CN102625832A - 产生对多种肿瘤抗原或多种病毒特异的ctl细胞系 - Google Patents

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C·鲁尼
U·格德曼
J·维拉
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Baylor College of Medicine
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Abstract

本发明包括生成并应用细胞毒性T淋巴细胞的方法和组合物，所述淋巴细胞靶向多种病毒或对多种肿瘤抗原特异。在具体的实施方式中，所述生成方法使用某些细胞因子在活化T细胞群体中促进增殖并降低细胞死亡和/或使用具有透气膜的具体生物反应器。

Description

产生对多种肿瘤抗原或多种病毒特异的CTL细胞系
相关申请的交叉参考
本发明要求2009年8月24日提交的美国临时专利申请系列第61/236,261号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在NIH-NCI资助的P50 CA126752下由政府支持完成。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
本发明一般涉及细胞生物学、免疫学、分子生物学和医药领域。在具体实施方式中，本发明一般涉及癌症免疫治疗。
发明背景
预防和/或治疗免疫受损宿主中的病毒感染的多病毒特异T细胞
病毒感染造成所述免疫受损宿主如接受异源干细胞移植(SCT)的患者的显著发病率和死亡率。由持续性疱疹病毒如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒，以及由呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、副流感病毒和流感病毒引起的感染已熟知，而近期更理解了由腺病毒(Adv)、BK病毒和人疱疹病毒6引起的感染的重要性(Kim等，2007；Myers等，2007；Kadakia等，1996；Comoli等，2006；de Pagter等，2008)。尽管药物试剂是一些感染的标准疗法，但其有显著的毒性、生成抗性变体且经常无效。
恢复病毒特异性免疫的免疫治疗策略提供了有吸引力的治疗替代法。已用EBV转化的类淋巴细胞系(EBVLCL)作为抗原来源制备了源于供体的EBV特异细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，且异基因造血SCT(HSCT)(Heslop等，1996；Comoli等，2007)(Heslop等，2010)后输注这些细胞系以最小的毒性阻止并治疗了EBV驱动的B细胞淋巴增殖性疾病(EBV-LPD)(Cruz等，2010)。
相似地，用CMV肽、裂解物或载体转导的抗原呈递细胞(APC)生成的过继转移性供体衍生CMV特异CTL能重建针对该病毒的免疫应答并保护患者抵御CMV疾病的发展或之后复发(Riddell等，1992；Walter等，1995；Einsele等，2002a；Einsele等，2002b；Peggs等，2003；Micklethwaite等，2008；Micklethwaite等，2007)。最近，通过用表达CMV-pp65的嵌合腺病毒载体作为转基因遗传修饰单核细胞和EBV-LCL来生成靶向EBV、CMV和Adv的三病毒(trivirus)反应性CTL。
输注到HSCT受体中后，少至2×105/kg的三病毒特异CTL增殖数个数量级且看来会保护所述受体抵御由所有三种病毒产生的疾病(Leen等，2006)。虽然有这些振奋人心的临床结果，T细胞免疫治疗的广泛实施受到以下限制：(i)生成CTL通常需要的所述感染性病毒材料(EBV/CMV/Adv)，(ii)制造用于抗原呈递的临床级别载体的成本，和(iii)消除同种异源反应性T细胞需要的长时间培养(10-12周制造过程)，和其随之对技术技能和时间的需求。为了解决所述后期问题，一些小组评价了更快速的选择抗原特异性T细胞的方法。
使用人白细胞抗原(HLA)肽四聚体然后用磁珠选择，Cobbold和同事选择了来自干细胞移植供体血液的CMV特异CD8+T细胞，并观察到将极少数量的所选细胞输注后给人深刻印象的临床反应，9个治疗患者中有8个清除了感染(中值8.6 x 103/kg)(Cobbold等，2005)。暴露于抗原后选择分泌干扰素γ(IFN-γ)的T细胞(IFN-γ捕获试验)也用于临床，Feuchtinger和同事在用病毒肽体外刺激后直接从外周血中具体选择了Adv特异T细胞并表明少量细胞(1.2-50 x 103/kg)在体内安全、有保护性且有效(Feuchtinger等，2004；Feuchtinger等，2006)。然而，这些方法都昂贵且需要大体积的起始血液，其通常难以获取，特别是在非血缘关系匹配供体的设定中。四聚体试剂受到已知的表位和CD8选择的限制。γ捕获限制分泌γ干扰素的T细胞的输注。可能缺失具有其他功能的抗原特异T细胞。迄今为止，其使用受到紧急医疗需求的约束情况的限制。
本领域需要替代的符合实施的良好制造方法，其能克服所有三种限制(体积、时间和感染性试剂)以从少量血液体积中快速生成多病毒特异CTL用于免疫治疗目的。本发明提供如何用编码免疫优势和次优势病毒抗原的DNA质粒核转染树突细胞(DC)以及将其用作体外T细胞刺激物以生成多病毒反应性CTL，所述CTL在10天内靶向来自多种常见病毒的抗原中的多种不同表位(Gerdemann等，2009)。
用于呈递和/或治疗癌症的多肿瘤相关抗原(TAA)T细胞
例如，EBV与霍奇金和非霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌相关。在这些情况下，所述肿瘤细胞表达约90种EB病毒抗原之中的三种。为了优化CTL的抗原靶向，我们小组通过依次使用树突细胞(DC)和EBV-LCL制备了特异性指向所述三种表达病毒抗原的CTL，所述EBV-LCL经遗传修饰以过表达LMP1和LMP2(所述三种抗原之二)来再激活并扩增来自患者或其HLA匹配的异源供体的LMP特异CTL。所述LMP抗原从腺病毒载体表达。HL和NHL中的临床结果振奋人心，17个缓解的高风险HL患者中16个仍然处于缓解中，而15个活动性复发疾病的患者中12个发生肿瘤响应。然而，涉及我们研究的＞70％的患者具有EBV阴性淋巴瘤且不适合EBV抗原特异T细胞。
过继免疫治疗非病毒癌症的挑战之一仍是强免疫原性靶向抗原的鉴定。模式肿瘤抗原需在肿瘤细胞上特异并普遍表达以限制附带损伤，且理想地应对维持所述肿瘤的致癌表型很重要。然而，大多数抗原不满足这些标准，因为其不一定是独立存在于癌症细胞中的新抗原(neo-antigens)，而是在正常细胞中也表达的抗原，且外周血T细胞对其耐受或缺失。然而已鉴定本质上肿瘤特异的抗原，但肿瘤抗原的表达形式是高度依赖肿瘤类型。这强调了鉴定在正常组织中不表达或表达很少的合适抗原的重要性，以及优化肿瘤特异性CTL生产的细胞培养条件的重要性，从而克服建立T细胞耐受“自身”抗原的机制。
一些研究中已描述具有希望的临床结果的非病毒肿瘤抗原的T细胞免疫治疗。Rosenberg和同事报道了黑素瘤特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和高剂量干扰素2(IL-2)的共同输注使约35％的转移性黑素瘤患者产生临床响应。没有分析所述输注细胞的特异性但可能其靶向多种表位/肿瘤相关抗原。用改良的治疗方案随后获得了更有希望的结果，所述方案包括CTL输注前的淋巴消耗步骤，从而改善了过继转移细胞的扩增和持续存在。标准治疗法难以治疗的93个转移性黑素瘤患者接受免疫消耗化疗-/+全身辐射，然后过继转移高度选择的、TIL源的肿瘤反应性T细胞和高剂量IL-2(每8小时720,000IU/kg用以耐受)。93患者中有52个对治疗(39PR，12CR)有客观的临床响应，包括大量肿瘤的消退。然而，大多数肿瘤不可能收集到自体同源的TIL。而且，大量肿瘤特异T细胞的体外扩增(＞1010CTL)是复杂且昂贵的过程。同一组还将输注了直接靶向黑色素瘤相关抗原中的单一表位的T细胞克隆，gp100+/-IL-2，但报道了较差的临床响应，仅有一较小响应和一混合响应，表明所述细胞没有在体内植入或保留。这些研究证明过继转移抗原特异T细胞消除癌症的可能，但强调了靶向多表位/抗原对产生最优临床结果的重要性。
发明概述
本发明涉及生产CTL，所述CTL为多肿瘤抗原或靶向靶标多病原体(包括例如病毒或细菌)。由于本文提供的新的改善，与常规方法相比CTL生成更快。所述改善至少包括使用来自具体类型载体(例如质粒)或具体肽文库的抗原来源。其他改善包括在细胞增殖培养基中使用某些细胞因子和细胞培养环境。
在具体实施方式中，本发明提供产生多病毒特异CTL的方法，所述CTL用于治疗被多病毒感染的个体(如异基因干细胞移植后感染多病毒的个体)或患具有特定肿瘤相关抗原的癌症的个体。在多病毒和肿瘤相关抗原的实施方式中，所述抗原的来源可为质粒或肽文库。在多病毒和肿瘤相关抗原的实施方式中，所述CTL可在具有透气膜的容器中培养。在多病毒实施方式的具体实施方式中，所述培养基含IL4和IL7。在所述肿瘤相关抗原实施方式的具体实施方式中，所述培养基含IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。
在某些实施方式中，本发明描述多病毒CTL系或多TAA CTL系的生成。对于多病毒CTL的生成，树突细胞可用覆盖所述病毒抗原的肽混物(pepmixes)脉冲处理或DC可用编码所述病毒抗原的质粒核转染以产生抗原呈递细胞(APC)。或者PBMC可用肽混物直接刺激以激活抗原特异细胞。这些策略避免了使用腺病毒载体和EBV转化APC(LCL)的需要。对于多TAA CTL生成，DC可用覆盖所述靶抗原的肽混物脉冲处理或DC可用编码至少部分所述肿瘤抗原的质粒核转染。额外的实施方式包括使用某些能促进所述激活的T细胞群体的增殖并降低细胞死亡的细胞因子和使用生物反应器如G-Rex生物反应器来培养细胞以促进体外T细胞的优化扩增。
用于病毒感染的多病毒特异T细胞
本发明的具体方面中包括快速并有效的生成具有广泛表位反应性的多病毒特异CTL的方法。具体情况中可用本发明生成具有“广谱”特异性的CTL，其可用编码优势免疫和保护性抗原的质粒生成，所述抗原衍生自各种病毒或其他病原体。
在本发明的一些实施方式中，制备和/或给予多病毒特异CTL用于预防和/或治疗免疫受损个体(实体器官移植、HIV感染、化疗、遗传免疫缺陷)中的感染。尽管所述个体可由于任何原因而免疫受损，但具体情况中所述个体是在异基因干细胞移植后。所述病毒感染可为任何形式，尽管具体实施方式中其为EBV、CMV、腺病毒(Adenovirus)、BK、HHV6、RSV、流感病毒(Influenza)、副流感病毒(Parainfluenza)、博卡病毒(Bocavirus)、冠状病毒(Coronavirus)、LCMV、腮腺炎病毒(Mumps)、麻疹病毒(Measles)、偏肺病毒(Metapneumovirus)、细小病毒B(Parvovirus B)、轮状病毒(Rotavirus)和西尼罗河病毒(West Nile Virus)。
在某些涉及多病毒特异CTL的实施方式中，本发明采用IL-4和IL-7的某个细胞因子组合用于促进所述激活的T细胞群体的增殖并降低细胞死亡。
在某些方面，用表达示例性病毒蛋白的下述质粒开发多病毒特异CTL：(i)腺病毒六邻体和/或五邻体；(ii)巨细胞病毒(CMV)立即早期中间体1(IE1)和/或pp65；和(iii)EB病毒(EBV)EBNA1、LMP2和/或BZLF1。在具体实施方式中，所述广谱CTL纳入所有用于制作三病毒特异细胞的表达载体，以及在具体实施方式中纳入表达例如下述病毒蛋白的额外质粒：(i)BK多瘤病毒大T抗原和/或VP1；和/或(ii)人疱疹病毒-6(HHV-6)立即早期中间体1(IE1)和/或内膜蛋白U90、U11、U14和/或U71；和/或(iii)呼吸道合胞病毒(RSV)F、M和/或N蛋白；和/或(iv)副流感病毒(PIV)F、HN和/或NP蛋白。
本发明的一些实施方式中包括生成供体来源的多病毒特异细胞毒性T细胞以治疗和/或预防需要该治疗的对象中的病毒感染和/或再激活的方法，所述方法包括至少一个或多个以下步骤：(i)从供体中分离外周血单核细胞(PBMC)；(ii)通过选择粘附细胞培养底物的能力和随后在含GM-CSF和IL4的培养基中培养，从所述PBMC中生成称为树突细胞的抗原呈递细胞(APC)；(ii)用编码至少一种来自至少两种病毒的病毒蛋白的质粒DNA表达载体独立核转染DC，如下：(a)编码所述免疫优势腺病毒抗原六邻体和五邻体的表达质粒；(b)巨细胞病毒(CMV)立即早期中间体1(IE1)和pp65；(c)EB病毒(EBV)EBNA1、LMP1和BZFL1；(d)BK多瘤病毒大T抗原和VP1；(e)人疱疹病毒-6(HHV-6)立即早期中间体1(IE1)和/或内膜蛋白U90、U11、U14和/或U71；(f)呼吸道合胞病毒(RSV)F、M和/或N蛋白；(g)副流感病毒(PIV)F、HN和NP蛋白；(iii)将所述核转染的DC和所述非贴壁PBMC组分中保留的T细胞共培养；(iv)在含添加的IL7+IL4的培养基中培养所述刺激的T细胞9-12天；(v)在所述G-Rex设备中扩增所述CTL以维持最优扩增；和(vi)验证所述刺激T细胞的抗原特异性和同种异源反应性缺失。
为了使用T细胞靶向非病毒相关且在免疫竞争个体中产生的肿瘤，可靶向非病毒肿瘤表达的抗原。在肿瘤细胞中表达或过表达的这些抗原包括(例如)生存素、PRAME(黑色素瘤优先表达抗原)、NY-ESO-1、MAGE-A4、SSX2和SSX4，其通常在HL和NHL中表达且在具体实施方式中靶向抗原特异T细胞。为此，本发明人开发了生成对多肿瘤抗原具有同时特异性的多克隆CTL系的方案，用覆盖例如SSX2、生存素和MAGEA4的肽混物的主混物脉冲处理DC以初免CD4+和CD8+T细胞肿瘤特异性T细胞。靶向多抗原的该策略同时需最大化CTL功效并最小化肿瘤免疫逃逸。对于体外扩增，本发明定义了优化的细胞因子混合物以促进最大特异性增殖而保持所述细胞系的多特异性。所得CTL体外具有功能且在酶联免疫斑点试验(ELIspot)和胞内细胞因子试验中用TAA肽混物刺激时产生IFNγ和TNFα，并在Cr51传统释放试验中特异性裂解肽混物脉冲的和完整的抗原表达靶向细胞。本发明人成功从分离自大量预处理的HL患者的PBMC生成TAA-CTL，其能裂解自体肿瘤材料。
用于癌症的多肿瘤相关抗原特异T细胞
本发明的某些实施方式中，开发了靶向TAA的CTL，所述TAA在肿瘤细胞上高度表达，包括例如MAGE1、3、PRAME和NY-ESO-1(见下)。
在某些实施方式中，本发明涉及用于治疗包括EBV阴性肿瘤在内的具体肿瘤的CTL治疗。
在具体实施方式中，本发明涉及用于多肿瘤抗原的CTL的生成。尽管本发明可用于任何癌症包括肺癌、乳腺癌、脑癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、骨癌、颈椎癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、头颈部肿瘤等，但本发明在某些实施方式中用于有关血液和骨髓的癌症。
在本发明的具体实施方式中，设计所述CTL产品以特异对应所述个体的肿瘤所展现的抗原表达形式。因此，现在将多抗原表达载体核转染入DC提供了一种生成单CTL产品的途径，所述产品响应个体肿瘤的独立抗原特征。
为此本发明人开发了生成同时针对多肿瘤抗原有反应性的CTL细胞系的方法，通过在细胞因子混合物IL7、12、15和IL6或IL27存在下用覆盖感兴趣抗原的肽混物脉冲处理的树突细胞作为刺激物首先刺激9天，本发明人显示其对产生具有多抗原特异性的CTL细胞系很重要(图14)。随后，用相同肽混物脉冲处理的DC重刺激所述CTL并培养在IL7和IL2中。
