JPH03244601A

JPH03244601A - マンナンと癌細胞分化誘導体の複合体、その製法及び抗癌剤

Info

Publication number: JPH03244601A
Application number: JP4200790A
Authority: JP
Inventors: Masuko Suzuki; 益子鈴木; Shigeo Suzuki; 茂生鈴木
Original assignee: Minophagen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Minophagen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-02-22
Filing date: 1990-02-22
Publication date: 1991-10-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、マンナンと癌細胞分化誘導体の複合体、その
製法及びこれを含有する抗癌剤に関する。

［従来の技術］従来から用いられている抗癌剤の大部分は、腫瘍細胞に
対する特異性に乏しく、また種々の副作用を示すことが
知られている。そこで抗癌剤を複合体化することによっ
て、その副作用を低減する試みが盛んに行なわれている
。

本発明者等は、ＢＲＭとして抗腫瘍活性を示すパン酵母
中性マンナンに、抗腫瘍性抗生物質であるマイトマイシ
ンＣを結合させたマンナン−マイトマイシンＣ複合体が
マウス移植１１！ＩｌｆｇＪに対して、マイトマイシン
Ｃ単独に比べて、有意な抗Ｍ４Ｐ：ｊ活性の増強を示す
ことを発見した。この抗腫瘍性は、複合体中のマンナン
が腫瘍細胞に対し、標的指向性を有し、その結果腫瘍細
胞に特異的に細胞障害性を引き起こすことにより発揮さ
れることを発表している（Ｋ、＾ｉｚａｗａ、　Ｔ、Ｍ
ａｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｋ、Ｔｓｕｋａ−ｄａ、　Ａ、Ｉ
ｔｏ、　Ｈ，５ａｔｏ、　Ｓ、５ｕｚｕｋｉ、＆　Ｍ、
５ｕｚｕｋｉ。

Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａ　Ｂａ
ｋｅｒ　ｓ　、Ｙｅａｓｔ　Ｍａｎｎａｎ−Ｍｉｔｏｍ
ｙｃｉｎ　ＣＣｏｎｊｕｇａｔｅ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｍ
ｏｕｓｅＩＴｅｐａｔｏｍａ、　ＭＨ１３４，Ｉｎ　Ｖ
ｉｖｏ　ａｎｄ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、Ｉｎｔ。

Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、、　１ｌｃ２）、　
１９１−１９５．１９８９）。

一方、現在白血病を含む腫瘍細胞に対する新しい治療法
の一つとして、ｆｌｉ［細胞を分化誘導し、正常細胞へ
と向かわせる研究が行なわれている（！！積木男、高久
史麿編集、癌細胞の分化誘導と制癌、ソフトサイエンス
社、１９８５）　、この分化誘導の研究で、多種類の分
化誘導効果を有する化学物質が見出された。例えば、マ
イトマイシンＣ、シトシンアラビノサイド等の抗腫瘍剤
や、ヘミン、醋酸、サイト力イン、ビタミン等、様々な
物質が分化誘導能を有することが報告されている（把積
本男、癌と化学療法、１４　（５）　、１３４９−１３
５７、　ｌ’１８７）。

［発明が解決しようとする課題］上記マンナン−マイトマイシンＣ複合体は、従来の抗腫
瘍性多糖体と抗癌抗生物質の効果の増強と、抗癌抗生物
質の副作用の低減とを目的として合成されたもので、低
毒性であって腫瘍細胞障害性を荷する。

本発明者等はマンナンに、上述の腫瘍細胞に対し癌細胞
分化誘導作用を有する化学物質、特に抗腫瘍性を併せ保
有する化学物質を導入し、腫瘍細胞に対する標的指向性
を有する低毒性であって、かつ腫瘍細胞障害性のみなら
ず、腫瘍細胞に対する分化誘導作用による腫瘍細胞の増
殖抑制効果を併せもつ、従来の抗Ｍ瘍性薬剤とは異なる
新規な多機能性抗腫瘍複合体を得るに至った。

