CN113924125A - 免疫治疗组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了用于治疗癌症的组合疗法，包括免疫刺激融合分子，其中包括免疫细胞靶向部分和细胞因子分子；和装载有蛋白纳米凝胶的免疫细胞，所述蛋白纳米凝胶包含可逆地交联的细胞因子分子和聚合物，及其药物和制剂，以及使用和制备的方法。

Description

免疫治疗组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月29日提交的美国临时申请第62/826,923号；2019年7月31日提交的美国临时申请第62/881,300号；2019年8月8日提交的美国临时申请第62/884,540号和2019年11月4日提交的美国临时申请第62/930,363号的优先权和权益；上述各自通过引用全文纳入本文。
序列表
通过EFS-Web在2020年3月30日创建的名为“174285_011704_sequence.txt”的具有231,284字节大小的ASCII文本文件通过引用其全部内容纳入本文。
技术领域
本公开一般涉及免疫治疗组合物。还提供了其制造和使用的方法。
背景技术
免疫疗法在治疗癌症和其他疾病和病症方面的潜力还没有被充分认识。许多早期成功的癌症治疗方法是单药疗法，其仅在一小部分患者中成功，并且经常复发。使用细胞疗法(如TIL、CAR-T细胞的TCR)与免疫治疗组合的组合疗法的发展可能是不可预测的，容易增加毒性并使疗效范围更窄。事实证明，开发组合疗法，即使是基于现有的药物，也是有挑战性的。例如，将IL-12或IL-15与T细胞组合的组合疗法的早期努力包括至少三项被终止的研究，其中两项提到了毒性(参见NCT01236573、NCT01369888和NCT01457131)。
当用于癌症治疗时，细胞因子(如IL-12和IL-15)可以充当具有抗肿瘤作用的免疫调节剂，并且可以增加针对某些类型肿瘤的免疫应答。然而，快速的血液清除和肿瘤特异性的缺乏需要全身给予高剂量的细胞因子，从而在肿瘤部位和其他相关组织处(例如，淋巴结和脾)获得足够的细胞因子浓度以激活免疫应答或具有抗肿瘤作用。这些高水平的全身性细胞因子可导致严重毒性和不良反应。IL-12和IL-15都已被证明作为单药诱导大量的毒性。
因此，仍然需要具有改进性质的细胞因子组合物和组合疗法，例如具有更高的治疗效果以及减少这些产物的副作用的数量和严重性(例如毒性，非肿瘤细胞的破坏等)。
发明概述
本文提供了用药物组合治疗疾病(如癌症)的新型免疫疗法。已经发现这种新型组合疗法在降低毒性方面表现出意想不到的改进，通过例如最小化剂量(协同效力)和/或在转归方面，通过例如增强效果(协同功效)。事实上，虽然本发明组合的各个药物单独产生相似或特征性的作用，但是当组合给药时，其展示出大大增强的作用。这种增强的作用比由所述药物的单独效力所预测或预期的强。因此，组合的作用不仅是协同的也是意想不到和出乎意料的。不同的方法和工具可用于评估根据本发明的药物组合的协同作用。参见例如，Tallarida，R.，评估药物协同作用的量化方法(Quantitative Methods for AssessingDrug Synergism)，Genes & Cancer，2(11)1003-1008，2011；Meyer，C.，等，沿着效力和功效轴量化药物组合协同作用(Quantifying Drug Combination Synergy Along Potency andEfficacy Axes)，Cell Systems，8，97-108，Feb.2，2019；和Ianevski，A.，SynergyFinder：用于分析药物组合剂量-反应矩阵数据的网络应用(SynergyFinder：a Web Applicationfor Analyzing Drug Combination Dose-Response Matrix Data)，Bioinformatics，33(15)，2413-15，2017；上述各自通过引用全文纳入本文。用于产生比较相互作用指数或组合指数以量化在药物组合中观察到的作用(如零相互作用(zero-interaction)、协同作用或拮抗作用)的多种参考模型述于例如，Schindler，M.协同作用理论：作为用于混合物的‘无相互作用’模型的山型反应表面(Theory of Synergistic Effects：Hill-type ResponseSurfaces as ‘Null-interaction’Models for Mixtures)，Theoretical Biology andMedical Modelling，14：15，2017，其通过引用全文纳入本文。
更具体地，本公开尤其提供了治疗性(如癌症免疫治疗)组合物，包括：第一免疫细胞，其表面装载多种蛋白纳米凝胶，和第二免疫细胞，其表面装载多种免疫刺激融合分子(IFM，可与“系连融合体(tethered fusion)”或TF互换使用)。在一些实施方式中，第一免疫细胞和第二免疫细胞是相同细胞，即，蛋白纳米凝胶和IFM可装载于单个细胞上。在一些实施方式中，第一免疫细胞和第二免疫细胞是不同的细胞，其中两个细胞(或细胞群)可一起给予或连续给予(期间有或没有一定量的时间)。在另一个实施方式中，IFM可以以“游离”形式递送-即，在溶液中，未与细胞附接。这种游离递送可以是全身性给予或瘤内给予，且可以与装载纳米凝胶的免疫细胞同时递送或在装载纳米凝胶的免疫细胞之前或之后递送。装载纳米凝胶的细胞和/或IFM(以细胞结合和/或游离形式)的给予可以重复给予。已经发现，这种纳米凝胶和IFM共同给药产生出乎意料和意想不到的协同作用。在协同作用下，可实现以更低的剂量和/或降低的毒性水平产生更高的疗效(对于一种或两种化合物)。可以有更宽的剂量窗口，在疗效和毒性之间有更大的跨度-即，在达到最大的、不期望的毒性水平之前，有更宽的范围以优化疗效的剂量。
具体地说，惊喜的发现IL-15纳米凝胶(包括化学交联的IL-15/IL-15Rα/Fc异二聚体(IL15-Fc)和聚合物的多聚体)和装载到细胞表面的IL-12系连融合体(融合到人源化抗-CD45 Fab的单链IL-12p70)的抗肿瘤活性在组合时产生改进的治疗状况，具有协同作用而不是简单相加。即，IL-15纳米凝胶和IL-12系连融合体组合的效力与将其效力纯粹相加的预期相比有统计学上的显著性差异(增加)。
在一些实施方式中，蛋白纳米凝胶可各自包括通过多种可生物降解的交联剂彼此可逆交联的多种治疗性蛋白单体。在一些实施方式中，通过动态光散射法测量蛋白纳米凝胶大小直径在30nm和1000nm之间。在一些实施方式中，给予有需要的对象后，交联剂在生理条件下降解，从而从蛋白纳米凝胶中释放治疗性蛋白单体。在一些实施方式中，蛋白纳米凝胶进一步包括表面修饰，如聚阳离子，以允许蛋白纳米凝胶与第一免疫细胞缔合。
在一些实施方式中，所述治疗性蛋白单体可包含一种或多种细胞因子分子和/或一种或多种共刺激分子，其中：
(i)一种或多种细胞因子分子选自IL-15，IL-2，IL-7，IL-10，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23，IL-4，IL-1α，IL-1β，IL-5，IFNγ，TNFa，IFNα，IFNβ，GM-CSF或GCSF；以及
(ii)一种或多种共刺激分子选自CD137，OX40，CD28，GITR，VISTA，抗-CD40或CD3。
在一些实施方式中，该交联剂可以是可降解或可水解的接头。在一些实施方式中，可降解的接头是氧化还原响应性接头。示例性接头以及制备和使用各种接头(例如，以制备纳米凝胶)的方法在PCT申请号PCT/US2018/049594，美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944和美国公开号2014/0081012中公开，其各自通过引用全文纳入本文。
在某些实施方式中，每个IFM可经工程改造以包含免疫刺激细胞因子分子和对免疫细胞表面抗原有亲和性的靶向部分(例如抗体或其抗原结合片段)，其中免疫刺激细胞因子分子可操作地连接到靶向部分。示例性IFM(也称作“系连融合体”或TF)公开在PCT国际公开号WO 2019/010219和WO2019/010222中，各自通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，免疫刺激细胞因子分子选自IL-15，IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23或IL-27或其变体形式中的一种或多种。抗原可选自CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CDl1c，CD18，CD25，CD127，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8，CCR10，CD16，CD56，CD137，OX40或GITR中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述IFM包含IL-12，例如与人源化的抗-CD45 Fab融合的单链IL-12p70。所述单链IL-12p70可包含由柔性接头连接的IL-12B和IL-12A。在一个示例中，“IL-12系连融合体”(融合到人源化抗-CD45 Fab的单链IL-12p70)可以重组表达、纯化，然后系连到表达CD45的免疫细胞(如T细胞)上以形成表面装载有免疫激动剂的T细胞。
在各种实施方式中，第一和第二免疫细胞可分别向需要(例如癌症免疫疗法)的患者提供和给予(例如依次地)。在一些实施方式中，免疫细胞可来自已被富集或训练以具有针对一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的特异性的T细胞群。
其他方面涉及用于提供癌症免疫治疗的方法，包括给予有需要的患者多种免疫细胞，其各自装载有第一组多个蛋白纳米凝胶和第二组多个免疫刺激融合分子(IFM)。
另一个方面涉及用于提供癌症免疫疗法的方法，其包括：向有需要的患者给予第一种多个免疫细胞，其各自装载有多个蛋白纳米凝胶；并给予所述患者第二种多个免疫细胞，其各自装载有多个免疫刺激融合体分子(IFM)。
在各自实施方式中，癌症免疫疗法用于治疗选自以下的癌症：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肝癌、食道癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、胰腺癌、睾丸癌、脑癌和骨癌，白血病、慢性淋巴细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、子宫内膜癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤(intraepithelial neoplasm)、喉癌、淋巴瘤；神经母细胞瘤；唇、舌、口和咽癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；甲状腺癌；和子宫癌。
另一方面涉及用于诱导人CD8+T细胞在人免疫治疗方案中协同扩增的方法，所述方案由共同给予至少两种免疫激动剂组成，第一免疫激动剂包括装载IL-12系连融合体的T细胞，和第二免疫激动剂包括装载IL-15纳米凝胶的T细胞，其中这种免疫激动剂的共同给予导致所述人CD8+T细胞的协同扩增效果。在一些实施方式中，装载IL-12系连融合体的T细胞、装载IL-15纳米凝胶的T细胞或这两种T细胞对一种或多种肿瘤相关抗原具有特异性。
在一些实施方式中，肿瘤相关抗原是由选自下组的癌症表达的一种抗原：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肝癌、食道癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、胰腺癌、睾丸癌、脑癌和骨癌，白血病、慢性淋巴细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、子宫内膜癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤(intraepithelial neoplasm)、喉癌、淋巴瘤；神经母细胞瘤；唇、舌、口和咽癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；甲状腺癌；和子宫癌。
在一些实施方式中，IL-12系连融合体包括人源化的抗-CD45抗体或选自Fab、F(ab′)2、Fd和Fv的抗体片段。在一些实施方式中，IL-15纳米凝胶包括多种交联的IL-15-Fc融合蛋白单体。
本文还提供了用于治疗癌症的方法，包括向有需要的哺乳动物同时给予协同的、治疗有效量的两种免疫激动剂，第一免疫激动剂包括装载IL-12系连融合体的T细胞，第二免疫激动剂包括装载IL-15纳米凝胶的T细胞。在一些实施方式中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方式中，所述癌症治疗进一步包括抗增殖细胞毒性剂，单独或与放射疗法组合。
在一些实施方式中，第一和第二免疫激动剂的给予比例为，任一免疫激动剂与其他免疫激动剂的比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70；1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95、1∶100、1∶120、1∶130、1∶140、1∶150、1∶160、1∶170、1∶180、1；190、1∶200、1∶500、1∶1000.1∶5000、1∶10,000、1∶100,000、2∶3、3∶4、2∶5、3∶5、3∶10、7∶10、9∶10、2∶15、4∶15、6∶15、7∶15、8∶15、11∶15、13∶15、14∶15、3∶20、7∶20、9∶20、11∶20、13∶20、17∶20、19∶20、1∶25、2∶25、4∶25、6∶25、7∶25、8∶25、10∶25、11∶25、12∶25、13∶25、14∶25、16∶25、17∶25、18∶25、19∶25、21∶25、22∶25、23∶25或24∶25。
在一些实施方式中，第一和第二免疫激动剂中至少其一被给予的剂量为：约2x107个细胞/m2、4x107个细胞/m2、1x108个细胞/m2、1.2x108个细胞/m2、2x108个细胞/m2、3.6x108个细胞/m2、6x108个细胞/m2、1x1010个细胞/m2、1.5x1010个细胞/m2、106个细胞/m2、约5x106个细胞/m2、约107个细胞/m2、约5x107个细胞/m2、约108个细胞/m2、约5x108个细胞/m2、约109个细胞/m2、约5x109个细胞/m2、约1010个细胞/m2、约5x1010个细胞/m2或约1011个细胞/m2。
一方面，提供了免疫刺激融合分子，包括：
(a)免疫刺激细胞因子分子；和
(b)免疫细胞靶向部分，其包含对靶标免疫细胞表面上的抗原具有亲和性的抗体的抗原结合片段，
其中所述免疫刺激细胞因子分子与所述抗原结合片段可操作地连接。
在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子，包括：
(a)免疫刺激细胞因子分子；和
(b)免疫细胞靶向部分，其包含具有对靶标免疫细胞表面上的抗原有特异性的抗原结合位点的抗体，其中所述抗体包含具有C末端和N末端的轻链，和具有C末端和N末端的重链，其中所述轻链通过二硫键与所述重链连接，
其中所述免疫刺激细胞因子分子在所述轻链的C末端，所述轻链的N末端或所述重链部分的N末端与所述抗体可操作地连接。
在另一方面，提供了一种免疫刺激融合分子，包括：
(a)IL-12分子；和
(b)T细胞靶向部分，其包含具有对CD45细胞表面受体有特异性的抗原结合位点的Fab片段；
其中Fab片段和所述IL-12分子作为融合分子可操作地连接在一起。
在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分靶向T细胞，选自效应T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CTL。在一些实施方式中，抗原是在T细胞表面表达的CD45受体。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分包含抗-CD45抗体BC8、4B2、GAP8.3或9.4的Fab片段，F(ab′)2，Fv，单链Fv或前述任一项的人源化形式。在一些实施方式中，免疫刺激细胞因子分子包含IL-12、单链IL-12、IL-12的亚基或任何前述形式的变体。免疫刺激融合分子可进一步包括对靶标免疫细胞表面上的抗原有亲和性的单链Fv，其中单链Fv可选地与抗原结合片段对相同的抗原有亲和性。在一些实施方式中，单链Fv与抗原结合片段对不同的抗原有亲和性。在一些实施方式中，抗原结合片段是Fab片段，其任选地包含任选地通过二硫键连接的轻链和重链片段，并且其中免疫刺激细胞因子分子在所述轻链的C-末端、所述轻链的N-末端、所述重链片段的C-末端或所述重链片段的N-末端可操作地连接至所述Fab片段。
在一些实施方式中，免疫刺激细胞因子分子通过接头可操作地连接至抗原结合片段。在一些实施方式中，接头选自：可裂解的接头、不可裂解的接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头和非螺旋接头，如包含Gly和Ser的肽接头。在一些实施方式中，肽接头是(GGGS)N(SEQ ID NO：124)或(GGGGS)N(SEQ ID NO：125)接头，其中N表示基序的重复数，并且是选自1-10的整数。
在一些实施方式中，抗原结合片段对CD45受体具有亲和性，并且包含：
(a)轻链可变氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的抗体部分中的可变结构域，或与SEQ ID NO：82的可变结构域有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列；和/或
(b)重链可变氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的可变结构域，或与SEQ ID NO：79的可变结构域有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，细胞因子分子包含IL-12分子，该IL-12分子具有对应于SEQID NO：50所示氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：50的细胞因子部分有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，细胞因子分子包含单链IL-12分子，其具有通过接头与IL-12B亚基连接的IL-12A亚基，该接头具有对应于SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：70的细胞因子部分有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，接头包含肽接头，该肽接头具有对应于与SEQ ID NO：36中的氨基酸序列的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36的细胞因子部分有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，单链Fv具有对应于SEQ ID NO：80的Fv部分的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80的Fv部分有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述Fab片段包含具有可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)的轻链和具有可变结构域(VH)和恒定结构域(CH1)的重链片段，其中所述轻链和重链片段任选地通过二硫键连接，并且其中轻链和重链片段各自包含C-末端和N-末端。在一些实施方式中，IL-12分子与所述轻链或重链片段的C-末端或N-末端可操作地连接。
在一些实施方式中，免疫刺激融合分子进一步包含肽接头，该肽接头具有与IL-12分子融合的第一末端和与Fab片段融合的第二末端，从而可操作地连接IL-12分子和Fab片段。
本文还提供分离的核酸分子，其编码本文所公开的任一种免疫刺激融合分子。
本文还提供了包含一种或多种核酸的载体，该核酸编码对应于SEQ ID NO：36、50、70、79、80或82的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36、50、70、79、80或82有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列的多肽。
本文还提供了包含本文所公开的核酸分子或载体的宿主细胞。
另一方面涉及修饰的免疫细胞，其包括：
(a)免疫刺激融合分子，包含
(i)免疫刺激细胞因子分子；和
(ii)对细胞表面抗原具有亲和性的免疫细胞靶向部分；和
(b)表达或以其他方式展示所述细胞表面抗原的靶标免疫细胞，
其中所述免疫刺激融合分子通过与所述细胞表面抗原的相互作用结合到所述免疫细胞的表面。
另一个方面涉及修饰的免疫细胞，其包含健康和/或非恶性免疫细胞以及与之结合的本文公开的免疫刺激融合分子。
另一方面涉及制备修饰的免疫细胞的方法，其包括：
(a)提供免疫细胞群；和
(b)将本文公开的免疫刺激融合分子与免疫细胞群一起孵育，以允许免疫刺激融合分子与其靶向结合，从而产生在细胞表面上结合有免疫刺激融合分子的免疫细胞群。
另一方面涉及用于免疫细胞疗法的组合物，该组合物包含：
(a)多个免疫刺激融合分子，各个融合分子包含
(i)免疫刺激细胞因子分子；和
(ii)对T细胞的细胞表面抗原具有亲和性的免疫细胞靶向部分；
(b)表达或以其他方式展示所述细胞表面抗原的T细胞群，其中所述多个免疫刺激融合分子通过与所述细胞表面抗原的相互作用结合到所述T细胞的表面；和
(c)药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂。
另一方面涉及药物组合物，其包含本文公开的免疫刺激融合分子和药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂。
本文还提供了用于治疗人对象的癌症的方法，该方法包括向人对象给予细胞治疗组合物，该组合物包括：
(a)多个免疫刺激融合分子，各个融合分子包含
(i)免疫刺激细胞因子分子；和
(ii)对T细胞的细胞表面抗原具有亲和性的免疫细胞靶向部分；和
(b)归巢于癌细胞或癌细胞存在的组织的T细胞群，并且其中所述T细胞表达所述细胞表面抗原，
其中所述多个免疫刺激融合分子结合至所述T细胞的表面，并且其中所述细胞因子分子在体内作用于所述人对象中的T细胞和/或其他免疫细胞群以刺激针对癌症的免疫应答。
在一些实施方式中，T细胞群包括原代T细胞，扩增的原代T细胞，衍生自PBMC细胞的T细胞，衍生自脐带血细胞的T细胞，与人对象自体的T细胞，与人对象同种异体的T细胞，基因工程改造的T细胞，CAR-T细胞，效应T细胞，活化T细胞，CD8+T细胞，CD4+T细胞和/或CTL。在一些实施方式中，在选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法或富集抗原特异性T细胞疗法的细胞疗法过程中将细胞治疗组合物给予人对象。
在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-12和/或IL-15。免疫细胞靶向部分可包含结合至CD45的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，免疫细胞是健康和/或非恶性免疫细胞。在各种实施方式中，IFM可进一步包含用于可操作地连接靶向部分和细胞因子分子的接头。例如，接头可以是选自：可裂解接头、不可裂解接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头，优选肽接头，其任选地包含Gly和Ser，其中优选肽接头是(GGGS)N或(GGGGS)N接头，其中N表示基序的重复数，并且是选自1-10的整数。
本文还提供了药物组合物，其包含本文公开的IFM和/或蛋白纳米凝胶和药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂。
另一个方面涉及修饰的免疫细胞(例如用于细胞治疗)，其包含健康和/或非恶性免疫细胞以及与之结合或靶向的本文公开的IFM和/或蛋白纳米凝胶。
在一些实施方式中，细胞疗法可用于治疗癌症，优选实体瘤癌症或血液癌症。
在各种实施方式中，细胞疗法可以选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，富集的抗原特异性T细胞疗法或NK细胞疗法。在某些实施方式中，多个健康和/或非恶性免疫细胞是对象自体的。
在一些实施方式中，免疫刺激部分是细胞因子分子。在某些实施方式中，细胞因子分子包括细胞因子，例如，包括选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23或IL-27，包括其变体(例如细胞因子衍生物，包含细胞因子分子和多肽的复合物，例如，细胞因子受体复合物及其其他激动剂形式)。在一个实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子。
在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分能够结合免疫细胞表面靶标，从而将免疫刺激部分靶向免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如淋巴细胞)。不希望受到理论的约束，认为免疫细胞靶向部分与免疫细胞表面靶标的结合会增加免疫刺激部分(例如细胞因子分子)及免疫细胞表面上的其相应受体，例如细胞因子受体的浓度，例如随时间的浓度，例如，相对于游离细胞因子分子与其细胞因子受体的缔合。在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标大量存在于免疫细胞的表面上(例如，超过免疫细胞表面上存在的细胞因子分子的受体的数目)。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分可选自与免疫细胞表面靶标(例如选自CD4、CD8、CD11a、CD19、CD20或CD45的靶标)结合的抗体分子或配体分子。在一个实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体分子或配体分子。在实施方式中，据信靶向部分特异性地将细胞因子分子递送至免疫细胞表面和/或增加至免疫细胞表面的浓度，从而导致细胞因子分子增加的定位、分布和/或增强细胞表面可及性中的一种或多种。在实施方式中，IFM基本上不干扰细胞因子分子的信号转导功能。这种靶向作用导致免疫细胞的增殖和活化的局部和长期刺激，从而诱导免疫应答的受控放大和活化。
因此，一方面，本公开内容提供了一种免疫刺激融合分子(IFM)，其包含免疫刺激部分(例如，细胞因子分子，共刺激分子的激动剂或负免疫调节剂的抑制剂)和免疫细胞靶向部分。
在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，连接至，例如共价连接至免疫细胞靶向部分(例如，直接或间接地，例如，通过肽接头)。在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分结合至免疫细胞(例如免疫效应细胞)的表面靶标(例如表面受体)。在实施方式中，IFM将免疫刺激部分(例如细胞因子分子)和免疫细胞靶向部分与免疫细胞(例如效应免疫细胞)缔合(例如连接在一起)。在一些实施方式中，IFM增加了免疫细胞表面的IFM的细胞因子分子的浓度(例如，随着时间的推移(例如一个特定的时间段)IFM的细胞因子分子的浓度)。在实施方式中，IFM的细胞因子分子在免疫细胞表面上的浓度增加导致以下一种或多种：(i)例如，相对于游离细胞因子分子，IFM的细胞因子分子在免疫细胞表面上的定位增加(例如水平)；(ii)例如，相对于游离细胞因子分子，IFM的细胞因子分子的细胞表面可及性(例如浓度(例如水平或量)和/或暴露持续时间)增加；(iii)例如，相对于游离细胞因子分子，在靶向的免疫细胞群，例如表达预选表面靶标，例如本文所述的表面靶标的细胞群中，细胞因子信号转导增加；(iv)例如，相对于游离细胞因子分子，延长靶细胞群中的细胞因子信号转导(例如，将细胞因子信号转导的持续时间延长至少8小时，例如24小时)；(v)引起免疫刺激；(vi)增加，例如靶向的免疫细胞群的免疫细胞的活化和/或增殖；或(vii)与游离细胞因子分子相比显示减少的副作用，例如较低的全身毒性。在一些实施方式中，IFM改变(例如增加)(i)-(vii)中的任何一个的程度大于游离细胞因子分子(如至少8小时，如24小时)。在一个实施方式中，本文所述细胞因子分子是IL-15分子，免疫细胞靶向部分是抗-CD45抗体分子，例如本文所述的结合至CD45的抗体或抗体片段。
在相关方面，本公开内容提供了一种组合物，例如IFM，其包含偶联至例如融合至免疫细胞靶向部分的细胞因子分子。在实施方式中，免疫细胞靶向部分结合至免疫细胞上的靶标或受体。在实施方式中，免疫细胞靶向部分包括(或为)抗体分子，例如抗体或抗体片段，例如抗-CD45抗体分子(例如IgG、Fab、scFv)，其结合细胞(例如免疫细胞，例如免疫效应细胞，如淋巴细胞)上的CD45受体。在实施方式中，组合物，例如IFM，将细胞因子分子和免疫细胞靶向部分缔合(例如，连接到一起)到免疫细胞，例如效应免疫细胞。在实施方式中，结合至细胞的抗-CD45抗体增加IL-15分子与细胞的缔合，并随着时间的推移改进一个或多个IL-12信号转导、免疫刺激，例如，相对于游离的IL-12分子(不在组合物中的IL-12分子)。在实施方式中，信号转导和/或免疫刺激在一段时间内发生，例如几分钟、几小时、几天，例如至少8小时，例如24小时。
在另一方面，本公开提供了一种颗粒，例如纳米颗粒，其包含如本文所述的免疫激动剂，例如包括蛋白质(例如，本文所述的蛋白质纳米凝胶)的纳米颗粒。在一个实施方式中，颗粒包含相同的免疫激动剂。在另一个实施方式中，颗粒包含一种或多种不同类型的免疫激动剂。
还公开了包含本文公开的IFM和/或纳米凝胶的组合物，例如药物组合物。在实施方式中，药物组合物进一步包含药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂。
本文所述的IFM和蛋白纳米凝胶可以通过例如静脉内或皮下给药直接给予患有待治疗的疾病(例如癌症)的对象。在一些实施方式中，IFM和蛋白纳米凝胶的免疫细胞靶向部分将细胞因子分子递送到免疫细胞的表面，从而增加细胞因子分子在免疫细胞表面的浓度。在实施方式中，IFM和纳米凝胶的结果是以下一种或多种：使细胞因子分子的分布本地化和/或增强细胞因子分子的细胞表面可及性，从而激活和/或刺激免疫细胞。
在其他实施方式中，本文所述的IFM可以与免疫细胞疗法组合给予，以在体内或体外激活和/或刺激免疫细胞疗法。例如，本文所述的IFM可以通过例如静脉内或皮下与基于细胞的疗法共同给予患有待治疗的疾病(例如癌症)的对象。在其他实施方式中，细胞疗法在给药前用本文所述的IFM在体外脉冲。在一些实施方式中，细胞疗法选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法。
本文公开的任何IFM、组合物、纳米颗粒、方法、用途、核酸、载体和宿主细胞的其他特征和实施方式包含以下一个或多个。
在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，与免疫细胞靶向部分功能性连接，例如共价连接(例如，通过化学偶联，遗传或蛋白质融合，非共价缔合或其他方式)。例如，免疫刺激部分可以例如通过接头与免疫细胞靶向部分间接地共价偶联。在实施方式中，接头选自：可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施方式中，接头是肽接头。肽接头的长度可以是5-20、8-18、10-15或约8、9、10、11、12、13、14、15-20、20-25或25-30个氨基酸。在一些实施方式中肽接头的长度可以是30个氨基酸或更长；例如30-35、35-40、40-50、50-60个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头包含Gly和Ser，例如，包含氨基酸序列(Gly3-Ser)n或(Gly4-Ser)n的接头，其中n表示基序的重复数，例如，n＝1、2、3、4或5(例如(Gly3-Ser)2或(Gly4Ser)2或(Gly3-Ser)3或(Gly4Ser)3接头)。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：36、37、38或39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代)。在一个实施方式中，接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)。在另一个实施方式中，接头包含衍生自抗体铰链区的氨基酸。在某些实施方式中，接头包含衍生自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgGM或IgGA抗体的铰链区的氨基酸。在实施方式中，接头包含衍生自IgG铰链区的氨基酸，例如IgG1、IgG2或IgG4铰链区。例如，接头包含来自IgG铰链区的可变氨基酸序列，例如具有一个或多个半胱氨酸替换的变体，例如用丝氨酸替换。
在其他实施方式中，接头是非肽化学接头。例如，免疫刺激部分通过交联共价偶联至免疫细胞靶向部分。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。在其他实施方式中，将免疫刺激部分直接共价偶联至免疫细胞靶向部分，而无需接头。在其他实施方式中，IFM的免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分不是共价连接的，例如是非共价缔合的。
在其他实施方式中，接头可以是蛋白质或其片段或衍生物，例如人白蛋白或Fc结构域，或其片段或衍生物。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分连接到N-末端，免疫刺激部分连接到C-末端。
在其他实施方式中，接头将免疫细胞靶向部分与免疫刺激部分非共价缔合。例如，接头包括二聚化结构域，例如卷曲螺旋或亮氨酸拉链。
通过附图和详述以及权利要求书，不难了解本发明的其它特征、目的和优点。
除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语的含意与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
附图简要说明
图1描绘了用于细胞表面靶向和刺激的结合细胞因子和免疫球蛋白部分的本公开的示例性融合蛋白。
图2A-2D显示了包含抗CD45抗体和IL-12(，也称为“抗CD45-IL12-TF”或“aCD45-IL12-TF”或“IL 12-TF”)的4种示例性构建体。
图3显示抗CD45-IL12-TF支持IL-12的强细胞装载和强表面持久性。
图4A-4B显示了示意图，其描绘了系连融合体可以顺式、反式和通过转移到靶细胞中进行信号传递，并且显示了通过IL-12系连融合体在装载的(“顺式”)未装载的靶细胞(“反式”和“转移的”)中激活STAT4磷酸化。
图5A显示了肿瘤生长，小鼠体重变化，存活(直至ACT后第100天)。
图5B显示了携带替代IL12-TF先导候选物的Pmel细胞诱导转移的和内源性免疫细胞的瞬时淋巴细胞减少。
图5C-5D显示了循环内源性CD8 T细胞的增殖(通过KI67阳性)。
图5E显示了内源性NK细胞增殖(通过Ki67阳性)和活化(通过CD69阳性)。
图6显示了当IL12-TF预先装载到过继转移的T细胞上或可溶地共同给予时，IL12-TF增强了肿瘤特异性T细胞疗法。
图7A显示了单剂量或多剂量携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞后的肿瘤生长曲线。
图7B显示了单剂量或多剂量携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞的存活。
图7C显示IL12-TF增强体内肿瘤特异性T细胞的扩增和植入。
图7D显示了用一剂或两剂携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞治疗后的体重变化。
图8显示了携带两个IL12-TF之一的Pmel的ACT后的IFN-γ血浆水平。
图9显示了携带两个IL12-TF之一的Pmel的ACT后的CXCL10血浆水平。
图10A-10D显示体内包含野生型或突变的IL-15的靶向CD8的IFM与CD8 T细胞的特异性结合，以及靶向CD8的IFM对循环CD4 T，CD8 T和NK细胞的活性。
图11A-11C显示，与包含野生型或突变的IL-15变体的靶向CD8的IFM的安全性相比，在增加剂量或给药方案后IL-15的毒性。*表示在第二次给药后。
图12A-12B显示了随着IL-12，靶向CD8的IL-12IFM或两种不同的靶向CD45的IL-12IFM的剂量递增，抗肿瘤功效和体重变化。
图13A：IL-15纳米凝胶提供自分泌的细胞因子刺激。
图13B：IL-12系连融合体构建体和T细胞的表面装载。
图14：研究时间线。
图15：装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞(DP-15PMEL；10×106)与装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞(DP-12PMEL)的组合以1(左图)、2.5(中图)或5×106细胞(右图)的剂量共同给予的抗肿瘤活性。也显示了装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞(DP-12PMEL；1、2.5或5x106)和组合对照组的活性，其中装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞(DP-15PMEL；10×106)和PMEL T细胞(1、2.5或5x 106)共同给予。
图16：不同治疗组的体重相对于治疗开始(第0天)的变化。
图17：左图：给药后第4天的脾脏重量。给药后第4天，4-5只小鼠/组被安乐死，进行总体病理学评估并记录脾脏重量。**＝p＜0.01；***＝p＜0.001；****＝p＜0.0001。
图17：右图：给药后第4天的脾脏重量。给药后第4天，4-5只小鼠/组被安乐死，进行总体病理学评估并记录脾脏重量。
图18A：转移的PMEL T细胞随时间变化的表型。在第4、7、11、16、23、30和37天收集血样，染色，用于流式细胞仪评估。转移的PMEL T细胞通过CD90.1染色鉴定。根据CD44和CD62L的染色情况，PMEL T细胞被细分为四个不同的群体：效应T细胞(Teff；CD44-CD62L-)，原初/干细胞记忆T细胞(Tn/scm；CD44-CD62L+)，效应记忆T细胞(Tem；CD44+CD62L-)，以及中央记忆T细胞(Tcm；CD44+CD62L+)。
图18B：共载IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶，或仅装载IL-15纳米凝胶的IL-12系连融合体的PMEL T细胞与B16-F10黑色素瘤细胞以低效应物∶靶标比率(1∶10)共同培养。评估了B16-F10黑色素瘤细胞的生长(最左边)、PMEL T细胞的增殖(左中)、活化的PMEL T细胞的数量(CD25+CD69+，通过流式细胞仪测量)(右中)和PMEL T细胞的表型(最右边)。为了表型评估，根据CD44和CD62L的染色情况，PMEL T细胞被细分为四个不同的群体：效应T细胞(Teff；CD44-CD62L-)，原初/干细胞记忆T细胞(Tn/scm；CD44-CD62L+)，效应记忆T细胞(Tem；CD44+CD62L-)，以及中央记忆T细胞(Tcm；CD44+CD62L+)。
图19：顶行-MART-1 T细胞数量通过流式细胞仪与CountBright量化珠进行量化。IL-12系连融合体装载(蓝色曲线)促进细胞存活率高于仅MART-1，和IL-15纳米凝胶装载(绿色曲线)促进2倍扩增。通过组合(混合，橙色)或共载，组合免疫激动剂IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶。底行-第6天的抗原反应性(四聚体阳性)细胞的计数显示，表面装载的免疫激动剂增加了抗原反应性。
图20：活细胞比色报告试验显示，在较高的E∶T比率下，靶向MART-1的T细胞单独具有细胞毒性，而在较低的E∶T比率和较晚的时间点，靶向MART-1的T细胞的细胞毒性增加。装载IL-12系连融合体的T细胞(蓝色)和组合装载IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶的T细胞(混合，橙色)在此试验中显示出类似的细胞毒性增加。DP-12＝装载IL-12系连融合体，DP-15＝装载IL-15纳米凝胶，CTL＝效应靶向MART-1的T细胞。
图21：第6天MART-1 T细胞具有效应记忆表型(CD45RO+CCR7-)，MTC高度活化(CD25+CD69+)。装载IL-15纳米凝胶的T细胞(左)和组合(右)装载IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶的T细胞显示出类似的表型。