在本发明的某些实施方式中包括生成细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述细胞靶向来自两种或更多病毒的至少一种抗原，所述方法包括步骤：用多种质粒核转染个体的树突细胞(DC)群，其中所述多种质粒中的各质粒编码来自所述两种或更多病毒之一的至少一种抗原，并从而产生表达并呈递来自两种或更多病毒的至少一种抗原的树突细胞群；将所述个体的外周血单核细胞(PBMC)与所述核转染DC(APC)接触以产生抗原特异T淋巴细胞群，所述淋巴细胞能响应来自两种或更多病毒的至少一种抗原；和在具有透气膜的容器中的培养基内培养所述抗原特异T淋巴细胞，其中培养基组分包括IL-4和IL-7以产生靶向来自两种或更多病毒的至少一种抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在具体实施方式中，将所述CTL给予免疫受损的个体。在一些情况中，所述个体接受过异基因干细胞移植。在具体情况中，所述病毒可选自下组：EBV、CMV、腺病毒(Adenovirus)、BK、HHV6、RSV、流感病毒(Influenza)、副流感病毒(Parainfluenza)、博卡病毒(Bocavirus)、冠状病毒(Coronavirus)、LCMV、腮腺炎病毒(Mumps)、麻疹病毒(Measles)、偏肺病毒(Metapneumovirus)、细小病毒B(Parvovirus B)、轮状病毒(Rotavirus)、西尼罗河病毒(West Nile Virus)和其组合。在具体实施方式中，所述细胞通过注射给予，如静脉注射。
在某些实施方式中包括生成细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述细胞靶向来自两种或更多病毒的至少一种抗原，所述方法包括步骤：(1)用多种质粒核转染个体的树突细胞(DC)群，其中所述多种质粒中的各质粒编码来自所述两种或更多病毒之一的至少一种抗原，和从而产生表达并呈递来自两种或更多病毒的至少一种抗原的树突细胞群；或(2)将来自个体的DC群体与肽文库接触，其中所述肽序列重叠以覆盖部分或全部的整个病毒抗原，从而产生呈递来自两种或更多不同抗原的至少一种表位的DC群体(APC)；和将所述个体的外周血单核细胞(PBMC)与所述核转染DC(APC)接触以产生抗原特异T淋巴细胞群，所述淋巴细胞能响应来自两种或更多病毒的至少一种抗原；和在具有透气膜的容器中的培养基内培养所述抗原特异T淋巴细胞，其中培养基组分包括IL-4和IL-7以产生靶向来自两种或更多病毒的至少一种抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在一些实施方式中包括生成靶向两种或更多肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述方法包括步骤：(1)用多种质粒核转染个体的DC群体，其中所述多种质粒中的各质粒编码所述一种或多种肿瘤抗原的至少一种表位，从而产生表达并呈递来自两种或更多肿瘤抗原的至少一种表位的DC群体(APC)；或(2)将来自个体的DC群体与肽文库接触，其中所述肽序列重叠以覆盖部分或全部的完整抗原，从而产生呈递来自两种或更多不同抗原的至少一种表位的DC群体(APC)；和将所述个体的外周血单核细胞(PBMC)与所述APC接触以产生抗原特异T淋巴细胞群，所述淋巴细胞能响应来自两种或更多肿瘤抗原的至少一种表位；和在具有透气膜的容器中的培养基内培养所述T淋巴细胞，其中培养基组分包括IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。在具体实施方式中，所述个体患有淋巴瘤或白血病。在某些实施方式中，所述T淋巴细胞通过例如注射给予对象，包括通过静脉注射。
附图说明
图1A-1C显示健康供体中TA特异CTL细胞系的产生。(A)用肽混物脉冲或质粒转染的DC作为APC生成CTL，且CTL在增加的细胞因子组合(如表1所示)存在下培养。(B)用肽混物(左图)或DNA质粒(右图)作为抗原来源生成的CT1细胞系的IFN-γ酶联免疫斑点分析。(C)所述细胞因子组合IL7、IL12、IL15和IL6生成的多病毒特异CTL对例如SSX2、生存素(Survivin)和MAGE-A4具有同时特异性，如IFN-γ酶联免疫斑点所测。
图2显示健康供体中功能性的TA特异CTL细胞系的生成。在4小时铬释放试验中，对生存素和SSX具有特异性的TAA-CTL能杀死肽混物脉冲的自体APC。
图3显示通过本领域现有方法生产三病毒特异CTL。
图4显示依照本发明至少某些方法的多病毒特异CTL的示例性生成。
图5显示生成多病毒CTL的新方案的实施方式，使用质粒作为抗原来源以及其他示例性改良例如添加细胞因子IL4和IL7以及在G-Rex生物反应器中培养。
图6显示添加IL4和IL7的较高CTL特异性。
图7说明起始刺激时DC∶PBMC的接种密度的优化，并显示最优激活需要至少1∶20的比例。
图8显示rCTL的特异性与用常规方案生成的相当。
图9显示采用质粒或肽混物生成CTL的对比。
图10显示质粒与肽混物的CTL特异性对比。
图11说明肽混物的表位范围更广。
图12显示用肽混物/生物反应器生成CTL。
图13说明细胞因子混合物例如IL7、IL12、IL15和IL27扩展了多肿瘤CTL的抗原特异性范围。
图14说明CTL细胞系显示出对两种或更多抗原的同时特异性。
图15显示肿瘤CTL可用转基因IL7受体转导。
图16说明所述转基因IL7受体是有功能的。
图17说明图17中的肿瘤CTL保持抗原特异性。
图18显示临床rCTL生成方法的结果，包括本发明系统的实施方式的多种组分。
图19显示对5种示例性病毒的响应(CMV、EBV、Ads、BK和流感病毒)。所用的各病毒的抗原示于图例中，其中柱从左到右的顺序对应图例从上到下。
具体实施方式
与长期存在的专利法惯例一致，本说明书(包括权利要求)中使用的单词“一”和“一个”与单词包括一致，表示“一种或多种”。本发明的一些实施方式可由或主要由一种或多种元件、方法步骤和/或本发明的方法组成。预期本文所述任何方法或组合物可相对于本文所述任何其他方法或组合物实现。
2009年12月8日提交的美国临时专利申请61/267,761，″Culture Method forMore Efficient Production of Cells(《更有效生产细胞的培养方法》)″和2004年10月8日提交的美国专利申请号10/961,814都通过引用全文纳入本文。
I.本发明大体实施方式
本发明涉及生成CTL，所述CTL靶向多病原体(包括例如病毒或细菌)或靶向多肿瘤抗原。通过使用本发明提供的改良，所述CTL的生成比常规方法更快。所述改良包括具体类型的载体或具体肽文库作为抗原来源的应用，和在细胞增殖培养基中某些细胞因子的应用，和特定细胞培养仪器的应用以支持优化细胞培养物的增殖和扩增。
具体说，本发明提供产生多病毒特异CTL的方法，所述CTL用于治疗被多病毒感染的个体(如异基因干细胞移植后感染多病毒的个体)或患具有特定肿瘤相关抗原的癌症的个体。在多病毒和肿瘤相关抗原的实施方式中，所述抗原的来源可为质粒或肽文库。在两种情况的实施方式中，所述CTL可在具有透气膜的容器中培养。在多病毒实施方式的具体实施方式中，所述培养基含IL4和IL7。在所述肿瘤相关抗原实施方式的具体实施方式中，所述培养基含IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。
II.示例性细胞培养仪器和试剂
本发明的某些实施方式中，任何细胞都在促进所需细胞增殖的条件下培养。具体情况中，所述细胞的培养条件描述于2009年12月8日提交的美国临时专利申请61/267,761，″Culture Method for More Efficient Production of Cells(更有效生产细胞的培养方法)″和2004年10月8日提交的美国专利申请号10/961,814，其通过引用全文纳入本文。在本发明具体实施方式中，细胞在透气细胞培养设备中培养。在某些情况中，所述细胞培养仪器使T细胞增殖到较高密度，而显著降低细胞培养技术人员部分的操作。在一些实施方式中，所述设备具有透气底部，其允许细胞下沉到底部以通过所述透气底部获取氧气。
在本发明的某些实施方式中，使用包括由多侧面连接的顶部和底部的透气细胞培养设备，其中所述底部包括透气材料且至少部分侧面包括透气材料，从而可在所述装置取至少两种方向即垂直(certically)和水平时培养细胞。在具体实施方式中有透气设备且公开用于细胞培养的方法，所含细胞培养设备和方法包括采用一定高度和某个透气表面积与培养基体积之比的培养基。这些设备和方法使细胞培养效率和规模放大效率得到改良。
本文公开的某些实施方式提供更有效的细胞培养设备和方法，其通过产生可整合各种新特性的透气设备来克服现有设备和方法的限制。这些不同特性包括不依赖气/液界面的的气体交换、增加的培养基高度、减少的透气表面积与培养基体积比，透过所述设备的气体交换、侧面壁、包括传统材料的细胞支持支架、和增加的透气材料厚度。在具有包括较低透气材料的透气设备的具体实施方式中，增加培养基高度超出常规所定或市售设备所允许的高度是有利的，从而细胞培养基中底物的转送起作用。
将透气表面积与培养基体积之比降到现有细胞培养基设备或方法所未预期的比例也能提高培养效率。其使培养基高度提高而不相应增加设备长度或宽度。在优选的实施方式中，使培养基高度增加或透气表面积与培养基体积之比降低。也可使培养基高度增加且透气表面积与培养基体积之比降低。
若设计目标是相对于常规降低透气表面积与培养基体积之比，则可采用各种用于透气设备和方法的实施方式。其可用现有设备的形式，或完全为新形式。若所述形式为直径至多小于50mm的透气皮氏培养皿，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于2.74cm2/ml。若所述形式为直径50mm或更大的透气皮氏培养皿，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于1.96cm2/ml。若所述形式为384孔或更多的多孔组织培养板，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于1.10cm2/ml；少于24孔-少于384孔，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于1.03cm2/ml；24孔或更少，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于0.97cm2/ml。若所述形式为两侧可透气的透气筒，则所述表面积与培养基体积之比优选小于0.79cm2/ml。若所述形式为细胞培养袋，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于1.0cm2/ml。若所述形式为分隔设备且设备中的所有培养基完全处于所述半透膜之上，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于1.74cm2/ml。若所述形式为分隔设备且设备中的所有培养基未完全处于所述半透膜之上，则所述透气表面积与培养基体积之比优选小于0.31cm2/ml。
所述较低的透气材料可为任何膜、膜片，或用于透气细胞培养设备的材料如硅、氟代乙烯聚丙烯、聚烯烃和乙烯乙酸乙烯酯共聚物。了解透气材料及其在细胞培养中的应用的大量来源可用于额外的指导，包括共同待审的美国专利申请号10/460,850，其全文纳入本文。单词膜片和膜的使用表示穿过所述透气材料的距离非常薄，且本发明人发现当所述设备和方法的透气材料超出膜片和膜的相关厚度时，本发明的实施方式起作用。因此，有助于所述培养物的气体交换的所述设备部分在本文中称为透气材料。本领域技术人员会认识到所述透气材料应基于各种特性选择，所述特性包括透气性、湿气渗透性、根据所需的细胞和细胞相互作用而改变的能力、光学净度、物理强度等。存在各种资料描述已成功用于细胞培养的透气材料的类型。通常优选硅。其具有优良的氧渗透性，可光学观测，不易刺破，通常不结合细胞，且可容易的制成各种形状。若用硅，需要气体转移的区域可薄于约0.2英寸、约0.1英寸、约0.05英寸或约0.030英寸。
所述设备的壁高度在设备规模放大效率上起重要作用。本发明的目的是提供增加的培养基高度，从而增加设备效率。所述壁的高度确定设备中能存在多少培养基。添加培养基会提供更大的底物源和更大的废品池。规模放大期间需要更多培养基时通过增加壁高度，所述设备的几何结构与培养器、无菌操作台和生物危险品垃圾袋的形状更相容。此外，体积相对于细胞驻留的表面积的增长可使每细胞存在更多的培养基。这可产生降低加料频率的作用，从而减少工作和污染风险。其还可具有增加设备覆盖面积的每平方厘米存在的细胞数量的作用。结构化壁以使培养基体积增长还可具有消除培养基蒸发影响的有利作用。
在某个实施方式中，壁能依赖于气/液界面使培养基驻留高度超过设备高度且更优选地超过常规静态透气设备。例如，壁的高度超出3mm，且在一些情况中超出2.0cm，因此会提供优势。通过给设备用户提供选择为设备添加比现有透气设备更多培养基可产生许多优势，包括每设备存放更多细胞的能力、更低频率给所述设备加料和将所述设备规模放大而不增加覆盖面积。壁可包括任何生物相容性材料且需以形成液体密封的方式配备低透气性材料。给壁配备低透气性材料的方法包括粘合剂结合、热密封、压缩挤压和任何通常用于生成部件之间密封的其他方法。作为选择，壁和低透气性材料可由相同材料形成并制造为单一整体。
在某些实施方式中有多孔组织培养设备如板，所述多孔各由含透气材料的孔底组成且孔侧壁超过某一高度如超过5mm、7mm、9mm、10mm、10.5mm、10.7mm、10.9mm、11mm、11.1mm、11.5mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、16.5mm、17mm、18mm等。在具体实施方式中，透气材料的表面积与细胞培养隔室(如孔底和侧壁)体积之比小于特定大小，例如小于3、2、1、0.58、0.94、0.91cm2/ml。
在具体实施方式中，本发明使用透气筒，其中所述筒包括含透气材料的较低的壁和较高的壁，其中所述较低和较高的壁粘连中间侧壁形成细胞培养隔室，其中所述中间侧壁高度超过0.5cm、0.75cm、0.9cm、1.0cm、1.2cm、1.27cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm和1.6cm。
在某些情况中，本发明所用的透气细胞培养设备基本由静态细胞培养容器组成，其中所述细胞培养容器包括顶部、底部和侧壁，其中至少所述底部包括至少部分无孔透气材料(所述底部不是弧形)、所述细胞培养容器的接入孔和至少部分侧壁，所述侧壁所处高度大于某一到所述底部表面的量，如大于3cm、4cm、5cm、5.2cm、6cm、7cm等。
在一些实施方式中，透气细胞培养设备包括静态细胞培养容器，其中所述细胞培养容器包括顶部、底部和侧壁，其中至少所述底部包括至少部分无孔透气材料(所述底部不是弧形)、所述细胞培养容器的接入孔且不包括混合仪器，其中所述侧壁未被所述接入孔中断，当所述顶部未完全包含透气材料时至少低于某一到所述底部的量(如1cm、1.5cm、2.0cm、2.5cm、2.6cm、2.7cm、2.8cm、3.0cm等)或所述顶部完全包含透气材料时至少超出某一到所述底部的量(如1.5cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm、2.0cm、2.1cm、2.2cm、2.3cm等)。
在本发明的一些实施方式中包括培养细胞的方法，所述方法包括形成含透气底部的细胞培养容器；和添加细胞培养基并将预定细胞类型和预定量的细胞接种到细胞培养容器中，从而所述细胞类型和细胞培养基驻留于所述细胞培养容器中；和使所述预定量的细胞下沉到透气底部以建立第一细胞表面密度，所述第一细胞表面密度定义为细胞培养的接种期驻留于容器表面积的细胞/每平方厘米；和所述第一细胞表面密度归一化为细胞/平方厘米后低于常规方法建立的第一细胞表面密度，从而在烧瓶或多孔板上培养给定的细胞类型，且不混合所述细胞培养基并使所述细胞类型生长到第二细胞表面密度；和所述第二细胞表面密度高于常规方法可得到的最大细胞表面密度。
对于多病毒CTL的生成，可采用1∶10-20的DC∶PBMC比。细胞可以30ml培养基+IL4+IL7的体积在G-Rex40中培养。在第5-7天计数细胞，在一些实施方式中，若细胞多于5x107则所述培养物会分成1∶1且少数具有新鲜培养基。
III.肿瘤抗原
将多TAA特异性CTL用于治疗和/或预防癌症的实施方式中，可靶向各种TAA。肿瘤抗原为肿瘤细胞产生的物质，其引起宿主免疫应答。
