性））、ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（１２ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（１２ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。２日目（薄灰色のバー）、６日目（濃灰色のバー）および７日目（黒色のバー）に、顕微鏡検査によって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）であった。
図１２Ａ〜１２Ｂは、ＮＫ−９２細胞株および初代ＮＫ細胞の拡大分析を示す。図１２Ａでは、ＮＫ−９２細胞をＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ゲル（バックパック）と会合させたか（右端の２つの群）、または会合させなかった（左端の３つの群）。最初の４群は、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で２時間凍結させ、５群は、洗浄し、完全培地中で培養した（ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック（非凍結））。左端の４つの群を融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性））、ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（１２ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（１２ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。１日目（薄灰色のバー）、５日目（濃灰色のバー）および６日目（黒色のバー）に、顕微鏡検査によって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、組換えトランスフェリン（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、５％ヒト血清ＡＢ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＸｖｉｖｏ１０であった。図１２Ｂでは、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で２週間凍結する前に、初代ＮＫ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させたか（右端の群）、または会合させなかった（左端の３つの群）。融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性））、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（０．６ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。１６時間後（灰色のバー）および９日目（黒色のバー）に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、組換えトランスフェリン（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、５％ヒト血清ＡＢ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＸｖｉｖｏ１０であった。
図１３Ａ〜１３Ｂは、Ｔ細胞サブセット分析を示す。図１３Ａでは、ＣＤ３ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させてから（右端の群）、または会合させずに（左端の３つの群）、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で２週間凍結した。融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性）、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（０．６ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。９日間培養した後、サブセット（図１３Ａ）および活性化（図１３Ｂ）マーカーの発現について、フローサイトメトリーによってＣＤ３ Ｔ細胞を分析した。
図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｔ細胞効力分析を示す。図１４Ａでは、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で２週間凍結させる前に、ＣＤ３ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させたか（右端の群）、または会合させなかった（左端の３つの群）。融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性）、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（０．６ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。１日間培養した後、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＣＤ３ Ｔ細胞を標的細胞（Ｄａｕｄｉ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による２元配置ＡＮＯＶＡによって、統計的有意性を計算した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。図１４Ｂは、図１４Ａと同じ細胞からのＩＦＮｇ放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）であった。
図１５Ａ〜図１５Ｂは、Ｔ細胞効力分析を示す。図１５Ａでは、ＣＤ８ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させ、洗浄および完全培地で培養したか、または無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で凍結した（２日間）。融解して、完全培地中で、ＣＤ８ Ｔ細胞を培養した。１８日間培養した後（「非凍結」の群については２０日間）、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＣＤ８ Ｔ細胞を標的細胞（Ｄａｕｄｉ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。Ｓｉｄａｋの多重比較検定による２元配置ＡＮＯＶＡによって、統計的有意性を計算した。ｎ．ｓ．：有意でない。図１５Ｂは、図１５Ａと同じ細胞からのＩＦＮｇ放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）であった。
図１６Ａ〜図１６Ｂは、Ｔ細胞効力分析を示す。図１６Ａでは、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲル（バックパック）と会合させたか（右端の群）、または会合させず（左端の２つの群）、洗浄およびＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）含有培地で培養したか（左端の群）、またはＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ中で凍結した（右端の２つの群）（一晩）。融解して、ＩＬ−２含有培地（２０ｎｇ／ｍｌ）中で、両群を培養した。３日間培養した後、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＣＤ８ Ｔ細胞を標的細胞（Ｄａｕｄｉ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。Ｓｉｄａｋの多重比較検定による２元配置ＡＮＯＶＡによって、統計的有意性を計算した。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。図１６Ｂは、図１６Ａと同じ細胞からのＩＦＮｇ放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）であった。
図１７Ａ〜１７Ｂは、初代ＮＫ細胞効力分析を示す。図１７Ａでは、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で２週間凍結させる前に、ＮＫ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックとコンジュゲートさせたか（右端の群）、またはコンジュゲートさせなかった（左端の３つの群）。融解して、完全培地中で第１の群を培養し（培地のみ）、ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）完全培地中で第２の群を培養し（ＩＬ−２（可溶性）、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（０．６ｕｇ／ｍｌ）完全培地中で第３の群を培養し（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ））、完全培地中で第４の群を培養した（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック）。１日間培養した後、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＮＫ細胞を標的細胞（Ｄａｕｄｉ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。図１７Ｂは、図１７Ａと同じ細胞からのＩＦＮｇ放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、組換えトランスフェリン（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、５％ヒト血清ＡＢ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＸｖｉｖｏ１０であった。
図１８Ａ〜１８Ｂは、初代マウスＴ細胞生存能力分析を示す。図１８Ａでは、インビトロ活性化Ｔ細胞（実施例１４を参照のこと）を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；黒色のバー）と共にインキュベートしたか（０日目）、またはＩＬ−１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパック（灰色のバー）もしくはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパック（灰色の斜線バー）とコンジュゲートした。ＩＬ−１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックは、ＩＬ１５タンパク質内にＤ８Ｎ変異（これは、ＩＬ１５タンパク質を不活性にする）を有する。洗浄後（実施例２１を参照のこと）、Ｔ細胞を半分に分割し、ＣＭ−ｍＴ中で培養したか（実施例３１を参照のこと）、または無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で凍結した（５日間）。融解後、ならびに２日間培養した後、二重蛍光顕微鏡検査（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム、Ｃａｔ．ＣＳ２−０１０６；Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ，Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ）によって、Ｔ細胞生存能力を測定した。ＮＡ：該当なし。Ｆ／Ｔ：凍結／融解。ＢＰ：バックパック。図１８Ｂでは、ＩＬ−１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックを用いず、培養液中でＴ細胞を２日間ではなく３日間保持する以外は同じ実験を、独立した操作者が反復した。
図１９は、培養中の初代マウスＴ細胞拡大を示す。インビトロ活性化Ｔ細胞（実施例３１を参照のこと）を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；黒色のバー）と共にインキュベートしたか（０日目）、またはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパック（灰色の斜線バー）とコンジュゲートした。洗浄後（実施例２１を参照のこと）、Ｔ細胞を半分に分割し、ＣＭ−ｍＴ中で培養したか（実施例３１を参照のこと）、または無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で凍結した（５日間）。融解後、ならびに３日間および６日間培養した後、二重蛍光顕微鏡検査（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム、Ｃａｔ．ＣＳ２−０１０６；Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ，Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）によって、Ｔ細胞をカウントした。結果を、０日目に対する変化倍率として報告する。Ｆ／Ｔ：凍結／融解。ＢＰ：バックパック。
図２０Ａ〜２０Ｂは、培養中の初代ヒトＴ細胞拡大を示す。両パネルでは、ＣＤ８ Ｔ細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；黒色のバー）と共に、もしくはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａ（暗灰色のバー）と共にインキュベートし、またはＰｅｇ５ｋｐｏｌｙＫ３０を有しないＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパック（薄灰色のバー）と、もしくはＰｅｇ５ｋｐｏｌｙＫ３０を有するＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａ（白色のバー）とコンジュゲートした。図２０Ａでは、Ｔ細胞を凍結せずに新鮮培養し、図２０Ｂでは、（９０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ中で）Ｔ細胞を７日間凍結し、融解し、さらに７日間培養した。両パネルでは、培養条件は、サイトカインを含んでいなかった。示されている時点において、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。結果は、０日目に対する変化倍率として報告されている。ＢＰ：バックパック。
図２１Ａ〜２１Ｂは、レシピエントマウスの循環中の移入マウスＰｍｅｌ Ｔ細胞の濃度を示す。両パネルでは、Ｐｍｅｌトランスジェニックマウスの脾臓から初代マウスＴ細胞を単離し、インビトロで活性化した（実施例３１）。図２１Ａでは、活性化Ｔ細胞をＩＬ−１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａまたはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックとコンジュゲートし、凍結した（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）。図２１Ｂでは、活性化Ｔ細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）と共にインキュベートし、またはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックとコンジュゲートし、凍結した（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）。融解して、Ｔ細胞を洗浄し、マウス１匹当たり１０７個を静脈内注射した。５日目（図２１Ａ）または７日目（図２１Ｂ）に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。独立した操作者が、２回の実験を実施した。結果は、血液１μｌ当たりのＴ細胞の数として報告されている。マンホイットニー検定による統計分析。ＢＰ：バックパック。
図２２は、レシピエントマウスの腫瘍微小環境中の移入マウスＰｍｅｌ Ｔ細胞の濃度を示す。Ｐｍｅｌトランスジェニックマウスの脾臓から初代マウスＴ細胞を単離し、インビトロで活性化した（実施例３１）。活性化Ｔ細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）と共にインキュベートし、ＩＬ−１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックとコンジュゲートし、またはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックとコンジュゲートした。新鮮細胞または凍結細胞（マウス１匹当たり１０７個）を動物に注射した。２６日目に、フローサイトメトリーによって、腫瘍に浸潤した生移入Ｔ細胞の数を測定した。結果は、腫瘍１ｍｇ当たりのＴ細胞の数として報告されている。マンホイットニー検定による統計分析。ＢＰ：バックパック。
詳細な説明
少なくとも１つの保存された機能を有する（例えば、保存された生存能力、増殖および細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを有する）有核細胞、例えば、免疫細胞を（例えば、エクスビボで）生産するための最適化された方法および組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、免疫細胞機能を保存するための方法が本明細書に開示される。前記方法は、保存剤を含む粒子、例えばナノ粒子、例えばタンパク質（例えば、タンパク質ナノゲル）を含むナノ粒子と、有核細胞、例えば免疫細胞とを接触させる工程（例えば、被験体から得られた例えば免疫細胞の集団をエクスビボで接触させる工程）を含む。
本明細書で使用される場合、「保存剤」は、有核細胞の生存能力、有核細胞の増殖能力、または有核細胞の別の生物学的活性、例えば細胞傷害活性、有核細胞の活性化（例えば、免疫細胞との関連では、活性化は、免疫細胞増殖、サイトカイン分泌または標的細胞死滅の１つまたはそれよりも多くの増加を含む）、因子、例えばサイトカイン、例えば炎症促進性サイトカインを分泌する能力の１つまたはそれよりも多くを促進する、例えば保存または増強する薬剤、例えばタンパク質を指す。実施形態では、保存剤は、インターフェロンガンマを分泌する能力を促進する。
実施形態では、前記保存剤は、１つまたはそれより多くの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの）治療用タンパク質または生物学的に活性なタンパク質、例えば１つまたはそれより多くのサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−２１（そのバリアント形態、例えば変異体を含む）；ポリペプチドと共にサイトカイン分子を含む複合体、例えばサイトカイン受容体複合体；その融合形態またはアゴニスト形態）；成長因子；および他の分子、例えばアゴニスト、例えば共刺激分子、例えばＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストに対する抗体分子またはリガンドから選択される。いくつかの実施形態では、保存剤としては、融合物、例えばサイトカインと免疫グロブリンＦｃ領域との融合物、または抗体分子（例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体）が挙げられる。
あるいはまたは組み合わせて、バックパックピローは、抗体分子（例えば、本明細書に記載される抗体分子）、ヒト血清アルブミンまたは他の結合部分、例えばフィブロネクチン分子、ダーピン、受容体外部ドメイン、アプタマーまたは結合ペプチドの１つまたはそれよりも多くを含む。実施形態では、治療用タンパク質は、例えば分解性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）によって、ナノ粒子に共有結合的にカップリングされる、例えば架橋される。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、細胞療法、例えば免疫療法のための有意な利益を提供し得る。
定義
特定の用語を以下で定義する。さらなる定義は、本出願を通して提供される。
本明細書で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く、例えば少なくとも１つを指す。「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、「含む」という用語と併せて使用される場合、本明細書では「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つまたはそれより多く」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多く」の意味と一致する。
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量に関する誤差の許容され得る程度を意味する。誤差の例示的な程度は、所定の範囲値の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
「自己」という用語は、それがその後に再導入されるのと同じ個体に由来する任意の材料を指す。
「同種」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。
本明細書で使用される場合、「取得する」または「取得」という用語は、物理的エンティティまたは値を「直接的に取得すること」または「間接的に取得すること」によって、物理的エンティティ（例えば、サンプル、細胞もしくは細胞集団、ポリペプチド、核酸または配列）または値、例えば数値を得ることを指す。一実施形態では、取得は、細胞または細胞集団（例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞または集団）を得ることまたは採取することを指す。「直接的な取得」は、物理的エンティティまたは値を得るためのプロセスを実施すること（例えば、合成方法または分析方法または精製方法を実施すること）を意味する。「間接的な取得」は、別の団体または供給源（例えば、物理的エンティティまたは値を直接的に取得した第３者研究室）から物理的エンティティまたは値を受け取ることを指す。
「免疫細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答に、例えば免疫応答の促進に関与する細胞を指す。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。免疫エフェクター細胞の例としては、限定されないが、Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞および肥満細胞が挙げられる。「免疫細胞」はまた、免疫応答に関与する細胞の改変型、例えば改変ＮＫ細胞、例えばＫｌｉｎｇｅｍａｎｎら（前掲）に記載されているように、例えばＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）、ｈａＮＫ（高親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａを発現するＮＫ−９２バリアント（１５８Ｖ））およびｔａＮＫ（遺伝子でトランスフェクトされた標的ＮＫ−９２細胞であって、所定の腫瘍抗原に対するＣＡＲを発現する標的ＮＫ−９２細胞）を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、標的細胞を死滅する能力を有するＴ細胞を指す。２つの工程が起こると（１）標的細胞上の抗原結合ＭＨＣ分子と、ＣＴＬ上のＴ細胞受容体との間の相互作用がなされ；２）Ｔ細胞および標的細胞上への共刺激分子の嵌合によって共刺激シグナルが作られると）、ＣＴＬ活性化が起こり得る。次いで、ＣＴＬは、標的細胞上の特定の抗原を認識し、例えば細胞溶解によるこれらの標的細胞の破壊を誘導する。
本明細書で使用される場合、「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）は、腫瘍に遊走したリンパ球を指す。実施形態では、ＴＩＬは、異なる成熟段階または分化段階の細胞であり得、例えば、ＴＩＬは、他のタイプのリンパ球の中でも、ＣＴＬ、Ｔｒｅｇおよび／またはエフェクター記憶Ｔ細胞を含み得る。
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間または２つのポリペプチド分子間におけるサブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占められている場合；例えば、２つの各ＤＮＡ分子における位置がアデニンによって占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数の一次関数である；例えば、２つの配列における位置の半数（例えば、長さ１０サブユニットのポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同である；位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致または相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
本明細書で使用される場合、「因子分子」は、天然に存在する全長野生型分子、および天然に存在する分子の活性の少なくとも１０％を有するそのバリアント、例えば機能的バリアント（例えば、切断型、断片、変異型（例えば、実質的に類似の配列）またはその誘導体化形態）を指す。実施形態では、因子分子は、天然に存在する分子の活性の少なくとも３０、５０または８０％の活性を有する。実施形態では、バリアントは、天然に存在する野生型分子の対応する部分と７０、８０、９０または９５％の相同性を有する。実施形態では、因子分子は、抗体分子、サイトカイン分子、受容体分子、共刺激分子である。
ポリペプチドとの関連における「機能的バリアント」という用語は、天然に存在する配列の１つまたはそれより多くの活性の少なくとも１０％を有することができるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、機能的バリアントが、天然に存在する配列の１つまたはそれより多くの活性を有するように、機能的バリアントは、天然に存在する配列と実質的なアミノ酸配列同一性を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされる。
本明細書で使用される場合、「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。抗体分子は、抗体（例えば、全長抗体）および抗体断片を包含する。例えば、全長抗体は、天然に存在するかまたは正常な免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）である。実施形態では、抗体分子は、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分、例えば抗体断片を指す。抗体断片、例えば機能的断片は、抗体の一部、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。機能的抗体断片は、インタクトな（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」または「機能的断片」という用語はまた、可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、またはペプチドリンカーによって軽可変領域および重可変領域が接続された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合活性を有しない抗体の一部、例えばＦｃ断片または単一アミノ酸残基を含まない。例示的な抗体分子としては、全長抗体および抗体断片、例えばｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
実施形態では、抗体分子は単一特異性であり、例えば、それは、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は多重特異性であり、例えば、それは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、抗体分子は、二重特異性抗体分子である。本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体分子」は、１つより多くの（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれより多くの）エピトープおよび／または抗原に対する特異性を有する抗体分子を指す。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン分子」は、天然に存在する野生型サイトカインの全長、断片またはバリアント（天然に存在するサイトカイン分子の活性の少なくとも１０％の活性を有するその断片および機能的バリアントを含む）を指す。実施形態では、サイトカイン分子は、天然に存在する分子の活性、例えば免疫調節活性の少なくとも３０、５０または８０％を有する。実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃ領域に場合によりカップリングされた受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体ドメインをさらに含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃ領域にカップリングされる。他の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子（例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体）にカップリングされる。
本明細書で使用される場合、「サイトカインアゴニスト」は、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を誘発するサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）を含み得る。
「サンプル」または「組織サンプル」は、被験体または患者の組織または体液から得られた生物学的サンプルを指す。組織サンプルの供給源は、新鮮器官、凍結器官および／もしくは保存器官、組織サンプル、生検または吸引物由来の固体組織；血液または任意の血液成分（例えば、血清、血漿）；骨髄または任意の骨髄成分；体液、例えば尿、脳脊髄液、全血、血漿および血清であり得る。サンプルは、非細胞画分（例えば、尿、血漿、血清または他の非細胞体液）を含み得る。他の実施形態では、個体から得られるサンプルが由来する体液は、血液（例えば、全血）を含む。
「被験体」という用語は、免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含む。一実施形態では、被験体は、患者、例えば免疫細胞療法を必要とする患者である。別の実施形態では、被験体は、ドナー、例えば同種移植用の免疫細胞の同種ドナーである。
「実質的に精製された細胞」という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、それがその天然に存在する状態で通常は結合している他の細胞型から分離されている細胞を指す。いくつかの場合では、実質的に精製された細胞の集団は、均一な細胞集団を指す。他の場合では、この用語は、それらがそれらの天然の状態で本来的に結合している細胞から分離されている細胞を単に指す。いくつかの態様では、細胞は、インビトロで培養される。他の態様では、細胞は、インビトロで培養されない。
さらなる定義は、本明細書を通して提供される。
保存剤
いくつかの実施形態では、保存剤は、有核細胞（例えば、免疫細胞）の生存能力、有核細胞の増殖能力、または有核細胞の別の生物学的活性、例えば細胞傷害活性、有核細胞の活性化、因子、例えばサイトカイン、例えば炎症促進性サイトカインを分泌する能力の１つまたはそれよりも多くを促進する、例えば保存または増強するタンパク質である。実施形態では、保存剤は、インターフェロンガンマを分泌する能力を促進する。
実施形態では、前記保存剤は、１つまたはそれより多くの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの）治療用タンパク質または生物学的に活性なタンパク質、例えば１つまたはそれより多くのサイトカイン分子（例えば、免疫刺激性サイトカイン、例えばＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−２１（バリアント、例えばその変異体形態を含む）、またはサイトカイン複合体、例えば本明細書に記載されるＩＬ−１５複合体から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、例えば免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖を促進する。
他の実施形態では、保存剤は、成長因子である。
他の実施形態では、保存剤は、分子、例えばアゴニスト、例えば共刺激分子、例えばＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、またはＣＤ１３７のアゴニストに対する抗体分子またはリガンドを含む。
実施形態では、保存剤は、Ｔ細胞のアゴニスト、例えばアゴニスト抗体もしくはその断片、または共刺激分子のアクチベーター／アゴニストを含む。実施形態では、Ｔ細胞のアゴニストは、共刺激分子を含むか、または共刺激分子である。共刺激分子は細胞表面分子であり、必要に応じて、抗原に対するリンパ球、例えばＴ細胞の効率的な応答を増強する。実施形態では、共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の分子である。理論に縛られることを望むものではないが、共刺激は、Ｔ細胞の拡大、生存およびエフェクター機能を増強すると考えられる（例えば、Ｔ細胞の持続性および／または抗がん活性を増強する。例えば、Ｓｏｎｇら、ＢＬＯＯＤ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６を参照のこと）。例示的な共刺激分子として、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ４０、ＣＤ３０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−１、トール様受容体、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、Ｂ７−Ｈ３、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、インテグリン、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＴＧＡ４、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＴＮＦＲ２、ＣＤ８４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ２２９、ＣＤ６９、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、およびＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、保存剤は、共刺激分子、例えばＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、またはＣＤ１３７のアゴニストに対するアゴニスト（例えば、抗体分子またはアゴニストリガンド）を含む。
いくつかの実施形態では、保存剤は、融合物、例えばサイトカイン分子、成長因子または共刺激分子と免疫グロブリンＦｃ領域との融合物を含む。
あるいはまたは組み合わせて、保存剤は、抗体分子（例えば、免疫グロブリンＦａｂまたはｓｃＦｖ断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体）、ヒト血清アルブミンまたは他の結合部分、例えばフィブロネクチン分子、ダーピン、受容体外部ドメイン、アプタマーまたは結合ペプチドの１つまたはそれよりも多くを含む。
いくつかの実施形態では、保存剤は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンの１つまたはそれよりも多くを含む。
いくつかの実施形態では、保存剤は、１つまたはそれより多くの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの）治療用タンパク質、具体的には免疫刺激性サイトカインまたは抗体（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ３アゴニストまたはＣＤ１３７アゴニスト）（これらのサイトカインの変異体またはスーパーアゴニスト、ならびにこのようなサイトカインと、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、ヒト血清アルブミン、単一ドメイン抗体、さらなるサイトカイン、二重特異性物、フィブロネクチン、ダーピン、受容体外部ドメイン、アプタマーまたは結合ペプチドとの遺伝子融合物形態を含む）を含む。
成長因子分子
本明細書に記載される方法および組成物、例えばナノ粒子は、１つまたはそれより多くの成長因子分子を含み得る。実施形態では、成長因子分子は、成長因子の完全長、断片またはバリアント、例えば１つまたはそれより多くの変異を含む成長因子である。実施形態では、成長因子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリン（例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ１、Ｂ２またはＢ３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２またはＦＧＦ２３）、ＧＤＮＦファミリーのリガンド、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、成長分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝細胞癌由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、遊走促進因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、ニューレグリン（例えば、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）、ニューロトロフィン脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（例えば、ＮＴ−３またはＮＴ−４）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−アルファまたはＴＧＦ−ベータ）または血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
サイトカイン分子
本明細書に記載される方法および組成物、例えばナノ粒子は、１つまたはそれより多くのサイトカイン分子を含み得る。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインの全長、断片またはバリアント、例えば１つまたはそれより多くの変異を含むサイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１アルファ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ベータ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、腫瘍壊死アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または前記サイトカインの任意の組み合わせから選択されるサイトカインを含む。別の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）またはインターフェロンガンマ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または前記サイトカインの任意の組み合わせから選択される。サイトカイン分子は、単量体であっても、二量体であってもよい。
実施形態では、サイトカイン分子は、受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体ドメインをさらに含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、本明細書に記載されるＩＬ−１５受容体またはその断片（例えば、ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ＩＬ−１５結合ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子、例えば本明細書に記載されるＩＬ−１５またはＩＬ−１５スーパーアゴニストである。本明細書で使用される場合、サイトカイン分子の「スーパーアゴニスト」形態は、天然に存在するサイトカインと比較して、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％増加した活性を示す。例示的なスーパーアゴニストは、ＩＬ−１５ＳＡである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡは、例えば本明細書に記載されるように、ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５受容体のＩＬ−１５結合断片、例えばＩＬ−１５受容体アルファまたはそのＩＬ−１５結合断片との複合体を含む。
別の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、例えば、Ｆｃ領域、単一ドメイン抗体、二重特異性または多重特異性抗体）をさらに含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃまたはＦａｂをさらに含む。
いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２分子、例えばＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃである。
他の実施形態では、サイトカインアゴニストが、本明細書に開示される方法および組成物において使用され得る。実施形態では、サイトカインアゴニストは、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を誘発するサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）である。実施形態では、サイトカインアゴニストは、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えばＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択されるサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）である。
ＩＬ−１５分子
いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子、例えば、ＩＬ−１５の全長、断片またはバリアント、例えば、ヒトＩＬ−１５である。ある実施形態では、ＩＬ−１５分子は、野生型、ヒトＩＬ−５であり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、ヒトＩＬ−５のバリアントであり、例えば、１つもしくはそれより多くのアミノ酸改変を有する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５分子は、変異、例えば、本明細書の配列番号６に示されるＮ７２Ｄ点変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号６との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型ヒトＩＬ−１５と比較してＮ７２Ｄ変異を含み、ＩＬ−１５Ｒα結合活性を有する。
他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃまたは抗体分子に場合によりカップリングされた受容体のドメイン、例えばＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外ドメインをさらに含む。実施形態では、サイトカイン分子は、ＷＯ２０１０／０５９２５３に記載されているＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５ＳＡ）である。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、例えばＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、ＰＮＡＳ １０３：２４ ｐ．９１６６−９１７１（２００６）に記載されているように、ＩＬ−１５と、Ｆｃに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファドメインとを含む（例えば、ｓＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ融合タンパク質）。
ＩＬ−１５分子は、ポリペプチド、例えば、サイトカイン受容体、例えば、サイトカイン受容体ドメイン、および第２の異種ドメインをさらに含み得る。一実施形態では、異種ドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域である。別の実施形態では、異種ドメインは、抗体分子、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、ｓｃＦｖ断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第３の異種ドメインも含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第２のドメインのＮ末端であり、別の実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第２のドメインのＣ末端である。
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列ならびにこの配列の断片およびバリアントは、以下に記載されている。
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ２１１４１．１）
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメイン（アクセッション番号Ｑ１３２６１の一部）：
アイソフォームＣＲＡ＿ｄＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメイン（アクセッション番号ＥＡＷ８６４１８の一部）：
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列は、配列番号４として上記で提供されている。ＩＬ−１５受容体アルファは、細胞外ドメインと、２３アミノ酸の膜貫通セグメントと、３９アミノ酸の細胞質尾部とを含有する。ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、配列番号３として提供されている。
他の態様では、ＩＬ−１５アゴニストが使用され得る。例えば、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を誘発するＩＬ−１５受容体のアゴニスト、例えばＩＬ−１５受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）。
実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類に由来する。
本明細書の組成物および方法は、ＩＬ−１５Ｒαの部分、例えば、ＩＬ−１５ＲαのＳｕｓｈｉドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｓｕｓｈｉドメインおよび第２の異種ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第３の異種ドメインも含む。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインは、第２のドメインのＮ末端であり、別の実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインは、第２のドメインのＣ末端である。ある実施形態では、第２のドメインは、Ｆｃドメインを含む。
ＩＬ−１５受容体アルファ配列の断片およびバリアントは、以下に記載されている。
最小Ｓｕｓｈｉドメイン、野生型：
拡張Ｓｕｓｈｉドメイン、野生型：
最小Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌ７７Ｉ：
拡張Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌ７７Ｉ：
ｓｕｓｈｉドメインの野生型およびＬ７７Ｉ変異形態は、本明細書に記載されるアッセイの１つまたはそれよりも多くにおいて、同様の活性を示した。
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列は、配列番号２として本明細書で提供されている。ＩＬ−１５受容体アルファは、細胞外ドメインと、２３アミノ酸の膜貫通セグメントと、３９アミノ酸の細胞質尾部とを含有する。ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、配列番号３として提供されている。ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、ＩＬ−１５に結合するドメイン（これは、Ｓｕｓｈｉドメインと称される）を含む。Ｓｕｓｈｉドメインは、６２アミノ酸の最小ドメイン（配列番号７）、および最小ドメインを含む６５アミノ酸の拡張ドメイン（配列番号８）として提供されている。
本明細書に記載されるＳｕｓｈｉドメインは、野生型Ｓｕｓｈｉドメインと比較して１つまたはそれより多くの変異を含み得る。例えば、ＩＬ−１５Ｒａの残基７７は、野生型遺伝子ではロイシンであるが、イソロイシンに変異され得る（Ｌ７７Ｉ）。したがって、Ｌ７７Ｉを含む最小Ｓｕｓｈｉドメイン（ナンバリングは、配列番号２の野生型ＩＬ−１５Ｒａを参照のこと）は、配列番号９として提供されている。Ｌ７７Ｉを含む拡張Ｓｕｓｈｉドメイン（ナンバリングは、配列番号４の野生型ＩＬ−１５Ｒａを参照のこと）は、配列番号１０として提供されている。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の６２〜１７１アミノ酸あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の６５〜１７１アミノ酸あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の最大１７１アミノ酸あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、または６５〜７０アミノ酸あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、または６５〜７０アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の６２〜１７１アミノ酸あるいはそれと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の改変（例えば、置換）を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の最大１７１アミノ酸あるいはそれと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の改変（例えば、置換）を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、または６５〜７０アミノ酸あるいはそれと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の改変（例えば、置換）を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の少なくとも６２アミノ酸あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比較してＬ７７Ｉ変異を含み、ＩＬ−１５結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の少なくとも６５アミノ酸あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比較してＬ７７Ｉ変異を含み、ＩＬ−１５結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の部分あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比較してＬ７７Ｉ変異を含み、ＩＬ−１５結合活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の少なくとも６２アミノ酸あるいはそれと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の改変（例えば、置換）を有する配列を含み、配列は、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比較してＬ７７Ｉ変異を含み、ＩＬ−１５結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の部分あるいはそれと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の改変（例えば、置換）を有する配列を含み、配列は、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比較してＬ７７Ｉ変異を含み、ＩＬ−１５結合活性を有する。
ある実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、６２、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または１６０の連続したアミノ酸、あるいはそれと比較してＬ７７Ｉ変異を有する配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドのＩＬ−１５Ｒα部分は、配列番号３の１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、または１６０〜１７０の連続したアミノ酸、あるいはそれと比較してＬ７７Ｉ変異を有する配列からなる。
ある実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類由来のＳｕｓｈｉドメインである。
実施形態では、組成物は、例えばナノ粒子を含み、および／または保存剤は、ＩＬ−１５複合体、ポリペプチドと例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含むＩＬ−１５複合体を含み、ポリペプチドは、以下を含む第１のドメインを含む：
ｉ）配列番号３の野生型ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメインの少なくとも６２アミノ酸であって、ここでポリペプチドの最長の連続したＩＬ−１５受容体アルファ配列は、１７１以下のアミノ酸長であるか、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列；
ｉｉ）配列番号３の少なくとも６２アミノ酸であって、ここでポリペプチドの最長の連続したＩＬ−１５受容体アルファ配列は、１７１以下のアミノ酸長であるか、または配列番号３の対応する配列から１、２、３、４、または５アミノ酸以下だけ異なり、ＩＬ−１５結合活性を有する配列；
ｉｉｉ）配列番号３の少なくとも６２アミノ酸であって、ここでポリペプチドの最長の連続したＩＬ−１５受容体アルファ配列は、１７１以下のアミノ酸長であり、ＩＬ−１５結合活性を有する；
ｉｖ）最小ｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号３の１７１以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；
ｖ）最小ｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号３の１７１以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、あるいは配列番号３の対応する配列から１、２、３、４、または５アミノ酸以下だけ異なる配列；
ｖｉ）最小ｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号３の１７１以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片；
ｖｉｉ）拡張ｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号３の１７１以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；
ｖｉｉｉ）拡張ｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号３の１７１以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、あるいは配列番号３の対応する配列から１、２、３、４、または５アミノ酸以下だけ異なる配列；
ｉｘ）拡張ｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号３の１７１以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片；または
ｘ）配列番号３の少なくとも６２アミノ酸、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有する配列、ここで、アミノ酸７７（ナンバリングは、配列番号４の野生型ＩＬ−１５受容体アルファを参照のこと）はイソロイシンである；
ｘｉ）配列番号３の少なくとも６２アミノ酸、あるいは配列番号３の対応する配列から１、２、３、４、または５アミノ酸以下だけ異なり、ＩＬ−１５結合活性を有する配列、ここで、アミノ酸７７はイソロイシンである；
ｘｉｉ）ＩＬ−１５結合活性を有する配列番号３の少なくとも６２アミノ酸、ここで、アミノ酸７７はイソロイシンである；
ｘｉｉｉ）最小もしくは拡張ｓｕｓｈｉドメインの活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列、ここで、アミノ酸７７はイソロイシンである；
ｘｉｖ）最小もしくは拡張ｓｕｓｈｉドメインの活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、あるいは配列番号３の対応する配列から１、２、３、４、または５アミノ酸以下だけ異なる配列、ここで、アミノ酸７７はイソロイシンである；または
ｘｖ）最小もしくは拡張ｓｕｓｈｉドメインの活性断片、例えば、ＩＬ−１５結合断片、ここで、アミノ酸７７はイソロイシンである、
および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、ＦｃドメインもしくはＦａｂドメイン。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片を含むポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。
実施形態では、エフェクター弱体化Ｆｃドメインは、例えば野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、例えば配列番号１２の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して減少したエフェクター活性を有する。いくつかの実施形態では、エフェクター活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む。実施形態では、エフェクター活性は、ＡＤＣＣアッセイにおいて、例えば配列番号１２の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％だけ減少している。いくつかの実施形態では、エフェクター活性は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む。実施形態では、エフェクター活性は、ＣＤＣアッセイ、例えばＡｒｍｏｕｒら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９）２９：２６１３−２４”に記載されているＣＤＣアッセイにおいて、例えば配列番号１２の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％だけ減少している。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１２のＩｇＧ１ Ｆｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１３のＩｇＧ２定常領域もしくはその断片、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１４のＩｇＧ２Ｄａ Ｆｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用してＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ変異の一方または両方を含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、Ａｒｍｏｕｒら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．”Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９）２９：２６１３−２４に記載されているものを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、二量体化活性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号１５の配列あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載のｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７における）および本明細書に記載のＦｃドメイン、例えば、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（例えば、配列番号１１あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号７のｓｕｓｈｉドメインおよび本明細書に記載のＦｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１２のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号８のｓｕｓｈｉドメインおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号８のｓｕｓｈｉドメインおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１２のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号７のｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号１４のＩｇＧ２Ｄａ Ｆｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号８のｓｕｓｈｉドメインおよび配列番号１４のＩｇＧ２Ｄａ Ｆｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、配列番号１５の配列あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するｓｕｓｈｉ−ＩｇＧ２Ｄａ−Ｆｃタンパク質を含む。
実施形態では、ＩＬ−１５分子は、国際出願ＷＯ２０１７／０２７８４３（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている分子である。
いくつかの実施形態では、保存剤は、ＩＬ−１５ＳＡを含む。ヒトＩＬ−１５と可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａとの組み合わせは、ヒトＩＬ−１５単独よりも大きな生物学的活性を有するＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５ＳＡ）と称される複合体を生成する。
可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａ、ならびに、例えば、（Ｗｅｉら、２００１、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：２７７−２８２）に記載されている、細胞外ドメインの短縮バージョン。ヒトＩＬ−１５Ｒａのアミノ酸配列は、本明細書の配列番号２に記載される。したがって、本開示のいくつかの態様は、は、ヒトＩＬ−１５および可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒ分子の複合体を含むＩＬ−１５ＳＡに関する。本開示のいくつかの態様では、ＩＬ−１５ＳＡは、細胞外ドメインの全てまたは一部を含むヒトＩＬ−１５および可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａの複合体を含み、膜貫通または細胞質ドメインを含まない。本開示のいくつかの態様では、ＩＬ−１５ＳＡは、ＩＬ−１５結合活性ＩＬ−１５結合活性を保持する完全細胞外ドメインを含むヒトＩＬ−１５および可溶性ヒトＩＬ−Ｉ５Ｒａの複合体を含む。本開示のいくつかの態様は、ＩＬ−１５結合活性を保持する細胞外ドメインの短縮型、例えば、ヒトＩＬ−１５Ｒａのアミノ酸１〜６０、１〜６１、１〜６２、１〜６３、１〜６４または１〜６５を含むヒトＩＬ−１５および可溶性ヒトＩＬ−Ｉ５Ｒａの複合体を含むＩＬ−１５ＳＡに関する。本開示のいくつかの態様では、ＩＬ−１５ＳＡは、ＩＬ−１５結合活性を保持する細胞外ドメインの短縮型、例えば、ヒトＩＬ−１５Ｒａのアミノ酸１〜８０、１〜８１、１〜８２、１〜８３、１〜８４または１〜８５を含むヒトＩＬ−１５および可溶性ヒトＩＬ−Ｉ５Ｒａの複合体を含む。本開示のいくつかの態様では、１Ｌ−１５ＳＡは、ＩＬ−１５結合活性を保持する細胞外ドメインの短縮型、例えば、ヒトＩＬ−１５Ｒａのアミノ酸１〜１８０、１〜１８１、または１〜１８２を含むヒトＩＬ−１５および可溶性ヒトＩＬ−Ｉ５Ｒａの複合体を含む。
本開示のいくつかの態様は、ヒトＩＬ−１５と、ＩＬ−１５結合活性を保持する短縮型細胞外ドメインであって、Ｓｕｓｈｉドメインを含む短縮型細胞外ドメインを含む可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａとの複合体を含む１Ｌ−１５ＳＡに関する。ＩＬ−１５活性を保持する短縮型可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａであって、Ｓｕｓｈｉドメインを含む短縮型可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａは、本開示のＩＬ−１５ＳＡにおいて有用である。
変異型ヒトＩＬ−１５は、例えば、Ｚｈｕら、２００９ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：３５９８に記載されている。したがって、本開示は、ヒトＩＬ−１５が野生型であるか、または１つもしくはそれより多くの変異（例えば、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失）を含む変異体ＩＬ−１５である上記ＩＬ−１５ＳＡ複合体のいずれかを提供する。本開示のＩＬ−１５ＳＡにおいて使用するための例示的なＩＬ−１５変異体であって、野生型ＩＬ−１５と比べて増加した生物学的活性を有する例示的なＩＬ−１５変異体は、アミノ酸７２においてアスパラギンからアスパラギン酸への置換（Ｎ７２Ｄ）を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、本開示は、ＩＬ−１５と共に、融合タンパク質、例えば本明細書に記載されるＦｃ融合物（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）として発現される可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒａを含む複合体に関する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡは、２つのヒトＩＬ−１５分子と複合体化した二量体ヒトＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡサイトカイン複合体は、本明細書の配列番号１または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１５分子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡサイトカイン複合体は、国際出願ＷＯ２０１７／０２７８４３（本明細書に参考として援用される）の配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ−１５分子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡサイトカイン複合体は、本明細書の配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の配列を含む可溶性ＩＬ−１５Ｒａ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡサイトカイン複合体は、国際出願ＷＯ２０１７／０２７８４３（本明細書に参考として援用される）の配列番号３、配列番号７または配列番号８の配列を含む可溶性ＩＬ−１５Ｒａ分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡは、２つのＩＬ−１５分子と複合体化した二量体ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質を含むサイトカイン複合体である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５−ＳＡは、二量体ＩＬ−１５ＲａＳｕ（Ｓｕｓｈｉドメイン）／Ｆｃ（配列番号５）と、２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ（配列番号６）分子とを含む。実施形態では、米国特許出願公開第２０１４０１３４１２８号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＩＬ−１５ＳＡは、ＡＬＴ−８０３を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡは、二量体ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ分子（配列番号５）と、２つのＩＬ−１５分子（配列番号１）とを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５ＳＡは、可溶性ＩＬ−１５Ｒａ分子（例えば、配列番号７または配列番号８）と、２つのＩＬ−１５分子（例えば、配列番号１または配列番号６）とを含む。
粒子、例えばナノゲル
組成物、例えばナノ粒子（例えば、ナノゲル）は、１つまたはそれより多くの本明細書に開示されるタンパク質（例えば、生物学的に活性なタンパク質、例えば治療用タンパク質）を含み得る。例示的なナノ粒子（例えば、ナノゲル）およびその作製方法は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ａｇｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」という表題の国際公開第２０１０／０５９２５３号および「Ｃａｒｒｉｅｒ−Ｆｒｅｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，」という表題の国際公開第２０１５／０４８４９８号（両出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書で使用される場合、「粒子」は、複数の（例えば、少なくとも２つの）タンパク質、例えば複数の本明細書に記載されるサイトカイン分子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、１〜１０００ナノメートル（ｎｍ）の範囲の直径を有するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の直径は、２０〜７５０ｎｍまたは２０〜５００ｎｍまたは２０〜２５０ｎｍのサイズ範囲である。いくつかの実施形態では、直径は、５０〜７５０ｎｍまたは５０〜５００ｎｍまたは５０〜２５０ｎｍまたは約１００〜３００ｎｍのサイズ範囲である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１００、約１５０、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍまたは約３００ｎｍである。実施形態では、ナノ粒子は、実質的に球形である。
実施形態では、ナノ粒子は、３０ｎｍ〜１２００ｎｍ、４０ｎｍ〜１，１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１，０００ナノメートル、例えば５０〜５００ｎｍ、より典型的には７０〜４００ｎｍの（例えば、動的光散乱によって測定された）平均流体力学直径を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、例えば本明細書に記載されるナノゲルを含むか、またはそれからなる。
実施形態では、ナノ粒子中のタンパク質は、互いに、および／または粒子の第２の成分（例えば、分解性リンカーによって可逆的に連結されたタンパク質）にカップリングされる、例えば共有結合的にカップリングまたは架橋される。実施形態では、タンパク質は、ポリマーまたはシリカ中に、例えばポリマー系シェルまたはシリカシェル中に存在する。実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載されるナノシェルを含む。
実施形態では、タンパク質は、分解性リンカーによって官能基もしくはポリマーに可逆的に連結されるか、または「可逆的に改変される」。いくつかの実施形態では、ナノシェルは、触媒（例えば、ＮａＦ）存在下で、タンパク質コンジュゲートの官能基（例えば、シラン）を架橋剤（例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン）と重合することによって形成される。タンパク質ナノ粒子の例は、「タンパク質ナノゲル」（これは、分解性リンカーによって互いに架橋された（例えば、可逆的におよび共有結合的に架橋された）複数のタンパク質を指す）である（例えば、国際公開第２０１５／０４８４９８号の図９Ａを参照のこと）。いくつかの実施形態では、ナノゲルのタンパク質は、ポリマー（例えば、親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；例えば、国際公開第２０１５／０４８４９８号の図９Ａを参照のこと）に架橋される（例えば、可逆的におよび共有結合的に架橋される）。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ナノゲルの表面に（例えば、ナノゲルの表面に露出したタンパク質に）架橋され得る。
タンパク質ナノゲルのサイズは、少なくとも２つの方法（その「乾燥サイズ」に基づくおよびその「流体力学的サイズ」に基づく）で決定され得る。タンパク質ナノゲルの「乾燥サイズ」は、乾燥固体としてのナノゲルの直径を指す。タンパク質ナノゲルの「流体力学的サイズ」は、水和ゲルとしてのナノゲル（例えば、水性緩衝液中のナノゲル）の直径を指す。ナノゲルの乾燥サイズは、例えば、透過電子顕微鏡検査によって決定され得る一方、ナノゲルの流体力学的サイズは、例えば、動的光散乱によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、ナノゲルの乾燥サイズは、４００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、ナノゲルの乾燥サイズは、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６５ｎｍ未満、または６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、ナノゲルの乾燥サイズは、４０〜９０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、６０〜８０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、または５０〜６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノゲルの乾燥サイズは、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍまたは９５ｎｍである。
いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子内のナノ粒子（例えば、ナノゲル）の平均乾燥サイズは、４００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、このような複数内のナノ粒子の平均乾燥サイズは、５％または１０％以下で変動する。いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子内のナノ粒子（例えば、ナノゲル）の平均乾燥サイズは、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６５ｎｍ未満、または６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子内のナノ粒子（例えば、ナノゲル）の平均乾燥サイズは、４０〜９０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、６０〜８０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、または５０〜６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノゲルの乾燥サイズは、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍまたは９５ｎｍである。
いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子内のナノ粒子（例えば、ナノゲル）の平均流体力学的サイズは、１０００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、このような複数内のナノ粒子の平均流体力学的サイズは、動的光散乱によって測定した場合に、０．３５未満の多分散指数を有する。いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子内のナノ粒子（例えば、ナノゲル）の平均流体力学的サイズは、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、または１００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、複数のナノ粒子内のナノ粒子（例えば、ナノゲル）の平均流体力学的サイズは、４００〜５００ｎｍ、３００〜４００ｎｍ、２００〜３００ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、５０〜１００ｎｍである。
いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズは、直径３００ｎｍ未満である。例えば、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズは、直径５０〜２００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される複数のタンパク質ナノゲルは、同様の乾燥サイズのものである（例えば、ナノゲルの７０％が互いの直径の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または１００％以内であり、動的光散乱によって測定した場合に０．３５未満の多分散指数を有する場合）。
いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的サイズは、直径１５０ｎｍ未満である。例えば、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的サイズは、直径５０〜１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される複数のタンパク質ナノゲルは、同様の流体力学的サイズのものである（例えば、ナノゲルの７０％が互いの直径の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または１００％以内であり、動的光散乱によって測定した場合に０．３５未満の多分散指数を有する場合）。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、乾燥固体形態、例えば凍結乾燥形態で提供される。他の実施形態では、ナノ粒子は、水和形態、例えば水溶液または他の液体溶液で提供される。他の実施形態では、ナノ粒子は、凍結形態で提供される。
いくつかの実施形態では、生理学的条件下で、リンカーが分解し、インタクトな生物学的に活性なタンパク質を放出するように、ナノ粒子のタンパク質は、分解性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）によって互いに可逆的に連結される。他の実施形態では、生理学的条件下で、リンカーが分解し、インタクトな生物学的に活性なタンパク質を放出するように、ナノ粒子のタンパク質は、分解性リンカーによって官能基に可逆的に連結される。各場合では、タンパク質は、下記のように可逆的に改変されると考えられる。
「別のタンパク質に可逆的に連結された」タンパク質は、本明細書では、分解性リンカーによって別のタンパク質に付着された（例えば、共有結合的に付着された）タンパク質を指す。このようなタンパク質は、分解性リンカーによって互いに連結される（例えば、架橋される）と考えられる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノゲル）は、単一の（例えば、単一タイプの）生物学的に活性なタンパク質（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−Ｆｃ、ＩＬ−１５Ｆａｂ断片、ＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃ、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、ｓｃＦｖ断片またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片など）を含有し、他の実施形態では、ナノ粒子は、１つより多くの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多くの）生物学的に活性なタンパク質（例えば、異なるタンパク質の組み合わせ、例えばＩＬ−２およびＩＬ−１５（またはＩＬ−１５ＳＡまたはＩＬ−１５およびＩＬ−２１）を含有する。例えば、タンパク質ナノゲルは、タンパク質Ａがタンパク質Ａに連結された、タンパク質Ａがタンパク質Ｂに連結された、および／またはタンパク質Ｂがタンパク質Ｂに連結されたタンパク質Ａとタンパク質Ｂとの組み合わせを含有し得る。