图22：通过ELISA在第1、3和6天测量的干扰素-γ(IFNg)增加。装载IL-12系连融合体的T细胞(蓝色)和组合装载IL-12系连融合体和IL-12系连融合体的T细胞(混合，橙色)在此试验中显示出类似的细胞毒性增加。E∶T＝效应物∶靶标。
图23A：左图-MART-1 T细胞数量通过流式细胞仪与CountBright量化珠进行量化，显示第3天的T细胞的可用数量。E∶T＝效应物∶靶标。右图-再次攻击后活细胞比色报告试验显示，与单独装载的T细胞相比(绿色，蓝色)，使用组合装载IL-12系连融合体和IL-12系连融合体的T细胞(混合，橙色)靶向MART-1的T细胞的细胞毒性得到改善。
图23B：IL-12系连融合体驱动Pmel细胞的细胞毒性。协同装载处理改进了装载IL15纳米凝胶的Pmel细胞的细胞毒性。如图23B所示，到第2天，IL-12系连融合体和共载组实现肿瘤完全消退。IL-12系连融合体驱动IFNg产生和细胞毒性活性。到第5天，在对照组和IL-15纳米凝胶组观察到肿瘤的外生。
图23C：在低E∶T比率下，共载介导的靶细胞的细胞毒性。如图23C所示，随着E∶T比率的降低，IL-15纳米凝胶失去了长期细胞毒性优势。相比单一治疗，共载IL15纳米凝胶+IL12 TF条件显示出诱导的持久的细胞毒性优势。
图23D：IL-15纳米凝胶+IL-12 TF的组合：与单独药剂相比活性提高。如图23D所示，IL-15纳米凝胶、IL-12 TF和抗原呈递显示出令人惊讶的PMEL T细胞在循环中的长期持久性增强。共载(15M)和组合组(IL-15纳米凝胶10M+IL-12TF 5M)显示出相当的抗肿瘤活性。与单独药剂相比，组合组显示出改进的活性。
图23E：组合治疗使抗原特异性细胞持久扩增并增强细胞毒性。如图23E所示，IL-15纳米凝胶挽救了装载IL-12 TF的MTC的抗原特异性细胞扩增。IL-12 TF驱动IFNg的产生，并增强装载IL-15纳米凝胶细胞的细胞毒性。
图23F：在低水平的IL-15纳米凝胶和IL-12 TF的共载细胞上观察到有益的协同作用。如图23F所示，确定共载样品的IL-15纳米凝胶和IL-12TF的最优装载剂量，每种单一疗法的较低剂量可能足以达到相同的协同作用。
图23G：相对于IL-12 TF和IL-15纳米凝胶，在相同的总细胞数(15M)下，组合和共载显示出改进的活性。*IL-12 TF15M组：变异性是由1只小鼠w比其他小鼠更早的肿瘤逃逸而定的。
图24显示了一个实施方式，其中通过将直接装载15聚肽的常规成熟DC和呈递6-15聚肽的预装载DC结合起来，创建组合DC集。
图25显示了对针对TAA训练的MTC的询问，使用组合过程以通过装载肽的MHC四聚体结合至PRAME-衍生的9聚和10聚肽(结合至四个PRAME四聚体集的MTC显示在左边)。四聚体结合的CD8细胞群被突出显示。CD8对单个肽的反应性显示在右边。
图26显示了在BioSep4000尺寸排阻色谱柱上用聚K30官能化的交联IL-15N72D/sushi-Fc蛋白纳米凝胶的HPLC。
图27描述了蛋白纳米凝胶与CD8 T细胞的缔合。CD8 T细胞与含有3％重量的Alexa-647偶联IL-15N72D/sushi-Fc的IL-15N72D/sushi-Fc蛋白纳米凝胶缔合。CD8 T细胞在FBS+5％DMSO中冷冻过夜。解冻后，将CD8 T细胞在含有IL-2的培养基(20ng/ml)中培养，用流式细胞仪在指定时间点测量其Alexa-647荧光。
图28描述了T细胞扩增分析。CD8 T细胞与IL-15N72D/sushi-Fc纳米凝胶偶联(右组)或不偶联(左组)，然后在FBS+5％DMSO中冷冻过夜。解冻后，两组都在含有IL-2的培养基(20ng/ml)中培养，4小时后(灰色柱)和第2天(黑色柱)用流式细胞仪测量活细胞的数量。该实验的完全培养基为：IMDM(隆萨)，Glutamaxx(生命技术公司)，20％FBS(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(Octapharma)，0.5ug/ml肌醇(西格玛)。
图29A-29B显示了T细胞扩增分析。在图29A中，CD3 T细胞与IL-15N72D/sushi-Fc蛋白纳米凝胶缔合(最右组)或不缔合(最左3组)然后在无血清培养基(Bambanker)中冷冻2周。解冻后，第一组在完全培养基(仅培养基)中培养，第二组在含有IL-2(20ng/ml)的完全培养基(IL-2(可溶性))中培养，第三组在含有IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml)的完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml))中培养，第四组在完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc纳米凝胶)中培养。16小时后(灰色柱)和第9天(黑色柱)用流式细胞仪测量活细胞的数量。在图29B中，CD3 T细胞与IL-15WT/sushi-Fc蛋白纳米凝胶偶联(最右组)或不偶联(最左3组)然后在无血清培养基(Bambanker)中冷冻过夜。解冻后，第一组在完全培养基(仅培养基)中培养，第二组在含有IL-2(20ng/ml)的完全培养基(IL-2(可溶性))中培养，第三组在含有IL-15WT/sushi-Fc(12ug/ml)的完全培养基(IL-15WT/sushi-Fc(12ug/ml))中培养，第四组在完全培养基(IL-15WT/sushi-Fc纳米凝胶)中培养。第2天(浅灰色柱)、第6天(深灰色柱)和第7天(黑色柱)用显微镜测量活细胞的数量。该实验的完全培养基为：IMDM(隆萨)，Glutamaxx(生命技术公司)，20％FBS(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(Octapharma)，0.5ug/ml肌醇(西格玛)。
图30A-30B描述了NK-92细胞系和原代NK细胞扩增分析。在图30A中，NK-92细胞与IL-15WT/sushi-Fc蛋白凝胶(纳米凝胶)缔合(最右边2组)或不缔合(最左边3组)。前4组在无血清培养基(Bambanker)中冷冻2小时，第五组洗涤后在完全培养基(IL-15WT/Sushi-Fc纳米凝胶(不冷冻))中培养。最左4组解冻后，第一组在完全培养基(仅培养基)中培养，第二组在含有IL-2(20ng/ml)的完全培养基(IL-2(可溶性))中培养，第三组在含有IL-15WT/sushi-Fc(12ug/ml)的完全培养基(IL-15WT/sushi-Fc(12ug/ml))中培养，第四组在完全培养基(IL-15WT/sushi-Fc纳米凝胶)中培养。第1天(浅灰色柱)、第5天(深灰色柱)和第6天(黑色柱)用显微镜测量活细胞的数量。在图30B中，原代NK细胞与IL-15N72D/sushi-Fc蛋白纳米凝胶缔合(最右组)或不缔合(最左3组)然后在无血清培养基(Bambanker)中冷冻2周。解冻后，第一组在完全培养基(仅培养基)中培养，第二组在含有IL-2(20ng/ml)的完全培养基(IL-2(可溶性))中培养，第三组在含有IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml)的完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml))中培养，第四组在完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc纳米凝胶)中培养。16小时后(灰色柱)和第9天(黑色柱)用流式细胞仪测量活细胞的数量。该实验的完全培养基是含有重组转铁蛋白(隆萨)、Glutamaxx(生命技术公司)、5％人血清AB(康宁(Corning))的Xvivo10。
图31A-31B描述了T细胞亚群分析。在图31A中，CD3 T细胞与IL-15N72D/sushi-Fc蛋白纳米凝胶缔合(最右组)或不缔合(最左3组)然后在无血清培养基(Bambanker)中冷冻2周。解冻后，第一组在完全培养基(仅培养基)中培养，第二组在含有IL-2(20ng/ml)的完全培养基(IL-2(可溶性))中培养，第三组在含有IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml)的完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml))中培养，第四组在完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc纳米凝胶)中培养。培养9天后，用流式细胞仪分析CD3 T细胞的亚群(图31A)和活化(图31B)标志物的表达。
图32A-32B描述了T细胞效力分析。在图32A中，CD3 T细胞与IL-15N72D/sushi-Fc蛋白纳米凝胶缔合(最右组)或不缔合(最左3组)然后在无血清培养基(Bambanker)中冷冻2周。解冻后，第一组在完全培养基(仅培养基)中培养，第二组在含有IL-2(20ng/ml)的完全培养基(IL-2(可溶性))中培养，第三组在含有IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml)的完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc(0.6ug/ml))中培养，第四组在完全培养基(IL-15N72D/sushi-Fc纳米凝胶)中培养。培养1天后，CD3 T细胞与靶细胞(Daudi)以不同的效应物与靶标(E∶T)比率共同培养。16小时后用流式细胞仪测量靶细胞的杀伤力。使用Tukey多重比较检验的双向ANOVA计算统计学显著性。*：p＜0.05；**：p＜0.01。图32B显示了与图32A相同的细胞释放IFNg的测量。该实验的完全培养基为：IMDM(隆萨)，Glutamaxx(生命技术公司)，20％FBS(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(Octapharma)，0.5ug/ml肌醇(西格玛)。
具体实施方式
本公开内容尤其提供了免疫刺激融合分子或IFM的组合物和相关使用方法。如本文所述“IFM”包括免疫刺激部分，例如细胞因子分子(例如生物活性细胞因子)和免疫细胞靶向部分，例如能够结合至免疫细胞(例如免疫效应细胞)的抗体分子(例如抗体或抗体片段)。在实施方式中，免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分功能性地连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分能够与免疫细胞表面靶标结合，从而将免疫刺激部分，例如细胞因子分子靶向免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如淋巴细胞)。
不希望受到理论的束缚，认为免疫细胞靶向部分与免疫细胞表面靶标的结合会增加免疫刺激部分(例如细胞因子分子)及免疫细胞上的其相应受体，例如细胞因子受体在表面上的浓度，例如随时间的浓度，例如，相对于游离细胞因子分子与其细胞因子受体的缔合。这可以对由IFM结合的免疫细胞本身(自分泌信号转导)和/或对另一个(例如，相邻的)免疫细胞(旁分泌信号转导)产生免疫作用。有利地，与其他疗法例如可溶性细胞因子，武装CAR-T(具有细胞因子)和纳米凝胶(在免疫细胞上)相比，本发明的系连融合体可以提供平衡的双重自分泌和旁分泌活性，结合了两者的优点，足够高的活性和低毒性。相反，可溶性细胞因子的递送虽然提供全身性活性，但是以其高毒性而闻名。武装CAR-T可以局部分泌细胞因子，提供旁分泌和全身性活性，以及全身性毒性。纳米凝胶，例如在美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944，美国公开号2014/0081012和PCT申请号PCT/US2017/037249和PCT/US2018/049596中描述的那些(在此通过引用全文纳入本文)能够提供高度局部的自分泌活性，这对于某些细胞因子(例如IL-15)可能是理想的。然而，对于需要旁分泌活性的细胞因子(如IL-12)，本文公开的系连融合体可以成为平衡自分泌和旁分泌活性的最有效点。如图4A所示，系连融合体一旦系连(或装载)到免疫细胞上，就可以顺式发出信号，反式传给邻近的靶标免疫细胞，并通过转移到达不靠近原始表面装载细胞的靶标免疫细胞。
在实施方式中，免疫细胞靶向部分导致以下的一种或多种增加：免疫细胞上的免疫刺激部分的结合，可及性，激活和/或信号转导，例如，在指定的时间内。在实施方式中，IFM基本上不干扰细胞因子分子的信号转导功能。这种靶向作用导致免疫细胞的增殖和活化的局部和长期刺激，从而诱导免疫应答的受控放大和活化。本文公开的IFM与本领域已知细胞因子相比提供了一些优势，例如较低的全身性毒性，同时保留了细胞因子分子的免疫刺激生物活性(信号转导活性和/或效力)。
免疫细胞因子-抗体-细胞因子融合蛋白的先前公开内容通常被设计为通过其抗体组分靶向疾病抗原(例如，肿瘤相关抗原，例如细胞膜抗原和细胞外基质组分)，以通过其细胞因子组分增强效应功能。(Clin.Pharmacol.2013；5(增刊1)：29-45.Thomas List和Dario Neri.网上公开，2013年8月20日.doi：10.2147/CPAA.S49231 PMCID：PMC3753206。)细胞因子的治疗性使用的典型障碍与它们的短血清半衰期和有限的生物可及性有关。高剂量的细胞因子可以克服这些障碍，但会导致剂量限制性毒性。因此，大多数细胞因子需要蛋白质工程改造方法来减少毒性和增加半衰期。具体策略包括PEG化、抗体复合物和融合体蛋白形式和诱变。(Antibodies 2013，2，426-451；doi：10.3390/antib2030426RodrigoVazquez-Lombardi Brendan Roome和Daniel Christ。)
本公开内容尤其提供融合蛋白作为细胞因子和靶向部分的共价偶联物，所述靶向部分的功能是将融合蛋白靶向具有特定受体组成的免疫细胞(例如，健康的和/或非恶性的)。将促炎性细胞因子和靶向部分融合，靶向部分优选抗体或抗体片段(如单链Fv、Fab、IgG)，将融合蛋白引导至目的细胞，并增强细胞因子的细胞表面可及性。目的细胞尤其包括免疫细胞，特别是淋巴细胞，优选T细胞(例如总CD3 T细胞、CD4 T细胞或CD8 T细胞)，并可以包括其他细胞类型。在一些实施方式中，融合蛋白质可以激活CD8 T细胞的亚群。目的细胞，包括免疫细胞，可以是体内的(例如，在对象体内)、体外的或离体的(例如，基于细胞的疗法)。
在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标大量存在于免疫细胞的表面上(例如，超过免疫细胞表面上存在的细胞因子分子的受体的数目)。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分可选自与免疫细胞表面靶标(例如选自CD4、CD8、CD18、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20或CD45的靶标)结合的抗体分子或配体分子。在一个实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体分子或配体分子。
CD45是丰富受体的一个例子。CD45也被称为白细胞共同抗原，是除有助于细胞激活的红细胞外，存在于造血细胞上的I型跨膜蛋白(参见例如Altin，JG，Immunol CellBiol.1997年10月；75(5)：430-45))。IFM的靶向部分的其他受体理想地保持在细胞表面且对细胞内化有抵抗力(例如持久性受体)。CD45是丰富的持久性受体的一个例子。或者，靶向部分的受体可以组成性地翻转，例如被细胞内化并回收到表面，从而允许融合蛋白有显著的结合机会，尽管它们动态内化(回收受体)。CD22是回收受体的一个例子。
细胞因子受体的表达水平可基于多种因素而变化，包括(i)细胞类型和(ii)细胞的活化状态。在实施方式中，表达水平可以影响细胞因子信号转导、信号强度和持续时间中的一个或多个。在一个实施方式中，免疫细胞表面表达的受体以有效比率存在，即在细胞表面上，靶向部分的受体数量超过细胞因子组分的受体数量。当靶向部分受体持久时；或者；当它们的细胞表面密度通过将受体恢复到细胞表面的回收机制有效维持时，这样的有效比率被实现，从而允许靶向组分的结合机会超过细胞因子组分的结合机会。在受体被回收的情况下(例如内化并返回到细胞表面)，抗体受体将以有效比率存在，以允许蛋白质的靶向部分的结合机会超过细胞因子组分的结合机会。这样的有效比率允许细胞因子定位到细胞表面，并因此增加了细胞因子与自己的细胞表面受体结合的时间和可及性(尽管靶向受体动态存在、内化和返回表面)。
在某些情况下，由质膜受体引发的信号转导调节与内吞作用偶联。活化受体的内化是信号衰减的一种手段，但也调节了受体信号转导的持续时间和信号输出特异性(在Barbieri，P.P.Di Fiore，S.Sigismund.质膜上的信号转导的内吞控制(Endocyticcontrol of signaling at the plasma membrane)，Curr.Opin.Cell Biol.，第39期(2016)，第21-27页中进行了综述)。内体可以用作移动信号转导平台，促进多蛋白信号转导组装的形成，从而实现时空上高效的信号转导。在质膜上引发的一些信号转导事件，例如，细胞因子信号转导事件可能会从内体隔室继续。
一般而言，本公开的IFM可以赋予激动性细胞因子特别是IL-15，IL-7，IL-21和IL-12p70改善的生物学活性。其他激动性细胞因子包括IL-2、IL-6和IL-27。在一些实施方式中，细胞因子分子包括促炎性细胞因子，例如，包括选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或IL-27，包括其变体(例如细胞因子衍生物，包含细胞因子分子和多肽的复合物，例如，细胞因子受体复合物及其其他激动剂形式)。在一个实施方式中，细胞因子分子包括IL-15和/或IL-12(在一个IFM或两个IFM中)。
在一个示例性的实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分衍生自抗CD45抗体分子，并且细胞因子分子是任选地复合至IL-15受体α亚基的sushi结构域的白细胞介素-15(αCD45-IL15和αCD45-IL15/sushi)。在另一个示例性的实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分衍生自抗-CD45抗体分子，并且细胞因子分子是白细胞介素-12(αCD45-IL12)。αCD45-IL15/sushi IFM和αCD45-IL12IFM可以在例如组合疗法中一起使用。
在另一个实施方式中，IFM可以系连至不同的细胞表面分子，例如IFM，其中免疫细胞靶向部分衍生自靶向除CD45以外的丰富或持久性的细胞表面受体的抗体，例如选自CD4、CD8、CD18、CD11a、CD11b、CD11c、CD19或CD20的靶标。IFM可以包含细胞因子，如白细胞介素-15，任选地与IL-15受体α亚基和/或白细胞介素-12的sushi结构域形成复合物。IFM可以与αCD45-IL15、αCD45-IL15/sushi或αCD45-IL12的组合疗法一起使用。
在另一个实施方式中，例如在组合疗法中一起使用包含与相同或不同细胞表面受体系连的另外的细胞因子的IFM。免疫细胞靶向部分可选自结合至免疫细胞表面靶标的抗体分子或配体分子，例如选自CD4、CD8、CD18、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20或CD45的靶标，和促炎性细胞因子，例如包含选自IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或IL-27的一种或多种的细胞因子，包括其变体。在一些实施方式中使用两种不同IFM的组合。在其他实施方式中使用三种不同IFM的组合。在其他实施方式中使用多于三种IFM的组合。
本公开内容的融合蛋白的治疗用途尤其包括：(1)作为通过受体介导的特异性细胞独特受体(例如，CD4或CD8)的结合特异性递送治疗性蛋白质的试剂；(2)作为离体药剂，以在重新引入患者之前诱导分离的自体和同种异体细胞的活化和扩增；例如，在包括ACT(过继细胞转移)在内的T细胞疗法中，以及在其他重要的免疫细胞类型中，包括例如B细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，NK细胞，抗原特异性CD8 T细胞，经遗传工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或CAR-T细胞，经遗传工程改造以表达肿瘤抗原特异性的T细胞受体的T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或受抗原训练的T细胞(例如已经通过展示感兴趣抗原(例如肿瘤相关抗原(TAA)的抗原呈递细胞(APC)“训练”的T细胞)；和(3)作为体内药剂，用于给药以递送用以支持用于包括ACT在内的细胞疗法的细胞扩增的细胞因子。
这样，包含本公开内容的IFM和药学上可接受的运载体，赋形剂或稳定剂的药物组合物可以用于将治疗性蛋白质递送至需要其的对象。提供了修饰的免疫细胞，其包含健康和/或非恶性免疫细胞以及与之结合或靶向的本公开的IFM。这种修饰的免疫细胞可以在体外或体内制备。
本公开还提供了体外制备修饰的免疫细胞的方法，其包括：提供多个健康和/或非恶性免疫细胞；和将本公开的IFM与多个健康和/或非恶性免疫细胞一起孵育，以允许IFM与其靶向结合，从而产生多个修饰的免疫细胞。
本文还提供了提供细胞疗法的方法，其包含：提供多个健康和/或非恶性免疫细胞；将本公开的IFM与多个健康和/或非恶性免疫细胞一起孵育，以允许IFM与其靶向结合，从而产生多个修饰的免疫细胞；并给予有需要的对象多个修饰的免疫细胞。在一些实施方式中，在不进行对象的预处理的情况下给予细胞疗法，其中所述预处理包括CPX(环磷酰胺)或其他淋巴细胞清除调节化学疗法。消除预处理是有利的，因为众所周知，用化疗药物预处理会导致对所有细胞(包括健康的细胞)的全身性的高毒性，削弱免疫系统并诱发许多不良副作用。
在一些实施方式中，本文提供的是共载的IL-15纳米凝胶和IL-12 TF，其能够使Pmel在遇到抗原后抗原特异性扩增，即使在低效应物∶靶标比率的情况下也促进长期Pmel激活和IFNg的产生，和/或支持持久的抗原特异性靶标细胞毒性。
在一些实施方式中，本文提供了IL-15纳米凝胶和IL-12 TF组合疗法，其能够在遇到抗原时使抗原特异性细胞扩增，增强IFNg的产生，维持记忆表型和激活状态，在遇到抗原后，和/或增强长期的抗原特异性靶标细胞毒性。
在一些实施方式中，本文提供了IL-15纳米凝胶和IL-12 TF组合疗法，其能够使MART-1在遇到抗原时抗原特异性扩增，增强IFNg的产生，维持效应细胞记忆表型和激活状态，在遇到抗原后，和/或支持抗原特异性靶标细胞毒性。
定义
以下定义了本文中的某些术语。在整个申请中提供了其他定义。
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或多于一个的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。术语“一种”或“一个”当与“包含”在本文中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。
如本文所用，“约”和“近似”通常表示在考虑测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定数值范围的20％以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。术语基本“(上)”表示超过50％，更优选超过80％并且最优选超过90％或95％。
术语“自体的”是指衍生自后来将其重新引入该个体的同一个体的任何材料。术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。
如本文所用的“抗体”或“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在一个实施方式中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如，IgG)。在实施方式中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体片段(例如功能片段)是抗体的一部分，例如Fab，Fab’，F(ab’)2，F(ab)2，可变片段(Fv)，域抗体(dAb)或单链可变片段(scFv)。功能性抗体片段结合与完整(例如，全长)抗体识别的抗原相同的抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段，例如由重链和轻链的可变区或其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子组成的“Fv”片段。在一些实施方式中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如，dAb(域抗体)，单链，Fab，Fab’和F(ab’)2片段以及单链可变片段(scFv)。术语“Fab”和“Fab片段”可互换使用，并且是指包括来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定域和一个可变域的区域，即VL，CL，VH，和CH1。
如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指能形成免疫球蛋白可变结构域结构的氨基酸序列。例如，该序列可包括天然存在可变结构域氨基酸序列的全部或部分。例如，该序列可包含或不包含一个、两个或更多给N-或C-末端氨基酸，或可包含与蛋白质结构形成相容的其他改变。
在实施方式中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用，“双特异性抗体分子”是指对多于一种(例如，两，三，四或更多种)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。
如本文所用，“抗原”(Ag)是指大分子，包括所有蛋白质或肽。在一些实施方式中，抗原是可以引起免疫应答的分子，例如涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体产生。抗原不仅参与抗体产生。T细胞受体还识别抗原(尽管其肽或肽片段与MHC分子复合的抗原)。任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以是抗原。抗原也可以源自基因组重组体或DNA。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都编码“抗原”。在实施方式中，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也不需要完全由基因编码。在实施方式中，抗原可以合成或可以衍生自生物学样品，例如组织样品，肿瘤样品，细胞或具有其他生物学组分的流体。如本文所用，“肿瘤抗原”或可互换使用的“癌症抗原”包括存在于癌症，例如，癌症细胞或肿瘤微环境上或与之相关的可以激发免疫应答的任何分子。如本文所用，“免疫细胞抗原”包括存在于免疫细胞上或与之相关的可引起免疫应答的任何分子。
抗体分子的“抗原结合位点”或“抗原结合片段”或“抗原结合部分”(在本文中可互换使用)是指抗体分子，例如免疫球蛋白(Ig)分子，例如IgG参与抗原结合的一部分。在一些实施方式中，抗原结合位点由重(H)链和轻(L)链的可变(V)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的可变区域内的三个高度发散的延伸(称为高变区域)位于称为“框架区”(FR)的更为保守的侧翼延伸之间。FR是天然在免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在实施方式中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面，其与结合的抗原的三维表面互补。重链和轻链三个高变区中的每一个被称为“互补决定区”或“CDR。”框架区和CDR已经在例如Kabat，E.A.等，(1991)《热门免疫学蛋白质序列》，第五版，美国卫生和人服务部，NIH出版号91-3242，和Chothia，C.等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917中被定义和描述。每条可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个CDR和四个FR组成，按照下述氨基酸顺序从氨基端到羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。可变轻链(VL)CDR通常定义为包括位置27-32(CDR1)，50-56(CDR2)和91-97(CDR3)上的残基。可变重链(VH)CDR通常定义为包括位置27-33(CDR1)，52-56(CDR2)和95-102(CDR3)上的残基。本领域普通技术人员将理解，环在抗体之间可以具有不同的长度，并且以诸如Kabat或Chotia的编号系统为准，从而框架在抗体之间具有一致的编号。
在一些实施方式中，抗体的抗原结合片段(例如，当作为本公开的融合分子的一部分包括时)可以缺乏或没有完整的Fc结构域。在某些实施方式中，抗体结合片段不包含完整的IgG或完整的Fc，但是可以包含来自轻链和/或重链的一个或多个恒定区(或其片段)。在一些实施方式中，抗原结合片段可以完全不含任何Fc结构域。在一些实施方式中，抗原结合片段可以基本上没有完整的Fc结构域。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括完整Fc结构域的一部分(例如，CH2或CH3结构域或其部分)。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括完整的Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域是IgG结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。
如本文所用，“细胞因子分子”是指天然存在的野生型细胞因子的全长，片段或变体(包括其具有天然存在的细胞因子分子的至少10％活性的片段和功能变体)。在实施方式中，细胞因子分子具有天然存在分子的至少30、50或80％的活性，例如免疫调节活性。在实施方式中，细胞因子分子进一步包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域，任选地与免疫球蛋白Fc区偶联。在其他实施方式中，细胞因子分子与免疫球蛋白Fc区偶联。
本发明中的术语“共同给药”指的是在一定条件下给予不同的免疫激动剂部分，如装载IL-12系连融合体的T细胞和装载IL-15纳米凝胶的T细胞，使得这些实体，例如IL-12免疫激动剂和IL-15免疫激动剂，在至少一个所需参数中引发协同作用，例如协同效力和/或协同功效。这些部分可以在相同或不同的组合物中给予，如果分开给药则彼此相近，例如在彼此的24小时内，或在彼此的约1-8小时内，和或与彼此的1-4小时或接近同时给予。相对量是指实现所需协同作用的剂量。
术语“组合疗法”包括在方案中以顺序方式给予各种药剂或治疗，这将提供组合的有益效果，以及这些药剂或治疗以基本上同时的方式共同给药，例如，在这些活性药剂的固定比例的单一组合物中，或在各种药剂的多个分离组合物中。组合疗法还包括单个元素可以在不同的时间和/或通过不同的途径给药的组合，但是通过组合疗法的各个药物或肿瘤治疗方法的共同作用或药代动力学和药效动力学作用，组合发挥作用，以提供有益的效果。
如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫系统中起作用，例如保护免受感染和异物侵害的各种细胞中的任何一种。在实施方式中，该术语包括白细胞，例如嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞。术语“免疫细胞”包括本文所述的免疫效应细胞。“免疫细胞”还指参与免疫应答的细胞的修饰形式，例如，修饰的NK细胞，包括NK细胞系NK-92(ATCC目录号CRL-2407)，haNK(表达高亲和性Fc受体FcγRIIIa(158V)的NK-92变体)和taNK(靶向的NK-92细胞，其用表达给定肿瘤抗原的CAR的基因转染)，例如，如上文Klingemann等所述。
“CD45”，也称为白细胞共同抗原，是指人CD45蛋白及其种类，同种型和其他序列变体。因此，CD45可以是天然的、全长蛋白质，或可以是截短的片段或序列变体(例如天然存在的同种型，或重组变体)，其保留天然蛋白质的至少一种生物活性。CD45是在白细胞上表达的受体连接的蛋白酪氨酸磷酸酶，并且在这些细胞的功能中起重要作用(综述于Altin，JG(1997)Immunol Cell Biol.75(5)：430-45，在此通过引用纳入)。例如，CD45的胞外结构域在T细胞的几种不同同种型上表达，所表达的一种或多种特定同种型取决于特定的细胞亚群、其成熟状态和抗原暴露。CD45的表达对通过TCR激活T细胞很重要，不同的CD45同种型显示出支持T细胞激活的不同能力。
如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫效应应答。免疫效应细胞的示例包括但不限于T细胞，例如CD4 T细胞，CD8 T细胞，αT细胞，βT细胞，γT细胞和δT细胞；B细胞；自然杀伤(NK)细胞；自然杀伤T(NKT)细胞；树突状细胞；和肥大细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其包含，例如，表达嵌合抗原受体(CAR)，例如结合癌抗原的CAR。在其他实施方式中，免疫细胞表达外源高亲和性Fc受体。在一些实施方式中，免疫细胞包含，例如表达工程改造的T细胞受体。在一些实施方式中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含免疫细胞群，并且包含已经针对肿瘤相关抗原(TAA)的特异性富集的T细胞，例如，通过分选针对展示目的TAA(例如MART-1)的MHC具有特异性的T细胞来富集。在一些实施方式中，免疫细胞包括免疫细胞群，并且包括已经被展示目的TAA肽的抗原呈递细胞(APC)，例如，树突状细胞“训练”以具有针对TAA的特异性的T细胞，。在一些实施方式中，针对选自MART-1，MAGE-A4，NY-ESO-1，SSX2，生存素或其他中的一种或多种的TAA训练T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含T细胞群，其已被展示了多个目的TAA肽的APC，例如，树突状细胞“训练”以对多种TAA具有特异性。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞毒性T细胞(例如，CD8 T细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞是辅助T细胞，例如CD4 T细胞。
术语“效应功能”或“效应响应”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
如本文所用的细胞毒性“T淋巴细胞”(CTL)是指具有杀死靶细胞能力的T细胞。当发生以下两个步骤时可以发生CTL活化：1)靶细胞上的抗原结合的MHC分子和CTL上的T细胞受体之间产生相互作用；2)通过T细胞上共刺激分子和靶细胞的接合而产生共刺激信号。然后，CTL识别靶细胞上的特异性抗原并诱导这些靶细胞的破坏，例如通过细胞裂解。在一些实施方式中，CTL表达CAR。在一些实施方式中，CTL表达工程改造的T细胞受体。
本文所述的组合物和方法包括具有指定序列的多肽和核酸，或具有与指定序列基本相同或与其相似(例如与指定序列有至少85％、90％、95％或更高相同性)的序列的多肽和核酸。在描述氨基酸序列的情况下，用于本文的术语“基本相同”是指第一氨基酸含有足够或最少数量的如下氨基酸残基：i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或ii)第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基的保守取代，从而第一和第二氨基酸序列可具有共有的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含与参比序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的共有结构域的氨基酸序列。
在描述核苷酸序列的情况下，本文所用术语“基本相同”是指第一核酸序列包含足够或最少数量的与第二核酸序列中的比对核苷酸相同的核苷酸，从而第一和第二核苷酸序列编码具有相同功能活性的多肽、或编码共有结构多肽结构域或共有功能性多肽活性。例如，包含与参比序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列。
序列间的同源性或序列相同性(这些术语在本文中可互换使用)的计算如下进行。
为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比相同性，可以为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的之一或两条中引入缺口以达到最佳对齐，并且出于比较目的可以不考虑非同源序列)。在优选的实施方式中，为了比较目的而比对的参比序列的长度为参比序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，60％，甚至更优选至少70％，80％，90％，或100％。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸的“相同性”等同于氨基酸酸或核酸“同源性”)。
考虑到用于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条序列之间的百分比相同性与序列共有相同位置的数目相关。
序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。在优选的实施方式中，两条氨基酸序列之间的百分比相同性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法确定，该算法已经结合到GCG软件包中的GAP程序中(可从http：//www.gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在其他优选的实施方式中，两条核苷酸序列之间的相同性百分比使用GCG软件包中的GAP程序(可从http：//www.gcg.com获得)，采用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80，长度权重1、2、3、4、5或6进行计算。一组具体的优选参数(以及除非另有说明而应采用的参数组)为Blossum 62评分矩阵，其缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，译码缺口罚分为5。
两条氨基酸或核苷酸序列之间的相同性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。
本文公开的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”来对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其他家族组成部分或相关序列。这样的检索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可利用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与本公开的核酸(例如，SEQ ID NO：1)分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(得分＝50，字长＝3)来获取与本公开中蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的缺口比对结果，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402所述利用缺口BLAST。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.。应理解，本公开所述分子可具有额外的保守或非必需的氨基酸取代，其不对分子功能产生实质性影响。
术语“氨基酸”旨在涵盖包含氨基官能团和酸官能团且能够被包含于天然存在氨基酸形成的聚合物的所有分子，不论其为天然或合成分子。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物及同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及前述中任意的所有立体异构体。如本文所用，术语“氨基酸”包括D-和L-光学异构体和模拟肽。
“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代的情况。本领域已定义具有带相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在多肽的上下文中，术语“功能变体”或“变体”或“变体形式”是指能够具有天然存在的序列的一种或多种活性的至少10％的多肽。在一些实施方式中，功能性变体与天然序列具有基本相同氨基酸序列相同性或由基本相同的核苷酸序列编码，使得功能性变体具有天然序列一种或多种活性。