示例性的肿瘤抗原至少包括下述：肠癌癌胚抗原(CEA)；卵巢癌CA-125；乳腺癌MUC-1或上皮肿瘤抗原(ETA)或CA15-3；恶性黑色素瘤的酪氨酸酶或黑色素瘤相关抗原(MAGE)；和各种类型肿瘤的ras、p53的异常产物；肝细胞瘤、卵巢癌或睾丸癌的α-胎甲球蛋白；睾丸癌男性患者的hCG的β亚基；前列腺癌的前列腺特异抗原；多发性骨髓瘤或一些淋巴瘤中的β2微球蛋白；结肠直肠癌、胆管癌和胰腺癌的CA19-9；肺癌和前列腺癌的嗜铬粒蛋白A；黑素瘤、软组织肉瘤和乳腺癌、结肠癌和肺癌的TA90。本领域已知肿瘤抗原的例子，例如Cheever等，2009中所述，其通过引用全文纳入本文。
肿瘤抗原的具体例子至少包括例如CEA、MHC、CTLA-4、gp100、间皮素、PD-L1、TRP1、CD40、EGFP、Her2、TCRα、trp2、TCR、MUC1、cdr2、ras、4-1BB、CT26、GITR、OX40、TGF-β.WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、PSMA、GD2、Melan A/MART1、Ras突变体、gp 100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、生存素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、多聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、海藻糖GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精液蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2和Fos相关抗原1。
IV.生成肽混物文库
在某些方面，本文所用的肽混物可来自由15个氨基酸长度且彼此重叠11个氨基酸的肽组成的市售肽文库。例子包括来自JPT技术公司(JPTtechnologies)或美天旎(Miltenyi)公司的那些。在具体实施方式中，所述肽为例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多个氨基酸长度，且有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸长度的重叠。
V.联合治疗
本发明的某些实施方式中，本发明临床方面的方法和过度增殖性疾病治疗中有效的其他试剂如抗癌试剂结合。“抗癌”试剂能对对象的癌症产生不利影响，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、降低肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、促进对癌细胞或肿瘤的免疫应答、阻止或抑制癌症发展、或延长患癌对象的寿命。更一般地，这些其他组合物会以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及用表达构建体和试剂或多种因子同时接触所述癌细胞。这可通过用单一组合物或包括两种试剂的药物制剂接触所述细胞，或者通过用两种不同组合物或制剂同时接触所述细胞来实现，其中一种组合物包括所述表达构建体而另一种包括所述第二试剂。
耐受化疗和放疗试剂的肿瘤细胞是临床肿瘤学中的主要问题。当前癌症研究的一个目的是通过结合基因治疗发现改善化疗和放疗效力的方法。例如，通过逆转录病毒载体系统递送单纯疱疹胸苷激酶(HS-tK)基因到脑肿瘤时，其成功诱导了对抗病毒试剂更昔洛韦的易感性(Culver，等，1992)。本发明的内容中，除了其他促调亡或细胞周期调控试剂外，预期细胞治疗可相似地与化疗、放疗或免疫治疗介入联用。
或者，本发明治疗可先于或在其他试剂治疗之后，间隔数分钟到数周。在所述其他试剂和本发明对所述个体分别应用的实施方式中，一般需保证各递送的时间之间没有显著的时间段，从而所述试剂和发明治疗法仍可在细胞上产生有利的组合效果。在该情况下，预期可用两种形式在彼此约12-24小时内接触所述细胞，更优选地在彼此约6-12小时内。然而在一些情况中，可能需要显著延长治疗时间，其中各给药之间间隔数天(2、3、4、5、6或7)到数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可使用各种组合，本发明为“A”，所述第二试剂如放疗或化疗为“B”。
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/BB/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/AB/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/AA/A/B/A
预期所述治疗循环在需要时重复。还预期各种标准治疗法以及外科手术介入可与本发明细胞治疗法联用。
A.化疗
癌症治疗还包括基于化学和放射治疗的各种组合治疗。组合化疗包括例如，凯素(abraxane)、六甲蜜胺、多西他赛、赫赛汀、甲氨蝶呤、诺肖林、以诺雷德、顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合试剂、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤、或上述任何类似物或衍生变体。
B.放疗
造成DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线和/或将放射性同位素直接递送给肿瘤细胞。还包括其它形式的DNA损伤因素，如微波和紫外线辐射。所有这些因素很有可能会对DNA、DNA前体、DNA复制和修复、染色体装配和维持造成较宽范围的损伤。X射线的剂量范围为从长时间的每日剂量50-200伦琴(3-4周)到单次剂量2000-6000伦琴。放射性同位素的剂量范围差异很大，取决于所述同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型、以及肿瘤细胞的摄入。
本文所用术语“接触”和“暴露”用于细胞时，描述治疗构建体和化疗或放疗试剂递送给靶细胞或放置成与所述靶细胞直接并置所用的方法。为了实现细胞杀死或静止，以有效杀死所述细胞或阻止其分裂的结合量将两种试剂递送给细胞。
C.免疫治疗
一般免疫治疗法依赖于使用免疫效应细胞和分子靶向并破坏癌细胞。所述免疫效应物可为例如对肿瘤细胞表面的一些标记特异的抗体。抗体本身可用作治疗效应物或其可招募其他细胞以实际影响细胞杀死。所述抗体还可结合药物或毒素(化疗、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并仅作为靶向试剂。或者所述效应物可为携带表面分子的淋巴细胞，所述分子直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
因此，免疫治疗可用作组合治疗的部分，与本细胞治疗联用。下面讨论组合治疗的一般方法。通常，所述肿瘤细胞必须带有一些可靶向的标记，即不在大多数其他细胞上存在。存在许多肿瘤标记且任何这些可适于在本发明的内容中靶向。常见的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原、致死抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层连蛋白受体、erb B和p155。
D.基因
在另一实施方式中，所述第二治疗为基因治疗，其中在本发明临床实施方式之前、之后或同时给予治疗性多核苷酸。本发明涵盖各种表达产物，包括细胞增殖诱导剂、细胞增殖抑制剂或细胞程序性死亡调节剂。
E.外科手术
约60％的癌症患者会经历一些类型的外科手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和缓解性外科手术。治愈性外科手术是可与其他治疗法联用的癌症治疗，所述治疗法如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其他治疗。
治愈性外科手术包括切除术，其中所有或部分癌组织被物理移除、切割和/或破坏。肿瘤切除术指物理移除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除术，外科手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(莫氏(Mohs)手术)。还预期本发明可与浅表性癌、初癌或附带量的正常组织移除联用。
所有癌细胞、组织或肿瘤的部分切割后，可在体内形成空腔。治疗可通过灌注、直接注射或局部区域应用其他抗癌治疗来实现。该治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复。这些治疗也可用不同的剂量。
F.其他试剂
预期其他试剂可与本发明联用以改进治疗的治疗效力。这些其他试剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP连接上调的试剂、细胞抑制和分化试剂、细胞粘附抑制剂、或增加所述过度增殖性细胞对凋亡诱导物的敏感性的试剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。还预期通过在过度增殖性细胞上建立自分泌或旁分泌效应，细胞表面受体或其配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调会增强本发明的凋亡诱导能力。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖性细胞群体的抗过度增殖效应。在其他实施方式中，细胞抑制或分化试剂可与本发明联用以改进所述治疗的抗过度增殖效力。细胞粘附抑制剂预期可改善本发明的效力。细胞粘附抑制剂的例子为粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期其他增加过度增殖细胞对凋亡敏感性的试剂如抗体c225可与本发明联用以改善治疗效力。
激素治疗也可与本发明联用或与前述任何其他癌症治疗联用。所述激素的应用可在某些癌症如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌的治疗中采用以降低某些激素如睾丸激素或雌激素的水平或阻碍其效应。该治疗常与至少一种其他癌症治疗联用作为治疗选择或降低转移的风险。
DNA甲基转移酶抑制剂和/或组氨酸脱乙酰基酶抑制剂。示例性的DNA甲基转移酶抑制剂包括例如5-氮杂胞苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、1-β-D-阿糖胞苷-5-氮杂胞嘧啶和二氢-5-氮杂胞苷。示例性的HDAC抑制剂包括异羟肟酸、如曲古抑菌素A；环四肽(如曲泼素(trapoxin)B)和缩肽类(depsipeptides)；苯酰胺类；亲电酮；和脂族酸化合物如丁酸苯酯和丙戊酸。
VI.实施例
提供下述实施例是为了更完整地说明本发明的优选实施方式。然而其决不构成对本发明广泛范围的限制。
A.多病毒特异CTL
图3提供生成用于过继转移的病毒特异性(例如)CTL的常规方法。供体来源的B细胞先转化入EBV转化的淋巴母细胞系(LCL)以用作抗原呈递细胞。一旦建立(可花费4-6周)，用表达来自CMV的免疫优势pp65抗原的腺病毒载体转导供体PBMC。PBMC中的单核细胞优选进行转导并刺激病毒特异性T细胞，然后所述细胞在额外刺激循环中扩增，用转导有相同载体的LCL作为APC(Leen等，2006)。所述方法耗时且昂贵(生成临床级别的Ad载体和EBV病毒)。本发明的一些实施方式中生成多病毒特异性CTL(图4)以替代使用Ad载体和EBV病毒作为用于T细胞刺激的抗原来源。生成编码来自EBV、CMV和Ad(例如)的病毒抗原的DNA质粒。这些可通过核转染在APC中表达，然后可收集所述APC并用于刺激T细胞(Gerdemann等，2009)。在本发明中，发明人现已开发用质粒或肽混物作为抗原来源和某些实施方式中的其他改良如在培养CTL的细胞培养基中添加细胞因子IL4和IL7来生成多病毒CTL的新方案。所述实施方式用于维持CTL细胞系中反应性的广度，且在所述G-Rex生物反应器中培养能最大化T细胞扩增(图5)。
存在IL4和IL7时生成的CTL能识别来自所述靶抗原/病毒的广泛肽库(图9、10、11)，且具有最小的同种异源反应性即不识别来自潜在接受者的正常细胞(图12)。因此，本发明产生的CTL具有高度病毒特异性且不识别预期接受者的未感染细胞并因此在输注后不诱导移植物抗宿主病(GVHD)。
对于多病毒特异性CTL的示例性质粒，可使用表达(例如)来自所述靶病毒Ad、EBV和CMV的2或3或更多种免疫原性基因的多顺反子质粒(例如)。一个示例性腺病毒构建体(7970bp)含六邻体∶IRES∶五邻体(2858bp六邻体和1715bp五邻体)。一个示例性EBV构建体(6641bp)包括EBNA1ΔGALMP2:IRES:BZLF1(1926bp EBNA1Δ；1493bp LMP2；和737bpBZLF1)。一个示例性CMV构建体(6583bp)包括IE1:IRES:pp65(1471bp IE1和1686bp pp65)。所述双顺反子质粒在激活T细胞上有效。为了生成所述质粒，在某些方面一种或多种下述特性有用：主链尽可能小(例如，2.8-3kbp)；优化的启动子，如CMV启动子(SV40增强子)；没有抗生素抗性基因；且与人基因组DNA不同源。在一些情况中，所述质粒不含抗生素抗性基因，而是含通过蔗糖(果糖基转移酶(SacB)在细菌中条件致死)(自然科技公司(Nature Technology Corporation))的细菌选择。
在本发明的某些实施方式中，所述CTL细胞系是CD4+和CD8+T细胞的混合物。在一些情况中，再激活的细胞针对不同靶抗原的预期分布如下：
抗原主要T细胞限制
IE1CD8
pp65CD8
EBNA1CD4
LMP2CD4+CD8
BZLF1CD8
六邻体CD4
五邻体CD4
对于图6的细胞因子，IL4和/或IL7至少在某些培养中提高病毒反应性细胞的频率。图7说明起始刺激时DC∶PBMC的接种密度的优化，并显示最优激活需要至少1∶20的比例。
图18显示临床rCTL生成过程的结果，包括本发明系统的实施方式的多种组成，例如下述：1)DC核转染；2)EBV、CMV、Adv-Ag质粒；3)添加细胞因子IL4/IL7；4)G-Rex中的T cell扩增；和5)DC的生成。图8显示本发明人生成的CTL与用常规方案生成的CTL有相似特性，但只用了部分时间。这些细胞体内应安全且与最小的同种异源反应性相关，如铬释放试验所评估。
对于快速多病毒rCTL的生成，可用本领域任何有用的方法核转染所述DC，包括例如Amaxa
Figure BPA00001545998100211
核转染系统或InVitrogen
Figure BPA00001545998100212
核转染系统。多病毒CTL也可通过用覆盖所述靶抗原的肽混物脉冲处理DC或通过用感兴趣的抗原直接刺激PBMC而快速生成。
淋巴瘤表达的模式抗原包括例如SSX2、生存素、MAGE-4、PRAME和NY-ESO-1。白血病表达的模式抗原包括例如生存素、WT1、蛋白酶3和PRAME。在某些实施方式中，完整抗原来源包括肽混物(PepMix)，其为肽的重叠文库，例如15聚体肽(且具有不赋予HLA限制的优点)。
实施例1
用于CTL刺激的树突细胞的生成和DNA核转染
树突细胞是已知的最有力的抗原呈递细胞。用表达抗原的成熟树突细胞(DC)刺激外周血(PB)T细胞可导致抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的再激活。DC可通过在GM-CSF和IL-4中培养而从粘附性PB单核细胞(PBMC)分化。抗原可通过用DNA质粒核转染而导入DC，然后所述DC可通过在含IL1β、IL6、TNFα和PGE-2的细胞因子混合物中培养而成熟。
在本实施例中，提供示例性方法用于制备和核转染树突细胞，作为生成治疗性T细胞所需的组分。某些实施方式中的测试样可含来自患者或供体的肝素化外周血(或预先冷冻的PBMC)。感染性疾病测试可在血液收集7天内进行。
制备来自新鲜血液的PBMC(若使用冻存血液，则如下所述进行)。环境温度下(室温)在等体积D-PBS或RPMI 1640中稀释肝素化的外周血(理想上60ml)。在50ml离心管中小心地用约20ml稀释的血液覆盖约10ml淋巴细胞分离剂。根据需要调整以采用所有可用细胞。环境温度下400 x G离心40分钟。保存3 x 1ml等分血浆并存于-80℃。收获PBMC界面到等体积D-PBS或RPMI 1640中。环境温度下450 x G离心10分钟。吸出上清。“轻弹手指”松动团块并在20ml D-PBS或RPMI 1640中重悬。移出20μl细胞。添加20μl50％红细胞裂解缓冲液并用血球计计数。