本発明はかかる多機能性抗腫瘍複合体、その製法及びこ
れを有効成分とした抗癌剤を提供することを課題とする
。

［課題を解決するための手段］本発明において、原料であるマンナンは次のような構造
式であられされる。

このマンナンは、以下に述べる方法によって得ることか
できる。即ち、市販のパン酵母（Ｓａｃ−ｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓＬａｓｅ）より１３０℃、２
時間熱水抽出を行ない、セバーグ法による除蛋白、フェ
ーリング沈殿後、得られたマンナン粗画分をイオン交換
樹脂による脱銅、透析、濃縮後、ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ａ−５０（Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａ社製）カラム
クトマトグラフィーにより溶出し、マンナン画分を得。

透析、濃縮、エタノール沈殿後、減圧乾燥することによ
り、マンノース量にして９８％以上の純度のパン６！、
Ｉ３マンナンを得る。

またマンナンは、上記の場合の他、Ｓａｃｃｈａｒｏ−
ｍｙｃｅｓ属やＣａｎｄｉｄａ属などの酵母類、または
アイポリ−ナツツなど殖物からも得ることができる。

上記マンナンに、化学構造上において結合可能な分化誘
導能を有する化学物質としては、次のようなものがある
。例えば、シトシンアラビノシド、アザシチヂン、サイ
クロシチヂン、マイトマイシンＣ１５−フルオロウラシ
ル、プレオマイシン、ハービマイシン、アクチノマイシ
ンＤ、ピューロマイシン、６−メルカプトプリン、ヒポ
キサンチン、メトトレキセート、ピラゾール、シクロヘ
キシミド、ダウノルビシンなどがその代表的なものとし
て挙げられるが、必ずしもこれらの化学物質に限定され
るものではない。

マンナン−化学物質複合体の合成は、マンナンにスペー
サーとして、通常はε−アミノ低級アルカン酸を用いる
ことができ、通常炭素数４〜８のＣ−アミノ−Ω−アル
カ７Ｍ等が用いられる。ハロゲン化シアンとしては臭化
シアン、塩化シアン、ヨウ化シアン等が使用できる。

奉祝合体の合成は次のようにして行なう。まずマンナン
を水に溶解し、これにハロゲン化シアンを加え、ｐＨを
１０．７に調整し、室温下で３〜４．５時間撹拌し活性
化したマンナンを得る。

次いでこれにε−７ミノアルカン酸を加え、ｐＨ９，０
で室温下、２４時間撹拌して反応させ、スペーサーを導
入したマンナンを得る。

次に、これに上述した分化誘導体を加え、さらに適当な
縮合剤、例えば水溶性カルボジイミド等を触媒として使
用し、ｐＨ５〜６で室温下において２４時間撹拌して反
応させる。反応終了後、限外濾過にて精製段凍結乾燥す
ることにより、マンナンの水酸基と分化誘導剤のＮＨ基
とがスペーサーを介して結合した複合体が得られる。

これらは、後述するように、Ｋ５６２細胞に対して分化
誘導効果を発揮し、Ｋ５６２細胞の増殖を抑制すること
が誌められるので、副作用の少ない有効な抗癌剤として
使用することができる。

この場合、投与形態としては、凍結乾燥粉末として低温
保存し、投与時には適当な塩類緩衝溶液に溶解し、注射
剤として使用することができる。

また投与量は、患者の年令、症状等により異なるが、成
人−日あたり、ｌＯμｇ／ｋｇ−１，０００μｇ／ｋｇ
の範囲で用いることにより、所期の効果が期待できる。

以下に本発明の実施例を掲げる。

［実施例１］本複合体の製造例パン酵母マンナン、１００　ｍｇをＩＮ水酸化ナトリウ
ム液で調整したｐＨ１０，７の蒸留水１０　ｍｇに溶解
後、臭化シアンを２０．２０及び１５ｍｇグループに分
けて、夫々のグループを上記ｐＨ１０，７の蒸留水２０
０μｌに溶解して上記溶解液に加え、その後ｐＨをＩＮ
の水酸化ナトリウム液により１０．７に維持しながら約
６時間反応させる。

次いでこれをｐＨ９，ｏｌＮ塩酸にて調整後５ε−アミ
、ツカプロン酸１００　Ｂを加え、ＩＮ水酸化ナトリウ
ム液によりｐＨを９．０に維持しながら２４時間反応さ
せる。