如本文所用，本文所用的术语“分子”可以指多肽或编码多肽的核酸。该术语包含天然存在的、野生型的多肽或编码相同多肽的核酸的全长、片段或变体，例如，其功能变体。在一些实施方式中，变体是野生型多肽或编码相同多肽的核酸的衍生物，例如，突变体。
本文所用术语“分离的”指，某一物质是从其原生或天然环境(例如，若其是天然产生的，则从天然环境)脱离。例如，活体动物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的某些或所有共存物质分离的该多核苷酸或多肽则是分离的。此类多核苷酸可为载体的部分和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的部分，但其仍为分离的，这是因为该载体或组合物不是该多核苷酸或多肽天然存在环境的一部分。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(若为单链)在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或支化聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，并且可间插有非氨基酸。该术语也包括修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联。多肽可从天然来源分离，可采用重组技术由原核或真核宿主产生，或者可为合成方法的产品。
术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以是单链或双链，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可被进一步修饰，如通过与标记性组分偶联。核酸可为重组多核苷酸、或基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，即非天然存在或以非天然排列方式与另一多核苷酸相联。
术语“亲本多肽”指野生型多肽，并且该野生型多肽的氨基酸序列或核苷酸序列是公众可及的蛋白质数据的一部分(例如，EMBL核苷酸序列数据库、NCBI Entrez、ExPasy、蛋白质数据库等)。
术语“突变多肽”或“多肽变体”或“突变蛋白”指这样一种形式的多肽，其中，其氨基酸序列不同于其相应的野生型(亲本)形式、自然存在的形式或任何其它亲本形式的氨基酸序列。突变多肽可以包含一个或多个突变，例如取代、插入、缺失等，这些突变导致突变多肽的出现。
术语“对应亲本多肽”(或该术语的语法变体)用于描述本发明的多肽，其中，该多肽的氨基酸序列与相应的亲本多肽的氨基酸序列仅存在至少一个氨基酸变异的区别。通常，变体多肽和亲本多肽的氨基酸序列表现出高相同百分比。在一个实施例中，“对应亲本多肽”是指变体多肽的氨基酸序列与亲本多肽的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的相同性。在另一个实施例中，编码变体多肽的氨基酸序列与编码亲本多肽的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的相同性。
术语“向亲本多肽中引入(或添加等)变异”(或其语法变体)，或“修饰亲本多肽”以包括变异(或其语法变体)，不一定意味着该亲本多肽是这种转化的物理起始材料，而是亲本多肽提供了指导氨基酸序列，用于制备变体多肽。在一个实施例中，“向亲本多肽中引入变异”意为亲本多肽的基因通过合适的突变修饰，以创建编码变体多肽的核苷酸序列。在另一个实施例中，“向亲本多肽中引入变异”是指所得到的多肽理论上是使用亲本多肽序列作为指导设计的。然后，所设计的多肽可以通过化学或其他手段生成。
根据本发明，靶标“免疫细胞”是有核细胞，例如下文所述的有核细胞。在更具体的实施方式中，免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如，选自淋巴细胞，T细胞，B细胞或天然杀伤细胞的免疫细胞)，或造血干细胞。在实施方式中，免疫细胞包括淋巴细胞。在实施方式中，免疫细胞包括T细胞。在实施方式中，免疫细胞包括B细胞。在实施方式中，免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞。在实施方式中，免疫细胞包括造血干细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其包含，例如，表达嵌合抗原受体(CAR)，例如结合癌抗原的CAR。在一些实施方式中，免疫细胞包含，例如表达工程改造的T细胞受体。在一些实施方式中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞毒性T细胞(例如，CD8 T细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞是调节性T细胞(“Treg”)。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫效应细胞群，例如选自以下一种或多种的免疫效应细胞群：T细胞，例如CD4 T细胞，CD8 T细胞，αT细胞，βT细胞，γT细胞和δT细胞；B细胞；自然杀伤(NK)细胞；自然杀伤T(NKT)细胞；或树突状细胞。在实施方式中，免疫细胞(例如免疫效应细胞)展示细胞表面受体，其结合免疫细胞靶向部分。在实施方式中，免疫细胞是从患者中(例如患者的血液)获得的免疫细胞。在其他实施方式中，免疫细胞是从健康供体获得的免疫细胞。在实施方式中，免疫细胞是来自胚胎干细胞和/或iPSC细胞的免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞系，例如稳定的或永生化的细胞系。
下面进一步详细描述本公开的各个方面。在整个说明书中提供了其他定义。
细胞因子分子
细胞因子是蛋白质信号转导化合物，其是免疫应答的介质。它们控制许多不同的细胞功能，包括增殖、分化和细胞存活/细胞凋亡；细胞因子还参与一些病理生理过程，包括病毒感染和自身免疫性疾病。细胞因子在各种刺激下由多种细胞合成，包括先天性(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)和适应性(T细胞和B细胞)免疫系统。细胞因子可分为两类：促炎性和抗炎性。促炎性细胞因子，包含IFN-γ、IL-1、IL-6和TNF-α，主要来源于先天免疫细胞和Th1细胞。抗炎性细胞因子，包含IL-10、IL-4、IL-13和IL-5，是由Th2免疫细胞合成的。
在一些实施方式中，IFM和/或蛋白纳米凝胶的细胞因子分子包括免疫调节细胞因子，例如促炎性细胞因子或抗炎性细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子是共有γ-链(γc)家族细胞因子的成员。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自下组中的一种或多种细胞因子：白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-1(例如白细胞介素-1α(IL-1α)或白细胞介素-1β(IL-1β))、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-27(IL-27)、白细胞介素-35(IL-35)、IFNγ、TNFα、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF，包括其变体(例如细胞因子衍生物，包含细胞因子分子和多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物及其其他激动剂形式)。在一些实施方式中，细胞因子分子是促炎性细胞因子分子，选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23或IL-27细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子是抗炎性细胞因子分子，选自IL-4、IL-10、IL-13、IL-35细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子选自IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或IL-27，包括其变体形式(例如细胞因子衍生物，包含细胞因子分子和多肽的复合物，例如，细胞因子受体复合物及其其他激动剂形式，例如非中和性抗细胞因子抗体分子)。在一些实施方式中，细胞因子分子是超激动剂(SA)，例如，如本文所述。例如，与天然存在的细胞因子相比，超激动剂能够增加细胞因子活性，例如至少10％、20％或30％。在一些实施方式中，细胞因子分子是单体或二聚体。在实施方式中，细胞因子分子进一步包含受体或其片段，例如细胞因子受体结构域。
本公开内容尤其提供了IFM(例如IFM多肽)和/或蛋白纳米凝胶，其包括例如经工程改造以包含一种或多种细胞因子分子，例如其免疫调节性(例如促炎性)细胞因子及其变体例如功能性变体。因此，在一些实施方式中，细胞因子分子是白细胞介素或变体，例如其功能性变体。在一些实施方式中白细胞介素是促炎性白细胞介素。
在实施方式中，细胞因子分子是细胞因子的全长，片段或变体，例如，包含一个或多个突变的细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自以下的细胞因子：白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-23(IL-23)、干扰素(IFN)α、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子α、GM-CSF、GCSF或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。在其他实施方式中，细胞因子分子选自白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)，或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。
在一些实施方式中细胞因子或生长因子分子可以是Treg抑制性分子，选自以下的一种或多种：Ifn-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23、IL-27或TNF-α。Ifn-γ促进Treg的脆性，并能减少肿瘤微环境中的抑制。IL-1和IL-6、IL-21和IL-23可以诱导Treg产生促炎性IL-17和/或将Treg转化为Th17 T细胞亚群。IL-12促进Ifn-γ在Treg中的产生，导致Treg脆性和普遍促炎性环境。.TNF-α也损害Treg发育并减少现有的Treg的功能。因此，这些细胞因子会损害Treg发育，减少Treg的功能或诱导Treg转分化为免疫激活细胞。
在癌症的情况中，需要降低Treg活性的情况下，可以通过Treg特异性IFM全身性地递送一种或多种Treg抑制性细胞因子以总体上降低Treg抑制。双特异性靶向(例如CD4：CD25，CD4：NRP1，CD4：CD39)可用于在体内将全身注射的IFM引导到Treg细胞。靶向特定细胞群体的这个概念在实施例中有描述。这些IFM然后减少Treg数目和/或功能，并驱动它们进入促炎或免疫原性状态。
另外，可以将Treg特异性IFM离体装载到抗肿瘤免疫细胞上，并通过反式或旁分泌信号转导传递至Treg。在这种情况下，抗肿瘤细胞通过增加Treg抑制性细胞因子的局部浓度来创建局部抗抑制环境。这可以促进局部而非全身Treg功能障碍。
在一个实施方式中，细胞因子分子包含野生型细胞因子，例如野生型，例如人氨基酸序列。在其他实施方式中，该细胞因子分子包括与野生型细胞因子序列(例如，人细胞因子序列)基本相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，相对于野生型细胞因子序列，例如人细胞因子序列，细胞因子分子包含至少95％至100％相同的氨基酸序列，或具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多氨基酸改变(例如取代、缺失或插入，例如保守取代)。在实施方式中，细胞因子分子相对于野生型细胞因子序列，例如人细胞因子序列，包含不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)。
示例性的细胞因子氨基酸序列在本文中公开，例如，IL-15的氨基酸以例如SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：40提供；IL-12A的氨基酸以例如SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47提供；IL-12B的氨基酸以例如SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49提供；IL-12A和IL-12B的示例性融合体以例如SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51公开。本文公开的任何细胞因子序列和基本相同的序列(例如至少90％、95％或更高序列相同性)可用于本文公开的IFM。
IL-12分子
白细胞介素-12(IL-12)是由p35和p40亚基组成的异二聚体细胞因子，分别由2个独立的基因IL-12A和IL-12B编码。IL-12参与将原初T细胞分化为Th1细胞。它被称为T细胞刺激因子，其可以刺激T细胞的生长和功能。它刺激T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并减少IL-4介导的IFN-γ抑制。产生IL-12的T细胞具有一个共受体CD30，该受体与IL-12活性有关。
IL-12在NK细胞和T淋巴细胞的活性中起重要作用。IL-12介导NK细胞和CD8细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性增强。NK细胞中IL-2和IL-12的信号转导之间似乎也存在联系。IL-2刺激两种IL-12受体IL-12R-β1和IL-12R-β2的表达，从而维持NK细胞中与IL-12信号转导有关的关键蛋白的表达。IFN-γ的产生和靶细胞的杀伤证明了增强的功能反应。
IL-12也具有抗血管生成活性，这意味着它可以阻断新血管的形成。它通过增加干扰素γ的产生来做到这一点，这又增加了一种被称为诱导蛋白-10(IP-10或CXCL10)的趋化因子的产生。IP-10然后介导这种抗血管生成作用。由于其诱导免疫应答的能力及其抗血管生成活性，人们一直在测试IL-12作为一种可能的抗癌药物。IL-12与银屑病和炎症性肠病之间可能存在可用于治疗的联系。
IL-12与IL-12受体结合，后者是由IL-12R-β1和IL-12R-β2形成的异二聚体受体。IL-12R-β2被认为在IL-12功能中起关键作用，因为它被发现在活化的T细胞上，并受到促进Th1细胞发育的细胞因子的刺激和被促进Th2细胞发育的细胞因子的抑制。结合后，IL-12R-β2被酪氨酸磷酸化，并提供激酶Tyk2和Jak2的结合位点。这些对于激活关键的转录因子蛋白(例如STAT4)很重要，该蛋白与T细胞和NK细胞的IL-12信号转导有关。
IL-12是一种有效的细胞因子，具有重塑实体瘤中抗炎环境的潜力。然而，其临床应用受到可溶给药或工程改造分泌IL-12的过继转移T细胞产生的严重毒性的限制。本文公开的系连融合体(TF)能够改善对细胞因子剂量和生物分布的控制。在体外模型系统中，IL12-TF细胞因子在T细胞表面提供持久的IL-12装载，并在IL-12受体下游提供持久的T细胞活化和信号转导。反过来，这可以激活先天免疫和适应性免疫。
系连融合体中的IL-12可以是包含IL-12A和IL-12B亚基的单链形式。在一些实施方式中，IL-12可作为非单链存在(即，作为IL-12的天然形式的IL-12A和IL-12B的异二聚体)。例如，TF可以通过三个蛋白亚基(Fab重链，Fab轻链w/IL-12A(或IL-12B)和IL-12B(或IL-12A))的共表达制备。
IL-15分子
在一些IFM和/或纳米凝胶的实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子，例如IL-15的全长、片段或变体，例如人IL-15。在实施方式中，IL-15分子是野生型人IL-15，例如具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在其他实施方式中，IL-15分子是人IL-5的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方式中，IL-15变体在位置45、51、52或72处包含突变或由其组成，例如，如US 2016/0184399中所述。在一些实施方式中，IL-15变体包含四个，五个或六个或更多个突变。
在一些实施方式中，IL-15变体在氨基酸位置8、10、61、64、65、72、101或108(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)包含一个或多个突变或由其组成。在一些实施方式中，与野生型IL-15相比，IL-15变体具有增加的活性。在一些实施方式中，与野生型IL-15相比，IL-15变体具有降低的活性。在一些实施方式中，与野生型IL-15相比，IL-15变体拥有约两倍、四倍、十倍、20倍、40倍、60倍、100倍或超过100倍的活性降低。在一些实施方式中，所述突变选自D8N，K10Q，D61N，D61H，E64H，N65H，N72A，N72H，Q101N，Q108N或Q108H(参考人IL-15的序列，SEQ ID NO：11)。本领域的普通技术人员会意识到，这些位置的任何组合可以被突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含两个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含三个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含四个，五个或六个或更多个突变。在一些实施方式中，IL-15变体包含在位置61和64处的突变。在一些实施方式中，在位置61和64处的突变是D61N或D61H和E64Q或E64H。在一些实施方式中，IL-15变体包含在位置61和108处的突变。在一些实施方式中，在位置61和108处的突变是D61N或D61H和Q108N或Q108H。
在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在一个实施方式中，细胞因子分子包含如本文所述的IL-15受体或其片段(例如，IL-15受体α的IL-15结合结构域)。在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子，例如本文所述的IL-15或IL-15超激动剂。如本文所用，与天然存在的细胞因子相比，细胞因子分子的“超激动剂”形式显示增加，例如至少10％，20％，30％的活性。示例性的超激动剂是IL-15 SA。在一些实施方式中，IL-15 SA包含IL-15和IL-15受体的IL-15结合片段，例如IL-15受体α或其IL-15结合片段的复合物，例如，如本文所述。在其他实施方式中，细胞因子分子还包含任选地与免疫球蛋白Fc或抗体分子偶联的受体结构域，例如IL-15Rα的胞外结构域。在实施方式中，细胞因子分子是如WO 2010/059253中所述的IL-15超激动剂(IL-15SA)。在一些实施方式中，细胞因子分子包含IL-15和与Fc融合的可溶性IL-15受体α结构域(例如，sIL-15Ra-Fc融合蛋白)，如Rubinstein等，PNAS 103：24p.9166-9171(2006)。
IL-15分子可进一步包含多肽，例如细胞因子受体，例如细胞因子受体结构域，和第二异源结构域。在一个实施方式中，异源结构域是免疫球蛋白Fc区。在其他实施方式中，异源结构域是抗体分子，例如，Fab片段，Fab2片段，scFv片段或亲和体片段或衍生物，例如sdAb(纳米抗体)片段，重链抗体片段。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的N-末端，并且在其他实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的C-末端。
在其他实施方式中，IL-15分子还包含任选地与免疫球蛋白Fc或抗体分子偶联的受体结构域，例如IL-15Rα的胞外结构域。在实施方式中，细胞因子分子是如WO 2010/059253中所述的IL-15超激动剂(IL-15SA)。在一些实施方式中，细胞因子分子包含IL-15和与Fc融合的可溶性IL-15受体α结构域(例如，sIL-15Ra-Fc融合蛋白)，如Rubinstein等，PNAS 103：24第9166-9171页(2006)。
IL-15分子可进一步包含多肽，例如细胞因子受体，例如细胞因子受体结构域，和第二异源结构域。在一个实施方式中，异源结构域是免疫球蛋白Fc区。在其他实施方式中，异源结构域是抗体分子，例如，Fab片段，Fab2片段，scFv片段或亲和体片段或衍生物，例如sdAb(纳米抗体)片段，重链抗体片段。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的N-末端，并且在其他实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的C-末端。
野生型IL-15受体α序列和该序列的片段和变体在下文列出。
野生型IL-15受体α序列(Genbank登记号AAI21141.1)：SEQ ID NO：41。
野生型IL-15受体α胞外结构域(登录号Q13261的部分)：SEQ ID NO：63。
异构体CRA_d IL-15受体α胞外结构域(登录号EAW86418的部分)：SEQ ID NO：64。
野生型IL-15受体α序列在上文以SEQ ID NO：41提供。IL-15受体α包含胞外结构域，23个氨基酸的跨膜区段和39个氨基酸的细胞质尾。IL-15受体α的胞外结构域以SEQ IDNO：63提供。
在其他实施方式中，可以使用IL-15激动剂。例如，IL-15受体的激动剂，例如针对IL-15受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引起天然存在的细胞因子的至少一种活性。在实施方式中，IL-15受体或其片段是来自人或非人的动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类。
本文的组合物和方法可包含IL-15Rα的部分，例如IL-15Rα的Sushi结构域。在一些实施方式中，多肽包含Sushi结构域和第二异源结构域。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，Sushi结构域是第二结构域的N-末端，并且在其他实施方式中，Sushi结构域是第二结构域的C-末端。在实施方式中，第二结构域包含Fc结构域。
野生型IL-15受体α序列以SEQ ID NO：41提供。IL-15受体α包含胞外结构域，23个氨基酸的跨膜区段和39个氨基酸的细胞质尾。sushi结构域已经在包括例如Bergamaschi等，(2008)，JBC卷283，第7期，第4189-4199页；Wei等，(2001)，Journal of Immunology167：277-282；Schluns等，(2004)PNAS卷110(15)5616-5621；US 2016/0184399的文献中进行了描述(其各自内容通过引用纳入本文)。
IL-15受体α的胞外结构域以SEQ ID NO：63提供。IL-15受体α的胞外结构域包含与IL-15结合的结构域，本文称为sushi结构域。通常sushi结构域也称为补体调节蛋白(CCP)模块或短共有重复序列(SCR)，其为在几种蛋白质(包括补体系统的多个成员)中发现的蛋白质结构域。sushi结构域采用β三明治折叠，由四个高度保守的半胱氨酸残基的第一个和第四个半胱氨酸所界定，包含约60个氨基酸的序列延伸(Norman，Barlow等，J MolBiol.1991年6月20；219(4)：717-25)。IL-15Rα中由sushi结构域的第一和第四半胱氨酸界定的氨基酸残基包含62个氨基酸的多肽，被称为最小结构域(SEQ ID NO：52)。在最小sushi结构域的N和C端包括IL-15Rα的其他氨基酸，例如包含N末端Ile和Thr以及C末端Ile和Arg残基，形成65个氨基酸的延伸sushi结构域(SEQ ID NO：9)。
本文所述的sushi结构域可包含相对于野生型sushi结构域的一个或多个突变。例如，IL-15Ra的残基77在野生型基因中是亮氨酸(并且在SEQ ID NO：41中加下划线)，但是可以突变为异亮氨酸(L77I)。因此，以SEQ ID NO：65提供了包含L77I的最小sushi结构域(编号参考SEQ ID NO：41的野生型IL-15Ra)。以SEQ ID NO：66提供了包含L77I的延伸的sushi结构域(编号参考SEQ ID NO：41的野生型IL-15Ra)。
最小sushi结构域，野生型：
Figure BDA0003377443230000451
延伸的sushi结构域，野生型：
Figure BDA0003377443230000452
最小sushi结构域，L77I：
Figure BDA0003377443230000453
延伸的sushi结构域，L77I：
Figure BDA0003377443230000454
在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的65-171个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的多至171个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性且具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸组成。在一些实施方式中，sushi结构域包含或由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171个氨基酸或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)，并具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的至多171个氨基酸或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)，并具有IL-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的62-171、62-160、62-150、62-140、62-130、62-120、62-110、62-100、62-90，62-80、62-70、65-171、65-160、65-150、65-140、65-130、65-120、65-110、65-100、65-90、65-80或65-70个氨基酸或与其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)，且具有IL-15结合活性的序列组成。
在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少65个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的一部分或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。在一些实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：66的部分或相对于其具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个修饰(例如，取代)的序列，其中该序列相对于野生型IL-15Ra包含L77I突变，并具有IL-15结合活性。
在实施方式中，sushi结构域包含SEQ ID NO：63的至少10、20、30、40、50、60、62、65、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个连续氨基酸，或相对于其具有L77I突变的序列。在实施方式中，sushi结构域由SEQ ID NO：63的10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160或160-170个连续氨基酸，或相对于其具有L77I突变的序列组成。
在实施方式中，sushi结构域是来自人或非人的动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类的sushi结构域。
在一些实施方式中，多肽可以具有第二异源结构域，例如Fc结构域或Fab结构域。
在一些实施方式中，包含IL-15受体或其片段的多肽包含Fc结构域。在实施方式中，Fc结构域是效应减弱的Fc结构域，例如，人IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID NO：54的人IgG2Fc结构域或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在实施方式中，效应减弱的Fc结构域具有降低的效应活性，例如，与野生型IgG1Fc结构域相比，例如与SEQ ID NO：67的野生型IgG1 Fc结构域相比。在一些实施方式中，效应活性包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在实施方式中，例如，与SEQ ID NO：67的野生型IgG1 Fc结构域相比，在ADCC测定中效应活性降低了10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。在一些实施方式中，效应活性包括补体依赖性细胞毒性(CDC)。在实施方式中，在CDC测定例如在Armour等，“缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor Ibinding and monocyte triggering activities)”，Eur J Immunol(1999)29：2613-24所述的CDC测定中，例如，与SEQ ID NO：67的野生型IgG1 Fc结构域相比，效应活性降低了10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。
在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：67的IgG1 Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：68的IgG2恒定区或其片段，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：55的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在实施方式中，使用Kabat编号系统，Fc结构域包含A330S和P331S其中之一或两者的突变。在实施方式中，Fc结构域是Armour等，“缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding andmonocyte triggering activities)”Eur J Immunol(1999)29：2613-24中描述的那个结构域。
在一些实施方式中，Fc结构域具有二聚化活性。在其他实施方式中，Fc结构域是IgG结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。在一个实施方式中，Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方式中，纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：56的序列的蛋白质(sushi-IgG2Da-Fc)或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，IFM包括本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9)和本文所述的Fc结构域，例如IgG2 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：54或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列)。在一些实施方式中，IFM包括SEQID NO：9的sushi结构域和本文所述的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：67的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：52的sushi结构域和IgG2 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：54的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：52的sushi结构域和IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：67的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和SEQ ID NO：56的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包括SEQ ID NO：52的sushi结构域和SEQ ID NO：56的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，IFM包含sushi-IgG2Da-Fc蛋白，其具有SEQ ID NO：56的序列或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
在实施方式中，Sushi结构域是来自人或非人的动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类的Sushi结构域。
在实施方式中，组合物包含，例如纳米颗粒包含IL-15复合物，IL-15复合物包含IL-15分子与多肽(共价或非共价地)复合物，其中多肽包含第一结构域，其包括：
i)SEQ ID NO：63的野生型IL-15受体α胞外结构域的至少62个氨基酸，其中该多肽的最长连续IL-15受体α序列长度不超过171个氨基酸，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列，并具有IL-15结合活性；
ii)SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸，其中该多肽的最长连续IL-15受体α序列长度不超过171个氨基酸，或与SEQ ID NO：63的对应序列相比不超过1、2、3、4或5个氨基酸不同，并具有IL-15结合活性；
iii)SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸，其中该多肽的最长连续IL-15受体α序列长度不超过171个氨基酸，并具有IL-15结合活性；
iv)最小sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)和SEQ ID NO：63的不超过171个连续氨基酸残基，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列；
v)最小sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)和SEQ ID NO：63的不超过171个连续氨基酸残基，或与SEQ ID NO：63的对应序列相比不超过1、2、3、4或5个氨基酸不同的序列；
vi)最小sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)和SEQ ID NO：63的不超过171个连续氨基酸残基；
vii)延伸的sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)和SEQ ID NO：63的不超过171个连续氨基酸残基，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列；
viii)延伸的sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)和SEQ ID NO：63的不超过171个连续氨基酸残基，或与SEQ ID NO：63的对应序列相比不超过1、2、3、4或5个氨基酸不同的序列；
ix)延伸的sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)和SEQ ID NO：63的不超过171个连续氨基酸残基；或
x)SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列，具有IL-15结合活性，且其中氨基酸77(编号参考SEQID NO：41的野生型IL-15受体α)是异亮氨酸；
xi)SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸，或与SEQ ID NO：63的对应序列相比不超过1、2、3、4或5个氨基酸不同的序列，具有IL-15结合活性，且其中氨基酸77是异亮氨酸；
xii)SEQ ID NO：63的至少62个氨基酸，具有IL-15结合活性，且其中氨基酸77是异亮氨酸；
xii)最小的或延伸的sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列，其中氨基酸77是异亮氨酸；
xiv)最小的或延伸的sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)，或与SEQ IDNO：63的对应序列相比不超过1、2、3、4或5个氨基酸不同的序列，其中氨基酸77是异亮氨酸；或
xv)最小的或延伸的sushi结构域的活性片段(例如IL-15结合片段)，其中氨基酸77是异亮氨酸；和
任选地，第二异源结构域，例如Fc结构域或Fab结构域。
在一些实施方式中，包含IL-15受体或其片段的多肽包含Fc结构域。在实施方式中，Fc结构域是效应减弱的Fc结构域，例如，人IgG2 Fc结构域，例如SEQ ID NO：54的人IgG2Fc结构域或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
Figure BDA0003377443230000511
在实施方式中，效应减弱的Fc结构域具有降低的效应活性，例如，与野生型IgG1Fc结构域相比，例如与SEQ ID NO：53的野生型IgG1 Fc结构域相比。在一些实施方式中，效应活性包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在实施方式中，例如，与SEQ ID NO：53的野生型IgG1 Fc结构域相比，在ADCC测定中效应活性降低了10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。在一些实施方式中，效应活性包括补体依赖性细胞毒性(CDC)。在实施方式中，在CDC测定例如在Armour等，“缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptorIbinding and monocyte triggering activities)”，Eur J Immunol(1999)29：2613-24所述的CDC测定中，例如，与SEQ ID NO：53的野生型IgG1 Fc结构域相比，效应活性降低了10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。
在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：53的IgG1 Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
Figure BDA0003377443230000521
在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：68的IgG2恒定区或其片段，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
Figure BDA0003377443230000522
在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO：55的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在实施方式中，使用Kabat编号系统，Fc结构域包含A330S和P331S其中之一或两者的突变。在实施方式中，Fc结构域是Armour等，“缺乏Fcγ受体I结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子(Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding andmonocyte triggering activities)”Eur J Immunol(1999)29：2613-24中描述的那个结构域。