对于制备预先冷冻的PBMC，37℃解冻细胞，每1ml冷冻细胞在10ml温热CellGenix DC培养基中稀释并计数。对于初始DC，按如下进行。计算每板接种了约10 x 106PBMC(7-14 x 106的范围)的6孔板的35mm孔的数量以使用所有可用的PBMC。环境温度下400 x G离心5分钟。每板重悬2mL细胞用于接种。转移到37℃/5％CO2孵育器中持续2小时以粘附DC前体。用10mlD-PBS或RPMI冲洗孔3次，合并含所述PBMC非粘附部分的上清液。对于剩余的粘附细胞，每孔添加2ml含1000单位/毫升IL-4和800单位/毫升GM-CSF的DC培养基。将烧瓶/板放回37℃，5％CO2的孵育器。若没有预先冻存，可冻存非粘附细胞以将来使用应答T细胞。
添加未成熟DC。第3或4天，补充IL-4到1000单位/毫升和GM-CSF到800单位/毫升。制作含20X GM-CSF和IL-4的CellGenix培养基并每孔添加100μl。
DC成熟时，第5或6天通过温和重悬收获未成熟DC(此时应仅有很少细胞粘附所述烧瓶)。为了移除剩余的粘附细胞，添加5ml冷D-PBS持续约1分钟并温和重悬且结合未成熟DC。用血球计计数细胞。仅计数大树突细胞。以每mL 2x106在CellGenix培养基中重悬DC并在24孔板上每孔等分1ml。在未使用的孔中添加无菌水。添加含所述细胞因子成熟混合物的1ml DC培养基。
细胞因子终浓度
GM-CSF800U/ml
IL-41000U/ml
TNF-α10ng/ml
PGE-11g/ml
IL-1β10ng/ml
IL-6100ng/ml
在37℃，5％CO2孵育器中孵育DC 20-28小时。20-28小时后用3ml转移液管通过温和重悬收获24小时成熟DC。用血球计计数细胞。仅计数大树突细胞。对于树突细胞的核转染，于37℃/5％CO2孵育器内的6孔板中预热4mlCell Genix培养基。将收获的树突细胞分装于3个(管1-3)15ml离心管中。DC细胞数/管应不低于0.5x106且不高于2x106。以200g离心DC 10分钟。吸出上清并在DC团块中添加DNA质粒至终浓度为每管5μg。在管1中添加DNA质粒NTC IE1-pp65，管2中添加DNA质粒NTC E1dGALMP2-BZLF1和管3中添加DNA质粒NTC六邻体-五邻体。用100μl核转染溶液重悬DC和DNA，混合良好并转移到核转染小试管中。将所述小试管置于核转染仪(Nucleofector)中，选择程序U2，按开始按钮开始核转染。核转染后立即添加500μl所述预热的培养基到所述小试管中并将该小试管转移到37℃/5％CO2孵育器中。10分钟后将核转染的DC转移到12孔组织培养处理的板中并添加1.5ml含所述细胞因子成熟混合物的DC培养基。
细胞因子终浓度
GM-CSF800U/ml
IL-41000U/ml
TNF-α10ng/ml
PGE-11g/ml
IL-1β10ng/ml
IL-6100ng/ml
在37℃，5％CO2孵育器中孵育12-18小时。
收获DC并辐照以用作APC。收获并计数。用30Gy辐照DC以用作APC。用10ml培养基清洗一次。用CTL培养基以每毫升2或1x 105重悬。DC现在即可用作PBMC或CTL的刺激物。
实施例2
用质粒核转染的树突细胞生成抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
本实施例涉及抗原特异性细胞毒性淋巴细胞的示例性加工。可采用本过程制备细胞用于将质粒核转染的DC用作抗原呈递细胞的方案。在某些情况中，用编码例如六邻体-IRES-五邻体、IE1-IRES-pp65和E1dGALMP2-IRES-BZLF1的质粒核转染DC。
抗原特异性细胞毒性T细胞系(CTL)可通过用表达来自DNA质粒的抗原的自体抗原呈递细胞(APC)刺激外周血单核细胞(PBMC)来生成。在本发明的某些实施方式中，所述APC为所述树突细胞(DC)。树突细胞是可被有效核转染并用于生成来自患者的病毒特异T细胞的有效APC。在某些实施方式中，质粒核转染的树突细胞可用于第二或随后刺激。在所用的培养条件下，过快生长的T细胞系应含有对感兴趣抗原(CMV-IE1和pp65，腺病毒抗原和EBV抗原)特异的T细胞。第一次刺激时添加细胞因子(IL-4和IL-7)。
可使用来自所述患者的肝素化外周血，或预先冷冻的患者PBMC。感染性疾病测试可在血液收集7天内(取决于具体方案)进行。制备来自所述患者或供体的质粒核转染的树突细胞(DC)。
可计算所需的最终扩增的T细胞数量。根据该患者的体表面积、预测的剂量水平和是否允许额外剂量，需要足够的细胞用于患者剂量和QC检测。在某些实施方式中，允许所述患者可以比预期更高剂量水平参与。DC应在CellGenix培养基中制备以确保其在具体情况中不呈递胎牛血清抗原。存在FCS时进行初始CTL。
从新鲜血液中制备单核“应答”细胞(对于冷冻血液，见下)。环境温度下(室温)在等体积D-PBS或RPMI 1640中稀释肝素化的外周血(例如，60ml)。在50ml离心管中小心地用约20ml稀释的血液覆盖约10ml淋巴细胞分离剂。根据需要调整以采用所有可用细胞。环境温度下400 x G离心40分钟。保存3x 1ml等分血浆并存于-80℃。收获PBMC界面到等体积D-PBS或RPMI 1640中。室温下450 x G离心10分钟。吸出上清。“轻弹手指”松动团块并在20mlD-PBS或RPMI 1640中重悬。移出20μl细胞。添加20μl 50％红细胞裂解缓冲液并用血球计计数。若合适，然后可通过树突细胞在板或生物反应器中进行PBMC刺激。
若需要，可从预冷冻的PBMC或非粘附单核细胞中制备应答细胞。37℃解冻细胞，每1ml冷冻细胞用10ml温热培养基稀释。计数细胞。
在合适的条件中，可通过树突细胞在例如板或生物反应器中进行PBMC刺激。室温下400 x G离心PBMC 5分钟。移除上清并以每毫升2 x 106细胞在CTL培养基+IL4(终浓度1000U/ml)和IL7(终浓度10ng/ml)中重悬。24孔的每孔等分1ml细胞并将板放回孵育器中，或在GP40生物反应器中等分5-7.5ml(10-15 x 106)PBMC并放回孵育器。获得制备的质粒核转染的DC，用30Gy辐照并清洗4次。以2x105-1 x 105(DC)细胞/毫升重悬抗原呈递细胞，产生PBMC与DC之比为10∶1或20∶1。在PBMC孔中等分1ml DC或在生物反应器中等分7.5ml DC并加入培养基至30ml。37℃，5％CO2下空气培养7天。第7天：若每孔含＜3x106细胞，则更换二分之一培养基。每孔移除约1ml培养基并用约1ml新鲜CTL培养基+细胞因子替换。在第7天：若每孔＞3x106细胞，则分割并添加CTL；转移约1ml CTL到新孔中；添加约1ml新鲜CTL培养基+细胞因子。在第7天：若生物反应器中＜50x106细胞则移除10ml培养基并补充新鲜培养基+细胞因子。在第7天：若生物反应器中＞50x106细胞则转移15ml CTL到新的生物反应器中并补充新鲜培养基+细胞因子。再培养4-6天。对于临床冻存，获得足够的细胞时冻存并鉴定细胞。冷冻CTL一周内，按照具体方案要求需用5 x 106-1x107细胞进行细胞毒性试验并需用另外2 x106细胞确定表型。
在某些实施方式中，所述细胞可具有下述特性，在某些实施方式中：1)足够的CTL数量用于以合适的剂量水平给患者输注(当时确定)和用于所有QC需求；以20∶1杀死的受体PHA母细胞(PHA blasts)＜10％(若为异源)；和3)＜2％CD 83+/
Figure BPA00001545998100261
细胞(不包括DC)。
实施例3
多病毒特异性CTL用于预防和治疗异基因干细胞移植后的EBV、CMV和腺病毒感染
可用本实施例的方法生成多病毒特异T细胞产物，其还靶向任何病毒组合，不仅是本文说明的那些。本发明的某些实施方式中含快速生成的供体来源多病毒特异性CTL细胞系，其针对以下三种示例性病毒具有抗病毒活性：EBV、CMV和腺病毒。然而，所述多病毒CTL可针对2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种病毒。除了EBV、CMV和/或腺病毒作为靶标，所述CTL可针对例如一种或多种的HHV-6、BK、RSV、流感病毒或副流感病毒(见图19)。
本实施例描述评估供体来源的快速生成的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(rCTL)在患者中的安全性和毒性的示例性I/II期研究，所述患者在异基因干细胞移植后有发展CMV、腺病毒或EBV感染的风险。首先，进行I期剂量递增研究以说明四种示例性rCTL剂量水平的安全性并确定最大耐受剂量(MTD)水平。剂量限制毒性定义为任何器官系统中42天内发展III-IV级GVHD或NCI 3-5级输注相关的不良事件，其可归因于rCTL但之前不存在且不是由于CTL给予30天内的潜在恶性肿瘤或复发。
背景技术
通过供体来源的CTL重建抗病毒免疫用于阻止和治疗移植后的CMV、EBV和腺病毒感染(Leen等，2006)。然而，用常规方案进行T细胞免疫治疗的更广泛实施受到以下限制：(i)生产成本(ii)限制可扩展性的生产复杂性，和(iii)CTL生产所需的时间，其不仅导致成本和复杂性上升还妨碍严重疾病患者的紧急治疗，除非CTL按预计制备且大大提前。
本文提供生成供体来源的多病毒特异性CTL(rCTL)的快速方案，用于异基因造血干细胞移植(HSCT)受体的输注，所述受体有发展出感染如CMV、腺病毒或EBV感染或早期感染的风险。在具体实施方式中，给予快速生成的供体来源的多病毒特异CTL以介导HSCT受体中的抗病毒活性，所述受体有发展或具有活性病毒再激活或感染的风险。
患者可接受所述细胞作为任何类型异源移植后的早期感染的预防和/或治疗。若患者正接受类固醇用于移植物抗宿主病(GVHD)的治疗或出于其他原因，则剂量必须减少为≤0.5mg/kg氯泼尼松(或等价物)。在本发明的某些方面，患者在之前的28天内没有接受ATG、或坎帕斯或其他免疫抑制单克隆抗体。
在本发明的某些实施方式中，患者在本研究的剂量递增安全期单次输注接受5x106-5 x 107之间的rCTL/m2并将5 x 107rCTL/m2用于固定剂量II期效力成分。例如，如果其发生部分响应(如定义)或接受可去除输注T细胞的输注后治疗，其适于接受例如最多2额外剂量。个体可随后进行病毒负荷的PCR分析且可在给定的间隔记录GvHD分值。
在本实施例中，确定rCTL是否安全和对3种示例性病毒EBV、CMV和腺病毒是否有活性。患者可具有一种或多种下述特性：1)之前用骨髓或PBSC进行异基因造血干细胞移植；2)卡氏/兰氏(Karnofsky/Lansky)分值≥50；3)ANC大于500/μL；4)胆红素＜2x，AST＜3x，血清肌酸酐＜2x正常上限，Hgb＞8.0；6)室内空气下脉冲血氧＞90％；7)妊娠测试阴性(若为有生育能力的女性)；和8)可用的三病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞。
在示例性临床方案中，1期组成的主要终点涵盖安全性，包括42天内的急性GvHD和输注相关的不良事件或最后CTL输注30天内的非血液学不良事件。II期组成的示例性主要终点包括安全性和抗病毒响应。两期的示例性次要终点包括rCTL在感染患者中对病毒负荷的影响；1、2、4、6和8周和3个月的抗病毒免疫重建；和/或3个月内的病毒再激活。
移植后的病毒感染
在血液干细胞移植(HSCT)后的免疫恢复期间，通常由T细胞免疫控制的病毒感染是发病和死亡的重要原因。感染风险的程度由供体和受体之间的组织错配程度、和得到的免疫抑制程度、以及供体的免疫状态确定。例如潜伏病毒如巨细胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)的再激活很常见且常引起全身疾病。例如呼吸道病毒如腺病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)也常引起感染。抗病毒药理学试剂仅对这些病毒中的一些有效；使用所述试剂成本高且伴有显著的毒性和药物抗性变体的过快生长。由于病毒特异的细胞免疫应答的恢复延迟明显与病毒再激活和这些患者的疾病有关，所以恢复病毒特异性免疫的细胞免疫治疗法用于靶向3种示例性常见病毒；CMV、EBV和腺病毒。
CMV
巨细胞病毒(CMV)是潜伏β疱疹病毒，其通常引起免疫竞争个体中无临床症状的感染。其存在于约70％的健康成人中并在上皮细胞、成纤维细胞和单核细胞中复制。CMV在所述干细胞受体中的再激活可导致显著的发病和致死，临床表现包括间质性肺炎、胃肠炎、发热、肝炎、脑炎和视网膜炎(Boeckh等，2003)。细胞介导的免疫被认为是控制CMV感染的最重要因子，且CMV特异CD4+和CD8+淋巴细胞在免疫保护初次感染和后续再激活中有重要作用。预防或事先治疗的最常用药物是更昔洛韦和膦甲酸。这些药物与静脉免疫球蛋白联用能成功地降低与CMV疾病有关的发病率并阻止早期CMV疾病。然而，其都具有明显的副作用包括嗜中性白血球减少症和中毒性肾损害。
EB病毒
EB病毒(EBV)是γ疱疹病毒，感染95％以上的世界人口。初次感染常产生轻度的自限性疾病，然后在B细胞中潜伏感染并在B细胞和粘膜上皮中大量复制。至少存在4种类型的病毒潜伏：1型，仅表达病毒核抗原1(EBNA1)；2型，除了EBNA1，还表达潜伏膜蛋白LMP1和LMP2；和3型，表达所有7种潜伏相关蛋白包括免疫优势EBNA3病毒抗原(Young和Rickinson，2004)。这些类型的潜伏中，所述病毒小RNA和EBER都大量表达，以及来自所述病毒基因组的BamHI A区域的转录本BART也大量表达。在健康个体的大多数循环B细胞内发现的第4种潜伏中，没有检测到病毒RNA表达。在免疫受损宿主中，表达3型潜伏的B细胞(其对病毒特异T细胞高度易感)的过快生长可导致发生移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)。HSCT后的PTLD总体发生率低于1％，但在有潜在免疫缺陷诊断的受体中该发生率上升以及用于来自非血缘关系或人白细胞抗原(HLA)错配供体的干细胞的受体，所述受体接受选择性耗尽T细胞的移植以阻止移植物抗宿主病(GVHD)(Curtis等，1999；Cohen等，2007；Brunstein等，2006)。
几乎没有小分子药物对已被EBV转化的B细胞有任何影响，尽管核苷类似物如更昔洛韦能抑制所述病毒复制周期。化疗效果很小且伴有显著毒性。HSCT后预防和治疗PTLD的一种选择是利妥昔单抗，这是一种针对B细胞表型抗原CD20的单克隆抗体。在不同系列中报道了对利妥昔单抗的响应率在55％-100％之间(Brunstein等，2006；Keuhnle等，2000；Comoli等，2007)。然而，不是所有患者有响应且利妥昔单抗会耗尽正常B细胞6个月以上，这对已经免疫抑制的患者群来说是一大问题。
腺病毒
腺病毒是无包被的裂解性DNA病毒。人类对51种血清型的腺病毒易感，形成6种不同类型(A-F)，在其组织特异性和毒性上不同。尽管腺病毒为急性感染病毒，其可在疾病消除后存在数月且因此常漏检地存在于供体或受体的移植物中。虽然在健康成人中急性感染很少致命，但它是免疫受损个体中发病和致死的重要原因，这些个体中其可产生肺炎、出血性膀胱炎、肾炎、结肠炎、肝炎和脑炎。腺病毒在儿科HSCT后具有特别高的发生率(Myers等，2005)。数个报告已表明清除腺病毒感染伴有检测到腺病毒特异性T细胞(Feuchtinger等，2005；Myers等，2007)且非血缘关系匹配供体和单倍体相合移植的受体的恢复被显著延迟，所述受体受到较强的免疫抑制如坎帕斯(Myers等，2007)。用于疾病治疗的最常用药是西多福韦，但主要问题是相关的中毒性肾损害，且没有预期的、随机的、受控的试验，所述药物的效力是不确定的。
用病毒特异性CTL进行过继免疫治疗
由于病毒特异性T细胞的恢复明显与保护免受这些病毒中每个的感染有关(Feuchtinger等，2005；Cwynarski等，2001；Gottschalk等，2005)，所以减少免疫重建时间的过继免疫是具有吸引力的方法。通过用表达病毒抗原的抗原呈递细胞重复刺激生成的病毒特异性T细胞已在临床试验中评估以阻止和治疗免疫受损宿主的病毒感染(Leen等，2006；Leen等，2009；heslop等，2009；Walter等，1995；Pegs等，2003)。所述方法消除同种异源反应性T细胞。