反応終了後、Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｍ
ｂｒａｎｅＣｏｎｅｓ（ＡＭＩＣＯＮ　ＤｒＶ、、Ｗ、
Ｒ，ＧＲＡＣＥ　＆　ＣＯ，、Ｕ、Ｓ、Ａ製）にて１１
１１？外濾過を行ない稍製瀝縮する。

次にｐＨ５，５に調整した蒸留水１０　ｍｌにサイクロ
シチジン１０　ｍｇを溶解したものを加え、ｐＨを５．
５に調整後、水溶性カルボジイミドｚｏｏ　ｍｇを加え
、その後のｐ　Ｈを５〜６に維持しながら２４時間反応
させる。反応終了後、限外濾過にて精製ａｔａ後、凍結
乾燥にて乾燥複合体を得た。マンナン−サイクロシチジ
ン複合体の推定化学構造は、以下のようなものである。

上記合成での収率は、平均９０％であった。

また、サイクロシチジンの結合量は平均的２％であった
。

尚、複合体のＩｌｆ！瘍細胞に対する分化誘導効果は、
Ｋ５６２　、　ＨＬ６０、ＭＥＬおよびＭ１各細胞等を
用いることにより測定できる。即ち、複合体試料は腫瘍
細胞に添加して適当な条件下で培養し、その後の腫瘍細
胞の形態学的変化を定量的に測定し、未処理腫瘍細胞の
それと比較することにより、分化誘導活性を数値化する
ことができる。

上記方法により実施した薬理試験例を、以下に掲げる。

［試験例１に５６２細胞に対する増殖抑制効果Ｆ１合体の腫瘍細胞に対する分化誘導能は、Ｋ５６２細
胞を用いて行な−）た。腫瘍細胞培養用培地は、ｌＯ％
ＦＢＳ血清とペニシリンＧ、　１００　ｕｎｉｔ／ｍ１
、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含むように調
整されたＲＩ’ＭＩ−１４６０培地を使用した。Ｋ５６
２細胞に対する分化誘導能の測定は、Ｋ５６２細胞５×
１０’個／ｍｌとマンナン−サイクロシチジン複合体（
以下、ＷＮＭ−Ｃｙｃ　１　ｏ−Ｃと略す）の６０．１
５０　、６００ｕｇ／ｒｎｌの各溶液、更にマンナンに
対する陰性対象としてデキストラン（Ｐｂａｒｍａｃｉ
ａ社製Ｄｘｔｒａｎ　Ｔ２Ｏ）を用いて合成したデキス
トラン−サイクロシチジン複合体（以下、Ｄｅｘ−Ｃｙ
ｃｌｏ−Ｃと略す）の８０、２００．　８００ｕ　ｇ／
ｌａ１の各溶液と、サイクロシチジン（以下。

Ｃｙｃｌｏ−Ｃと略す）　１．２．３．０．１２．０ｕ
ｇ／＋ｎｌの各溶液とを混和し、３７℃においで５％Ｃ
Ｏｊ中で１時間培養した後、リン酸塩類緩衝液で２回洗
浄する（１．００Ｏｒｐｍ、　５分間、４℃）。

その後細胞を、複合体やＣｙｃｌｏ−Ｃを含まない新培
地中に悲濁し、４日間、３７℃の５％Ｃｏｔ中において
培養後、細胞の増殖率と赤芽球様細胞への分化率を測定
した。分化率の測定は、約　２００個の細胞を数え、そ
の中のＯ−ジアニシジンにより染色される細胞数を％で
示すものである。

また、Ｋ５６２細胞に対する増殖抑制効果の測定は、培
養４日日における未処置細胞群の平均細胞数を１００％
とし、複合体を添加した細胞群の平均細胞数と比較する
ことにより増殖抑制率を計算した。

Ｋ５６２細胞に対し、６００　μｇ／ｍｌのＷＮＭ−Ｃ
ｙｃｌｏ−Ｃは、第１図に示すように、８００ｕ　ｇ／
ｍｌのＤｅｘ−Ｃｙｃ　ｌ　ｏ−Ｃ（１２μｇ／ｍｌの
Ｃｙｃｌｏ−Ｃに対応する量）では認められない有意な
増殖抑制効果の増強が見られた。