Figure BDA0003377443230000531
在一些实施方式中，Fc结构域具有二聚化活性。在其他实施方式中，Fc结构域是IgG结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。在一个实施方式中，Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方式中，纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：56的序列的蛋白质或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。
Figure BDA0003377443230000532
在一些实施方式中，纳米颗粒包括本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9)和本文所述的Fc结构域，例如IgG2 Fc结构域(例如，SEQ ID NO：54或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列)。在一些实施方式中，纳米颗粒包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和本文所述的Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：53的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包括SEQ ID NO：52的sushi结构域和IgG2 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：54的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包括SEQ IDNO：52的sushi结构域和IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO：53的Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括SEQ ID NO：9的sushi结构域和SEQ ID NO：55的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包括SEQ ID NO：52的sushi结构域和SEQ ID NO：55的IgG2Da Fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包含sushi-IgG2Da-Fc蛋白，其具有SEQ IDNO：56的序列或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。
在实施方式中，IL-15分子是国际申请WO2017/027843中描述的分子，其通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中IL-15分子是IL-15SA。人IL-15和可溶性人IL-15Ra的组合产生被称为IL-15超激动剂(IL-15SA)的复合物，其拥有比单独的人IL-15更强的生物活性。
可溶性人IL-15Ra以及胞外结构域截短版本已经描述于，例如(Wei等，2001，J.ofImmunol.167：277-282)。人IL-15Ra的氨基酸序列在本文中示于SEQ ID NO：2。因此，本公开的一些方面涉及IL-15SA，其包含人IL-15和可溶性人IL-15R分子的复合物。在本公开的一些方面，IL-15SA包含人IL-15和可溶性人IL-15Ra的复合物，其包含全部或部分胞外结构域，不包含跨膜结构域或胞质结构域。在本公开的一些方面，IL-15SA包含人IL-15和可溶性人IL-15Ra的复合物，其包含全部胞外结构域或保留IL-15结合活性的胞外结构域的截短形式。本公开的一些方面涉及IL-15SA，其包含人IL-15和可溶性人IL-15Ra的复合物，其包含保留IL-15结合活性的胞外结构域的截短形式，例如人IL-15Ra的氨基酸1-60、1-61、1-62、1-63、1-64或1-65。在本公开的一些方面中，IL-15SA包含人IL-15和可溶性人IL-15Ra的复合物，其包含保留IL-15结合活性的胞外结构域的截短形式，例如人IL-15Ra的氨基酸1-80、1-81、1-82、1-83、1-84或1-85。在本公开的一些方面中，IL-15SA包含人IL-15和可溶性人IL-15Ra的复合物，其包含保留IL-15结合活性的胞外结构域的截短形式，例如人IL-15Ra的氨基酸1-180、1-181或1-182。
本公开的一些方面涉及IL-15SA，其包含人IL-15和可溶性人IL-15Ra的复合物，其包含保留IL-15结合活性并包含Sushi结构域的胞外结构域截短形式。保留IL-15活性并包含Sushi结构域的可溶性人IL-15Ra的截短形式用于本公开的IL-15SA。
人IL-15的突变形式已经描述于，例如，Zhu等，2009J of Immunol.183：3598。因此，本公开提供了前述IL-15SA复合物中的任何一种，其中人IL-15是野生型或包含一个或多个突变(如一个或多个氨基酸取代、添加或缺失)的突变IL-15。与野生型IL-15相比，用于本公开的IL-15SA的具有增加的生物活性的示例性IL-15突变体包含在氨基酸72处的天冬酰胺到天冬氨酸的取代(N72D)。
在任一上述实施方式中，本公开涉及包含可溶性人IL-15Ra的复合物以融合蛋白形式表达，例如与IL-15的如本文所述的Fc融合体(例如人IgG1Fc)。在一些实施方式中，IL-15SA包含与两个人IL-15分子复合的二聚体人IL-15RaFc融合蛋白(例如，人IgG1 Fc)。
在一些实施方式中，IL-15SA细胞因子复合物包含IL-15分子，该分子包含本文中示于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在一些实施方式中，IL-15SA细胞因子复合物包含IL-15分子，该分子包含示于国际申请WO2017/027843的SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的氨基酸序列，其通过引用纳入本文。在一些实施方式中，IL-15SA细胞因子复合物包含可溶性IL-15Ra分子，该分子包含本文中SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66的序列。在一些实施方式中，IL-15SA细胞因子复合物包含可溶性IL-15Ra分子，该分子包含国际申请WO2017/027843中SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：52的序列，其通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，IL-15SA是细胞因子复合物，其包含与两个IL-15分子复合的二聚体IL-15RaFc融合蛋白。在一些实施方式中，IL-15-SA包含二聚体IL-15RaSu(Sushi结构域)/Fc(SEQ ID NO：13)和两个IL-15N72D(SEQ ID NO：11)分子。在实施方式中，IL-15SA包含ALT-803，如US20140134128所述，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，IL-15SA包含二聚体IL-15RaSu/Fc分子(SEQ ID NO：13)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：10)。
在一些实施方式中，IL-15SA包含可溶性IL-15Ra分子(例如SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：52)和两个IL-15分子(例如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11)。
蛋白纳米凝胶/纳米颗粒
组合物，例如纳米颗粒(例如纳米凝胶)可包含本文所公开的一个或多个蛋白质(例如生物活性蛋白，例如治疗性蛋白)。示例性纳米颗粒(例如，纳米凝胶)及其制作方法描述于国际公开申请WO 2010/059253，题为“用于局部药剂递送的方法和组合物(Methodsand Compositions for Localized Agent Delivery)”和国际公开申请WO 2015/048498，题为“无运载体生物活性蛋白纳米颗粒(Carrier-Free Biologically-Active ProteinNanoparticles)，”这两项申请的全部内容通过引用纳入本文。
本文所用“颗粒”包含多个(例如至少2个)蛋白质，例如本文所述的多个细胞因子分子。在一些实施方式中，颗粒是纳米颗粒，直径为1-1000纳米(nm)。在一些实施方式中，纳米颗粒直径大小范围为20-750nm，或20-500nm，或20-250nm。在一些实施方式中，直径大小范围为50-750nm，或50-500nm，或50-250nm，或约100-300nm。在一些实施方式中，纳米颗粒直径为约100、约150、约200nm、约250nm，或约300nm。在实施方式中，纳米颗粒是基本球形的。
在实施方式中，纳米颗粒具有在30nm和1200nm之间，40nm和1100nm之间，50nm和1000纳米之间，例如50-500nm，更典型地，70和400nm之间的平均流体动力学直径(例如，通过动态光散射测量)。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含或由纳米凝胶组成，例如，如本文所述。在实施方式中，纳米凝胶中的蛋白质是偶联的，例如共价偶联或交联彼此和/或颗粒的第二组分(例如，蛋白质通过可降解的接头可逆地连接)。在实施方式中，蛋白质存在于聚合物或二氧化硅中，例如，在基于聚合物的或二氧化硅的壳中。在实施方式中，纳米颗粒包含本文所述的纳米壳。
在实施方式中，蛋白质通过可降解接头可逆地连接至官能团或聚合物，或“可逆地修饰”。在一些实施方式中，纳米壳可以通过在催化剂(例如NaF)的存在下用交联剂(硅烷-PEG-硅烷)将蛋白质偶联物的官能团(例如硅烷)聚合而形成。蛋白质纳米颗粒的例子是“蛋白纳米凝胶”，它是指多个蛋白质通过可降解接头(参见，例如WO2015/048498的图9A)彼此交联(例如，可逆地和共价地交联)。在一些实施方式中，纳米凝胶的蛋白质被交联(例如可逆地和共价地交联)至聚合物(例如亲水性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；参见例如WO2015/048498的图9A)。在一些实施方式中，聚合物可以被交联至纳米凝胶的表面(例如，至暴露在纳米凝胶表面的蛋白质)。
蛋白纳米凝胶的尺寸至少可以通过两种方式确定：基于其“干尺寸”和基于其“流体力学尺寸”。蛋白纳米凝胶的“干尺寸”是指作为干固体的纳米凝胶的直径。蛋白纳米凝胶的“流体力学尺寸”是指纳米凝胶作为水合凝胶(例如，水性缓冲液中的纳米凝胶)的直径。纳米凝胶的干尺寸可以通过例如透射电子显微镜来确定，而纳米凝胶的流体力学尺寸可以通过例如动态光散射来确定。
在一些实施方式中，纳米凝胶的干尺寸为小于400nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干尺寸为小于300nm、小于200nm、小于100nm、小于80nm、小于75nm、小于70nm、小于65nm或小于60nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干尺寸为40至90nm、40至80nm、40至70nm、40至60nm、50至90nm、60至80nm、50至70nm或50至60nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干尺寸为40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm或95nm。
在一些实施方式中，多个纳米颗粒中的纳米颗粒(例如纳米凝胶)的平均干尺寸小于400nm。在一些实施方式中，在这样的多个纳米颗粒中的纳米颗粒的平均干尺寸变化不超过5％或10％。在一些实施方式中，在多个纳米颗粒中的纳米颗粒(例如纳米凝胶)的平均干尺寸为小于300nm、小于200nm、小于100nm、小于80nm、小于75nm、小于70nm、小于65nm或小于60nm。在一些实施方式中，在多个纳米颗粒中的纳米颗粒(例如纳米凝胶)的平均干尺寸为40至90nm、40至80nm、40至70nm、40至60nm、50至90nm、60至80nm、50至70nm或50至60nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干尺寸为40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm或95nm。
在一些实施方式中，多个纳米颗粒中的纳米颗粒(例如纳米凝胶)的平均流体力学尺寸小于1000nm。在一些实施方式中，在这样的多个纳米颗粒中的纳米颗粒的平均流体力学尺寸具有通过动态光散射测量的多分散指数，小于0.35。在一些实施方式中，在多个纳米颗粒中的纳米颗粒(例如纳米凝胶)的平均流体力学尺寸为小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm或小于100nm。在一些实施方式中，在多个纳米颗粒中的纳米颗粒(例如纳米凝胶)的平均流体力学尺寸为400至500nm、300至400nm、200至300nm、100至200nm、50至100nm。
在一些实施方式中，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶的干尺寸为直径小于300nm。例如，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶的干尺寸可以为直径50-200nm。在一些实施方式中，如本文所提供的多个蛋白纳米凝胶具有相似的干尺寸(例如，其中70％纳米凝胶彼此的直径为10％、20％、30％、40％、50％或100％以内，并且具有通过动态光散射测量的多分散指数小于0.35)。
在一些实施方式中，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶的流体力学尺寸为直径小于150nm。例如，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶的流体力学尺寸可以为直径50-100nm。在一些实施方式中，如本文所提供的多个蛋白纳米凝胶具有相似的流体力学尺寸(例如，其中70％纳米凝胶彼此的直径为10％、20％、30％、40％、50％或100％以内，并且具有通过动态光散射测量的多分散指数小于0.35)。
在一些实施方式中，纳米颗粒以干燥的、固体形式提供，例如冻干形式。在其他实施方式中，纳米颗粒以水合形式提供，例如在水性溶液或其他液体溶液中。在其他实施方式中，纳米颗粒以冷冻形式提供。
在一些实施方式中，纳米颗粒的蛋白质通过可降解的接头可逆地彼此连接，使得在生理条件下，接头降解并释放完整的生物活性蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒的蛋白质通过可降解的接头可逆地连接至官能团，使得在生理条件下，接头降解并释放完整的生物活性蛋白。在各情况下，蛋白质被认为是可逆地修饰的，如下所述。
本文中“可逆地连接至另一蛋白质”的蛋白质是指通过可降解接头附接(例如共价附接)至另一蛋白质的蛋白质。这种蛋白质被认为是通过可降解接头彼此连接(例如交联)。在一些实施方式中，纳米颗粒(例如纳米凝胶)包含单一(例如单一类型的)生物活性蛋白(例如，IL-15、IL-15-Fc、IL-15 Fab片段、IL-2或IL-2-Fc、Fab片段、FAB2片段、scFv片段或亲和片段或衍生物，例如sdAb(纳米抗体)片段、重链抗体片段等等)，而在其他实施方式中，纳米颗粒包含多于一种(例如2、3、4、5或更多种)生物活性蛋白(例如不同蛋白的组合，例如IL-2和IL-15(或IL-15SA)或IL-15和IL-21)。例如，蛋白纳米凝胶可包含蛋白A和蛋白B的组合，其中蛋白A与蛋白A相连，蛋白A与蛋白B相连和/或蛋白B与蛋白B相连。
在本文中“可逆地连接至官能团”的蛋白质或“可逆地修饰”的蛋白质是指通过可降解的接头与官能团附接(例如，共价附接)的蛋白质。这样的蛋白质在本文中可以被称为“蛋白偶联物”或“可逆修饰的蛋白偶联物”，这些术语在本文中可以互换使用。应理解，蛋白质和聚合物各自含有官能团，蛋白质可以通过可逆接头(例如，可降解接头，如二硫化物接头)与之连接。本文提供的蛋白偶联物和可逆修饰的蛋白质的实例包括但不限于，可逆地连接(例如，经由可降解的接头)至另一蛋白质的蛋白质，可逆地连接至聚合物的蛋白质，和可逆地连接至另一官能团的蛋白质。应当理解，术语“蛋白质”包括融合蛋白。
可降解接头
用于本文所述的纳米颗粒的合适的可降解接头(例如交联剂)可包含，例如，两个N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基，通过对还原性生理环境敏感的含有二硫化物的柔性接头连接在一起，或对酸性生理环境(pH＜7，例如pH为4-5、5-6或6-小于7，例如6.9)敏感的可水解的接头，或蛋白酶敏感接头，其对一种或多种存在于生物介质中的酶敏感，例如肿瘤微环境中的蛋白酶，如存在于肿瘤微环境或发炎组织中的基质金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶2(MMP2)或基质金属蛋白酶9(MMP9))。对还原性生理环境敏感的交联剂是，例如，具有含二硫化物接头的交联剂，其通过NHS基团的存在与蛋白质上的胺基反应，将蛋白质交联成高密度蛋白纳米凝胶。在本文实施例中使用的交联剂包括双[2-(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基氧基)乙基]二硫化物。
在一些实施方式中，可降解接头包含至少一种N-羟基琥珀酰亚胺酯。在一些实施方式中，可降解的接头是氧化还原响应性接头。在一些实施方式中，氧化还原响应性接头包含二硫键。在一些实施方式中，本文提供的可降解接头包含至少一种N-羟基琥珀酰亚胺酯，它能够在中性pH(例如，约6至约8，或约7)下与蛋白质反应，而基本不会使蛋白质变性。在一些实施方式中，可降解接头是“氧化还原响应性”接头，即在生理条件下(如20-40℃和/或pH4-8)，它们在还原剂(如谷胱甘肽，GSH)存在的条件下降解，从而将完整的蛋白质从其可逆连接的化合物中释放出来。根据本公开使用的可降解接头的一个示例如下表示：
Figure BDA0003377443230000601
式I的接头包含二硫键，在还原剂存在的条件下被裂解。例如，在生理条件下，式I的接头的二硫键被谷胱甘肽裂解。
蛋白质可通过任何末端或内部-NH2官能团(例如赖氨酸的侧链)连接(例如，共价连接)至可降解的接头。因此，在用式I的可降解接头可逆地修饰蛋白质时形成的中间体物质是以下：
Figure BDA0003377443230000602
本文还提供了可逆修饰的蛋白偶联物，其包含式III：
Figure BDA0003377443230000611
接头可以在胺基处与目标蛋白质偶联，如末端胺或内部胺。内部胺包括侧链胺，例如赖氨酸胺。
本公开进一步包括蛋白偶联物，其包含式III：
Figure BDA0003377443230000612
此外，本公开进一步提供蛋白偶联物，其包含式IV：
Figure BDA0003377443230000613
具有高纳入效率(例如＞～90％)和高蛋白质药物装载效率(例如＞～80％)的硅基纳米颗粒是由硅烷可逆修饰的蛋白质聚合形成的。因此，本文提供的是通过式III的蛋白偶联物与交联剂(例如硅烷-PEG-硅烷聚合物)聚合形成的纳米颗粒。
在其他实施方式中，蛋白质可以通过酶敏感的接头连接。在实施方式中，接头通过酶(例如蛋白酶或酯酶)的作用被降解或水解。在一些实施方式中，接头包括底物肽，其被选自以下基质金属蛋白酶的酶裂解(例如活化)：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、纤溶酶、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14或TACE。在实施方式中，接头包括公开于美国专利申请第2015/0087810号、美国专利第8,541,203号、美国专利第8,580,244号中的底物序列。在一些实施方式中，接头包括公开于以下文章之一中的序列：van Kempen，等Eur Cancer(2006)42：728-734；Desnoyers，L.R.等Sci Transl Med(2013)5：207；Rice，J.J.等Protein Sci(2006)15：825-836；Boulware，K.T.和Daugherty，P.S.Proc Natl Acad Sci USA(2006)103：7583-7588；以及Eckhard，U等Matrix Biol(2015)doi：10.1016/j.matbio.2015.09.003(电子出版)。本文引用的任何公开物的内容通过引用明确纳入本文。
其他在本发明的纳米凝胶中有用的接头描述于PCT申请号PCT/US2018/049594和PCT/US2018/049596中，其各自的公开内容全文纳入本文。
本文提供的可逆修饰的蛋白质可以，在一些实施方式中，被形成或自组装成各种纳米结构，包括但不限于蛋白亲水聚合物偶联物(例如，用PEG可逆修饰)，蛋白疏水聚合物偶联物(例如，可逆修饰的PLA或PLGA)，块状交联的蛋白质水凝胶，交联的蛋白质纳米凝胶颗粒，具有不同壳材料(例如二氧化硅)的蛋白质纳米胶囊，偶联蛋白质的纳米颗粒(例如脂质体、胶束、聚合物纳米颗粒，无机纳米颗粒)，例如在WO2015/048498中所述。同样，本文提供的蛋白质彼此交联，在一些实施方式中，可以被形成或自组装成蛋白纳米颗粒。
在一些实施方式中，蛋白纳米颗粒(例如，蛋白纳米凝胶，包括蛋白聚合物纳米凝胶)包含运载体蛋白或其他运载体分子。运载体蛋白通常有利于不同分子的扩散和/或运输，并能增加纳米颗粒的稳定性和/或增加纳米颗粒在细胞表面的稳定性，和/或增加纳米颗粒对细胞表面的亲和性。应理解，本文所用术语“运载体蛋白”是指对蛋白纳米颗粒的生物活性蛋白没有不利影响的蛋白质。在一些实施方式中，运载体蛋白是惰性蛋白。在一些实施方式中，运载体蛋白或运载体分子选自白蛋白、鱼精蛋白、壳聚糖碳水化合物、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、天然聚合物、多糖、葡聚体、纤维素、纤连蛋白、胶原、纤维蛋白或蛋白聚糖。因此，在一些实施方式中，运载体蛋白是没有生物活性的。
在一些实施方式中，本文提供的是单分散的多个生物活性蛋白聚合物颗粒，例如纳米颗粒，例如纳米凝胶。在实施方式中，纳米凝胶的蛋白质通过可降解接头可逆地和共价地相互交联，并且其中纳米凝胶的蛋白质被交联至聚合物。在一些实施方式中，聚合物被交联至纳米凝胶的表面(并且，因此，被认为是表面偶联的)。
在一些实施方式中，纳米颗粒(例如纳米凝胶)包括、由或基本由以下组成：(a)通过可降解接头(例如二硫化物接头)可逆地和共价地相互交联的一种或多种生物活性蛋白和(b)交联至纳米凝胶的表面暴露蛋白的聚合物(例如通过可降解接头可逆地和共价地交联的)。在一些实施方式中，相互交联的蛋白质的重量百分比大于纳米凝胶的75％w/w(例如，大于80％、85％或90％w/w)。
如果多个纳米凝胶相对于彼此具有相似的尺寸(例如直径)，例如通过动态光散射测量的多分散指数小于0.35，更优选小于0.3，例如小于0.25或小于0.2，则认为多个纳米凝胶在组合物(例如水性或其他液体组合物)中是“单分散”。如果多个纳米凝胶之间的尺寸变化不超过5％-10％，则可认为多个纳米凝胶相对于彼此具有相同的尺寸。
本公开的其他方面提供了包括聚合物和至少75％(例如，约80％)w/w的蛋白质的纳米凝胶，这些蛋白质通过可降解接头可逆地和共价地相互交联。在一些实施方式中，可降解接头是氧化还原响应性接头，例如，二硫化物接头(例如，式I)。
然而，本公开的其他方面提供了生产多个具有生物活性的蛋白纳米凝胶的方法，该方法包括(a)在允许蛋白质通过可降解接头可逆地相互交联的条件下，将蛋白质与可降解接头(例如，二硫接头)接触，从而产生多个蛋白纳米凝胶，和(b)在允许聚合物与蛋白纳米凝胶的蛋白质交联的条件下，将蛋白纳米凝胶与聚合物(例如聚乙二醇)接触，从而产生多个具有生物活性的蛋白质-聚合物纳米凝胶。
在一些实施方式中，(a)的条件包括使蛋白质与可降解的接头在水性缓冲液中在4℃至25℃的温度下接触。在一些实施方式中，(a)的条件包括使蛋白质与可降解的接头在水性缓冲液中接触30分钟至1小时。在一些实施方式中，(b)的条件包括使蛋白纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液中在4℃至25℃的温度下接触。在一些实施方式中，(b)的条件包括使蛋白纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液中接触30分钟至1小时。在一些实施方式中，水性缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一些实施方式中，(a)的条件不包括使蛋白质与可降解的接头在高于30℃的温度下接触。在一些实施方式中，(b)的条件不包括使蛋白纳米凝胶与聚合物在高于30℃的温度下接触。
在一些实施方式中，(a)的条件不包括使蛋白质与可降解的接头在有机溶剂(例如醇)中接触。在一些实施方式中，(b)的条件不包括使蛋白纳米凝胶与聚合物在有机溶剂中接触。
在一些实施方式中，蛋白质是细胞因子、生长因子、抗体或抗原。例如，蛋白质可以是本文所述的细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-12分子。在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子，例如IL-15或IL-15SA。
在一些实施方式中，可降解的接头是氧化还原响应性接头。在一些实施方式中，氧化还原响应性接头包含二硫键。在一些实施方式中，可降解接头包括或由式I组成。
在一些实施方式中，聚合物是亲水性聚合物。亲水性聚合物，在一些实施方式中，包括聚乙二醇(PEG)。例如，亲水性聚合物可以是4-臂PEG-NH2聚合物。
在一些实施方式中，水性缓冲液中蛋白质的浓度为10mg/mL至50mg/mL(例如10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/mL)。
在一些实施方式中，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶中的蛋白质(例如，生物活性蛋白、交联蛋白)的重量百分比至少为75％。在一些实施方式中，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶中的蛋白质的重量百分比至少为80％。在一些实施方式中，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶中的蛋白质的重量百分比至少为85％。在一些实施方式中，生物活性蛋白-聚合物纳米凝胶中的蛋白质的重量百分比至少为90％。
在一些实施方式中，在生理条件下，蛋白质以其天然构象从纳米凝胶中释放出来，并具有生物活性。在一些实施方式中，释放的蛋白质的比活性为该蛋白质通过可降解接头交联至另一蛋白质之前的比活性的至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
本发明的一些方面提供了通过可降解接头可逆地连接至可聚合的官能团的蛋白质。这种蛋白质在本文中被认为是可逆修饰的蛋白质。
在一些实施方式中，可聚合官能团包括硅烷和/或可交联聚合物。在一些实施方式中，可交联聚合物包含聚(环氧乙烷)、聚乳酸和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。在一些实施方式中，蛋白质通过可降解接头可逆地连接至硅烷。
本公开的其他方面提供了多个本文所述的任何可逆修饰蛋白质。在一些实施方式中，这种多个中的可逆修饰蛋白质是交联的。
然而本公开的其他实施方式提供了纳米颗粒，其包含聚合物和至少50％w/w的蛋白质，该蛋白质通过可降解接头可逆地连接至可聚合官能团。本文中“w/w”意指蛋白质的重量与纳米颗粒(纳米凝胶)重量之比。本文所用“可聚合官能团”意指一组可发生化学反应以形成聚合物链或网络的原子和键。“聚合物”是指重复单元的链或网络或不同重复单元的混合物。如本文所用，聚合物本身是官能团。根据本公开使用的可聚合官能团的例子包括但不限于硅烷、环氧乙烷、乳酸、丙交酯、乙醇酸、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、二氧化硅、聚环氧乙烷、聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚谷氨酸、聚赖氨酸、环糊精和葡聚糖壳聚糖。考虑并且可以根据本公开使用其他可聚合官能团。然而，应理解，本文所用的“聚合物”不是蛋白质(非蛋白质)、肽(非肽)或氨基酸(非氨基酸)。
术语“聚合物”涵盖“共聚物”。也就是说，聚合物可以包括不同官能团(如硅烷-PEG-硅烷)的混合物，其包括较短的聚合物或共聚物。这些官能团通常在与蛋白质相容的中性条件下进行聚合。因此，在一些实施方式中，官能团的聚合发生在至少部分水性溶液中，约pH 6至约pH 8。例如，官能团的聚合可发生在pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5或pH 8。在一些实施方式中，官能团的聚合发生在约pH 7。
在一些实施方式中，聚合反应是由氟化钠、氟化钾或任何其他可溶性氟化物催化的。
可以可逆地连接至蛋白质和/或用于形成纳米颗粒(例如，纳米胶囊、纳米凝胶、水凝胶)的示例性聚合物包括但不限于：脂肪族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(carprolactone)(PCL)、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)，以及天然聚合物，例如藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物，(包括取代、添加化学基团(例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化以及本领域技术人员常规进行的其他修饰)，白蛋白和其他亲水性蛋白、玉米蛋白和其他醇溶谷蛋白和疏水蛋白、共聚物和其混合物。通常，这些材料在体内通过酶促水解或暴露于水中，通过表面或整体溶蚀降解。考虑并且可以根据本公开使用其他聚合物。
在一些实施方式中，蛋白质与亲水聚合物可逆地连接，例如，聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(PEG-PLL)和/或聚乙二醇-b-聚精氨酸(PEG-PArg)。
本公开的一些实施方式涉及表面包含聚阳离子的纳米颗粒(例如纳米凝胶)。聚阳离子是在几个位点处具有正电荷的分子或化学复合物。通常，聚阳离子具有总体正电荷。根据本公开内容使用的聚阳离子的例子包括但不限于：聚赖氨酸(聚L-赖氨酸和/或聚D-赖氨酸)、聚(精氨酸甘油琥珀酸酯)(PAGS，一种基于精氨酸的聚合物)、聚乙烯亚胺、聚组氨酸、聚精氨酸、硫酸鱼精蛋白、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(PEG-PLL)，或聚乙二醇-g-聚赖氨酸。
在一些实施方式中，聚阳离子被添加到纳米凝胶的表面。在一些实施方式中，聚阳离子(例如聚乙二醇-b-聚赖氨酸或PEG-PLL)被添加到纳米凝胶的表面。在一些实施方式中，聚阳离子是聚乙二醇-b-聚赖氨酸。在一些实施方式中，聚阳离子被添加到具有或没有抗-CD45抗体的纳米凝胶中。
在实施方式中，纳米颗粒包含聚K30。在一些实施方式中，纳米颗粒包含聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(PEG-PLL)或聚乙二醇-b-聚精氨酸(PEG-PArg)。在实施方式中，纳米颗粒包含聚K200。
在实施方式中，纳米颗粒在纳米颗粒表面包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，阳离子聚合物包含聚赖氨酸，例如聚K30或聚K200。在一些实施方式中，聚赖氨酸为聚-L-赖氨酸。在实施方式中，聚赖氨酸的平均长度为20-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400或400-500个氨基酸。
在实施方式中中，纳米颗粒包含聚乙二醇(PEG)。在实施方式中，PEG分子量为1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10kD。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含阳离子嵌段共聚物，其包含PEG(例如PEG5k)和聚赖氨酸，例如聚K30或聚K20。在实施方式中，阳离子嵌段共聚物包含PEG5k-聚K30或PEG5k-聚K200。
不希望受理论限制，在一些实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸(例如，具有10-150、20-100、20-80、20-60、20-40或约30个氨基酸的平均长度)的纳米颗粒显示出比包含更高分子量聚赖氨酸(例如，具有约200个氨基酸的平均长度)的纳米颗粒优良的特性。优良的特性可以是，例如，低毒性、低聚集性、或高细胞负荷，或其任何组合。
在实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸的纳米颗粒显示出对T细胞的低毒性，例如，通过量化冷冻和解冻后的活T细胞的数量测定，例如，使用实施例的方法。在实施方式中，低毒性包括在冷冻和解冻后至少扩增1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、或5倍的细胞。
在实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸的纳米颗粒显示出低聚集性，例如，通过动态光散射测量，例如，如实施例中所述。在实施方式中，低聚集性包括约80nm(例如，70-90nm、60-100nm，或50-150nm)大小的纳米颗粒群。
在实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸的纳米颗粒显示出高细胞负荷，如，通过被装载到活化的原初T细胞上的纳米颗粒的平均荧光强度(MFU)测量，例如，如实施例中所述。在实施方式中，高细胞负荷包括MFU比其他方面类似但具有聚K200的对照纳米颗粒高至少2、5、10、20、50、100、200或500倍。
在其他实施方式中，蛋白质被可逆地连接到疏水聚合物上，例如，聚乳酸(PLA)和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在一些实施方式中，这些蛋白质-疏水性聚合物偶联物可以自组装成纳米颗粒。
在一些实施方式中，本公开的蛋白偶联物可以交联形成水凝胶网络、纳米凝胶颗粒或蛋白质纳米凝胶，例如描述于WO2015/048498和WO2017/027843，这些所有在本文中被视为“纳米颗粒”。
在一些实施方式中，可聚合官能团包括硅烷和/或可交联聚合物。在一些实施方式中，可交联聚合物包含聚(环氧乙烷)、聚乳酸和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括至少75％w/w的蛋白质，其可逆地连接至可聚合官能团。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至少80％w/w的蛋白质，其可逆地连接至可聚合官能团。本文还考虑了包含约50％w/w至约90％w/w的可逆地连接至可聚合官能团的蛋白质的纳米颗粒。例如，在一些实施方式中，纳米颗粒可以具有约50％w/w、约55％w/w、约60％w/w、约65％w/w、约70％w/w、约75％w/w、约80％w/w、约85％w/w或约90％w/w的可逆地连接至可聚合官能团的蛋白质。
本公开的其他方面还提供了生产纳米颗粒的方法，这些方法包括用可降解接头和可聚合官能团修饰蛋白质，以及用交联剂和可溶性氟化物聚合这些可聚合官能团。
在一些实施方式中，可聚合官能团包括硅烷和/或可交联聚合物。在一些实施方式中，可交联聚合物包含聚(环氧乙烷)、聚乳酸和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。
在一些实施方式中，可溶性氟化物是氟化钠。在一些实施方式中，可溶性氟化物是氟化钾。
在一些实施方式中，纳米颗粒在其表面包含一个或多个反应性基团。在实施方式中，其外表面的一个或多个反应性基团可与有核细胞(如T细胞)上的反应性基团反应。示例性的纳米颗粒反应性基团包括但不限于：硫醇反应性马来酰亚胺头部基团、卤代乙酰基(如碘代乙酰基)基团、亚胺酯基团、N-羟基琥珀酰亚胺酯、吡啶基二硫基等。这些反应性基团与有核细胞表面的基团反应，因此，纳米颗粒结合到细胞表面。在实施方式中，当以这种方式进行表面修饰时，纳米颗粒旨在与具有“互补”反应性基团(即与纳米颗粒的反应性基团反应的反应性基团)的特定运载体细胞使用。在一些实施方式中，纳米颗粒不会整合到包含细胞表面的脂质双层中。通常，纳米颗粒不会被有核细胞显著吞噬(或基本内化)。
在一些实施方式中，反应性基团是马来酰亚胺、罗丹明或IR783反应性基团。
在实施方式中，IL-15分子是PCT国际申请公开号WO2017/027843中描述的分子，其通过引用全文纳入本文。
免疫刺激融合分子/系连融合体
在某些实施方式中，IFM可以在N至C末端的方向上用下式表示：R1-(任选地L1)-R2或R2-(任选地L1)-R1；其中R1包含免疫细胞靶向部分，L1包含接头(例如本文所述的肽接头)，并且R2包含免疫刺激部分，例如细胞因子分子。
在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，连接至，例如共价连接至免疫细胞靶向部分。
在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，与免疫细胞靶向部分功能性连接，例如共价连接(例如，通过化学偶联，融合，非共价缔合或其他方式)。例如，免疫刺激部分可以例如通过接头与免疫细胞靶向部分间接地共价偶联。
在实施方式中，接头选自：可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施方式中，接头是肽接头。肽接头的长度可以是5-20、8-18、10-15或约8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头包含Gly和Ser，例如，包含氨基酸序列(Gly4-Ser)n的接头，其中n表示基序的重复数，例如，n＝1、2、3、4或5(例如(Gly4Ser)2或(Gly4Ser)3接头)。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：36、37、38或39的氨基酸序列，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代)。在一个实施方式中，接头包含氨基酸序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：37)。在另一个实施方式中，接头包含来自IgG4铰链区的氨基酸，例如氨基酸DKTHTSPPSPAP(SEQ ID NO：38)。
在另一个实施方式中，可裂解接头被配置为可被酶裂解，如蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysine)、基质金属蛋白酶(MMP)、解聚素(disintegrin)和金属蛋白酶(ADAM；如ADAM-10或ADAM-17))、糖苷酶(例如α-、β-、γ-淀粉酶、α-、β-葡萄糖苷酶或乳糖酶)或酯酶(如乙酰胆碱酯酶、假胆碱酯酶或乙酰酯酶)。可能将可裂解的接头裂解的其他酶包括尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)，组织纤溶酶原激活物(tPA)，颗粒酶A，颗粒酶B，溶酶体酶，组织蛋白酶，前列腺特异性抗原，单纯疱疹病毒蛋白酶，巨细胞病毒蛋白酶，凝血酶，胱天蛋白酶和白细胞介素1β转化酶。
另一个例子是酶，例如蛋白酶(例如，胃蛋白酶，胰蛋白酶)在目的组织中的过表达，由此在到达目的组织时将裂解专门设计的肽接头。在这方面，合适的接头的说明性实例是Gly-Phe-Ser-Gly(SEQ ID NO：105)，Gly-Lys-Val-Ser(SEQ ID NO：106)，Gly-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO：107)，Gly-Lys-Lys-Trp(SEQ ID NO：108)，Gly-Ala-Tyr-Met(SEQ ID NO：109)。
在另一个例子中，酶，例如糖苷酶(例如α-淀粉酶)在目的组织中的过表达，导致在到达目的组织时将裂解专门设计的碳水化合物接头。在这方面，合适的接头的说明性实例是-(α-1-4-D-葡萄糖)n-，其中n≥4。