在开发离体生成病毒特异CTL的方法中有数个要考虑的方面。需要免疫优势抗原的知识，所述抗原诱导对靶病毒特异的保护性T细胞，并需要鉴定转移所述抗原到有效抗原呈递细胞(APC)的递送系统。所述APC必须自体同源，表达主要组织相容性复合物(MHC)抗原呈递相关病毒来源的肽以及足以诱导T细胞活化和扩增的共刺激分子。所有这些试剂需要适用于GMP加工，这限制了一些类型和来源的抗原的使用。
CMV的T细胞治疗
评估过继转移T细胞能否重建靶向CMV的抗病毒免疫的第一研究。在本研究中，CMV特异T细胞克隆衍生自用CMV脉冲处理的自体同源成纤维细胞刺激后的同胞供体(Walter等，1995)。没有不良效应且重建了CMV特异免疫应答，没有患者发生CMV疾病或以后复发。但是没有发生CD4+CMV特异T细胞响应的受体中抗CMV活性降低，表明在某些情况中长期留存可能需要CD4 T细胞。在其他预防研究中，Peggs等，通过用衍生自CMV感染的人肺成纤维细胞系的CMV抗原脉冲处理的树突细胞刺激外周血单核细胞(PBMC)生成了CMV特异CD4+和CD8+T细胞(Peggs等，2003)。小剂量的CTL能重建免疫，且CMV特异CTL有显著的体内扩增。T细胞加工中为了避免使用活的CMV，最近的研究用衍生自巨细胞病毒pp65蛋白的HLA-A2限制肽NLV脉冲处理的树突细胞刺激CTL(Micklethwaite等，2007)。虽然此方法看起来也有效，但问题是输注的CTL的限制特异性，因为靶向单一表位可使变异逃逸且将研究限制在HLA A2阳性的患者中。
CMV特异CTL也用于治疗CMV感染的患者，所述患者尽管经长期抗病毒药物治疗，但所述感染仍留存或复发(Einsele等，2002)。结果振奋人心，7个对象中有6个的病毒再激活受到抑制。本研究中，抗原来源是CMV裂解物，其具有产生广泛免疫应答的优势，但由于所述裂解物中的活病毒的感染风险，其不适于III期研究。
所有上述CTL治疗使用T细胞生产方法，所述方法需要特殊GMP设备中的长期激活和扩增和重要的调控支持。这些需求降低了过继免疫治疗的实用性，因为CTL细胞系必需在疾病很早之前制作，且几乎没有中心有所述设备或此类细胞加工所需的基础设备。最近报道的临床试验使用直接来自外周血的CMV肽特异T细胞的四聚物选择，避免离体扩增和活病毒抗原。尽管仅输注CD8+T细胞，但输注后其扩增数个数量级，在8/9个案例中清除了感染(Cobbold等，2005)。然而由于非常见HLA型的四聚体供应有限且缺少II类四聚体，此方法受到阻碍。
EBV的T细胞治疗
过快生长的PTLD的EBV感染B细胞与EBV转化的淋巴母细胞系(LCL)有相同的表型和病毒抗原表达，所述细胞系通过用EBV实验室株系感染外周血B细胞生成。由于LCL可容易地从任何供体制备，其在评价EBV特异CTL的临床研究中被用作APC(Comoli等，2007；Rooney等，1995；Rooney等，1998；Heslop等，1996；Gustafsoon等，2000)。用此方法生成的EBV特异CTL是多克隆的，含CD4+和CD8+EBV特异T细胞，识别多种潜伏和裂解的病毒抗原。过继转移的EBV特异CTL可存活至少8年，输注后扩增最多2-4个数量级，并降低约20％患者中观察到的高病毒负荷(Heslop等，2009；Rooney等，1995；Heslop等，1996)。在靶向高风险患者群的三种研究的近期综述中，接受EBV CTL作为预防的101个患者都没有发展出PTLD(Heslop等，2010)。输注时有活性PTLD的13个患者中，11个有供体源性EBV特异CTL细胞系诱发的缓解(Heslop等，2009)，而不响应的患者之一中，肿瘤病毒删除了EBNA3中作为所输注效应T细胞靶标的优势免疫表位(Gottschalk等，2001)。其他研究证实了移植后EBV特异CTL的活性(Comoli等，2007；Gustafsson等，2000)。
腺病毒的T细胞治疗
Feuchtinger等用腺病毒抗原短暂体外刺激供体后用γ干扰素分泌细胞筛选，用分离自所述供体的CD4+和CD8+腺病毒特异T细胞通过腺病毒感染处理患者。将少量的腺病毒特异供体T细胞输注给9个HSCT后有全身性腺病毒的儿童。6个可评估的患者中5个检测到腺病毒特异的免疫应答，伴随有病毒负荷的持续降低和感染清除(Feuchtinger等，2006)。
多病毒特异T细胞
上述策略各自仅靶向一种病毒。为了拓宽单一CTL细胞系的特异性以包括干细胞受体的3种最常见病毒病原体，本发明人用转导有编码所述CMV抗原pp65的重组腺病毒载体的单核细胞再激活了CMV和腺病毒特异T细胞。随后用转导了相同载体的EBV-LCL刺激，再激活了EBV-特异T细胞并维持了活化的腺病毒和CMV特异T细胞的扩增。此方法能可靠地生成具有对所有三种病毒特异的细胞毒性功能的CTL，在I期预防研究中将其输注到14个干细胞受体中。所有患者中都产生对CMV和EBV的免疫恢复，但腺病毒特异T细胞的增加仅在输注前有腺病毒感染迹象的患者中发现(Leen等，2006)。输注的CTL中腺病毒特异T细胞的频率增加的后续研究也产生相似的结果，因此强调了内源抗原对促进输注的T细胞的体内扩增的重要性(Leen等，2009)。然而，两种临床试验中患有输注前CMV、腺病毒或EBV感染或再激活的所有患者都能清除所述感染，包括一个患有严重腺病毒肺炎需要血液充氧支持的患者(Leen等，2006)。因此识别多种抗原的CTL产生针对所有三种病毒的临床相关效应。
现有CTL生成方案的局限
现在有证据表明CTL过继转移能治疗病毒感染和血液恶性肿瘤，常规治疗对这些无法控制。由于益处能持续较长时间且所述细胞产生最小的毒性，所有该方法具有潜在出色的药物经济学概况。不幸的是，广泛的应用受到下述限制：(i)生产成本，所述生产包括EBV转化的淋巴母细胞系(EBV-LCL)的起始加工和临床级腺病毒载体的生产和测试；(ii)CTL生产的复杂性，所述生产要求用于每周CTL刺激的APC的生成和遗传修饰，开放培养系统的重复添加和多种熟练的“正确判断”，因此限制了可扩展性，和(iii)CTL生产所需的时间；除了4-6周的EBV-LCL起始生成，还要加上额外的4-8周CTL活化和扩增期以提高抗原特异T细胞频率并消除同种异源反应性T细胞。这种延迟不仅导致成本和复杂性上升，还妨碍严重疾病患者的紧急治疗，除非CTL按预计制备且大大提前。
多病毒特异CTL的快速生成
用DNA质粒核转染DC作为APC来生成多病毒特异CTL
为了更快生产多病毒CTL，本发明人开发了用编码多病毒抗原的DNA质粒替代Ad5pp65载体(Adv和CMV特异)和EBV-LCL(EBV特异)的方案。可用临床可应用的Lonza/AMAXA核转染系统将这些DNA质粒导入APC如单核细胞或DC的核中。转移后，T细胞活化期间实现了高水平的转基因表达和良好的靶细胞活力(Gerdemann等，2009)。质粒为非感染性、非复制性，整合到转染细胞基因组中较弱。可快速并高性价比地以可扩展量生产具有优良长期稳定性的临床级DNA。通过减少CTL加工时间和免疫测试程度，质粒的取代降低了50％以上的加工成本，因为质粒测试成本约为腺病毒载体测试成本的十分之一。
这些质粒DNA编码的保护性和免疫原性Adv和CMV抗原的评估可基于所述振奋人心的临床结果，该结果表明抵御Adv六邻体和五邻体并指向CMV1-E1和CMV-pp65的T细胞体内具有保护性(Leen等，2009；Leen等，2008)。CMV-IE1特异T细胞可靶向将CMV从潜伏中再激活的细胞，而pp65特异T细胞靶向新感染的细胞。所述免疫原中包含各病毒的两种蛋白增加了潜在的靶向表位的数量，并因此增加了T细胞被再激活的可能性(不考虑HLA型T细胞供体)。一旦给药，多表位特异CTL不太可能失效，这是感染细胞中表位突变的免疫逃逸的结果。对于EBV，EBNA1是优势免疫CD4+T细胞靶向抗原，在所有EBV相关恶性肿瘤和正常EBV感染的B细胞中表达，LMP2跨越多种HLA类型中具有免疫原性并在大多数EBV恶性肿瘤中表达，而BZLF1编码优势免疫、立即早期裂解周期抗原，其刺激来自大多数个体的CD4+和CD8+T细胞。
用生长促进细胞因子生成多病毒特异CTL
本发明人和其他人已证明存在增强细胞因子IL-7(10ng/ml)和IL-4(1,000U/ml)时病毒特异CTL能有效并快速的扩增。与来自相同患者的没有细胞因子时生成的T细胞相比，这些细胞因子降低能激活抗原特异T细胞的诱导细胞死亡，相应地协助增加响应抗原特异T细胞的频率和库。此外，在我们的培养物中添加这些细胞因子产生的CTL细胞系具有可忽略的同种异源反应性，即使是在单一刺激后。因此，通过减少CTL加工时间，用这些可作为临床级试剂的细胞因子补充我们的CTL培养物降低了＞50％的加工成本。
用优化的培养设备生成多病毒特异CTL
当前制备CTL需要通过在传统组织培养处理的24孔板中逐渐扩增和每周的再刺激。此系统会耗费大量劳动力，需要很高的技术且难以规模化。即使24孔板中的细胞培养物需要频繁更换培养基和操作以优化营养水平并移除废品，但T细胞仍产生严重的细胞死亡，而由于不使用抗生素，除了最熟练的组织培养技师外所有人都经常存在感染的风险。不幸的是，迄今为止对替换这种封闭式、可规模化的在其他类型临床细胞培养系统中广泛使用的生物反应器系统的努力都失败了。得到的CTL产物没有功能或没有特异性。
本发明人采用新的透气快速扩增设备(G-Rex)，其显著减少培养期间T细胞凋亡，产生更有效的体外扩增。穿过所述烧瓶底部的透气硅膜发生气体交换(进O2和出CO2)，防止供氧不足同时使细胞上方有较大深度的培养基，提供更多的营养并稀释废品。这些培养条件能使对CTL生产非常关键的细胞和细胞之间的稳定相互作用通过物理破碎而无阻碍进行，技师操作时间减少＞10倍，细胞产出增加＞3倍，并加速CTL加工时间＞2倍而不影响所述CTL的表型和功能(Vera等，2010)。
总的来说，通过结合这三种新过程，我们能用简单的一步法生产大量没有同种异源反应性细胞的多病毒CTL，所述方法能显著降低传统CTL方案相关的成本、复杂性和时间。
本发明的某些实施方式设计
在本发明的某些方面，评估有发展EBV、CMV或腺病毒感染或早期再激活风险的HSCT患者中快速生成三病毒特异系(rCTL)的可行性、安全性和效力。
研究设计的主要目标和原理
本研究的主要目的是评估将rCTL给予有EBV、CMV或腺病毒感染或早期再激活或感染风险的移植患者的安全性。我们选择使用4种不同剂量水平，开始为5 x 106、然后1 x 107、2 x 107和最终剂量5 x 107rCTL/m2。我们先前的方法加工的CTL在最多108细胞/kg的剂量时是安全的(Leen等，2006)。然而随着该加工方法被修改，本发明人在本研究的一些情况中从较低剂量5 x 106细胞/m2开始。在某些情况中，对于在一剂量后有部分响应的对象或接受其他可能影响所输注CTL留存或功能的治疗法的对象给予额外剂量(以相同水平)。
可行性/安全性研究中，任何类型的异源移植患者适于接受CTL作为预防或适于本文定义的早期再激活，包括例如：1)早期治疗可给予患单一或多种感染的合适患者(也包括患多种感染但一种再激活一种受控感染的患者)；2)招募时的临床状态使类固醇减少到每天少于0.5mg/kg氯泼尼松；3)适当的(接受强度降低的调节方案的分娩妇女)女性患者的妊娠测试为阴性；4)先前12个月内用骨髓或外周血干细胞进行促骨髓摧毁性或非促骨髓摧毁性异基因血液干细胞移植；5)对有CMV、腺病毒或EBV感染的风险的患者的预防；6)针对下述各病毒的具体实施方式确定的再激活或感染的早期治疗：
CMV(Nichols等，2001；Ljungman等，2001)
移植后至少每周监控CMV抗原血症。在白细胞阳性＜10的CMV抗原血症时定义早期再激活。若任何患者发展出CMV抗原血症(白细胞阳性＞10)或CMV感染的临床证据(定义为CTL输注前或后通过来自内脏位置的活检试样证明CMV(通过培养物或组织学))，会开始用更昔洛韦、和/或膦甲酸和免疫球蛋白的标准治疗。没有内脏感染的患者可接受CTL用于抗原血症或升高的PCR。
腺病毒
腺病毒感染定义为通过PCR或来自单一位置如粪便或血液或尿液或鼻咽的培养物中检测出存在腺病毒阳性。腺病毒疾病定义为在多于两种位置如粪便或血液或尿液或鼻咽的培养物中检测出存在腺病毒阳性。满足疾病标准的患者中可添加西多福韦，除非所述对象由于中毒性肾损害而不能忍受该试剂。患者可接受CTL用于血液或粪便中升高的PCR。
EBV
按照近期的准则定义EBV-LPD(Styczynski等，2009)，证实的EBV-LPD由活检定义或可能的EBV-LPD定义为与临床症状(腺病或发热或成像有团块)相关的EBV DNA水平升高但没有活检验证。EBV DNA再激活的患者在研究中仅可接受CTL。有证实或可能的EBV-LPD的患者还应接受利妥昔。
本设计的某些方面，某些患者可被排除：1)招募筛选的28天内接受了ATG、或坎帕斯或其他免疫抑制T细胞单克隆抗体的患者；2)患有其他不受控制的感染的患者(对细菌感染，患者必须接受明确的治疗并在招募前72小时没有进一步感染的征兆；对于真菌感染，患者必须接受明确的全身抗真菌治疗且招募前1周没有进一步感染的征兆；进一步感染定义为可归因于败血症或新症状的血液动力学不稳定、更差的体征或可归因于感染的放射图像发现。(没有其他征兆或症状的持续发热不解释为进一步感染))；3)28天内接受供体淋巴细胞输注(DLI)的患者；4)活化急性GVHD级为II-IV的患者；5)恶性肿瘤活化和不受控制的复发。
供体
可评估异基因(即血缘或非血缘关系的HLA匹配或错配)干细胞移植的供体，包括下述：完整的历史和身体检查；CBC、血小板、差异；电解质、BUN、肌酸酐、葡萄糖、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、ALT、AST、LDH、血清蛋白电泳(若有说明)；HIV-1抗体、HIV-2抗体、HIV NAT、HTLV-1/2抗体、乙型肝炎表面抗原(Hbsantigen)、HBc抗体、HCV NAT、CMV抗体、RPR、西尼罗病毒NAT和美洲锥虫病检测；ABO和Rh分型；血红蛋白电泳或Sickle Prep检测(若有说明)；完整的尿分析。
治疗计划
CTL细胞系
三病毒特异CTL细胞系可用快速方案生成，使用例如质粒核转染DC，生长促进细胞因子和针对T细胞扩增优化的G-Rex培养设备。
为了起始所述三病毒特异CTL细胞系，用塑料粘附2小时、在IL4+GM-CSF中培养5天和用PGE1、TNFa成熟一天来生成单核细胞来源的DC。24小时成熟后，用表达EBV、CMV和腺病毒的保护性和免疫原性病毒抗原的DNA质粒核转染DC，使用例如所述GMP相容的Lonza/AMAXA系统。构建双顺反子质粒，其编码1)CMV-pp65和IE1以及2)Adv六邻体和五邻体，各被IRES序列连接。对于EBV，生成编码三种EBV抗原EBNA1、LMP2和BZLF1的构建体。然后用核转染的DC刺激所述非粘附PBMC组分中保存的病毒特异T细胞，刺激物/响应物比例为1∶10。
为了抑制多病毒特异T细胞的凋亡并促进其扩增，刺激当天将细胞因子IL7和IL4分别以10ng/ml和1,000U/ml的浓度加入。在优化的GMP相容性G-Rex设备中进行T细胞刺激和扩增，已验证其用于生产多病毒特异T细胞(Vera等，出版中)。
在CTL培养期(9-12天)结束时，用例如多聚体试剂检测对各病毒和抗原特异的T细胞的频率。为了检测所述CTL的功能性抗原特异性，可用覆盖CMV-pp65和IE1、Adv六邻体和五邻体、和EBV-EBNA1、LMP2和BZLF1的重叠肽文库(肽混物)作为IFNg酶联免疫斑点试验的刺激物。也可用自体同源和异源的LCL作为检测EBV反应性的刺激物。用受体PHA母细胞作为剩余同种异体反应性的测量方法进行细胞毒性试验，且可通过用单独LCL或与所述三种刺激质粒一起核转染来检测抗原特异T细胞杀死，且可用覆盖pp65、IE1、六邻体、五邻体、EBNA1、LMP2和BZLF1的肽混物脉冲处理的受体PHA母细胞评估共有等位基因产生的抗原杀死。
检查所述CTL细胞系的相同性、表型和不育性，在某些实施方式中根据SOP，给药前需将其冷冻保存。将所述CTL给予患者的释放标准包括活力＞70％、细菌和真菌阴性培养至少7天、内毒素检测≤5EU/ml、支原体检测结果阴性、CD83阳性细胞＜2％、Cr51释放试验中以20∶1杀死的受体PHA母细胞＜10％和HLA同一性。
给药和监控