「官能基に可逆的に連結された」タンパク質または「可逆的に改変された」タンパク質は、本明細書では、分解性リンカーによって官能基に付着された（例えば、共有結合的に付着された）タンパク質を指す。このようなタンパク質は、本明細書では「タンパク質コンジュゲート」または「可逆的に改変されたタンパク質コンジュゲート」と称され得る−これらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る。タンパク質およびポリマーはそれぞれ、可逆的リンカー（例えば、分解性リンカー、例えばジスルフィドリンカー）によってタンパク質が連結され得る官能基を含有すると理解すべきである。本明細書で提供されるタンパク質コンジュゲートおよび可逆的に改変されたタンパク質の例としては、限定されないが、別のタンパク質に（例えば、分解性リンカーによって）可逆的に連結されたタンパク質、ポリマーに可逆的に連結されたタンパク質、および別の官能基に可逆的に連結されたタンパク質が挙げられる。「タンパク質」という用語は、融合タンパク質を含むと理解すべきである。
分解性リンカー
本明細書に記載されるナノ粒子のための適切な分解性リンカー、例えば架橋剤は、例えば、還元的生理学的環境に対して感受性のフレキシブルなジスルフィド含有リンカー、または酸性的生理学的環境（ｐＨ＜７、例えば４〜５、５〜６または６〜７未満、例えば６．９のｐＨ）に対して感受性の加水分解性リンカー、または生物学的媒体中に存在する１つもしくはそれより多くの酵素、例えば腫瘍微小環境中のプロテアーゼ、例えば腫瘍微小環境中もしくは炎症組織中に存在するマトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）またはマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９））に対して感受性のプロテアーゼ感受性リンカーによって互いに接続された２つのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を含有し得る。還元的生理学的環境に対して感受性の架橋剤は、例えば、タンパク質を高密度タンパク質ナノゲルに架橋するＮＨＳ基の存在によって、タンパク質上のアミン基と反応するジスルフィド含有リンカーを有する架橋剤である。本明細書の実施例で使用した架橋剤は、ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］ジスルフィドを含む。
いくつかの実施形態では、分解性リンカーは、少なくとも１つのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。いくつかの実施形態では、分解性リンカーは、レドックス応答性リンカーである。いくつかの実施形態では、レドックス応答性リンカーは、ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される分解性リンカーは、少なくとも１つのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（これは、タンパク質を実質的に変性させずに、中性ｐＨ（例えば、約６〜約８または約７）でタンパク質と反応することができる）を含む。いくつかの実施形態では、分解性リンカーは、「レドックス応答性」リンカー（これは、それらが、還元剤（例えば、グルタチオン、ＧＳＨ）の存在下、生理学的条件（例えば、２０〜４０℃および／またはｐＨ４〜８）下で分解し、それにより、それが可逆的に連結された化合物からインタクトなタンパク質を放出することを意味する）である。本開示にしたがって使用するための分解性リンカーの例は、以下のものである：
式Ｉのリンカーは、還元剤の存在下で切断されるジスルフィドを含有する。例えば、生理学的条件下では、式Ｉのリンカーのジスルフィド結合は、グルタチオンによって切断される。
タンパク質は、任意の末端または内部−ＮＨ２官能基（例えば、リジンの側鎖）によって、分解性リンカーに連結され得る（例えば、共有結合的に連結され得る）。したがって、式Ｉの分解性リンカーによるタンパク質の可逆的改変中に形成される中間体種は、以下のとおりである：
式ＩＩＩ：
を含む可逆的に改変されたタンパク質コンジュゲートも本明細書で提供される。
リンカーは、アミン基、例えば末端アミンまたは内部アミンにおいて、目的のタンパク質にコンジュゲートされ得る。内部アミンとしては、側鎖アミン、例えばリジンアミンが挙げられる。
本開示はさらに、式ＩＩＩ：
を含むタンパク質コンジュゲートを提供し、タンパク質は、サイトカイン分子、例えばＩＬ−２またはＩＬ−１５分子などである。
高い取り込み効率（例えば、＞約９０％）および高いタンパク質薬物ローディング効率（例えば、＞約８０％）を有するシリカ系ナノ粒子は、シランで可逆的に改変されるタンパク質の重合によって形成される。したがって、式ＩＩＩのタンパク質コンジュゲートと架橋剤、例えばシラン−ＰＥＧ−シランポリマーなどとの重合によって形成されたナノ粒子が本明細書で提供される。
他の実施形態では、タンパク質は、酵素感受性リンカーによって連結され得る。実施形態では、リンカーは、酵素（例えば、プロテアーゼまたはエステラーゼ）の作用によって分解または加水分解される。いくつかの実施形態では、リンカーは、マトリクスメタロプロテアーゼであるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｄ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｋ、ＣＡＴＨＥＰＳＩＮ Ｓ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、またはＴＡＣＥから選択される酵素によって切断、例えば、活性化される基質ペプチドを含む。ある実施形態では、リンカーとして、米国特許出願第２０１５／００８７８１０号、米国特許第８，５４１，２０３号、米国特許第８，５８０，２４４号に開示される基質配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、以下の文献：ｖａｎ Ｋｅｍｐｅｎら、Ｅｕｒ Ｃａｎｃｅｒ（２００６）４２：７２８−７３４；Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ、Ｌ．Ｒ．ら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２０１３）５：２０７；Ｒｉｃｅ、Ｊ．Ｊ． ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ（２００６）１５：８２５−８３６；Ｂｏｕｌｗａｒｅ，Ｋ．Ｔ．およびＤａｕｇｈｅｒｔｙ、Ｐ．Ｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００６）１０３：７５８３−７５８８；およびＥｃｋｈａｒｄ，Ｕら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ（２０１５）ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｍａｔｂｉｏ．２０１５．０９．００３（ｅｐｕｂ）の１つに開示される配列を含む。本明細書において参照される刊行物のいずれの内容も、本明細書によって明示的に参考として援用される。
ナノ粒子の他の態様および実施形態は、本明細書でさらに提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される可逆的に改変されたタンパク質は、限定されないが、例えば国際公開第２０１５／０４８４９８号に記載されているように、タンパク質−親水性ポリマーコンジュゲート（例えば、ＰＥＧで可逆的に改変された）タンパク質−疎水性ポリマーコンジュゲート（例えば、可逆的に改変されたＰＬＡまたはＰＬＧＡ）、バルク架橋タンパク質ヒドロゲル、架橋タンパク質ナノゲル粒子、異なるシェル材料（例えば、シリカ）を有するタンパク質ナノカプセル、タンパク質コンジュゲートナノ粒子（例えば、リポソーム、ミセル、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子）を含む様々なナノ粒子に形成され得るかまたは自己集合し得る。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように互いに架橋されたタンパク質は、タンパク質ナノ粒子に形成され得るかまたは自己集合し得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質ナノ粒子（例えば、タンパク質−ポリマーナノゲルを含むタンパク質ナノゲル）は、担体タンパク質または他の担体分子を含有する。担体タンパク質は、典型的には、異なる分子の拡散および／または輸送を促進し、ナノ粒子の安定性を増加させ得、および／または細胞表面上のナノ粒子の安定性を増加させ得、および／または細胞表面に対するナノ粒子の親和性を増加させる。本明細書で使用される場合、「担体タンパク質」という用語は、タンパク質ナノ粒子の生物学的に活性なタンパク質に悪影響を及ぼさないタンパク質を指すと理解すべきである。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、不活性タンパク質である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質または担体分子は、アルブミン、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。したがって、いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、生物学的に活性ではない。
いくつかの実施形態では、単分散した複数の生物学的に活性なタンパク質−ポリマー粒子、例えばナノ粒子、例えばナノゲルを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ナノゲルのタンパク質は、分解性リンカーによって互いに可逆的および共有結合的に架橋され、ナノゲルのタンパク質は、ポリマーに架橋される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ナノゲルの表面に架橋される（したがって、表面にコンジュゲートされると考えられる）。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノゲル）は、（ａ）分解性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）によって互いに可逆的および共有結合的に架橋された１つまたはそれより多くの生物学的に活性なタンパク質と、（ｂ）ナノゲルの表面露出タンパク質に架橋された（例えば、分解性リンカーによって可逆的および共有結合的に架橋された）ポリマーとを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。いくつかの実施形態では、互いに架橋されたタンパク質の重量パーセントは、ナノゲルの７５％ｗ／ｗ超（例えば、８０％、８５％または９０％ｗ／ｗ超）である。
ナノゲルが互いに同様のサイズ（例えば、直径）を有し、例えば、動的光散乱によって測定した場合の多分散指数が０．３５未満、より好ましくは０．３未満、例えば０．２５未満または０．２未満である場合、複数のナノゲルは、組成物（例えば、水性または他の液体組成物）中に「単分散」していると考えられる。複数のナノゲル間のサイズの変動が５％〜１０％以下である場合、複数のナノゲルは、互いに同じサイズを有すると考えられ得る。
本開示の他の態様は、分解性リンカーによって互いに可逆的および共有結合的に架橋されたポリマーおよび少なくとも７５％（例えば、約８０％）ｗ／ｗのタンパク質を含むナノゲルを提供する。いくつかの実施形態では、分解性リンカーは、例えば、レドックス応答性リンカー、例えばジスルフィドリンカー（例えば、式Ｉ）である。
本開示のさらに他の態様は、複数の生物学的に活性なタンパク質ナノゲルを生産する方法であって、（ａ）分解性リンカーによってタンパク質を互いに可逆的共有結合的に架橋することを可能にする条件下で、タンパク質と分解性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）とを接触させ、それにより、複数のタンパク質ナノゲルを生産する工程、および（ｂ）前記タンパク質ナノゲルのタンパク質へのポリマーの架橋を可能にする条件下で、前記タンパク質ナノゲルとポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）とを接触させ、それにより、複数の生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルを生産する工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、（ａ）の条件は、水性緩衝液中で、タンパク質と分解性リンカーとを４℃〜２５℃の温度で接触させることを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）の条件は、水性緩衝液中で、タンパク質と分解性リンカーとを３０分間〜１時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）の条件は、水性緩衝液中で、タンパク質ナノゲルとポリマーとを４℃〜２５℃の温度で接触させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）の条件は、水性緩衝液中で、タンパク質ナノゲルとポリマーとを３０分間〜１時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）の条件は、タンパク質と分解性リンカーとを３０℃超の温度で接触させることを含まない。いくつかの実施形態では、（ｂ）の条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーとを３０℃超の温度で接触させることを含まない。
いくつかの実施形態では、（ａ）の条件は、有機溶媒（例えば、アルコール）中で、タンパク質と分解性リンカーとを接触させることを含まない。いくつかの実施形態では、（ｂ）の条件は、有機溶媒中で、タンパク質ナノゲルとポリマーとを接触させることを含まない。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、成長因子、抗体または抗原である。例えば、タンパク質は、本明細書に記載のサイトカイン分子であり得る。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２分子、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃである。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＳＡである。
いくつかの実施形態では、分解性リンカーは、レドックス応答性リンカーである。いくつかの実施形態では、レドックス応答性リンカーは、ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、分解性リンカーは、式Ｉを含むかまたは式Ｉからなる。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、親水性ポリマーである。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。例えば、親水性ポリマーは、４アームＰＥＧ−ＮＨ２ポリマーであり得る。
いくつかの実施形態では、水性緩衝液中のタンパク質の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬ）である。
いくつかの実施形態では、複数の生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルは、単分散した複数の生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルである。
いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルは、アルブミンを含まない。
いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質（例えば、生物学的に活性なタンパク質、架橋タンパク質）の重量パーセントは、少なくとも７５％である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセントは、少なくとも８０％である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセントは、少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセントは、少なくとも９０％である。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、生理学的条件下で、ナノゲルからそのネイティブなコンフォメーションで放出され、生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、放出されたタンパク質の比活性は、分解性リンカーによってそれが別のタンパク質に架橋される前のタンパク質の比活性の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）である。
本開示のいくつかの態様は、分解性リンカーによって重合性官能基に可逆的に連結されたタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、本明細書では可逆的に改変されたタンパク質であると考えられる。
いくつかの実施形態では、重合性官能基は、シランおよび／または架橋性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、架橋性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸および／またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分解性リンカーによってシランに可逆的に連結される。
本開示の他の態様は、本明細書に記載されるいずれかの複数の可逆的に改変されたタンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、このような複数の可逆的に改変されたタンパク質は、架橋される。
本開示のさらに他の実施形態は、ポリマーと、分解性リンカーによって重合性官能基に可逆的に連結された少なくとも５０％ｗ／ｗのタンパク質とを含むナノ粒子を提供する。「ｗ／ｗ」は、本明細書では、ナノ粒子（例えば、ナノゲル）の重量に対するタンパク質の重量を意味する。本明細書で使用される場合、「重合性官能基」は、化学反応してポリマー鎖またはネットワークを形成し得る原子および結合の基を指す。「ポリマー」は、反復単位または異なる反復単位の混合物の鎖またはネットワークを指す。本明細書で使用される場合、ポリマーはそれ自体が官能基である。本開示にしたがって使用するための重合性官能基の例としては、限定されないが、シラン、エチレンオキシド、乳酸、ラクチド、グリコール酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、シリカ、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリグルタミン酸、ポリリジン、シクロデキストリンおよびデキストラン・キトサンが挙げられる。他の重合性官能基が企図され、本開示にしたがって使用し得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ポリマー」は、タンパク質ではない（非タンパク質である）、ペプチドではない（非ペプチドである）またはアミノ酸ではない（非アミノ酸である）と理解すべきである。
「ポリマー」という用語は、「コポリマー」を包含する。すなわち、ポリマーは、短いポリマーまたはコポリマーを含む異なる官能基の混合物（例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン）を含み得る。官能基は、典型的には、タンパク質適合性中性条件下で重合される。したがって、いくつかの実施形態では、官能基の重合は、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の少なくとも部分的に水性の溶液中で起こる。例えば、官能基の重合は、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７、ｐＨ７．５またはｐＨ８で起こり得る。いくつかの実施形態では、官能基の重合は、約ｐＨ７で起こる。
いくつかの実施形態では、重合反応は、フッ化ナトリウム、フッ化カリウムまたは任意の他の可溶性フッ化物によって触媒される。
タンパク質に可逆的に連結され得、および／またはナノ粒子（例えば、ナノカプセル、ナノゲル、ヒドロゲル）の形成に使用され得る例示的なポリマーとしては、限定されないが、脂肪族ポリエステル、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）およびポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）および天然ポリマー、例えばアルギネートおよび他のポリサッカライド（デキストランおよびセルロースを含む）、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化および当業者によってルーチンに行なわれる他の改変を含む）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質、それらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。一般に、これらの物質は、インビボで酵素加水分解または水への曝露によって、表面浸食またはバルク浸食によって分解する。他のポリマーが企図され、本開示にしたがって使用され得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール−ｂ−ポリリジン（ＰＥＧ−ＰＬＬ）および／またはポリエチレングリコール−ｂ−ポリアルギニン（ＰＥＧ−ＰＡｒｇ）に可逆的に連結される。
本開示のいくつかの実施形態は、それらの表面上にポリカチオンを含むナノ粒子（例えば、ナノゲル）を伴う。ポリカチオンは、いくつかの部位に正電荷を有する分子または化学錯体である。一般に、ポリカチオンは、全体的な正電荷を有する。本開示にしたがって使用するためのポリカチオンの例としては、限定されないが、ポリリジン（ポリ−Ｌ−リジンおよび／またはポリ−Ｄ−リジン）、ポリ（アルギニン酸グリセリルコハク酸）（ＰＡＧＳ、アルギニン系ポリマー）、ポリエチレンイミン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、硫酸プロタミン、ポリエチレングリコール−ｂ−ポリリジン（ＰＥＧ−ＰＬＬ）またはポリエチレングリコール−ｇ−ポリリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、ナノゲルの表面に追加される。いくつかの実施形態では、ポリカチオン（例えば、ポリエチレングリコール−ｂ−ポリリジンまたはＰＥＧ−ＰＬＬ）は、ナノゲルの表面に追加される。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、ポリエチレングリコール−ｂ−ポリリジンである。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、抗ＣＤ４５抗体と共にまたは抗ＣＤ４５抗体なしでナノゲルに追加される。
実施形態では、ナノ粒子は、ｐｏｌｙＫ３０を含む。実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール−ｂ−ポリリジン（ＰＥＧ−ＰＬＬ）またはポリエチレングリコール−ｂ−ポリアルギニン（ＰＥＧ−ＰＡｒｇ）を含む。実施形態では、ナノ粒子は、ｐｏｌｙＫ２００を含む。
実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、ポリリジン、例えば、ｐｏｌｙＫ３０またはｐｏｌｙＫ２００を含む。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジンである。ある実施形態では、ポリリジンは、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、または４００〜５００アミノ酸の平均長を有する。
ある実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ある実施形態では、ＰＥＧは、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、または９〜１０ｋＤの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ５ｋ）と、ポリリジン、例えばｐｏｌｙＫ３０またはｐｏｌｙＫ２００とを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む。実施形態では、カチオン性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０またはＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ２００を含む。
理論に縛られるものではないが、いくつかの実施形態では、（例えば、１０〜１５０、２０〜１００、２０〜８０、２０〜６０、２０〜４０または約３０アミノ酸の平均長を有する）低分子量ポリリジンを含むナノ粒子は、（例えば、約２００アミノ酸の平均長を有する）高分子量ポリリジンを含むナノ粒子よりも優れた特性を示す。優れた特性は、例えば、低い毒性、低い凝集または高い細胞ローディングまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。
実施形態では、低分子量ポリリジンを含むナノ粒子は、例えば、凍結および融解後に、例えば実施例２３の方法を使用して生Ｔ細胞の数を定量することによってアッセイした場合に、Ｔ細胞に対する低い毒性を示す。実施形態では、低い毒性は、凍結および融解後に、少なくとも１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍または５倍拡大する細胞を含む。
実施形態では、低分子量ポリリジンを含むナノ粒子は、例えば、実施例１に記載されているように、例えば動的光散乱によって測定した場合に、低い凝集を示す。実施形態では、低い凝集は、約８０ｎｍ（例えば、７０〜９０ｎｍ、６０〜１００ｎｍまたは５０〜１５０ｎｍ）のサイズを有するナノ粒子の集団を含む。
実施形態では、低分子量ポリリジンを含むナノ粒子は、例えば、実施例１８に記載されているように、活性化ナイーブＴ細胞上にロードされているナノ粒子の平均蛍光強度（ＭＦＵ）によって測定した場合に、高い細胞ローディングを示す。実施形態では、高い細胞ローディングは、ｐｏｌｙＫ２００を有する以外は同様の対照ナノ粒子よりも少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、２００または５００倍大きいＭＦＵを含む。
他の実施形態では、タンパク質は、疎水性ポリマー、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）および／またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などに可逆的に連結される。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質−疎水性ポリマーコンジュゲートは、ナノ粒子に自己集合し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質コンジュゲートは、例えば、国際公開第２０１５／０４８４９８号および国際公開第２０１７／０２７８４３号に記載されているように、ヒドロゲルネットワーク、ナノゲル粒子またはタンパク質ナノゲル（これらはすべて、本明細書では「ナノ粒子」とみなされる）を形成するように架橋され得る。
いくつかの実施形態では、重合性官能基は、シランおよび／または架橋性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、架橋性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸および／またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、重合性官能基に可逆的に連結された少なくとも７５％ｗ／ｗのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、重合性官能基に可逆的に連結された少なくとも８０％ｗ／ｗのタンパク質を含む。重合性官能基に可逆的に連結された約５０％ｗ／ｗ〜約９０％ｗ／ｗのタンパク質を含むナノ粒子も本明細書で企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、重合性官能基に可逆的に連結された約５０％ｗ／ｗ、約５５％ｗ／ｗ、約６０％ｗ／ｗ、約６５％ｗ／ｗ、約７０％ｗ／ｗ、約７５％ｗ／ｗ、約８０％ｗ／ｗ、約８５％ｗ／ｗまたは約９０％ｗ／ｗのタンパク質を有し得る。
本開示のさらに他の態様は、ナノ粒子を生産する方法であって、分解性リンカーおよび重合性官能基でタンパク質を改変する工程、ならびに前記重合性官能基を架橋剤および可溶性フッ化物と重合する工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、重合性官能基は、シランおよび／または架橋性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、架橋性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸および／またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）を含む。
いくつかの実施形態では、可溶性フッ化物は、フッ化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、可溶性フッ化物は、フッ化カリウムである。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、それらの表面上に１つまたはそれより多くの反応基を含む。実施形態では、それらの外面上の１つまたはそれより多くの反応基は、有核細胞（例えば、Ｔ細胞）上の反応基と反応し得る。例示的なナノ粒子反応基としては、限定されないが、チオール反応性マレイミド頭部基、ハロアセチル（例えば、ヨードアセチル）基、イミドエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ピリジルジスルフィド基などが挙げられる。これらの反応基は、有核細胞表面上の基と反応して、ナノ粒子は、細胞表面に結合される。実施形態では、表面がこのように改変されると、ナノ粒子は、「相補的」反応基（すなわち、ナノ粒子のものと反応する反応基）を有する特定の担体細胞と共に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、細胞表面を構成する脂質二重層に組み込まれないであろう。典型的には、ナノ粒子は、有核細胞によって有意に貪食（または、実質的に取り入れ）されないであろう。
いくつかの実施形態では、反応基は、マレイミド、ローダミンまたはＩＲ７８３反応基である。
標的粒子
いくつかの実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、標的化部分、例えば親和性リガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、粒子の表面上にある。いくつかの実施形態では、標的化部分は、リガンドまたは抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、免疫細胞に特異的な抗体分子、例えばＴ細胞表面部分を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ナノ粒子それ自体は、有核細胞に単に結合することによって、有核細胞の活性化を刺激しない。いくつかの実施形態では、標的化部分は、有核細胞の表面安定性を増加させる、例えば標的タンパク質の取り入れを減少させる。しかしながら、他の実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に結合することによって、有核細胞の活性化を刺激する（例えば、ナノ粒子の結合は細胞表面部分の架橋をもたらし、これが有核細胞を活性化する）。例示的な標的化部分としては、限定されないが、親和性リガンド、例えばＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２に対する抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的化部分（例えば、抗体分子）は、チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＣＴＬＡ−４．に結合する。実施形態では、チェックポイント阻害剤は、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞上に存在する。
ナノ粒子は、抗ＣＤ４５抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４５抗体は、ヒト抗ＣＤ４５抗体またはヒト化抗ＣＤ４５抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４５抗体は、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗ＣＤ４５抗体は、ＢＣ８（ＡＣＣＴ：ＨＢ−１０５０７）、４Ｂ２、９．４（ＡＴＴＣ：ＨＢ−１０５０８）またはＧＡＰ８．３（ＡＴＴＣ：ＨＢ−１２）である。したがって、いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノゲル）は、抗ＣＤ４５抗体に連結される。いくつかの実施形態では、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−ＳＡまたはそれらの組み合わせ）を含むタンパク質ナノゲルは、抗ＣＤ４５抗体に連結される。いくつかの実施形態では、抗体は細胞表面受容体に結合し、抗体（例えば、抗ＣＤ４５抗体）の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）は、細胞の表面上に少なくとも２４時間（例えば、少なくとも３６時間または少なくとも４８時間）残る。いくつかの実施形態では、抗体（例えば、抗ＣＤ４５抗体）は、例えば表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、１ｕＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭまたは１ｆＭまたはそれを超える親和性で、ヒトＣＤ４５に結合する。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＰＤ−１に結合する。例えば、ピジリズマブおよび他の抗ＰＤ−１抗体は、Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｊら、（２０１１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ３４（５）：４０９−１８、ＵＳ７，６９５，７１５、ＵＳ７，３３２，５８２およびＵＳ８，６８６，１１９（これらは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。ＭＥＤＩ０６８０および他の抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ９，２０５，１４８およびＷＯ２０１２／１４５４９３（これらは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。さらなる抗ＰＤ−１抗体として、例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７ ＷＯ２０１１／０６６３４２、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１６／０９２４１９、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１４／２０９８０４、ＷＯ２０１５／２００１１９、ＵＳ８，７３５，５５３、ＵＳ７，４８８，８０２、ＵＳ８，９２７，６９７、ＵＳ８，９９３，７３１、およびＵＳ９，１０２，７２７に記載のものが挙げられ、それらの全体が参考として援用される。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＰＤ−Ｌ１に結合する。例えば、アテゾリズマブおよび他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＵＳ８，２１７，１４９（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。アベルマブおよび他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＷＯ２０１３／０７９１７４（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。デュルバルマブおよび他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＵＳ８，７７９，１０８（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。ＢＭＳ−９３６５５９および他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＵＳ７，９４３，７４３およびＷＯ２０１５／０８１１５８（これらは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。さらなる抗ＰＤ−Ｌ１抗体として、例えば、ＷＯ２０１５／１８１３４２、ＷＯ２０１４／１０００７９、ＷＯ２０１６／０００６１９、ＷＯ２０１４／０２２７５８、ＷＯ２０１４／０５５８９７、ＷＯ２０１５／０６１６６８、ＷＯ２０１３／０７９１７４、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８０５、ＷＯ２０１５／１０９１２４、ＷＯ２０１５／１９５１６３、ＵＳ８，１６８，１７９、ＵＳ８，５５２，１５４、ＵＳ８，４６０，９２７、およびＵＳ９，１７５，０８２に記載のものが挙げられ、それらの全体が参考として援用される。
いくつかの実施形態では、標的化部分はＬＡＧ−３に結合する。ＬＡＧ−３抗体は、例えば、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、ＴＳＲ−０３３（Ｔｅｓａｒｏ）、ＭＫ−４２８０（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、またはＲＥＧＮ３７６７（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）から選択され得る。ＩＭＰ７３１および他の抗ＬＡＧ−３抗体は、ＷＯ２００８／１３２６０１およびＵＳ９，２４４，０５９に開示されており、それらの全体が参考として援用される。さらなる抗ＬＡＧ−３抗体として、例えば、ＷＯ２００８／１３２６０１、ＷＯ２０１０／０１９５７０、ＷＯ２０１４／１４０１８０、ＷＯ２０１５／１１６５３９、ＷＯ２０１５／２００１１９、ＷＯ２０１６／０２８６７２、ＵＳ９，２４４，０５９、ＵＳ９，５０５，８３９に記載のものが挙げられ、それらの全体が参考として援用される。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＴＩＭ−３に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３標的化部分は、ＭＧＢ４５３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＴＳＲ−０２２（Ｔｅｓａｒｏ）またはＬＹ３３２１３６７（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）から選択される。ＡＰＥ５１３７、ＡＰＥ５１２１および他の抗ＴＩＭ−３抗体は、ＷＯ２０１６／１６１２７０（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。さらなる抗ＴＩＭ−３抗体として、例えば、ＷＯ２０１６／１１１９４７、ＷＯ２０１６／０７１４４８、ＷＯ２０１６／１４４８０３、ＵＳ８，５５２，１５６、ＵＳ８，８４１，４１８、およびＵＳ９，１６３，０８７に記載のものが挙げられ、それらの全体が参考として援用される。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＣＴＬＡ−４に結合する。抗体イピリムマブおよび他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第６，９８４，７２０号（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。抗体トレメリムマブおよび他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第７，４１１，０５７号（これは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。
ナノ粒子は、共有結合的にコンジュゲートされ得る（付着または結合され得る。これらは、本明細書で互換的に使用される用語である）か、またはそれらは、有核細胞に非共有結合的にコンジュゲートされ得る。共有結合的コンジュゲーションは、典型的には、ナノ粒子と有核細胞との間のより安定な（したがって、より長期の）会合を提供する。いくつかの実施形態では、共有結合的コンジュゲーションはまた、インビボにおける薬剤の安定性およびしたがってより持続的な局所送達を提供し得る。非共有結合的コンジュゲーションとしては、限定されないが、細胞表面および／または細胞膜の脂質二重層への吸収が挙げられる。