可裂解的接头可包含总共2至60个原子，例如2至20个原子。可裂解的接头可包含氨基酸残基，可以是肽接头，例如1-30或2-10个氨基酸残基。在一个变体中，可裂解接头B由1-30(例如2-10、或2-8、或3-9、或4-10)个氨基酸组成。对于pH敏感接头，原子的数目通常为2-50，例如2-30。
在本发明的一些实施方式中，接头包括氨基己酸(也称为胺基己酸)键或由1至30或2至10个碳水化合物残基组成的键。
除底物肽外，该接头还可包含连接物，参与与治疗性蛋白的一个或多个键合。这种连接物可以各自由一个氨基酸残基或含有2-10(例如3-9、或4-8、或2-8)个氨基酸残基的寡肽组成。作为连接物的氨基酸残基或寡肽如果存在，可以结合至底物肽的两端，也可以仅结合至底物肽的一端，以代表其中一个结构。可用作一种或多种连接物的一个氨基酸的类型，以及构成可用作一种或多种连接物的寡肽的氨基酸残基没有特别限制，可以使用任意类型的氨基酸残基，或含有例如2-8个相同或不同的任一类型的氨基酸残基的任意寡肽。可用作一种或多种连接物的寡肽的示例包括，例如，富含Gly氨基酸的连接物。其他有机部分也可以用作连接物。
在其他实施方式中，将免疫刺激部分直接共价偶联至免疫细胞靶向部分，而无需接头。
在其他实施方式中，IFM的免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分不是共价连接的，例如是非共价缔合的。
细胞因子分子与抗体分子，例如免疫球蛋白部分(Ig)(例如抗体(IgG)或抗体片段(Fab，scFv等))融合的示例性格式可包括与抗体分子的氨基末端(N末端)或羧基末端(C末端)，通常是抗体分子的C末端的融合。在一个实施方式中，包含结合至Ig多肽的细胞因子多肽，细胞因子-受体复合物或细胞因子-受体Fc复合物，细胞因子多肽链和Ig多肽链之间的合适连接的细胞因子-Ig部分融合分子包括直接多肽键，在两个链之间具有多肽接头的连接；以及链之间的化学键。典型的连接是由小的Gly4Ser接头(GGGGS)N组成的柔性接头，其中N表示基序的重复数。(GGGGS)2和(GGGGS)3是用于本公开的融合构建体中的接头的优选实施方式。
本文所述的示例性免疫刺激融合分子可包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：55，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72，SEQ IDNO：73，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：78，SEQ IDNO：79，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：85，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90，SEQ IDNO：91，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96，SEQ IDNO：97，SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：102，SEQID NO：103，SEQ ID NO：104的氨基酸序列或与其基本相同(例如，与任何上述氨基酸序列具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性)的氨基酸序列。
本文描述了本公开的示例性免疫刺激融合分子(或其部分)。应当注意，在某些scFv中，排列是VH-接头-VL。但是，VL-接头-VH排列也可以使用，没有影响。
可以在本公开的IFM中包括的其他序列在下表4中显示。在一些实施方式中，IFM包括恒定的兰巴(lamba)或λ区。示例性恒定兰巴或λ区包括SEQ ID NO：74-78。在各种实施方式中，本文所述的IFM可包含选自SEQ ID NO：1-104的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：1-104中任一个有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的相同性，或相对于SEQ ID NO：1-104中任一个具有至少1，2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)。在实施方式中，IFM相对于SEQ ID NO：1-104中的任意一个包括不超过五个，十个或十五个改变(例如，取代、缺失或插入，例如，保守取代)。
表4.其他序列
Figure BDA0003377443230000731
Figure BDA0003377443230000741
Figure BDA0003377443230000751
蛋白质变体
全长多肽及其变体描述如下。全长IL-15序列(SEQ ID NO：40)取自Genbank登录号CAA62616.1；成熟IL-15没有信号序列，并在SEQ ID NO：10中定义。全长IL-15Rα(SEQ IDNO：41)取自Genbank登录号AAI21141.1。IL-15Rα(IL-15Rα-sushi)的sushi结构域由SEQ IDNO：9给出。最小sushi结构域包括第一和第四半胱氨酸和间插氨基酸(SEQ ID NO：52)在其他地方有描述，并且是合理取代物。类似地，向包含天然Thr或Ile-Thr的最小sushi结构域的任选N-末端添加和/或向包含Ile或Ile-Arg残基的最小sushi结构域的任选C-末端添加也是合理的。
下文描述的蛋白质变体指定了蛋白质亚基名称和与成熟蛋白质相对应的SEQ IDNO。每个蛋白亚基是用N-端信号肽重组表达的，以促进从表达细胞中分泌。天然IL-15Rα信号肽(SEQ ID NO：35)被用于sushi、sushi-L77I-Fc和sushi-Fc。SEQ ID NO：33中的前导序列用于支持抗体轻链，IL15-WT，N末端IL-15融合体，IL15-N72D以及sushi与Fab轻链的N末端融合体的分泌。SEQ ID NO：34中的前导序列用于支持抗体重链的分泌。
对于“重链”和“轻链”命名法，本文使用的是标准的抗体命名系统。例如，在抗体Fab片段中，两条链的分子质量大致相同，但重链被称为Fab片段的链，对应于全长抗体中的重链(例如包含可变重链和CH1结构域)。此外，在细胞因子与Fab片段的轻链融合的情况下，由于细胞因子融合，轻链实际上具有比重链更大的分子量；为了保持一致，然而，维持标准命名约定，其中可变轻链结构域和恒定κ结构域和细胞因子融合体包含“轻链”，而可变重链结构域和CH1结构域包含“重链”。
在一些实施方式中，IFM包含h9.4Fab-scIL-12p70或h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70，如下所定义：
蛋白质名称：h9.4Fab-scIL-12p70
该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab(SEQ ID NO：79)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体。h9.4Fab是抗-人CD45R抗体Fab片段，其包含来自h9.4的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)以及来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
蛋白质名称：h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70
该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab-h9.4scFv(SEQ ID NO：80)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1的h9.4 scFv与h9.4Fab片段重链的融合体。
免疫细胞靶向部分
在某些实施方式中，本文公开的免疫刺激融合分子包括免疫细胞靶向部分。免疫细胞靶向部分可以选自抗体分子(例如本文所述的抗原结合结构域)、受体或受体片段、或配体或配体片段，或其组合。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分与免疫细胞(例如，存在于免疫细胞表面的分子，例如抗原)缔合，例如，与之结合。在某些实施方式中，免疫细胞靶向部分靶向，例如，将本文所公开的免疫刺激融合分子引导到免疫(例如，淋巴细胞，例如，T细胞)。
在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自抗体分子(例如，完整抗体(例如，包括至少一个且优选地两个完整的重链，以及至少一个且优选地两个完整的轻链的抗体)或抗原结合片段(例如Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv，单域抗体，双抗体(dAb)，二价抗体，或双特异性抗体或其片段，其单结构域变体或骆驼科动物抗体))，非抗体支架，或与CD45受体结合的配体。
在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分将IFM靶向在免疫细胞表面上表达的持久的，丰富的和/或再循环的细胞表面受体和分子。这些受体/分子包括，例如CD45(通过例如BC8(ACCT：HB-10507)，9.4(ATTC：HB-10508)，GAP8.3(ATTC：HB-12)，单克隆抗体)，CD8(通过OKT8单克隆抗体)，跨膜整合素分子CD11a(通过MHM24单克隆抗体)或CD18(通过嵌合1B4单克隆抗体)。在其他优选实施方式中，靶向部分被引导至选自下组的标志物：CD4、CD8、CD11a、CD18、CD19、CD20和CD22。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自与CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD25，CD127，CD137，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8或CCR10结合的抗体分子，例如抗原结合结构域，非抗体支架或配体。
在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分包括与免疫细胞表面靶标例如免疫细胞表面受体选择性结合的抗体分子或配体。在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标或受体可以具有以下性质中的一种、两种、三种或更多种：(i)大量存在于免疫细胞的表面上(例如，超过存在于免疫细胞表面上的细胞因子分子的受体的数目)；(ii)例如，相对于由IFM的细胞因子激活的受体，显示缓慢的下调，内化和/或细胞表面更新；(iii)例如，相对于被IFM的细胞因子激活的受体而言，存在于免疫细胞表面上的时间较长；或(iv)一旦内化，则基本上被循环回细胞表面，例如至少25％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的免疫细胞表面靶标被循环回细胞表面。
在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分与回收细胞表面受体结合。不受理论的系连，据信与回收细胞表面受体的结合介导了受体和IFM的内化。例如，与受体一起内化的IFM可能被封存到早期内体中，随后被回收到细胞表面，而不是推进到随后的降解(例如网格蛋白介导的和不依赖于网格蛋白的内吞作用)。IFM/受体返回到细胞表面可以通过将IFM的细胞因子分子恢复到细胞表面来改善细胞因子信号转导，从而增加细胞因子分子结合至自己的细胞表面受体的时间和可及性。此外，通过结合本发明的融合蛋白在表面膜上引发的信号转导事件可以从内体隔室继续进行。
在一些实施方式中，免疫细胞表面靶标或受体存在于免疫细胞的表面上，但是不存在于癌细胞或肿瘤细胞，例如实体瘤或血液癌细胞上。在一些实施方式中，与其在癌细胞或肿瘤细胞上的存在相比，免疫细胞表面靶标或受体主要存在于免疫细胞的表面，例如相对于癌细胞或肿瘤细胞，以至少5∶1、10∶1、15∶1、20∶1更高的比率存在。
在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分与细胞(例如免疫细胞)上，例如细胞的表面膜上表达的受体结合，并且细胞还表达细胞因子受体(例如，IFM的细胞因子分子的受体)。
在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分可以选自与免疫细胞表面靶标结合的抗体分子或配体分子，所述靶标例如选自CD16，CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD25，CD127，CD56，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD137，OX40，GITR，CD56，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8或CCR10。在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分结合至CD4、CD8、CD11a、CD18、CD20、CD56或CD45。在其他实施方式中，免疫细胞表面靶标选自CD19、CD20或CD22。在一个实施方式中，免疫细胞靶向部分包含与CD45结合的抗体分子或配体分子(在本文中也可互换地称为“CD45受体”或“CD45R”)。在一些实施方式中，靶标是CD45(例如，选自CD45RA，CD45RB，CD45RC或CD45RO的CD45同种型)。在实施方式中，CD45主要在T细胞上表达。例如，CD45RA主要在原初T细胞上表达；CD45RO主要在活化的和记忆T细胞上表达。
在其他实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分包含抗体分子(例如，抗原结合结构域)，受体分子(例如，受体，受体片段或其功能变体)或配体分子(例如，配体，其配体片段或功能变体)或它们的组合，它们与免疫细胞靶标或受体结合。
在一些实施方式中，IFM的免疫细胞靶向部分的抗体分子包含完整抗体(例如，包含至少一条，优选两条完整的重链，以及至少一条，优选两条完整的轻链的抗体)或抗原结合片段(例如Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv，单域抗体，双抗体(dAb)，二价抗体或双特异性抗体或其片段，其单结构域变体或骆驼科动物抗体))，其与免疫细胞靶标或受体结合。
抗体分子的重链恒定区可以选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其片段，更通常为IgGl，IgG2或IgG4。在一些实施方式中，重链的Fc区可包括一种或多种改变，例如取代，以增加或减少以下一种或多种：Fc受体结合，新生儿-Fc受体结合，抗体糖基化，半胱氨酸残基的数目，效应细胞功能，补体功能或稳定抗体形成(例如，稳定IgG4)。例如，IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区可在228位包含取代(例如Ser向Pro取代)(参见，例如Angal，S，King，DJ等，(1993)Mol Immunol 30：105-108(最初使用不同的编号系统描述为S241P)；Owens，R，Ball，E等，(1997)Immunotechnology 3：107-116)。
IFM免疫细胞靶向部分的抗体分子可以小于约100nM，50nM，25nM，10nM(例如，小于1nM(例如，约10-100pM))的解离常数与靶抗原结合。在实施方式中，抗体分子结合至抗原上的构象或线性表位。在某些实施方式中，被免疫细胞靶向部分的抗体分子结合的抗原是在免疫细胞表面稳定表达的。在实施方式中，抗原是细胞表面受体，相对于细胞表面上的IFM的细胞因子分子受体而言，它在细胞表面的含量更高。
在一些实施方式中，免疫细胞靶向部分选自抗体分子(例如，完整抗体(例如，包括至少一个且优选地两个完整的重链，以及至少一个且优选地两个完整的轻链的抗体)或抗原结合片段(例如Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv，单域抗体，双抗体(dAb)，二价抗体，或双特异性抗体或多特异性抗体或其片段，其单结构域变体或骆驼科动物抗体))。
在一些实施方式中，抗体分子(例如，单或双特异性抗体)结合CD45，CD8，CD18或CD11a中的一个或多个，例如，它是IgG，例如人IgG4，或抗原结合结构域，例如，与CD45，CD8，CD18或CD11a结合的Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv。在一些实施方式中，抗体分子是人、人源化或嵌合抗体。在实施方式中，抗体分子是重组抗体。
在一些实施方式中，抗CD45抗体是人抗CD45抗体，人源化抗CD45抗体或嵌合抗CD45抗体。在一些实施方式中，抗-CD45抗体是抗-CD45单克隆抗体。示例性的抗CD45抗体包括抗体BC8、4B2，GAP8.3或9.4。还公开了针对其他免疫细胞表面靶点的抗体，例如，抗-CD8抗体，如OKT8单克隆抗体，抗CD-18抗体，如1B4单克隆抗体，和抗-CD11a抗体，如MHM24抗体。
本公开还包括具有本文公开的氨基酸序列或与其基本相同的氨基酸序列的抗体分子，编码相同氨基酸序列的核酸分子，包含该核酸分子的宿主细胞和载体。
在一个实施方式中，与CD45结合的抗体分子对一种CD45同种型是特异性的或与超过一种CD45同种型结合的抗体分子是，例如，泛CD45抗体。在一些实施方式中，抗-CD45抗体分子结合至CD45RA和CD45RO。在一个实施方式中，抗-CD45抗体分子是BC8抗体。在一些实施方式中，BC8抗体结合至CD45RA和CD45RO。在其他实施方式中，抗-CD45抗体分子是CD45RO-特异性的或是泛-CD45抗体分子，例如，它结合至活化和记忆T细胞。抗CD45抗体分子的其他实例包括但不限于GAP8.3、4B2和9.4。
在一个实施方式中，抗CD45抗体分子是BC8抗体，例如嵌合或人源化的BC8抗体。在一些实施方式中，嵌合BC8抗体包含：
(i)对应于SEQ ID NO：1、2、3、4、7、21或22所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQID NO：1、2、3、4、7、21或22的抗体部分有至少85％、90％、95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
(ii)分别为SEQ ID NO：5、6或8所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括具有S228P取代的人IgG1重链序列或人IgG4序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，分别与SEQ ID NO：5、6或8至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。
在其他实施方式中，SEQ ID NO：1-4的氨基酸或与其基本相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：1-4有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)(任选地，进一步包括κ轻链序列)，包括，任选地经由接头，IL-15细胞因子或受体，例如本文所述的sushi结构域(例如，SEQ ID NO：9或与其基本上相同的氨基酸(例如，与SEQ ID NO：9有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。
在其他实施方式中，结合CD45的抗体分子是9.4抗体，例如嵌合或人源化9.4抗体。在一些实施方式中，嵌合9.4抗体包含：
(i)对应于SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：15的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
(ii)SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：14有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，9.4抗体包含9.4抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个、两个或全部三个CDR1、CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：14或15的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在其他实施方式中，结合CD45的抗体分子是4B2抗体，例如嵌合或人源化4B2抗体。在一些实施方式中，嵌合4B2抗体包含：
(i)对应于SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的抗体部分的轻链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括κ轻链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，与SEQ ID NO：17的抗体部分有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)；和/或
(ii)SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的重链可变氨基酸序列(任选地，进一步包括人IgG1重链序列)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如与SEQ ID NO：16有至少85％，90％，95％或更高相同性的氨基酸序列)。在实施方式中，例如根据Kabat定义，4B2抗体包含4B2抗体的轻链可变区和/或重链可变区的一个、两个或全部三个CDR1、CDR2或CDR3，或紧密相关的CDR，例如，具有SEQ ID NO：16或17的CDR序列中至少一个氨基酸改变，但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
抗体分子
本文所述的免疫刺激融合分子可包含一个或多个抗体分子。例如，免疫细胞衔接子(engager)可包含抗体分子。在一个实施方式中，抗体分子结合癌症抗原，例如肿瘤抗原或基质抗原。在一些实施方式中，癌症抗原是，例如哺乳动物，例如人癌症抗原。在其他实施方式中，抗体分子与免疫细胞抗原结合，例如，哺乳动物，例如，人类，免疫细胞抗原。例如，抗体分子特异性结合至癌症抗原或免疫细胞抗原上的表位，例如线性或构象表位。
在一个实施方式中，抗体分子是单特异性抗体分子，并结合单个表位。例如，具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，其中每个都结合相同的表位。
在另一个实施方式中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方式中，第一和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方式中，第一和第二表位重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方式中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
在一个实施方式中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子其特征为具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方式中，第一和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方式中，第一和第二表位重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方式中，第一和第二表位在不同的抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的一半抗体和对第二表位具有结合特异性的一半抗体。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的一半抗体(或其片段)和对第二表位具有结合特异性的一半抗体(或其片段)。在一个实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或Fab(或其片段)和对第二表位具有结合特异性的scFv或Fab(或其片段)。
在一个实施方式中，抗体分子包含双抗体，和单链分子，以及抗体的抗原结合片段(例如，Fab，F(ab’)2和Fv)。例如，抗体分子可包含重(H)链可变区序列(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区序列(本文中缩写为VL)。在一个实施方式中，抗体分子包含或由重链和轻链(本文中称为半抗体)组成。在另一个实例中，抗体分子包两条重(H)链可变结构域序列和两条轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(二价且单或双特异性)、三抗体(三价且单或多特异性)以及嵌合或人源化抗体，且可通过修饰完整抗体或采用重组DNA技术从头合成的那些产生。这些功能性抗体片段保留了选择性结合其相应抗原或受体的能力。抗体和抗体片段可来自任何抗体类型(包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，并来自任何抗体亚型(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子的制剂可以是单克隆或多克隆的。抗体分子还可为人、人源化、CDR移植或体外产生的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如，κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白(Ig)”与本文中的术语“抗体”可互换使用。
抗体分子的抗原结合片段的示例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)双抗体(diabody，dAb)片段，其由VH结构域组成；(vi)骆驼或骆驼源化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等，(1988)Science 242：423-426；以及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；(viii)单域抗体。这些抗体片段可使用本领域普通技术人员所知的常规技术获得，并且筛选与完整抗体具有相同应用的片段。
抗体分子包括完整分子及其功能性片段。可改变(例如突变)抗体分子的恒定区以修饰该抗体的性能，例如增加/提高或减少/降低如下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。
抗体分子也可以是单域抗体。单域抗体可包括其互补决定区为单域多肽一部分的抗体。实例包括但不限于：重链抗体、天然缺失轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单域抗体、工程改造的抗体和非衍生自抗体的单结构域骨架。单域抗体可为本领域中任何单域抗体或任何未来的单域抗体。单域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于：小鼠、人、骆驼、大羊驼、鱼、鲨鱼、羊、兔和牛。根据本公开的另一方面，单域抗体是已知为缺失轻链的重链抗体的天然存在单域抗体。此类单域抗体公开于例如WO 9404678。清楚起见，衍生自天然缺失轻链的重链抗体的该可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体以区别于四链免疫球蛋白的常规VH。该VHH分子可衍生自骆驼科(Camelidae)物种中生长的抗体，例如衍生自骆驼、大羊驼、单峰驼、羊驼和驮马。除了骆驼科，其他物种也可产生天然缺失轻链的重链抗体；这些VHH也在范围内。
VH和VL区可进一步细分为超变区，称为“互补决定区(CDR)”，其间间插更保守的被称为“框架区”(FR或FW)的区。
已采用多种方法精确来划定框架区和CDR的范围(参见Kabat，E.A.，等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(《热门免疫学蛋白质序列》，第5版，美国公共卫生署，国立卫生研究院，公开号91-3242；Chothia，C.等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；以及牛津分子的AbM抗体造模软件(Oxford Molecular’s AbMantibody modeling software)所用的AbM定义。总体上参见例如“Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains”(《抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析》)。于：《抗体工程实验室手册》(Antibody Engineering Lab Manual)(Duebel，S.和Kontermann，R.编，Springer-Verlag，Heidelberg)。
本文所用术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和性的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中有三个CDR(HCDR1，HCDR2，HCDR3)，每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1，LCDR2，LCDR3)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多已知方案中的任何一种编号来确定，包括Kabat等，(1991)，“热门免疫学蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)”，第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局，马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)，A1-Lazikani等，(1997)JMB273，927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也被称为“高变环”。
例如，在Kabat的情况下，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)，50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)，50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia的情况下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)，52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)，50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。
各VH和VL通常包含三个CDR和四个FR，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体分子可为多克隆或单克隆抗体。
本文所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物针对具体表位显示单一的结合特异性和亲和性。单克隆抗体的制备可采用杂交瘤技术或不采用杂交瘤技术的方法(例如重组法)。
可重组产生抗体，例如通过任何噬菌体展示或组合方法(combinatorial method)来产生。
在一个实施方式中，抗体是完整人抗体(例如由小鼠产生的抗体，该小鼠在已通过遗传工程改造以产生源自人免疫球蛋白序列的抗体)、或非人抗体，例如啮齿类(小鼠或大鼠)、羊、灵长类(例如猴)、骆驼抗体。优选地，非人抗体是啮齿类抗体(小鼠或大鼠抗体)。制备啮齿类抗体的方法是本领域已知的。
人单克隆抗体可采用携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠而不是小鼠体系产生。来自用感兴趣抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞被用于产生分泌人mAb的杂交瘤，这些人mAb对来自人蛋白质的表位具有特异性亲和性(参见例如，Wood等，国际申请号WO 91/00906，Kucherlapati等，PCT公开号WO 91/10741；Lonberg等，国际申请号WO 92/03918；Kay等，国际申请号92/03917；Lonberg等，1994 Nature 368：856-859；Green，L.L.等，1994Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等，1993 Year Immunol 7：33-40；Tuaillon等，1993 PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等，1991 Eur J Immunol 21：1323-1326)。
抗体分子可为其中的可变区或其部分(例如CDR)在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生的抗体。嵌合、CDR移植以及人源化抗体均包含在本公开内容中。本公开内容包括在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生并随后(例如在可变框架或恒定区中)进行修饰以降低在人体内抗原性的抗体分子。例如，抗-人CD45抗体例如9.4、4B2和BC8可使用本领域已知的技术被人源化，用于制作本文所公开的系连融合体。
可采用本领域已知的方法将抗体分子人源化，本领域中已知许多此类方法(参见例如，Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4：214，以及Queen等，US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，其全部内容作为参考纳入本文)。
可采用CDR移植或CDR取代来产生人源化或CDR移植抗体，其中可替换免疫球蛋白链中的一个、两个或全部CDR。参见例如美国专利号5,225,539；Jones等，1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等，1988 Science 239：1534；Beidler等，1988 J.Immunol.141：4053-4060；Winter US 5,225,539，其全部内容作为参考纳入本文。Winter描述了可用于制备本公开的人源化抗体的CDR移植方法(英国专利申请GB 2188638A，提交于1987年3月26日；Winter US 5,225,539)，其全部内容作为参考纳入本文。
人源化抗体分子也在本公开的范围内，其中特定氨基酸已被取代，缺失或添加。从供体中选择氨基酸的标准描述于例如US 5,585,089，例如US 5,585,089的第12-16栏，其内容通过参考纳入本文。使抗体人源化的其他技术描述于Padlan等EP519596 A1(公开于1992年12月23日)。
抗体分子可为单链抗体。可对单链抗体(scFV)进行工程改造(参见例如Colcher，D.等，(1999)Ann N Y Acad Sci 880：263-80；以及Reiter，Y.(1996)Clin Cancer Res 2：245-52)。单链抗体可二聚化或多聚化以产生对相同靶蛋白上不同表位具有特异性的多价抗体。
在其他实施方式中，抗体分子所具有的重链恒定区选自例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；具体而言，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人的)重链恒定区。在另一个实施方式中，抗体分子所具有的轻链恒定区选自例如κ或λ(例如人的)轻链恒定区。可改变(例如突变)恒定区以修饰该抗体的性能(例如以增加或减少如下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能和/或补体功能)。在一个实施方式中，抗体具有：效应功能；且能够固定补体。在其他个实施方式中，抗体不募集效应细胞或固定补体。在另一个实施方式中，抗体结合Fc受体的能力降低或不具备该能力。例如，抗体是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如其具有经诱变的Fc受体结合区或缺失的Fc受体结合区。
改变抗体恒定区的方法是本领域中已知的。具有改变的功能(例如对效应体配体(如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和性改变)的抗体可通过将该抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基替换为不同的残基来产生(参见例如EP388，151A1、美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其全部内容通过引用纳入本文)。可描述相似类型的改变，其若应用于鼠或其他物种免疫球蛋白将减弱或消除这些功能。
抗体分子可以被衍生化或连接至另一个功能分子(例如，本文所述的细胞因子分子或其他化学或蛋白质基团)。如本文所用，“衍生化”抗体分子是已被修饰的抗体分子。衍生化的方法包括但不限于：添加荧光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或亲和配体(如生物素)。因此，本公开的抗体分子旨在包括本文所述抗体的衍生化和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可与一个或多个其他分子实体功能性联接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价关联或其他)，所述其他分子实体为例如细胞因子分子、另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、细胞毒性剂、药剂和/或能介导该抗体或抗体部分与其他分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽。
一种类型的衍生抗体分子是通过使抗体分子与一种或多种蛋白质(例如细胞因子分子)，另一种抗体分子(相同或不同类型，例如产生双特异性抗体)交联而产生的。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。此类交联剂可获自皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company)(伊利诺斯州罗克福德)。
给药方案
治疗有效剂量是在被治疗的人或非人哺乳动物中能够以具有统计学显著性的方式产生临床所需结果(即足以诱导或增强特异性T细胞针对过表达抗原的细胞的免疫应答(即细胞毒性T细胞反应)的量)的装载免疫激动剂的T细胞(例如装载IL-12系连融合体T细胞或装载IL-15纳米凝胶T细胞)的量。在医学领域众所周知，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体重、体表面积、年龄、要给予的特定治疗、性别、给药时间和途径、一般健康状况以及同时给予的其他药物。剂量会变化，但是根据本发明的一些实施方式，本文所述的装载免疫激动剂的T细胞的给药剂量为：约20M个细胞/m2、40M个细胞/m2、100M个细胞/m2、120M个细胞/m2、200M个细胞/m2、360M个细胞/m2、600M个细胞/m2、1B个细胞/m2、1.5B个细胞/m2、106个细胞/m2、约5x106个细胞/m2、约107个细胞/m2、约5x107个细胞/m2、约108个细胞/m2、约5x108个细胞/m2、约109个细胞/m2、约5x109个细胞/m2、约1010个细胞/m2、约5x1010个细胞/m2或约1011个细胞/m2。
在一些实施方式中，装载IL-12系连融合体的T细胞和装载IL-15纳米凝胶的T细胞按以下的一种药和另一种药的比率给予：约1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70；1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95、1∶100、1∶120、1∶130、1∶140、1∶150、1∶160、1∶170、1∶180、1；190、1∶200、1∶500、1∶1000.1∶5000、1∶10,000、1∶100,000、2∶3、3∶4、2∶5、3∶5、3∶10、7∶10、9∶10、2∶15、4∶15、6∶15、7∶15、8∶15、11∶15、13∶15、14∶15、3∶20、7∶20、9∶20、11∶20、13∶20、17∶20、19∶20、1∶25、2∶25、4∶25、6∶25、7∶25、8∶25、10∶25、11∶25、12∶25、13∶25、14∶25、16∶25、17∶25、18∶25、19∶25、21∶25、22∶25、23∶25或24∶25。