解冻多病毒特异T细胞并通过例如静脉内注射给予。患者可用苯海拉明(Benadryl)0.25-0.5mg/kg(最大25mg)IV和泰诺(Tylenol)5-10mg/kg(最大650mg)PO作为前驱用药。可按照血液产品给药制度标准监控患者且最低程度应按照下述进行监控：例如，患者可在不断的脉冲血氧中持续至少30分钟。在输注最后和随后30和60分钟监控生命征。患者可接受急性或慢性毒性的支持护理，包括血液组分或抗体和其他合适的介入。若患者具有部分响应(定义为50％落入病毒负荷)或接受可能影响所输注的CTL留存或功能的药物(如类固醇)，其适于在相同起始剂量时接受至多额外2剂。
输注后的6周检测GVHD的发作可能。每周记录GVHD器官阶段评分、总体临床级别、GVHD活检信息和相关的差异诊断。所述每周评分可包括最后评估以来的所有信息。记录器官损害、活检信息、阶段、差异诊断和GVHD治疗。慢性GVHD的明确表现包括硬皮病(表皮或筋膜炎)、扁平苔藓、白癫风、疤痕性秃发、毛发角化过度症、皮肤固定挛缩、甲床发育异常；非感染性溃疡、角膜腐蚀/非感染性结膜炎；食道狭窄、脂肪泻；阴道狭窄，非脓毒性关节炎、肌炎、肌无力、多发性浆膜炎、关节固定的挛缩和梗阻性细支气管炎。慢性GVHD的可能表现包括湿疹皮疹、干性皮肤、斑丘疹皮疹、色素沉着过度、脱发；口腔干燥、干燥性角结膜炎；厌食症、吸收不良、体重减轻、腹泻、腹痛；碱性磷酸酶升高、转移酶炎、胆管炎，高胆红素血症；非传染性阴道炎，阴道萎缩、关节痛；血小板减少症、嗜酸粒细胞增多、自身免疫性血球减少；有组织肺炎的闭塞性细支气管炎和间质性肺炎。CTL易被1-2mg/kg剂量的类固醇杀死。这是GVHD的标准治疗且也可在受体发展出可能与CTL给药有关的其他并发症时给予。
主要终点
所述I期部分的主要目的是可行性和安全性。II期部分的主要终点是抗病毒效果。给予CTL对GVHD的安全性是42天，对于其他毒性为30天。所述安全性终点定义为CTL最后剂量的42天内的急性III-IV级GvHD或CTL最后剂量的30天内的3-5级输注相关不良事件或CTL最后剂量的30天内的4-5级非血液学的不良事件，且其不是由于已存在的感染或原始恶性肿瘤或已存在的NCI常见不良事件术语标准(CTCAE)4.0版所定义的副发病变。考虑的毒性包括GI毒性、肾毒性、出血毒性、心血管毒性(低血压、心律失常和左心室脉动阵列机能障碍)、神经学毒性(嗜睡和发作)、混凝毒性、血管毒性和肺毒性。
急性GVHD的分期和分级
可通过共识会议标准(Przepiorka，等，1994)进行急性GVHD分级。
Figure BPA00001545998100401
急性GVHD的分级指数*
Figure BPA00001545998100402
抗病毒活性
监控CMV、EBV和腺病毒的病毒负荷。对于治疗中的感染，病毒负荷的响应如下定义：
完全响应：采用的具体试验和和临床体征和症状恢复到正常范围
部分响应：病毒负荷从基线降低至少50％或临床体征和症状改善50％
混合响应：一种感染的病毒负荷从基线降低至少50％，而第二感染的病毒负荷增加或没有变化(仅适用于基线处患两种感染的患者)。
稳定疾病：变化没有达到部分响应或发展
进展：病毒负荷从基线增加至少50％或扩散到疾病的其他位置。
抗病毒免疫重建
通过使用合适的病毒特异肽混合物的酶联免疫斑点试验或多聚体试验监控患者。
对病毒感染的临床体征的影响
若患者有器官损害，则监控临床响应。对于患EBV淋巴瘤和可检测疾病的患者，通过RECIST标准评估响应。
存活
计算CTL输注后6-12个月的总体存活。
慢性GVHD
在CTL输注后3、6和12个月评估慢性GVHD。
病毒再激活
收集CTL输注3个月内的所有CMV、EBV或腺病毒再激活。
二次移植失败
二次移植失败定义为起始嗜中性粒细胞移植后不同天数的3次连续检测中ANC随后降低到＜500/mm3，在没有已知原因如复发时对生长因子治疗不响应持续至少14天。CTL输注后30天评估二次移植失败。
患者评估
后续方案
下文列出预定的研究回访的后续方案。随访的时间基于CTL输注的日期。若患者有多重CTL剂量则在开始时重新设定方案，所以后续的与最后CTL剂量相关。
后续方案
评估时间目标日1
(招募后天数)
1周7天
2周14天
3周21天
4周28天
5周35天每周
6周42天
8周56天
90天90天
6个月180天
12个月365天
1目标日范围＝招募后8周的最多±2天，90、120天的±14天，6和12个月的±28天。
评估
下面所有评估作为注意标准，除非用“*”标出。
输注前评估可包括历史和身体检查，包括身高和体重；EBV、腺病毒、CMV的病毒负荷；完整的急性GVHD分期和分级信息，包括皮疹、腹泻、恶心/呕吐、重量和肝功能测试的评估；差异CBC、血小板计数；肝功能检测(胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT)加肌酸酐；他克莫司/环孢霉素水平(若在这些试剂中)；**若为分娩妇女且接受低强度移植方案则需孕检；和/或**实验室研究的样品。输注后评估可包括1、2、3、4、6和8周中每周的和3个月的CMV、EBV、腺病毒的病毒负荷；完整的急性GVHD分期和分级信息，包括第42天前每周的皮疹、腹泻、恶心/呕吐、重量和肝功能测试的评估；3、6和12个月的慢性GVHD评估(若存在)；1、2、3、4、6和8周，和3个月的差异CBC和血小板计数；1、2、3、4、6和8周，和3个月的肝功能检测(胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT)加肌酸酐；24小时内输注相关的毒性和第30天前每周的毒性评估，和第45天前的急性GVHD；第42天前的每周和3、6和9个月的类固醇剂量；**1、2、3、4、6和8周，和3个月的实验室研究的样品；和/或3个月间的病毒再激活。
实验室研究包括用酶联免疫斑点或多聚体试验检测的基于CTL水平的病毒特异免疫的评估。对于毒性的安全性的初始跟进在第30天完成且GVHD在第42天完成后，患者继续进行常规移植后临床护理。评估3、6和12个月的临床和实验室记录以评价本研究的基因转移组分造成的长期效应。
评估可包括下述的一种或多种：历史和身体检查；CMV、EBV、腺病毒负荷；急性GVHD评估；慢性GVHD评估；差异CBC、血小板计数；基础化学(肌苷酸)；肝功能测试(碱性磷酸酶、胆红素、AST、ALT)；毒性评估；类固醇剂量；辅助实验室研究的血液和血清；感染。
I期试验完成时，累积其他患者的最大耐受剂量(MTD)水平以评价II期早期研究中抗病毒活性的临床终点。基于安全性数据，I期试验的最大样品大小为18。包括以MTD剂量水平治疗的6个对象在内，额外的10个对象会计入所述II期早期研究。I/II研究的最大样品大小为28个患者。
确定样品大小和设计特征
用改良的连续重新估计方法(mCRM)确定rCTL的MTD来指导剂量扩大(Przepiorka等，1995)。过继转移rCTL会造成GCHD的风险非常低。可接受毒性的目标概率设为不多于20％的合格病例。因此MTD定义为剂量限制性毒性(DLT)概率最多20％的剂量。基于先前的试验，本发明人希望平滑的剂量毒性曲线。评价四种剂量水平，即5x106、1x107、2x107和5x107，先前的毒性概率分别估计为3％、5％、10％和21％。在此试验中，基于大小为2的组的指数剂量毒性模型实现mCRM。为了降低以不可接受毒性剂量水平治疗患者的概率，可对原始CRM进行修改(Przepiorka等，1995)。具体地，各组治疗两名对象，剂量扩大限制在不多于一种剂量水平，且HSCT后CTL的先前研究显示在最低剂量水平开始招募患者是安全的(Leen等，2009)。
基于患者在各剂量水平的毒性响应，该I期试验中最多计入18名患者。两名患者开始分入最低剂量水平组，然后进行42天的后CTL输注，以评价包括GvHD的DLT和输注相关毒性。若在所述最低剂量水平处有一种或多种DLT，则停止试验。否则，下一剂量水平招募两名患者。对于中等剂量水平，若患者中任一或二者都发生DLT，则mCRM通过评估所述毒性概率来指导下一剂量水平。剂量相同或基于当前评估的MTD概率而减少。在mCRM推荐的剂量水平招募2个以上的患者。若先前已选择了治疗剂量水平且有任何患者发生DLT，则停止试验；否则，在下一剂量水平招募两名患者。若在mCRM推荐的剂量水平没有患者发生DLT，则两名患者继续下一剂量水平。重复剂量选择过程直到达到MTD或最高剂量水平。
最终MTD是概率接近目标20％毒性概率的剂量水平。若任何剂量水平的DLT评价概率(考虑该剂量水平治疗的所有患者)变得高于20％，则所述剂量减少。根据所述计量升级算法，各剂量水平最多2组。本发明人没有预期看到任何剂量水平发生任何CTL相关AE。但是在某些实施方式中，完成所述剂量递增后，所有三种剂量水平是安全的。若情况是这样，则治疗最少12名患者且MTD水平共计6名患者。若有一次或多次DLT事件，本发明人预计至多18名患者超募入本试验。
进行10000次重复刺激以确定该建议设计的操作特性，且本发明人将此与标准3+3剂量递增设计相比较。所建议的设计能更好估计MTD，基于更高概率的产生如MTD合适的剂量水平、在较低剂量水平需要较少数量的患者、且试验所需的患者总平均数保持较低。如上所述，所述第一剂量水平与HSCT后CTL的之前研究中所用的相同，且所述最高剂量低于先前试验(Leen等，2009)的一半。在某些实施方式中，剂量范围中的剂量毒性曲线平滑。
将起始输注后的42天内发生的DLT纳入CRM计算中以确定后续组的推荐剂量，从而下一组会等到42天DLT评价完成后。研究中，进行患者毒性结果的实时监控以评估所述剂量毒性曲线，且用预设剂量水平之一确定下一患者组的剂量水平。
确定所述MTD后，以MTD水平治疗其他患者以进一步评估其抗病毒活性。测试病毒负荷的治疗响应率能否高于65％。该治疗响应定义为完全响应、部分响应和混合响应。在某些实施方式中，若所述响应率低于30％则rCTL MTD无效。通过单臂二项式样品大小计算，其他10名患者可在MTD水平治疗(共16名，其中6名在考虑安全性的I期试验中治疗)。与不感兴趣的30％变化率相比，16的样品大小提供了实际84.1％的效力检测假设的65％比率，I型误差为0.05。I/II期试验计入最多28名对象。
B.多重肿瘤抗原特异性CTL
肿瘤可通过各种机制逃避免疫系统，包括抗原表达抑制、阴性免疫调节因子分泌等。同时靶向多种肿瘤抗原的能力是其提供克服和补偿肿瘤抗原表达抑制的策略，从而若肿瘤表达低水平的该抗原则CTL产物直接针对单一抗原可能无效，但若单一CTL产物中多种抗原被同时靶向，则刺激强抗肿瘤响应概率增加。
在具体实施方式中，本发明涉及用于多肿瘤抗原的CTL的生成。尽管本发明可用于任何癌症包括肺癌、乳腺癌、脑癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、骨癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、头颈部肿瘤等，但在本发明的某些实施方式中用于有关血液和骨髓的癌症。
霍奇金病。霍奇金病(HD)是淋巴网状内皮细胞来源的恶性肿瘤，特征为存在大量单核霍奇金(H)细胞和巨大多核里-施(RS)细胞，统称为霍奇金和里-施细胞(HRS)(Anastasi等，1989；Harris，1999)。美国每年诊断出约7500个新病例，生命的第三个10年中发生率最高。化疗和辐射组合有效且总体存活率较高但治疗后长期发病和致死仍是重要的问题。因此，需要开发新的治疗方法，改善结果并降低治疗相关的并发症(Yazbeck等，2006)。
复发的霍奇金病的表观遗传治疗。越来越多的证据表明霍奇金淋巴瘤(HL)的发病机理涉及基因沉默，所述基因沉默是由于基因启动子DNA超甲基化和组氨酸脱乙酰作用(HDAC)的异常表观遗传改变。通过在肿瘤细胞系中使用去甲基化试剂和HDAC抑制剂在体外逆转了这些效应，且用这些试剂的临床研究在复发的HL患者中产生了客观响应(Buglio等，2008)。观察到的优点可能部分是由于所述恶性肿瘤细胞中的肿瘤相关抗原(TAA)的诱导，且我们在响应对象中的研究表明直接针对这些新表达的表观遗传调节基因的抗原特异T细胞活性增加。已报道数种TAA表达上调，包括LAGE-1、SSX-2、NYESO-1和生存素(Shichijo等，1996)。本发明的具体方面中，确定TAA表达分布在表观遗传治疗前和后的活检中是否不同且在一些情况中评价直接针对所述表达抗原的CTL能否从治疗前和后的外周血单核细胞(PBMC)中离体生成。
过继免疫治疗-病毒相关恶性肿瘤。复发或难治疗的HL患者的其他治疗选择为过继T细胞转移。我们在＞100个干细胞受体的研究中表明供体来源的EB病毒(EBV)-CTL细胞系能安全地保护患者抵御EBV推动的淋巴瘤发展并治愈患者，甚至是患大量已建立疾病的患者(Rooney等，1995；Rooney等，1998；Heslop等，1996)。该方法还显示治疗免疫受损个体中产生的EBV相关肿瘤的希望(Straathof等，2005；Louis等，2008；Bollard等，2004；Bollard等2007)。在近期的I期试验中，对6名患者中5名复发EBV+ve HL或NHL的患者输注EBVILMP2-特异CTL后产生肿瘤响应，其中4名为完全响应。这些研究结合EBV-CTL的早期基因标记研究证明功能性EBVILMP2特异T细胞在输注后的患者血液中频率增加(表示体内扩增)，进入肿瘤组织并消除肿瘤细胞(Sollard等，2007)。然而，我们研究涉及的患者＞80％有EBV阴性肿瘤，这引导我们调查CTL治疗的其他肿瘤靶标。
过继免疫治疗-病毒独立性恶性肿瘤。体外开发用于靶向治疗免疫受损宿主中的病毒独立性癌症的扩增CTL的努力受到以下阻碍：(i)肿瘤活检样品上有关TAA表达的有限信息，和(ii)缺乏生成导向TAA的CTL细胞系的可复制方法。
在第一非病毒TAA中没有鉴定到病毒肿瘤相关的抗原癌睾丸抗原(CTA)，其最初发现存在于黑色素瘤中(Scanlan等，2004；Carrel和Johnson，1993)。随后发现许多其他肿瘤表达TAA包括MAGE、SSX、NY-ESO-1、PRAME和生存素(Mashino等，2001；Chambost等，2000；van等，1999；van等，2005；Ambrosini等，1997)。生存素在胎儿发育期间表达，但在最终分化的正常组织中检测不到。然而，其在各种肿瘤组织和细胞系中大量表达。重要的是，已从患一系列肿瘤的患者中分离到了CTA和生存素特异T细胞，且发现其识别和杀死肿瘤目标(Yee等，2002；Mautner等，2005；Tan等，2005)。在HL和其免疫原性中记录TAA表达并评估体外和体内反应性CTL的效力。
体外生成TAA特异CTL-使用EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(LCL)和腺病毒载体转导的单核细胞/DC过表达病毒抗原来体外生产多克隆病毒特异CTL(Bollard等，2004；Bolard等，2007；Leen等，1997；Leen等，2006)。然而，此方法不能用于生成TAA-CTL，因为EBV和Adv抗原比TAA有明显更强的免疫原性。迄今为止，生成TAA-CLT需要使用单表位肽作为抗原来源和细胞因子增加情况下的CTL细胞系培养物(Foster等，2007；Quintarelli等，2008)。如下所述，优化本方法以可重复地生成来自患者PBMC的TAA-CTL，使用DC表达完整抗原(例如混合态或TAA编码质粒)作为APC并在最优细胞因子组合存在下共培养。体外和体内评估TAA-CTL效力。
在本发明用于癌症的其他情况中，可使用头颈部肿瘤。鳞状细胞癌(SCC)构成多数头颈部肿瘤，其5年存活率为50％或更少，这个数据40年没有发生变化(Forastiere等，2001；Uppaluri等，2008)。改善治疗的可能方法是基于我们对疾病生物学的理解和使用细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作为肿瘤导向免疫治疗。
此方法已成功用于靶向病毒相关的恶性肿瘤且我们在患EBV阳性霍奇金病的免疫活性患者中的研究产生了高度完全持久的缓解率，甚至是在复发、抗性疾病的患者中(Bollard等，2004；Bollard等，2007)。此外，T细胞靶向黑素瘤相关肿瘤抗原的抗肿瘤活性已被重复证明(Dudley等，2002)，且SCC肿瘤样品中存在的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)已与更好的临床结果相关联(Wolf等，1987；Wolf等，1986；Sbrandwein-Gensler等，2005；Snyderman等，1989)。在本发明的具体情况中，使用肿瘤导向CTL以治疗头颈部的SCC。数个研究已证实SCC肿瘤定位于口咽中，且口腔表达数种肿瘤相关抗原(TAA)，包括MAGE1、3、PRAME和NY-ESO-I，其为潜在T细胞靶标。此外，在晚期肿瘤患者(分析样品的T4-100％)中表达率通常更广泛，所述患者中通常检测出≥2的TAA基因(Kienstra等，2003；Figueiredo等，2006；Ries等，2008；Mollaoglu等，2008；Marioni等，2005；Atanackovic等，2006)。