いくつかの場合では、共有結合的付着は、最初に有核細胞をマレイミド担持ナノ粒子と共にインキュベートして細胞表面へのコンジュゲーションを可能にし、続いて、チオール末端ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）によってインサイチューでペグ化して粒子の残存マレイミド基をキャッピングし、細胞の粒子媒介性架橋を回避する二段階プロセスで達成され得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、生理学的条件下で、ナノ粒子からそのネイティブなコンフォメーションで放出され、生物学的に活性である。
有核細胞
有核細胞は、ナノ粒子がカップリングされた、例えば共有結合的または非共有結合的にカップリングされた細胞であり、例えばそれにより有核細胞−ナノ粒子複合体が形成される。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質、例えば本明細書に記載されるサイトカイン分子を含む。いくつかの実施形態では、有核細胞（例えば、有核細胞の集団）は、本明細書に開示されるナノ粒子または複数のナノ粒子に共有結合的にカップリングされる。実施形態では、有核細胞（例えば、有核細胞の集団）は、例えば静電相互作用によって、本明細書に開示されるナノ粒子に非共有結合的にカップリングされる。
いくつかの実施形態では、有核細胞は、被験体からの単離または精製後に、例えば細胞の保存（凍結保存を含む）または細胞の輸送前に、有核細胞と、本明細書に開示されるナノ粒子とを接触させることによって改変される。いくつかの実施形態では、接触工程は、細胞を凍結する前に行われる。他の実施形態では、接触工程は、細胞を融解した後に、例えば細胞の投与前に行われる。
一実施形態では、有核細胞は、リンパ球を含む有核細胞を含む。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、有核細胞は、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３ Ｔ細胞であり得る。他の適切な細胞としては、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および造血前駆細胞（限定されないが、マウス系統陰性、Ｓｃａ−１陽性およびｃ−ｋｉｔ陽性細胞ならびにそれらのヒトカウンターパートを含む）が挙げられる。相当レベルの遊離チオール（−ＳＨ）基が、Ｔ細胞、Ｂ細胞および造血前駆細胞の表面上に存在し、それにより、このような細胞へのナノカプセルナノ粒子のコンジュゲーションを容易にする。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に連結される。いくつかの実施形態では、有核細胞は、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。
本開示のいくつかの実施形態は、単離または精製された、例えば実質的に精製された有核細胞を指す。いくつかの実施形態では、単離された有核細胞は、それらが天然に存在する（すなわち、それらがインビボで存在しない）環境から分離された細胞である。インビトロのＴ細胞は、単離された細胞の例である。有核細胞は、それらのインビボ環境から単離され、本開示のナノ粒子にコンジュゲートされ、次いで、インビボで再導入され得ると理解すべきである。有核細胞は、それらのインビボ環境から単離され、本開示のナノ粒子と会合またはコンジュゲートされ、有核細胞−ナノ粒子複合体は、複合体の凍結を可能にするための成分と混合され、融解されて、例えばインビボで患者に再導入され得る。このような有核細胞は依然として、単離された細胞であるとみなされる。
いくつかの実施形態では、有核細胞は、被験体、例えば免疫療法を必要とする患者から例えば直接的または間接的に取得される。有核細胞が免疫細胞である実施形態では、免疫細胞、例えばＴ細胞は、当業者に公知の多数の技術を使用して、血液、例えば被験体から収集された血液サンプルから得られ得る。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球、例えばＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含む。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、場合により、その後の処理工程のために、細胞を適切な緩衝液または培地に入れ得る。
いくつかの実施形態では、有核細胞は、限定されないが、共刺激分子または受容体（キメラ受容体を含む）を含む１つまたはそれより多くの因子を発現するように遺伝子操作され得る。他の実施形態では、有核細胞は、遺伝子操作されない。いくつかの実施形態では、有核細胞は、単離されたものおよび天然に存在するもの（すなわち、それらは、遺伝子操作または他の方法で操作されていない）。
いくつかの実施形態では、性質および機能に応じて、ナノ粒子とのコンジュゲーション前に、有核細胞（遺伝子操作有核細胞を含む）は操作される。しかしながら、ナノ粒子のコンジュゲーションを促進するために、有核細胞は表面改変されることを必要としない。実施形態のいくつかでは、代わりに、反応基または他の構成要素を細胞表面上に組み込まずに、有核細胞表面上に通常存在する反応基が使用される。その結果、ナノ粒子にコンジュゲートするために、このような有核細胞は、とりわけそれらの表面上に外因性エンティティ、例えば抗体または抗体断片の存在を必要としない。
このような操作はまた、Ｔ細胞に対してルーチンに実施されるように、有核細胞の活性化を伴い得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子との混合前に、有核細胞は、インビトロで拡大および／または活性化され得る（または刺激され得る。これらは、本明細書では互換的に使用される用語である）。拡大および活性化プロトコールは、有核細胞型に応じて変動するが、１つまたはそれより多くのサイトカインとのインキュベーション、１つまたはそれより多くの細胞型とのインキュベーションおよび１つまたはそれより多くの抗原とのインキュベーションを含み得る。有核細胞がＴ細胞である場合、活性化は、細胞表面受容体に対する抗体を含む様々なＴ細胞表面分子に対する抗体、例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８によって刺激し、続いて、Ｔ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニストおよび場合により共刺激分子、例えばＢ７、Ｂ７．２、ＣＤ４０などと共にインキュベートすることによって実施され得る。いくつかの実施形態では、有核細胞、より具体的にはＴ細胞は、それらの細胞表面上を外因性抗体でコーティングされない（すなわち、投与前に、細胞は、インビトロで抗体または抗体断片でコーティングされていない）。
拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）は、放射性標識ヌクレオチド、例えばトリチウム標識チミジンの取り込みを伴う増殖アッセイによって測定され得る。活性化は、とりわけ、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ガンマ−ＩＦＮ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＴＮＦの産生によって測定され得る。拡大および活性化を測定する他の方法は当技術分野で公知であり、フローサイトメトリーによってモニタリングされ得る細胞表面受容体に対する蛍光標識抗体、例えばＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、ＣＤ６９、ＣＤ１３４に対する抗体の使用が挙げられ、本開示にしたがって使用され得る。
有核細胞は、より小量で多数のこのような細胞を富化し、および／または組成物から他の潜在的に望ましくない細胞を除去するために選択され得る。選択は、例えば、カラムまたはプレートベースの富化プロトコールを含む陽性選択または陰性選択を伴い得る。
免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞は、被験体の末梢血から採取され得る。
造血前駆細胞は、限定されないが、臍帯血、骨髄、動員末梢血およびいくつかの場合では分化胚性幹細胞を含む多くの供給源から得られ得る。
造血前駆細胞は、当技術分野で特性評価されている。ヒトにおけるこのような細胞は、一般に、最小限にＣＤ３４＋表現型を有するが、それらはまた、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／ｎｅｇ、ＣＤ３３−および／またはｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋であり得る。それらはまた、系統特異的マーカーを発現しないと特性評価されている。それらは、アフィニティーカラム、磁気ビーズ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、それらのいくつかの組み合わせなどを使用して、骨髄、臍帯血または末梢血から採取され得る。これらの細胞は、移植されると１つまたはそれより多くの造血系統を再配置する能力を有する。好ましくは、これらの細胞は、１つより多くの系統、さらにより好ましくはすべての系統を再配置する。本明細書で使用される場合、系統の再配置または配置は、幹細胞の子孫が被験体におけるその系統の構成に寄与するような、１つまたはそれより多くの系統への幹細胞の分化を指す。しかしながら、全系統区画が移植細胞に由来する必要はないが、しかしながらいくつかの場合では、これが起こり得る。
単離された幹細胞は、限定されないが、細胞表面マーカーを含む１つまたはそれより多くのマーカーにしたがって、異種細胞集団を分画することによって得られ得る。
有核細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）であり得る。あるいは、それらは、非哺乳動物細胞であり得る。さらに他の実施形態では、有核細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。いくつかの細菌細胞型が特に興味深い。例えば、弱毒化ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、経口ワクチン送達用の候補ベクターとして研究中であり（Ｘｉａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２２２：１１７，２００８；およびＩｗｅａｌａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３（４）：２２５２，２００９）、操作された大腸菌は、酸素化不良の腫瘍に特異的にホーミングすることができることが示されている（Ｃｈｅｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４（５８０３）：１３０８，２００６）。細菌は、新たな投与様式および組織部位標的化可能性、例えば経口投与および治療薬を腸管および腸管関連リンパ系組織に標的化する能力を提供する。このような微生物ベクターは、既製の即時使用細胞−ナノ粒子系を作り出す点で、自己宿主細胞と比較して利益を提供し得る。微生物への粒子コンジュゲーションは、哺乳動物細胞について記載されているのと同じ一連の化学戦略を使用して達成され得る。いくつかの場合では、微生物の鞭毛コートの一過性除去（例えば、Ｒｏｓｕら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８８（１４）：５１９６，２００６に記載されている単純な機械的剪断による）は、微生物細胞体への粒子の最適コンジュゲーションを達成するために使用され得る。
ナノ粒子を作製する方法
ナノ粒子を生産する方法が本明細書で提供される。ナノ粒子の例は、タンパク質ナノゲル、例えば、インタクトな生物学的に活性なタンパク質を含有するが担体（例えば、アルブミン、ＢＳＡ）を含有しないタンパク質ナノゲルである。
いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質ナノゲルを生産する方法は、分解性リンカーによってタンパク質を互いに可逆的共有結合的に架橋することを可能にする条件下で、タンパク質と分解性リンカーとを接触させ、それにより、生物学的に活性なタンパク質ナノゲルを生産する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質ナノゲルのタンパク質へのポリマーの架橋を可能にする条件下で、タンパク質ナノゲルとポリマーとを接触させ、それにより、生物学的に活性なタンパク質−ポリマーナノゲルを生産する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、複数のタンパク質ナノゲルまたは複数のタンパク質−ポリマーナノゲルが生産される。
典型的には、分解性リンカーによってタンパク質を互いに可逆的共有結合的に架橋することを可能にする条件は、タンパク質と分解性リンカーとを４℃〜２５℃の温度（例えば、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃）で接触させることを含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で、タンパク質を分解性リンカーと共に４℃〜２５℃の温度（例えば、室温）でインキュベートする。いくつかの実施形態では、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で、タンパク質を分解性リンカーと共に２０℃、３０℃もしくは４０℃以下の温度または約３５〜４５℃の温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、分解性リンカーによってタンパク質を互いに可逆的共有結合的に架橋することを可能にする条件は、タンパク質と分解性リンカーとを３０分間〜２時間または３０分間〜１時間（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０分間）接触させることを含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で、タンパク質を分解性リンカーと共に３０分間〜２時間または３０分間〜１時間インキュベートする。
いくつかの実施形態では、水性緩衝液中のタンパク質の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬである。例えば、水性緩衝液中のタンパク質の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍＬ（タンパク質／水性緩衝液）であり得る。
いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質ナノゲルまたはタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセントは、少なくとも７５％ｗ／ｗである。例えば、生物学的に活性なタンパク質ナノゲルまたはタンパク質−ポリマーナノゲルにおけるタンパク質の重量パーセントは、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、または少なくとも９５％ｗ／ｗである。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質ナノゲルまたはタンパク質−ポリマーナノゲルにおけるタンパク質の重量パーセントは、７５％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗ、８０％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗ、または８５％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗである。
タンパク質ナノゲルのタンパク質へのポリマーの架橋を可能にする条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーとを４℃〜２５℃の温度（例えば、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃）で接触させることを含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で、タンパク質ナノゲルをポリマーと共に４℃〜２５℃の温度（例えば、室温）でインキュベートする。いくつかの実施形態では、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で、タンパク質ナノゲルをポリマーと共に３０℃以下の温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、タンパク質ナノゲルのタンパク質へのポリマーの架橋を可能にする条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーとを３０分間〜２時間または３０分間〜１時間（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０分間）接触させることを含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中で、タンパク質ナノゲルをポリマーと共に３０分間〜２時間または３０分間〜１時間インキュベートする。
本開示のナノ粒子を生産する他の方法は、分解性リンカーおよび重合性官能基でタンパク質を改変する工程、および前記重合性官能基を架橋剤および可溶性フッ化物と重合する工程を含み得る。
本開示のタンパク質は、例えば、分解性リンカー、例えばレドックス応答性リンカーで改変され得るか、またはそれにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、改変は、共有結合的改変であり得る。国際公開第２０１５／０４８４９８号の図３Ａには、タンパク質改変スキームの一例が説明されている。この例では、タンパク質は、分解性リンカーによってシランに共有結合的にコンジュゲートされる。
重合性官能基は、可溶性フッ化物触媒の存在下で、架橋剤と重合され得る。いくつかの実施形態では、架橋剤は、ポリマー（例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン）である。いくつかの実施形態では、可溶性フッ化物は、フッ化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、可溶性フッ化物は、フッ化カリウムである。
組成物
タンパク質ナノ粒子（例えば、有核細胞−ナノ粒子複合体）を含む医薬組成物を含む組成物が本明細書で提供される。組成物は、薬学的に許容され得る量および薬学的に許容され得る組成物で製剤化され得る。「薬学的に許容され得る」という用語は、活性成分（例えば、ナノ粒子の生物学的に活性なタンパク質）の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性物質を意味する。いくつかの実施形態では、このような組成物は、塩、緩衝剤、保存剤および場合により他の治療剤を含有し得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物はまた、適切な保存剤を含有し得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は単位用量形態で提供され、医薬分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。
いくつかの実施形態では、非経口投与に適切な医薬組成物は、ナノ粒子の滅菌水性または非水性調製物を含み、いくつかの実施形態では、これは、レシピエント被験体の血液と等張である。この調製物は、公知の方法によって製剤化され得る。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は滅菌のものであり得、有核細胞を含むまたは有核細胞を含まない有効量のナノ粒子（例えば、ナノゲル）を単独で、または重量単位もしくは体積単位で所望の応答をもたらすために別の薬剤と組み合わせて含有し得る。
使用
本開示のさらなる態様は、有核細胞の最適化生産の方法を提供する。実施形態では、有核細胞、例えば免疫細胞の機能は、１サイクルまたはそれより多くの凍結および／または融解後に促進される、例えば保存される。生産された有核細胞（例えば、本明細書に開示されるナノ粒子、例えば有核細胞−ナノ粒子複合体を含む）は融解され、被験体に投与され得る、例えば直接投与され得る。したがって、別の態様では、本明細書に開示される有核細胞の集団を被験体、例えばヒト被験体に投与する方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、被験体は、ヒト被験体である。被験体としては、動物、例えば家庭用ペット（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット）、家畜動物または飼育動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリおよび他の家禽）、ウマ、例えばサラブレッド、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ）なども挙げられる。いくつかの実施形態では、被験体は疾患を有するか、または疾患を有するリスクがある。いくつかの実施形態では、被験体は、患者、例えばヒト患者である。他の実施形態では、疾患は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、アレルギーもしくはアレルギー症状、喘息または心血管疾患である。実施形態では、被験体は、移植を必要とする。
本明細書の組成物（例えば、有核細胞組成物）が送達される被験体は、正常被験体または健常被験体であり得る。あるいは、それらは、診断され得る症状、または１つもしくはそれより多くの細胞の送達から利益を受け得る症状を有し得るか、またはそれを発症するリスクがあり得る。
このような症状としては、がん（例えば、固形腫瘍がん）、自己免疫障害、移植拒絶などが挙げられる。
実施形態では、がんは、血液がんである。実施形態では、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。例示的な血液がんとしては、限定されないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫または急性リンパ性白血病が挙げられる。実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）以外である。
実施形態では、がんは、固形がんである。例示的な固形がんとしては、限定されないが、卵巣がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、肛門部のがん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌腫、肝臓がん、肺の非小細胞癌腫、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、類表皮がん、頸部の癌腫、扁平上皮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、膣の癌腫、軟組織の肉腫、尿道のがん、外陰の癌腫、陰茎のがん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎盂の癌腫、脊髄腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記がんの転移巣またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、処置すべき被験体は、有核細胞、例えば免疫細胞が単離された被験体と同じものである。他の実施形態では、処置すべき被験体は、有核細胞、例えば免疫細胞が単離された被験体と異なるものである。実施形態では、両被験体は、同じタイプのがんを有するかまたは有していた。
実施形態では、有核細胞は、処置または予防すべき疾患に適切な方法で投与される。投与量および投与頻度は、患者の症状ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定されるであろう。適切な投与量は、臨床試験によって決定され得る。例えば、「有効量」または「治療量」が示される場合、投与すべき医薬組成物（または有核細胞）の正確な量は、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、被験体の年齢、体重および症状の個人差を考慮して、医師によって決定され得る。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、細胞１０４〜１０９個／体重ｋｇ、例えば細胞１０５〜１０６個／体重ｋｇ（これらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得る。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、これらの投与量で複数回投与され得る。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、免疫療法に記載されている注入技術を使用して投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。
以下に列挙されている段落では、本出願のさらなる態様および実施形態が本明細書で提供される。
１．有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも１つの薬剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、前記組成物は凍結されており、前記組成物が融解されると、前記薬剤は、場合により前記ナノ粒子から放出され、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を改善する、組成物。
２．有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、前記組成物の凍結調製物が融解されると、前記保存剤は、場合により前記ナノ粒子から放出され、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進し、例えば保存または増強し、前記保存剤は、
配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン、あるいは配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；ならびに
場合により、第２の異種ドメイン、例えば抗体分子、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ２断片もしくはｓｃＦｖ；重鎖抗体断片；Ｆｃ断片；またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばｓｄＡｂ（ナノボディ）断片
を含むポリペプチドと例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含み；
場合により、前記組成物の少なくとも一部は凍結されている、組成物。
３．前記組成物、例えば前記ナノ粒子および／または前記保存剤が、ＩＬ−１５受容体またはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含むＩＬ−１５複合体を含む、実施形態１に記載の組成物。
４．前記ＩＬ−１５分子が、ＩＬ−１５変異体、例えば１つまたはそれより多くのアミノ酸置換、例えば７２位の置換、例えばＮからＤへの置換を有するヒトＩＬ−１５ポリペプチドを含む、実施形態２または３に記載の組成物。
５．前記ＩＬ−１５分子が、配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、実施形態２〜４のいずれかに記載の組成物。
６．ＩＬ−１５受容体またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２〜５のいずれかに記載の組成物。
７．ＩＬ−１５受容体またはその断片を含む前記ポリペプチドが、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号７または配列番号８のもの）およびエフェクター弱体化Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば、配列番号１１のヒトＩｇＧ２ドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の異種ドメインを含む、実施形態２〜５のいずれかに記載の組成物。
８．前記保存剤が、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である、実施形態１〜７のいずれかに記載の組成物。
９．インターフェロンガンマ産生を促進する、実施形態１〜８のいずれかに記載の組成物。
１０．インターフェロンガンマ産生によって、活性化を測定する、実施形態１〜９のいずれかに記載の組成物。
１１．前記組成物が、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含む（例えば、前記媒体が前記化合物を含有する）、実施形態１〜１０のいずれかに記載の組成物。
１２．前記組成物が、凍結および融解中に前記細胞を保護する化合物を含む（例えば、前記媒体が含む）、実施形態１〜１１のいずれかに記載の組成物。
１３．前記ナノ粒子からの前記保存剤の放出が、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる、実施形態１〜１２のいずれかに記載の組成物。
１４．前記ナノ粒子が前記有核細胞の表面と会合している、実施形態１〜１３のいずれかに記載の組成物。
１５．前記有核細胞が、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）または造血幹細胞であるむ、実施形態１〜１４のいずれかに記載の組成物。
１６．前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって前記細胞表面と会合している、実施形態１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１７．前記ナノ粒子が少なくとも１つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、実施形態１〜１６のいずれかに記載の組成物。
１８．前記ナノ粒子が、前記有核細胞の例えば表面に共有結合的にコンジュゲートしている、実施形態１〜１７のいずれかに記載の組成物。
１９．前記ナノ粒子が、前記有核細胞に共有結合的にコンジュゲートしていない、実施形態１〜１７のいずれかに記載の組成物。
２０．前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載の組成物。
２１．前記ナノ粒子がリポソームを含む、実施形態１〜２０のいずれかに記載に記載の組成物。
２２．前記ナノ粒子がタンパク質ナノゲルを含む、実施形態１〜２１のいずれかに記載に記載の組成物。
２３．記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、実施形態１〜２２のいずれかに記載の組成物。
２４．前記ナノ粒子が、ＰＥＧ（例えば、約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ）およびポリリジン、（例えば、１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジン）を含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、実施形態１〜２３のいずれかに記載の組成物。
２５．溶液中もしくは前記細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ／または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物、例えばプロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む、実施形態１〜２４のいずれかに記載の組成物。
２６．サイトカイン分子、成長因子分子または共刺激分子を含む、実施形態１〜２５のいずれかに記載の組成物。
２７．サイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、またはそれらのバリアント、例えば、それらのスーパーアゴニストを含む第２の保存剤を含む、実施形態１〜２６のいずれかに記載の組成物。
２８．共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、前記共刺激分子が、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、実施形態１〜２７のいずれかに記載の組成物。
２９．前記ナノ粒子が、前記有核細胞による前記ナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む、実施形態１〜２８のいずれかに記載の組成物。
３０．前記ナノ粒子が、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む、実施形態１〜２９のいずれかに記載の組成物。
３１．配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む、実施形態１〜３０のいずれかに記載の組成物。
３２．配列番号１のＩＬ−１５ポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号７または配列番号８のｓｕｓｈｉドメインあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１１のＦｃドメインあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｕｓｈｉ−Ｆｃポリペプチド；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子
を含む、実施形態１〜３０のいずれかに記載の組成物。
３３．前記ナノゲルが高密度タンパク質構造（例えば、８０重量％超のタンパク質）であり、かつ／または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、実施形態１〜３２のいずれかに記載の組成物。
３４．前記ナノ粒子が、レドックスに対して感受性（ジスルフィド）またはｐＨに対して感受性（加水分解性基）または酵素に対して感受性（プロテアーゼ）である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、実施形態１〜３３のいずれかに記載の組成物。
３５．患者から単離されて凍結融解処理にさらに供された有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強するための方法であって、緩衝化水溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを保存または増強する少なくとも１つの薬剤を含むナノ粒子との組み合わせによって、前記有核細胞は改変され、前記改変有核細胞は凍結されており、融解されると、前記保存剤は、場合により前記ナノ粒子から放出され、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を改善する、方法。
３６．例えば有核細胞を凍結する前に有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強するための方法であって、前記有核細胞は患者から単離されており、それを、緩衝化水溶液と、例えば前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子と組み合わせることによって、前記有核細胞を改変する工程を含む、方法。
３７．有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを促進する、例えば増強するための方法であって、前記有核細胞は、患者から単離されており、緩衝化水溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子と組み合わせることによって改変されており、前記改変有核細胞を少なくとも１回の凍結融解サイクルに供する工程を含む、方法。
３８．有核細胞の凍結組成物を作製する方法であって、
有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、例えば前記有核細胞の凍結調製物が融解されると、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含む複数のナノ粒子とを含む非凍結組成物を提供する工程、
場合により、前記組成物が凍結するのに十分に前記組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の組成物を凍結する工程
を含む、方法。
３９．前記組成物の温度を０℃未満に低下させる、実施形態３８に記載の方法。
４０．前記組成物の温度を−１０℃未満に低下させる、実施形態３８または３９に記載の方法。
４１．有核細胞の前記凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持することを含む、実施形態３７〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．
提供する工程が、
前記有核細胞と、保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせること、および場合により、前記有核細胞と緩衝化水性媒体溶液とを組み合わせることを含む、実施形態３７〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．提供する工程が、別のエンティティから前記ナノ粒子を受け取ること、および前記ナノ粒子と前記有核細胞とを組み合わせることを含む、実施形態３７〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．提供する工程が、別のエンティティから有核細胞の非凍結組成物を受け取ることを含む、実施形態３７〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．有核細胞の前記凍結組成物を別のエンティティ、例えばヘルスケアプロバイダ、例えば病院、診療所または医院に提供または放出することを含む、実施形態３７〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．有核細胞の前記凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供することを含む、実施形態３７〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．前記組成物の凍結調製物が融解されると、前記保存剤が前記ナノ粒子から放出され、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する、実施形態３７〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．前記保存剤が、ＩＬ−１５ポリペプチド受容体アルファ断片；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、抗体分子、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、またはｓｃＦｖ；重鎖抗体断片；Ｆｃ断片；またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片を含む、実施形態３７〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．前記保存剤が、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である、実施形態３７〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．インターフェロンガンマ産生を促進する、実施形態３７〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．インターフェロンガンマ産生によって、活性化を測定する、実施形態５０に記載の方法。
５２．前記組成物が、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含む（例えば、前記媒体が前記化合物を含有する）、実施形態３７〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．前記媒体が、凍結および融解中に前記細胞を保護する化合物を含む、実施形態３７〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる、実施形態３７〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．ナノ粒子が前記有核細胞の表面と会合している、実施形態３７〜５４のいずれかに記載の方法。
５６．前記有核細胞が、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）または造血幹細胞を含む、実施形態３７〜５５のいずれかに記載の方法。
５７．前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって前記細胞表面と会合している、実施形態３７〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．前記ナノ粒子がリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、実施形態３７〜５７のいずれかに記載の方法。
５９．前記ナノ粒子が、前記有核細胞の例えば表面に共有結合的にコンジュゲートしている、実施形態３７〜５８のいずれかに記載の方法。
６０．前記ナノ粒子が、前記有核細胞に共有結合的にコンジュゲートしていない、実施形態３７〜５８のいずれかに記載の方法。
６１．前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、実施形態３７〜６０のいずれかに記載の方法。
６２．前記ナノ粒子がリポソームを含む、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記ナノ粒子がタンパク質ナノゲルを含む、実施形態６１に記載の方法。