本发明的协同组合疗法可以一次性给予，也可以两次或更多次重复给予。这种组合疗法可以以每天、每周、每两周或每月的方式给予。此外或作为替代，这种组合治疗可以约每小时、2小时、5小时、8小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时、24小时、2天、3天、5天、10天、30天、60天、90天、3周、4周、6周、8周、10周、12周、15周、18周、24周、36周或52周给予。
核酸/载体/细胞
本公开的特征还在于包含编码本文所述的免疫刺激融合分子的核苷酸序列的核酸。本文进一步提供了包含编码本文所述的IFM和抗体分子的核苷酸序列的载体。在一个实施方式中，载体包含编码本文所述的IFM和抗体分子的核苷酸。在一个实施方式中，载体包含本文所述的核苷酸序列。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。可采用许多种载体系统。例如，一类载体利用DNA元件，这些元件衍生自动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(劳斯氏肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一类载体利用衍生自RNA病毒的RNA元件，所述RNA病毒为例如塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒和黄病毒。
此外，通过引入能够选择已转染宿主细胞的一种或多种标志物，可选择已将DNA稳定整合入其染色体中的细胞。该标志物可向营养缺陷型宿主提供例如营养缺陷型、杀生物剂(如抗生素)抗性或对重金属如铜等的抗性。选择性标志物基因可直接连接于待表达的DNA序列，或者通过共同转化引入同一细胞内。mRNA的优化合成也可能需要其它元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
一旦制得用于表达的含构建体的表达载体或DNA序列，可将表达载体转染或导入合适的宿主细胞。可用各种技术实现之，例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情形下，可在培养基中使细胞生长，并筛选适当的活性。培养所得转染细胞以及回收所产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的，且可基于本文的描述，根据所用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞进行改变或优化。
在另一方面中，本申请的特征包括包含本文所述核酸的宿主细胞和载体。核酸可存在于同一宿主细胞或非同一宿主细胞中的单个载体中或分开的多个载体中。宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞，或原核细胞，例如大肠杆菌。例如，哺乳动物细胞可以是培养细胞或细胞系。示例性的哺乳动物细胞包括淋巴细胞系(如NSO)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞、卵母细胞，和来自转基因动物的细胞，如乳腺上皮细胞。
本公开还提供了宿主细胞，其包含编码如本文所述的抗体分子的核酸。在一个实施方式中，宿主细胞经遗传工程改造以包含编码抗体分子的核酸。在一个实施方式中，采用表达盒对宿主细胞进行遗传工程改造。术语“表达盒”是指能够影响与此类序列相容的宿主中基因表达的核苷酸序列。此类表达盒可包括启动子、含或不含内含子的开放阅读框、以及终止信号。还可以采用实现表达所必需或有帮助的其他因子，例如诱导型启动子。本公开还提供了包含本文所述载体的宿主细胞。细胞可为但不限于：真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于：Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于：Sf9细胞。
组合物
本文提供了包含免疫刺激融合分子和/或蛋白纳米凝胶的组合物，包括药物组合物。组合物可以以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物配制。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分(例如，纳米颗粒的生物活性蛋白)的生物活性的有效性的无毒材料。在一些实施方式中，此类组合物可包含盐，缓冲剂，防腐剂和任选地其他治疗剂。在一些实施方式中，药物组合物还可包含合适的防腐剂。在一些实施方式中，药物组合物可以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。在一些实施方式中，适合于肠胃外给药的药物组合物包含纳米颗粒的无菌水性或非水性制剂，在一些实施方式中，其与受体对象的血液等渗。该制剂可以根据已知方法配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。
另外的组合物包括修饰的细胞，例如修饰的免疫细胞，其在其细胞表面上进一步包含一种或多种系连融合蛋白。这可用于细胞疗法的离体制备，所述细胞疗法例如过继细胞疗法、CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞疗法、抗原训练的T细胞疗法、富集的抗原特异性T细胞疗法或NK细胞疗法。
在一些实施方式中，本公开内容的IFM和/或纳米凝胶可以以例如纳米颗粒或水凝胶或生物凝胶的形式直接给予给需要其的患者，作为用于经由受体介导的对特定细胞独特的受体(例如CD4或CD8)结合来特异性递送治疗性蛋白质的试剂。这种直接给药可以是全身性的(例如，肠胃外的，例如静脉内注射或输注)或局部的(例如，瘤内的，例如注射到肿瘤微环境中)。本文所用的术语“肠胃外给药”和“胃肠外给予”是指除肠内(即，通过消化道)和局部给药以外的给药方式，通常通过注射或输注给药，包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，包膜下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一些实施方式中，本发明的IFM和/或纳米凝胶可以用作离体药剂，以在通过全身或局部给药给予患者或重新引入患者之前诱导分离的自体和同种异体细胞的活化和扩增。例如，扩增后的细胞可用于包括ACT(过继性细胞转移)在内的T细胞疗法，也可与其他重要的免疫细胞类型联用，包括B细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，NK细胞，抗原特异性CD8 T细胞，经遗传工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或CAR-T细胞，经遗传工程改造以表达对肿瘤抗原具有特异性的T细胞受体的T细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，和/或经过抗原训练的T细胞(例如，已经被展示感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原(TAA))的抗原呈递细胞(APC)“训练”的T细胞)。
治疗用途和方法
本文公开的方法和组合物具有多种治疗用途，包括例如癌症和传染病的治疗。本公开内容尤其提供了在患有癌症的对象中诱导免疫应答以治疗患有癌症的对象的方法。示例性方法包括向对象给予治疗有效量的本文所述的任何免疫刺激融合分子，其中IFM被选择和设计为增加细胞因子的细胞表面可及性并因此增强其信号转导。
本文所述的方法包括通过使用IFM，例如IFM和/或包含本文所述的IFM的纳米颗粒，例如，使用本文所述的药物组合物，来治疗对象的癌症。还提供了用于减少或改善对象的癌症症状的方法，以及用于抑制癌症的生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在实施方式中，本文描述的方法在给予了本文描述的或本文描述的药物组合物的对象中减小了肿瘤的大小和/或减少了癌细胞的数量。
在实施方式中，癌症是血液癌症。在实施方式中，血液癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“血液癌症”是指造血或淋巴组织的肿瘤，例如，影响血液，骨髓或淋巴结的肿瘤。示例性的血液癌症包括，但不限于：白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，毛细胞白血病，急性单核细胞白血病(AMoL)，慢性髓单核细胞白血病(CMML)，青少年髓单核细胞白血病(JMML)或大颗粒性淋巴细胞性白血病)，淋巴瘤(例如与AIDS相关的淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主导的霍奇金淋巴瘤)，真菌病(mycosis fungoides)，非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(真菌病，间变性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞淋巴瘤))，原发性中枢神经系统淋巴瘤，Sézary综合征，巨球蛋白血症)，慢性骨髓增殖性疾病，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，或骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤。
在实施方式中，癌症是实体癌。示例性的实体瘤癌包括，但不限于：卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域癌，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，卡波济肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，子宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊髓轴肿瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，所述癌症的转移性病变或其组合。
在实施方式中，以适合于待治疗或预防的疾病的方式给予免疫刺激融合分子和/或蛋白纳米凝胶(或其药物组合物)。通过诸如患者状态这样的因素以及患者疾病的类型和严重程度确定给药的数量和频率。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医师可以考虑对象的肿瘤大小，感染或转移程度，年龄，体重和状况的个体差异来确定要给予的药物组合物(或免疫刺激融合分子)的精确量。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以104至109个细胞/kg体重，例如105至106个细胞/kg体重的剂量给予，包括那些范围内的所有整数值。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以这些剂量多次给予。在实施方式中，本文描述的药物组合物可以使用免疫疗法中描述的输注技术给予(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.Med.319：1676，1988)。
在实施方式中，将免疫刺激融合分子和/或蛋白纳米凝胶，或其药物组合物肠胃外给予对象。在实施方式中，将细胞静脉内，皮下，肿瘤内，结节内，肌内，皮内或腹膜内给予给对象。在实施方式中，将细胞直接给予(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在实施方式中，以输注(例如，如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988中所述)或静脉内推注方式给予细胞。在实施方式中，细胞以可注射的储库制剂形式给予。
在实施方式中，对象是哺乳动物。在实施方式中，对象是人，猴，猪，狗，猫，牛，绵羊，山羊，兔，大鼠或小鼠。在实施方式中，对象是人。在实施方式中，所述对象是儿科对象，例如小于18岁，例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或以下。在实施方式中，对象是成年人，例如，至少18岁，例如，至少19、20、21、22、23、24、25、25-30、30-35、35-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90岁。
其他组合
本文公开的系连融合体和纳米凝胶的组合可与一种或多种治疗剂或治疗操作进一步组合使用。
在一些实施方式中，系连融合体和纳米凝胶的组合与放射疗法组合给予。
在一些实施方式中，系连融合体和纳米凝胶的组合与细胞疗法组合给予，例如选自过继细胞疗法，CAR-T细胞疗法，工程改造的TCR T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原-训练的T细胞疗法，或富集的抗原特异性T细胞疗法的细胞疗法。
在实施方式中，在已经诊断出对象患有癌症之后，例如在从对象中消除癌症之前，给予/进行系连融合体和纳米凝胶的组合以及其他治疗剂或操作。在一些实施方式中，系连融合体和纳米凝胶的组合以及其他治疗剂或操作是同时或并行给予/进行的。例如，当第二个治疗的递送开始时，一个治疗的递送仍在持续，例如，治疗的给予存在重叠。在其他实施方式中，系连融合体和纳米凝胶的组合以及其他治疗剂或操作是依次给予/进行的。例如，一个治疗的递送在另一个治疗的递送开始前结束。
在实施方式中，其他组合疗法可以比单独使用系连融合体和纳米凝胶的组合或用任一药剂的单一疗法导致更有效的治疗。在实施方式中，其他组合的比单独的系连融合体和纳米凝胶的组合或其他组合更有效(例如，导致症状和/或癌细胞减少更多)。在实施方式中，其他组合治疗允许使用比作为单治疗给予时所需要的实现相似作用的系连融合体、纳米凝胶和/或其他药剂的剂量更低的剂量。在实施方式中，其他组合疗法具有部分累加作用，完全累加作用或大于累加作用。
在一个实施方式中，将系连融合体和纳米凝胶的组合与疗法例如癌症疗法(例如抗癌药、免疫疗法、光动力疗法(PDT)、手术和/或放射中的一种或多种)进一步组合给予。术语“化疗剂”，“化学治疗剂”和“抗癌剂”在本文中可互换使用。给予系连融合体和纳米凝胶的组合和治疗，所述治疗例如癌症治疗，可以是依次的(有或没有重叠)或同时的。给予系连融合体和纳米凝胶的组合和其他药物，在治疗(如癌症治疗)过程中可以是连续的或断续的。本文所述的某些疗法可用于治疗癌症和非癌疾病。例如，使用本文所述的方法和组合物(例如在Agostinis，P.等，(2011)CA Cancer J.Clin.61：250-281中综述)，可以在癌性和非癌性疾病(例如，结核病)中增强PDT功效。
抗癌治疗
在其他实施方式中，系连融合体和纳米凝胶的组合与低或小分子量化学治疗剂组合给予。示例性的低分子量或小分子量化学治疗剂包括但不限于13-顺-视黄酸(异维甲酸，
Figure BDA0003377443230000961
)，2-CdA(2-氯脱氧腺苷，克拉屈滨，LEUSTATINTM)，5-氮杂胞苷(氮杂胞苷，
Figure BDA0003377443230000962
)，5-氟尿嘧啶(5-FU，氟尿嘧啶，
Figure BDA0003377443230000963
)，6-巯基嘌呤(6-MP，巯基嘌呤，
Figure BDA0003377443230000964
)，6-TG(6-硫鸟嘌呤，硫鸟嘌呤，
Figure BDA0003377443230000965
)，Abraxane(紫杉醇蛋白质-结合)，放线菌素D(放线菌素，
Figure BDA0003377443230000966
)，铝维甲酸(alitretinoin)
Figure BDA0003377443230000967
全反式视黄酸(ATRA，维甲酸，
Figure BDA0003377443230000968
)，六甲蜜胺(六甲基三聚氰胺，HMM，
Figure BDA0003377443230000969
)，氨甲蝶呤(甲氨蝶呤，甲氨蝶呤钠，MTX，TREXALLTM，
Figure BDA00033774432300009610
)，氨磷汀
Figure BDA00033774432300009611
阿拉伯糖胞嘧啶(Ara-C，阿糖胞苷，
Figure BDA00033774432300009612
)，三氧化二砷
Figure BDA00033774432300009613
天冬酰胺酶(欧文氏菌L-天冬酰胺酶，L-天冬酰胺酶，
Figure BDA00033774432300009614
)，BCNU(卡莫司汀，
Figure BDA00033774432300009615
)，苯达莫司汀
Figure BDA00033774432300009616
贝沙罗汀
Figure BDA00033774432300009617
博来霉素
Figure BDA00033774432300009618
白消安
Figure BDA00033774432300009619
亚叶酸钙(嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)，亚叶酸(folinic acid)，四氢叶酸(folinic acid))，喜树碱11(CPT-11，伊立替康，
Figure BDA00033774432300009620
)，卡培他滨
Figure BDA00033774432300009621
卡铂
Figure BDA00033774432300009622
卡莫司汀片(prolifeprospan 20与卡莫司汀植入物，
Figure BDA0003377443230000971
晶圆)，CCI-779(西罗莫司脂化物(temsirolimus)，
Figure BDA0003377443230000972
)，CCNU(洛莫司汀(lomustine)，CeeNU)，CDDP(顺铂，
Figure BDA0003377443230000973
)，苯丁酸氮芥(瘤可宁(leukeran))，环磷酰胺
Figure BDA0003377443230000974
达卡巴嗪(DIC，DTIC，咪唑甲酰胺，
Figure BDA0003377443230000975
)，道诺霉素(柔红霉素，柔红霉素盐酸盐，盐酸鲁比霉素，
Figure BDA0003377443230000976
)，地西他滨
Figure BDA0003377443230000977
右雷佐生
Figure BDA0003377443230000978
DHAD(米托蒽醌，
Figure BDA0003377443230000979
)，多西他赛
Figure BDA00033774432300009710
阿霉素
Figure BDA00033774432300009711
表柔比星(ELLENCETM)，雌莫司汀
Figure BDA00033774432300009712
依托泊苷(VP-16，依托泊苷磷酸盐，
Figure BDA00033774432300009713
)，氟尿嘧啶
Figure BDA00033774432300009714
氟达拉滨
Figure BDA00033774432300009715
氟尿嘧啶(乳膏)(CARACTM，
Figure BDA00033774432300009716
Figure BDA00033774432300009717
)，吉西他滨
Figure BDA00033774432300009718
羟基尿EA(
Figure BDA00033774432300009719
DROXIATM，MYLOCELTM)，伊达比星
Figure BDA00033774432300009720
异环磷酰胺
Figure BDA00033774432300009721
依沙贝比隆(IXEMPRATM)，LCR(白屈菜碱，长春新碱，VCR，
Figure BDA00033774432300009722
Figure BDA00033774432300009723
)，L-PAM(L-肌溶素，美法仑，苯丙氨酸芥末，
Figure BDA00033774432300009724
)，甲氯乙胺(盐酸甲氯乙胺，芥子碱，氮芥末，
Figure BDA00033774432300009725
)，美司钠(MESNEXTM)，丝裂霉素(丝裂霉素-C，MTC，
Figure BDA00033774432300009726
)，奈拉拉滨(nelarabine)
Figure BDA00033774432300009727
奥沙利铂(ELOXATINTM)，紫杉醇(
Figure BDA00033774432300009728
ONXALTM)，培门冬酶(PEG-L-天冬酰胺酶，
Figure BDA00033774432300009729
)，PEMETREXED
Figure BDA00033774432300009730
喷司他丁
Figure BDA00033774432300009731
甲苄肼(procarbazine)
Figure BDA00033774432300009732
链脲佐菌素
Figure BDA00033774432300009733
替莫唑胺
Figure BDA00033774432300009734
替尼泊苷(VM-26，
Figure BDA00033774432300009735
)，TESPA(硫代磷酰胺，塞替派，TSPA，
Figure BDA00033774432300009736
)，托泊替康
Figure BDA00033774432300009737
长春碱(硫酸长春碱，长春新碱，VLB，
Figure BDA00033774432300009738
)，长春瑞滨(酒石酸长春瑞滨，
Figure BDA00033774432300009739
)和伏立诺他
Figure BDA00033774432300009740
在另一个实施方式中，系连融合体和纳米凝胶的组合与生物制剂偶联给予。示例性的生物制剂包括例如
Figure BDA00033774432300009741
(曲妥珠单抗)；
Figure BDA00033774432300009742
(氟维司群)；
Figure BDA00033774432300009743
(阿那曲唑)；
Figure BDA00033774432300009744
(依西美坦)；
Figure BDA00033774432300009745
(来曲唑)；
Figure BDA00033774432300009746
(他莫昔芬)，
Figure BDA00033774432300009747
(贝伐单抗)；和
Figure BDA0003377443230000981
(替伊莫单抗)。
实施例
实施例1：用于ACT的T细胞的制备
T细胞被从健康供体中分离。用DPBS以1∶1的体积稀释一天龄的外周血白细胞单采术(leukopack)细胞(Biospecialties Inc.)并在50ml试管中(15ml Lymphoprep顶部35ml稀释的单采白细胞(1eukopack))在密度垫上分层(Lymphoprep，干细胞技术公司(StemcellTech.))。在800g离心30分钟，在lymphoprep和DPBS之间的界面处收获单核细胞。细胞在50ml的DPBS中洗涤3次以除去残余的lymphoprep和细胞碎片。根据制造商的说明，分别使用抗-CD3(或抗-CD8)和抗-CD56偶联珠(美天旎(Miltenyi))通过顺序磁珠分选分离T细胞。简言之，用3ml冰冷的DPBS平衡LS柱，同时将抗体-偶联珠与单核细胞孵育(在+4℃孵育30分钟)。将细胞装载到柱中后，用3ml冰冷的DPBS洗涤3次，并用5ml冰冷的DPBS将细胞从柱冲出。
分离后，T细胞在完全培养基(CM-T)中：IMDM(隆萨(Lonza))、Glutamaxx(生命技术公司(Life Tech))、20％FBS(生命技术公司)、2.5ug/ml人白蛋白(Octapharma)、0.5ug/ml肌醇(西格玛(Sigma))，补充有20ng/ml的白细胞介素-2(IL-2)，静息至少2小时。
在一些实施方式中，T细胞被引发以改善或优化T细胞活化。如图14B所示，用IL-21预处理显示ACT效力的最大改善，其次是IL-2/IL-7和IL-7。
体外APC制备
抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞(DC)，可以在体外制备，使用本文所述以及公开于PCT公开号WO2020/055931的那些的方法，其通过引用全文纳入本文。首先，moDC可以在体外从外周血单核细胞(PBMC)产生。PBMC在组织培养瓶中铺板允许单核细胞粘附。用白细胞介素4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理这些单核细胞导致分化为iDC。随后用肿瘤坏死因子(TNF)、IL6、IL1B和PGE2处理，使iDC进一步分化为mDC。
单核细胞、iDC和成为成熟DC之前的细胞可以与预选的抗原接触，以在其表面呈递。该过程可以在体外完成，在一些实施方式中，使用本文所述的预装载过程。如本文所用，预装载是指在单核细胞和/或未成熟的DC装载到主要组织相容性复合物(MHC)I和MHC II上之前，诱导其将肽内化并蛋白水解为较短的片段的过程。不希望受理论束缚，据信使用预装载过程装载的大多数肽的长度为8聚-11聚(相比于标准初始肽15聚)。相比之下，常规方法指的是将TAA肽装载到先前成熟的DC上，是一种细胞外方法，用肽短暂地(通常为1-3小时)脉冲DC，目的是将肽以其原始长度直接装载到MHC I和MHC II上，而不进行细胞内加工。使用预装载与常规方法装载的肽之间的这种大小差异是重要的，因为在肿瘤MHC I中呈递的肽大多短于15聚(通常为8-10聚)。因此，由于短肽(8-10聚)和长肽(15聚)装载之间的内在生物物理差异(intrinsic biophysical difference)，通过常规(即细胞外装载)方法使用15聚体训练的CD8+CTL不能预期结合肿瘤肽：MHC。预装载利用肽的细胞内加工以呈递MHC I等位基因特异性的肽，因此，可以导致更有力的刺激生理相关的CTL组库，其可以更好、更有效地结合肿瘤肽：MHC。此外，利用预装载，细胞可以通过蛋白水解“定制”肽(不同的病人可能不同)，从而无论MHC等位基因如何，装载生物学最优选的肽。在不同的实施方式中，本文公开的是一种组合组合物(常规装载和预装载DC的混合物)以及制作和使用该组合物的方法。
在一些实施方式中，本公开的APC制备方法可以包括以下步骤(图24)：
提供多个单核细胞；
在包含细胞因子(如IL-4和GMCSF)的第一培养基中培养第一等分的单核细胞，从而诱导第一等分的单核细胞的至少部分分化为未成熟的树突细胞(DC)；
向单核细胞和/或未成熟的DC递送衍生自一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多种肽(例如15聚体)(“TAA肽”)，例如，通过与TAA肽、整个TAA蛋白孵育，或通过偶联肽的脂质体递送；
继续将单核细胞和/或未成熟的DC培养成第一组成熟的DC，这些DC在其表面呈递6-15聚的肽抗原，优选8-11聚的肽抗原；
在第二培养基中培养单核细胞和/或多个未成熟DC的第二等分，从而诱导分化为成熟DC；
将多个TAA肽装载到成熟DC上，从而获得表面呈递TAA肽(例如15聚肽)的第二组成熟DC；和
以约10∶1至1∶10(例如，约5∶1至1∶5，或约1∶1)的比率组合第一组成熟DC和第二组成熟DC，从而产生适合下游使用(例如，T细胞训练)的APC。
在一些实施方式中，可以通过将PBMC淘洗成至少富含淋巴细胞的部分和富含单核细胞的部分来获得单核细胞，其中优选PBMC来自需要细胞治疗的癌症患者。
在一些实施方式中，肽可包括全长TAA和/或TAA片段。肽可以是一个从各种TAA获得或衍生的肽文库。它们的长度可以是8-15个氨基酸(8-15聚)。TAA可以是，例如，选自PRAME、SSX2、NY-ESO-1、生存素和WT-1。在某些实施方式中，TAA获取自需要治疗的癌症患者。在某些实施方式中，TAA可包括HPV+头颈癌和/或宫颈癌的病毒性肿瘤抗原。
所得的APC可以在其细胞表面展示由主要组织相容性复合物(MHC)I呈递的8-10聚体抗原，其中该8-10聚体是由单核细胞和/或iDC从肽中进行蛋白水解产生的抗原和/或肽创建的。
体外MTC制备
在多种实施方式中，按照本文公开的方法制备的APC可用于体外扩增多靶T细胞(MTC)。这可以通过，例如，将PBMC的富含淋巴细胞的部分与APC共同培养(例如，以约40∶1至约1∶1的比率)来扩增对TAA肽反应性的MTC。这种共培养可以在IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21中的一种或多种存在下进行。在一些实施方式中，共培养可以在IL-15、IL-12以及任选的IL-2、IL-21、IL-7和IL-6中的一种或多种存在下进行。有利地，使用本文公开的方法和组合物，从PBMC到MTC的整个过程时间可以被缩短到10-20天，而常规方法通常需要至少20天(参见例如，Putz等，Methods Mol Med.2005；109：71-82，通过引用全文纳入本文)。所得的MTC可用于本文进一步公开的多种T细胞疗法。
细胞因子分子
扩增的MTC可以装载交联的治疗性蛋白单体簇(如纳米凝胶)，以提供其他治疗性益处。治疗性蛋白单体的实例包括但不限于抗体(例如，IgG，Fab，混合的Fc和Fab)，单链抗体，抗体片段，工程化的蛋白质，例如Fc融合体，酶，辅因子，受体，配体，转录因子和其他调节因子，细胞因子，趋化因子，人血清白蛋白等。这些蛋白质可能是天然的也可能不是天然的。考虑并且可以根据本公开使用其他蛋白质。如在例如美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944，美国公开号2014/0081012，2017年6月13日提交的PCT申请号PCT/US17/37249，和2018年4月13日提交的美国临时申请号62/657,218中所公开的，可以通过交联可逆地修饰任何蛋白质以形成簇或纳米凝胶结构，其全部通过引用全文纳入本文。装载的细胞可以有许多治疗性应用。例如，装载的MTC可以用于包括过继细胞疗法的T细胞疗法。
治疗性蛋白单体可包含一种或多种细胞因子分子。在实施方式中，细胞因子分子是细胞因子的全长、片段或变体，例如，包含一个或多个突变的细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自以下的细胞因子：白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-23(IL-23)、干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、肿瘤坏死因子α、GM-CSF、GCSF，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。在其他实施方式中，细胞因子分子选自白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-23(IL-23)或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。
在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在一个实施方式中，细胞因子分子包含如本文所述的IL-15受体或其片段(例如，IL-15受体α的胞外IL-15结合结构域)。在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-15分子，例如本文所述的IL-15或IL-15超激动剂。如本文所用，与天然存在的细胞因子相比，细胞因子分子的“超激动剂”形式显示增加，例如至少10％，20％，30％的活性。示例性的超激动剂是IL-15SA。在一些实施方式中，IL-15 SA包含IL-15和IL-15受体的IL-15结合片段，例如IL-15受体α或其IL-15结合片段的复合物。
在其他实施方式中，细胞因子分子进一步包含抗体分子，例如，免疫球蛋白Fab或scFv片段，Fab片段，FAB2片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdAb(纳米抗体)片段，重链抗体片段，例如，Fc区，单结构域抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方式中，细胞因子分子还包含免疫球蛋白Fc或Fab。
在一些实施方式中，细胞因子分子是IL-2分子，例如IL-2或IL-2-Fc。在其他实施方式中，细胞因子激动剂可用于本文公开的方法和组合物中。在实施方式中，细胞因子激动剂是细胞因子受体的激动剂，例如针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引发天然存在的细胞因子的至少一种活性。在实施方式中，细胞因子激动剂是细胞因子受体的激动剂，例如针对选自IL-15Ra或IL-21R的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。
为了鉴定MTC对产物中较小的加工肽的反应性，将收获的MTC与商购来源的HLA-A*02：01、装载选定的PRAME-衍生的9聚体和10聚体肽的荧光团偶联四聚体进行孵育。通过流式细胞仪，基于四聚体的染色情况，鉴定对装载了9聚体和10聚体的四聚体反应性的负荷TCR的MTC(图25)。MART126-35(27L)四聚体被用作非特异结合至四聚体的阴性对照。该研究表明，可以从现成的、高度多样化的肽库中分离出对免疫显著的9和10聚体反应性的克隆。
实施例2：示例性包含IL-12的免疫刺激融合蛋白
为了探索IL-12和免疫靶向抗体的融合分子改善IL-12生物活性的潜力，构建了包含IL-12和单克隆抗体的IFM，该克隆靶向人CD45(免疫细胞表面上的丰富受体)(Cyster等，EMBO Journal，第10卷，第4期，893-902，1991)。在图2A-2D中描绘了示例性的IL-12系连融合体(IL12-TF)。已使用人或小鼠IL-12和对人或小鼠CD45有特异性的抗体片段构建了可在人或小鼠细胞上使用的IL12-TF。IL12-TF chM1Fab-sc-IL12p70包含与小鼠单链IL-12p70融合的抗小鼠CD45 Fab片段(图2A)。小鼠单链IL-12p70包含小鼠IL-12A和IL-12B的遗传融合体。用于小鼠细胞的另一种IL12-TF，chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70，包含抗小鼠CD45 Fab和scFv抗体片段与小鼠单链IL-12p70的Fab-scFv融合体(图2B)。还构建了与人细胞一起使用的对应的IL12-TF：h9.4Fab-scIL-12p70(图2C)和h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70(图2D)包含对人CD45有特异性的Fab或Fab-scFv融合体和单链人IL-12p70。尽管相反的表达方向也是可能的(例如，IL-12A-IL-12B)，全部四种构建体的相应IL-12p70亚基IL-12A和IL-12B表达成具有方向IL-12B-IL-12A的单链分子。连接IL-12A和IL-12B亚基的多种不同柔性接头是可能的。IL-12p70也可以表达为IL-12A和IL-12B的异源二聚体，后者是该蛋白质的天然形式。本文公开的各种接头可用于可操作地连接抗-CD45抗体和IL-12，其作用以增加两者之间的空间。
实施例3：抗体介导的IL-12系连至CD45支持IL-12的细胞装载且延长表面持久性
评估了IL12-TF支持将IL-12装载到T细胞上的能力。简而言之，将人总CD3 T细胞用CD3/CD28 Dynabeads激活三天。除去珠子，将细胞与IL-2孵育1天，然后与在完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)中稀释的h9.4Fab-scIL-12p70脉冲孵育。将细胞与完全培养基(空白条件)或h9.4Fab-scIL-12p70的生物重复物中于37℃孵育1小时，然后用完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640)洗涤3次以去除未结合的IL12-TF。然后将细胞以约200,000个细胞/mL的细胞密度接种于完全培养基中，并在37℃，5％CO2下孵育。通过使用多克隆抗人IgG抗体免疫染色，使用流式细胞仪检测了表面系连的IL-12。使用CountBright绝对流式细胞术计数珠计数细胞。在每种情况下，使用Diva软件在FACSCelesta上分析细胞；使用Cytobank分析数据。
如图3所示，与抗CD45抗体融合的IL-12的脉冲孵育不仅支持IL-12在T细胞表面上的显著装载和延长的持久性，而且还支持显著的T细胞扩增。
实施例4：通过IL-12系连融合体在非装载靶细胞中激活STAT4磷酸化
系连融合体可以同时激活装载的细胞和未装载的靶细胞(图4A)。因此，然后我们评估了IL-12系连融合体以顺/自分泌、反和旁分泌方式支持人T细胞活性的能力。简言之，在用IL-12系连融合体(h9.4Fab-scIL-12p70)脉冲孵育一天后，在三个独立试验中测量STAT4的磷酸化，以探测顺式、反式和旁分泌活性。如本文所述，总CD3 T细胞被活化。将活化的人T细胞与IL12-TF(h9.4Fab-scIL-12p70)在37℃下孵育1小时，通过洗涤除去未结合的系连融合体，并将细胞以4E5个细胞/mL的密度接种，在37℃和5％CO2下孵育过夜。在没有细胞因子的情况下，未装载的细胞在完全培养基中再繁殖一天，次日作为“靶”细胞用于反式和旁分泌试验。对于顺式呈递/自分泌活性，细胞被固定、透化，并如上所述对STAT4磷酸化进行免疫染色。对于反式呈递评估，未装载IL12-TF的靶细胞用CellTrace远红染料(赛默飞世尔公司)标记，以便使用流式细胞术从装载IL12-TF的细胞中分化出来。将装载IL12-TF的细胞与荧光标记的未装载细胞混合，沉淀并一起孵育30分钟。然后对细胞进行固定、透化并对STAT4的磷酸化进行免疫染色。对于反式/旁分泌，脉冲孵育后一天，从装载IL12-TF的细胞中回收条件培养基，转移到未装载细胞中，孵育30分钟，然后固定透化和对STAT4磷酸化免疫染色。在所有试验中，使用DiVa软件在FACSCelesta流式细胞仪上分析细胞，并使用Cytobank分析数据。对于所有试验，IL12-TF诱导STAT4磷酸化高于用不含系连融合体的培养基脉冲的“空白”脉冲细胞的背景(图4B)。据报道，IL-15可增强IL-12的活性，如上所示，IL-15和IL-12系连融合体的组合可增强STAT4的磷酸化；因此，此处所述的三种试验中，还评估了与IL-12(h9.4Fab-scIL-12p70)和IL-15(h9.4Fab-IL-15/sushi)系连融合体组合脉冲孵育的STAT4磷酸化情况。虽然IL-15系连融合体本身并不诱导强烈的STAT4磷酸化，但在顺式和反式试验中，通过IL-12和IL-15系连融合体的组合，STAT4磷酸化被增强了，如图4B所示。
携带小鼠IL12-TF的Pmel细胞显示对内源性免疫系统具有活性的迹象。它们诱导转移的和内源性免疫细胞的瞬时淋巴细胞减少，包括CD8 T细胞和NK细胞(图5B)。随后是内源性CD8 T细胞的增殖(由Ki67阳性定义)和分化(图5C)。对内源性CD8 T细胞的进一步细分显示，增殖的细胞几乎完全包含在经历抗原的内源性CD8 T细胞群中(通过流式细胞术，该细胞群对同类系的(congenic)Pmel T细胞标志物CD90.1都呈阴性，对CD8和CD44呈双阳性)，这表明IL12-TF的存在正在活化内源性免疫系统的特定隔室(图5D)。图5B所示的内源性NK细胞的瞬时淋巴细胞减少后，其增殖(由Ki67阳性)和活化(由CD69阳性)增加，如图5E所示。总之，携带IL12-TF的肿瘤特异性T细胞有可能既增强治疗癌症的ACT又引发内源性免疫系统。
实施例5：当IL12-TF预装载到过继转移的T细胞上或可溶地共同给予时，IL12-TF增强了肿瘤特异性T细胞疗法
评估了表面系连的IL-12增强针对癌症的过继细胞治疗(ACT)的能力。简而言之，用400,000个B16-F10黑色素瘤细胞皮内接种C57BL/6J小鼠。在用肿瘤特异性T细胞进行过继细胞治疗的前一天(接种B16-F10细胞后9天)，用4mg环磷酰胺处理荷瘤小鼠。分别地，从Pmel-1小鼠中分离出CD8T细胞，其表达对B16-F10黑色素瘤细胞中的gp100抗原具有特异性的T细胞受体，并如本文所述用于T细胞的，进行活化和扩增。然后，收获细胞用于ACT，并与IL-12系连融合体(chM1Fab-scIL-12p70)以125nM的浓度孵育。通过洗涤除去未结合的系连融合体，将细胞重新悬浮在HBSS中，然后通过静脉内(i.v.)注射将CD8 Pmel T细胞过继转移(3E6个细胞/小鼠)到B16-F10荷瘤小鼠体内。作为对照，小鼠也用单独的HBSS、CD8 PmelT细胞或CD8 Pmel T细胞后用单剂量可溶性IL-12p70(，剂量水平为10、50或250ng，对应于0.143、0.715和3.575pmol的IL-12p70)或用可溶性IL-12系连融合体(0.143、0.715或3.575pmol的系连融合体)治疗，所有条件都是静脉内给予。不希望被理论所束缚，基于本文的初步计算，到目前为止试验的最高剂量对应于超过100倍的表面系连IL-12的剂量。