また、６００　μｇ／ｍｌのＷＮＭ−Ｃｙ　ｃ　ｌ　ｏ
−Ｃでは、第２図に示すように、Ｄｅｘ−Ｃｙｃｌ。

−Ｃの８００　ｕｇ／ｍｌ　（Ｃｙｃ　１　ｏ−Ｃの１
２　μｇ／ｍｌに対応する鼠）に比べ、有意な分化誘導
効果の増強が見られた。

これらの結果より、ＷＮＭ−Ｃｙ　ｃ　ｌ　ｏ−Ｃはに
５６２細胞に対し分化誘導効果を発揮し、その結果増殖
も抑制されることが顕著に認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｋ５６２細胞の増殖におけるＷＮＭ−Ｃｙｃ
ｌ　ｏ−Ｃの効果を示す図、第２図は、Ｋ５６２細胞の
赤芽球様細胞への分化におけるＷＮＭ−Ｃｙ　ｃ　ｌ　
ｏ−Ｃの効果を示す図である。手続補正書平成２年６月５日１゜２゜３゜

Claims

【特許請求の範囲】

（１）マンナンの水酸基にスペーサーを介して癌細胞分
化誘導体を結合してなることを特徴とするマンナンと癌
細胞分化誘導体との複合体。
（２）前記スペーサーとして、ε−アミノ低級アルカン
酸を使用する特許請求の範囲第１項に記載のマンナンと
癌細胞分化誘導体の複合体。
（３）前記癌細胞分化誘導体は、シトシンアラビノシド
、アザシチヂン、サイクロシチヂン、マイトマイシンＣ
、５−フルオロウラシル、プレオマイシン、ハービマイ
シン、アクチノマイシンＤ、ピューロマイシン、６−メ
ルカプトプリン、ヒポキサンチン、メトトレキセート、
ピラゾール、シクロヘキシミド、ダウノルビシンの群か
ら選ばれたものである特許請求の範囲第１項又は２項に
記載のマンナンと癌細胞分化誘導体の複合体。
（４）マンナンを水に溶解し、ハロゲン化シアンを加え
、活性化したマンナンを得る工程と、上記活性化したマ
ンナンにスペーサーを加えて反応させ、該スペーサーを
導入したマンナンを得る工程と、上記マンナンに癌細胞
分化誘導体を加えて反応させる工程とからなることを特
徴とするマンナンと癌細胞分化誘導体の複合体の製法。
（５）前記スペーサーとして、ε−アミノ低級アルカン
酸を使用する特許請求の範囲第４項に記載のマンナンと
癌細胞分化誘導体の複合体の製法。
（６）前記癌細胞分化誘導体は、シトシンアラビノシド
、アザシチヂン、サイクロシチヂン、マイトマイシンＣ
、５−フルオロウラシル、プレオマイシン、ハービマイ
シン、アクチノマイシンＤ、ピューロマイシン、６−メ
ルカプトプリン、ヒポキサンチン、メトトレキセート、
ピラゾール、シクロヘキシミド、ダウノルビシンの群か
ら選ばれたものである特許請求の範囲第４項又は５項に
記載のマンナンと癌細胞分化誘導体の複合体の製法。
（７）マンナンの水酸基にスペーサーを介して癌細胞分
化誘導体を結合させたマンナンと癌細胞分化誘導体の複
合体を含有することを特徴とする抗癌剤。
（８）前記スペーサーとして、ε−アミノ低級アルカン
酸を使用する特許請求の範囲第７項に記載の抗癌剤。
（９）前記癌細胞分化誘導体は、シトシンアラビノシド
、アザシチヂン、サイクロシチヂン、マイトマイシンＣ
、５−フルオロウラシル、プレオマイシン、ハービマイ
シン、アクチノマイシンＤ、ピューロマイシン、６−メ
ルカプトプリン、ヒポキサンチン、メトトレキセート、
ピラゾール、シクロヘキシミド、ダウノルビシンの群か
ら選ばれたものである特許請求の範囲第７項又は８項に
記載の抗癌剤。