６４．記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、実施形態３７〜６３のいずれかに記載の方法。
６５．前記ナノ粒子が、ＰＥＧ（例えば、約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ）およびポリリジン、（例えば、１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジン）を含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、実施形態３７〜６４のいずれかに記載の方法。
６６．前記組成物が、溶液中もしくは前記細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ／または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物、例えばプロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む、実施形態３７〜６５のいずれかに記載の方法。
６７．前記保存剤が、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である、実施形態３７〜６６のいずれかに記載の方法。
６８．前記保存剤が、
配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン、あるいは配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、抗体分子、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、またはｓｃＦｖ；重鎖抗体断片；Ｆｃ断片；またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片
を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む、実施形態３７〜６７のいずれかに記載の方法。
６９．前記保存剤が、サイトカイン分子、成長因子分子または共刺激分子を含む、実施形態３７〜６８のいずれかに記載の方法。
７０．前記保存剤が、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、またはバリアント、例えば、それらのスーパーアゴニストを含む、実施形態３７〜６９のいずれかに記載の方法。
７１．前記組成物が、共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、前記共刺激分子が、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、実施形態３７〜７０のいずれかに記載の方法。
７２．前記組成物、例えば前記ナノ粒子が、前記有核細胞による前記ナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む、実施形態３７〜７１のいずれかに記載の方法。
７３．前記組成物、例えば、前記ナノ粒子が、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む、実施形態３７〜７２のいずれかに記載の方法。
７４．前記ナノゲルが高密度タンパク質構造（例えば、８０重量％超のタンパク質）であり、かつ／または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、実施形態３７〜７３のいずれかに記載の方法。
７５．前記ナノ粒子が、レドックスに対して感受性（例えば、ジスルフィド）またはｐＨに対して感受性（例えば、加水分解性基）または酵素に対して感受性（例えば、プロテアーゼ）である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、実施形態３７〜７４のいずれかに記載の方法。
７６．前記ナノ粒子が、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む、実施形態３７〜７５のいずれかに記載の方法。
７７．有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、
有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の凍結組成物を提供する工程；および
有核細胞の前記凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の前記凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程を含む、方法。
７８．提供する工程が、別のエンティティ、例えば有核細胞の前記組成物を作製および／または凍結するエンティティから前記凍結組成物を受け取ることを含む、実施形態７７に記載の方法。
７９．提供する工程が、
前記有核細胞を、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子と組み合わせることを含む、実施形態７７に記載の方法。
８０．提供する工程が、別のエンティティから前記ナノ粒子を受け取ること、および前記ナノ粒子と前記有核細胞とを組み合わせることを含む、実施形態７７に記載の方法。
８１．有核細胞の前記凍結組成物を加温する前に、有核細胞の前記凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持することを含む、実施形態７７〜８０のいずれかに記載の方法。
８２．凍結組成物が融解されると、前記保存剤が前記ナノ粒子から放出され、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する、実施形態７７〜８１のいずれかに記載の方法。
８３．前記保存剤が、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である、実施形態７７〜８２のいずれかに記載の方法。
８４．インターフェロンガンマ産生を促進する、実施形態７７〜８３のいずれかに記載の方法。
８５．インターフェロンガンマ産生によって、活性化を測定する、実施形態８４に記載の方法。
８６．前記組成物が、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含む（例えば、前記媒体が前記化合物を含有する）、実施形態７７〜８５のいずれかに記載の方法。
８７．前記組成物（例えば、前記媒体）が、凍結および融解中に前記細胞を保護する化合物を含む、実施形態７７〜８６のいずれかに記載の方法。
８８．前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる、実施形態７７〜８７のいずれかに記載の方法。
８９．ナノ粒子が前記有核細胞の表面と会合している、実施形態７７〜８８のいずれかに記載の方法。
９０．前記有核細胞が、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）または造血幹細胞である、実施形態７７〜８９のいずれかに記載の方法。
９１．前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって前記細胞表面と会合している、実施形態７７〜９０のいずれかに記載の方法。
９２．前記ナノ粒子がリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、実施形態７７〜９１のいずれかに記載の方法。
９３．前記ナノ粒子が、前記有核細胞の例えば表面に共有結合的にコンジュゲートしている、実施形態７７〜９２のいずれかに記載の方法。
９４．前記ナノ粒子が、前記有核細胞に共有結合的にコンジュゲートしていない、実施形態７７〜９２のいずれかに記載の方法。
９５．前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、実施形態７７〜９４のいずれかに記載の方法。
９６．前記ナノ粒子がリポソームを含む、実施形態９５に記載の方法。
９７．前記ナノ粒子がタンパク質ナノゲルを含む、実施形態９５に記載の方法。
９８．記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、実施形態７７〜９７のいずれかに記載の方法。
９９．前記ナノ粒子が、ＰＥＧ（例えば、約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ）およびポリリジン、（例えば、１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジン）を含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、実施形態７７〜９８のいずれかに記載の方法。
１００．前記組成物が、溶液中もしくは前記細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ／または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物、例えばプロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む、実施形態７７〜９９のいずれかに記載の方法。
１０１．前記保存剤が、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である、実施形態７７〜１００のいずれかに記載の方法。
１０２．前記保存剤が、
配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン、あるいは配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
場合により、第２の異種ドメイン、例えば、抗体分子、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、またはｓｃＦｖ；重鎖抗体断片；Ｆｃ断片；またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片
を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む、実施形態７７〜１０１のいずれかに記載の方法。
１０３．前記ナノ粒子が、
配列番号６のＩＬ−１５Ｎ７２ＤポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
配列番号５のｓｕｓｈｉ−ＦｃポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子を含む、実施形態７７〜１０２のいずれかに記載の方法。
１０４．前記保存剤が、サイトカイン分子、成長因子分子または共刺激分子を含む、実施形態７７〜１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．前記組成物が、サイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、またはバリアント、例えば、それらのスーパーアゴニストを含む第２の保存剤を含む、実施形態７７〜１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．前記組成物が、共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、前記共刺激分子が、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、実施形態７７〜１０５のいずれかに記載の方法。
１０７．前記組成物、例えば前記ナノ粒子が、前記有核細胞による前記ナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む、実施形態７７〜１０６のいずれかに記載の方法。
１０８．前記組成物、例えば、前記ナノ粒子が、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む、実施形態７７〜１０７のいずれかに記載の方法。
１０９．前記ナノゲルが高密度タンパク質構造（例えば、８０重量％超のタンパク質）であり、かつ／または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、実施形態７７〜１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．前記ナノ粒子が、レドックスに対して感受性（例えば、ジスルフィド）またはｐＨに対して感受性（例えば、加水分解性基）または酵素に対して感受性（例えば、プロテアーゼ）である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、実施形態７７〜１０９のいずれかに記載の方法。
１１１．有核細胞およびナノ粒子を凍結するための方法であって、前記細胞を−１０℃未満で凍結して少なくとも１時間後に融解し、前記ナノ粒子が、融解後に前記ナノ粒子から放出される少なくとも１つの薬剤であって、ナノ粒子を含まない有核細胞の組成物よりも大幅に前記細胞を生存状態で保持する薬剤を含む、方法。
１１２．前記薬剤が、有核細胞の生存能力を持続するための刺激分子である、実施形態１１１に記載の方法。
１１３．前記有核細胞がリンパ球である、実施形態１１１〜１１２のいずれかに記載の方法。
１１４．ナノ粒子が前記有核細胞の表面と会合している、実施形態１１１〜１１３のいずれかに記載の方法。
１１５．前記ナノ粒子が、前記有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしている、実施形態１１１〜１１４のいずれかに記載の方法。
実施例１：タンパク質ナノゲルの形成
無血清培地中で懸濁液適合ＨＥＫ２９３細胞からタンパク質を生産し、次いで、プロテインＡアフィニティーによって精製し、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）に緩衝液交換する。
架橋タンパク質ナノゲル（バックパック）を含むバックパックタンパク質ナノゲルを以下のように形成する。過剰な分解性架橋剤を使用して、本明細書に記載されるタンパク質またはタンパク質複合体をタンパク質ナノ粒子に架橋する。適切なタンパク質複合体は、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、ＰＮＡＳ １０３：２４ ｐ．９１６６−９１７１（２００６）に記載されているＩＬ−１５スーパーアゴニストである。
いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、以下のような野生型ヒトＩＬ−１５タンパク質配列を含む：
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮ ＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号１）
適切な架橋剤は、フレキシブルなジスルフィド含有リンカーによって互いに結合された２つのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を含有するビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］ジスルフィドである。
室温でインキュベートした後、ＤＰＢＳで反応物を所望の最終濃度に希釈する。次いで、Ｚｅｂａカラムを使用してＤＰＢＳへの緩衝液交換によって、リンカー脱離基（これは、架橋反応の一環として除去されるリンカーの分子断片を含む）および未反応リンカーからタンパク質ナノゲルを精製する。場合により、タンパク質ナノゲルをポリマー、抗体分子またはポリマーおよび抗体分子の両方とさらにコンジュゲートする。適切な抗体分子は、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（クローンＢＣ８；ハイブリドーマ培養物から精製；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ｎｏ．ＨＢ−１０５０７）である。次いで、下流アッセイ、例えば活性化初代Ｔ細胞、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）またはこれらのＴ細胞およびＮＫ細胞の改変型との会合において使用するために、等量のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で緩衝液交換タンパク質ナノゲルを所望の最終濃度に希釈する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって、タンパク質ナノゲルの形成を評価する。タンパク質ナノゲルが形成されると、遊離タンパク質またはタンパク質複合体は、分解性リンカーによって架橋タンパク質に変換される。この架橋は、より大きな流体力学的半径の粒子（これは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって効率的に移動しないタンパク質粒子として現れる）をもたらす。フォトダイオードアレイ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）を備えるＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムにより、溶出液（流速０．５ｍＬ／分）としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いてＢｉｏＳｅｐ（商標）ＳＥＣ−ｓ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）を使用したＳＥＣによる分析では、タンパク質ナノゲルは、より大きな分子種と一致して、より速い溶出時間で移動する。ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｏｍｎｉ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅｒ（ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐによる９０度の角度で動的光散乱（ＤＬＳ）によって、ナノゲルのサイズおよび多分散性を分析する。
実施例２：Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の単離
健常ドナーからＴ細胞およびＮＫ細胞を単離する。ＤＰＢＳで１日齢ｌｅｕｋｏｐａｃｋ細胞（Ｂｉｏｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：１（体積）希釈し、５０ｍｌチューブ中で高密度クッション（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ．）上に積層する（３５ｍｌの希釈ｌｅｕｋｏｐａｃｋを、１５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に）。８００ｇで３０分間遠心分離した後、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐとＤＰＢＳとの間の界面で、単核細胞を採取する。５０ｍｌのＤＰＢＳで細胞を３回洗浄して、残存ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐおよび細胞残屑を除去する。製造業者の説明書にしたがって、それぞれ抗ＣＤ３（または抗ＣＤ８）および抗ＣＤ５６コンジュゲートビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して連続磁気ビーズソーティングによって、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を単離する。簡潔にまとめると、抗体コンジュゲートビーズを単核細胞と共にインキュベート（＋４℃で３０分間）しながら、３ｍｌの氷冷ＤＰＢＳでＬＳカラムを平衡化する。細胞をカラムにロードした後、３ｍｌの氷冷ＤＰＢＳによる３回の洗浄を実施し、５ｍｌの氷冷ＤＰＢＳで細胞をカラムから洗い流す。
単離後、完全培地（ＣＭ−Ｔ）：ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）（２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充）中で、Ｔ細胞を少なくとも２時間静置する。単離後、ＮＫ完全培地（ＣＭ−ＮＫ）：組換えトランスフェリン（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、５％ヒト血清ＡＢ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＸｖｉｖｏ１０（２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充）中で、ＮＫ細胞を少なくとも２時間静置する。
実施例３：
標識前のＴ細胞の活性化
タンパク質ナノゲルとの会合の前に、プールされたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（これは、実施例２に記載されている抗ＣＤ３選択から得られる主要な細胞型である）、または単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（これらはそれぞれ、実施例２に記載されているように得る）を、製造業者の説明書にしたがって、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３２Ｄ）を用いて最初に活性化する。２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充したＣＭ−Ｔ中で、Ｔ細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを３７℃および５％ＣＯ２で２日間インキュベートする。次いで、磁気分離によって、Ｔ細胞からＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去する。
実施例４：Ｔ細胞へのタンパク質ナノゲルの会合および凍結保存
タンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を活性化ヒトＴ細胞と会合させ、凍結融解サイクルに供する。簡潔にまとめると、実施例１に記載されているように、バックパックピローを調製する。下流のフローサイトメトリー分析を支援するために、３質量％のＡｌｅｘａ−６４７標識タンパク質またはタンパク質複合体および９７質量％の非標識タンパク質またはタンパク質複合体を使用して、バックパックピローを生成する。製造業者の説明書にしたがってＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−６４７標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２０１８６，１００ｕｇスケールキット；またはｃａｔ．ｎｏ．Ａ２０１７３，１ｍｇスケールキット）を使用して、タンパク質またはタンパク質複合体を蛍光標識する。タンパク質ナノゲル合成のための他のすべての工程は、実施例１に記載されているように実施する。
実施例３にしたがって調製した活性化Ｔ細胞をＤＰＢＳで洗浄し、細胞約１０８個／ｍＬの最終細胞密度でタンパク質ナノゲルバックパックピローと共に３７℃で１時間インキュベートする。反転または穏やかなボルテックスによって、溶液を１０〜１５分ごとに混合する。次いで、細胞を、規定されているように、細胞１０７個／ｍＬの密度で、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＦＢＳ含有細胞凍結培地または無血清凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ，Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．ｃａｔ．ｎｏ．ＢＢ０２）に再懸濁し、低温バイアルに移して、製造業者によって記載されているようにＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）中で凍結する。Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）容器中、−８０℃で一晩インキュベートした後、水浴中、３７℃でインキュベートすることによって細胞を融解し、ＤＰＢＳで洗浄して、凍結培地および非結合バックパックを除去する。代替的な凍結長さは、下記の他の実施例に記載されている（例えば、２時間または２週間）。次いで、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含むＣＭ−Ｔ中で、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養する。ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）フローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーによって、バックパックピローとＴ細胞との会合をモニタリングして、凍結および融解後のバックパックピローとＴ細胞との持続的会合を定量する。
実施例５：初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞株へのタンパク質ナノゲルの会合
タンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を初代ヒトＮＫ細胞（実施例２に記載されているように単離したもの）およびＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）と会合させ、凍結融解サイクルに供する。タンパク質ナノゲル合成は、実施例１に記載されているように実施する。
ＮＫ細胞をＤＰＢＳで洗浄し、細胞約１０８個／ｍＬの最終細胞密度でタンパク質ナノゲルバックパックピローと共に３７℃で１時間インキュベートする。反転または穏やかなボルテックスによって、溶液を１０〜１５分ごとに混合する。次いで、細胞を、細胞１０７個／ｍＬの密度で、無血清凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ，Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．ｃａｔ．ｎｏ．ＢＢ０２）に再懸濁し、低温バイアルに移して、製造業者によって記載されているようにＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）中で凍結する。Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）容器中、−８０℃で２時間インキュベートした後、水浴中、３７℃でインキュベートすることによって細胞を融解し、ＤＰＢＳで洗浄して、凍結培地および非結合バックパックを除去する。代替的な凍結長さは、他の実施例に記載されている（例えば、２時間または２週間）。次いで、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含むＣＭ−ＮＫ中で、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養する。
実施例６：ＩＬ−２含有ＣＭ−Ｔ中におけるＣＤ８ Ｔ細胞の細胞拡大
ＣＤ８ Ｔ細胞をバックパックピローと共にインキュベートしてから、ＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ中で一晩凍結する。融解して、ＩＬ−２含有ＣＭ−Ｔ中で、バックパック会合Ｔ細胞を培養し、バックパックを用いない以外は同じ方法で処置した対照ＣＤ８ Ｔ細胞も同様。融解後の時点（例えば、４時間および４８時間）において生細胞の数を測定して、バックパックピローありの場合およびバックパックピローなしの場合のＣＤ８ Ｔ細胞の回復速度を定量する。
実施例７：ＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中におけるＣＤ３ Ｔ細胞の細胞拡大
ＣＤ３ Ｔ細胞をバックパックピローと共にインキュベートしてから、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で凍結する。融解して、ＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中で、バックパック会合ＣＤ３ Ｔ細胞を培養し、バックパックを用いない以外は同じ方法で処置した対照ＣＤ３ Ｔ細胞も同様。適切な対照としては、融解してＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中で培養したＣＤ３ Ｔ細胞と、融解して可溶性ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）ＣＭ−Ｔ中で培養したＣＤ３ Ｔ細胞と、融解して、タンパク質ナノゲルにおいて使用した同じタンパク質の可溶性（非架橋）形態において培養したＣＤ３ Ｔ細胞とが挙げられる。融解後の時点（例えば、１６時間、２日、７日および９日）において、生細胞の数を測定する。
実施例８：ＮＫ−９２細胞株および初代ＮＫ細胞の細胞拡大
ＮＫ−９２細胞および初代ＮＫ細胞をバックパックピローと共にインキュベートしてから、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で凍結する。融解して、ＩＬ−２不含ＣＭ−ＮＫ中で、バックパック会合細胞を培養する。適切な対照としては、融解してＩＬ−２不含ＣＭ−ＮＫ中で培養した初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞と、融解して可溶性ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）ＣＭ−ＮＫ中で培養した初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞と、融解して、タンパク質ナノゲルで使用した同じタンパク質の可溶性（非架橋）形態において培養した初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞と、バックパックピローと会合させたが凍結保存せずにＩＬ−２不含ＣＭ−ＮＫ中で培養したＮＫ−９２細胞とが挙げられる。融解後の時点（例えば、１６時間、１日、５日、６日および９日）において、生細胞の数を測定する。
実施例９：Ｔ細胞サブセットおよび活性化
以下の蛍光色素コンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを使用してフローサイトメトリーによって、実施例７のように処置したＣＤ３ Ｔ細胞をさらに特性評価する。ＣＤ８ Ｔ細胞の割合およびそれらの活性化状態を測定する。
実施例１０：標的細胞に対する活性化ＣＤ３ Ｔ細胞の短期効力
融解の１日後に、実施例７のように処置したＣＤ３ Ｔ細胞の細胞傷害活性を特性評価する。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ３ Ｔ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養する。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定する。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−Ｔ中で、共培養を１６時間実施する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算する。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存する。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定する。
実施例１１：標的細胞に対する活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の長期効力
ＣＤ８ Ｔ細胞をバックパックピローと共にインキュベートし、凍結保存するか、またはＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔによる培養に戻す。ＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中で１８日間培養した後に、それらの細胞傷害活性を比較する。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養する。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定する。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−Ｔ中で、共培養を１６時間実施する。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算する。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存する。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定する。
実施例１２：ＩＬ−２の存在下における標的細胞に対する活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の効力
実施例６のように処置したＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性を特性評価する。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養する。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定する。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−Ｔ中で、共培養を１６時間実施する。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算する。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存する。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定する。
実施例１３：標的細胞に対する初代ＮＫ細胞の効力
実施例８のように処置した初代ＮＫ細胞の細胞傷害活性を特性評価する。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、初代ＮＫ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養する。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定する。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−ＮＫ中で、共培養を１６時間実施する。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算する。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存する。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定する。
実施例１４：ＩＬ−１５タンパク質バリアントの生成
２つのＩＬ−１５タンパク質バリアントを生成した。第１のＩＬ−１５バリアント（以下、ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃと称される；図１Ａを参照のこと）は、野生型ヒトＩＬ−１５（配列番号１）と、ヒトＩＬ−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα；配列番号５）のｓｕｓｈｉドメインのＦｃ融合物との非共有結合複合体を含む。野生型ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαは、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６２６１６．１およびＡＡＩ２１１４１．１（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって示されている。第２のＩＬ−１５バリアント（以下、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃと称される；図１Ｂを参照のこと）は、Ｎ７２Ｄ点変異を含有するヒトＩＬ−１５（配列番号６）と、ヒトＩＬ−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα；配列番号５）のｓｕｓｈｉドメインのＦｃ融合物との非共有結合複合体を含む。無血清培地中で懸濁液適合ＨＥＫ２９３細胞からタンパク質を生産し、次いで、プロテインＡアフィニティーによって精製し、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）に緩衝液交換した。
ヒトＩＬ−１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインのＦｃ融合物：
Ｎ７２Ｄ点変異を含有するヒトＩＬ−１５：
実施例１５：タンパク質ナノゲルの形成
架橋タンパク質ナノゲル（バックパック）を含むバックパックタンパク質ナノゲルを以下のように形成した。２５倍モル過剰の分解性架橋剤を使用して、１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃをタンパク質ナノ粒子に架橋した。
この研究で使用した架橋剤（ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］ジスルフィド）は、式Ｉに示されているフレキシブルなジスルフィド含有リンカーによって互いに結合された２つのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を含有する。
式Ｉ：
室温で３０分間インキュベートした後、ＤＰＢＳで反応物を１０倍希釈して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終サイトカイン濃度にした。次いで、Ｚｅｂａカラム（７，０００または４０，０００ＭＷカットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒから入手可能）を使用してＤＰＢＳへの緩衝液交換によって、リンカー脱離基（これは、架橋反応の一環として除去されるリンカーの分子断片を含む）および未反応リンカーから、タンパク質ナノゲルを精製した。製造業者の説明書にしたがって、Ｚｅｂａカラムを使用した（ＤＰＢＳによる３回連続洗浄によってＤＰＢＳでカラムを平衡化して緩衝液交換を促進し、続いて、反応生成物を適用したことを含む）。下流アッセイ、例えば活性化初代Ｔ細胞、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）またはこれらのＴ細胞およびＮＫ細胞の改変型との会合において使用するために、等体積のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で、約１〜１．５ｍｇ／ｍＬのサイトカイン濃度の緩衝液交換タンパク質ナノゲルを約０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって、タンパク質ナノゲルの形成を評価した。タンパク質ナノゲルが形成されると、遊離ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃは、分解性リンカーによって架橋タンパク質に変換される。この架橋は、より大きな流体力学的半径の粒子（これは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって効率的に移動しないタンパク質粒子として現れた）をもたらした。図２を参照のこと。フォトダイオードアレイ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）を備えるＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムにより、溶出液（流速０．５ｍＬ／分）としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いてＢｉｏＳｅｐ（商標）ＳＥＣ−ｓ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）を使用したＳＥＣによる分析により、タンパク質ナノゲルは、より大きな分子種と一致して、より速い溶出時間で移動したことが明らかになった（図３）。タンパク質ナノゲル（図３）と遊離（非架橋）タンパク質（図４）とのＨＰＬＣトレースの比較により、架橋ナノゲル中に残存する遊離タンパク質が最小量であることが明らかになったが、これは、架橋ナノゲルへのタンパク質の変換がほぼ完全であることを示唆している。ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｏｍｎｉ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅｒ（ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐによる９０度の角度で動的光散乱（ＤＬＳ）によって、ナノゲルのサイズおよび多分散性を分析した。表１を参照のこと。非架橋ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃの流体力学的直径は、同様のサイズの分子（ＩｇＧ）の半径に基づいて約１０ｎｍであると推定された。
実施例１６：表面にポリカチオン性ポリマーを有するタンパク質ナノゲルの形成