如图6所示，预装载或可溶地共给予的IL-12系连融合体均显著抑制肿瘤生长并支持延长的生存。在各个情况下，系连融合体都比游离IL-12共给药更强地抑制肿瘤的生长和延长生存期。以体重下降的形式观察最小明显毒性。为了清楚起见，将数据绘制在两个单独的图中；在第二组图中，将HBSS，仅Pmel和Pmel携带IL12-TF组重新绘制以进行比较。显示了ACT后的前35天或截至给定组中的两只小鼠死亡的肿瘤生长动力学。
实施例6：候选IL12-TF能以多细胞剂量进一步改善肿瘤控制
大多数细胞疗法需要在ACT之前进行涉及清髓化学疗法的预处理方案，以产生强大的抗肿瘤反应。然而，该方法具有局限性，包括由于连续几轮预处理化学疗法清除先前给予的细胞活性的风险而无法给予多个细胞剂量。在没有预处理的情况下，IL12-TF在实体瘤模型中增强肿瘤特异性T细胞治疗的潜力如前所证。接下来，评估了IL12-TF通过使用多细胞剂量进一步增强抗肿瘤控制的能力。简而言之，用400,000个B16-F10黑色素瘤细胞皮内接种C57BL/6J小鼠。分别地，来自Pmel小鼠的CD8 T细胞被分离、活化、扩增，并按本文所述装载IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70)。肿瘤接种后9天，小鼠通过静脉注射CD8 Pmel T细胞治疗。在第一细胞剂量前一天使用环磷酰胺进行淋巴清除；在没有另进行淋巴切除术的情况下，在第一剂量之后14天给予第二细胞剂量。此外，评估了IL12-TF的替代性构型(chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)增强单剂量肿瘤特异性细胞治疗效果的能力。两种IL12-TF(chM1Fab-scIL-12p70和chM1Fab-M1scFv-scIL-12p70)以离体装载系连融合体的单细胞剂量改善了肿瘤生长抑制和生存期(图7A)。多剂量离体装载chM1Fab-scIL-12p70的肿瘤特异性T细胞(但不是单独的多剂量肿瘤特异性T细胞)进一步增强了抗肿瘤生存(图7B)。
IL12-TF增加了循环中的Pmel T细胞的峰值扩增及其长期持久性(图7C)。没有观察到以体重下降形式出现的明显毒性迹象(图7D)。观察到的体重减轻似乎均主要是由环磷酰胺进行的淋巴清除驱动的：在每个治疗组中，小鼠的体重减轻了约10％(图7D)，而在没有淋巴消除的情况下进行的前述实施例中，观察到所有治疗组中不足5％的体重减轻(图5A)。此外，用携带IL12-TF的Pmel进行ACT后一天，在血浆中观察到中等水平的全身性IFN-γ(图8)和CXCL10(图9)；循环水平在过继细胞转移后四天内恢复到基线(图8-9)。
总而言之，本文证明，抗体介导的细胞因子系连的多种构型可在T细胞表面上实现IL-12的强装载和持久性。此外，表面系连的IL-12在侵略性实体瘤模型中显著提高了过继转移的肿瘤特异性T细胞的功效，包括比全身给予的IL-12摩尔过量＞100倍更好的肿瘤控制和存活率。在没有淋巴清除的情况下，装载IL12-TF的肿瘤特异性T细胞的功效使得可以通过多细胞剂量给药来进一步提高疗效。
表面系连的IL-12也支持内源性免疫系统的激活(包括增加经历抗原的CD8 T细胞的增殖)同时没有以体重下降和持续的全身细胞因子释放形式的明显的毒性。
总之，细胞表面系连的免疫刺激细胞因子是增强针对癌症(包括实体瘤)的细胞疗法功效的有效方法。这种方法不需要基因工程化改造，可以很容易地纳入目前正在进行临床探索的细胞疗法中，例如CAR-T、TCR-T、肿瘤相关抗原特异性T细胞和NK细胞。
实施例7：系连融合平台能够进行体内特异性细胞靶向
建立了使用靶向CD8的IL-7或IL-15系连融合体在体外选择性装载CD8 T细胞的能力(请参见上述实施例)之后，使用靶向CD8的IL-15 IFM测试了体内对CD8 T细胞的选择性靶向作用。基于先前在人T细胞中的观察，证明使用二价Fab-scFv构建体可改善CD8亲和性(图17D-图17F)，产生了小鼠靶向CD8的IL-15变体，其包含类似的Fab-scFv抗体构型(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)。靶向CD8的Fab是设计为提供特异性，而靶向CD45的scFv是为了改善在靶细胞上的持久性。
在此实施例中描述的第一实验中，测试了静脉内给予的系连融合体是否可以在体内特异性靶向小鼠CD8 T细胞。两只C57BL/6J小鼠/组被注射chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi(2μg/小鼠)、chM1Fab-IL15/sushi(靶向CD45的IFM，2μg/小鼠)或PBS载剂对照。注射后一小时，抽血，用流式细胞仪评估系连融合细胞表面的结合。裂解红细胞，用针对κ和IL-15的荧光偶联抗体对剩余的细胞进行染色，以检测系连融合。另外还包括小鼠CD4、CD8、NK1.1和CD45的特异性抗体，以实现免疫细胞亚群分析。系连融合体表面结合是由κ和IL-15都是阳性定义的。载剂对照和chM1Fab-IL15/sushi-治疗的动物都有最少的阳性染色细胞(3.5-3.9/μl)，而chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi-治疗的动物有大于10倍的更高的循环系连融合体阳性细胞浓度(图10A)。图10A中的直方图显示chM1Fab-IL15/sushi-治疗的动物的荧光整体偏移；但是，没有独特的TF阳性群体。因为CD45存在于所有的免疫细胞上，所以很可能有特异性结合，但系连融合体信号分散在数量大得多的细胞中。对于用靶向CD8的IL-15(chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi)治疗的小鼠，虽然只有一小部分总细胞系连融合体阳性(1.73％)，但大多数CD8 T细胞呈阳性(图10B)。此外，其他被分析的亚群(CD4 T细胞、NK细胞)都没有表现出TF染色。这些数据共同显示了chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi系连融合体对CD8细胞的特异性、高水平靶向作用，和CD45特异性chM1Fab-IL15/sushi系连融合体的非特异性、低水平靶向作用。
在第二实验中，评估了单剂量(2或10ug)靶向CD45或CD8的IL-15 IFM对循环免疫细胞的影响。非靶向的IL-15/sushi-Fc构建体和包含D61H和E64H突变的靶向CD8的IL-15变体(包括chY169Fab-M1scFv-IL15-DHEH/sushi；对这些突变的进一步描述参见上述实施例)。在注射后第3天抽血，裂解红细胞，用针对CD45、CD4、CD8和NK1.1的荧光偶联抗体对剩余细胞进行染色。到注射后第3天，任何一种系连融合体格式或浓度的CD4 T细胞数量都有微小的变化(图10C)。相比之下，所有的系连融合体格式和浓度都使CD8数量增加，范围为3.4-13.6倍。靶向CD45和CD8的系连融合体对CD8细胞的作用是相似的，与非靶向IL15/sushi-Fc相比作用增加。对应于其生物活性降低，DHEH突变体驱动的CD8扩增比野生型IL-15 IFM少。虽然靶向CD8的系连融合体比起CD45没有增强CD8 T细胞的扩增，但是NK细胞的脱靶效应减少了(通过对循环中NK1.1+细胞的定量测得)。NK细胞对IL-15也高度敏感，通过IL-15/Sushi-Fc和靶向泛CD45的chM1Fab-IL15/sushi系连融合体，它们的数量急剧增加(比HBSS处理组扩增6-13倍)。相比之下，靶向CD8的chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi仅导致NK细胞数目的中等程度增加(3-5倍)。DHEH突变体对NK细胞的脱靶作用甚至被进一步减弱，相对于载剂对照仅扩增了1.5-3倍。通过比较CD8 T细胞和NK细胞的比率，可以最清楚地看到这些影响(图10D)。非靶向的IL15/sushi实际上降低了CD8 T细胞与NK细胞的比率，这表明在没有靶向的情况下，NK的特异性活性是有偏好的。虽然靶向泛-CD45的系连融合体显著增加了CD8 T细胞数量，但它对NK细胞数量也具有相当的影响，而与载剂治疗小鼠的CD8∶NK比没有变化。靶向野生型CD8的系连融合体使2μg和10μg剂量的CD8∶NK比率显著增加，分别增加9.2倍和4.4倍。DHEH突变体对CD8 T细胞没有显著影响，但对NK细胞的脱靶作用也有所降低，并且用该构建体处理的小鼠的CD8∶NK比率与靶向CD8的野生型系连融合体相似。总之，IFM靶向作用能够调节IL-15对CD8和NK细胞作用量级和选择性；特别是通过控制靶向(CD8比CD45比非靶向)、剂量和IL-15的活性(通过减弱IL-15突变)，可以使IL-15的活性偏向CD8细胞。
这些实验共同表明，全身给予CD8靶向的IL-15变体可以将IL-15体内装载到CD8 T细胞上，可以使IL-15偏向这些细胞，并且可以进一步增加CD8 T细胞的循环水平，使其超过通过用本领域描述的IL-15构建体，例如IL15/sushi-Fc处理可达到的水平。
实施例8：全身性给予靶向CD8的IL-15显示出毒性降低
评估了将IL-15重新靶向CD8 T细胞对全身毒性的影响。简而言之，通过静脉内注射10、30或90μg IL15/sushi-Fc构建体(IL-15的半衰期延长形式)或两种不同的含有D61H(DH)或D61H和E64H(DHEH)突变的靶向CD8的IL-15变体(chY169Fab-M1scFv-IL15-DH/sushi和chY169Fab-M1scFv-IL15-DHEH/sushi)，向C57BL/6J小鼠每周一次给予两剂量；每组n＝5只小鼠。此外，在90μg剂量水平评估含有野生型IL-15的靶向CD8的IFM，chY169Fab-M1scFv-IL15/sushi。在上述实施例中，证明了与IL15/sushi-Fc或靶向CD45的构建体相比，靶向CD8的构建体偏向于IL-15对CD8 T细胞的装载和活性，并且在10μg剂量下，靶向CD8的构建体诱导循环CD8 T细胞的扩增等于或优于10μg IL15/sushi-Fc，同时诱导循环NK细胞的较小扩增。还评估了在固定剂量水平下每周增加给药的次数，特别地，研究了每周两剂或三剂的10μg IL15/sushi-Fc或靶向CD8的IL-15 IFM，持续两周(每组3只小鼠)。图11A显示，对于靶向CD8的IL-15变体剂量递增，随时间推移没有出现以体重下降的形式的明显的毒性。然而，IL15/sushi-Fc构建体的最大耐受剂量为每周10μg对于IL15/sushi-Fc：30和90μg的剂量会诱发明显的毒性，导致注射后四天死亡(图11A，图例中括号内的数字表示实验结束时存活小鼠的比例)。从死亡的小鼠身上摘取脾脏，发现用30和90μg IL15/sushi-Fc治疗的小鼠脾脏肿大(图11B)。相比之下，每个靶向CD8的IL-15变体都能完成整个两周的研究，与此处检验的10μg IL15/sushi-Fc的整个两周给药方案相比，导致最小的体重损失(图11A)、没有死亡的动物、脾脏肿大较小(图11B)。此外，虽然IL15/sushi-Fc在每周一次10μg的剂量下可以耐受，但将此剂量增加到每周两次或三次，会导致明显的毒性和第二次注射后的死亡(图11C，图例中括号内的数字表示实验结束时存活小鼠的比例)。死去的小鼠也表现出脾脏肿大(图11B)。相比之下，每周两次或三次以10μg的剂量给予靶向CD8的IL-15变体，在整个两周的剂量方案过程中，没有导致明显的体重减轻、死亡动物(图11C)或大量脾脏增大(图11B)。总之，将IL-15重新靶向CD8 T细胞，可以在体内降低毒性、提高IL-15的剂量。已经显示通过IL-15扩增NK细胞对体内IL-15毒性有强烈贡献(Guo等，J Immunol.2015年9月1日；195(5)：2353-64)。不希望囿于理论，据推断，在体内将IL-15的活性从NK细胞上偏移可以减少毒性，并使针对CD8 T细胞的剂量更强。考虑到IL-15的抗肿瘤功效可以由CD8 T细胞介导，这在治疗上有优势且是显著的(Xu等，Cancer Res.2013年5月15日；73(10)：3075-86；Cheng等，J Hepatol.2014年12月；61(6)：1297-303)。
实施例9：IL-12的全身靶向CD8给药的抗癌功效
IL-12是一种强效的细胞因子，可在鼠肿瘤模型中诱导强抗肿瘤活性，但在人临床试验中有高毒性。IL-12支持CD4 T细胞分化为Th1表型，增加CD8 T细胞的细胞毒性，并激活NK细胞。然而，IL-12用于癌症治疗的临床试验发现，IL-12对人类患者的影响在NK细胞上最为突出(Robertson等，Clin Cancer Res.1999年1月；5(1)：9-16；Bekaii-Saab等，MolCancer Ther.2009年11月；8(11)：2983-2991)。可能IL-12在NK细胞上的主导活性(加上与活化NK细胞相关的毒性)限制了将IL-12的生物学作用有效递送给CD4和CD8 T细胞的能力。为了验证这一假设，构建了靶向小鼠CD8 T细胞的小鼠IL-12IFM(chY169Fab-M1scFv-scIL-12p70)并在鼠黑色素瘤肿瘤模型中评估了其安全性和抗肿瘤功效。
简而言之，通过皮内注射用400,000B16-F10黑色素瘤细胞接种B6D2F1/J小鼠。10天后，荷瘤小鼠被随机分组并通过静脉内注射两剂(每周一次给药)0.05、0.25、1或5μg重组IL-12(R&D系统公司(R&D Systems))、靶向CD45的IL-12(chM1Fab-M1scFv-scIL12p70和chM1Fab-scIL12p70)或靶向CD8的IL-12治疗(每组n＝5只小鼠)。图12A证明，每周注射靶向CD45的IL-12IFM或靶向CD8的IL-12IFM各自都比每周注射IL-12递送了更强的抗肿瘤功效。靶向CD8的IL-12还递送了与靶向CD45的IL-12类似的肿瘤生长抑制作用(图12A)。值得注意的是，用Fab-scFv CD45靶向的IL-12构建体治疗的小鼠在1和5ug剂量水平上出现了体重下降形式的毒性，而用Fab-scFv CD8靶向的IL-12治疗的小鼠没有表现出类似的毒性(图12B)。总之，与单独IL-12相比，包含IL-12的IFM可以递送改进的抗肿瘤功效，而且细胞特异性靶向的IL-12可以减少全身性毒性。
实施例10：IL-12系连融合体
在一个方面，在本发明中有用的系连融合体包括系连至抗-CD45 Fab的单链人IL-12p70，以及，任选地，还包括抗-CD45 scFV。Fab和scFV区域的功能是将IL-12系连融合体靶向至T细胞，特别是正常或功能性T细胞。IL-12 TF可以被离体装载到T细胞上，用于过继细胞疗法，或体内全身给药以结合至T细胞(和其他免疫细胞)。无论是何种给药方式，IL-12TF都表现出自分泌和旁分泌活性并表现出刺激免疫应答。
图2C-2D中描述了本文所述的两个IL-12 TF实施方式。
IL-12系连融合体描述
蛋白质名称：h9.4Fab-scIL-12p70
该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab(SEQ ID NO：79)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体。h9.4Fab是抗-人CD45R抗体Fab片段，其包含来自h9.4的可变重链和可变轻链结构域(VH和VL)以及来自人的恒定结构域(人恒定κ结构域和人IgG1-CH1结构域)。
蛋白质名称：h9.4Fab-h9.4scFv-scIL-12p70
该蛋白通过两个亚基的共表达而制成：HC-h9.4Fab-h9.4scFv(SEQ ID NO：80)和LC-h9.4Fab-scIL-12p70(SEQ ID NO：82)。所得蛋白质包含使用接头-1(SEQ ID NO：36)的单链人IL-12p70与h9.4 Fab片段轻链的C末端的融合体和使用接头-1的h9.4 scFv与h9.4Fab片段重链的融合体。
IL-12系连融合体序列
A.SEQ ID NO：36：接头-1(L1)(G4S)3接头
Figure BDA0003377443230001122
B.SEQ ID NO：50：scIL-12p70-BA
合成序列；由柔性接头连接的IL-12B和IL-12A。
Figure BDA0003377443230001121
Figure BDA0003377443230001131
C.SEQ ID NO：70：接头-5(L5)(G3S)4接头
Figure BDA0003377443230001133
D.SEQ ID NO：79：HC-h9.4Fab
人源化抗-CD45抗体的重链；包含人源化9.4(h9.4)重链可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。
Figure BDA0003377443230001132
E.SEQ ID NO：80：HC-h9.4Fab-h9.4scFv
人源化抗-CD45抗体的重链连接至人源化抗-CD45 scFv；包含来自h9.4的重链可变结构域和来自人IgG1的CH1结构域。h9.4 scFv被用柔性接头(接头-1，SEQ ID NO：36)遗传融合至Fab重链C-末端。
Figure BDA0003377443230001141
F.SEQ ID NO：82：LC-h9.4Fab-scIL-12p70
人源化抗-CD45抗体的轻链；包含来自h9.4轻链的可变区域和人恒定κ结构域，野生型单链人IL-12p70(SEQ ID NO：50)用柔性接头(接头-1，SEQ ID NO：36)遗传融合至抗体轻链C-端；单链人IL-12p70包含使用柔性接头(接头-5；SEQ ID NO：80)遗传融合的人IL-12A和IL-12B。
Figure BDA0003377443230001142
Figure BDA0003377443230001151
实施例11：IL-15纳米凝胶
在一个实施方式中，IL-15纳米凝胶包含IL-15-Fc单体、可降解化学交联剂和阳离子嵌段共聚物。IL-15纳米凝胶在形成纳米凝胶时具有最小的生物活性，但在体内交联剂降解导致IL-15-Fc单体释放后具有活性。
更特别的是，IL-15纳米凝胶包含交联的IL-15-Fc单体，涂有PEG-聚赖氨酸的阳离子嵌段共聚物(PK30)以促进细胞粘附。IL-15纳米凝胶的关键元件包括(1)IL-15-Fc单体，(2)可降解的化学交联剂，以及(3)由PEG-聚赖氨酸组成的阳离子嵌段共聚物(简称PK30)。
IL-15-Fc单体
根据实施方式，IL-15-Fc单体是一个具有两个缔合的IL-15蛋白的sushi-Fc融合同二聚体蛋白。IL-15蛋白的一级序列是野生型人IL-15。Sushi-Fc蛋白是野生型IL-15受体亚基α(IL-15Rα)的sushi结构至修饰的IgG2 Fc蛋白的N端的融合体。Fc区的一级序列由具有IgG4突变的人IgG2的CH2和CH3铰链区(PAPIEK-IgG2突变为PSSIEK-IgG4)构成，以最小化Fcγ受体和补体介导的效应物功能。每个Fc蛋白上融合了两个sushi结构域。由于高亲和性的离子和疏水相互作用，一个IL-15非共价地结合至各个sushi结构。IL-15-Fc单体由CHO细胞制造，IL-15和sushi-Fc蛋白分别在质粒上的单独的启动子下编码。
交联剂
在一个实施方式中，CL17交联剂[双(2-((((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧代)羰基)氧代)乙基)琥珀酸酯]是双官能团交联试剂(如下图所示)。该交联剂有多个反应位点，分别用于两个目的。交联剂两端的N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯基团与胺反应，连接IL-15-Fc单体，而分子中心的酯基可以通过水解裂解。更具体地，在纳米凝胶合成过程中，交联剂上的活性碳酸酯基团与IL-15-Fc上的游离赖氨酸交联反应，形成氨基甲酸酯键，使单体交联成多聚体。IL-15纳米凝胶在生理pH值下的溶液中是稳定的。然而，在体内，酯基将受到水解，导致硫醇修饰的IL-15-Fc单体释放。仍与IL-15-Fc上的赖氨酸附接的侧接硫醇将经历快速的分子内环化，释放出完整的天然蛋白，伴随形成1-3，草硫酮-2-酮(1-3，oxathiolon-2-one)。因此，交联剂和残余基团是自我消除的，交联剂完全解离，使IL-15-Fc单体处于纳米凝胶形成之前的相同状态。
Figure BDA0003377443230001171
嵌段共聚物PK30
由于阳离子赖氨酸残基的反应，IL-15-Fc与CL17交联剂的交联导致产生的IL-15纳米凝胶的净负电荷，从而抑制细胞的附着。在第一步，纳米凝胶通过静电相互作用与PK30(甲氧基-聚(乙二醇)n-嵌段-聚(L-赖氨酸盐酸盐)，PEG-聚赖氨酸，如下图所示)复合以驱动细胞附着。PK30是线性两亲嵌段共聚物，其具有聚(L-赖氨酸盐酸盐)嵌段和非反应性PEG嵌段。该嵌段共聚物包含约114个PEG单元(MW约5000Da)和30个赖氨酸单元(MW约4900Da)。聚-L-赖氨酸嵌段在生理pH下提供净阳离子电荷，并在缔合后使纳米凝胶具有净正电荷。
PK30
Figure BDA0003377443230001172
实施例12：表面带有聚阳离子聚合物的蛋白质纳米凝胶的形成
由表面带有阳离子聚合物的蛋白质纳米凝胶构成的蛋白质纳米凝胶形成如下。使用25倍摩尔过量的式IV中规定的可降解交联剂，将浓度为15mg/mL的IL-15WT/sushi-Fc交联成蛋白纳米颗粒。在室温下孵育30分钟后，将反应液用DPBS稀释10倍至最终细胞因子浓度为1.5mg/mL。然后，通过使用Zeba色谱柱(截止分子量为7,000或40,000MW，购自赛默飞世尔)将缓冲液交换成DPBS，从接头离去基团(包含作为交联反应的一部分被除去的接头的分子片段)和未反应的接头中纯化蛋白质纳米凝胶。根据制造商的说明使用Zeba色谱柱，包括使用DPBS连续洗涤3次以平衡DPBS中的色谱柱，以促进缓冲液交换，然后施加反应产物。然后，细胞因子浓度约为1-1.5mg/mL的缓冲液交换的蛋白质纳米凝胶与聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG-聚K)嵌段共聚物：PEG5k-polyK30(Alamanda聚合物目录号050-KC030)偶联，该嵌段共聚物包含5千道尔顿(kD)的聚乙二醇(PEG5k)和30个氨基酸的聚赖氨酸聚合物(聚赖氨酸30或聚K30)，或PEG5k-polyK200(Alamanda聚合物目录号050-KC200)。PEG5k-聚K30或PEG5k-聚K200在DPBS中重建至10mg/mL，并以50ug/mL的最终嵌段共聚物浓度添加至蛋白质纳米凝胶中，并在室温下孵育30分钟。在NanoBrook Omni粒径仪(NanoBrook仪器公司(NanoBrookInstruments Corp.))上以90度角进行动态光散射测量(DLS)分析表面官能化纳米颗粒的粒径和多分散度。使用BioSepTM SEC-s4000色谱柱(Phenomenex公司(Phenomenex Inc.))在Prominence HPLC系统上，以PBS(pH 7.2)作为洗脱液(流速0.5mL/分钟)，在配备有光电二极管阵列((岛津公司(Shimadzu Corp.))的Prominence HPLC系统上通过尺寸排除色谱法评估纳米颗粒的相对转化率，见图26。
最终的IL-15纳米凝胶用等体积的汉克平衡盐溶液(HBSS)稀释，最终浓度约为0.5-0.75mg/mL，用于下游检测，例如与活化的原代T细胞缔合。
实施例13：蛋白纳米凝胶与T细胞的缔合及低温保存
蛋白质纳米凝胶与活化的人T细胞缔合。简言之，制备表面用聚阳离子聚合物(PEG5k-聚K30)官能化的IL-15WT/sushi-Fc蛋白纳米凝胶，如实施例12中所述。为了支持下游的流式细胞分析，纳米凝胶是用3质量％的Alexa-647标记的IL-15WT/sushi-Fc和97质量％的未标记的IL-15WT/sushi-Fc生成。根据制造商的说明，使用Alexa-Fluor-647标记试剂盒对IL-15WT/sushi-Fc进行荧光标记(赛默飞世尔公司，目录号A20186，100ug规模试剂盒；或目录号A20173，1mg规模试剂盒)。蛋白纳米凝胶合成的所有其他步骤按实施例12所述进行。
用DPBS洗涤活化的T细胞，并在37℃下最终细胞密度约为108个细胞/mL与IL-15纳米凝胶孵育1小时，等效细胞因子浓度约为0.5-0.75mg/mL。每10-15分钟通过翻转或温和涡旋混合该溶液。然后按规定将细胞重悬于含FBS的加入5％的二甲亚砜(DMSO)的细胞冷冻培养基或无血清冷冻培养基(Bambanker，Lymphotec，Inc.目录号BB02)中，密度为107个细胞/mL，并按照制造商的描述转移到低温瓶中，在Mr.FrostyTM冷冻容器(Nalgene)中冷冻。然后，细胞在加入20ng/mL IL-2的CM-T中在37℃和5％CO2下培养。通过使用带有FACSDivaTM软件(BD生命科学公司(BD Biosciences))的FACSCelestaTM流式细胞仪进行流式细胞术监测免疫激动剂配制成系连融合体和/或纳米凝胶与T细胞的缔合，并显示在冷冻和解冻后这种免疫激动剂(immune agoing)和T细胞的持久缔合(图27)。
实施例14：IL-15纳米凝胶通过控制IL-15的集中释放，在过继转移后提供自分泌刺激和T细胞的扩增
白细胞介素15(CD8和NK细胞扩增的强力刺激因子)能驱动过继转移T细胞的抗肿瘤活性。然而，全身递送剂量不能安全地提供足够的剂量以驱动T细胞扩增移植和抗肿瘤活性。
癌症患者的血液中高水平IL-15与成功的临床缓解有关(Kochenderfer等，抗-C19嵌合抗原受体T细胞引起的淋巴瘤缓解与高水平血清白细胞介素-15水平有关(Lymphomaremissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells areassociated with high serum interleukin-15 levels.)J.Clinical Oncology(2017)35(16)：1803-1813)。本文公开的装载IL-15纳米凝胶的T细胞是自体T细胞，其携带严格控制剂量的IL-15，在7-14天期间内缓慢释放，用于输注的T细胞的定向自分泌激活，而不影响内源T细胞。一个实例是装载IL-15纳米凝胶的细胞毒性T细胞(CTL)，其使用新型树突细胞引发序列引发肿瘤抗原。
总之，IL-15纳米凝胶细胞装载是稳定且可调整的，给每个细胞可控的IL-15剂量。IL-15纳米凝胶技术的设计提供了缓慢而可控的IL-15释放，在过继T细胞治疗中产生自分泌刺激和持续的细胞扩增。与全身递送IL-15相比，由于缺乏全身暴露，IL-15纳米凝胶引发诱导的全身IFNg水平、内源CD8和NK细胞扩增低几个数量级。尽管有超低频(＜1％)前体，但全封闭的、半自动化的细胞过程可从健康供体中重复地生成几十亿个抗原定向的人CTL，其反应性约20％，T细胞纯度95％。人CTL高度依赖IL-15纳米凝胶引发技术以在体内实现细胞存活和扩增。
实施例15：装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞的药理活性
在一个实施方式中，IL-15纳米凝胶是指以下的多聚体：人IL-15受体α-sushi-结构域-Fc融合同源二聚体与两个缔合的IL-15分子(IL15-Fc)，通过可裂解的交联剂(接头-2)连接，且非共价地包覆有聚乙二醇(PEG)-聚赖氨酸30嵌段共聚物(PK30)。具体而言，IL-15纳米凝胶是指以下的多聚体：人IL15-Fc单体，通过可生物降解的交联剂连接，并非共价包覆有聚乙二醇(PEG)-聚赖氨酸30嵌段共聚物(PK30)。IL15-Fc单体由两个亚基组成，每个亚基由与非共价结合至IL-15分子的IL-15受体α-sushi-结构域融合的效应子减毒IgG2 Fc变体组成。装载IL-15纳米凝胶的T细胞是通过装载过程生成的，在该过程中，靶细胞与高浓度的IL-15纳米凝胶共孵育。通过此过程，IL-15纳米凝胶通过静电相互作用与细胞缔合，并被内化以产生IL-15纳米凝胶的细胞内储库。从这些储库中，IL-15纳米凝胶通过交联剂的水解缓慢释放生物活性IL15-Fc。IL15-Fc的这种延长释放促进了装载IL-15纳米凝胶的T细胞的增殖和存活，从而提供了靶向的、可控制的和时间依赖性的免疫刺激。
这项研究的目的是测试在有或没有原位放置B16-F10黑色素瘤的C57BL/6J小鼠中装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞的药理活性。对照组包括载剂对照，单独的PMEL细胞和PMEL细胞+IL15-Fc，分别注射给予(10μg，最大耐受剂量，MTD)。
B16-F10肿瘤建立和肿瘤测量
在研究第-12天，将B16-F10黑色素瘤肿瘤细胞(0.2x106)皮内注射到雌性C57BL/6小鼠(杰克逊实验室)的剃毛的右胁腹中。记录体重并每周用卡尺测量肿瘤尺寸(在缩写列表中定义的长度[L]和宽度[W])2至3次。使用以下公式计算肿瘤体积：W2xLxπ/6。
PEML细胞的分离和扩增
从14只雌性转基因PMEL小鼠(杰克逊实验室，缅因州巴港)的脾脏和淋巴结(腹膜，腋窝和宫颈)中分离出PMEL细胞。用GentleMACS Octo Dissociator(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech)，加利福尼亚州奥本)处理脾脏和淋巴结，并通过40μm过滤器。离心洗涤细胞，并使用IMACS原初CD8a+分离试剂盒(美天旎生物技术公司)和MultiMACS细胞24块(美天旎生物技术公司)和带有18根柱的分离器(美天旎生物技术公司)按照制造商的操作规程纯化CD8a+细胞。通过亲和柱除去非CD8a+细胞，并在柱洗脱液中收集CD8a+T细胞。通过流式细胞术确认了CD8a+细胞的纯度。
分离后(D0)，将来自PMEL小鼠的纯化的CD8a+细胞以5x106个细胞/孔的密度接种到十个涂有抗CD3和抗CD28的6孔组织培养板中，并在37℃和5％二氧化碳下孵育24小时。接种后24小时(D1)加入鼠IL-2(20ng/mL)和鼠IL-7(0.5ng/mL)。在D2和D3上，对细胞计数并用含有鼠IL-21(10ng/mL)的新鲜培养基稀释至0.2×106个细胞/mL的浓度。在第4天收集细胞以在28mL载剂对照中获得总计100x106个PMEL细胞/mL。
装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞的制备
将5mL PMEL细胞(100x106个细胞/mL)与5.5mL的IL-15纳米凝胶(1.36mg/ml)混合，并在37℃旋转孵育1小时，以产生装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞。通过离心(500g)洗涤装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞(3X，首先用培养基，然后用HBSS洗涤两次)并计数。装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞以50x106个细胞/mL的浓度重悬。给5A和5B组的小鼠注射200μL的这种制剂，每只小鼠总共10x106个装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞。将PMEL细胞(15mL以100x106个细胞/mL)与15mL HBSS混合，在37℃旋转孵育1小时，通过离心(500g)洗涤(3X，先用培养基，然后再用HBSS洗涤2次)并计数。将PMEL细胞以50x106个细胞/mL的浓度重悬。给2A和2B组的小鼠IV注射200μL的这种制剂，每只小鼠总共10x106个PMEL细胞。给3A和3B组的小鼠静脉内注射200μL的这种制剂，每只小鼠总共10x106个PMEL细胞，并接受眶后注射IL15-Fc(每只小鼠在50μl HBSS中10μg/小鼠；批号TS0)。基于39％的平均加载效率，与10x106个PMEL细胞缔合的IL15-Fc总量为58.5μg，这比3A和3B组中通过注射IL15-Fc(10μg)全身递送的量高5.85倍。
Fc-IL-15 ELISA
Fc-IL15酶联免疫吸附测定(ELISA)用于确定给药后2小时，第1天，第2天，第4天和第10天收集的样品中IL15 Fc的浓度。ELISA板(在4℃下用山羊抗人IgG Fc捕获抗体包被过夜。洗涤板，并在30℃下用试剂稀释剂封闭至少2小时。洗涤板，向孔中加入样品(在试剂稀释剂中稀释)和IL15-Fc标准品(一式两份，在试剂稀释剂中31至2000pg/mL)，并将板在37℃下孵育1小时。洗涤板，然后加入生物素-抗IL15检测抗体并在37℃下孵育1小时。将板洗涤并在37℃下与链霉亲和素-HRP孵育20分钟。洗涤板，然后添加3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液并在黑暗中于室温下孵育20分钟，直到反应停止。在酶标仪(450nm)上读板。
该测定进行两次。对于第一次运行，以以下稀释度对样品进行评估：2小时时间点为1∶20000，第1天时间点为1∶5000，并且第2天，第4天和第10天时间点为1∶250。对于第二次运行，将来自3A和3B组的样品在第1天时间点按1∶5000稀释，在第2天时间点按1∶250稀释，并在第4天和第10天时间点按1∶25稀释。在所有分析的时间点，将来自1A和1B，2A和2B和5A和5B组的样品按1∶25稀释。报告第二次运行的数据。但是，由于第二次运行中2小时时间点的样品已消耗尽，并且考虑到两次运行中3A和3B组在24小时时IL15-Fc的浓度相似，因此包含了第一次运行的2小时值与来自第二次运行的其他数据点一起用于计算药代动力学(PK)参数。
1∶20000稀释中血液的定量下限(LLOQ)为310ng/ml，1∶5000稀释中为77.5ng/ml，1∶250稀释中为3.875ng/ml，而1∶25稀释中为0.3875ng/ml。
来自小鼠的血清中的血清细胞因子水平
根据制造商的方案，使用赛默飞世尔ProcartaPlex小鼠高灵敏度测试组5重目录号EPXS0S0-22199-901试剂盒，在Bio-Plex 200系统上分析样品。将血清在冰上解冻，并测试20μL血清的IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4和IL-6水平。在一些样品中，无法获得20μL的血清，因此使用了较小的体积。调节稀释因子，以根据标准曲线计算浓度。统计分析在GraphPadPrism中进行。
临床化学
在血清样品上测量临床化学参数。图9显示了临床化学参数，其中在给药后第1天和第4天观察到原始小鼠的统计学显著变化。给药后第1天，相对于装载IL-15纳米凝胶的PMEL组，观察到PMEL+IL15-Fc组的白蛋白水平显著降低(p＜0.05)，以及与载剂对照和装载IL-15纳米凝胶的PMEL相比，血尿素氮(BUN)水平也显著降低(两者均p＜0.05)。给药后第4天，PMEL+IL15-Fc组显示显著降低的白蛋白(与所有其他治疗组相比，p＜0.05)，总蛋白(与载剂对照相比，p＜0.05)，葡萄糖(与装载IL-15纳米凝胶的PMEL相比p＜0.05)，白蛋白/球蛋白(ALB/GLOB)比率(与载剂对照相比p＜0.05，并且与PMEL和装载IL-15纳米凝胶的PMEL相比p＜0.01)。
此外，PMEL+IL15-Fc组胆固醇水平显著增加(与载剂对照和装载IL-15纳米凝胶的PMEL相比，p＜0.05)。与载剂对照相比，所有治疗组均表现出钙水平降低的趋势，这在PMEL组中是统计学显著的(p＜0.05)。装载IL-15纳米凝胶的PMEL组在总胆红素(与载剂对照和PMEL相比，p＜0.05)和磷(与PMEL相比，p＜0.05)上显示出统计学显著的变化。
图10显示了临床化学参数，其中在给药后第1天和第4天观察到荷瘤小鼠的统计学显著变化。给药后第1天，在临床化学上唯一的统计学显著变化是胆红素-偶联物的减少，在PMEL+IL15-Fc和装载IL-15纳米凝胶的PMEL组中均观察到(与载剂对照相比，两者均p＜0.05)。在给药后第4天，PMEL组的白蛋白(与载剂对照相比，p＜0.05)，总蛋白(与载剂对照相比，p＜0.01)和碳酸氢盐TCO2(与载剂对照相比，p＜0.05)在统计学上显著增加。此外，PMEL组(与载剂对照相比p＜0.001；与DP-15PMEL相比p＜0.05)和PMEL+IL15-Fc组(与载剂对照相比，P＜0.05)观察到球蛋白的统计学显著增加。
全身细胞因子释放
使用Luminex 5-重试剂盒，在给药后2小时、24小时和96小时测量血清细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和TNFα)。在原始非荷瘤小鼠中，PMEL+IL15-Fc组中的IFN-γ水平为12.8±3.7pg/mL，而在装载IL-15纳米凝胶的PMEL组中，IFN-γ低于定量下限(LLOQ＝0.06pg/mL)(图11)。在荷瘤小鼠中，与装载IL-15纳米凝胶的PMEL组(0.5±0.1pg/mL)相比，PMEL+IL15-Fc组(20.5±0.5pg/mL)中的IFN-γ浓度平均高41倍。与其他组相比，PMEL+IL15-Fc组也观察到更高水平的IL-2，IL-6和TNFα。
血液中IL15-Fc的药代动力学
使用夹心ELISA(抗-Fc捕获抗体，然后抗-IL15检测抗体)测量注射了PMEL+IL15-Fc(10μg)和装载IL-15纳米凝胶的PMEL(携带58.5ug的IL15-Fc)的小鼠血液中的IL15-Fc。
对于原始和荷瘤小鼠，确定了复合动物的单次剂量给予装载IL-15纳米凝胶的PMEL和PMEL+IL15-Fc的药代动力学(PK)。对于PMEL+IL15-Fc组，在原始和荷瘤小鼠中，给药后2小时均达到最大浓度(C最大值)。在装载IL-15纳米凝胶的PMEL组中，首次测量的浓度在24小时(最初以非最佳稀释度测量2小时样品，未检测到IL15-Fc，并且没有足够的样品供用理想稀释度重复测量)。荷瘤小鼠达到比原始小鼠略低的浓度。在荷瘤小鼠和非荷瘤小鼠中，PMEL+IL15-Fc组中IL15-Fc的计算平均值t1/2分别为28.9小时和7.12小时。
在24小时的时间点上，比较了PMEL+IL15-Fc和装载IL-15纳米凝胶的PMEL组的IL15-Fc浓度。PMEL+IL15-Fc(10μg)组中的总IL15-Fc浓度高于装载IL-15纳米凝胶的PMEL组(58.5ug的IL15-Fc)，在原始小鼠约高3488倍，并且在荷瘤小鼠中高3299倍。表1总结了复合IL15-Fc PK参数，图12描绘了平均(SD)IL15-Fc PK概况。
表1：PMEL+IL15-Fc组的复合IL15-Fc PK参数，在原始小鼠和荷瘤小鼠中(10ug剂量的IL15-Fc)
Figure BDA0003377443230001251
肿瘤生长的抑制
在第0天(给药当天)，肿瘤已达到约140mm3的平均体积。与载剂对照相比，在所有治疗组中，在给药后第4天观察到对肿瘤生长的统计学显著抑制(p＜0.0001)，并且这种差异随着时间的推移变得更加明显(图13，左图)。在研究第16天，在载剂对照组中仅剩余2/5只动物(由于广泛的肿瘤负担而处死了其他动物)，但是在每个治疗组中剩余了4/5只动物。载剂对照组中的肿瘤体积与所有其他组均显著(p＜0.0001)不同。PMEL组的肿瘤体积显著(p＜0.05)大于装载IL-15纳米凝胶的PMEL和PMEL+IL15-Fc组的肿瘤体积。在第16天，PMEL+IL15-Fc和装载IL-15纳米凝胶的PMEL组中肿瘤生长的抑制作用彼此不同(图13，左图和右图)。在给药后第1、4、10和16天，在处死后(n＝2-5，每个组，每个时间点)称量肿瘤。肿瘤重量示于图14。
在研究指定的终点之前，发现一些动物濒死或死亡。这些包括在载剂对照(共4只：第9天1只，第10天1只，第14天2只)，PMEL组(共2只：第2天1只，第6天1只)，PMEL+IL15-Fc组(共2只：第9天1只，第11天1只)和装载IL-15纳米凝胶的PMEL组(共2只：第9天1只，第16天1只)中的小鼠。这些不被认为与治疗有关，因为它们在组间分布，并在载剂对照中具有最高数量(n＝4)。最后，与PMEL相比，装载IL-15纳米凝胶的PMEL组相关的濒死或死亡的动物没有差异。
该研究的主要发现总结如下。
1.装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞在10x106个细胞的给药剂量下具有良好的耐受性。
2.与载剂对照相比，PMEL，PMEL+IL15-Fc和装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞均导致肿瘤生长抑制。与PMEL相比，PMEL+IL15-Fc和装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞的抑制作用更高。
3.使用PMEL或装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞均未观察到毒理学相关的临床化学参数变化。用PMEL+IL-15 Fc观察到一些变化。
4.在任何时间点，使用PMEL或装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞均未检测到血清IFN-γ，TNF-a或IL-6的变化。使用PMEL+IL15-Fc在24小时观察到血清IFN-γ和TNF-a的显著变化。在2小时(仅非荷瘤(原始)小鼠)和24小时，PMEL+IL15-Fc使IL-6升高。