可在IL-7、IL-12、IL-15和IL-6或IL-27存在时培养反应性T细胞，因为已证实这些细胞因子用于体外TAA特异CTL的活化(图13)。图14说明CTL细胞系显示出对两种或更多抗原的同时特异性。该系证明针对TAA特异活性和CD4和CD8 T细胞隔室中的特异性。肿瘤CTL的体内效率与体内留存密切相关，且在本发明的某些方面，抗肿瘤CTL能被遗传修饰以提高其体内存活和留存。例如，可用转基因IL7受体转导肿瘤CTL(图15)，在其中所述肿瘤IL7受体具有功能(图16)，且这些肿瘤CTL保持其抗原特异性(图17)。
实施例1
用肽混物脉冲处理或TAA表达作为APC从健康供体中生成TAA特异CTL
从健康供体中产生TA特异CTL。用TAA肽混物脉冲处理的或质粒转导的DC以10∶1的比例再激活肿瘤抗原特异T细胞(图1A)。存在IL7(10ng/ml)、IL12(10ng/ml)和IL15(10ng/ml)时培养PBMC。第9天用添加IL-7的质粒转染/肽混物脉冲处理的DC的二次刺激再刺激培养物中的肿瘤抗原特异T细胞，然后从第12天每周添加IL-2两次。第16-17天通过IFN-γ酶联免疫斑点评估扩增的TAA-CTL细胞系的特异性。2名健康供体的结果示于图2B；左图显示用SSX2肽混物脉冲的DC作为APC产生的系的CTL特异性，而右图显示用转染有生存素编码质粒的DC作为刺激物生成的系的特异性。为了优化所述CTL产生方案以生成同时具有对多种不同TAA特异性的CTL细胞系，研究不同细胞因子组合。用覆盖SSX2、生存素和MAGEA4的肽混物的主混物脉冲处理的DC作为APC，并在IL7、IL12、IL15和IL6(1000U/ml)存在下共培养，本发明人能成功生成同时具有针对所有三种刺激抗原的特异性的TAA-CTL(图1C)。重要的是，用相同来源的抗原、产生自相同供体、但在IL7、IL12、和IL15存在下培养的CTL生成针对SSX2的单特异性CTL，这证明优化抗原来源和细胞因子组合对TAA-CTL产生的重要性。如细胞毒性实验所示，所述多特异性CTL体外有功能(图2)。
实施例2
示例性实验设计和方法
在一些实施方式中，提供生成对多种淋巴瘤相关靶抗原特异的肿瘤特异CTL。可确定TAA-CTL能否从复发/难治疗的HL的对象中扩增用于单独或与表观遗传药物治疗联用进行过继转移。
这些多特异性CTL体内更有效，因为本发明的具体方面中，肿瘤免疫监视逃避机制会最小化。
关于示例性实施方式，可比较2种抗原来源；(i)覆盖所述TAA的肽混物(例如，重叠11个氨基酸的15聚体)和(ii)TAA编码的DNA质粒，和DC为用于刺激的APC。表明用两种抗原来源从健康供体生成TAA-CTL的研究示于图1B。为了生成多TAA-CTL，可产生覆盖最频繁表达抗原的3种或更多肽混物的主混物，或可用多种质粒同时转染DC(图1C)，尽管在一些情况中可单独核转染各质粒然后收集核转染的DC。再激活的T细胞可在细胞因子增加情况下培养，已证明这对体外激活TAA特异性CTL很关键(Foster等，2007；Quintarelli等，2008)。扩增的细胞在第9天用TAA肽混物脉冲处理的或转染的DC再刺激并与IL7培养，且从第12天开始每周添加2次IL-2(50U/ml)。第16天通过IFN-γ酶联免疫斑点评估特异性。图1A显示示意图。
在某些实施方式中，TAA-CTL能容易地从患者PBMC中生产，特别是那些收集了表观遗传后治疗的(即例如接受地西他滨和HDAC抑制剂)。提供可复制方法来生成多克隆多特异性TAA-CTL，其在某些实施方式中主要为CD8+且含有衍生自中央(CD62L+)和效应记忆(CD62L-)群体的T细胞，且在具体方面中被关联抗原刺激时产生IFNγ(和其他Th1细胞因子)。
本发明的某些实施方式中，通过使用优化的细胞因子组合可在细胞系中维持多特异性，如图1C所示。因此，本发明提供用于加工对多种肿瘤抗原内多种表位特异的多克隆CTL的可重复技术。这些方法可临床放大，因为其使用的方法可转化成药品生产质量管理规范(GMP)生产。
可评估体外和体内TA特异CTL细胞系的特异性和功能。可检测本文产生的TAA-CTL的扩增以及特异性和功能。体外-可在具体情况中每周用台盼蓝排除法计数CTL扩增以确保可重复生成足够的TAA-CTL用于临床应用(或例如用在剂量递增研究中(4x107-2x108细胞/平方米))。用例如表达TAA的APC和自体肿瘤作为靶标通过Cr51释放实验评估细胞溶解能力。细胞因子产生能力可通过荧光活性细胞分选评估。抗原刺激后检测来自CD4+和CD8+T细胞的胞内TNF-α、INF-γ、和IL-2。关于体内方面，一旦确立了TAA-CTL体外识别和杀死肿瘤靶标，可在例如表达TAA的异种移植模型中验证活性。一旦TAA-CTL的抗肿瘤活性评估为单独治疗，可鉴定后续结合TAA-CTL和表观遗传治疗是否增加体内效力。
本发明的具体实施方式中，如例如流式细胞术、IFN-γ酶联免疫斑点和细胞溶解实验所测，扩增的细胞保留对所有刺激抗原的特异性和活性，且所述CTL会在体外和体内杀死肿瘤靶标。
本发明人在示例性的16天培养期间一直能实现20-40倍的TAA-CTL扩增。然而，若扩增有问题，则可使用IL2替代IL15，其可提高增殖而不损失抗原特异性(Quintarelli等，2007)。在一些实施方式中，肿瘤细胞可激活抗凋亡/存活途径(如bcl-2)并随后抗CTL杀死。若此发生，其可能部分或不完全，且可通过输注对多种抗原特异的CTL而不是单抗原特异性的系来克服。此外，在某些实施方式中，CTL治疗结合表观遗传治疗(DNA甲基转移酶抑制剂和/或组氨酸脱乙酰基酶抑制剂)可用于提高抗肿瘤响应。示例性的DNA甲基转移酶抑制剂包括例如5-氮杂胞苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、1-β-D-阿糖胞苷-5-氮杂胞嘧啶和二氢-5-氮杂胞苷。示例性的HDAC抑制剂包括异羟肟酸、如曲古抑菌素A；环四肽(如曲泼素(trapoxin)B)和缩肽类(depsipeptides)；苯酰胺类；亲电酮；和脂族酸化合物如丁酸苯酯和丙戊酸。
本发明的具体实施方式中，例如去甲基化试剂和TAA-CTL的组合提供高度靶向的肿瘤杀死而对周边器官毒性有限。本发明可单独给予或与表观遗传药物治疗联用治疗癌症，包括表达肿瘤相关抗原的那些，例如表达肿瘤相关抗原的血液实体恶性肿瘤。
本发明的一些实施方式中，研究SCC活检样品中的TAA表达模式，以例如通过IRC和RT-PCR建立SCC活检样品中的TAA表达。通过示例性方法，可分析来自3种不同患者组的肿瘤；i)原位癌症患者或TI，ii)T2-3，和iii)T4。这些组的分类独立于肿瘤分化(分级)、淋巴结损害、转移或原发性肿瘤(口腔、下咽部、喉部等)的位置，因为研究表明TAA表达仅与局部散布相关(Figueiredo等，2006；Ries等，2008)。例如，可分析20个样品/组。用IHC和RT-PCR检测活检样品中的TAA抗原表达(包括但不限于，例如MAGE-I、2、3、4，MAGECI，MAGEC2，SSX1，SSX2，PRAME，NY-ESO-1和生存素)。某些实施方式中，IHC玻片可由独立组织学家用2个标准分级，(i)阳性细胞数量和(ii)抗原表达强度。
检测大多数患者样品中的至少一种TAA的表达(不考虑散布程度)，且在某些情况中对于T4 SCC的患者，其会上升到100％并发现2种或更多TAA(Figueiredo等，2006；Ries等，2008)。参考TAA表达的频率和强度定义等级。先前的研究表明多数肿瘤对MAGE1或3阳性。发现PRAME约为40％，且NY-ESO-1约为10％(Kienstra等，2003；Figueiredo等，2006；Ries等，2008；Mollaoglu等，2008；Marioni等，2005；Atanackovic等，2006)。本发明的某些方面中，表达最频繁的抗原可用于刺激生成CTL。
在具体实施方式中，获得了HNSCC活检样品中的TAA表达概况，并解决了这些TAA是否诱导体外反应性T细胞。可生成并评估肿瘤特异CTL对多种SCC-TAA的特异性和功能。确定TAA-CTL能否从所述H&N的SCC患者中扩增以进一步过继转移。首先可生成具有单抗原特异性的TAA-CTL，然后加工针对多种频繁表达的TAA特异的CTL细胞系。本发明的具体实施方式中，这些多种TAA特异CTL体内更有效，因为其最小化由抗原损失变体介导的肿瘤免疫逃逸。
在示例性方法中，可获得40-50ml患者血液，其为APC和应答T细胞的来源。血液可从本文分析的相同的3组中的新诊断患者收集(T1、T2-3、T4)。在具体情况中，相同患者的肿瘤和血液匹配。为了刺激，可比较并采用两种抗原来源：(i)覆盖所述TAA的肽混物(例如，重叠11个氨基酸的15聚体)和(ii)编码TAA的DNA质粒。制备患者DC用于刺激。为了生成多TAA-CTL，产生覆盖最频繁表达抗原的3种或更多肽混物的主混物，或可用多种质粒同时转染DC(Gerdemann等，2009)。在某些情况中，在IL-7、IL-12、IL-15和IL-6存在时培养反应性T细胞，因为已证实这些细胞因子对体外TAA特异CTL的活化很关键(Leen等，2007；Foster等，2007；Quintarelli等，2008)。
扩增的细胞在第9天用TAA肽混物脉冲处理的或核转染的DC再刺激并与IL7一起培养，且从第12天开始每周添加2次IL-2(50U/ml)。可在每周例如用台盼蓝排除法评估CTL扩增和活力以确保可常规生产足够的TAA-CTL用于临床应用，或例如用在剂量递增研究中(4x107-2x108细胞/平方米)。3次刺激后，用表达TAA的APC和HLA匹配的SCC细胞系如HSC-2、HSC-3、HNEC、BHY和HN23；24作为靶标通过Cr51释放实验评估细胞溶解能力。用FACS评估细胞因子生产。抗原刺激后可检测来自CD4+和CD8+T细胞的胞内TNF-α、INF-γ、和IL-2。
开发可重复方法来生成多克隆多TAA-CTL，其在某些实施方式中主要为CD8+且含有中央(CD62L+)和效应记忆(CD62L-)T细胞，且被关联抗原刺激时产生IFNγ(和例如其他Th1细胞因子)。在具体方面，如流式、IFN-γ酶联免疫斑点和细胞溶解实验所测，扩增的CTL保留对刺激抗原的特异性和活性。
若不是所有肿瘤抗原的免疫原性相当，且多轮刺激后存在抗原竞争和针对较弱抗原的特异性损失，可用优化的细胞因子组合保持系内的多特异性。有疑问的是体外TAA-CTL增殖较差，而本发明人在16天培养期间一直能实现20-40倍的TAA-CTL扩增。若增殖有问题，则可使用IL15替代IL2，因为IL15可提高增殖而不损失抗原特异性(Teague等，2006)。若所述肿瘤细胞激活抗凋亡/存活途径(如bcl-2)并随后抗CTL杀死，其可能是部分或不完全，且可通过例如输注对多种抗原特异的CTL而不是单抗原特异性的CTL来克服。
实施例3
将肿瘤相关抗原(TAA)特异性细胞毒性T淋巴细胞给予患有活性或复发的霍奇金或非霍奇金淋巴瘤的患者
本实施例考虑将TAA特异CTL给予患有活性或复发的霍奇金或非霍奇金淋巴瘤的个体的示例性实施方式，尽管技术人员认识到这些实践可应用于和/或适于其他类型的癌症。
在具体实施方式中，本发明涉及将自体或异源TAA特异CTL注射入(如静脉内)患有霍奇金(HL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)的个体中。
用EBV特异T细胞免疫治疗EBV+ve HL和NHL
免疫活性患者中EBV与HL和NHL相关，且在这些情况中，所述肿瘤细胞表达约90种EB病毒抗原中的3种。为了优化抗原靶向CTL针对免疫活性对象的HL/NHL，本发明人通过依次使用树突细胞(DC)和EBV-LCL制备了特异性针对所述三种(示例性)表达病毒抗原的CTL，所述EBV-LCL经遗传修饰以过表达LMP1和LMP2来再激活并扩增来自患者或其HLA匹配的异源供体的LMP特异CTL。所述LMP抗原从腺病毒载体表达。临床结果令人印象深刻，17个治疗缓解高风险HD患者中16个仍然处于缓解期，而15个活动性复发疾病的患者中12个发生肿瘤响应。然而，本研究涉及的＞70％的患者具有EBV阴性淋巴瘤且不适合用EBV抗原特异T细胞。
过继免疫治疗EBV-ve HL和NHL
过继免疫治疗非病毒性癌症的挑战之一仍是强免疫原性靶向抗原的鉴定。模式肿瘤抗原需在肿瘤细胞上特异并普遍表达以限制附带损伤，且在一些情况中对维持所述肿瘤的致癌表型很重要。然而，大多数抗原不满足这些标准，因为其不一定是独特存在于癌细胞中的新抗原，而是在正常细胞中也表达的抗原，且外周血T细胞对其耐受或缺失。然而如下所述已鉴定本质上肿瘤特异的抗原，但肿瘤抗原的表达形式高度依赖肿瘤类型。这强调了鉴定在正常组织中不表达或表达很少的合适抗原的重要性，以及优化肿瘤特异性CTL生产的细胞培养条件的重要性，从而克服建立T细胞耐受“自身”抗原的机制。
肿瘤抗原和T细胞免疫原性
肿瘤相关抗原(TAA)可基于其表达和组织分布分成四种主要组。
(I)单一突变导致的独特抗原(如MUM1)，其对肿瘤和患者特异并因此仅在肿瘤细胞中表达。其常被认为对免疫治疗很理想，因为肿瘤细胞可被特异靶向而不破坏邻近正常组织，且其可为相对较强的抗原。然而，由于其也通常是患者特异的，所以鉴定突变基因然后生成靶向所鉴定抗原的个体化CTL产物需大量工作且成本很高。
(II)共有的谱系限制抗原，在黑素瘤细胞以及其正常来源组织上表达，如MART，gp100或Melan-A。这些抗原还具有较强的几乎与弱病毒抗原相当的免疫刺激性，能有效的且相对容易地用最小体外操控从健康供体和患者中生成和扩增肿瘤特异T细胞。然而，T细胞介导的正常黑素细胞的破坏导致用黑素瘤特异CTL或TIL治疗的患者发生白癫风以及眼睛和全身的自身免疫病。
(III)共有的肿瘤特异TAA(如癌睾丸抗原[CTA]-MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、SSX、PRAME)，其在多种肿瘤而不在健康器官中表达，除了特权免疫的种系组织，且因此其对T细胞攻击不易感。CTA是CTL的最优靶标，因为这些可大规模生产以提供针对各种肿瘤的广泛保护。在疫苗和T细胞治疗方案中，CTA都被靶向并显示临床疗效。
(IV)最后一组是在许多不同肿瘤中过表达但在健康组织中低水平表达的抗原(如hTERT、CEA和生存素)。靶向这些抗原的T细胞有对共表达这些抗原的正常组织(如CEA和正常胆上皮细胞)诱发一些附带损伤的风险，且有关体内靶向这些抗原的安全性的临床数据很有限。然而，已从已清除肿瘤的患者的外周血中分离到生存素和CEA特异T细胞，且关于接受溶瘤细胞病毒的患者中生存素特异T细胞增加的报道说明其在患者中有效力而无毒性。
靶向TAA的T细胞免疫治疗
一些研究中已描述具有希望的临床结果的非病毒肿瘤抗原的T细胞免疫治疗。Rosenberg和同事报道了黑素瘤特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和高剂量干扰素2(IL-2)的共同输注使约35％的转移性黑素瘤患者产生临床响应。没有分析所述输注细胞的特异性但可能其靶向多种表位/肿瘤相关抗原。用改良的治疗方案随后获得了更具希望的结果，所述方案包括CTL输注前的淋巴消耗步骤，从而改善了过继转移细胞的扩增和留存。标准治疗法难以治疗的93个转移性黑素瘤患者接受免疫消耗化疗-/+全身辐射，然后过继转移高度选择的、TIL源的肿瘤反应性T细胞和高剂量IL-2(每8小时720,000IU/kg用以耐受)。93患者中有52个对治疗(39PR，12CR)有客观的临床响应，包括大量肿瘤的消退。然而，大多数肿瘤不可能收集到自体同源的TIL。而且，大量肿瘤特异T细胞的体外扩增(＞1010CTL)是复杂且昂贵的过程。
同一组还将输注了直接靶向黑色素瘤相关抗原中单一表位的T细胞克隆，gp100+/-IL-2，但报道了较差的临床响应，仅有一较小响应和一混合响应，表明所述细胞没有在体内植入或持续存在。这突出了靶向多种表位/抗原对产生最优化临床结果的重要性。
开发治疗EBV-ve HL和NHL的过继免疫治疗方法