カチオン性ポリマー表面を有するタンパク質ナノゲルを含むタンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を以下のように形成した。２５倍モル過剰の式Ｉに規定されている分解性架橋剤を使用して、１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃをタンパク質ナノ粒子に架橋した。室温で３０分間インキュベートした後、ＤＰＢＳで反応物を１０倍希釈して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終サイトカイン濃度にした。次いで、Ｚｅｂａカラム（７，０００または４０，０００ＭＷカットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒから入手可能）を使用してＤＰＢＳへの緩衝液交換によって、リンカー脱離基（これは、架橋反応の一環として除去されるリンカーの分子断片を含む）および未反応リンカーから、タンパク質ナノゲルを精製した。製造業者の説明書にしたがって、Ｚｅｂａカラムを使用した（ＤＰＢＳによる３回連続洗浄によってＤＰＢＳでカラムを平衡化して緩衝液交換を促進し、続いて、反応生成物を適用したことを含む）。次いで、約１〜１．５ｍｇ／ｍＬのサイトカイン濃度の緩衝液交換タンパク質ナノゲルを、ポリエチレングリコール−ポリリジン（ＰＥＧ−ｐｏｌｙＫ）ブロックコポリマー：ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０（Ａｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃａｔ．ｎｏ．０５０−ＫＣ０３０）（これは、５キロダルトン（ｋＤ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ５ｋ）と、３０アミノ酸のポリリジンポリマー（ポリリジン３０またはｐｏｌｙＫ３０）とを含むブロックコポリマーである）、またはＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ２００（Ａｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃａ．ｎｏ．０５０−ＫＣ２００）とコンジュゲートした。ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０またはＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ２００をＤＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬで再構成し、５０μｇ／ｍＬの最終ブロックコポリマー濃度でタンパク質ナノゲルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｏｍｎｉ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅｒ（ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）による９０度の角度における動的光散乱（ＤＬＳ）によって、表面官能化ナノ粒子のサイズおよび多分散性を分析し（表１を参照のこと）、フォトダイオードアレイ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）を備えるＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムにより、溶出液（流速０．５ｍＬ／分）としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いてＢｉｏＳｅｐ（商標）ＳＥＣ−ｓ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、ナノ粒子への相対的変換を評価した（図５を参照のこと）。
下流アッセイ、例えば活性化初代Ｔ細胞、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）またはこれらのＴ細胞およびＮＫ細胞の改変型との会合において使用するために、等体積のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で、最終バックパックピロータンパク質ナノゲルを約０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
実施例１７：表面結合親和性リガンドを有するタンパク質ナノゲルの形成
表面結合親和性リガンドおよびカチオン性ポリマー表面を有するタンパク質ナノゲルを含むタンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を以下のように形成した。２５倍モル過剰の式Ｉに規定されている分解性架橋剤を使用して、１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃをタンパク質ナノ粒子に架橋した。室温で３０分間インキュベートした後、ＤＰＢＳで反応物を１０倍希釈して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終サイトカイン濃度にした。次いで、抗体を５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加することによって、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（クローンＢＣ８；ハイブリドーマ培養物から精製；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ｎｏ．ＨＢ−１０５０７）を架橋タンパク質ナノ粒子にコンジュゲートし、室温で３０〜６０分間インキュベートした。次いで、Ｚｅｂａカラム（７，０００または４０，０００ＭＷカットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒから入手可能）を使用してＤＰＢＳへの緩衝液交換によって、リンカー脱離基（これは、架橋反応の一環として除去されるリンカーの分子断片を含む）および未反応リンカーから、抗ＣＤ４５抗体が表面にコンジュゲートしたタンパク質ナノゲルを精製した。製造業者の説明書にしたがって、Ｚｅｂａカラムを使用した（ＤＰＢＳによる３回連続洗浄によってＤＰＢＳでカラムを平衡化して緩衝液交換を促進し、続いて、反応生成物を適用したことを含む）。
下流アッセイ、例えば活性化初代Ｔ細胞、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）またはこれらのＴ細胞およびＮＫ細胞の改変型との会合において使用するために、等体積のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で、約１〜１．５ｍｇ／ｍＬのサイトカイン濃度の緩衝液交換タンパク質ナノゲルを約０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
ＤＬＳによって、表面官能化ナノ粒子のサイズおよび多分散性を分析した（表１）。ＢｉｏＳｅｐ（商標）ＳＥＣ−ｓ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）によるＳＥＣによって、抗ＣＤ４５抗体の取り込み効率を評価した：遊離抗ＣＤ４５抗体（図６）と抗ＣＤ４５表面官能化タンパク質ナノゲル（図７）との比較により、ナノゲルサンプル中の遊離ＩｇＧが最小であることが明らかになったが、これは、ナノゲル表面への抗体のコンジュゲーションがほぼ完全であることを示している。
実施例１８：表面結合親和性リガンドおよび表面上のカチオン性ポリマーを有するタンパク質ナノゲルの形成
表面結合親和性リガンドおよびカチオン性ポリマー表面を有するタンパク質ナノゲルを含むタンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を以下のように形成した。２５倍モル過剰の式Ｉに規定されている分解性架橋剤を使用して、１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃをタンパク質ナノ粒子に架橋した。室温で３０分間インキュベートした後、ＤＰＢＳで反応物を１０倍希釈して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終サイトカイン濃度にした。次いで、抗体を５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加することによって、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（クローンＢＣ８；ハイブリドーマ培養物から精製；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ｎｏ．ＨＢ−１０５０７）を架橋タンパク質ナノ粒子にコンジュゲートし、室温で３０〜６０分間インキュベートした。次いで、Ｚｅｂａカラム（７，０００または４０，０００ＭＷカットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒから入手可能）を使用してＤＰＢＳへの緩衝液交換によって、リンカー脱離基（これは、架橋反応の一環として除去されるリンカーの分子断片を含む）および未反応リンカーから、抗ＣＤ４５抗体が表面にコンジュゲートしたタンパク質ナノゲルを精製した。製造業者の説明書にしたがって、Ｚｅｂａカラムを使用した（ＤＰＢＳによる３回連続洗浄によってＤＰＢＳでカラムを平衡化して緩衝液交換を促進し、続いて、反応生成物を適用したことを含む）。次に、約１〜１．５ｍｇ／ｍＬの緩衝液交換タンパク質ナノゲルを、ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０（Ａｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃａｔ．ｎｏ．０５０−ＫＣ０３０）またはＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ２００（Ａｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃａ．ｎｏ．０５０−ＫＣ２００）とコンジュゲートさせた。ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０またはＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ２００を、最初に、ＤＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬに再構成し、次に、５０ｕｇ／ｍＬの最終ブロックコポリマー濃度でタンパク質ナノゲルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。表面官能化ナノ粒子のサイズおよび多分散性を、ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｏｍｎｉ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅｒ（ＮａｎｏＢｒｏｏｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．）によるＤＬＳによって（表２）、およびフォトダイオードアレイ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）を備えるＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムにより、溶出液（流速０．５ｍＬ／分）としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いてＢｉｏＳｅｐ（商標）ＳＥＣ−ｓ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．）を使用したＳＥＣによって分析した（図８）。
下流アッセイ、例えば活性化初代Ｔ細胞、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）またはこれらのＴ細胞およびＮＫ細胞の改変型との会合において使用するために、等量のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で最終バックパック−ピロータンパク質ナノゲルを約０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。
以下の表３に示されているように、活性化ナイーブＴ細胞への蛍光標識ナノ粒子のローディングを定量した。
実施例１９：Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の単離
健常ドナーからＴ細胞およびＮＫ細胞を単離した。ＤＰＢＳで１日齢ｌｅｕｋｏｐａｃｋ細胞（Ｂｉｏｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：１（体積）希釈し、５０ｍｌチューブ中で高密度クッション（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ．）上に積層した（３５ｍｌの希釈ｌｅｕｋｏｐａｃｋを、１５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に）。８００ｇで３０分間遠心分離した後、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐとＤＰＢＳとの間の界面で、単核細胞を採取した。５０ｍｌのＤＰＢＳで細胞を３回洗浄して、残存ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐおよび細胞残屑を除去した。製造業者の説明書にしたがって、それぞれ抗ＣＤ３（または抗ＣＤ８）および抗ＣＤ５６コンジュゲートビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して連続磁気ビーズソーティングによって、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を単離した。簡潔にまとめると、抗体コンジュゲートビーズを単核細胞と共にインキュベート（＋４℃で３０分間）しながら、３ｍｌの氷冷ＤＰＢＳでＬＳカラムを平衡化した。細胞をカラムにロードした後、３ｍｌの氷冷ＤＰＢＳによる３回の洗浄を実施し、５ｍｌの氷冷ＤＰＢＳで細胞をカラムから洗い流した。
単離後、完全培地（ＣＭ−Ｔ）：ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、２．５ｕｇ／ｍｌヒトアルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．５ｕｇ／ｍｌイノシトール（Ｓｉｇｍａ）（２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充）中で、Ｔ細胞を少なくとも２時間静置した。単離後、ＮＫ完全培地（ＣＭ−ＮＫ）：組換えトランスフェリン（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）、５％ヒト血清ＡＢ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有するＸｖｉｖｏ１０（２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充）中で、ＮＫ細胞を少なくとも２時間静置した。
実施例２０：
標識前のＴ細胞の活性化
タンパク質ナノゲルとの会合の前に、プールされたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（これは、実施例１９に記載されている抗ＣＤ３選択から得られる主要な細胞型である）、または単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（これらはそれぞれ、実施例１９に記載されているように得た）を、製造業者の説明書にしたがって、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｃａｔ．ｎｏ．１１３２Ｄ）を用いて最初に活性化した。２０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）を補充したＣＭ−Ｔ中で、Ｔ細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを３７℃および５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。次いで、磁気分離によって、Ｔ細胞からＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去した。
実施例２１：Ｔ細胞へのタンパク質ナノゲルの会合および凍結保存
タンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を活性化ヒトＴ細胞と会合させ、凍結融解サイクルに供した。簡潔にまとめると、実施例１６に記載されるように、ポリカチオン性ポリマー（ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０）で表面官能化したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲルからなるバックパックピローを調製した。下流のフローサイトメトリー分析を支援するために、３質量％のＡｌｅｘａ−６４７標識ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃおよび９７質量％の非標識ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃを使用して、バックパックピローを生成した。製造業者の説明書にしたがってＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−６４７標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２０１８６，１００ｕｇスケールキット；またはｃａｔ．ｎｏ．Ａ２０１７３，１ｍｇスケールキット）を使用して、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃを蛍光標識した。タンパク質ナノゲル合成のための他のすべての工程は、実施例１６に記載されているように実施した。
実施例２０にしたがって調製した活性化Ｔ細胞をＤＰＢＳで洗浄し、約０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの同等のサイトカイン濃度で、細胞約１０８個／ｍＬの最終細胞密度でタンパク質ナノゲルバックパックピローと共に３７℃で１時間インキュベートした。反転または穏やかなボルテックスによって、溶液を１０〜１５分ごとに混合した。次いで、細胞を、規定されているように、細胞１０７個／ｍＬの密度で、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＦＢＳ含有細胞凍結培地または無血清凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ，Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．ｃａｔ．ｎｏ．ＢＢ０２）に再懸濁し、低温バイアルに移して、製造業者によって記載されているようにＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）中で凍結した。Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）容器中、−８０℃で一晩インキュベートした後、水浴中、３７℃でインキュベートすることによって細胞を融解し、ＤＰＢＳで洗浄して、凍結培地および非結合バックパックを除去した。代替的な凍結長さは、下記の他の実施例に記載されている（例えば、２時間または２週間）。次いで、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含むＣＭ−Ｔ中で、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）フローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーによって、バックパックピローとＴ細胞との会合をモニタリングし、凍結および融解後のバックパックピローとＴ細胞との持続的会合を明らかにした（図９）。
実施例２２：初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞株へのタンパク質ナノゲルの会合
タンパク質ナノゲル（バックパックピロー）を初代ヒトＮＫ細胞（実施例１９に記載されているように単離したもの）およびＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）と会合させ、凍結融解サイクルに供した。簡潔にまとめると、実施例１６に記載されているように、ポリカチオン性ポリマー（ＰＥＧ５ｋ−ｐｏｌｙＫ３０）で表面官能化したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質ナノゲルのバックパックピローを調製した。タンパク質ナノゲル合成のための他の工程はすべて、実施例１６に記載されているように実施した。
ＮＫ細胞をＤＰＢＳで洗浄し、約０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬの同等のサイトカイン濃度で、細胞約１０８個／ｍＬの最終細胞密度でタンパク質ナノゲルバックパックピローと共に３７℃で１時間インキュベートした。反転または穏やかなボルテックスによって、溶液を１０〜１５分ごとに混合した。次いで、細胞を、細胞１０７個／ｍＬの密度で、無血清凍結培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ，Ｌｙｍｐｈｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．ｃａｔ．ｎｏ．ＢＢ０２）に再懸濁し、低温バイアルに移して、製造業者によって記載されているようにＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）中で凍結した。Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）容器中、−８０℃で２時間インキュベートした後、水浴中、３７℃でインキュベートすることによって細胞を融解し、ＤＰＢＳで洗浄して、凍結培地および非結合バックパックを除去した。代替的な凍結長さは、他の実施例に記載されている（例えば、２時間または２週間）。次いで、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２を含むＣＭ−ＮＫ中で、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
実施例２３：ＩＬ−２含有ＣＭ−Ｔ中におけるＣＤ８ Ｔ細胞の細胞拡大
ＣＤ８ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックと共にインキュベートしてから、ＦＢＳ＋５％ＤＭＳＯ中で一晩凍結した。融解して、ＩＬ−２含有ＣＭ−Ｔ中で、バックパック会合Ｔ細胞を培養し、バックパックを用いない以外は同じ方法で処置した対照ＣＤ８ Ｔ細胞も同様であった。融解後の示されている時間において、生細胞の数を測定した。活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の凍結保存前におけるバックパックの会合は、ＣＤ８ Ｔ細胞のより速い回復を促進した。実際、融解の２日後において既に、バックパック担持ＣＤ８ Ｔ細胞は、融解してＩＬ−２含有培地中で培養したＣＤ８ Ｔ細胞と比較して約２倍拡大した（図１０）。
実施例２４：ＩＬ−２不含ＣＭ−ＴにおけるＣＤ３ Ｔ細胞の細胞拡大
ＣＤ３ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックと共にインキュベートしてから、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で示されている時間凍結した。融解して、ＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中で、バックパック会合ＣＤ３ Ｔ細胞を、バックパックを用いない以外は同じ方法で処置した対照ＣＤ３ Ｔ細胞と一緒に培養した。試験した対照は、融解してＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中で培養したＣＤ３ Ｔ細胞（「培地のみ」）と、融解して可溶性ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）ＣＭ−Ｔ中で培養したＣＤ３ Ｔ細胞（「ＩＬ−２（可溶性）」）と、融解して可溶性ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（「ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ）」）または可溶性ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（「ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（１２ｕｇ／ｍｌ）」）ＣＭ−Ｔ中で培養したＣＤ３ Ｔ細胞とであった。融解後の示されている時点において、生細胞の数を測定した。活性化ＣＤ３ Ｔ細胞の凍結保存前におけるバックパックの会合は、ＣＤ３ Ｔ細胞の拡大を増加させた。実際、１週間後または９日後に、ＣＤ３ Ｔ細胞拡大のゲインは、それぞれ約５倍〜約１０倍であった（図１１Ａ〜１１Ｂ）。
実施例２５：ＮＫ−９２細胞株および初代ＮＫ細胞の細胞拡大
ＮＫ−９２細胞および初代ＮＫ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃまたはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックと共にインキュベートしてから、無血清培地（Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）中で示されている時間凍結した。融解して、ＩＬ−２不含ＣＭ−ＮＫ中で、バックパック会合細胞を培養した。試験した対照は、融解してＩＬ−２不含ＣＭ−ＮＫ中で培養した初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞（「培地のみ」）と、融解して可溶性ＩＬ−２含有（２０ｎｇ／ｍｌ）ＣＭ−ＮＫ中で培養した初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞（「ＩＬ−２（可溶性）」）と、融解して可溶性ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（「ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（０．６ｕｇ／ｍｌ）」）で培養した初代ＮＫ細胞およびＮＫ−９２細胞と、融解して可溶性ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ含有（「ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（１２ｕｇ／ｍｌ）」）ＣＭ−ＮＫ中で培養したＮＫ−９２細胞と、ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックと会合させたが凍結保存せずにＩＬ−２不含ＣＭ−ＮＫ中で培養したＮＫ−９２細胞（「ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパック（非凍結）」）とであった。融解後の示されている時点において、生細胞の数を測定した。ＮＫ−９２細胞および初代ＮＫ細胞の凍結保存前におけるバックパックの会合は、細胞の拡大を増加させた。実際、５日後に、ＮＫ−９２細胞拡大のゲインは、同じ方法で処置したＩＬ−２含有ＮＫ−９２培養物と比較して約２．５倍であった。バックパック処置非凍結保存ＮＫ−９２細胞では、最大拡大は約４倍であった。初代ＮＫ細胞拡大もまた、同じ方法で処置したＩＬ−２含有初代ＮＫ培養物と比較して約５倍増加した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。
実施例２６：Ｔ細胞サブセットおよび活性化
以下の蛍光色素コンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを使用してフローサイトメトリーによって、実施例２４のように処置したＣＤ３ Ｔ細胞をさらに特性評価した。溶液中またはバックパックとしてのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃによる処置は、活性化状態に影響を与えずに、ＣＤ４５ＲＡ＋の比率として測定した場合のＣＤ８ Ｔ細胞の割合を増加させた（図１３Ａ〜１３Ｂ）。
実施例２７：標的細胞に対する活性化ＣＤ３ Ｔ細胞の短期効力
融解の１日後に、実施例２４のように処置したＣＤ３ Ｔ細胞の細胞傷害活性を特性評価した。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ３ Ｔ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定した。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−Ｔ中で、共培養を１６時間実施した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析する。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算した。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存した。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定した。バックパックの会合は、ＣＤ３ Ｔ細胞の細胞傷害活性の発揮を妨害しなかった。反対に、凍結保存前におけるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックの会合は、同じ方法で処置したＩＬ−２含有ＣＤ３ Ｔ細胞培養物と比較して、ＣＤ３ Ｔ細胞の効力を改善した（図１４Ａ〜１４Ｂ）。
実施例２８：標的細胞に対する活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の長期効力
ＣＤ８ Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバックパックと共にインキュベートし、凍結保存したか、またはＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔによる培養に戻した。ＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔ中で１８日間培養した後に、それらの細胞傷害活性を比較した。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定した。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−Ｔ中で、共培養を１６時間実施した。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算した。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存した。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定した。ＣＤ８ Ｔ細胞へのバックパックの会合は、それらが拡大してＩＬ−２不含培養液中で１８日間生存することを可能にし、Ｔ細胞に対する凍結保存のマイナス効果を完全に無効化した（図１５Ａ〜１５Ｂ）。
実施例２９：ＩＬ−２の存在下における標的細胞に対する活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の効力
実施例２３のように処置したＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性を特性評価した。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定した。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−Ｔ中で、共培養を１６時間実施した。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算した。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存した。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定した。凍結保存前におけるＣＤ８ Ｔ細胞へのバックパックの会合および融解後における培養中の可溶性ＩＬ−２の存在は、ＩＬ−２含有ＣＭ−Ｔ中で培養した融解ＣＤ８ Ｔ細胞と比較して、活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の効力を改善した（図１６Ａ〜１６Ｂ）。
実施例３０：標的細胞に対する初代ＮＫ細胞の効力
実施例２５のように処置した初代ＮＫ細胞の細胞傷害活性を特性評価した。異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、初代ＮＫ細胞を、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で予め標識した標的細胞（Ｄａｕｄｉ、ＡＴＣＣ）と共に共培養した。１６時間後に、フローサイトメトリーによって、標的細胞の死滅を測定した。ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭ−ＮＫ中で、共培養を１６時間実施した。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で死細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋細胞の数をＰＫＨ６７＋細胞の総数で割って、標的細胞単独の培養から得られた比（バックグラウンド標的細胞生存能力）を差し引いた後に、死滅率を計算した。細胞の遠心分離後に、細胞傷害性アッセイからの細胞共培養上清を回収し、−２０℃で保存した。製造業者の仕様書にしたがってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって、上清中のＩＦＮｇ濃度を測定した。凍結保存前における初代ＮＫ細胞とのバックパックの会合は、ＩＬ−２含有ＣＭ−ＮＫ中で培養した凍結保存初代ＮＫ細胞と比較して、初代ＮＫ細胞の効力を明らかに改善した（図１７Ａ〜１７Ｂ）。
実施例３１：初代マウスＣＤ８ Ｔ細胞の単離および活性化
陰性選択によって、Ｃ５７Ｂ／６マウスの脾臓からマウスＣＤ８ Ｔ細胞を精製した。マウスＴ細胞完全培地（ＣＭ−ｍＴ：ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−Ｇｌｕｔ、５０ｕＭβ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ；ＩＴＳ １％、Ｓｉｇｍａ；０日目）中、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（それぞれＢＥ０００１−１およびＢＥ００１５−１、Ｂｉｏ−Ｘｃｅｌｌ）でコーティングした６ウェルプレート上に１０６個／ｍＬの密度でプレーティングすることによって、細胞を活性化した。１日間のインキュベーション後、マウスＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍＬ；４０２−ＭＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびマウスＩＬ−７（０．５ｎｇ／ｍＬ；４０７−ＭＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した（１日目）。さらに１日間のインキュベーション後、細胞を細胞０．２×１０５個／ｍＬに再播種し（２日目）、次いで翌日、再び同じ密度に再播種した（３日目）。バックパック付着のために、４日目に細胞を回収した。
実施例３２：ＩＬ−２不含ＣＭ−ｍＴにおける初代凍結マウスＣＤ８ Ｔ細胞の生存能力
実施例３１で生成した細胞を、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物について実施例４に記載されているように、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、バックパック対照なし）、または非機能的ＩＬ１５変異体（ＩＬ１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃＤａ ＢＰ）もしくは機能的ＩＬ−１５（ＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃＤａ ＢＰ）を含むバックパックと共にインキュベートした。ＩＬ１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａタンパク質はＩＬ−１５ Ｄ８Ｎ変異を含み、最小生物学的活性を有する；機能的に活性なＩＬ−１５の必要性を調査するための陰性対照として、ＩＬ１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａからのバックパックを使用した。ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃについて実施例１４に記載されているように、ＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＦｃＤａおよびＩＬ１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａタンパク質を生産した。実施例４に記載されているように、細胞を−８０℃で５日間凍結してから融解した。ＣＭ−ｍＴ中で融解細胞を２日間（図１８Ａ）または３日間（図１８Ｂ）培養した。二重蛍光顕微鏡検査（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム、Ｃａｔ．ＣＳ２−０１０６；Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ，Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）によって、凍結前（「凍結前」）、融解直後（「融解後」）および培養後における細胞の生存能力を評価した。
実施例３３：ＩＬ−２不含ＣＭ−ｍＴにおける初代凍結マウスＣＤ８ Ｔ細胞の拡大
記載されているように、ＨＢＳＳ（「Ｔ細胞」）または機能的ＩＬ１５を含むバックパック（「Ｔ細胞＋ＩＬ１５ＷＴ／Ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａ ＢＰ」）中で、活性化マウスＣＤ８ Ｔ細胞をインキュベートした。次いで、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ中で、細胞を−８０℃で３時間凍結した（「Ｆ／Ｔ」）。融解後、ＣＭ−ｍＴ中で細胞を培養し、融解直後（「０」）ならびに培養３日目および６日目に、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）による二重蛍光顕微鏡検査アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム（ＡＯ／ＰＩ）によって、生存能力を評価した。比較のために、凍結／融解に供しなかったＴ細胞およびバックパックＴ細胞（「新鮮」）を同様に培養した（図１９を参照のこと）。データは、０日目の生細胞数に対して正規化した生細胞数として報告されている（すなわち、０日目の生細胞数に対する生細胞の「変化倍率」）。
実施例３４：ＩＬ−２不含ＣＭ−Ｔにおける初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の拡大
実施例２および３に記載されているように、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞を単離および精製した。実施例４に記載されているように、ＨＢＳＳ、可溶性（非バックパック）ＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａ、ＰＥＧ５ｋｐｏｌｙＫ３０を有しないＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａを含むバックパック、またはＰＥＧ５ｋｐｏｌｙＫ３０を有するＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａを含むバックパックで、細胞をインキュベートした。処置細胞を洗浄し、直接培養するか（図２０Ａ）、または７日間凍結してから融解して培養した（図２０Ｂ）。プレーティング前（０日目）ならびに培養１日目、３日目、５日目および７日目に、フローサイトメトリーカウンティングビーズ（Ｃ３６９５０ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって細胞をカウントした。データは、０日目の細胞数に対する増加倍率として報告されている。
実施例３５：ＩＬ１５バックパックと共に凍結したＣＤ８ Ｔ細胞のインビボ拡大
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌性マウスの剃毛側腹部に皮内注射した（細胞１０５個／マウス）。７日後、ＨＢＳＳ、ＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックまたは非機能的ＩＬ１５ＭＵＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックと共に予めインキュベートしてＢａｍｂａｎｋｅｒ中で５日間凍結したＰｍｅｌトランスジェニックＣＤ８ Ｔ細胞を融解し、静脈内投与した（１０７個／マウス）。５日目（図２１Ａ）または７日目（図２１Ｂ）に、フローサイトメトリーによって、血中の移入Ｔ細胞をカウントした。データは、血液１μｌ当たりのドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数として報告されている。
実施例３６：ＩＬ１５バックパックと共に凍結したＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍標的化
実施例３５のマウスから腫瘍塊を切除し、フローサイトメトリーによって分析した。参照として、新鮮ＣＤ８ Ｔ細胞を投与したマウス（ＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａバックパックありまたはなし）が示されている。データは、腫瘍１ｍｇ当たりのドナーＣＤ８ Ｔ細胞の数として報告されている（図２２）。

Claims (104)

  1. 有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、
    （ａ）前記組成物の少なくとも一部は凍結されており、