5.与在PMEL+IL15-Fc组中检测到的水平相比，装载IL-15纳米凝胶的PMEL组中的IL15-Fc血清水平低3000倍以上，对应于与PMEL+IL15-Fc组相比，无体重减轻，CBC和内源性免疫细胞(CD8+，NK1.1+和CD4+细胞)无明显变化，降低的IFN-γ血清水平和相关药理变化。
实施例16：将装载IL-12系连融合体和装载IL-15纳米凝胶的T细胞组合，利用不同的机制增强抗肿瘤活性
背景：白细胞介素-15(IL-15)和白细胞介素-12(IL-12)作为免疫调节剂发挥着不同的作用。IL-15诱导T细胞记忆，支持CD8+T和NK细胞的存活、激活和增殖。IL-12促进T细胞的细胞毒性和肿瘤微环境中的先天免疫应答。这两种细胞因子都被探索作为癌症免疫疗法，但由于严重的副作用，临床成功受到限制。为了限制全身性毒性，如本文所述，开发了包括表面装载免疫激动剂的T细胞疗法。对多种肿瘤抗原有特异性的多靶点T细胞(MTC)是由患者单采(apheresis)产生的。细胞因子被系连在MTC上，以支持MTC在过继转移到患者体内后的持久性和活性，同时限制全身性细胞因子的暴露。这项研究评估了表面装载IL-15纳米凝胶和IL-12系连融合体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的组合，以利用它们互补的生物学特性获得卓越的疗效。
方法：对MART-1抗原有反应性的CTL是由健康供体(MART-1 CTL)产生的。接下来，评估了装载IL-12系连融合体、IL-15纳米凝胶或两者的MART-1 CTL的扩增和对表达MART-1的SKMEL-5黑色素瘤细胞的细胞毒性。此外，对B16-F10黑色素瘤抗原gp100有反应性的鼠PMEL CD8+T细胞被装载IL-12系连融合体、IL-15纳米凝胶或两者，并评估其体外扩增、活化和对B16-F10黑色素瘤细胞的细胞毒性，以及在B16-F10荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性。
结果：装载IL-15纳米凝胶促进了MART-1 CTL的增殖，并在一段时间内保持抗原反应性。装载IL-12系连融合体的MART-1 CTL显示出增强的IFN-γ分泌和细胞毒性，特别是在低效应物∶靶标比例下。装载IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶的MART-1 CTL的组合进一步增强了T细胞的扩增、IFN-γ分泌和细胞毒性。类似地，与单独装载的T细胞相比，装载了IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶的鼠PMEL T细胞的组合导致了持久的T细胞激活，改善了记忆，并增强了细胞毒性。装载IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞共同给予B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠，其耐受性良好，体重损失极小且可逆，并能引起卓越的抗肿瘤活性。
结论：将IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶模块化系连(Modular tethering)至T细胞上，发挥其作为免疫调节剂的不同作用机制，意外地产生了协同作用，在临床前模型中，抗肿瘤活性增加，而没有明显的毒性。
1.装载IL-15的纳米凝胶的PMEL T细胞与装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞的组合产生了意想不到的协同作用
白介素-15(IL-15)激活并扩增CD8+T细胞和NK细胞，而不是免疫抑制性Treg细胞。因此，IL-15对肿瘤免疫疗法是一种有吸引力的资源，但其全身给药受到免疫激活和毒性的限制。为了限制IL-15的全身暴露，我们开发了IL-15纳米凝胶，一种化学交联的本文公开的IL-15/IL-15 Rα/Fc异二聚体(IL15-Fc)多聚体。在过继细胞转移(ACT)之前，IL-15纳米凝胶被装载到肿瘤反应性T细胞上。这种新的治疗方法使得IL-15纳米凝胶以全身性IL15-Fc无法达到的浓度装载到细胞中，引起自身分泌T细胞活化和扩增，同时限制全身暴露和相关毒性。该T细胞疗法的抗肿瘤活性已经受到T细胞扩增和激活不足的限制。本文公开的是包括IL-15纳米凝胶与IL-12系连融合体组合以克服这些限制的组合疗法。
具体地，如图13A中所示，IL-15纳米凝胶(或指DP-15或深IL-15(Deep IL-15))是指以下的多聚体：人IL-15受体α-sushi-结构域-Fc融合同源二聚体与两个缔合的IL-15分子(IL15-Fc)，通过可裂解的交联剂(参见，例如，PCT申请号PCT/US2018/049594，以参考的方式纳入本文)连接，且非共价包覆有聚乙二醇(PEG)-聚赖氨酸30嵌段共聚物(PK30)。更具体地，IL-15纳米凝胶是指以下的多聚体：人IL15-Fc单体，通过可水解的交联剂(CL17)连接，且非共价包覆有聚乙二醇(PEG)-聚赖氨酸30嵌段共聚物(PK30)。IL15-Fc单体由两个亚基组成，每个亚基由与非共价结合至IL-15分子的IL-15受体α-sushi-结构域融合的效应减弱的IgG2 Fc变体组成。装载IL-15纳米凝胶的T细胞是通过装载过程生成的，在该过程中，靶细胞与高浓度的IL-15纳米凝胶共孵育。通过此过程，IL-15纳米凝胶通过静电相互作用与细胞缔合，并被内化以产生IL-15纳米凝胶的细胞内储库。从这些储库中，IL-15纳米凝胶通过交联剂的水解缓慢释放生物活性IL15-Fc。IL15-Fc的这种延长释放促进了装载IL-15纳米凝胶的T细胞的增殖和存活，从而提供了靶向的、可控制的和时间依赖性的免疫刺激。
如图13B所示，IL-12系连融合体(可称为DP-12或深IL-12)由IL-12 p70分子与抗-CD45抗体抗原结合片段(Fab)融合组成。通过该Fab，IL-12系连融合体被系连至MTC表面的CD45分子上。携带表面系连的IL-12系连融合体的T细胞(装载IL-12系连融合体T细胞)利用细胞因子IL-12以几种不同和互补的方式增强免疫应答的能力。这些方式包括产生干扰素-γ(IFN-γ)的T辅助1(TH1)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞的分化或扩增；主要组织相容性复合物1类(MHCI)分子对CTL的抗原呈递的诱导；免疫抑制性骨髓细胞的重编程；以及抗血管生成作用。装载IL-12系连融合体的T细胞将IL-12系连融合体转运至肿瘤，在那里它可以以旁分泌方式发挥作用。
本研究的目的是：(1)评估装载IL-12系连融合体、IL-15纳米凝胶或两者组合(作为混合细胞群；装载IL-12系连融合体或IL-15纳米凝胶的T细胞；或在两种细胞因子都被装载在同一细胞上的情况下，共载)的人类和小鼠T细胞的体外细胞毒性；(2)评估装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞(“DP-15PMEL”)和装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞(“DP-12PMEL”)组合的体内抗肿瘤活性。
对于组合的体内评估，如下表2所示，对以下组进行了评估：载剂对照组(G1)，单剂量装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞的剂量递增组(1、2.5和5×106)(G2-4)，将DP-12PMEL T细胞(1、2.5或5×106)加入到恒定量的装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞(10×106)的三个组合组(G5-7)。此外，将PMEL T细胞(1、2.5或5×106)加入到恒定量的装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞(10×106)中的三个组合组(G8-10)作为第5-7组的对照。
表2：处理组
Figure BDA0003377443230001291
Figure BDA0003377443230001301
读数包括抗肿瘤活性、体重变化、血液的流式细胞术评估内源性免疫细胞(CD4、CD8、NK和Treg)和转移的PMEL T细胞(计数、表型、激活、增殖)的变化、血清血液化学(给药后第4天和第11天)、全血细胞计数(CBC，给药后第1天和第4天)和全身性细胞因子释放(Luminex；给药后第1天和第4天)。此外，在给药后第4天和研究结束时(D39，来自治疗组的6只小鼠/组仍在研究中)，对4-5只小鼠/组(第2和第3组除外)进行总体病理学评估。研究时间线如图14所示。
如图15所示，装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞(10×106)与装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞以1、2.5和5×106的剂量共同给药的组合组的抗肿瘤活性与装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞与PMEL T细胞以对应剂量1、2.5和5×106个T细胞共同给药相比显示出显著改善的抗肿瘤活性(图15)。然而，在装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞的最高剂量(5×106)的组合组的情况下，该组合与装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞单药同样有效(图15，右图)。
该组合的耐受性良好，仅在给药后第3天观察到轻微的体重减轻，到给药后第7天完全恢复到基线水平(图16)。
用药后第4天和研究结束时(第39天)的总体病理学评估显示，任何治疗组都没有严重病灶。所有治疗组的肺部和脑部重量都与载剂对照处理小鼠相当。与载剂对照组相比，组合组的脾脏重量有所增加(图17，左图)。研究结束时，各治疗组的脾脏重量相当，与年龄匹配的载剂对照处理小鼠的脾脏重量相似(图17，右图)。
如图18A所示，在给药后第4天或第11天，组合组(5-7组)和匹配细胞剂量(8-10组)的组合对照组之间的临床化学参数没有观察到统计学显著的变化。流式细胞仪分析显示，在总体PMEL T细胞移植或内源性T细胞(CD4、CD8、NK和Treg)方面，组合组(5-7组)相对于匹配细胞剂量(8-10组)的组合对照组之间没有明显差异。随着时间的推移，对PMEL T细胞表型的分析显示，在相应的细胞剂量下，与组合对照组(8-10组)相比，组合组(5-7组)的效应记忆T细胞(Tem)相对增加。
在抗原存在的情况下，IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶共载在PMEL T细胞上导致持久性的T细胞活化和改善记忆表型并增强体外细胞毒性(图18B)。
材料和方法
IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶制备
根据前述实施例构建IL-12系连融合体并用于引发PMEL T细胞。IL-15纳米凝胶通过用交联试剂孵育IL15-Fc来合成。
B16-F10肿瘤建立和肿瘤测量
在研究第-10天，将B16-F10黑色素瘤肿瘤细胞(0.8x106)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠(杰克逊实验室)的剃毛的右胁腹中。B16-F10荷瘤小鼠在给药前一天用环磷酰胺(4mg/小鼠)处理。记录体重并每周用卡尺测量肿瘤尺寸(在缩写列表中定义的长度[L]和宽度[W])2至3次。使用以下公式计算肿瘤体积：W2xLxπ/6。
PEML细胞的分离和扩增
从12只(7只雌性和5只雄性)转基因PMEL小鼠(杰克逊实验室，缅因州巴港)的脾脏和淋巴结(腹膜，腋窝和宫颈)中分离出PMEL细胞。用GentleMACS Octo Dissociator(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech)，加利福尼亚州奥本)处理脾脏和淋巴结，并通过40μm过滤器。离心洗涤细胞，并使用IMACS原初CD8a+分离试剂盒(美天旎生物技术公司)和MultiMACS细胞24块(美天旎生物技术公司)和分离器(美天旎生物技术公司)按照制造商的操作规程纯化CD8a+细胞。通过流式细胞术确认了CD8a+细胞的纯度。
分离后(D0)，250×106个纯化的PMEL T细胞以1.0x106/mL被重悬在含有10％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(Pen/Strep)(1％)、L-谷氨酰胺(1％)、胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS；1％)和β-巯基乙醇(BME，50μM)的洛斯维公园纪念研究所1640培养基(RPMI-1640)中，并接种到6个包覆抗-CD3和抗-CD28的6孔组织培养板中(5×106个细胞/孔)。细胞在37℃和5％CO2下孵育24小时。接种后24小时(D1)加入鼠IL-2(20ng/mL)和鼠IL-7(0.5ng/mL)。在D2和D3，对细胞计数并用含有鼠IL-21(25ng/mL)的新鲜培养基稀释至0.2×106个细胞/mL的浓度。在D4收集细胞并以100×106或20x106个PMEL T细胞/mL重悬在PMEL T细胞培养基中。
装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞的制备
将PMEL细胞(100x106个细胞/mL)与等体积的IL-15纳米凝胶(1.36mg/ml)混合，并在37℃旋转孵育1小时，以产生装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞。通过离心(500g)洗涤装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞(3X，首先用培养基，然后用HBSS洗涤两次)并计数。装载IL-15纳米凝胶的PMEL细胞被重悬为终浓度100x106个细胞/mL，以注射到第5-10组体内(100ul/小鼠，相当于10x106个装载IL-15纳米凝胶的PMEL T细胞)。
装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞的制备
将PMEL细胞(20.0x106个细胞/mL)与等体积的小鼠IL-12系连融合体(250nM)混合，并在37℃旋转孵育30分钟，以产生装载IL-12系连融合体的PMEL细胞。通过离心(500g)洗涤装载IL-12系连融合体的PMEL细胞(3X，用培养基洗涤两次，然后用HBSS洗涤一次)并计数。然后装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞被重悬为10、25和50x106个装载IL-12系连融合体的PMEL T细胞用以注射在第2-7组体内，如上表所示；100ul/小鼠)。
血液收集
活体血样(～80μL)是通过颌下出血收集的。末次血液采集(D4)是通过CO2窒息后心脏穿刺进行的。
全血样品
全血被收集在涂有EDTA的试管中(格瑞纳生物科技公司，北卡罗来纳州门罗(Greiner Bio-One，Monroe，NC))用于流式细胞术和CBC分析。血样被运送到IDEXX实验室(马萨诸塞州格拉夫顿(Grafton，MA))用于CBC分析。
血清制备(用于Luminex和血液化学)
对于血清样品，血液被收集到含有凝血活化剂(clot activator)(格瑞纳生物科技公司，北卡罗来纳州门罗)的试管中。试管以10,000g离心，将血清上清液转移到预先标记的冷冻管中(格瑞纳生物科技公司，北卡罗来纳州门罗)，并储存在-80℃以供未来分析。样品被运送到IDEXX实验室(马萨诸塞州格拉夫顿)用于血液化学分析。
流式细胞术染色
将每只动物的50μl血液转移到96深孔板的一个孔中。使用低渗缓冲液裂解红细胞，并进行2次洗涤。在红细胞裂解步骤中，将计数珠加入血液中。剩余的细胞在染色缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA于PBS中)中洗涤3次。细胞被重悬在含有染色抗体的主混合物中(在染色缓冲液中1∶100稀释)。流式细胞术方案中使用的试剂列于下表3。细胞在室温下与抗体混合物孵育10分钟，避光。
为了进行细胞内抗原染色，细胞在染色缓冲液中洗涤3次，重悬在固定/透化溶液(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马塞柱塞州)中，并孵育过夜(4℃)。次日，离心样品，并在透化缓冲液中洗涤3次。用于细胞内Ki67和FoxP3标志物的抗体在室温下与透化的细胞孵育30分钟，避光并在染色缓冲液中洗涤2次。
在FACSCelesta(BD公司(Becton-Dickinson)，新泽西州富兰克林湖市)上收集流式细胞术的数据并在FlowJo中分析。
表3：流式细胞术试剂
Figure BDA0003377443230001341
2.装载IL-15纳米凝胶的MART-1 T细胞协同装载IL-12系连融合体的MART-1 T细胞
使用呈递免疫显性肽的树突细胞(DC)训练人T细胞，从MART-1生成靶向MART-1的T细胞。训练好的T细胞被装载人IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶，以产生装载IL-12系连融合体和装载IL-15纳米凝胶的靶向MART-1的T细胞，然后测试对SKMEL5(一种表达MART-1的人类癌症细胞系)的细胞毒性，无论是单独还是1∶1组合的IL-12系连融合体∶IL-15纳米凝胶。还测试了IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶共载的靶向MART-1的T细胞。通过比色法活细胞定量测量多种效应物∶靶标比率下的细胞毒性，并通过流式细胞术表征T细胞以跟踪与SKMEL-5细胞共培养的T细胞与单培养的T细胞相比数量和抗原反应性。
在第0天，MART-1细胞为82.6％特异性。大多数细胞具有效应记忆表型(CD45RO+CCR7-)。与非特异性MTC相比，抗原特异性MART-1 MTC在第0天被高度激活(CD25+CD69+)(数据未显示)。
随着时间变化过程(第0-6天)，单体、组合和共载疗法在抗原暴露时促进MART-1细胞增殖。IL-15纳米凝胶、组合(混合)和共载治疗在细胞扩增过程中保留了抗原特异性，同时IL-12系连融合体以较小的作用幅度保留了抗原特异性(图19)。IL-12系连融合体、组合(混合)和共载组显示了SKMEL-5的细胞毒性大大增强，特别是在低E∶T比率和较晚的时间点(图20)。
由IL-15纳米凝胶驱动的细胞增殖，组合(混合)和共载治疗导致了类似的T细胞表型和活化状态。IL-15纳米凝胶、组合(混合)和共载组具有类似的细胞扩增概况、活化状态和表型(图21)。为了开始理解IL-12系连融合体/共载/混合组中高得多的细胞毒性，对细胞培养物上清液中分泌的干扰素γ(IFN-伽马)进行了量化(图22)。IL-12系连融合体、组合(混合)和共载组的IFN-γ产生增强，而装载IL-15纳米凝胶的MART-1细胞产生IFN-γ水平低。组合(混合)和共载的MART-1细胞在第1天和第6天之间持续产生IFN-γ，即使在E∶T 10∶1的比率下，所有肿瘤细胞在第1天被杀死。
在多种E∶T比率和处理组中，早在第1天或第3天就观察到几乎完全杀死SKMEL-5。细胞增殖在第3天达到峰值(图23A)，反应性MART-1细胞群在扩增期间维持(图21)。在第3天，表面装载的MART-1 T细胞具有＞80％的效应记忆表型，并且具有＞80％的CD25+CD69+活化状态。共培养的第3天，将T细胞从共培养板上移除，并转移到新鲜的SKMEL-5培养液中，以再次攻击它们进行细胞毒性定量。再次攻击三天后，特别是在E∶T比率较低的情况下，与装载单独的IL-12系连融合体或IL-15纳米凝胶的T细胞相比，组合(混合)和共载的MART-1细胞显示出增强的SKMEL-5细胞毒性。
图23B：IL-12系连融合体驱动Pmel细胞的细胞毒性。协同装载处理改进了装载IL15纳米凝胶的Pmel细胞的细胞毒性。如图23B所示，到第2天，IL-12系连融合体和共载组实现肿瘤完全消退。IL-12系连融合体驱动IFNg产生和细胞毒性活性。到第5天，在对照组和IL-15纳米凝胶组观察到肿瘤的生长。
图23C：在低E∶T比例下，共载介导的靶细胞的细胞毒性。如图23C所示，随着E∶T比例的降低，IL-15纳米凝胶失去了长期细胞毒性优势。相比单一治疗，共载IL15纳米凝胶+IL12 TF条件显示出诱导的持久性的细胞毒性优势。
图23D：IL-15纳米凝胶+IL-12 TF的组合：与单独药剂相比活性提高。如图23D所示，IL-15纳米凝胶、IL-12 TF和抗原呈递显示出令人惊讶的PMEL T细胞在循环中的长期持久性增强。共载(15M)和组合组(IL-15纳米凝胶10M+IL-12TF 5M)显示出相当的抗肿瘤活性。与单独药剂相比，组合组显示出改进的活性。
图23E：组合治疗使抗原特异性细胞持续扩增并增强细胞毒性。如图23E所示，IL-15纳米凝胶挽救了装载IL-12 TF的MTC的抗原特异性细胞扩增。IL-12 TF驱动IFNg的产生，并增强装载IL-15纳米凝胶细胞的细胞毒性。
图23F：在低水平的IL-15纳米凝胶和IL-12 TF的共载细胞上观察到有益的协同作用。如图23F所示，确定共载样品的IL-15纳米凝胶和IL-12 TF的最优装载剂量，每种单一疗法的较低剂量可能足以达到相同的协同作用。
图23G：相对于IL-12 TF和IL-15纳米凝胶，在相同的总细胞数(15M)下，组合和共载显示出改进的活性。*IL-12 TF 15M组：变异性是由1只小鼠w比其他小鼠更早的肿瘤逃逸而定的。
材料和方法
靶向MART-1的T细胞生成
健康供体的单采由HemaCare收集和运送，这些细胞随后被称为CTL075。使用Elutra设备(Terumo BCT)将单采按大小和密度分离成六种组分。富含T细胞的组分(第3组分)用Sepax C-Pro设备(GE)将其体积缩小到HBSS中，在可控速率冷冻机(CRF)中用20％的HBSS和80％的CryoStor10(CS10，生物生命解决方案有限公司(BioLife Solutions))冷冻，然后转入液氮。
通过cellometer鉴定富含单核细胞的组分，如通过流式细胞仪确定的CD14+细胞百分比最高的一种或多种Elutra组分。在使用AO/PI染色和cellometer采集鉴定和计数后，活细胞被洗入单核细胞分化培养基(RPMI-1640，含2％人AB血清和1％GlutaMAX)。对富含单核细胞的细胞进行计数，将1.16×108个细胞/袋转移到细胞分化袋(美天旎生物技术公司)中。使用含有IL-4(750IU/mL)和GM-CSF(500IU/mL)的单核细胞分化培养基使体积达到20mL。接下来，所有的细胞被置于37℃和5％CO2的培养箱中过夜。
24小时后，通过加入80mL含有IL-1B(1400IU/mL)、IL-6(1100IU/mL)、TNF-α(1000IU/mL)和PGE-2(0.352μg/ml)的成熟混合物的单核细胞分化培养基，将富含单核细胞的细胞成熟为成熟树突细胞(mDC)。接下来，细胞在37℃/5％CO2下孵育48小时。
通过500g离心5分钟收获成熟的DC，洗入T细胞培养基(CTS AIM-V SFM[赛默飞世尔科技公司，加利福尼亚州旧金山]，含有5％人AB血清和1％GlutaMAX)。然后将细胞稀释到5.0×106个细胞/mL，并将重建的MART-1肽(ELAGIGILTV；新英格兰肽公司(New EnglandPeptide)，马萨诸塞州加德纳)以0.1μM加入到培养物中。细胞被置于培养箱中1小时。剩余的mDC通过离心沉淀、洗涤、重新沉淀，并在20％的HBSS和80％的CS10中冷冻。
此时，来自富含T细胞组分的细胞被手动解冻到T细胞培养基中，离心以去除DMSO，并转移到PL07袋(奥利金生物医学公司(Origen Biomedicfl)，得克萨斯州奥斯丁)。然后用T细胞培养基将细胞稀释到1.0×106个细胞/毫升，并加入引发细胞因子。接下来，按mDC比T细胞1∶10的比率向T细胞中加入mDC，并在37℃/5％CO2下孵育4天。
孵育四天后，对细胞计数、沉淀并重新悬浮在新鲜的T细胞培养基中。然后将细胞在含有引发细胞因子的T细胞培养基中稀释至1.0×106个细胞/mL，放入PL07袋中，在37℃/5％CO2下孵育3天。在T细胞培养的第7天，沉淀细胞，重悬在新鲜的T细胞培养基中，稀释至1.0×106个细胞/毫升，接种到PL07袋中，并加入扩增细胞因子。之前冷冻的mDC被手动解冻到T细胞培养基中，如上所述用MART-1肽装载，并以mDC比T细胞1∶10的比率直接放入T细胞培养中。然后培养物在37℃/5％CO2下孵育直到第11天。
在第11天，计数细胞，培养物在含有扩增细胞因子的T细胞培养基中调整到1.0×106个细胞/毫升，然后继续在37℃/5％CO2下孵育。第14天，收集细胞，计数，并将其洗入T细胞培养基，用于IL-12系连融合体装载和共培养试验。
人IL-15纳米凝胶和IL-12系连融合体装载到靶向MART-1的T细胞上
在1.5ml Eppendorf管中，以20-40x106个细胞的规模将人IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶装载到靶向MART-1的T细胞上。通过500×g离心5分钟收获靶向MART-1的T细胞，在HBSS中以1×108个细胞/mL重悬，并与IL-12系连融合体或IL-15纳米凝胶以2倍最终装载浓度1∶1混合。将IL-15纳米凝胶装入HBSS溶液中，最终浓度为50×106个/mL的细胞、0.375mg/mL的IL-15纳米凝胶，在37C孵育1小时。在HBSS+10％HSA溶液中将IL-12系连融合体装载到靶向MART-1的T细胞上，细胞最终浓度为25x106/mE，IL-12系连融合体为125nM，并在37C孵育30分钟。在HBSS+10％HSA溶液中将IL-12系连融合体装载到装载IL-15纳米凝胶的靶向MART-1的T细胞上，细胞最终浓度为25x106个/mL，IL-12系连融合体为125nM，并在37C孵育30分钟，创建共载IL-12系连融合体/IL-15纳米凝胶T细胞。接下来，细胞被初步稀释洗涤，500g离心5分钟，并用T细胞AIM5培养基进行第二次洗涤。将共载的T细胞在T细胞培养基中1∶4稀释，计数，在T细胞培养基中调整到5×104个细胞/mL，然后系列稀释并接种在共培养试验中。
MART-1特异性，IL-12系连融合体和IL-15纳米凝胶细胞表面装载的评估，和通过流式细胞术T细胞计数
如上所述，第0天，IL-12系连融合体或IL-15纳米凝胶被装载到靶向MART-1的T细胞上。装载后，每个装载条件1×104个T细胞一式三份转移到96孔板上。制备了两个这样的板。
一个板用以下染色：
BV421 CD25(0.5uL/样品)
BV711 CD69(0.5uL/样品)
PE/Cy7 CD62L(0.5uL/样品)
FITC CD4(0.5uL/样品)
BV605 CD45RO(0.5uL/样品)
BV785 CD8(0.5uL/样品)
HLA-A*02：01 MART-1四聚体(1∶100稀释)(MBL，马萨诸塞州沃本)
PercpCy5.5 IL137(1∶100稀释)
AF647抗-IL12(1∶100稀释)
AF700 CD3(0.5uL/样品)
APC-Cy7 CCR7(1uL/样品)
Zombie Aqua(1∶500稀释)
除非另有说明，试剂来自白乐津公司(白乐津公司(Biolegend)，加利福尼亚州圣迭戈)。对CD25、CD69、CD62L、CD137、CCR7和CD45RO进行荧光扣除对照(Fluorescence MinusOne control)。
另一个板用以下染色：
FITC CD4(0.5uL/样品)
BV711 CD8(0.5uL/样品)
BV785 CD8(0.5uL/样品)
PE IL15(1∶100稀释)
AF647抗-IL12(1∶100稀释)
AF700 CD3(0.5uL/样品)
Zombie Aqua(1∶500稀释)
在平底96孔板共培养或平行单培养的第1、3或4和6个时间点，将培养基上清液中的所有T细胞从T细胞单培养板和与靶细胞共培养板中都转移到新的U底96孔板。平底板用于MTT试验(见下文)。U底板在500xg旋降5分钟。收集培养基上清液用于IFNγ ELISA(见下文)：
BV421 CD25(0.5uL/样品)
PE/Cy7 CD62L(0.5uL/样品)
FITC CD4(0.5uL/样品)
BV711 CD8(0.5uL/样品)
BV605 CD45RO(0.5uL/样品)
BV785 CD8(0.5uL/样品)
PE四聚体(1∶100稀释)
PercpCy5.5 IL137(1∶100稀释)
AF647抗-IL12(1∶100稀释)
AF700 CD3(0.5uL/样品)
Zombie Aqua(1∶500稀释)
在洗掉抗体染色后，每孔加入5μL染色缓冲液(含2mM EDTA和2％FBS的PBS)中的CountBright计数珠(生命技术公司(LifeTechnologies))。
在FACSCelesta流式细胞仪(碧迪公司(BectonDickinson))上使用FACSDiva软件(碧迪公司)对分析样品。
肿瘤细胞裂解的评估
MART-1阳性人癌细胞系SKMEL-5按照ATCC的建议进行保持。为了直接评估抗原特异性T细胞的细胞毒性，SKMEL-5细胞以1×104个细胞/孔的量被接种于在96孔板中的目标细胞培养基(DMEM，含10％FBS，Pen/Strep)中。在37℃下用微孔膜覆盖过夜孵育后，去除目标细胞培养基，在T细胞培养基中加入200μL/孔的T细胞悬液进行系列稀释，在一个实验中，效应物∶靶标的比率为1∶1、1∶2、1∶5和1∶10，在一个重复的实验中为10∶1、1∶1和1∶10。包括仅有目标细胞的条件作为阴性对照。效应细胞的条件是：(1)单独的MART-1特异性T细胞，(2)装载IL-12系连融合体的MART-1特异性T细胞，(3)装载IL-15纳米凝胶的MART-1特异性T细胞，(4)装载IL-12系连融合体的MART-1特异性T细胞和装载IL-15纳米凝胶的MART-1特异性T细胞的1∶1组合，以及(5)IL-12系连融合体/IL-15纳米凝胶-共载MART-1特异性T细胞。含10％DMSO的培养基中只有目标细胞作为阴性对照，没有T细胞的细胞毒性。还在靶向MART-1的T细胞单体培养板上接种200μL/孔的相同T细胞悬液。加入T细胞后，板以100g旋降1分钟，在37℃下用微孔膜覆盖孵育。技术重复一式三份用于比色细胞毒性研究。
1、3或4和6天后，将含有T细胞的培养基上清液转移到新的96孔板上，用于流式分析(如上所述)。用PBS仔细清洗一次目标细胞。加入0.5mg/mlMTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，西格玛)在目标细胞培养基中的溶液(100μL/孔)，板在37℃下孵育1.5小时，同时活细胞中形成紫色的甲臜(formazan)晶体。1.5小时后，除去含有MTT的培养基，用PBS仔细清洗细胞。加入DMSO(100μL/孔)以溶解甲臜晶体。在Tecan平板阅读器上读取570nm的吸收率。为了评估目标细胞数量，减去背景信号(来自培养基孔中0％的DMSO活体)，并将数值归一化到只含有SKMEL-5目标细胞(但没有T细胞)的孔的100％活体数值。
对于再次攻击试验条件，4天后将含有T细胞的培养基上清液转移到含有SKMEL-5的新平底板上，用新的肿瘤共培养目标再次攻击T细胞。当天仍有重复的平板，以继续原来的时间过程，直到第6天。
IFNγ分泌的评估
在第1天、第4天和第6天时间点上，根据制造商的说明，通过人IFNγ定量ELISA试剂盒(R&D系统公司(R&D Systems)，明尼苏达州明尼阿波利斯)，保存从流式细胞仪(见上文)的细胞沉淀中除去的培养物培养基上清液，用于ELISA量化IFNγ。样品在提供的稀释液中以1∶4和1∶10的比率稀释到检测的线性范围内的浓度。吸收率在Tecan Infinite M200平板阅读器上测量。
用FlowJo v10软件(BD生命科学公司，加利福尼亚州圣迭戈)分析流式细胞术数据，并在GraphPad Prism v7.0中制作图表。ELISA分析在GraphPad Prism v7.0中完成。
修改
对本公开所述方法和组合物的改进和变动对本领域技术人员是显而易见的，而不偏离本公开的范围和精神。虽然已结合具体的优选实施方案对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方案。实际上，本公开所属领域的相关领域的技术人员意图和理解对所描述的用于实施本公开的方式的各种修改，这些修改落入由所附权利要求所表示的本公开的范围内。
通过引用纳入
本说明书中提到的所有专利和公开通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的专利或公开专门和单独地通过引用纳入本文那样。PCT国际申请号：PCT/US2018/040777、PCT/US2018/040783、PCT/US2018/040786、PCT/US2018/049594、PCT/US2018/049596和PCT/US2019/050492通过引用全文全部纳入本文。

Claims (20)

1.一种治疗性(例如，癌症免疫疗法)组合物，其包括：表面装载有多个蛋白纳米凝胶的第一免疫细胞和表面装载有多个免疫刺激融合分子(IFM)的第二免疫细胞。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，各蛋白纳米凝胶包括通过多个可生物降解交联剂彼此可逆交联的多个治疗性蛋白单体，其中所述蛋白纳米凝胶的直径通过动态光散射测量为30nm至1000nm，其中所述交联剂在给予有需要的对象后在生理条件下降解，以从所述蛋白纳米凝胶中释放所述治疗性蛋白单体，可选地，其中所述蛋白纳米凝胶进一步地包括表面修饰，例如聚阳离子，从而允许所述蛋白纳米凝胶与所述第一免疫细胞缔合。
3.如权利要求1所述的组合物，其中各IFM经工程改造以包含免疫刺激细胞因子分子和对所述第二免疫细胞表面抗原有亲和性的靶向部分(例如抗体或其抗原结合片段)，其中所述免疫刺激细胞因子分子可操作地连接到靶向部分。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一免疫细胞和所述第二免疫细胞是相同细胞。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一免疫细胞和第二免疫细胞是不同细胞，并分别向需要，例如癌症免疫疗法，的患者提供和给予(例如依次地)。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述治疗性蛋白单体包含一种或多种细胞因子分子和/或一种或多种共刺激分子，其中：
(i)一种或多种细胞因子分子选自IL-15，IL-2，IL-7，IL-10，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23，IL-4，IL-1α，IL-1β，IL-5，IFNγ，TNFa，IFNα，IFNβ，GM-CSF或GCSF；以及
(ii)一种或多种共刺激分子选自CD137，OX40，CD28，GITR，VISTA，抗-CD40或CD3。
7.如权利要求3所述的组合物，其中在IFM中，所述免疫刺激细胞因子分子选自IL-15，IL-2，IL-6，IL-7，IL-12，IL-18，IL-21，IL-23，或IL-27或其变体形式中的一种或多种，以及其中所述抗原选自CD45，CD4，CD8，CD3，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD25，CD127，CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD197，CD38，CD27，CD196，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CD84，CD229，CCR1，CCR5，CCR4，CCR6，CCR8，CCR10，CD16，CD56，CD137，OX40或GITR中的一种或多种。
8.一种用于提供癌症免疫疗法的方法，其包括：
向有需要的患者给予装载了第一组蛋白纳米凝胶和第二组免疫刺激融合分子(IFM)的多个免疫细胞。
9.一种用于提供癌症免疫疗法的方法，其包括：
向有需要的患者给予装载了多种蛋白纳米凝胶的第一组免疫细胞；以及
给予所述患者第二组免疫细胞，各自装载了多个免疫刺激融合分子(IFM)。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述癌症免疫疗法用于治疗选自以下的癌症：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肝癌、食道癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、胰腺癌、睾丸癌、脑癌和骨癌，白血病、慢性淋巴细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、子宫内膜癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤、喉癌、淋巴瘤；神经母细胞瘤；唇、舌、口和咽癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；甲状腺癌；和子宫癌。
11.一种用于诱导人CD8+T细胞在人免疫治疗方案中协同扩增的方法，所述方案由共同给予至少两种免疫激动剂组成，所述第一免疫激动剂包括装载IL-12系连融合体的T细胞，和第二免疫激动剂包括装载IL-15纳米凝胶的T细胞，其中这种免疫激动剂的共同给予导致所述人CD8+T细胞的协同扩增。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述装载IL-12系连融合体的T细胞、装载IL-15纳米凝胶的T细胞或这两种T细胞对一种或多种肿瘤相关抗原具有特异性。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是由选自下组的癌症表达的一种抗原：乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、结肠癌、胃癌、肝癌、食道癌、肾癌、喉癌、甲状腺癌、胰腺癌、睾丸癌、脑癌和骨癌，白血病、慢性淋巴细胞白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、子宫内膜癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内瘤、喉癌、淋巴瘤；神经母细胞瘤；唇、舌、口和咽癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；甲状腺癌；和子宫癌。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述IL-12系连融合体包括人源化的抗-CD45抗体或选自Fab、F(ab′)2、Fd和Fv的抗体片段。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述IL-15纳米凝胶包括多种交联的IL-15-Fc融合蛋白单体。
16.一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的哺乳动物同时给予协同的、治疗有效量的两种免疫激动剂，所述第一免疫激动剂包括装载IL-12系连融合体的T细胞，所述第二免疫激动剂包括装载IL-15纳米凝胶的T细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症治疗进一步包括抗增殖细胞毒性剂，单独或与放射疗法组合。
19.如权利要求16所述方法，其中第一和第二免疫激动剂的给予比率为1∶1、1∶2、1∶3、1∶41∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70；1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95、1∶100、1∶120、1∶130、1∶140、1∶150、1∶160、1∶170、1∶180、1；190、1∶200、1∶500、1∶1000.1∶5000、1∶10,000、1∶100,000、2∶3、3∶4、2∶5、3∶5、3∶10、7∶10、9∶10、2∶15、4∶15、6∶15、7∶15、8∶15、11∶15、13∶15、14∶15、3∶20、7∶20、9∶20、11∶20、13∶20、17∶20、19∶20、1∶25、2∶25、4∶25、6∶25、7∶25、8∶25、10∶25、11∶25、12∶25、13∶25、14∶25、16∶25、17∶25、18∶25、19∶25、21∶25、22∶25、23∶25或24∶25的任一免疫激动剂与另一免疫激动剂的比率。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述第一和第二免疫激动剂中至少其一被给予的剂量为：约2x107个细胞/m2、4x107个细胞/m2、1x108个细胞/m2、1.2x108个细胞/m2、2x108个细胞/m2、3.6x108个细胞/m2、6x108个细胞/m2、1x109个细胞/m2、1.5x109个细胞/m2、106个细胞/m2、约5x106个细胞/m2、约107个细胞/m2、约5x107个细胞/m2、约108个细胞/m2、约5x108个细胞/m2、约109个细胞/m2、约5x109个细胞/m2、约1010个细胞/m2、约5x1010个细胞/m2或约1011个细胞/m2。
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