选择在HL和NHL中表达的TAA。CTA、NY-ESO-1、PRAME、MAGE-A4和SSX2最多在55％的霍奇金-里-施细胞中表达。此外，生存素是CTL的良好靶标，其可在体外从癌症患者和健康供体中扩增(Pisarev等，2003)。HL和NHL中这些肿瘤抗原的表达和其明显的免疫原性使其成为CTL治疗的有用靶标。在本发明的某些实施方式中，可生成用于所有患者的靶向多种抗原的广泛范围抗原特异T细胞。
作为刺激T细胞的方法，可使用临床可应用的肽混合物(肽混物)，包括例如覆盖整个序列NY-ESO-1、SSX2、生存素、Prame和MAGEA4的重叠11个氨基酸的15聚体肽。这些肽库包括各蛋白所有可能的HLA I类表位。收集所述肽混物用于T细胞刺激，从而对来自所有其抗原的多种表位特异的T细胞可产生自所有患者或供体，不论其HLA表型。由于所述个体肽长度为15个氨基酸，在一些情况中CD4+和CD8+T细胞都被激活。
用DC作为APC来生成多肿瘤特异CTL
除了选择优化的肿瘤抗原用于T细胞刺激，本发明人确定了树突细胞(DC)是患者中最可能的抗原呈递细胞，因为其提供共同刺激和细胞因子(如IL-12)，其驱动T细胞沿着合适的效应物途径(Tc1/Th1)分化。
用Th1极化/促增殖性细胞因子生成TAA特异CTL
本发明人和其他人还表明细胞抗肿瘤免疫的有效诱导也依赖于免疫调节和促生长细胞因子。分离自全血或肿瘤活检样品的肿瘤特异T细胞常无能/耐受且增殖能力较差。为了克服此限制并可重复地产生具有多抗原特异性的肿瘤特异CTL细胞系，可在CTL培养物中补充外源IL-15、IL-7、IL-12和IL-6(在具体情况中)：IL-15是常见的γ链细胞因子，其能克服T细胞对肿瘤特异CTL的耐受而不促进Treg生长；IL-7改善原始、记忆和活化的肿瘤特异T细胞的存活；IL-12是Th1/Tc1极化细胞因子，其以添加剂/协作方式起作用以提高IFN-γ生产、增殖和抗原特异T细胞的细胞毒性功能。IL-6还有利于TAACTL生成，因为其使原初CD4偏向Th17 T细胞而防止Treg形成。
用优化的培养设备生成多肿瘤特异CTL
当前加工CTL通过在传统组织培养处理的24孔板中逐渐扩增，每周用抗原呈递细胞上表达的抗原再刺激。此系统会耗费大量劳动力，需要技术人员且难以规模化。尽管经常更换培养基并分割以优化细胞数量、营养水平和移除废品，T细胞在扩增期经历明显的细胞死亡，而感染风险随着操作的板数增加。对替换这种封闭式、可规模化的在其他类型临床细胞培养系统中广泛使用的生物反应器系统的努力没能成功用于生产抗原特异的细胞毒性T细胞。得到的T细胞产物没有功能或没有特异性。
在一些实施方式中，使用新的透气快速扩增设备(G-Rex)，其显著减少培养期间T细胞凋亡，产生更有效的体外扩增。穿过所述烧瓶底部的透气硅膜发生气体交换(进O2和出CO2)，防止供氧不足同时使细胞上方有较大深度的培养基，提供更多的营养并稀释废品。这些培养条件能使对CTL生产非常关键的细胞和细胞之间的稳定相互作用通过物理破碎而无阻碍进行，技师操作时间减少＞10倍，细胞产出增加＞3倍，并加速CTL加工时间＞2倍而不影响所述CTL的表型和功能(Vera等，2010)。
在输注T细胞靶向正常组织中所表达自身抗原诱导了输注后炎症响应的事件中，可给予类固醇以引起肺部症状的逆转，例如从而快速有效地控制相关毒性。
可包括在本文所述研究中的患者是诊断为霍奇金或非霍奇金淋巴瘤的患者和有活化疾病或复发中或自体或同系SCT后或异源SCT后的患者；平均寿命＞6周的患者；卡氏/兰氏分值＞50的患者；获取时HIV阴性的患者(若为自体产物-患者必须为HIV阴性)；若为异源SCR后则外周血或骨髓中的供体嵌合性必须低于50％的患者；胆红素＜3x正常值、AST＜5x正常值且Hgb＞8.0的患者；肌酸酐＜2x年龄正常值的患者；参加本研究前停止其他调查治疗1个月的患者；参加本研究前停止常规治疗至少1周的患者。排除有严重并发感染、HIV阳性和GVHD＞II级的患者。
示例性方案
获取血液用于生成CTL和抗原呈递细胞(APC)
生成肿瘤特异CTL细胞系需要从外周血单核细胞(PMBC)生成数种不同成分。通过用(例如)覆盖所述示例性肿瘤相关抗原SSX2、MAGEA4、生存素、PRAME和NY-ESO-1(尽管可使用其他肿瘤抗原和组合)的肽混物的主混物脉冲处理的抗原呈递细胞(APC)刺激，所述CTL细胞系可衍生自患者(或供体)外周血T细胞。在Th1/促增殖细胞因子白介素(IL)7、IL-12、IL-1和IL6存在下进行起始刺激，且在具体实施方式中细胞会在IL-2存在下扩增。用于刺激和扩增所述肿瘤特异T细胞的APC为衍生自单核细胞的树突细胞。
对于CTL生成，可用单核细胞分离性输血收集程序(ALC＜500的患者)或可要求例如两倍100ml外周血的最大抽血，总最大体积200ml。可从患者或异基因干细胞供体(对象必须至少12千克或24磅)中收集血液。对于＜18岁的供体或患者，8周期间最多提取3ml/kg的血液。用菲可(ficoll)梯度法从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。T细胞和单核细胞衍生的树突细胞(DC)可从新鲜或冷冻保存的PBMC中制备。
为了起始肿瘤特异CTL细胞系，可通过用细胞因子(GM-CSF、IL-4)培养PBMC衍生的单核细胞然后用标准DC成熟混合物(例如IL-1β、IL6、TNFα和PGE2)使其成熟来制备DC。这些成熟树突细胞用覆盖SSX2、MAGEA4、生存素、PRAME和NY-ESO-1的肽混物的主混物脉冲处理30-60分钟，从而各肽的终浓度为50纳克/管。然后清洗DC一次并在T细胞激活混合物IL-7、IL15、IL12和IL-6存在时以应答物∶刺激物10∶1的比例用所述DC刺激PBMC衍生的T细胞。为了起始，例如从约60mL血液中制备DC且T细胞衍生自20-40mL血液。
为了扩增所述肿瘤特异T细胞，可用肽混物脉冲的DC进行第二和后续的刺激且细胞在IL-2存在时培养。至少需要100 x 106单核细胞来生成第二批DC。
培养期结束时，可将CTL冷冻保存并等分测试其表型、功能、特异性、同一性和不育性。用胞内细胞因子染色、酶联免疫斑点实验和HLA肽四聚体(如果有)确定肿瘤特异CTL的频率。用流式细胞术分析效应记忆表型和T细胞子集。
释放标准可包括同一性、活力＞70％、7天后细菌和真菌的阴性培养、内毒素检测≤5EU/ml、支原体检测结果阴性、以20∶1杀死的患者PHA母细胞或皮肤成纤维细胞＜10％(若为异源产物)、CD83阳性/CD3阴性细胞＜2％和HLA同一性。
可用肽混物(例如由JPT科技公司生产)作为抗原来源。这些肽混物为覆盖各感兴趣抗原的完整序列的重叠肽库(重叠11个氨基酸的15聚体)。例如各肽化学合成到至少＞90％纯度。
给药和监控
临床评估患者并在某些情况中间隔两周给予2剂量的CTL。通过NCI常见毒性标准评分监控患者的临床毒性。还可通过可获得HLA型四聚体的患者中的酶联免疫斑点和四聚体研究分析包括表型和CTL频率在内的免疫学参数。通过铬释放试验和酶联免疫斑点/胞内细胞因子染色分别进行功能分析(抗原特异细胞毒性和细胞因子释放)。比较输注前后的血清细胞因子水平。例如6周的时间组成临床安全性监控的时间。若患者已有部分响应或有稳定的疾病，其适于接受最多6种进一步剂量的CTL，各所述剂量可由与其第二次注射相同的数量组成。
治疗计划
可使用下述示例性剂量：5x106细胞/平方米；1x107细胞/平方米；2x107细胞/平方米；和4x107细胞/平方米。
评估四种示例性剂量安排。各剂量安排中评估2-6名患者。本方案设计为I期研究。各患者按照下述剂量安排接受2次注射，间隔14天：
剂量水平1：
第0天5 x 106细胞/平方米
第14天5 x 106细胞/平方米
剂量水平2：
第0天1 x 107细胞/平方米
第14天1 x 107细胞/平方米
剂量水平3：
第0天2 x 107细胞/平方米
第14天2 x 107细胞/平方米
剂量水平4：
第0天4 x 107细胞/平方米
第14天4 x 107细胞/平方米
若第8周或后续评估时，活性疾病患者有稳定的疾病或根据RECIST标准有部分响应，则其适于每月间隔接受最多6种其他剂量的CTL，各所述剂量可由与其第二次注射相同的细胞数量组成。患者不能接受额外的剂量直到第二次输注后的6周完成起始安全性概况。
患者可用苯海拉明1mg/kg IV(最大50mg)和泰诺10mg/kg po(最大650mg)作为前驱用药。对于细胞给予，可由通过外周或中央线的静脉内注射1-10分钟给予肿瘤特异T细胞。可根据血液产品给药制度标准进行监控，除了输注是医生给予之外。患者可接受急性或慢性毒性的支持护理，包括血液组分或抗体和其他合适的介入。
患者评估
可在输注前，输注后2、4和6周和随后3、6、9和12个月时获取下述调查。CBC和差异、BUN、肌酸酐、胆红素、SGOT、SGPT、碱性磷酸酶、Na、K、Cl、CO2、白蛋白、和/或总蛋白。
输注前和第二次输注后6周使用诊断成像(CT扫描、MRI、核成像)和/或血液测试(血清细胞因子)记录可检测的疾病和对治疗的响应。若在本研究的治疗期间或治疗后的其他时间进行诊断成像研究，则收集该数据并使用得到的信息。若所述患者接受延长的剂量，则在最终输注后1-3个月完成成像。
可在输注前，输注后1、2、4和6周和随后3、6、9和12个月和此后的一年中每年获取下述调查。外周血在无防腐剂的肝素和ACD(柠檬酸葡萄糖)抗凝血剂中(20-40ml)。该血液可用于外周血T细胞的表型分型和CTL响应的特异性分析，使用HLA肽四聚体分析和免疫功能实验包括酶联免疫斑点、胞内细胞因子染色和细胞毒性实验。
若前两次输注后患者有额外细胞注射，则每次输注前、每次输注结束、每次输注后3-4天(基于患者喜好而任选的天)、和每次输注后1和2周获取这些测试。然后后续可每月继续3次，且可持续到最终输注后的12个月和此后1年的每年。在一些情况中，2年后不进行研究具体血液的测试(若患者有其他注射)，但可与患者继续保持联系以跟踪长期疾病响应。
第一年间任何阶段患者需要肿瘤活检的情况中，该样品可用于评估肿瘤抗原表达概况。若在任何评价时间患者的血红蛋白低于8.0g/dl，则用于评价的抽血量降低且若需要可通过多于一次的静脉穿刺获得。监控参数可包括例如输注肿瘤CTL、CBC差异、电解质和肝功能测试、成像研究、表型分型、和免疫功能研究。
研究期间的评价
对于后续间隔，患者可在第一个8周以两周的间隔评价(就诊时或通过研究调度员联系)，然后在3、6、9和12个月，然后每年一次持续一年。由于临床说明或若所述患者有多于两次输注，可进行额外的随访。考虑到提早终止研究并修改药物剂量，可在各组中的各剂量水平有2-6名患者参与时将本研究视为完成。若观察到剂量限制性毒性，则个体患者的治疗可终止。为了本研究的目的，剂量限制性毒性可定义为不可逆、危及生命或视作主要与所述CTL注射相关的3-4级的任何毒性。
若观察到剂量限制性毒性(DLT)，则个体患者的治疗可终止。对于本研究的目的，DLT定义为：发生III-IV级GVHD或毒性。NCI常见毒性标准评分列出的标准可用于分级毒性。可用Przepiorka等(2006)的方法分级GVHD。第二次输注后的6周时间构成评价重要毒性的过程，且评价抗肿瘤活性可能需要CTL输注后的6周时间。尽管响应不是本试验的主要终点，根据标准评估患可检测疾病的患者。开始治疗的2周内和第二次输注的6周后进行肿瘤尺寸的评估。接受第一次输注的所有患者可评价响应。患者长期的总体和无进展存活也可在1年时评价。
患可检测肿瘤和/或淋巴结病的患者中-本研究可用实体瘤疗效评价标准(RECIST)委员会推荐的国际标准评价响应和进展。所述RECIST标准使用仅肿瘤病损的最大直径中的变化(单维检测)。可检测的病损定义为可被精确测量的病损，其在至少一个维度(待记录的最长直径)用常规技术(CT、MRI、x光)＞20mm或用螺旋CT扫描＞10mm。研究人员可鉴定最多10个可检测的病损用于跟踪响应。用CT或MRI完成系列检测。将相同的评估方法用于表征基线和后续中各鉴定和报告的病损。
完全响应(CR)定义为所有目标病损消失。部分响应(PR)定义为目标病损的最长直径(LD)之和至少减少30％，参考基线LD和。进展疾病(PD)定义为目标病损的LD之和至少增加20％，参考治疗开始或产生一个或多个新病损以来记录的最小LD之和。稳定疾病定义为没有足够的收缩以满足PR或没有足够的增加满足PD，参考治疗开始以来的最小LD之和。本发明的具体实施方式中，个体可有CR或PR或稳定疾病。
参考文献
本说明书中涉及的所有专利和出版物指示本发明涉及领域技术人员的水平。本文中所有专利和出版物通过引用纳入，就如各出版物被具体地和单独地说明通过引用全文纳入本文一样。
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尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明。此外，本申请的范围不是旨在限制于本说明书所述的形式、手段、方法和步骤的过程、机器、制造、组合物的具体实施方式。通过本公开可容易理解，现存或后续开发的与本文所述相应实施方式实施基本相同功能或实现基本相同结果的形式、手段、方法、或步骤的过程、机器、制造、组合物均可使用。因此，所附权利要求旨在将形式、手段、方法、或步骤的过程、机器、制造、组合物包括在其范围内。

Claims (11)

1.一种生成靶向来自两种或更多病毒的至少一种抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述方法包括步骤：
(1)用多种质粒核转染来自个体的树突细胞(DC)群，其中所述多种质粒中的各质粒编码来自所述两种或更多病毒之一的至少一种抗原，且因此产生表达和呈递来自两种或更多病毒的至少一种抗原的树突细胞群；或
(2)用肽文库接触来自个体的DC群，其中所述肽序列重叠以覆盖完整病毒抗原的部分或全部，因此产生呈递来自两种或更多不同抗原的至少一种表位的DC群(APC)；和
用所述核转染的DC(APC)接触来自所述个体的外周血单核细胞(PBMC)以产生能响应来自两种或更多病毒的至少一种抗原的抗原特异T淋巴细胞群；和
在有透气膜的容器中的培养基内培养所述抗原特异T淋巴细胞，其中培养基成分包括IL-4和IL-7以产生靶向来自两种或更多病毒的至少一种抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTL给予免疫受损个体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述个体有异基因干细胞移植。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒选自下组：EBV、CMV、腺病毒、BK、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、细小病毒B、轮状病毒、西尼罗河病毒、和其组合。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞通过注射给予。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述注射为静脉内。
7.一种生成靶向两种或更多肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述方法包括步骤：
(1)用多种质粒核转染来自个体的DC群，其中所述多种质粒中的各质粒编码一种或多种肿瘤抗原的至少一种表位，因此产生表达和呈递两种或更多肿瘤抗原的的至少一种表位的DC群(APC)；
或
(2)用肽文库接触来自个体的DC群，其中所述肽序列重叠以覆盖完整抗原的部分或全部，因此产生呈递来自两种或更多不同抗原的至少一种表位的DC群(APC)；和
用所述APC接触来自所述个体的外周血单核细胞(PBMC)以产生能响应来自两种或更多肿瘤抗原的至少一种表位的抗原特异T淋巴细胞群；和
在有透气膜的容器中的培养基内培养所述T淋巴细胞，其中培养基成分包括IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述个体患有淋巴瘤或白血病。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述T淋巴细胞给予所述个体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞通过注射给予。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述注射为静脉内。
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