    （ｂ）前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
    （ｃ）
    （ｉ）前記サイトカイン分子は、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧＣＳＦから選択される；かつ／または
    （ｉｉ）前記共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、組成物。
  2. 前記組成物が融解されると、前記保存剤が、前記ナノ粒子の非存在下における有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを改善する、請求項１に記載の組成物。
  3. 複数の保存剤が互いに共有結合的に連結されており、前記ナノ粒子が、その表面にカチオン性ポリマーを場合によりさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記有核細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
  5. 有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、
    （ａ）前記組成物の少なくとも一部は凍結されており；
    （ｂ）前記保存剤は、
    配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
    場合により、抗体分子またはＦｃドメインを含む第２の異種ドメイン
    を含むポリペプチドと複合体化されたＩＬ−１５分子複合体を含む、組成物。
  6. 前記組成物が融解されると、前記保存剤が、前記ナノ粒子の非存在下における有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを改善する、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記Ｆｃドメインが野生型であるかもしくは変異されているか、または前記Ｆｃドメインが配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の組成物。
  8. 有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、前記組成物は凍結されており、前記組成物が融解されると、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを改善し、前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
    （ｉ）前記サイトカイン分子は、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧＣＳＦから選択されるか；または
    （ｉｉ）前記共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、組成物。
  9. 有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを保存または増強する少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、前記組成物の凍結調製物が融解されると、前記保存剤は、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを保存または増強し、前記保存剤は、
    配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；ならびに
    場合により、抗体分子およびＦｃドメインを含む第２の異種ドメイン
    を含むポリペプチドと複合体化したＩＬ−１５分子を含み；
    場合により、前記組成物の少なくとも一部は凍結されている、組成物。
  10. 複合体した前記ＩＬ−１５分子が、前記ポリペプチドと共有結合的または非共有結合的に会合している、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記抗体分子が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、ｓｃＦｖ、重鎖抗体断片、アフィボディ断片もしくは誘導体またはｓｄＡｂ（ナノボディ）断片を含む、請求項９に記載の組成物。
  12. 融解されると、前記保存剤が前記ナノ粒子から放出される、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  13. ＩＬ−１５受容体またはそのＩＬ−１５結合断片を含むポリペプチドと複合体化したＩＬ−１５分子を含むＩＬ−１５複合体を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  14. 前記ＩＬ−１５分子が変異体ＩＬ−１５ポリペプチドを含む、請求項５、９または１３に記載の組成物。
  15. 前記変異体ＩＬ−１５ポリペプチドが、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換を有するヒトＩＬ−１５ポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記ヒトＩＬ−１５ポリペプチドが７２位の置換を有する、請求項１５に記載の組成物。
  17. ７２位の前記置換が、ＮからＤへの置換である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ＩＬ−１５分子が、配列番号６のポリペプチド、あるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列である、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  19. ＩＬ−１５受容体またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号５のポリペプチド、あるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  20. 前記ＩＬ−１５受容体またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号７または配列番号８のポリペプチドと、エフェクター弱体化Ｆｃドメインを含む第２の異種ドメインとを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  21. 前記エフェクター弱体化ＦｃドメインがヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインが、配列番号１１のポリペプチドあるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 融解されると、インターフェロンガンマの産生増加をもたらす、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  24. 前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる、請求項１２〜２３のいずれかに記載の組成物。
  25. 前記有核細胞が免疫エフェクター細胞または造血幹細胞である、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  26. 前記有核細胞がリンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  28. 前記ナノ粒子が少なくとも１つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  29. 前記ナノ粒子が、前記有核細胞の表面と共有結合的にコンジュゲートしているか、または共有結合的にコンジュゲートしていない、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  30. 前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  31. 前記ナノ粒子がタンパク質ナノゲルを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  32. 前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  33. 前記ナノ粒子が、ＰＥＧとポリリジンとを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記ＰＥＧが、約１〜１０、２〜８、４〜６または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧである、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記ポリリジンが、１０〜５０、２０〜４０または約３０アミノ酸の平均長を有する、請求項３３または３４に記載の組成物。
  36. 溶液中もしくは細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ／または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  37. 前記化合物が、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む、請求項３６に記載の組成物。
  38. サイトカイン分子を含む第２の保存剤を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  39. 前記サイトカイン分子が、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦ、またはそれらのバリアントを含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記バリアントがスーパーアゴニストである、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ナノ粒子が、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  42. 配列番号６のポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
    配列番号５のポリペプチド、あるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
    約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
    場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子
    を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  43. 前記ナノ粒子が、レドックス、ｐＨまたは酵素に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
  44. レドックスに対して感受性の前記リンカーがジスルフィド基を含む、請求項４３に記載の組成物。
  45. ｐＨに対して感受性の前記リンカーが加水分解性基を含む、請求項４３に記載の組成物。
  46. 前記酵素がプロテアーゼである、請求項４３に記載の組成物。
  47. 有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の１つまたはそれよりも多くを増強するための方法であって、
    前記有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを接触させる工程；
    前記接触させた有核細胞を少なくとも１回の凍結融解サイクルに供する工程
    を含み、
    前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
    （ｉ）前記サイトカイン分子は、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧＣＳＦから選択されるか；または
    （ｉｉ）前記共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、方法。
  48. 有核細胞の凍結組成物を作製する方法であって、
    有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含む複数のナノ粒子とを含む非凍結組成物を提供する工程、および
    前記組成物が凍結するのに十分に前記組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の組成物を凍結する工程
    を含み、
    前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
    （ｉ）前記サイトカイン分子は、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧＣＳＦから選択されるか；または
    （ｉｉ）前記共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、方法。
  49. 前記組成物の温度を０℃未満または−１０℃未満に低下させる、請求項４８に記載の方法。
  50. 提供する工程が、別のエンティティから前記ナノ粒子を受け取ること、および前記ナノ粒子と前記有核細胞とを組み合わせることを含む、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。
  51. 提供する工程が、別のエンティティから有核細胞の前記非凍結組成物を受け取ることを含む、請求項４７〜５０のいずれかに記載の方法。
  52. 有核細胞の前記凍結組成物を別のエンティティに提供または放出する工程を含む、請求項４７〜５１のいずれかに記載の方法。
  53. 前記エンティティがヘルスケアプロバイダである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ヘルスケアプロバイダが病院、診療所または医院である、請求項５３に記載の方法。
  55. 有核細胞の前記凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供する工程を含む、請求項４７〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 前記保存剤が、
    ＩＬ−１５ポリペプチド受容体アルファ断片、および
    場合により、抗体分子またはＦｃドメインを含む第２の異種ドメイン
    を含む、請求項４７〜５５のいずれかに記載の方法。
  57. 前記抗体分子が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、ｓｃＦｖ、重鎖抗体断片、アフィボディ断片もしくは誘導体またはｓｄＡｂ（ナノボディ）断片を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. インターフェロンガンマ産生を促進する、請求項４７〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. インターフェロンガンマ産生によって活性化を測定する、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる、請求項４７〜５９のいずれかに記載の方法。
  61. ナノ粒子が、前記有核細胞の表面と会合または共有結合的にコンジュゲートしている、請求項４７〜６０のいずれかに記載の方法。
  62. 前記有核細胞が免疫エフェクター細胞または造血幹細胞である、請求項４７〜６１のいずれかに記載の方法。
  63. 前記有核細胞がリンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記有核細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している、請求項４７〜６４のいずれかに記載の方法。
  66. 前記ナノ粒子が少なくとも１つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、請求項４７〜６５のいずれかに記載の方法。
  67. 前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、請求項４７〜６６のいずれかに記載の方法。
  68. 前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項４７〜６７のいずれかに記載の方法。
  69. 前記ナノ粒子が、ＰＥＧとポリリジンとを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記ＰＥＧが、約１〜１０、２〜８、４〜６または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧである、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ポリリジンが、１０〜５０、２０〜４０または約３０アミノ酸の平均長を有する、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記組成物が、溶液中もしくは細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ／または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む、請求項４７〜７１のいずれかに記載の方法。
  73. 前記化合物が、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記保存剤が、
    配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
    場合により、抗体分子またはＦｃドメインを含む第２の異種ドメイン
    を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したＩＬ−１５分子を含む、実施形態４７〜７３のいずれかに記載の方法。
  75. 前記組成物が、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む、請求項４７〜７４のいずれかに記載の方法。
  76. 前記ナノゲルが８０重量％超のタンパク質であり、かつ／または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、請求項４７〜７５のいずれかに記載の方法。
  77. 前記ナノ粒子が、レドックス、ｐＨまたは酵素に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、請求項４７〜７７のいずれかに記載の方法。
  78. 前記ナノ粒子が、
    配列番号６のポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
    配列番号５のポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
    約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
    場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子
    を含む、請求項４７〜７７のいずれかに記載の方法。
  79. 有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、
    有核細胞と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを含む凍結組成物を提供する工程；および
    有核細胞の前記凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の前記凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程
    を含み、
    前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
    （ｉ）前記サイトカイン分子は、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦａ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧＣＳＦから選択されるか；または
    （ｉｉ）前記共刺激分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ３、もしくはＣＤ１３７のアゴニストから選択される、方法。
  80. 提供する工程が、別のエンティティから前記凍結組成物を受け取ることを含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記エンティティが、有核細胞の前記組成物を作製および／または凍結するエンティティである、請求項８０に記載の方法。
  82. 提供する工程が、
    前記有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも１つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることを含む、請求項７９に記載の方法。
  83. 提供する工程が、別のエンティティから前記ナノ粒子を受け取ること、および前記ナノ粒子を前記有核細胞および前記緩衝化水性媒体溶液と組み合わせることを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 有核細胞の前記凍結組成物を加温する前に、有核細胞の前記凍結組成物を少なくとも１時間凍結したままに維持することを含む、請求項７９〜８３のいずれかに記載の方法。
  85. 前記保存剤が、
    配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
    場合により、抗体分子またはＦｃドメインを含む第２の異種ドメイン
    を含むポリペプチドと複合体化されたＩＬ−１５分子を含む、請求項７９〜８４のいずれかに記載の方法。
  86. 前記抗体分子が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、ｓｃＦｖ、重鎖抗体断片、アフィボディ断片または誘導体、またはｓｄＡｂ（ナノボディ）断片を含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ナノ粒子が、
    配列番号６のポリペプチドあるいはＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
    配列番号５のポリペプチドあるいはＩＬ−１５結合活性を有するそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列；
    約１〜１０、２〜８、４〜６、または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧ、および１０〜５０、２０〜４０、または約３０アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー；および
    場合により、ＣＤ４５に対する抗体分子
    を含む、請求項７９〜８６のいずれかに記載の方法。
  88. 前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、１時間〜３週間、例えば１時間〜２４時間、１日間〜３日間、４日間〜６日間、１週間〜２週間または２週間〜３週間にわたって起こる、請求項７９〜８７のいずれかに記載の方法。
  89. 前記有核細胞が免疫エフェクター細胞または造血幹細胞である、請求項７９〜８８のいずれかに記載の方法。
  90. 前記有核細胞がリンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記有核細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している、請求項７９〜９１のいずれかに記載の方法。
  93. 前記ナノ粒子が少なくとも１つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、請求項７９〜９２のいずれかに記載の方法。
  94. 前記ナノ粒子が、前記有核細胞の表面と共有結合的にコンジュゲートしているか、または共有結合的にコンジュゲートしていない、請求項７９〜９３のいずれかに記載の方法。
  95. 前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、請求項７９〜９４のいずれかに記載の方法。
  96. 前記ナノ粒子が、場合により、前記ナノ粒子表面上に少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項７９〜９５のいずれかに記載の方法。
  97. 前記ナノ粒子が、ＰＥＧとポリリジンとを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記ＰＥＧが、約１〜１０、２〜８、４〜６または約５ｋＤの分子量を有するＰＥＧである、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ポリリジンが、１０〜５０、２０〜４０または約３０アミノ酸の平均長を有する、請求項９７または９８に記載の方法。
  100. 前記保存剤が、
    配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、ＩＬ−１５結合活性を有するアミノ酸配列を含む第１のドメイン；および
    場合により、抗体分子またはＦｃ断片を含む第２の異種ドメイン
    を含むポリペプチドと複合体化されたＩＬ−１５分子を含む、請求項７９〜９９のいずれかに記載の方法。
  101. 前記抗体分子が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ２断片、ｓｃＦｖ、重鎖抗体断片、アフィボディ断片または誘導体、またはｓｄＡｂ（ナノボディ）断片を含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記組成物が、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ８、またはＣＤ４に対する抗体分子を含む、請求項７９〜１０１のいずれかに記載の方法。
  103. 前記ナノゲルが８０重量％超のタンパク質であり、かつ／または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、請求項７９〜１０２のいずれかに記載の方法。
  104. 前記ナノ粒子が、レドックス、ｐＨまたは酵素に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、請求項７９〜１０３のいずれかに記載の方法。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9603944B2 (en) 2013-09-27 2017-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Carrier-free biologically-active protein nanostructures
CN116212048A (zh) 2015-08-12 2023-06-06 麻省理工学院 纳米颗粒的细胞表面偶联
AU2018328209A1 (en) 2017-09-05 2020-04-23 Torque Therapeutics, Inc. Therapeutic protein compositions and methods of making and using the same
MX2021002332A (es) * 2018-08-27 2021-08-11 Affimed Gmbh Células nk crioreservadas precargadas con una construcción de anticuerpo.
EP3880232A4 (en) * 2018-11-15 2022-08-10 Torque Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
CN113924125A (zh) * 2019-03-29 2022-01-11 转矩医疗股份有限公司 免疫治疗组合物及其用途
US20220289838A1 (en) * 2019-08-19 2022-09-15 Nantong Yichen Biopharma. Co. Ltd. Immunocytokine, Preparation for the Same, and Uses Thereof
CN112125832B (zh) * 2020-08-12 2022-09-20 北京大学 刺突蛋白受体结合结构域纳米凝胶及其制备方法与应用
WO2022165260A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
CN112891556B (zh) * 2021-02-01 2023-03-03 浙江大学医学院附属第一医院 一种单抗类药物口服纳米凝胶及其制备方法
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2024086827A2 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Repertoire Immune Medicines, Inc. Cd8 t cell targeted il2
WO2024097859A1 (en) * 2022-11-03 2024-05-10 Board Of Regents, The University Of Texas System An adjuvant and cd47-blockade combination cancer treatment and methods of using the same
WO2024130179A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013541335A (ja) * 2010-09-21 2013-11-14 アルター・バイオサイエンス・コーポレーション 多量体ｉｌ−１５可溶性融合分子並びにその製造及び使用方法
WO2015048498A2 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Carrier-free biologically-active protein nanostructures
JP2018523710A (ja) * 2015-08-12 2018-08-23 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ナノ粒子の細胞表面共役

Family Cites Families (251)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0440742B1 (en) 1988-10-27 1997-01-15 The Regents Of The University Of Minnesota Liposome immunoadjuvants containing il-2
JPH03244601A (ja) 1990-02-22 1991-10-31 Masuko Suzuki マンナンと癌細胞分化誘導体の複合体、その製法及び抗癌剤
US5453491A (en) 1990-09-11 1995-09-26 Kiyoshi Takatsu Murine interleukin-5 receptor
US6197298B1 (en) 1991-04-19 2001-03-06 Tanox, Inc. Modified binding molecules specific for T lymphocytes and their use as in vivo immune modulators in animals
CA2065658A1 (en) 1991-04-19 1992-10-20 Tse-Wen Chang Conjugates of liposomes or microbeads and antibodies specific for t lymphocytes and their use in vivo immune modulators
EP0633929B1 (en) 1992-04-01 2004-03-03 The Rockefeller University METHOD FOR $i(IN VITRO) PROLIFERATION OF DENDRITIC CELL PRECURSORS AND THEIR USE TO PRODUCE IMMUNOGENS
US20020085993A1 (en) 1992-11-25 2002-07-04 Ralph M. Steinman Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens
US6077519A (en) 1993-01-29 2000-06-20 University Of Pittsburgh Methods for isolation and use of T cell epitopes eluted from viable cells in vaccines for treating cancer patients
US5753261A (en) 1993-02-12 1998-05-19 Access Pharmaceuticals, Inc. Lipid-coated condensed-phase microparticle composition
US6180134B1 (en) 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
US5464629A (en) 1993-11-16 1995-11-07 Georgetown University Method of forming hydrogel particles having a controlled size using liposomes
EP0772624B1 (en) 1994-04-06 2000-09-13 Immunex Corporation Interleukin-15
US6548065B1 (en) 1994-05-06 2003-04-15 Immunex Corporation Interleukin-15 receptors
US5591630A (en) 1994-05-06 1997-01-07 Immunex Corporation Monoclonal antibodies that bind interleukin-15 receptors
ATE328890T1 (de) 1994-07-15 2006-06-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5795966A (en) 1995-02-22 1998-08-18 Immunex Corp Antagonists of interleukin-15
US6143292A (en) 1995-05-25 2000-11-07 Baxter International Inc. Allogeneic cell therapy for cancer following allogeneic stem cell transplantation
CA2252557A1 (en) 1996-04-26 1997-11-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagonists of interleukin-15
US6451308B1 (en) 1996-04-26 2002-09-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
IN184589B (ja) 1996-10-16 2000-09-09 Alza Corp
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
WO1998053048A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for making dendritic cells from expanded populations of monocytes and for activating t cells
US6977074B2 (en) 1997-07-10 2005-12-20 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
ES2438735T3 (es) 1997-07-10 2014-01-20 Mannkind Corporation Inmunización intralinfática para inducir respuestas de CTL efectores prolongadas
FR2766205B1 (fr) 1997-07-16 2002-08-30 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede
IN190388B (ja) 1997-10-01 2003-07-26 Biomira Usa Inc
US6787132B1 (en) 1997-12-04 2004-09-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Combined chemo-immunotherapy with liposomal drugs and cytokines
US6602709B1 (en) 1998-02-20 2003-08-05 The Rockefeller University Methods for use of apoptotic cells to deliver antigen to dendritic cells for induction or tolerization of T cells
US6693086B1 (en) 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
AU4603499A (en) 1998-06-26 2000-01-17 Joergen Agnholt Methods of expanding and selecting disease associated t-cells
US20020001841A1 (en) 1998-06-26 2002-01-03 Keld Kaltoft Continuous t-cell lines
ES2222719T3 (es) 1998-07-30 2005-02-01 Oakville Trading Hong Kong Limited Procedimiento para preparar conjugados reticulados solubles en agua.
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
IL129299A0 (en) 1999-03-31 2000-02-17 Mor Research Applic Ltd Monoclonal antibodies antigens and diagnosis of malignant diseases
US6613582B1 (en) 1999-05-25 2003-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for rapid and efficient protein cross-linking
US6521431B1 (en) 1999-06-22 2003-02-18 Access Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable cross-linkers having a polyacid connected to reactive groups for cross-linking polymer filaments
CA2381770C (en) 1999-08-24 2007-08-07 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
DK1224264T3 (da) 1999-10-15 2010-05-10 Baylor Res Inst Anvendelse af allogene cellelinjer til at belaste antigenpræsenterende celler til at fremkomme med immunresponser
DK1234031T3 (en) 1999-11-30 2017-07-03 Mayo Foundation B7-H1, AN UNKNOWN IMMUNE REGULATORY MOLECULE
EP1111039A1 (en) 1999-12-22 2001-06-27 Universite Libre De Bruxelles Immature autologous clinical grade dendritic cells intended for vaccination of cancer patients
US6319715B1 (en) 2000-04-21 2001-11-20 Cornell Research Foundation, Inc. Method of enhancing the delivery of nucleic acids using silica nanoparticles
US20020151004A1 (en) 2000-07-24 2002-10-17 Roger Craig Delivery vehicles and methods for using the same
JP4812951B2 (ja) 2001-03-21 2011-11-09 一般財団法人化学及血清療法研究所 特異性不明のｔ細胞のクローン化法及びその認識ペプチドリガンドの同定方法
MXPA03008864A (es) 2001-03-26 2004-12-06 Johnson & Johnson Composicion de liposoma para el suministro intracelular mejorado en un agente terapeutico.
US20030082806A1 (en) 2001-04-27 2003-05-01 Xcyte Therapies, Inc. Maturation of antigen-presenting cells using activated T cells
AU2002361468A1 (en) 2001-08-14 2003-03-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human S Method for rapid generation of mature dendritic cells
DE60238864D1 (de) 2001-11-07 2011-02-17 Mankind Corp Für epitope von antigenen kodierende expressionsvektoren und verfahren zu deren konzeption
US20030235619A1 (en) 2001-12-21 2003-12-25 Christine Allen Polymer-lipid delivery vehicles
GB0201679D0 (en) 2002-01-25 2002-03-13 Asterion Ltd Polypeptide variants
WO2003072753A2 (en) 2002-02-27 2003-09-04 Emory University Multimeric binding complexes
WO2003094850A2 (en) 2002-05-09 2003-11-20 Biomira, Inc. Lipid a and other carbohydrate ligand analogs
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
JP4409430B2 (ja) 2002-07-03 2010-02-03 小野薬品工業株式会社 免疫賦活組成物
EP1545204B1 (en) 2002-09-06 2016-08-10 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
EP2402036B1 (en) 2002-09-06 2018-02-14 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for delivering the therapeutic agents covalently attached thereto
CA2497554A1 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Dendreon Corporation Immunotherapeutic compositions and methods for the treatment of moderately to well-differentiated cancers
US20040057935A1 (en) 2002-09-20 2004-03-25 Cedars-Sinai Medical Center Intratumoral delivery of dendritic cells
AU2003300043A1 (en) 2002-10-10 2004-05-04 Elizabeth Chambers Carriers attached to blood cells
CN1703423A (zh) 2002-10-14 2005-11-30 豪夫迈－罗氏公司 Il－15拮抗剂
US8192485B2 (en) 2002-11-13 2012-06-05 The United States of America, as represented by the Department of Veterens Affairs Reversible hydrogel systems and methods therefor
JP4511943B2 (ja) 2002-12-23 2010-07-28 ワイス エルエルシー Ｐｄ−１に対する抗体およびその使用
US7402431B2 (en) 2004-03-01 2008-07-22 Immunovative Therapies, Ltd. T-cell therapy formulation
US7435592B2 (en) 2003-05-13 2008-10-14 Immunovative Therapies, Ltd. Compositions for allogeneic cell therapy
US20040247624A1 (en) 2003-06-05 2004-12-09 Unger Evan Charles Methods of making pharmaceutical formulations for the delivery of drugs having low aqueous solubility
WO2004108753A1 (en) 2003-06-10 2004-12-16 The University Of Melbourne Immunomodulating compositions, uses therefor and processes for their production
US7223544B2 (en) 2003-06-27 2007-05-29 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-engineered materials
AU2004220325B2 (en) 2003-06-30 2011-05-12 Domantis Limited Polypeptides
JP2007528848A (ja) 2003-07-09 2007-10-18 ヴァックスデザイン・コーポレーション ワクチン接種ノードを用いるプログラムされた免疫応答
US20050042298A1 (en) 2003-08-20 2005-02-24 Pardridge William M. Immunonanoparticles
US20050123542A1 (en) 2003-11-06 2005-06-09 Genmab A/S Methods for treating disorders involving monocytes
EP1550458A1 (en) 2003-12-23 2005-07-06 Vectron Therapeutics AG Synergistic liposomal adjuvants
WO2005079581A1 (en) 2004-01-20 2005-09-01 Cedars-Sinai Medical Center Intratumoral delivery of dendritic cells
ES2367027T3 (es) 2004-02-27 2011-10-27 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Medicale) Sitio de unión de la il-15 para il-15ralfa y mutantes específicos de il-15 que tienen actividad agonista/antagonista.
AU2005219413A1 (en) 2004-03-02 2005-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Nanocell drug delivery system
CA2571899A1 (en) 2004-07-01 2006-08-03 Yale University Targeted and high density drug loaded polymeric materials
WO2006017853A2 (en) 2004-08-11 2006-02-16 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Mutant interleukin-15-containing compositions and suppression of an immune response
TW200616604A (en) 2004-08-26 2006-06-01 Nicholas Piramal India Ltd Nitric oxide releasing prodrugs containing bio-cleavable linker
US8076132B2 (en) 2004-09-17 2011-12-13 Hasumi International Research Foundation Dendritic cell tumor injection (DCTI) therapy
US20060216269A1 (en) 2004-09-17 2006-09-28 Kenichiro Hasumi Dendritic cell tumor injection (DCTI) therapy
US20060104945A1 (en) 2004-10-05 2006-05-18 Choi Yong S Enhancement of B cell proliferation by IL-15
DE102004054536A1 (de) 2004-11-06 2006-05-11 Capsulution Nanoscience Ag Multimodal veränderte Zellen als zellulare Darreichungsformen für aktive Substanzen und als diagnostische Zellpartikel
US7964571B2 (en) 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
MX2007012221A (es) 2005-04-08 2008-03-18 Argos Therapeutics Inc Composicion de celulas dendriticas y metodos.
US20060257361A1 (en) 2005-04-12 2006-11-16 Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Novel form of interleukin-15, Fc-IL-15, and methods of use
CA2606018A1 (en) 2005-04-28 2006-11-02 Ventana Medical Systems, Inc. Nanoparticle conjugates
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
JP5236461B2 (ja) 2005-05-17 2013-07-17 ユニバーシティ オブ コネチカット 生物におけるイムノモデュレーションのための組成物および方法
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
US20070148246A1 (en) 2005-08-11 2007-06-28 Dan Luo Nucleic Acid-Based Matrixes
US20070059318A1 (en) 2005-08-15 2007-03-15 Balu-Iyer Sathy V Lipid nano particulates containing antigens as cancer vaccines
US20080267876A1 (en) 2005-09-20 2008-10-30 Yissum Research Development Company Nanoparticles for Targeted Delivery of Active Agent
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
JP5954918B2 (ja) 2005-12-08 2016-07-20 ノースウエスト バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド 未成熟な単球性樹状細胞の活性化を誘導するための組成物および方法
AU2006326283B2 (en) 2005-12-12 2012-01-19 Ac Immune S.A. Therapeutic vaccine
ATE534415T1 (de) 2005-12-13 2011-12-15 Harvard College Gerüste zur zelltransplantation
US20070160578A1 (en) * 2005-12-14 2007-07-12 The Gov. Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dep. Of Health And Human Services Expansion of natural killer and CD8 T-cells with IL-15R/ligand activator complexes
CN101309705A (zh) 2006-01-13 2008-11-19 独立行政法人理化学研究所 用于免疫疾病的预防或治疗剂以及方法
NZ596494A (en) 2006-01-13 2013-07-26 Us Gov Nat Inst Health Codon optimized il-15 and il-15r-alpha genes for expression in mammalian cells
CA2642532A1 (en) 2006-02-16 2007-08-23 Nascent Biologics, Inc. Methods for improving immune function and methods for prevention or treatment of disease in a mammalian subject
US8653238B2 (en) 2006-02-27 2014-02-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for transport of molecules with enhanced release properties across biological barriers
US20080171059A1 (en) 2006-08-07 2008-07-17 Shanshan Wu Howland Methods and compositions for increased priming of t-cells through cross-presentation of exogenous antigens
EP1921452A1 (en) 2006-11-08 2008-05-14 Medizinische Hochschule Hannover Method for the diagnosis of leukemia
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
DE102006060824B4 (de) 2006-12-21 2011-06-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Nachweis von individuellen T-Zell-Reaktionsmustern gegen Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in Tumorpatienten als Basis für die individuelle therapeutische Vakzinierung von Patienten
EP1987839A1 (en) 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US9244059B2 (en) 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US8492118B2 (en) 2007-05-11 2013-07-23 Altor Bioscience Corporation Fusion molecules and IL-15 variants
WO2009002562A2 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Marine Polymer Technologies, Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
EP2025746A1 (en) 2007-08-16 2009-02-18 Cell Med Research GMBH Dendritic cells
WO2009025846A2 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2009042215A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Inhibition of dendritic cell-driven regulatory t cell activation and potentiation of tumor antigen-specific t cell responses by interleukin-15 and map kinase inhibitor
WO2009046738A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc)
AU2008321174A1 (en) 2007-11-14 2009-05-22 The Regents Of The University Of California Sterol-modified amphiphilic lipids
JP2009149526A (ja) 2007-12-18 2009-07-09 Tokyo Medical & Dental Univ サイトカイン−ナノゲル複合体を含む皮下注射又は筋肉内注射徐放製剤
US8629098B2 (en) 2008-01-15 2014-01-14 Yale University Compositions and methods for adoptive and active immunotherapy
EP2297303A4 (en) 2008-04-29 2012-06-20 Brigham & Womens Hospital CELL MEMBRANE MANIPULATION
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
EP2324055A2 (en) 2008-08-25 2011-05-25 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
US8323696B2 (en) 2008-08-29 2012-12-04 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Nanoparticles for immunotherapy
US8927697B2 (en) 2008-09-12 2015-01-06 Isis Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
CA2998281C (en) 2008-09-26 2022-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1 antobodies and uses therefor
KR101316159B1 (ko) 2008-10-24 2013-10-15 아이알엠 엘엘씨 생합성적으로 생성된 피롤린-카르복시-리신, 및 피롤린-카르복시-리신 및 피롤리신 잔기의 화학적 유도체화를 통한 부위 특이적 단백질 변형
US9283184B2 (en) 2008-11-24 2016-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for localized agent delivery
US8728806B2 (en) 2008-12-06 2014-05-20 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to Th-1 dendritic cells
EP4169951A1 (en) 2008-12-09 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
US20100266642A1 (en) 2009-02-20 2010-10-21 Bind Biosciences, Inc. Modified cells for targeted cell trafficking and uses thereof
WO2010104865A2 (en) 2009-03-09 2010-09-16 The Regents Of The University Of California Single protein nanocapsules for protein delivery with long-term effect
EP2405758B1 (en) 2009-03-09 2016-04-27 Molecular Express, Inc. Methods and compositions for liposomal formulation of antigens and uses thereof
EA028288B1 (ru) 2009-05-27 2017-10-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Наноносители, имеющие компоненты с различными скоростями высвобождения
US20100324124A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods relating to DNA-based particles
US20100323018A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Massachusetts Institute Of Technology Branched DNA/RNA monomers and uses thereof
US8467973B2 (en) 2009-07-28 2013-06-18 Promising Future, Llc Pairing processes for preparing alloreactive cytotoxic T cells
US8666674B2 (en) 2009-07-28 2014-03-04 Promising Future, Llc Pairing processes for preparing reactive cytotoxic T cells
EP2464377B1 (en) 2009-08-14 2016-07-27 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
CN102625832A (zh) 2009-08-24 2012-08-01 贝勒医学院 产生对多种肿瘤抗原或多种病毒特异的ctl细胞系
US8075895B2 (en) 2009-09-22 2011-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Identification of antigenic peptides from multiple myeloma cells
KR20120093978A (ko) 2009-10-27 2012-08-23 이뮤니쿰 에이비 항원 특이적 ｔ 세포의 증식 방법
CN102711837B (zh) 2009-11-18 2016-10-19 尼克塔治疗公司 盐形式的多-臂聚合物-药物偶联物
CN104961829B (zh) 2009-11-24 2018-08-21 米迪缪尼有限公司 针对b7-h1的靶向结合剂
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
CA2783876C (en) 2009-12-11 2018-04-03 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. New conjugates and compositions for immunotherapy and antitumoral treatment
US8993731B2 (en) 2010-03-11 2015-03-31 Ucb Biopharma Sprl PD-1 antibody
RU2595872C2 (ru) 2010-03-19 2016-08-27 Массачусетс Интитут Оф Текнолоджи Композиции липидных везикул и способы применения
US20110229556A1 (en) 2010-03-19 2011-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Lipid-coated polymer particles for immune stimulation
US9149432B2 (en) 2010-03-19 2015-10-06 Massachusetts Institute Of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
JP6158511B2 (ja) 2010-06-11 2017-07-05 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ−３抗体
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US9289505B2 (en) 2010-08-17 2016-03-22 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for delivering nucleic acid molecules and treating cancer
US9487800B2 (en) 2010-09-08 2016-11-08 Chemotherapeutisches Forschunginstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
US20130203675A1 (en) 2010-09-16 2013-08-08 Joseph M. DeSimone Asymmetric biofunctional silyl monomers and particles thereof as prodrugs and delivery vehicles for pharmaceutical, chemical and biological agents
WO2012054792A2 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Virginia Commonwealth University Composition and method for immunological treatment of cancer, prevention of cancer recurrence and metastasis, and overcoming immune suppressor cells
EP2630158B1 (en) 2010-10-22 2018-12-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Discovery of regulatory t cells programmed to suppress an immune response
US20140081012A1 (en) 2011-02-15 2014-03-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle, liposomes, polymers, agents and proteins modified with reversible linkers
EP2697367B1 (en) 2011-04-13 2018-12-19 Immunicum AB Method for proliferation of antigen-specific t cells
WO2012142410A2 (en) 2011-04-15 2012-10-18 The Regents Of The University Of California Redox responsive polymeric nanocapsules for protein delivery
WO2012145493A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Amplimmune, Inc. Antibodies and other molecules that bind b7-h1 and pd-1
CA2834532A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers to reduce cytotoxic t lymphocyte responses
SG10201604236RA (en) 2011-05-26 2016-07-28 Geneius Biotechnology Investments Llc Modulated Immunodominance Therapy
EP2537933A1 (en) 2011-06-24 2012-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
US20130045491A1 (en) 2011-07-19 2013-02-21 Derya Unutmaz Methods for activating t cells
US9511150B2 (en) 2011-07-19 2016-12-06 CellMosaic, Inc. Crosslinking reagents, macromolecules, therapeutic bioconjugates, and synthetic methods thereof
LT2734551T (lt) 2011-07-24 2018-04-10 Cure Tech Ltd. Humanizuotų imunomoduliuojančių monokloninių antikūnų variantai
WO2013033430A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Wake Forest School Of Medicine Targeted delivery and prodrug designs for platinum-acridine anti-cancer compounds and methods thereof
WO2013035099A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
EP3326467B1 (en) 2011-09-16 2020-03-11 Baylor College of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
SG11201402603WA (en) 2011-11-28 2014-06-27 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
JP6081483B2 (ja) 2011-12-12 2017-02-15 セル・メディカ・リミテッド Ｔ細胞を増殖させるプロセス
JP5577472B2 (ja) 2012-02-10 2014-08-20 医療法人社団博心厚生会 単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法
JP2013173689A (ja) 2012-02-24 2013-09-05 Univ Of Tsukuba 高分子化ニトロキシドラジカル化合物と非ステロイド性抗炎症薬の複合体
WO2013181634A2 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind pd-l1
US20130337471A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Emory University Cell identification with nanoparticles, compositions and methods related thereto
US9149535B2 (en) 2012-06-28 2015-10-06 University Of South Carolina Polymers and the preparation of nanogel drug cocktails
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
US9597356B2 (en) 2012-07-05 2017-03-21 Fullhope Biomedical Co., Ltd Method for treating cancers with dendritic killer cells and pharmaceutical composition comprising the same
TWI503414B (zh) 2012-07-05 2015-10-11 Fullhope Biomedical Co Ltd 一種製備專一性ｔ細胞之配方、方法及其配方製備方法
US9597383B2 (en) 2012-07-05 2017-03-21 FullHope Biomedical Co., Ltd. Formulation and method for preparing specific T cell, and method for preparing the formulation
TWI458485B (zh) 2012-07-05 2014-11-01 Fullhope Biomedical Co Ltd 毒殺型樹突細胞群組用於製備藥物的用途及包含其之醫藥組合物
US9845356B2 (en) 2012-08-03 2017-12-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Single agent anti-PD-L1 and PD-L2 dual binding antibodies and methods of use
MX370848B (es) 2012-10-04 2020-01-08 Dana Farber Cancer Inst Inc Anticuerpos monoclonales humanos anti-pd-l1 y métodos de uso.
JP6359019B2 (ja) 2012-10-24 2018-07-18 ノバルティス アーゲー ＩＬ−１５Ｒα型、ＩＬ−１５Ｒα型を発現する細胞、ならびにＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の治療上の使用
WO2014074952A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for localized delivery of agents to hiv-infected cells and tissues
AR093984A1 (es) 2012-12-21 2015-07-01 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) humano
WO2014127296A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd Cancer vaccines and vaccination methods
CA2906514C (en) 2013-03-14 2021-07-27 Jonathan Schneck Nanoscale artificial antigen presenting cells
SI2970464T1 (sl) 2013-03-15 2020-08-31 Glaxosmithkline Intellectual Propety Development Limited Anti-LAG-3 vezavni proteini
FR3004106B1 (fr) 2013-04-05 2016-08-05 Oreal Composition contenant des particules composites filtrant les radiations uv de taille moyenne superieure a 0,1μm et des particules d'aerogel de silice hydrophobes
HUE058364T2 (hu) 2013-04-19 2022-07-28 Cytune Pharma Citokinbõl származó kezelés redukált vaszkuláris permeabilitási szindrómával
DK2992017T3 (da) 2013-05-02 2021-01-25 Anaptysbio Inc Antistoffer rettet mod programmeret død-1 (pd-1)
JP6463577B2 (ja) 2013-05-14 2019-02-06 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 改変キメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞のヒト応用
CN105683217B (zh) 2013-05-31 2019-12-10 索伦托治疗有限公司 与pd-1结合的抗原结合蛋白
WO2014204762A1 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology In vivo targeting of cells with ligand-conjugated particles
US20160145355A1 (en) 2013-06-24 2016-05-26 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
EP3013356B1 (en) 2013-06-27 2018-10-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin 15 (il-15) antagonists and uses thereof for the treatment of autoimmune diseases and inflammatory diseases
DK3444271T3 (da) 2013-08-08 2022-01-10 Cytune Pharma Il-15- og il-15r-alfa-sushi-domænebaserede modulokiner
KR20220148304A (ko) 2013-08-08 2022-11-04 싸이튠 파마 병용 약학 조성물
UA120595C2 (uk) 2013-08-21 2020-01-10 Куревак Аг Композиція та вакцина для лікування недрібноклітинного раку легень
JP6623353B2 (ja) 2013-09-13 2019-12-25 ベイジーン スウィッツァーランド ゲーエムベーハー 抗ｐｄ−１抗体並びにその治療及び診断のための使用
NZ718283A (en) 2013-09-25 2022-05-27 Cytomx Therapeutics Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2015061668A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Anti-pd-l1 monoclonal antibodies and fragments thereof
EP3062779B1 (en) 2013-11-01 2024-06-12 Yale University Modular particles for immunotherapy
WO2015081158A1 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating hiv by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
DK3081576T3 (da) 2013-12-12 2019-10-21 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1-antistof, antigenbindende fragment deraf og medicinsk anvendelse deraf
WO2015103928A1 (zh) 2014-01-08 2015-07-16 上海恒瑞医药有限公司 Il-15异源二聚体蛋白及其用途
HRP20220214T1 (hr) 2014-01-15 2022-04-29 Kadmon Corporation, Llc Imunomodulacijska sredstva
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
CA2937503A1 (en) 2014-01-28 2015-08-06 Bristol-Myers Squibb Company Anti-lag-3 antibodies to treat hematological malignancies
WO2015120421A1 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Nvigen, Inc. Cell modulation nanocomposition, and methods of use
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
MA39711A (fr) 2014-04-03 2015-10-08 Nektar Therapeutics Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère
US20150335679A1 (en) 2014-05-20 2015-11-26 Kiromic, Llc Methods and Compositions for Treating Malignancies with Dendritic Cells
CN104189897A (zh) 2014-05-21 2014-12-10 深圳先进技术研究院 一种树突状细胞高效负载抗原的制备方法
WO2015181342A1 (en) 2014-05-29 2015-12-03 Spring Bioscience Corporation Pd-l1 antibodies and uses thereof
EP3685842B1 (en) 2014-06-06 2022-08-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Mesothelin-targeted chimeric antigen receptors and uses thereof
CN106574244B (zh) 2014-06-11 2022-01-07 保利比奥斯博特有限责任公司 用细胞因子组合物扩增淋巴细胞用于主动细胞免疫治疗
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
KR102130600B1 (ko) 2014-07-03 2020-07-08 베이진 엘티디 Pd-l1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단
EP3174974B1 (en) 2014-07-29 2020-05-20 Novartis AG Il-15 and il-15ralpha heterodimer dose escalation regimens for treating conditions
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
LT3186283T (lt) 2014-08-29 2020-03-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinuotoji terapija į naviką nutaikytais il-2 imunocitokinais ir antikūnais prieš žmogaus pd-l1
CA2963989A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
US10272050B2 (en) 2014-10-14 2019-04-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles and methods of use
US20170333571A1 (en) 2014-11-04 2017-11-23 The Regents Of The University Of California Targeted Delivery Platform for Delivery of Therapeutics
NZ731467A (en) 2014-11-06 2021-12-24 Hoffmann La Roche Anti-tim3 antibodies and methods of use
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
PT3235830T (pt) 2014-12-19 2020-10-06 Jiangsu Hengrui Medicine Co Complexo proteico de interleucina 15 e sua utilização
SG11201705064XA (en) 2014-12-24 2017-07-28 Neximmune Inc Nanoparticle compositions and methods for immunotherapy
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
EP3064507A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
JP2018510151A (ja) 2015-03-06 2018-04-12 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｔｉｍ３に結合する抗体医薬
WO2016145317A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Thomas Schwaab Enrichment of cd16+ monocytes to improve dendritic cell vaccine quality
WO2016145578A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Syz Cell Therapy Co. Methods of cancer treatment using activated t cells
US20180171294A1 (en) 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
EP3273975A4 (en) 2015-03-26 2018-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
MA41867A (fr) 2015-04-01 2018-02-06 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de cellule t et protéine 3 de mucine (tim-3)
US10858452B2 (en) 2015-09-16 2020-12-08 Insitut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Specific interleukin-15 (IL-15) antagonist polypeptide and uses thereof for the treatment of inflammatory and auto-immune diseases
JP2018532729A (ja) 2015-09-25 2018-11-08 アルター・バイオサイエンス・コーポレーション インターロイキン−１５スーパーアゴニストは、移植片対腫瘍活性を大幅に増強する
AU2016333873A1 (en) 2015-10-06 2018-05-17 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treatment of metastatic and refractory cancers and tumors
CN115920017A (zh) 2015-11-20 2023-04-07 纪念斯隆凯特林癌症中心 用于治疗癌症的方法和组合物
EP3892316A3 (en) 2015-12-29 2021-11-24 Thermogenesis Corp. Cell separation devices, systems, and methods
CN117362450A (zh) 2016-05-27 2024-01-09 阿尔托生物科学有限公司 具有cd3结合域的基于多聚体il-15的分子的构造和表征
JP7492336B2 (ja) 2016-10-21 2024-05-29 アルター・バイオサイエンス・コーポレーション 多量体ｉｌ－１５に基づく分子
AU2018328209A1 (en) 2017-09-05 2020-04-23 Torque Therapeutics, Inc. Therapeutic protein compositions and methods of making and using the same
EP3880232A4 (en) 2018-11-15 2022-08-10 Torque Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
CN113924125A (zh) 2019-03-29 2022-01-11 转矩医疗股份有限公司 免疫治疗组合物及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013541335A (ja) * 2010-09-21 2013-11-14 アルター・バイオサイエンス・コーポレーション 多量体ｉｌ−１５可溶性融合分子並びにその製造及び使用方法
WO2015048498A2 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Carrier-free biologically-active protein nanostructures
JP2016533344A (ja) * 2013-09-27 2016-10-27 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 無担体生物活性タンパク質ナノ構造体
JP2018523710A (ja) * 2015-08-12 2018-08-23 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ナノ粒子の細胞表面共役

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ENPING HONG: "CONFIGURATION-DEPENDENT PRESENTATION OF MULTIVALENT IL-15:IL-15Rα ENHANCES THE ANTIGEN-以下備考", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. VOL:291, NR:17, JPN5019005560, 22 April 2016 (2016-04-22), US, pages 8931 - 8950, ISSN: 0004536342 *
JOURNLA OF IMMUNOTHERAPY, vol. 39, no. 2, JPN6021024277, 2016, pages 90 - 100, ISSN: 0004762016 *
KAI-PING HAN: "IL-15:IL-15 RECEPTOR ALPHA SUPERAGONIST COMPLEX: HIGH-LEVEL CO-EXPRESSION IN RECOMBINANT 以下備考", CYTOKINE, vol. VOL:56, NR:3, JPN5019005559, 28 September 2011 (2011-09-28), US, pages 804 - 810, ISSN: 0004536341 *
PETER S KIM: "IL-15 SUPERAGONIST/IL-15RαSUSHI-FC FUSION COMPLEX (IL-15SA/IL-15RαSU-FC; ALT-803) MARKEDLY以下備考", ONCOTARGET, vol. VOL:7, NR:13, JPN5019005561, 29 March 2016 (2016-03-29), pages 16130 - 16145, ISSN: 0004536343 *

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